UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra farmakologie a toxikologie. Standardizace metodiky pro in vitro stanovení

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmakologie a toxikologie

Standardizace metodiky pro in vitro stanovení chelatace mědi

Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D.

Hradec Králové, 2013

Lucie Sedlářová

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Farmakologie a toxikologie Kandidát: Lucie Sedlářová Školitel: PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Název diplomové práce: Standardizace mědi pro in vitro stanovení chelatace mědi

Měď je stopový prvek nezbytný pro mnohé biochemické děje v lidském organismu. Poruchy homeostázy mědi mohou způsobovat celou řadu onemocnění. V prvé řadě jsou to dvě dědičná onemocnění: Wilsonova choroba, která je spojena s přesycením jater a dalších tkání mědí, a Menkesova choroba, která je naopak spojena s nedostatkem systémové mědi. Navíc lokální poruchy mědi hrají roli i u dalších onemocnění patologických stavů (neurodegenerativní nemoci, nádory, akutní infarkt myokardu). Hlavním cílem této experimentální práce byla standardizace jednoduché, ale přesné metodiky pro rychlý screening chelátorů mědi, které by mohly být v budoucnu využívány k terapii systémového i lokálního nadbytku mědi. Metodika vychází ze spektrofotometrického stanovení mědi na mikrotitračních destičkách za použití vhodných indikátorů, disodné soli kyseliny bathocuproindisulfonové (BCS) a hematoxylinu. Tato diplomová práce ukázala, že metodika s BCS je schopna stanovit chelataci jak měďnatých, tak měďných iontů při čtyřech různých pH (4.5; 5.5; 6.8; 7.5) odpovídajících fyziologickým či patofyziologickým podmínkám v organismu. Kromě stanovení chelatace iontů mědi může metodika sloužit ke stanovení redukčních vlastností stanovovaných látek. Hematoxylin se dá použít pouze ke stanovení chelatace měďnatých iontů a to pouze při

vyšších pH. Prováděné metodiky byly úspěšně standardizovány zejména ve vztahu k optimálnímu množství reaktantů a aplikovány v chelatačních experimentech na známém chelátoru kliochinolu. Vyvinutá metodika představuje velmi jednoduchý a přesný způsob měření chelatace mědi.

KLÍČOVÁ SLOVA: Měď, Chelátor, Bathocuproin, Hematoxylin

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Lucie Sedlářová Supervisor: Dr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Title of thesis: Standardization of method for in vitro assessment of copper chelation.

Cooper is a trace element, which is essential for many biochemical processes in the human body. Disruption of copper homeostasis can cause a variety of diseases. There are primarily two hereditary diseases associated with copper dyshomeostasis: Wilson´s disease, which is linked with the excess of copper in the liver and other tissues, and Menkes disease, which is associated with a lack of systemic copper. In addition, local disturbances of copper play a role also in other diseases (neurodegenerative diseases, tumors, myocardial infarction). The main objective of this experimental work was the standardization of a simple but accurate method for rapid screening of copper chelators, which could be applied for the therapy of systemic or local copper excess in the future. The methodology is based on the spectrophotometric determination of copper in microplates using appropriate indicators, bathocuproindisulfonic acid disodium salt (BCS) and hematoxylin. This thesis has shown that the BCS methodology is able to determine chelation of cupric as well as cuprous ions at four different pH (4.5, 5.5, 6.8, 7.5) corresponding with physiological or pathophysiological conditions of the organism. In addition to the assessment of chelating properties, this methodology can be used for the determination of reducing properties of tested compounds. Hematoxylin can be used only for the assessment of the

chelation of cupric ions and only at higher pH. Performed methodologies were successfully standardized particularly in relation to the optimal amount of reactants and applied in chelation experiments with a known chelating compound clioquinol. The developed methodology represents very simple and accurate way to measure copper chelation.

KEYWORDS: Copper, Chelator, Bathocuproine, Hematoxylin

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného titulu.

……………………………. V Hradci Králové dne 17. 4. 2013

Lucie Sedlářová

Zvláštní poděkování patří mému školiteli PharmDr. Přemyslu Mladěnkovi, PhD. za odborné vedení a vstřícné jednání, trpělivost, cenné rady a pomoc při měřeních v rámci mé diplomové práce. Další dík patří Mgr. Michalovi Říhovi za pomoc při utváření mé diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala pracovníkům Katedry farmakologie a toxikologie za možnost vykonání diplomové práce na této katedře a Katedře farmaceutické botaniky za poskytnutí laboratoře pro naměření mých výsledků. Práce vznikla za podpory grantů FRVŠ 664/2011/A a GAUK 605712C.

OBSAH

1. ÚVOD .................................................................................................................................... 1 2. CÍL PRÁCE............................................................................................................................ 3 3. TEORETICKÁ ČÁST............................................................................................................ 5 3.1. Funkce mědi v organismu................................................................................................ 6 3.2. Farmakokinetika mědi ..................................................................................................... 7 3.3. Patologické stavy spojené s dysbalancí mědi .................................................................. 8 3.3.1. Nedostatek mědi ........................................................................................................ 8 3.3.2. Nadbytek mědi .......................................................................................................... 9 3.4. Chelatace mědi .............................................................................................................. 13 3.4.1. Chelátory mědi ........................................................................................................ 13 3.4.2. Měď-chelatační sloučeniny ..................................................................................... 14 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................................ 15 4.1. Materiál a přístroje......................................................................................................... 16 4.1.1. Chemikálie .............................................................................................................. 16 4.1.2. Přístroje ................................................................................................................... 16 4.2. Příprava zásobních roztoků ........................................................................................... 16 4.3. Pracovní postupy ........................................................................................................... 17 4.3.1. Obecný postup pro BCS .......................................................................................... 17 4.3.2. Obecný postup pro HEM ........................................................................................ 17 4.3.3. Změření spektra pro BCS-metodiku ....................................................................... 18 4.3.4. Změření spektra pro metodiku s hematoxylinem včetně ověření linearity vztahu absorbance-koncentrace .................................................................................................... 18 4.3.5. Ověření linearity závislosti absorbance na koncentraci mědi u BCS .................... 18 4.4. Statistická analýza ......................................................................................................... 19 5. VÝSLEDKY ........................................................................................................................ 20 5.1. Příprava metodiky pro stanovení chelatace měďnatých iontů pomocí hematoxylinu ... 21 5.2. Příprava metodiky pro stanovení chelatace měďných iontů pomocí BCS ................... 35

5.3. Ověření metodiky na známém chelátoru ....................................................................... 44 6. DISKUZE ............................................................................................................................. 45 7. ZÁVĚR................................................................................................................................. 49 8. POUŽITÁ LITERATURA ................................................................................................... 51

SEZNAM ZKRATEK ATPáza

Adenosin-trifosfatáza

BCS

Sodná sůl bathocuproindisulfonové kyseliny

CNS

Centrální nervový systém

CuCl

Chlorid měďný

DMSO

Dimethylsulfoxid

D-PEN

D-penicilamin

EDTA

Ethylendiamintetraoctová kyselina

HA

Hydroxylamin

HCl

Kyselina chlorovodíková

HEM

Hematoxylin

NaCl

Chlorid sodný

RDA

Doporučená denní dietní dávka, z ang. required daily dose

TEPA

Tetraethylenepentamin

1. ÚVOD

1

Měď patří k prvkům, o kterých uvažujeme spíše v souvislosti s vedením elektrického proudu, ale hraje také důležitou roli v našem organismu. Po železe a zinku je třetím nejvíce zastoupeným esenciálním prvkem v našem organismu. Dysbalance v homeostáze mědi doprovází řadu patologických stavů, zejména neurodegenerativních onemocnění, nádorů, zánětlivých onemocnění a akutního infarktu myokardu. Přes rozsáhlý výzkum v této oblasti, je zatím klinické použití chelátorů mědi omezeno především na Wilsonovu chorobu. D-penicilamin (D-PEN) byl také schválen pro revmatoidní artritidu, ale jeho použití u Wilsonovy choroby může při zasažení CNS zhoršit neurologické příznaky samotné choroby. Kliochinol je neselektivní chelátor, u kterého byly prokázány některé pozitivní dopady na pacienty s Alzheimerovou chorobou a v in vivo experimentech i na nádorová onemocnění.

2

2. CÍL PRÁCE

3

Hlavním cílem této experimentální práce byla standardizace jednoduché, ale přesné metodiky pro rychlý screening chelátorů mědi využitelné při různých patofyziologicky relevantních pH.

4

3. TEORETICKÁ ČÁST

5

3.1. Funkce mědi v organismu Měď patří mezi prvky s významným vlivem na živý organizmus. Hraje významnou roli v řadě enzymatických reakcí, které jsou nezbytné pro správnou funkci organismu např. metabolismus katecholaminů, při stabilizaci kolagenu a elastinu a při energetickém metabolismu buňky. Společně se zinkem je komponentou plazmatické a extracelulární superoxiddismutázy a má tedy významnou úlohu v antioxidační ochraně organismu. (Racek et al. 1999) Spolu s železem se účastní krvetvorby a vytváření krevního barviva hemoglobinu. Účastní se také tvorby melaninu – barviva v kůži a vlasech. V těle dospělého člověka je možno nalézt přibližně 80 -150 mg mědi, která se ukládá v játrech a je krví rozváděna do celého těla. Množství, které se v organismu vstřebá, se pohybuje mezi 25 a 60 % a zbytek vyloučíme. Denní potřebná dávka mědi je asi 20µg/kg. Bezpečná denní dávka pro dospělého je 15-30mg. V organismu se měď vyskytuje převážně ve vázáné formě s bílkovinami a aminokyselinami. (Trojan et al. 2003) Největší část mědi je navázána na specifický protein ceruloplazmin. Tento protein je pro měď velmi důležitý, protože slouží jako zásobárna a současně jako transportér mědi, který dodává měď pro její využití v periferii.

6

3.2. Farmakokinetika mědi Měď je vstřebávána ve všech částech tenkého střeva a malé množství také z žaludku. Měď se vyskytuje v řadě zdrojů – kakau, játrech nebo rovněž i v korýších či měkkýších. U nás ji můžeme najít i v méně exotických zdrojích, k nimž patří ořechy, ovesné vločky, droždí, maliny či houby. Ve stopovém množství se měď vyskytuje i v řadě dalších potravin. (Trojan et al. 2003) Účinnost vstřebávání stoupá s klesajícím obsahem mědi v potravě a klesá s přítomností vitamínu C a železa. Po vstupu mědi do buňky střevní sliznice, 1) se měď může využít na syntézu měď-obsahujících enzymů, 2) je navázána na bílkovinu melatothionein, v případě nadbytku mědi, nebo 3) je transportována přes tuto buňku do portální cirkulace. Dlouhodobé podávání zinku, např. v potravních doplňcích, snižuje vstřebávání mědi, vyvíjí se známky nedostatku mědi. Využívá se toho ale terapeuticky při Wilsonově chorobě. V portální krvi je měď transportována na krevních bílkovinách, především albuminu a transkupreinu do jater, kde je zabudována do jaterních enzymů a do ceruloplazminu (Obr. 1). Z jater je buď transportována ceruloplazminem krví do periferie k využití nebo vylučována žlučí a tedy stolicí ven z těla. Ceruloplazmin je plazmatická bílkovina typu alfa-2glykoproteinu, která je syntetizována v játrech a je hlavním přenašečem pro měď v krvi. Je schopná na své molekule vázat až osm atomů mědi. Ceruloplazmin nejen přenáší měď do tkání z jater, ale je zároveň účinným zhášečem volných kyslíkových radikálů, které vznikají vlivem oxidativních procesů v buňkách a jsou zvýšeně produkovány např. při zánětu. Navíc oxiduje Cu+ na Cu2+ a brání tak dalšímu šíření volných radikálů inhibicí Fentonovy reakce. Jde o významný reaktant akutní fáze. (Racek et al. 1999)

7

Obr. 1 Molekula ceruloplazminu. Převzato: Bento et al. 2007

3.3. Patologické stavy spojené s dysbalancí mědi 3.3.1.

Nedostatek mědi

Při nedostatku mědi může dojít zejména k anémii (chudokrevnosti) a zhoršení duševního vývoje. Dále se může projevit zhoršením metabolismu cukrů v důsledku snížení hladin inzulinu, šedivěním a vypadáváním vlasů, poruchou tvorby červených i bílých krvinek s porušenou imunitní reakcí. Deficit mědi též má vliv na zvýšení hladiny cholesterolu v krvi, může působit i poruchy pigmentace a osteoporózu. Významnou nemocí spojenou s nedostatkem mědi je Menkesova choroba, což je dědičná porucha metabolismu, která se řadí mezi poruchy metabolismu mědi, zinku a železa. Toto dědičné onemocnění je vázané na chromozom X. Je způsobeno mutací genu kódujícího Cu2+ transportující ATPázu. To způsobí, že střevní sliznice není schopna přenášet měď přes membránu do krve. Výsledkem je tedy snížení koncentrace mědi ve tkáních. Projevuje se

8

hlavně u kojenců, zejména chlapců už ve 2-3 měsících života, kdy se neurodegenerativní onemocnění, vyvolané touto chorobou, začíná projevovat křečemi a hypotonií. Tyto postižené děti se nedožívají déle než 3 let, příčinou je většinou infekce nebo cévní komplikace. Onemocnění se projevuje opožděným mentálním vývojem a růstem, zvýšenou teplotou, zkrouceností, zvláštním vzhledem vlasů (kudrlinky na krátkém šedém vlasu), mozkovou poruchou, typickým vzhledem obličeje s propadlými tvářemi a čelem, vyskytují se i problémy s příjmem potravy, zvracení nebo chronické průjmy. Kromě degenerace neuronů a demyelinizace mozkové tkáně způsobené sníženou aktivitou cytochrom c-oxidázy, dopaminβ-hydroxylázy a superoxiddismutázy vzniká také anémie a osteoporóza s různými frakturami kostí následkem porušené biosyntézy kolagenu a elastinu. (Zeynep et al. 2009) Z výše uvedeného je patrné, že jde o velmi závažné onemocnění. Jediným možným terapeutickým způsobem je podání mědi hned po narození dítěte. Tím se může zabránit těžkým změnám. (Fernandes et al. 2008) Nedostatek mědi je v našich zemích poměrně vzácný, vyskytuje se hlavně u nedonošených a podvyživených dětí, u osob s poruchou vstřebávání, u pacientů na nitrožilní výživě či u pacientů s onemocněním střev a u starších lidí. Nedostatek mědi pozorujeme také u Parkinsonovy nemoci. Příjem mědi potravou je dnes na hranici její potřeby. (Fernandes et al. 2008)

3.3.2.

Nadbytek mědi

Případy, kdy dojde k absolutnímu nadbytku mědi v organismu bez genetické příčiny, jsou velmi vzácné. Muselo by totiž dojít ke zvýšené konzumaci potravin nebo doplňku stravy s vysokým obsahem mědi. Přebytek mědi je u zdravých osob možný pouze po požití minimálně 250 mg mědi. Při požití tohoto množství mědi, se měď již začíná projevovat jako jed a působí, stejně jako těžké kovy – olovo, rtuť, tedy jako nevratný inhibitor enzymů. Při požití mědi v 9

množství mezi 0,25–2 gramy, může měď způsobit vážné zdravotní problémy. Tkáňová akumulace mědi je pozorována, jestliže dlouhodobější dieta obsahuje 200-500x více než je denní doporučená dietní dávka (RDA) tj. od 1,5 do 3 mg denně. Měď je pro člověka relativně toxický prvek. Vdechovaný nebo ve formě aerosolu vyvolává příznaky akutní intoxikace ,,horečku kovů“ s příznaky stejnými jako v případě zinku, tj. kašlem, třesavkou, teplotou, malátností a bolestí hlavy. Perorální požití gramových dávek mědi vede k iritaci zažívacího traktu s průjmy a zvracením. Následné vysoké koncentrace mědi v séru provází ikterus s poškozením jater, ledvin a hemolýzou s častým fatálním průběhem. Chronický nadměrný přívod mědi vyústí v jaterní cirhózu. K akutní otravě mědí může dojít při pití vody vysoce kontaminované mědí nebo při požití kyselé potravy skladované dlouhodobě v měděných nádobách. Toxické projevy byly též pozorovány u vinařů, kteří užívají měď jako pesticid. Obsah mědi ve vodě, která působí toxické projevy, se udává 2-3 mg mědi na litr. Horní tolerovatelný limit pro ženy je pod 10 mg na den a pro muže pod 12 mg na den. Vyšší dávky mohou vést k neurodegenerativním onemocněním podobným Alzheimerově chorobě. (Ferenci 2004) Významným problémem je také to, že měď je nebezpečná z hlediska vzniku kyslíkových radikálů a tím poškození tkání. Fentonova reakce (Rovnice 1) představuje nejčastější mechanismus vzniku nebezpečného hydroxylového radikálu v organismu. V sumární podobě představuje reakci peroxidu vodíku (vzniká působením superoxiddismutázy ze superoxidu i v reakcích katalyzovaných některými oxidázami) s iontem přechodného kovu v nižším mocenství (Fe2+, Cu+, obecně Mn+). I když je mědi v organismu mnohem méně než železa, reaguje s peroxidem vodíku mnohem rychleji. V reakci vzniká hydroxylový radikál, hydroxidový anion a přechodný kov se oxiduje na Fe3+, Cu2+, obecně M(n+1)+. (Wardman a Candeias, 1996)

10

Cu+ + H2O2 → Cu2+ + OH- + OHRovnice 1. Fentonova reakce vyjadřující vznik hydroxylového radikálu

Značná reaktivita hydroxylového radikálu jako možného oxidantu se projevuje reakcí s velkým množstvím molekul buď odtržením vodíkového atomu, adicí, nebo elektronovým -

přenosem. Tím, že je OH značně reaktivní, omezuje se dosah jeho difúze a toxicita na okolí jeho vzniku. (Wardman a Candeias, 1996) Otravy mědí jsou však vzácné, protože měď v potravě má nepříjemnou chuť, která ji činí nepoživatelnou. Mnohem častějším případem nadbytku mědi v organismu je Wilsonova choroba. Jedná se o dědičné onemocnění způsobené deficitem měď transportující ATPázy, což vede ke kumulaci mědi v orgánech. Tento přebytek se nejčastěji projevuje poškozením jater a mozku, protože dochází ke kumulaci mědi v těchto orgánech. Kumulace je způsobena poruchou exkrece mědi do žluče a inkorporaci do ceruloplazminu. Jaterní forma je typická hlavně pro děti a adolescenty, naopak neurologická forma se častěji vyskytuje u dospělých. Nejdříve bývají postižena játra a projevuje se to celou řadou příznaků, např. nechutenstvím, žloutenkou a únavou. Někdy se mohou objevit komplikace, které jsou velmi závažné, jsou jimi např. cirhóza jater, selhávání jater nebo rakovina. (Mareček 2004) Dalším postiženým orgánem bývá mozek. Postižení mozku se objevuje později a projevuje se spíše poruchou intelektu. Častými příznaky jsou poruchy polykání, změny osobnosti, snížení inteligence, křeče a poruchy hybnosti. Měď se ukládá i na okrajích rohovky a vytvoří viditelný tzv. Kayser-Fleischerův prstenec (Obr. 2). Pokud je onemocnění včas diagnostikováno a léčeno, je možné jeho projevy zmírnit, zastavit, nebo jim i předejít. Jako první vedou k podezření výše zmíněné příznaky. Je možné zjistit i laboratorně sníženou hladinu ceruloplazminu a zvýšené vylučování mědi v moči. Dlouhodobé poškození jater mědí se projeví laboratorním zvýšením jaterních testů. Konečná diagnóza se udělá na 11

základě biopsie jaterní tkáně, kdy ve vzorku nalezneme zvýšený obsah mědi. Biopsie jater se provede speciální jehlou přes břišní stěnu. Léčba spočívá v tom, že se omezí přísun mědi v potravinách, kde je mědi větší množství (ořechy, čokoláda, ryby, vnitřnosti). Dále by se mělo zlepšit vylučování mědi z těla a to se provede použitím speciálních chelatačních činidel, která jsou schopna pevně vázat měď a vyloučit ji z těla ven. Pokud nepomůže ani toto opatření, musí se transplantovat játra. (Mareček 2004)

Obr. 2 Kayser-Fleischerův prstenec. Převzato od Hynek, 2009.

12

3.4. Chelatace mědi Chelatace je fyzikálně chemický proces, při němž některé organické sloučeniny váží vícevazebné kationty obvykle kovy jako železo, měď a vápník dvěma nebo více vazbami. Při chelataci se tedy kovy mohou vázat na vhodné molekuly, vznikají tak cheláty. Chelatačních látek se využívá i léčebně, např. k léčbě otrav některými kovy např. olovem, k odstranění nadměrného množství mědi u Wilsonovy choroby nebo železa u pacientů léčených krevními transfuzemi a hemochromatózy. Vzhledem k faktu, že měď je součástí některých složitých bílkovinných struktur, které se podílí na katalytické aktivitě a je klíčová pro regulační funkce, může nerovnováha mědi v homeostáze u člověka způsobit vážné zdravotní problémy. Přesto jsou chelátory mědi nezbytné v klinické praxi u chorob způsobených v důsledku změn v homeostáze mědi. Různé chelátory mají rozdílné vlastnosti, které vedou k jejich specifickému použití. Cílem je většinou odstranění přebytečné mědi z orgánových systémů.

3.4.1.

Chelátory mědi

Polyaminokarboxylátové chelátory Polyaminokarboxyláty jsou organická chelatační činidla skládající se ze základního ligandu

kyseliny

šťavelové.

Mezi

nejznámější

chelátory

této

skupiny

patří

ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA), která je běžně používaná v molekulární biologii a v biochemických studiích. Má vysokou afinitu i k Cu2+. Nicméně, měď navázanou na bílkovinu, už EDTA nedokáže vytěsnit. (Ding et al. 2010)

13

Acyklické aminochelátory Základním ligandem acyklických aminochelátorů je etylendiamin. Typickým chelatačním činidlem této skupiny je TEPA – tetraethylenepentamin.

Hydroxychinolinové chelátory Mezi nejznámější chelátor této skupiny patří kliochinol, derivát 8-hydroxychinolinu. Kliochinol byl testován u Alzheimerovy nemoci, která se vyznačuje zvýšenými hladinami železa, mědi a zinku v mozku. (Ding et al. 2010)

Diaminové chelátory Diaminové chelátory často obsahují 2,2´-bypiridin a 1,10-fenanthrolin. Jedním z nejznámějších je bathocuproin, který je používán v buněčné biologii. Jeho sulfonovaný derivát, kyseliny bathocuproindisulfonová, vytváří hydrofilní komplex s Cu2+. (Ding et al. 2010)

3.4.2.

Měď-chelatační sloučeniny

Bathocuproin

Klioquinol

EDTA

Obr. 3 Vzorce vybraných měď-chelatačních sloučenin.

14

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

15

4.1. Materiál a přístroje 4.1.1. Chemikálie 

Sodná sůl bathocuproindisulfonové kyseliny (BCS),



Hematoxylin (HEM),



Hydroxylamin (HA),



Dimethylsulfoxid (DMSO),



Pentahydrát síranu měďnatého (CuSO4.5H2O), Chlorid měďný,



Octan sodný, Kyselina octová,



4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonová kyselina (HEPES), HEPES sodná sůl,



Kliochinol

Byly zakoupeny od Sigma Aldrich (Německo).

4.1.2. Přístroje 

Analytické váhy Kern ALT 220-4NM (Kern, Německo)



Spektrofotometr pro mikrotitrační destičky Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTec Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA)

4.2. Příprava zásobních roztoků Zásobní roztok měďných iontů (5 mM) byl připraven rozpuštěním chloridu měďného (CuCl) ve vodném roztoku 0.1 M HCl a 1 M NaCl. Pracovní roztoky o nižších koncentracích byly připraveny naředěním destilovanou vodou. Měďnaté ionty (síran měďnatý pentahydrát), HA a BCS byly rozpuštěny přímo v destilované vodě. Hematoxylin a kliochinol v DMSO.

16

Měření byla provedena v 15 mM pufrech, acetátové pufry byly použity pro pH 4.5 a 5.5 a HEPES pufry pro pH 6.8 a 7.5.

4.3. Pracovní postupy Všechny experimenty byly provedeny na mikrotitračních destičkách.

4.3.1. Obecný postup pro BCS Roztok mědi (50 µl) se 2 min mísil s roztokem rozpouštědla nebo chelatotvorného činidla (50 µl) ve 100 µl pufru. V případě měďných iontů směs obsahovala navíc 50 µl hydroxylaminu, aby bylo zabráněno oxidaci na měďnaté ionty. V případě měďnatých iontů byl HA přidán až po 2 minutách. Účelem tohoto kroku byla redukce měďnatých iontů na měďné, protože prakticky pouze ty reagují s BCS. Nakonec, bylo přidáno 50 µl BCS nebo vody (slepý vzorek - blank) a byla okamžitě a po 5 minutách měřena absorbance při 484 nm. Podobný postup byl použit pro stanovení redukujících vlastnosti, tj. měďnatých iontů. Měďnaté ionty byly smíchány se zkoušenou látkou v pufru bez hydroxylaminu. BCS byl přidán po 2 min míchání. HA byl použit pouze jako pozitivní kontrola - 100% redukce.

4.3.2. Obecný postup pro HEM Roztok chelatotvorného činidla (50 µl) se smísí s roztokem měďnatých iontů (50 µl) ve 150 µl pufru. Po 2 min míchání se přidá 50 µl roztoku hematoxylinu nebo DMSO (blank) a míchá se další 3 min. Absorbance byla měřena okamžitě a po 4 min.

17

4.3.3. Změření spektra pro BCS-metodiku Do kapkovací destičky bylo napipetováno 150 µl pufru o požadovaném pH (4.5-7.5). Poté bylo přidáno 50 µl roztoku měďnatých iontů o koncentraci 250 µM nebo voda. V dalším kroku se přidalo 50 µl HA o koncentraci 100 mM a BSC v různých koncentracích a do druhé poloviny jamek voda jako slepý vzorek. Posledním krokem bylo měření spektra v rozmezí 300-800 nm a časovém intervalu 0 až 30 minut.

4.3.4 Změření spektra pro metodiku s hematoxylinem včetně ověření linearity vztahu absorbance-koncentrace měďnatých iontů Do kapkovací destičky bylo napipetováno 150 µl pufru o požadovaném pH (5.5-7.5). Poté bylo přidáno 50 µl roztoku měďnatých iontů o různých koncentracích nebo voda. Pak se přidalo 50 µl hematoxylinu v různých koncentracích (0.75; 0.5; 0.25; 0.1 mM) a směs se nechala 2 minuty míchat. Posledním krokem bylo měření spektra v rozmezí 400-800 nm a časovém intervalu 3 až 20 minut. Prakticky identický postup byl uplatněn při ověření linearity ve vztahu absorbancekoncentrace měďnatých iontů. Jen bylo měření provedeno ve vybraných vlnových délkách.

4.3.5. Ověření linearity závislosti absorbance na koncentraci mědi u BCS Do kapkovací destičky bylo napipetováno 150 µl pufru. Poté se přidalo 50 µl roztoku měďnatých iontů v klesajících koncentracích (250/200/150/100/50/0 µM). Koncentrace 0 µM představovala destilovanou vodu. Pak se přidalo 50 µl HA 100 mM a 50 µl bathocuproinu o

18

koncentraci 5 mM nebo vody. Posledním krokem bylo měření při vlnové délce 484 nm po 0, 5, 10, 15 a 20 minutách.

4.4. Statistická analýza Výsledky jsou prezentovány jako průměr ± směrodatná odchylka vypočítaná podle

vzorce

. Koeficienty lineární regrese byly vypočítány za pomocí programu MS

EXCEL. Grafy zobrazující účinnost chelatace byly vytvořeny v programu GraphPad Prism verze 4.00 pro Windows, GraphPad Software (San Diego California USA).

19

5. VÝSLEDKY

20

5.1 Příprava metodiky pro stanovení chelatace měďnatých iontů pomocí hematoxylinu Nejdříve byla proměřena spektra samotných iontů mědi (Obr. 4). Absorpce měďnatých a měďných iontů byla i při jejich vysokých koncentracích minimální od vlnové délky 430 nm.

Obr. 4 Spektrum Cu+/Cu2+. Spektrum bylo měřeno v pufru o pH 7.5. Finální koncentrace mědi byla 5 mM a HA 2 mM.

21

Po přídavku hematoxylinu k měďnatým iontů se vytvořil při pH 5.5-7.5 komplex, jehož maximum se silně lišilo podle pH (Obr. 5-9) a absorbance komplexu v čase stoupala u všech pH (Obr. 5 vs 6, 7 vs 8). Předběžné experimenty ukázaly, že při pH 4.5 se komplex prakticky netvoří. Přídavek hydroxylaminu snížil tvorbu komplexu pravděpodobně redukcí měďnatých iontů na měďné u všech pH. Samotný hematoxylin vykazoval určitou absorbanci v oblasti 500-600 nm, tato absorbance byla prakticky eliminována přídavkem HA. Je tedy pravděpodobné, že se jedná o spontánní oxidaci hematoxylinu a redukční činidlo HA ji tedy může snížit.

Obr. 5 Okamžité spektrum Cu2+ s hematoxylinem při pH 7.5. Koncentrace měďnatých iontů byla 41 µM.

22

Obr 6. Spektrum Cu2+ s hematoxylinem po 20 minutách při pH 7.5.

Obr 7. Okamžité spektrum Cu2+ s hematoxylinem při pH 6.8. Koncentrace měďnatých iontů byla 41 µM.

23

Obr 8. Spektrum Cu2+ s hematoxylinem po 30 minutách při pH 6.8.

Obr 9. Okamžité spektrum Cu2+ s hematoxylinem při pH 5.5. Koncentrace měďnatých iontů byla 41 µM.

24

Vzhledem k tomu, že se absorpční maxima lišila podle pH, byly připraveny kalibrační křivky závislosti absorbance na koncentraci měďnatých iontů. Při pH 7.5 bylo maximum při vlnové délce 750 nm, při pH 6.8 bylo maximum při 740 nm a při pH 5.5 bylo maximum při 570 nm. Překvapivě ale kalibrační křivky v maximech absorbance při pH 7.5 a pH 6.8 nebyly zcela lineární (R2 < 0.98). Proto byla změřena celá spektra s různými koncentracemi měďnatých iontů a při každé vlnové délce byla připravena kalibrační křivka. Obrázky 10-12 jsou jejich souhrnem, který porovnává spektrum a hodnotu koeficientu lineární regrese. Z výsledků je zřejmé, že nejlepších kalibračních křivek vzhledem k absorpčnímu spektru (tj. citlivosti metody) bylo dosaženo v oblasti kolem 600 nm.

Obr 10. Stanovení absorpčního maxima Cu2+ při pH 7.5 a v čase 2.5 min a 20 min. Na levé ose y je hodnota koeficientu lineární regrese, na pravé ose y pak absorbance. Z grafu je zřetelné, že vlnová délka maxima vzhledem k nižšímu koeficientu linearity není vhodná, naopak i přes nižší absorbanci, nejvyšší koeficient linearity ve vztahu k co nejvyšší absorbanci byl nalezen při vlnových délkách okolo 600 nm. Šedá čára popisuje koeficienty lineární regrese v čase 2.5 min, černá pak v čase 20 min. Modrá barva znázorňuje absorpční spektrum komplexu hematoxylin-měďnaté ionty (Cu2+ ve finální koncentraci 5 µM) v čase 2.5 min (světle modrá) a 20 min (tmavě modrá). Světle růžová znázorňuje absorpční spektrum hematoxylin-měďnaté ionty o koncentraci měďných iontů 50 µM v čase 2.5 min a tmavě červená pak stejnou situaci v čase 20 min. 25

Obr 11. Stanovení absorpčního maxima Cu2+ při pH 6.8 a v čase 2 min a 20 min. Osy, značky a koncentrace odpovídají pH 7.5 (Obr. 10).

Obr 12. Stanovení absorpčního maxima Cu2+ při pH 5.5 a v čase 3 min a 20 min. Osy, značky a koncentrace odpovídají pH 7.5 (Obr. 10).

Díky těmto předběžným výsledkům byly poté připraveny přesné kalibrační křivky u vybraných vlnových délek (Obr. 13-21). Z těchto výsledků vyplývá, že ideální vlnová délka u pH 7.5 je 600 nm, u pH 6.8 je 590 nm a u pH 5.5 je 595 nm.

26

Kalibrace pH 7.5:

Obr. 13 Kalibrace Cu2+ hematoxylinem při pH 7.5 a vlnové délce 590 nm. Finální koncentrace hematoxylinu byla 250 µM.


27


Kalibrace pH 6.8:


28



29

Kalibrace pH 5.5:



30


Dalším bodem bylo stanovení ideální koncentrace hematoxylinu, protože jeho absorbance není stabilní a stoupá v čase. Z výsledných měření (Obr. 22-27) vyplývá, že mezi koncentracemi 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM byly v okolí ideální vlnové délky (600 nm) jen malé rozdíly. Navíc u vyšších koncentrací (0.5 a 0.75 mM) docházelo k silnému vzestupu absorbance po 20 minutách. U pH 5.5 byla absorbance obecně velmi nízká (pod 0.1), toto pH lze tedy použít u hematoxylinu spíše orientačně k určení chelatace.

31

Obr. 22 Stanovení absorpčního maxima u Cu2+ při různých koncentracích hematoxylinu a pH 7.5 po 3 min.

Obr. 23 Stanovení absorpčního maxima u Cu2+ při různých koncentracích hematoxylinu a pH 7.5 po 20 min. 32



33


Obr. 27 Stanovení absorpčního maxima u Cu2+ při různých koncentracích hematoxylinu a pH 5.5 po 20 min. 34

Příprava metodiky pro stanovení chelatace

5.2.

měďných iontů pomocí BCS Nejdříve byla změřena spektra BCS s měďnými ionty při všech pH (Obr. 28-31). Kvůli porovnání byly do grafů zahrnuty vždy měďné ionty s bathocuproinem za přítomnosti redukčního činidla hydroxylaminu a bez něj. Z grafů je jednoznačné, že bez redukčního činidla nedochází k tvorbě komplexu. Vysvětlením je, že měďné ionty jsou rychle oxidovány v roztoku bez přítomnosti redukčního činidla. Měďnaté ionty tedy nereagují nebo jen minimálně s BCS. Absorpční maximum měďných iontů s BCS nastalo při všech pH při vlnové délce 484 nm. Z obrázků je patrné, že docházelo i zde k vzestupu absorbance, která se ale po určité době ustálila a již nestoupala. Při pH 6.8 a 7.5 byla reakce velmi rychlá a absorbance komplexu se nezměnila od prvního měření. Je nutné zdůraznit, že v těchto experimentech byla koncentrace mědi relativně vysoká.

pH 4.5

Obr. 28 Spektrum Cu+ s BCS při pH 4.5 po 3 min, 5 min a 12 min. Koncentrace Cu+ a BCS byla 1 mM. Absorbance směsi bez HA se v čase neměnila. 35

pH 5.5

Obr. 29 Spektrum BCS-Cu+ pH 5.5 po 0 min, 5 min, 10 min a 15min. Koncentrace Cu+ a BCS byla 1 mM. Absorbance směsi bez HA se v čase neměnila.

pH 6.8

Obr. 30 Spektrum BCS-Cu+ při pH 6.8 v 0 min a 10 min. Koncentrace Cu+ a BCS byla 1 mM. Absorbance směsi bez HA se v čase neměnila. 36

pH 7.5

Obr. 31 Spektrum BCS-Cu+ při pH 7.5 v 3 min, 5 min a 12 min. Koncentrace Cu+ a BCS byla 1 mM. Absorbance směsi bez HA se v čase neměnila.

V maximu absorpce komplexu byla ověřena při všech pH lineární závislost absorbance na koncentraci mědi (Obr. 32-35). Absorbance komplexu měďných iontů a měďnatých iontů redukovaných hydroxylaminem se při žádném pH významně nelišila.

Obr. 32 Kalibrace Cu+ BCS při pH 4.5 a vlnové délce 484 nm v různých časových intervalech. Pro porovnání jsou vidět i měďnaté ionty v čase 0, absorbance se ani u nich se vzrůstajícím časem neměnila.

37

Obr. 33 Kalibrace Cu+ BCS při pH 5.5 a vlnové délce 484 nm v různých časových intervalech.

Obr. 34 Kalibrace Cu+ při pH 6.8 a vlnové délce 484nm v různých časových intervalech.

38

Obr. 35 Kalibrace Cu+ BCS při pH 7.5 a vlnové délce 484 nm v různých časových intervalech.

39

Dalším bodem byla optimalizace metodiky. Nejdříve byl změřen vztah mezi koncentrací hydroxylaminu a optimální redukcí mědi ve vztahu k úspěšnosti redukce i času (Obr. 36-39). Výsledky se lehce lišily podle pH. K rychlé a kompletní redukci při pH 4.5 – 6.8 stačila koncentrace hydroxylaminu kolem 1 mM na rozdíl od neutrálního pH, kdy musela být výrazně vyšší (minimálně 2.5 mM).

Obr. 36 Vztah rychlosti a účinnosti redukce mědi na koncentraci hydroxylaminu při pH 4.5 v čase. Osa x znázorňuje logaritmus molárního poměru hydroxylamin k Cu. Z grafu je zřetelné, že k rychlé kompletní redukci bylo potřeba přidat roztok hydroxylaminu se zhruba 3x vyšší koncentrací (log 3 = 0.5) než je měď. Měď byla přidána v koncentraci 250 M, tedy hydroxylaminu je nutno přidat minimálně 750 M, proto byla zvolena pro další experimenty koncentrace 1 mM.

40

Obr. 37 Vztah rychlosti a účinnosti redukce mědi na koncentraci hydroxylaminu při pH 5.5 v čase. Osa x znázorňuje logaritmus poměru molárních koncentrací hydroxylaminu a k mědi. Účinnost redukce byla podobná jako při pH 4.5.

Obr. 38 Vztah rychlosti a účinnosti redukce mědi na koncentraci hydroxylaminu při pH 6.8 v čase. Osa x znázorňuje logaritmus poměru molárních koncentrací hydroxylaminu a mědi. Z grafu je zřetelné, že rychlost redukce byla opět velmi rychlá a koncentrace nutná k úplné redukci byla podobná jako v předchozích případech. 41

Obr. 39 Vztah rychlosti a účinnosti redukce mědi na koncentraci hydroxylaminu při pH 7.5 v čase. Osa x znázorňuje logaritmus poměru molární koncentrace hydroxylaminu a mědi. Zde je zřetelné, že koncentrace hydroxylaminu nutná k rychlé a kompletní redukci musí být minimálně 10x (log 10 = 1) vyšší než koncentrace mědi, tj. minimálně 2.5 mM.

42

Posledním bodem optimalizace metodiky bylo zjištění nejvhodnější koncentrace BSC pro rychlou tvorbu komplexu se stabilní absorbancí v čase (Obr. 40 a 41). Podobných výsledků bylo dosaženo i při dalších pH.

Obr. 40 Rychlost a kompletnost chelatace Cu+ BCS při pH 4.5 ve vztahu ke koncentraci BCS. Do reakční směsi byl přidán HA o koncentraci 1 mM podle předchozích experimentů. Graf znázorňuje absorbanci při vlnové délce 484 nm ve vztahu k logaritmu koncentrace BCS v mM, která byla přidána ke směsi. Z grafu je vidět, že při malých koncentracích BCS nedošlo k úplné tvorbě komplexu ani po delším časovém intervalu. U koncentrace 1 mM byla tvorba komplexu sice kompletní ale relativně pomalá. Ideální se z tohoto důvodu jeví koncentrace 5 mM (log 5 = 0.7, předposlední body v grafu), kdy se komplex rychle vytvořil a s přibývajícím časem už byl stabilní. Zvýšení koncentrace na 10 mM (log 10 = 1) není potřebné.

43

Obr. 41 Rychlost a kompletnost chelatace Cu+ při pH 7.5 ve vztahu ke koncentraci BCS.

5.3. Ověření metodiky na známém chelátoru Připravená metodika byla ověřena na příkladu z literatury známého chelátoru kliochinol. V následujícím Obr. 42 jsou pro ilustraci zobrazeny výsledky při pH 7.5 pro obě metodiky.

Obr. 42 Chelatace iontů mědi kliochinolem, porovnání obou metodik při pH 7.5. Při koncentračním poměru 1:1 bylo chelatováno zhruba 50% mědi, stechiometrie komplexu je tedy 2:1, kliochinol:měď. 44

6. DISKUZE

45

Existují různé principy pro stanovení iontů mědi in vitro. Jedním z nich jsou spektrofotometrická měření, která jsou rychlá a levná. To je také jeden z důvodů, proč jsou tak často používána. Nicméně, několik spektrofotometrických metod má pouze omezené použití ve farmakologickém výzkumu. Některé z nich mají nízkou citlivost (např. nízký molární absorpční koeficient v případě bis(acetylaceton)ethylenediimin, nebo může být použit pouze v omezeném rozsahu pH (např. β-benzoyl-α-pyridylthiomočoviny) (Chimpalee et al. 1996; Das a Majumdar 1970). Ve světle těchto skutečností představuje BCS vhodný indikátor: 1) Patří mezi chelátory měďných iontů s vysokou afinitou, 2) komplex je tvořen v širokém rozsahu pH a jeho absorbance je stabilní, 3) tato metoda může být také použita pro stanovení chelatace měďných iontů v kombinaci s vhodným redukčním činidlem, 4) tato metoda může odhalit i relativní afinity testovaných sloučenin pro měď z důvodu vysoké afinity BCS pro měď, a 5) v případě silných chelátorů mědi, se dá u těchto látek s vysokou afinitou k mědi stanovit i stechiometrie vzniklého komplexu. Navíc, BCS je specifický pro měďné ionty ve srovnání s jinými ionty (Cherny et al. 2000). Je dobře vidět z grafů (Obr. 28-31), že afinita pro měďnaté ionty je relativně malá při všech testovaných pH. Je ale pravděpodobné, že BCS jako silný chelátor měďných iontů je schopen chelatovat i s nižší afinitou měďnaté ionty, které jsou ve vzniklém komplexu rychle redukovány za tvorby stabilního komplexu BCS:Cu+. Hematoxylin je spíše indikátor, který vytváří nestabilní komplex s mědí a test není použitelný při nižším pH. Nicméně se dá úspěšně využít při pH 6.8 a 7.5. Dá se použít i při pH 5.5, ale je třeba vzít v úvahu, že afinita hematoxylinu pro měďnaté ionty je při tomto pH relativně nízká, nelze jej použít k porovnání relativních afinit testovaných látek pro měďnaté ionty. Na druhé straně lze tento přístup při pH 5.5 použít alespoň při určení stechiometrie vznikajících komplexů.

46

Nestabilní komplexy u hematoxylinu neznamená, že měď je volně vázaná, ale že komplex prochází v čase nějakými konformačními změnami, jak je patrné i ze změn absorbance v čase (Obr. 22-27). Hematoxylin je totiž typickým příkladem barviv, která netvoří komplexy přímo. Barevné komplexy s různými kovy se totiž tvoří až s oxidovanou formou hemateinem. Oxidace hematoxylinu na hematein probíhala velmi pomalu ve vodě, ale velmi rychle ve vodném alkalickém roztoku, což odráží i výsledky této diplomové práce, kdy při nižším pH je tvorba komplexu s měďnatými ionty velmi pomalá. Navíc asi vícemocné kationy jsou schopny svými oxidačními schopnostmi zvyšovat tvorbu hemateinu. Toto bylo prokázáno u železa, kdy železnaté ionty nebyly v přeměně hematoxylinu na hematein úspěšné na rozdíl od železitých. V jejich případě byla oxidace rychlá a byla také spojena s tvorbou komplexu (Kazuko et al. 1996). Důležitým přínosem těchto experimentů je fakt, že lze použít kombinaci těchto indikátorů k relativně rychlému screeningu nových chelátorů a přitom otestovat i jejich schopnost chelatovat měďnaté nebo měďné ionty při různých patofyziologicky významných pH. Zatím nelze určit patofyziologický význam specifické chelatace měďných nebo měďnatých iontů, protože i přes rozsáhlý výzkum role mědi v organismu, není význam jednotlivých oxidačních stavů mědi jednoznačně objasněn (Racek et al. 1999). Ale s určitostí se ví, že i méně stabilní forma mědi Cu+, která jak bylo ukázáno i na našich experimentech (např. Obr. 29) může být ve vodném prostředí rychle zoxidována na měďnaté ionty, se v organismu určitě vyskytuje. Lze to doložit např. specifickým měďným transportérem. Měď je transportována ve formě měďných iontů přes plazmatickou membránu bílkovinou označovanou jako Copper Transporter 1, neboli CTR1 (Wang et al. 2011). Druhým významným faktorem je pH prostředí. Patofyziologické rozdíly pH mohou výrazně ovlivnit chelatační potenci jak bylo prokázáno v případě železa (Mladenka et al. 2011). U mědi lze předpokládat podobný scénář, např. u nádorů bylo opakovaně zjištěno nižší pH (Parolini et

47

al. 2009) a nádorové buňky také často obsahují vyšší koncentraci mědi než zdravé (Goodman et al. 2005), (Pan et al. 2002). Podobně u ischémie nacházíme nižší pH (Ambrosio et al. 1987) a navíc uvolnění iontů mědi do cirkulace (Chevion et al. 1993).

48

7. ZÁVĚR

49

Tato diplomová práce ukázala, že lze použít kombinaci indikátorů k relativně rychlému screeningu nových chelátorů a přitom otestovat i jejich schopnost chelatovat měďnaté nebo měďné ionty při různých patofyziologicky významných pH. Hematoxylin je indikátor, který vytváří nestabilní komplex s mědí a test není použitelný při nižším pH. Nicméně se dá úspěšně využít při pH 6.8 a 7.5. Dá se použít i při pH 5.5, ale je třeba vzít v úvahu, že afinita hematoxylinu pro měďnaté ionty je při tomto pH relativně nízká. BCS představuje indikátor, který patří mezi chelátory měďných iontů s vysokou afinitou. BCS je specifický pro měďné ionty ve srovnání s jinými ionty. Závěrem lze říci, že daná metodika byla úspěšně otestovaná na příkladu známého chelátoru kliochinolu.

50

8. POUŽITÁ LITERATURA

51

1. Ambrosio G, Zweier JL, Jacobus WE, Weisfeldt ML and Flaherty JT. Improvement of postischemic myocardial function and metabolism induced by administration of deferoxamine at the time of reflow: the role of iron in the pathogenesis of reperfusion injury. Circulation 1987;76(4): 906-15. 2. Bareggi SR, Cornelli U Cliquinol? Review of its mechanisms of action and clinical uses in neurodegenerative disorders. CNS Neurosci Ther 2010; 18(1):41-46 3. Bento I, Peixoto C, Zaitsev VN, Lindley PF. Ceruloplasmin revisited: structural and functional roles of various metal cation-binding sites. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2007;63(Pt 2):240-8. 4. Brewer GJ, Terry CA, Aisen AM, Hill GM Worsening of neurologic syndrome in patients with Wilson´s dinase with initial penicillamine therapy. Arch Neurol 1987; 44(5):490-493 5. Burkhead JL, Gray LW, Lutsenko S. Systems biology approach to Wilson´s disease. Biometals 2011; 24(3): 455-66 6. Clarke W. and Dufour DR, Editors. Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC: Garganta, Inborn Errors of Metabolism. 2006: 425440. 7. Collins JF, Prohaska JR, Knutson MD. Metabolic crossroads of iron and copper. Nutr Rev. 2010; 68(3): 133-47 8. Crouch PJ, Barnham KJ Therapeutic Redistribution of Metal Ions To Treat Alzheimer´s Disease. Acc chem Res 2012; 45 (9): 1604-1611 9. Ding X, Xie H, Kang YJ.. The significance of copper chelators in clinical and experimental application. J Nutr Biochem 2011;22:301–310 10. Ferenci P. Diagnosis and Current Therapy of Wilson's Disease. Medscape from Aliment Pharmacol Ther 2004, 19(2):157-165

52

11. Fernandes J, Saudubray JM, Berghe G, Walte, J. Diagnostika a léčba dědičných metabolických poruch. Praha: Triton, 2008; 517-519 12. Goodman VL, Brewer GJ, Merajver SD. Control og copper status for cancer therapy. Curr Cancer Drug Targets. 2005;5(7):543-9 13. Hashem E, Seleim M, El-Zohry A Spectrophotometric determinativ of copper (II) in pharmaceutical, biological and water samples by 4-(2´-benzothioazolylazo)salicylicacid. J Appl Spectr 2011; 78(4):586-593 14. Hynek B. Co prozradí oči. Regenerace 2009;4. 15. Chevion M, Jiang Y, Har-El R, Berenshtein E, Uretzky G and Kitrossky N. Copper and iron are mobilized following myocardial ischemia: possible predictive criteria for tissue injury. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90(3): 1102-6. 16. Kazuko S, Masaru M. Structure and properties of hematein derivatives. Elsevier Science 1996. 159-169. 17. Kosman DJ Multicopper oxidases: a workshop oncopper coordination chemismy, elektron transfer, and metallophysiology. J Biol Inorg Chem 2010; 15 (1): 15-28 18. Lovell MA, Robertson JD, Teesdale WJ, Campbell JL, Markesbery WR, Copper, iron and zinc in Alzheimer´s disease senile plaques. J Neurol Sci. 1998;158(1):47-52 19. Lutsenko S, Bhattacharjee A, Hubbard AL. Copper handling machinery of the brain. Metallomics. 2010;2(9):596-608 20. Lűllmann H. et al. Farmakologie a toxikologie, Praha: Grada Publishing, a.s., 2004: 607 – 608 21. Mareček Z. Wilsonova choroba. Praha : Galén, 1996, 53–62. 22. Maryon EB, Molloy SA, Zimnicka AM, Kaplan JH. Copper entry into human cells: progress and unanswered questions. Biometals. 2007;20(3-4):355-64.

53

23. Masopust J. a Průša R. Patobiochemie metabolických drah. Univerzita Karlova 2004, 190−192 24. Mladenka P, Macakova K, Filipsky T et al. In vitro analysis of iron chelating aktivity of flavonoids. J Inorg Biochem 2011; 105 (5): 693-701 25. Muller P, van Bakel H, van de Sluis B, Holstege F, Wijmenga C, Klomp LW. Gene espressiv profilig of liver cells after copper overload in vivo and vitro revers new copper-regulated genes. J Biol Inorg Chem. 2007;12(4):495-507 26. Oliveri V, Giuffrida ML, Vecchio G, Aiello C, Viale M Gluconjugates of 8hydroxyquinolines as potential anti-cancer prodrugs. Dalton Trans 2012; 41 (15): 4530-4535 27. Pan Q, Kleer CG, Van Golen KL et al. Copper deficiency induced by tetrathiomolybdate suppresses tumor growth and angiogenesis. Cancer Res. 2002, 62, 4854-4859. 28. Parolini I, Federici C, Raggi C. et al. Microenvironmental pH Is a Key Factor for Exosome Traffic in Tumor Cells. The journal of biological chemistry. 2009: 3421134222. Published online September 30, 2009. 29. Price KA, Crouch PJ, White AR. Therapeutic treatment of Alzheimer´s dinase using metal complexing agents. Recent Pat CNS Drug Discov. 2007; 2(3):180-7 30. Racek J, et al. Klinická biochemie. Praha: Galén – Karolinum, 1999; 137 31. Steindl P, Ferenci P, Dienes HP, et al. Wilson’s disease in patients presenting with liver liver disease: a diagnostic challenge. Gastroenterology 1997; 13: 221–228. 32. Trojan S et al. Lékařská fyziologie, Praha: Grada Publishing, a.s., 2003; 398-399 33. Tümer Z, Møller. LB Menkes disease. Eur J Hum Genet. 2010; 18(5): 511–518 34. Wardman P, Candeias LP. Fenton Chemistry: an introduction, Radiat. Res. 1996; 145: 523-531

54

35. Wiggelinkhuizen M, Tilanus ME, Bollen CW, Houwen RH Systematic review: clinical efficacy of chelator agents and zinc in the initial treatment of Wilson Disease. Aliment Pharmacol Ther 2009; 29 (9):947-958

55

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra farmakologie a toxikologie. Standardizace metodiky pro in vitro stanovení

Recommend Documents