UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE IZOLACE ROSTLINNÝCH ORGANEL A STUDIUM TRANSPORTNÍCH DĚJŮ

Izolace rostlinných organel a studium transportních dějů

Dana Kettnerová

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

KATEDRA FARMAKOGNOZIE

IZOLACE ROSTLINNÝCH ORGANEL A STUDIUM TRANSPORTNÍCH DĚJŮ Diplomová práce

DANA KETTNEROVÁ

Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Jan Martin, Ph.D.

Hradec Králové 2015


Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jiřina Spilková, CSc. Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Jan Martin, Ph.D. Datum zadání: 26. 9. 2012 Datum odevzdání: 14. 8. 2015 Datum obhajoby: 14. 9. 2015 Oponent diplomové práce:

Dana Kettnerová


Dana Kettnerová

Prohlášení „Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“ V Hradci Králové dne 14. 8. 2015 ………………………….. Dana Kettnerová


Dana Kettnerová

Poděkování Děkuji svému školiteli PharmDr. Janu Martinovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a konzultace, které mi poskytl při vypracování této diplomové práce.


Dana Kettnerová

Obsah 1

ÚVOD ................................................................................................................... 8

2

CÍL PRÁCE....................................................................................................... 10

3

METODIKA PRÁCE ....................................................................................... 11

4

SEZNAM SYMBOLŮ A ZKRATEK ............................................................. 12

5

TEORETICKÁ ČÁST ...................................................................................... 15 5.1

Charakterizace rostlinné buňky ................................................................... 15

5.2

Buněčná stěna .............................................................................................. 15

5.2.1

Charakterizace buněčné stěny .............................................................. 15

5.2.2

Složení buněčné stěny .......................................................................... 16

5.2.3

Komunikace zprostředkovaná buněčnou stěnou .................................. 17

5.2.4

Typy buněčné stěny.............................................................................. 17

5.2.5

Jednotlivé složky buněčné stěny .......................................................... 19

5.2.5.1 Polysacharidy ................................................................................... 19 5.2.5.1.1 Celulóza ...................................................................................... 19 5.2.5.1.2 Hemicelulózy .............................................................................. 19 5.2.5.1.3 Pektiny ........................................................................................ 21 5.2.5.1.4 Kalóza ......................................................................................... 22 5.2.5.2 Proteiny ............................................................................................ 22 5.2.5.3 Organické látky ................................................................................ 24 5.2.5.4 Anorganické látky ............................................................................ 26 5.2.6

Funkce buněčné stěny .......................................................................... 26

5.2.7

Izolace buněčné stěny .......................................................................... 26

5.2.7.1 Příklad izolace buněčné stěny .......................................................... 28 5.3

Cytoplazmatická membrána – plazmalema ................................................. 28

5.3.1

Definice ................................................................................................ 28

5.3.2

Funkce plazmalemy ............................................................................. 29

5.4

Protoplast ..................................................................................................... 30

5.4.1

Definice ................................................................................................ 30

5.4.2

Využití .................................................................................................. 31

5.4.3

Izolace protoplastů ............................................................................... 32

5.4.3.1 Mechanická izolace .......................................................................... 32 5.4.3.2 Enzymatická izolace ......................................................................... 33 5


Dana Kettnerová

5.4.3.2.1 Historie........................................................................................ 33 5.4.3.2.2 Provedení enzymatické izolace ................................................... 34 5.4.3.2.3 Výhody a limity enzymatické izolace ......................................... 35 5.4.3.2.4 Faktory ovlivňující izolaci .......................................................... 35 5.4.3.2.5 Purifikace protoplastů ................................................................. 40 5.4.3.2.6 Vyhodnocení úspěšnosti izolace ................................................. 42 5.4.3.2.7 Stanovení výtěžnosti izolace ....................................................... 43 5.4.3.2.8 Příklady enzymatických izolací .................................................. 43 5.5

Chloroplasty ................................................................................................ 47

5.5.1

Definice ................................................................................................ 47

5.5.2

Izolace .................................................................................................. 49

5.5.3

Souhrn .................................................................................................. 71

5.5.3.1 Složky izolačního a resuspendačního pufru ..................................... 72 5.5.3.2 Izolace detailní příklad ..................................................................... 73 5.6

Vakuoly ....................................................................................................... 76

5.6.1

Definice ................................................................................................ 76

5.6.2

Funkce vakuoly .................................................................................... 77

5.6.2.1 Zachování homeostázy cytoplasmy.................................................. 77 5.6.2.2 Zásobní funkce ................................................................................. 77 5.6.2.3 Odpadní, detoxifikační funkce ......................................................... 78 5.6.2.4 Zprostředkování interakcí................................................................. 78 5.6.2.5 Funkce lysozomálního kompartmentu, význam pro vodní hospodářství a růst buněk ................................................................................ 78 5.6.3

Výskyt látek ve vakuolách a jejich význam pro rostlinnou buňku ...... 78

5.6.3.1 Meziprodukty buněčného metabolismu ........................................... 78 5.6.3.2 Anorganické ionty ............................................................................ 79 5.6.3.3 Rezervní sacharidy ........................................................................... 79 5.6.3.4 Rezervní bílkoviny ........................................................................... 79 5.6.3.5 Sekundární metabolity ...................................................................... 79 5.6.3.6 Hydrolytické enzymy ....................................................................... 79 5.6.4

Izolace vakuol ...................................................................................... 79

5.6.5

Souhrn .................................................................................................. 92

6

DISKUSE ........................................................................................................... 93

7

ZÁVĚR .............................................................................................................. 96 6


Dana Kettnerová

8

POUŽITÁ LITERATURA A ZDROJE ......................................................... 97

9

ABSTRAKT .................................................................................................... 108

10

ABSTRACT ................................................................................................. 109

7


1

Dana Kettnerová

ÚVOD Již od pradávna se lidé učili používat jednotlivé rostliny buď jako zdroje potravy

pro sebe či pro svá domácí zvířata nebo jako léčivé rostliny využitelné pro léčbu nejrůznějších nemocí. Nemůžeme zapomenout na úlohu rostlin jako zdroje pro textilní materiál. Naši předkové však neměli o mnohém využití rostlin, tak jak je známe dnes, ani potuchy. My už v dnešní době známe struktury rostlinné buňky velmi detailně a umíme toho využívat. Víme o obsahu látek v jednotlivých rostlinných druzích, z nichž jsme již celou řadu schopni syntetizovat chemicky. Nicméně tomuto období předcházelo období domněnek, pokusů a omylů. Pojem buňka byl poprvé použit v 17. století Robertem Hookem, který pozoroval pomocí primitivně vyrobeného mikroskopu buňky korku. Zásadní posun však přinesl až objev mikroskopu Antoni van Leeuwenhoekem v roce 1665. Mikroskopem byla otevřena brána do mikrosvěta. Leeuwenhoek byl tímto světem fascinován a své mikroskopické preparáty zachycoval i pomocí kreseb. Následovaly další vědecké a technické objevy. Vývoj nových přístrojů poskytl lepší podmínky pro vědeckou činnost a tak se počátkem 20. století začaly množit vědecké objevy. Přístroje ještě nebyly dostatečně přesné, takže o přesné analýze nemohla být řeč. I proto vznikala řada konfliktů mezi vědci, neboť jedni se domnívali, že učinili důležitý objev, pro který mají důkazy. Jiná skupinka však vzápětí přišla s diametrálně odlišným závěrem a bylo to tvrzení proti tvrzení. Přesnější vědecká práce mající vypovídající hodnotu byla umožněna až s vývojem nových a spolehlivých metod a přístrojů. Syntéza chemikálií, přesné analytické, chromatografické a další metody umožnily podrobnější studium rostlinné buňky. Jednotlivé části rostlinné buňky jsou dnes detailně popsány, je známa jejich stavba i chemické složení, což usnadňuje přípravu izolačních postupů. Pro řadu rostlinných struktur jsou již známy izolační postupy zaručující poměrně vysokou výtěžnost požadované struktury a otevírají možnosti ke studiu fyziologických i patologických procesů v rostlinné buňce, genetické manipulaci, ovlivnění procesů uskutečňovaných v rámci rostlinné buňky, včetně ovlivnění produkce velmi specifických sloučenin nacházejících se v rostlinné buňce a to sekundárních metabolitů. Sekundární metabolity jsou farmaceuticky cenné látky, a proto probíhá v této oblasti intenzivní výzkum s cílem porozumět jejich syntéze, faktorům syntézu ovlivňujícím, jejich transportům. Znalost izolačních metod jednotlivých organel 8


Dana Kettnerová

rostlinné buňky může v tomto výzkumu pomoci. Díky izolaci jednotlivých organel mohou být pomocí výzkumu in vitro pochopeny transportní procesy, přesně lokalizována kumulace jednotlivých látek, potvrzen výskyt jednotlivých enzymů a jejich charakterizace, studovány podmínky vedoucí k optimální syntéze sekundárních metabolitů apod.

9


2

Dana Kettnerová

CÍL PRÁCE Tato diplomová práce s názvem „Izolace rostlinných organel a studium

transportních dějů“ se zabývá popisem jednotlivých rostlinných buněčných organel a struktur, jejich funkcí a postupy, které umožňují jejich izolaci. Cílem práce bylo: 1. Zjistit informace o struktuře a funkci jednotlivých organel rostlinné buňky 2. Seznámit se s postupy využívanými pro izolaci těchto organel 3. Vyhodnotit jednotlivé izolační postupy na základě četnosti jejich použití 4. Zhodnotit využití jednotlivých izolačních metod

10


3

Dana Kettnerová

METODIKA PRÁCE Zpracování této diplomové práce se skládalo z několika fází. Nejprve byly

prohledány

abstraktové

a

fulltextové

internetové

databáze:

ScienceDirect,

Google Scholar, PubMed, Plant Physiology, ResearchGate, Web of Science a Springer, pomocí kterých bylo vyhledáno co největší množství informací týkajících se metod určených k izolaci jednotlivých částí rostlinné buňky. Na základě tohoto předběžného „průzkumu“ bylo vytipováno několik rostlinných buněčných struktur, u nichž bylo k dispozici dostatečné množství odborných článků a zároveň se jevily jako zajímavé i z hlediska farmaceutického. Další fází bylo vyhledání informací o jednotlivých strukturách. O jejich stavbě, funkci a následně o metodách využívaných pro jejich izolaci. K tomu bylo využito uvedených zdrojů a internetového vyhledávače Google. Byla snaha seřadit izolační metody chronologicky, případně podle prováděných modifikací či rostlinného druhu použitého při izolaci. Nakonec bylo provedeno zhodnocení jednotlivých izolačních metod, jejich kladů, záporů a omezení. Případně faktorů ovlivňujících izolaci a zhodnocení jednotlivých složek roztoků využívaných při izolaci a ovlivňujících stabilitu izolovaných struktur.

11


4

Dana Kettnerová

SEZNAM SYMBOLŮ A ZKRATEK

ADP

adenosindifosfát

AgNO3

dusičnan amonný

AGPs

arabinogalaktanové proteiny

ATP

adenosintrifosfát

BSA

hovězí sérový albumin

Ca2+

vápenaté ionty

CaCl2

chlorid sodný

CaCO3

uhličitan vápenatý

Ca(H2PO4)2

dihydrogenfosforečnan vápenatý (superfosfát)

CAM

Crassulacean Acid Metabolism (metabolismus kyselin u tučnolistých)

CHAPS

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1propansulfonát (detergent)

CH3COOH Cl

-

kyselina octová chloridové ionty

CO2

oxid uhličitý

CPW

promývací roztok pro buňku a protoplast

DEAE-dextran

diethylaminoethyl

DNA

deoxyribonukleová kyselina

DTE

dithioerythritol

DTT

dithiotreitol

GRPs

proteiny bohaté na glycin

EDTA

kyselina ethylendiamintetraoctová

EGTA

kyselina ethylen-glykol-tetraoctová

FDA

fluorescein diacetát

HCl

kyselina chlorovodíková

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina

HMS pufr

pufr skládající se z HEPES, MgSO4 a sorbitolu

HRGPs

glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin

HS pufr

pufr skládající se z HEPES a sorbitolu

HSA

lidský sérový albumin (human serum albumin)

Hyp4

4-hydroxyprolin 12


Dana Kettnerová

K+

draselné ionty

KHCO3

hydrogenuhličitan draselný

K2HPO4

hydrogenfosforečnan draselný

KOH

hydroxid draselný

KCl

chlorid draselný

Lys

lysin

MES

kyselina 2-(N-morfolino)ethan sulfonová

MgSO4

síran hořečnatý

MgCl2

chlorid hořečnatý

MnCl2

chlorid manganatý

MS médium

Murashige a Skoog médium

MTT

3-(4,5–dimethylthiazol–2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid

MW

molekulová hmotnost

Na+

sodné ionty

Na2CO3 NADP

+

uhličitan sodný nikotinamidadenindinukleotidfosfát

NaHCO3

hydrogenuhličitan sodný

NaCl

chlorid sodný

NaClO2

chloritan sodný

NaNO3

dusičnan sodný

NO3-

dusičnanové ionty

Na4P2O7.10 H2O

dekahydrát difosforečnou tetrasodného

PEG

polyethylenglykol

PMSF

fenylmethylsulfonyl fluorid

PPi

anorganický pyrofosfát

Pro4

4-prolin

PRPs

proteiny bohaté na prolin

Pn

polymerizační stupeň

PVP

polyvinylpyrrolidon

PVPP

polyvinylpolypyrrolidon

Ser

serin

SiO2

oxid křemičitý

TAE

tris acetát 13


TBE

tris–borátový pufr

Tricin

N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycin

Tris

trisaminomethan

Tyr

tyrosin

UV záření

ultrafialové záření

14

Dana Kettnerová


5

Dana Kettnerová

TEORETICKÁ ČÁST

5.1

Charakterizace rostlinné buňky Rostlinné buňky se, spolu s buňkami prvoků, řas, hub, rostlin a živočichů,

řadí mezi buňky eukaryotní. Jedná se o buňky, které se na Zemi objevily o tři miliardy let později než buňky prokaryotní. 1) Rostlinná buňka se skládá z buněčné stěny a protoplastu. Povrch protoplastu je tvořen cytoplazmatickou membránou. Protoplast obsahuje cytoplazmu, v té se nachází jádro (nukleus), buněčné organely (ribozomy, plastidy, mitochondrie) a soustava membrán (tzv. endomembránový systém - Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum, vezikulární útvary). Mezi vezikulární útvary patří např. vakuoly, lysozómy, mikrotělíska, peroxyzómy, glyoxyzómy. Funkčně jsou tyto útvary velmi různorodé, vzhledově jde o drobné váčky s membránou na povrchu. 3) 4) Základní strukturou cytoplazmy jsou cytosol a cytoskelet, zvnějšku je cytoplasma ohraničena plazmatickou membránou (plazmalemou). 2) 3) Cytoskelet zajišťuje na buněčné úrovni pohyb a zároveň tvoří opěrnou soustavu buňky. Skládá se z vláknitých a trubičkovitých bílkovinných útvarů. Jedná se o mikrotubuly, mikrofilamenta a intermediální filamenta. Tyto útvary jsou tvořeny bílkovinami tubulinem, aktinem a myozinem. (2) (4) Cytosol tvoří převážnou část vnitřního prostředí buňky, v němž jsou rozptýleny organely a membránová soustava buňky. Jedná se o základní nestrukturovanou substanci, tvořenou zejména vodou (75–85 %), organickými a anorganickými látkami, bílkovinami (10-20 %), lipidy (2-3 %), sacharidy (1 %) a řádově 1 % popelovin. (Přibližné obsahy jsou platné u vyšších rostlin). 2) 5.2 5.2.1

Buněčná stěna Charakterizace buněčné stěny Buněčná stěna je vnější strukturou rostlinné buňky. Tuto strukturu obsahují,

s výjimkou některých řas a spermatických, někdy i vaječných, buněk cévnatých rostlin, všechny rostlinné buňky. Právě buněčná stěna odlišuje buňku rostlinnou od buňky živočišné. Buněčná stěna vzniká jako výsledek činnosti zejména Golgiho aparátu. Hemicelulózy a pektiny jsou syntetizovány přímo v cisternách Golgiho aparátu. Glykoproteiny jsou částečně syntetizovány v drsném endoplazmatickém retikulu 15


Dana Kettnerová

(bílkovinná část glykoproteinů), jejich syntéza je dokončena glykosylací v cisternách Golgiho aparátu. Odtud jsou všechny zmíněné stavební jednotky buněčné stěny ve vezikulech transportovány k plazmalemě, s kterou splývají a dostávají se do prostoru buněčné stěny. K biosyntéze celulózy však dochází přímo v místě vzniku budoucí mikrofibrily. K syntéze potřebný enzym celulózosyntáza je součástí plazmalemy. Nízkomolekulární prekurzory celulózy jsou transportovány z cytoplazmy. Buněčná stěna je ve většině případů prakticky zcela propustná. Může však být i nepropustná, jak je tomu např. u zkorkovatělých buněčných stěn korku, či částečně propustná např. u některých buněk endodermis primární kůry stonků a kořenů. 1) 2) 3) 4) 7) 5.2.2

Složení buněčné stěny Buněčná stěna se skládá z celulózových mikrofibril a amorfní matrix. Její

struktura je přirovnávána k železobetonu. Celulózové mikrofibrily zde představují železné pruty a amorfní složky odpovídají betonové výplni. Ve stavbě buněčné stěny existují taxonomické rozdíly, rovněž se liší složení primární a sekundární stěny. Buněčná stěna je u všech rostlinných buněk složena ze dvou vrstev – střední lamely a primární stěny. Střední lamela vzniká v ontogenezi z přepážky (tzv. buněčné destičky) mezi dceřinými buňkami splýváním váčků odškrcených z Golgiho komplexu. Tyto váčky obsahují látky pektinové povahy. Z pektinů převládají pektiny kyselé povahy. Hlavní složkou kyselých pektinů je kyselina galakturonová, která vytváří řetězce homogenní nebo heterogenní. Homogenní řetězce jsou tvořeny pouze z molekul kyseliny galakturonové, u heterogenních řetězců jsou přítomny kromě molekul kyseliny galakturonové též molekuly dalších sacharidů, např. rhamnózy. Na snížení rozpustnosti střední lamely a především na zvýšení její pevnosti se podílejí vápenaté a hořečnaté ionty. Tyto ionty se váží v jednotlivých řetězcích na volné karboxylové skupiny kyseliny galakturonové, čímž řetězce propojí a zvýší celkovou pevnost střední lamely. Ke střední lamele se dostředivě přikládá primární stěna, která sílí přikládáním dalšího materiálu, jako jsou pektiny, celulóza či hemicelulóza. U některých buněk se jako produkt sekundárního růstu vytváří další vrstva - tzv. sekundární stěna. Nejprve

16


Dana Kettnerová

dochází k ukládání přechodné lamely. K této lamele se následně přikládají lamely sekundární stěny. Buněčnou stěnu tvoří čtyři skupiny polymerů: celulóza, proteiny, pektin a hemicelulózy. Minoritně se vyskytuje kalóza. 1) 2) 3) 4) 7) 5.2.3

Komunikace zprostředkovaná buněčnou stěnou K propojení a možnosti vzájemné komunikace jednotlivých buněk slouží

tzv. plazmodezmy. Jedná se o kanálky o průměru přibližně 50 nm, kterými procházejí cytoplazmatické spoje, jež propojují sousedící protoplasty. Tento vzájemně propojený protoplazmatický celek, díky němuž může docházet k transportu látek mezi buňkami, nazýváme symplast. Velikost plazmodezmů je značná, mají však limitovanou, a pravděpodobně i regulovatelnou, propustnost. Počet plazmodezmů na jednu buňku může být velký (až 10000), některé buňky však nemusí plazmodezmy obsahovat vůbec. Tento jev nepropojenosti s ostatními buňkami je však u rostlin velmi ojedinělý. Jednotlivé prostory mezi mikrofibrilami a micelami celulózy tvoří dohromady tzv. apoplast, tedy kontinuum propojených prostor buněčných stěn. Díky tomuto kontinuu dochází k transportu látek nejen v rámci tohoto kontinua, ale i k povrchu protoplastu. Tato transportní dráha se nazývá apoplastická dráha. Volně se zde mohou pohybovat voda a molekuly látek bez elektrického náboje, jejichž molekula je menší než velikost pórů v buněčné stěně. Komplikovanější je to však v případě iontů, neboť u těch dochází k interakcím se strukturou buněčné stěny. Např. u kyselých pektinů dochází k interakci s disociovanými karboxylovými skupinami kyseliny galakturonové. 1) 2) 3) 4) 7) 5.2.4

Typy buněčné stěny Rozlišujeme dva typy buněčné stěny – primární a sekundární. Tyto typy se

navzájem liší nejen stavbou, ale i chemickým složením. Primární buněčnou stěnu najdeme u buněk rostoucích, vzniká přidáváním nových mikrofibril mezi mikrofibrily již existující. Mikrofibrily utváří síť, která je pro primární buněčnou stěnu charakteristická. Růst buněčné stěny vyžaduje rozvolnění struktury (regulace fytohormonem auxinem), zvýšený příjem vody buňkou,

intenzivnější

respiraci

a

v neposlední

proteinů. 1) 2) 3) 4) 7)

17

řadě

zvýšení

syntézy


Dana Kettnerová

Primární buněčná stěna je dostatečně mechanicky odolná, zároveň však umožňuje dostatečnou expanzi buňky v případě zvýšení vnitřního tlaku, čímž zabraňuje jejímu prasknutí. 48) Matrix primární stěny je velmi hydratovaná a skládá se z hemicelulóz, pektinů a bílkovin. V matrix stěny jsou uloženy celulózové mikrofibrily. Obsah celulózy v primární buněčné stěně je přibližně 20 % suché hmotnosti stěny. Sekundární stěna se nachází u buněk již nerostoucích a zvětšuje se pouze tloustnutím, tedy přikládáním nových vrstev. Sekundární stěna se ukládá dostředivě, díky čemuž dochází k značnému zmenšení lumen buňky. Rigidita sekundární stěny je dána absencí pektinů a značným podílem celulózy (40 %, např. u trichomů bavlníku však až 90 %). V sekundární stěně chybí glykoproteiny, které naopak tvoří značný podíl struktury primární stěny. Přítomny jsou hemicelulózy a bílkoviny, které však nejsou totožné s těmi ve stěně primární. Velmi důležitou součástí sekundární stěny je lignin. Sekundární stěna se může vytvářet rovnoměrně po celém povrchu primární stěny, nebo jen na některých místech. I při rovnoměrném ukládání na primární stěnu se však vytváří neztloustlá místa, která se zpravidla vyskytují v místě plazmodezmů a zabezpečují neporušení kontinuity symplastu. I přes značné tloustnutí si sekundární stěna zachovává jistou míru pružnosti. Ukládání dalších anorganických či organických látek do buněčné stěny nebo na její povrch může značně měnit vlastnosti stěny. Častým procesem je lignifikace (dřevnatění). Při lignifikaci je do prostor buněčné stěny ukládána organická látka lignin (dřevovina). Sekundární stěna je důležitá zejména u specializovaných buněk, které mají zpevňující funkci a jsou zásadní pro vedení vody. U těchto buněk se již zpravidla nenachází protoplast, který po utvoření sekundární stěny většinou zcela odumírá. Specializované buňky, jedná se zejména o vodivé elementy xylému, nabývají plné funkčnosti až po odumření protoplastu. 1) 2) 3) 4) 7)

18


5.2.5

Dana Kettnerová

Jednotlivé složky buněčné stěny

5.2.5.1 Polysacharidy 5.2.5.1.1 Celulóza Celulóza je polysacharid skládající se z molekul D-glukózy (β1→4), určuje architekturu buněčné stěny. Její molekuly jsou uspořádány do micel, které tvoří mikrofibrily široké 10–25 nm. Mikrofibrily jsou stabilizovány intermolekulárními i intramolekulárními vodíkovými můstky. Prostor mezi mikrofibrilami a micelami umožňuje pohyb vody, iontů a malých molekul (např. monosacharidů a oligosacharidů) v rámci buněčné stěny. Mikrofibrily vytvářejí makrofibrily o průměru 0,5 μm a délce až 4 μm. Takto je vytvořena celulózová kostra buněčné stěny, která je prostoupena matrix necelulózových molekul (hemicelulóz, pektinu, proteinů). Pevnost celulózových mikrofibril je obrovská, shodná s pevností ocelového drátu majícího stejný průměr. 1) 2) 3) 4) 7) 43) Vlastnosti mikrofibril, jako je stupeň polymerizace, šířka a krystalinita jsou velmi variabilní a závisí na zdroji a stáří rostlinné tkáně. Stupeň polymerizace celulózy je u primární buněčné stěny poměrně nízký, vyšších hodnot nabývá u sekundární buněčné stěny. Obsah této vláknité komponenty buněčné stěny se u jednotlivých rostlin a jejich částí výrazně liší a může nabývat hodnot od 2–4 % obsahu v buněčné stěně endospermu obilnin až po obsah 94 % v buněčné stěně chlupů semen bavlníku. Studium fyzikálních a chemických vlastností celulózy se zpravidla provádí na frakci, která zůstane po extrakci buněčné stěny vodnými chelatačními činidly a silnými zásadami. Jedná se o frakci tzv. α–celulózy. Pokud se jedná o lignifikované rostlinné tkáně, je často v postupu vedoucímu k izolaci frakce α–celulózy zahrnut krok využívající extrakci pomocí NaClO2 a CH3COOH. Frakce α–celulózy vždy obsahuje glykoprotein extenzin a některé neglukózové zbytky. 43) 5.2.5.1.2 Hemicelulózy Jedná se o skupinu heterogenních polysacharidů, jejichž základní kostru tvoří monosacharidové jednotky propojené β-(1→4) glykosidickou vazbou v ekvatoriální konfiguraci.

Skupina

hemicelulóz

zahrnuje

xyloglukany,

xylany,

manany,

glukomanany a β-(1→3, 1→4)–glukany. U všech suchozemských rostlin se v buněčné stěně vyskytují všechny zmíněné skupiny až na β-(1→3, 1→4) - glukany, 19


Dana Kettnerová

které se vyskytují pouze u řádu Poales a u několika dalších rostlin. Mezi jednotlivými rostlinnými druhy a rostlinnými tkáněmi nalezneme velké rozdíly v detailní struktuře a množství vyskytujících se hemicelulóz. Jejich nejdůležitějším přínosem pro buněčnou stěnu je její posílení pomocí interakcí s celulózou, popř. i ligninem.

Hemicelulózy

jsou

syntetizované

v Golgiho

aparátu

pomocí

glukosyltranferáz. Většina hemicelulóz může být extrahována alkalickou extrakcí. 49)

Xyloglukany Xyloglukany

jsou

v rostlinných

buňkách

nejčastěji

se

vyskytující

hemicelulózy. Byly nalezeny u každého rostlinného pozemského druhu s výjimkou oddělení Charophyta (parožnatky). Tvoří přibližně 20 % suché váhy buněčné stěny u dvouděložných rostlin a 2 % u jednoděložných rostlin. Poprvé byly xyloglukany izolovány a popsány v roce 1961 (Kooiman). Molekula xyloglukanu je tvořena z polysacharidu celulózy (tvořeného jednotkami

β – D - (1→4) – glukózy) a

jednotkami D - xylopyranózy v postranních řetězcích, na kterou mohou být eventuálně navázány další substituenty. Jednotky xylózy jsou na molekuly glukózy vázány α - (1→6) glykosidickými vazbami. 4) 43) 44) 45) 49)

Xylany Jedná se o velmi rozmanitou skupinu polysacharidů, jejichž společným rysem je výskyt polysacharidového řetězce tvořeného monosacharidovými jednotkami xylózy propojenými β-(1→4) glykosidickými vazbami. Obvyklou modifikací xylanů je substituce glukuronosylovými a 4

O – methyl glukuronosylovými zbytky

vázanými α-(1→2) vazbou. Takto substituované xylany jsou známy pod názvem glukuronoxylany a jsou hlavní složkou necelulózových polysacharidů sekundární buněčné stěny dvouděložných rostlin. U commelinidů (mezi ně se řadí i obsáhlý řád Poales) patřících mezi jednoděložné rostliny tvoří xylany přibližně 20 % primární buněčné stěny a představují hlavní necelulózové polysacharidy buněčné stěny. Struktura těchto xylanů obvykle obsahuje zbytky arabinózy navázané na základní polysacharidový řetězec a tak se tyto xylany označují jako arabinoxylany a glukuronoarabinoxylany. Většina xylanů je v různé míře acetylována, zejména pak xylany v buněčných stěnách dvouděložných rostlin.

20


Dana Kettnerová

Manany a glukomanany Jedná se o polysacharidy, jejichž řetězec je tvořen molekulami manózy vázanými navzájem β-(1→4) glykosidickými vazbami. Jejich kostru tvoří buď samotná manóza (manany, galaktomanany) či manóza a glukóza (glukomanany a galaktoglukomanany). Manany a glukomanany jsou často acetylovány. β-(1→3, 1→4)–glukany β-(1→4) vázané glukany střídané jednotlivými β-(1→3) vazbami jsou známy u travin. Tyto glukany mají v primární buněčné stěně důležitou roli při expanzi buňky. Jejich množství v buněčné stěně je závislé na vývojové fázi buňky. β - (1 → 3, 1 → 4) – glukany se nachází u řádu Poales, rodu Equisetum, oddělení Charophyta, u kmene Rhodophyta (ruduchy), jejich výskyt se předpokládá i u játrovek. Tyto glukany se nevyskytují u dvouděložných rostlin. 49) 5.2.5.1.3 Pektiny Pektiny jsou heterogenní polysacharidy obsahující velké množství zbytků kyseliny galakturonové. Kyselina galakturonová tvoří průměrně 70 % struktury pektinů. Skupina pektinů zahrnuje homogalakturonan, rhamnogalakturonan I a substituované galakturonany rhamnogalakturonan II a xylogalakturonan. Pektiny tvoří přibližně 35 % struktury primární stěny dvouděložných a jednoděložných rostlin s výjimkou lipnicovitých, 2–10 % primární buněčné stěny travin a dalších commelinidů a až 5 % stěn dřevnatých pletiv. Pektiny se hojně vyskytují v buněčných stěnách obklopujících rostoucí a dělící se buňky, ve stěnách buněk měkkých částí rostliny, ve střední lamele a buněčných rozích. Pektiny jsou též přítomny v místech sloužících k propojení buňky se sekundární buněčnou stěnou, jako je xylém a vláknité buňky dřevnatého pletiva. Tvoří složku buněčné stěny všech vyšších rostlin, stěny nahosemenných, kapraďorostů, mechorostů a rodu Chara. Pektiny hrají pravděpodobně důležitou roli ve stavbě a funkci primární i sekundární buněčné stěny a jejich izolace se ukazuje jako klíčová pro pochopení jejich struktury a funkce. Tyto znalosti jsou následně využitelné při modifikaci struktury buněčné stěny, což je výhodné například ke zvýšení produkce biopaliv z odolné rostlinné lignocelulózové biomasy. 21


Dana Kettnerová

Pektiny se podílejí na růstu a vývoji rostlin, morfogenezi, obranyschopnosti, vzájemné buněčné adhezi, struktuře buněčné stěny, buněčné signalizaci, expanzi buňky, pórovitosti stěny, vazbě iontů, hydrataci semen, opadávání listů. Pektiny se rovněž využívají jako želatinizující a stabilizující látky v potravinářském a kosmetickém průmyslu. Mají pozitivní vliv na zdraví člověka, např. snižují hladinu cholesterolu a glukózy, podporují imunitu. Využití zaznamenávají i ve výrobě speciálních produktů jako jsou jedlé a biodegradovatelné filmy, adheziva, pěny, změkčovadla, povrchové modifikátory pro lékařské přístroje, materiály pro biomedicínskou implantaci, materiály určené pro podání léku. 50) Jsou též schopny vázat Mg 2+ a Ca 2+. 51) Pektiny se snadno extrahují kyselinou za horka nebo chelatačními činidly. Některé pektiny však mohou být extrahovány pouze alkalicky (např. plavuně), což je důvod, proč je definování pektinů podle extrahovatelnosti nepřesné. 49) 5.2.5.1.4 Kalóza Kalóza je nevětvený polymer tvořený z monomerů D–glukózy. Na rozdíl od celulózy jsou však jednotlivé monomery propojeny β(1→3) glykosidickou vazbou. Vlákno kalózy zaujímá díky těmto vazbám helikální strukturu a vytváří duplexy či triplexy.

Kalózu

nalezneme

především

u

specializovaných

buněk

a

v charakteristických fázích vývoje buněčné stěny. Vyskytuje se v sítkách sítkovic, pylových láčkách, podílí se na tvorbě fragmoplastu dělících se buněk. Objevuje se při mechanickém poškození pletiv, kdy brání vniknutí patogenních agens do 51) 52)

buňky.

5.2.5.2 Proteiny HRGPs Jedná se o velice dobře prozkoumanou skupinu glykoproteinů bohatých na hydroxyprolin, jejichž zastoupení je v buněčné stěně největší. V buněčné stěně byly popsány tři skupiny glykoproteinů obsahujících ve své struktuře hydroxyprolin a to lektiny (výskyt pouze u čeledi Solanaceae), arabinogalaktanové proteiny (AGPs) a extenziny. Lektiny a AGPs jsou rozpustné složky buněčné stěny extrahovatelné solemi, zatímco extenziny jsou nerozpustné glykoproteiny, což byl jeden z důvodů, proč bylo zpočátku jejich studium velice obtížné.

22


Dana Kettnerová

Pojem HGRPs se u dvouděložných druhů rostlin používá k popisu extenzinů. Extenziny představují pro buněčnou stěnu největší zdroj prolinu a hydroxyprolinu. 55) Přesto, že jsou jednotlivé součásti buněčné stěny objevovány a zkoumány již poměrně dlouhou dobu (zhruba od 40. let 19. století), extenziny byly objeveny poměrně nedávno. Stalo se tak v roce 1960, kdy Lamport a Northcote izolovali ze suspenzní kultury buněk Acer pseudoplatanus (javoru klene) a kalusové kultury Nicotiana tabacum (tabáku virginského) primární buněčnou stěnu, která obsahovala enzymy a složku bohatou na hydroxyprolin. Přítomnost hydroxyprolinu naznačovala, že se jedná o strukturální protein. Následně byl zkoumán růst buněk javoru klene za přítomnosti

18

O2. Tento experiment prokázal, že je molekulární kyslík přímým

zdrojem kyslíku hydroxylu, což je významný objev vzhledem k tomu, že hydroxyl hydroxyprolinu představuje vazebné místo pro sacharidy. 53) Lamport vyslovil v roce 1965 domněnku, že proteiny buněčné stěny bohaté na hydroxyprolin, které byly provizorně pojmenovány extenziny, jsou zodpovědné za změny plasticity primární stěny buňky. Změna plasticity buněčné stěny umožňuje růst buňky pomocí její expanze. Lamport předpokládal, že pokud se extenziny skutečně podílejí na plasticitě buňky, pak představují řetězce, které propojují jednotlivé polysacharidy. V tom případě by musely být extenzin a polysacharidy propojeny kovalentní vazbou. Tento předpoklad potvrdil v roce 1969 při svém výzkumu prováděném na buněčné stěně izolované z buněk suspenzní kultury rajčete. Při tomto pokusu byly po vhodné enzymatické degradaci buněčné stěny izolovány HRGPs, u kterých byly následně prokázány vazby sacharid–protein, čímž byla potvrzena Lamportova domněnka o kovalentní vazbě mezi extenzinem a polysacharidy. 54) Izolace umožnila též detailní analýzu struktury glykoproteinu, kterou bylo zjištěno, že extenziny obsahují arabinózu, galaktózu, hydroxyprolin a další aminokyseliny (valin, serin, threonin, lysin, tyrosin a isodityrosin). 55) Pro strukturu extenzinů je typická repetice aminokyselinových sekvencí Ser - Pro4

a

Tyr – Lys – Tyr.

propylhydroxyláz

Extenzinový

hydroxylován.

Následná

prolin

je

glykosylace

pomocí probíhá

specifických s největším

úspěchem u proteinu obsahujícího Hyp4. Proteiny obsahující Hyp3/2/1 vykazující nižší stupeň glykosylace. 52) 55) 56) 57)

23


Dana Kettnerová

Zejména díky přítomnosti lysinu mají extenziny bazický charakter. Syntéza extenzinů roste při napadení buňky patogeny či při jejím poranění. Role extenzinů však není prozatím zcela objasněna. 52)

PRPs Další skupinu glykoproteinů představují glykoproteiny bohaté na prolin, které byly identifikovány především pomocí studií využívajících rekombinantní DNA. 55) PRPs postrádají oproti extenzinům aminokyselinovou sekvenci Ser - Pro4. GRPs Jedná se o proteiny bohaté na glycin. Obsah glycinu v peptidovém řetězci může u některých GRPs převyšovat 65 % (rod Petunia). 55)

AGPs Arabinogalaktanové proteiny jsou rozpustné glykoproteiny buněčné stěny s vysokým obsahem sacharidů. Sacharidy tvoří většinou 90–95 % molekuly AGP. Nejčastěji obsahuje struktura AGP sacharidové zbytky galaktózy a arabinózy, v menším množství pak mohou být přítomny zbytky rhamnózy, kyseliny glukuronové a dalších monosacharidů. Sacharidy jsou vázány O–glykosidickou vazbou na hydroxyprolin, serin a threonin. Předpokládá se, že se díky svým agregačním vlastnostem a lepivosti AGPs podílejí na zachycování pylu na blizně a poskytují sacharidové prekurzory pro růst stěny pylové láčky. Rovněž je popsán jejich podíl na udržení vodní rovnováhy v buňce. Možný je i vliv na diferenciaci buněk, který byl pozorován u zárodečných buněk mrkve. 56)

5.2.5.3 Organické látky Lignin Lignin je amorfní výrazně se větvící heteropolymer. Jeho základní stavební jednotky tvoří tři alkoholy s aromatickým jádrem (kumarylalkohol, sinapylalkohol, koniferylalkohol). Stavební jednotky jsou syntetizovány v cytoplazmě, odkud se následně transportem dostávají do buněčné stěny. V buněčné stěně jsou pomocí peroxidáz přeměňovány na reaktivní radikály, které spolu náhodně polymerizují. 24


Vazba

ligninu

v buněčné

stěně

je

chemická.

Dana Kettnerová

Díky

ukládání

ligninu

v mikrokapilárních prostorách stěny dochází k omezení či naprostému potlačení apoplastického transportu. Lignin způsobuje větší pevnost buněčné stěny, zároveň však působí i na snížení její pružnosti. 4) Lignin se vyskytuje v zdřevnatělé sekundární stěně a střední lamele rostlin, výjimečně i v zdřevnatělých primárních buněčných stěnách (např. jehličnany, epidermis cykasů, listnaté dřeviny s tvrdými listy). Představuje 15–35 % sušiny dřeva (ale až 50 % u jehličnanů). Lignin zastává funkci mechanickou (zpevňuje buněčnou stěnu), izolační (zdřevnatělé stěny se stávají nepropustnými pro vodu a plyny) a ochrannou. 51)

Kutin, suberin Kutin, suberin jsou hydrofobní polymery, jejichž stavební jednotky tvoří mastné kyseliny, hydroxykyseliny s dlouhými řetězci a malé množství fenolických látek. Oba polymery se v buněčných stěnách vyskytují v kombinaci s vosky. Díky kombinaci těchto hydrofobních polymerů s vosky se prohlubuje snížení propustnosti buněčné stěny pro vodu. 4) Suberin má chemické složení podobné ligninu. Jeho strukturu můžeme rozdělit na alifatickou a aromatickou část. Alifatickou část tvoří mastné kyseliny, dikarboxylové kyseliny, hydroxymastné kyseliny a vyšší alkoholy. Aromatická část je tvořena deriváty kyseliny hydroxyskořicové. Suberin se nejvíce vyskytuje v sekundárním krycím pletivu – pletivu korkovém. Můžeme ho však nalézt i v dalších rostlinných strukturách, jako jsou např. exodermis, endodermis a Casparyho proužky v kořenech. Plní zpravidla funkci izolační. 4) 51) Kutin je typický pro vnější stěny buněk epidermis prýtu. Je uložen v buněčné stěně buněk epidermis a spolu s vosky vytváří na povrchu buněčné stěny ochrannou vrstvu - kutikulu. 4) Kutin představuje pro buňky izolační a ochranný polymer. 51)

Sporopolenin Z dalších organických látek se může v buněčné stěně nacházet sporopolenin, vyskytující se v buněčné stěně pylových zrn a spor. Představuje směs polymerů skládající se z dlouhých řetězců mastných kyselin, fenylpropanoidů, fenolických látek, karotenoidů. Přesná struktura sporopoleninu nebyla popsána. Jeho funkcí je ochrana buňky před vnějším prostředím. 4) 51) 25


Dana Kettnerová

Vosky Vosky jsou estery vyšších mastných kyselin a vyšších jednosytných alifatických alkoholů. Mastné kyseliny mohou být nasycené i nenasycené Vosky tvoří vnější vrstvu kutikuly a stejně jako kutin mají ochrannou a izolační funkci. 51)

5.2.5.4 Anorganické látky Z anorganických látek se v buněčné stěně vyskytují např. kyselina křemičitá, SiO2, CaCO3 (inkrustace buněčných stěn trav a přesliček). 4)

5.2.6

Funkce buněčné stěny Buněčná stěna zastává pro buňku především funkci ochrannou. Uděluje

buňce a posléze i rostlině tvar, pro rostlinu je podpůrnou strukturou, která jí mimo jiné umožňuje vzpřímenou polohu. Brání prasknutí buňky, chrání ji před napadením patogenními organismy, před vlivy vnějšího prostředí. Její prostor slouží jako zásobárna (např. pro apoplastický vápník, polysacharidy) či místo k uložení odpadních metabolitů a přebytečných minerálních solí. Vytváří bariéru proti úniku vody z rostlinného organismu. Buněčné stěny pak společně vytvářejí systém vodivých pletiv, díky němuž dochází k transportu vody a rozpuštěných minerálních látek v rostlině. Buněčná stěna se též podílí na procesu buněčného dělení, morfogeneze, polarity růstu, přenosu signálů mezi buňkami. 2) 49)

5.2.7

Izolace buněčné stěny Jedním ze základních důvodů pro provádění pokusů o izolaci buněčné stěny

byla snaha zodpovědět otázky týkající se její struktury a složení, které vyvstaly v podstatě ihned po objevení skutečnosti, že se v rostlinné buňce nachází jak buněčná stěna taka cytoplazmatická membrána. Velkou otázkou bylo, zda jsou v rostlinné buněčné stěně přítomny proteiny. V roce 1888 přichází Julius Wiessner s velmi odvážným tvrzením, že buněčná stěna proteiny obsahuje a zároveň, že rostoucí buněčná stěna představuje živou strukturu. Výsledky výzkumů prováděných v následujících letech s cílem získat odpověď na tuto otázku se však různily, stejně jako materiály a metody využívané při snaze izolovat buněčnou stěnu. 26


Dana Kettnerová

Tupper–Carey a Priestley uskutečnili v roce 1924 první izolaci buněčné stěny z meristematického pletiva bobu obecného (Vicia faba). Provedli frakcionaci izolovaných buněčných stěn a jednotlivé frakce (proteiny, pektiny, celulóza, a další) zanalyzovali se závěrem, že buňky zkoumaného meristematického pletiva obsahují buněčnou stěnu, kterou kromě jiných komponent tvoří i proteiny. Výsledky tohoto výzkumu však zpochybnil v roce 1926 Wood, který z histochemických dat vyvodil zcela jiný závěr. Wood tvrdil, že se v celulózových buněčných stěnách nevyskytují žádné proteiny, a pokud ano, pak jejich obsah nepřesahuje 0,001 %. Výsledky izolací dalších vědců výskyt proteinů v buněčné stěně spíše potvrzovaly. Bohužel však nikdo z nich nedokázal stoprocentně zaručit, že tyto proteiny náleží buněčné stěně a nejedná se o kontaminanty pocházející z cytoplazmy. Díky tomu rostla potřeba objevit takové metody, které by umožnily odlišit specifické proteiny buněčné stěny od kontaminujících proteinů pocházejících z cytoplazmy. Úplně prvním krokem tak byla snaha o popsání metod, které by umožnily izolaci požadované subcelulární struktury. Pro izolaci buněčné stěny lze teoreticky využít přibližně čtyři metody, mezi které se řadí: selektivní extrakce (enzymatická či chemická), autolýza, osmotická lýza buňky, prasknutí buňky a následná diferenciální centrifugace jejích subcelulárních struktur. Nejméně náročná na provedení je posledně zmíněná metoda zakončená diferenciální centrifugací. 47) Jedním z důvodů proč i nadále roste ve vědě zájem o izolaci buněčné stěny s navazující možností detailnějšího studia skladby a funkce buněčné stěny je snaha nalézt takové rostliny, které budou vhodným zdrojem pro produkci biopaliva, zároveň však budou využitelné jako krmiva pro hospodářská zvířata. K nalezení takovéto plodiny je třeba správného vyhodnocení vlastností a z toho vyplývající teoretické využitelnosti, při čemž se vědec bez předchozí detailní znalosti buněčné stěny neobejde. Pro biopaliva mohou být využitelné traviny a to hned několika způsoby. Mohou se použít jako zdroj sacharidů využitelných pro následnou fermentaci vedoucí k získání ethanolu, dále k přímému vzniku energie prostřednictvím spalování anebo získáním využitelného oleje pyrolýzou. Zvyšování obsahu ligninu v buněčné stěně vede k většímu zisku energie prostřednictvím přímého spalování, zároveň však vyšší obsah ligninu snižuje vzniklé množství ethanolu při fermentaci a

27


Dana Kettnerová

využitelnost plodiny jako krmiva pro užitková zvířata. Obsah ligninu hraje zcela zásadní roli ve využitelnosti biomasy. 46) Poznatky získané izolací a následným studiem skladby buněčných stěn mají svůj význam i v oblasti nutrice lidí a zvířat. A díky obsahu přírodních vláken v buněčné stěně též v textilním a papírenském průmyslu. 48)

5.2.7.1 Příklad izolace buněčné stěny Izolace buněčné stěny Hatfield R. D. a kol. 2009 Do 50 ml centrifugačních zkumavek bylo naváženo 5 g zmražených vzorků stonků C3 a C4 travin. Rozmražené vzorky byly třikrát suspendovány v pufru (50 mM TAE, pH 6,7, 2,5 ml/g vzorku), sonikovány 10 min. a centrifugovány při 3200 x g 20 min. Pufrový extrakt byl oddělen od nerozpustného rezidua. Všechny tři pufrové extrakty byly spojeny dohromady, zmraženy v tekutém dusíku a až do využití pro stanovení rozpustných fenolů skladovány při –80 °C. Ke každému nerozpustnému reziduu byl přidán TAE pufr (50 mM, pH 6,7). Vzorky byly umístěny do vodní lázně o teplotě 90 °C. Po 2 hod. k nim byla pro odstranění škrobů přidána α–amyláza a amyloglukosidáza a byly přemístěny na 2 hod. do vodní lázně o teplotě 55 °C. Do každé zkumavky byl přidán 90 % ethanol tak, aby byla koncentrace ethanolu ve zkumavce 80 %. Vzorky byly zamíchány a centrifugovány 15 min. při 3200 x g. Nerozpustná rezidua, která zůstala po extrakci škrobů, byla z důvodu odstranění cytoplazmatických kontaminant intenzivně promývána (1 ml rozpouštědla na gram čerstvé rostlinné tkáně) sérií rozpouštědel: 80 % ethanol (dvakrát), chloroform:methanol (2:1, jedenkrát) a aceton (třikrát). Každé promytí zahrnovalo 10 min. sonikaci, centrifugaci (3200 x g po dobu 15 min.) a odstranění rozpouštědla. Závěrečné nerozpustné reziduum (buněčné stěny) bylo vysušeno vzduchem v digestoři a následně podrobeno strukturální analýze. (46) 5.3 5.3.1

Cytoplazmatická membrána – plazmalema Definice Plazmalema je dynamická buněčná struktura o tloušťce 5–10 nm, která

odděluje cytoplazmu od buněčné stěny. 2)

28


Dana Kettnerová

Velmi důležitou událostí, která umožnila studium struktury biologické membrány, se stal vynález mikroskopu - 1676 Anton van Leeuwenhoek. Od 17. století mohla díky využití mikroskopu vznikat řada modelů membrány, které postupně vedly až k objevení modelu fluidní mozaiky, jehož autory jsou Singer S. J. a Nicolson G. L. Spolu s uveřejněním modelu fluidní mozaiky byla též autory vyslovena domněnka o tekutosti lipidové dvojvrstvy, v níž se proteiny pohybují volně. Šlo o vůbec první model, který propojil do společného modelu v té době existující teorie o lipidové dvojvrstvě a membránových proteinech. S tím souvisel i nový vhled na problematiku membránových kanálů a popisu transportních dějů uskutečňovaných v buněčných membránách. 8) Plazmalema se skládá z dvojité vrstvy lipidů s proteiny. Lipidy jsou zastoupeny třemi třídami. Jedná se o glycerofosfolipidy, sfingolipidy a steroly. Většina lipidů se nachází ve formě fosfolipidů, nejvíce jsou zastoupeny: fosfatidylcholin,

fosfatidylethanolamin,

fosfatidylinositol,

fosfatidylserin. 8)

Samotnou strukturu membrány tvoří tak, že jejich nepolární části směřují k sobě a polární hlavičky směřují do vnějšího prostředí, stejně jako dovnitř buňky. Proteiny mohou v membráně zaujímat různá postavení. Mohou být v dvojité vrstvě zabudovány (tzv. integrální proteiny), nebo se mohou vyskytovat na povrchu (periferní proteiny). 2)

5.3.2

Funkce plazmalemy Plazmalema představuje velmi selektivní bariéru mezi okolním a vnitřním

prostředím buňky, z čehož vyplývá její důležitost pro existenci a správné fungování rostlinné buňky. Její hlavní rolí je regulace přenosu látek a signálů mezi vnitřním a vnějším prostředím buňky, stejně jako mezi jejími jednotlivými částmi. Zajišťuje kontrolu nad permeabilitou buňky, volnou difuzí látek rozpustných ve vodě, zasahuje do procesů absorpce, sekrece a exkrece. Skrze plazmalemu je regulován přenos signálů v rámci pletiv, orgánů a celého organismu. Díky propojení s buněčnou stěnou a cytoskeletem má podíl na integraci mechanických a chemických signálů. Dále vykazuje enzymatickou činnost, je tedy schopna štěpit některé substráty. Podílí se na tvorbě buněčné stěny, syntetizuje její základní složky. Pro většinu transportních procesů uskutečňovaných skrze plazmalemu je rozhodující transmembránový protonový gradient. 2) 29


5.4

Dana Kettnerová

Protoplast Pojem protoplast použil poprvé Hanstein v roce 1880 k pojmenování živé

hmoty ohraničené rostlinnou buněčnou membránou. 18) 5.4.1

Definice Protoplast je silně nehomogenní útvar, na jehož povrchu se nachází

cytoplazmatická membrána (plazmalema). Jedná se v podstatě o buňku bez buněčné stěny, což je důvod, proč bývá někdy protoplast označován termínem „nahá buňka“. Protoplast se využívá při popisu buněk rostlinných, bakteriálních a buněk hub zbavených buněčné stěny. 4) 5) 6) 14) U rostlin je protoplast tvořen protoplazmou („živou“ částí buňky) a útvary neprotoplazmatickými („neživou“ částí buňky“). Protoplazmu můžeme dále rozčlenit na cytoplazmu, karyoplazmu (protoplazma buněčného jádra), plastidoplazmu (protoplazma plastidů) a chondrioplazmu (protoplazma mitochondrií). Karyoplazma je charakteristická vysokým obsahem nukleoproteinů. Na povrchu je karyoplazma ohraničena jadernou blánou (karyotékou). Karyotéka je perforovaná a odděluje karoplazmu od cytoplazmy. Skrz karyotéku je realizován transport bílkovin (histonů a enzymů) nutných pro syntézu DNA a RNA. V opačném směru probíhá transport nukleových kyselin z karyoplazmy do cytoplazmy. Cytoplazma zahrnuje Golgiho aparát, ribozomy, cytoskelet a endoplazmatické retikulum. Mezi neprotoplazmatické útvary, které mohou (zejména díky vakuole) tvořit významnou část rostlinných buněk, řadíme

vakuoly, intracisternální fáze

(mezimembránový prostor plastidů a mitochondrií, vnitřní fáze Golgiho aparátu, endoplazmatického retikula), nejrůznější krystaly, zásobní látky (škrobová zrna, tukové krůpěje, bílkovinné globule) a vnitřní prostory organel. 4) 5) 6) Vnější plazmatická membrána protoplastu je plně vystavena podmínkám vnějšího prostředí a je zároveň jedinou bariérou mezi vnějším a vnitřním prostředím buňky. 18) Protoplasty jsou totipotentní buňky, které mohou za předpokladu vhodných chemických a fyzikálních stimulů regenerovat novou buněčnou stěnu. Díky vzniku buněčné stěny jsou následně schopny mitotického dělení, vzniku dceřiných buněk a za příhodných podmínek v tkáňové kultuře i regenerace celé nové rostliny. 10) 14) Zvýšený zájem o protoplasty byl zaznamenán díky značným pokrokům v genomice, proteomice a metabolice. Z důvodu velmi unikátní využitelnosti pro širokou škálu 30


Dana Kettnerová

experimentálních procedur se staly předmětem zájmu mnoha vědců. 10) V současné době jsou známy spolehlivé metody pro izolaci a kultivaci protoplastů z široké škály rostlin, jednoděložných i dvouděložných. Schopnost protoplastů a buněk odvozených z protoplastů vyjádřit svou totipotenci a vyvinout se ve fertilní rostlinu ovlivňuje několik parametrů. Mezi ně patří zejména: zdrojová tkáň, kultivační medium a vlivy okolního prostředí. Nové přístupy snažící se o maximalizaci efektivity systémů, při nichž je z protoplastu následně získávána fertilní rostlina, zahrnují již dobře známé a využívané techniky u buněk mikrobiálních a živočišných. Jedná se například o techniky jako je elektrostimulace, vystavení protoplastů povrchově aktivním látkám a nosičům dýchacích plynů, zejména pak perfluorochemikáliím a hemoglobinu. I přes 50 let intenzivního celosvětového výzkumu však zůstávají rostlinné druhy, u nichž se izolace a následná kultivace nedaří. 10)

5.4.2

Využití Protoplasty jsou využitelné při genetické manipulaci rostlin, somatické

hybridizaci, při šlechtění rostlin. Skrze jejich fúzi je umožněna úplná či částečná kombinaci jaderného a cytoplazmatického genomu, což umožňuje obejít bariéry přirozeně se vyskytující sexuální inkompatibility na mezidruhové a mezirodové úrovni.

Je

možné

získat

v extrajaderných genech.

asymetrické

hybridy

a

rostliny

heterozygotní

10) 15)

Příjem izolované DNA do protoplastů poskytuje základ pro tranzientní (přechodnou) a stabilní jadernou transformaci, pro transformaci organel a následné vytvoření transplastomických rostlin. 10) Z protoplastu mohou být také izolovány jednotlivé organely, což umožňuje zkoumat vnitrobuněčný transport metabolitů mezi jednotlivými vnitřními částmi rostlinné buňky. 19) Izolované protoplasty jsou využívány i v mnoha rozličných studiích zahrnujících funkci membrán, buněčné struktury, syntézu farmaceutických produktů, toxikologické hodnocení, studium transportních dějů a expresi genů. 10) 15) V roce 2001 byla provedena studie na pohance Fagopyrum esculentum Moench. Pohanka je rostlina akumulující ve svém těle hliník. Tato studie měla objasnit mechanismus detoxikace hliníku. Pomocí protoplastů a vakuol izolovaných z listů pohanky pěstovaných hydroponicky v roztoku hliníku, bylo zkoumáno, kde je hliník kumulován. Studie pomocí

13

Al–NMR prokázala vysokou přítomnost hliníku 31


Dana Kettnerová

v protoplastu (více než 80 % celkového hliníku obsaženého v listech) a to v podobě hliníko-oxalátového komplexu (v poměru 1:3) lokalizovaného ve vakuole. Předpokládá se tedy, že detoxikace hliníků probíhá pomocí tvorby komplexu s oxalátem a separací do vakuol. (31)

5.4.3

Izolace protoplastů Izolace protoplastů může být uskutečněna mechanicky nebo enzymaticky.

5.4.3.1 Mechanická izolace Pro tento typ izolace mohou být využity buňky zásobních pletiv rostlin. Tyto buňky bývají zpravidla hodně vakuolizovány. K izolaci jsou vhodné např. šupiny cibule, pletivo řepy, pletivo ředkvičky. 18) Vůbec první mechanickou izolaci provedl v roce 1892 Klercker z tkáně jednoděložné rostliny čeledi Hydrocharitaceae – Stratiotes aloides L. Jednalo se o mikrochirurgické provedení mechanické izolace. 16) 17) 33) Nejprve byla provedena v osmotickém roztoku plazmolýza pletiva, následoval mikrořez ostrou čepelí mezi buněčnou stěnou a protoplastem, čímž došlo k uvolnění nepoškozeného protoplastu. 18) 20) 21) Metoda mechanické izolace však měla několik nevýhod. Jednak poskytovala velmi malý výnos a pak bylo její použití omezené pouze na ty typy pletiv, které obsahovaly vakuolizované buňky. Těmito omezeními se stala metoda ve větším měřítku prakticky nevyužitelnou a věda čekala na objev metody jiné. 16) 18) Zlomovou událostí byl objev enzymů trávících buněčnou stěnu. Jednalo se o pektinázu, hemicelulázu a celulázu izolovanou z hub. 16) Mechanická metoda však může být užitečná v případě, že se u enzymatické metody vyskytnou nežádoucí účinky spojné s lytickými enzymy degradujícími buněčnou stěnu. Díky těmto nežádoucím účinkům může docházet např. k poškození protoplastu, snížení jeho životaschopnosti. V tomto případě je vhodnější využít metodu mechanickou. 18)

32


Dana Kettnerová

5.4.3.2 Enzymatická izolace 5.4.3.2.1 Historie První enzymatickou izolaci protoplastů z vyšších rostlin provedl v roce 1960 Cocking.

32)

K degradaci buněčné stěny využil E. C. Cocking celulázu izolovanou

z houby Myrothecium verrucaria. Protoplasty izoloval z kořenové čepičky rostliny rajčete Lycopersicon esculentum Mill. aplikací extraktu hydrolytického enzymu celulázy. 16) 18) Z důvodu vysoké výtěžnosti se metoda enzymatické izolace stala brzy metodou pro izolaci protoplastů preferovanou. Za předpokladu zachování příslušných podmínek poskytuje chemická metoda u řady rostlinných druhů možnost následné kultivace a regenerace buněčné stěny či podmínky pro provedení genetické manipulace. 18) Po objevu enzymatické izolace, byly realizovány další izolace protoplastů pomocí různých enzymatických přípravků a to z široké škály rostlinných druhů. Od první chemické izolace uplynulo téměř deset let, než byly enzymatické přípravky dostupné komerčně. Rozdíl mezi jednotlivými komerčními přípravky je především v jejich čistotě. Prvně byl využit komerční enzymatický přípravek v roce 1968. Výzkumný tým započal výzkum zaměřený na izolaci protoplastů z mezofylu tabákových listů. Po testování řady komerčně dostupných přípravků lytických enzymů a s tím souvisejícího testování podmínek dostatečné izolace protoplastů se současným zachování jejich životaschopnosti, vyvinul tento tým metodu izolace protoplastů z mezofylu tabákových listů. Metoda umožnila izolaci protoplastů v množství dostačujícím pro biochemické experimenty. Jednalo se o významný výzkum, neboť to byla vůbec první izolace protoplastů z rostliny tabáku. Navíc se mezofyl listů ukázal jako velice dobrý zdroj protoplastů. Nejen dobře dostupný, ale i s vysokou výtěžností. Metoda izolace protoplastů se sestává z dvoukrokového působení enzymů. V prvním kroku jsou listy tabáku macerovány v pektináze a dochází k uvolnění buněk palisádového a houbového parenchymu. K takto izolovaným buňkám je v dalším kroku přidána celuláza. 12) Zprvu se jednalo o neaseptickou izolační metodu, z důvodu dlouhodobějšího zachování kultury izolovaných protoplastů však byla v roce 1970 popsána metoda aseptická. 35)

33


Dana Kettnerová

Byl také studován vývojový potenciál protoplastů, podmínky, za kterých dochází u protoplastů k tvorbě buněčné stěny, tvorba kolonií v agaru a případná regenerace celé rostliny. V roce 1971 byla poprvé v historii z protoplastu regenerována celá rostlina (Nicotiana tabacum L.). 35) 36) 37) V roce 1968 však byla objevena i jednokroková metoda. Power a Cocking provedli výzkum, při němž prokázali, že lze při izolaci protoplastů použít dva enzymy najednou. 25) 34) V roce 1969 proběhl další výzkum, který se zaměřil na množení viru tabákové mozaiky uvnitř protoplastu získaného z mezofylu listu tabáku. Uvnitř protoplastu docházelo k velice intenzivnímu množení viru, proto byly tyto izolované protoplasty prohlášeny za materiál velice vhodný pro experimentální účely. Viry byly do tohoto systému naočkovány s efektivitou, které nebylo u jiných rostlinných modelů využívaných ke studiu virů nikdy dosaženo. Protoplasty mezofylu tabáku tedy poskytly materiál vhodný pro objasnění zásadních kroků provázejících virovou infekci a pro studium množení rostlinných virů. 38) Roku 1972 byl získán mezidruhový hybrid. Vznikl fúzí protoplastů Nicotiana glauca a Nicotiana langsdorffii. 16) 39) Zkřížení dvou rostlinných druhů, které by nemohlo být realizováno sexuální hybridizací, bylo uskutečněno v roce 1978. Fúzí protoplastů Solanum tuberosum L. a Solanum lycopersicum L. vznikly dva hybridy. Jeden z nich měl chloroplasty Solanum tuberosum L., druhý chloroplasty Solanum lycopersicum L. 16) 40)

5.4.3.2.2 Provedení enzymatické izolace Rozlišujeme dvě metody enzymatické izolace: jednokrokovou a dvoukrokovou. Jednokroková (simultánní) metoda Jednokroková metoda je využívána pro izolaci protoplastů častěji než metoda dvoukroková. Její provedení je rychlejší, díky menšímu množství prováděných kroků je zároveň menší riziko kontaminace. Mechanicky rozvolněné pletivo je vystaveno směsi enzymů (pektinázy a celulázy, jedná se o komerčně dostupné přípravky). U každé použité rostlinné části musí být provedena optimalizace enzymatické směsi a tlaku extrakčního média.

34


Dana Kettnerová

Dvoukroková (sekvenční) metoda Dvoukroková izolační metoda se skládá ze dvou kroků. 1.krok Za pomoci komerčně dostupných enzymatických preparátů (macerozym nebo pektináza) dochází k uvolnění jednotlivých buněk z pletiva. Jednotlivé buňky se uvolňují díky degradaci středních lamel a následnému rozpadu pletiva. 2.krok Za pomoci celuláz (celuláza Onozuka R-10, cellulysin) dochází k rozpuštění buněčné stěny jednotlivých volných buněk a uvolnění protoplastu. Doba setrvání buněk v enzymatické směsi je kratší než v případě jednokrokové izolace. 16) 18) 25) V současné době jsou k dispozici standardní a obecné postupy enzymatické izolace a kultivace protoplastů, které však musejí být dle jednotlivých druhů a variet upřesňovány. Většinou se izolační a kultivační optimum stanovuje empiricky. 16) 22) 5.4.3.2.3 Výhody a limity enzymatické izolace Výhody enzymatické izolace K výhodám enzymatické izolace patří snadná izolace velkého množství protoplastů, přítomnost menšího osmotického zmenšení. Další výhodou oproti mechanickým metodám je větší šetrnost k buňkám, takže tolik nedochází k poškození protoplastů 23) Limity enzymatické izolace Mezi limity enzymatické reakce je počítána využitelnost metody pouze pro buňky s nezdřevnatělou buněčnou stěnou (zdřevnatělá buněčná stěna je vůči enzymům rezistentní) 16)

5.4.3.2.4 Faktory ovlivňující izolaci Fyziologický stav pletiva, buněčný materiál Buňky pro izolaci protoplastů lze získat z kalusové kultury, suspenzní kultury a rostlinné tkáně. Rostlinnou tkáň vhodnou pro izolaci protoplastů můžeme získat z nejrůznějších rostlinných druhů a jejich částí (řapíky, kořeny, plody, hypokotyl, stonek, embryo, mikrospory, okvětní lístky, palisádový parenchym listu, kořenová špička). 15) 16) 19)

35


Dana Kettnerová

Široké spektrum potencionálních zdrojů protoplastů však bohužel nezaručuje izolaci protoplastů schopných nepřetržitého dělení a následné regenerace rostliny. Z tohoto důvodu je množství dále využitelných protoplastů (a tedy i jejich zdrojů) stále omezené. 22) Nejvhodnější pro izolaci jsou buňky málo diferencované, např. embryonální či meristematické. Opakovaně bylo pozorováno, že izolace z mladých pletiv poskytuje větší množství životaschopných protoplastů než izolace ze staršího pletiva. 14) 22) Velký potenciál pro regeneraci rostliny z protoplastu byl pozorován u protoplastů izolovaných z buněk mezofylu listu či buněk suspenzních kultur. 26) Mají-li být jako zdroj protoplastů využity buňky rostlinného pletiva, využívají se zpravidla mladé listy příslušné rostliny. U těchto listů je nejprve provedena sterilizace. Poté je, pokud to jde, odstraněna epidermální vrstva buněk. Následně je mezofyl vystaven roztoku připravených enzymů (celuláza, případně hemicelulóza, pektináza), které umožní trávení buněčné stěny a odstranění střední lamely. Není-li odstranění epidermální vrstvy možné, mohou se listy nakrájet na malé proužky (cca 1 mm2), čímž dojde k obnažení vrstvy mezofylu. V tomto případě je následně vhodné využít vakuovou infiltraci, díky které mohou enzymy dobře proniknout do buněk listu. Po odstranění vakua se kousky listu potápějí a uvolňují protoplasty. Následuje izolace pomocí filtrace a centrifugace. Tato metoda má výhodu v poměrně velkém výnosu protoplastů za relativně krátký čas. Toto platí pro simultánní metodu. V případě metody sekvenční se nejprve přidává roztok celulázy nebo hemicelulázy, čímž dojde k trávení buněčné stěny a až v dalším kroku se využije macerační enzym (pektináza). 19) 26) Výše uvedené oloupání epidermální vrstvy buněk, které se po oloupání nechávají plavat na hladině enzymatického roztoku tak, aby byla oloupaná vrstva v kontaktu s enzymatickým roztokem a krájení listů na malé kousky s využitím vakuové infiltrace se řadí mezi metody pre-enzymatických úprav. Jako další příklad je možné uvést kartáčování listu měkkým kartáčkem či břitem skalpelu, které též zlepší následné působení enzymu. K odstranění horní vrstvy epidermis může být využita též kutináza. Všechny tyto metody vedou k lepšímu průniku roztoku enzymu či enzymů, což je žádoucí především z hlediska úspěšnosti izolace. 25) K výhodám použití mezofylu jako zdroje protoplastů řadíme vysokou výtěžnost (pravděpodobně díky dobrému přístupu enzymů k buněčné stěně, který je 36


Dana Kettnerová

způsoben poměrně volným uspořádáním buněk mezofylu) a také fakt, že po odebrání materiálu potřebného k izolaci nemusí být matečná rostlina zklikvidována. 18) Protoplasty obilovin a trav jsou s velkým úspěchem izolovány ze suspenzních kultur zárodečných buněk. 22) Úspěšná izolace protoplastů je mimo jiné významně ovlivněna fyziologickým stavem rostlin. Proto je nutné při jejich růstu, ať už se jedná o rostliny pěstované na poli, ve skleníku či in vitro, dbát na kontrolu vnějších podmínek. Důležité je především udržování příslušné teploty a světla. Semena in vitro pěstovaných rostlin jsou povrchově sterilizována, následně se nechají klíčit na agarovém mediu, z kterého jsou přenesena do kultivačního média. Poté je důležité provádět pravidelnou subkultivaci. 16)

Enzymy Schopnost enzymů degradovat buněčnou stěnu a uvolnit protoplasty je závislá na vlastnostech a složení příslušného enzymového roztoku. Podmínky vhodné pro izolaci protoplastů a složení enzymatického roztoku se určují zpravidla empiricky. Izolace protoplastů je obvykle prováděna při teplotě 25–28 °C. Enzymatickému působení mohou být buňky vystaveny krátkodobě (po dobu dvou až šesti hodin) nebo dlouhodobě, působením přes noc (dvanáct až dvacet hodin). Faktory ovlivňující účinnost enzymatického roztoku: koncentrace enzymů, doba působení, pH enzymatického roztoku, teplota, poměr množství enzymatického roztoku k objemu rostlinné tkáně. Výběr enzymů se řídí složením buněčné stěny. Buněčná stěna obsahuje tři hlavní složky: celulózu, hemicelulózu a pektin. 16) 18) 22) Stáří, genotyp a fáze diferenciace pletiva, které bude sloužit jako materiál pro izolaci protoplastů, určují, jaká kombinace a koncentrace enzymů bude použita. 28) U mnoha druhů, zejména pokud jsou protoplasty izolovány přímo z explantátů, může být prospěšná krátkodobá plazmolýza. Plazmolýza zahrnuje jednohodinovou inkubaci v solném roztoku obsahujícím stejné osmotikum, jako obsahuje enzymová směs. Plazmolýza je vhodná k udržení životaschopnosti protoplastů a redukci spontánní fúze. 22) Používané enzymy můžeme rozdělit od dvou skupin:

37


Dana Kettnerová

Enzym pektináza Enzym pektináza je enzym degradující střední lamelu. Střední lamela je složena z pektinu a spojuje jednotlivé buňky. Tedy v případě rozpuštění střední lamely dochází i k oddělení jednotlivých buněk. Enzymy celuláza a hemiceluláza Enzymy celuláza a hemiceluláza slouží k trávení složek primární a sekundární buněčné stěny, kterými jsou celulóza a hemicelulóza. Díky těmto dvěma enzymům může dojít k uvolnění protoplastu. 16) 18) Po uvolnění protoplastů dochází k čištění a filtraci enzymů. 16) Další složky přidané k roztoku enzymů Látky upravující osmotické podmínky Jelikož při odstranění buněčné stěny dochází i k odstranění potřebného osmotického tlaku, je třeba ho nahradit. V opačném případě by plazmolytický roztok vyvolal nejen stres rostlinné buňky, ale mohlo by dojít až k prasknutí protoplastu. 16) 29) 30) Osmotický potenciál je třeba upravit v každém prostředí, se kterým přijde protoplast po izolaci do styku. Tedy v roztocích účastnících se izolace protoplastu (enzymatický roztok, promývací roztok) a v kultivačním médiu. Pro úpravu osmotického potenciálu byly testovány látky iontové a neiontové povahy. V současné době se nejčastěji provádí úprava osmotického tlaku přidáním mannitolu, glukózy, sorbitolu či sacharózy. 26) Nejvíce využívané jsou sorbitol a mannitol. 25) V případě použití neionogenní látky k stabilizaci osmotického potenciálu se do enzymového roztoku přidávají často soli, zejména CaCl2 (50–100 mmol/l). Tento přídavek vede ke stabilizaci plazmatické membrány. 25) Optimální osmotický potenciál by se měl pohybovat v rozmezí 470–700 mOsm. Vyšší osmotický potenciál může inhibovat dělení protoplastu, zároveň je však prevencí jeho prasknutí. 16) 24) Zajištění potřebných osmotických podmínek během izolace, čištění a kultivace protoplastů je zcela zásadní pro stabilitu, životaschopnost a pozdější schopnost růstu protoplastu spojenou s regenerací celé rostliny. 16) 24) 26) V průběhu desítek let byla zkoumána využitelnost celé řady solutů (osmotik) jako je KCl, směs NaCl a CaCl2, glukóza s malým množstvím KCl a CaCl2, sacharóza, mannitol, CaCl2 a KCl, sorbitol a NaNO3. Kritéria pro vhodnost použití 38


Dana Kettnerová

daného solutu zahrnovala stabilitu protoplastu, mikroskopicky detekovatelnou životaschopnost protoplastu, schopnost fúze a specifickou hodnotu gravitace roztoku solutů podobnou hodnotě gravitace protoplastů. 30) Ruesink A. W. v roce 1978 zkoumal příjem a inkorporaci radioaktivního leucinu buňkami suspenzní kultury Convolvulus arvensis L. Studie byla prováděna za různých osmotických podmínek a jejím cílem bylo stanovit, jaký vliv má osmotický stres na buňku a která osmotika jsou využitelná pro stabilizaci protoplastu. K buňkám byla v prvním případě přidána směs mannitolu, sorbitolu a sacharózy, v druhém případě CaCl2 a KCl, vše v koncentracích běžně využívaných k stabilizaci protoplastů. Příjem leucinu byl inhibován o 50 až 60 % a inkorporace o 37 %. Mezi směsi obou skupin osmotik nebyl prakticky rozdíl. NaNO3 má podobnou osmotickou sílu, způsobil však podstatně vyšší inhibici. Žádné z osmotik nezměnilo unikání proteinů a leucinu z pletiva. Obecně vnější koncentrace solutů pod 0,36 osmol/l slabě zvýšila příjem a inkorporaci leucinu. S postupně se zvyšující koncentrací solutů příjem a inkorporace leucinu lineárně klesaly. Během plazmolýzy buňky nenastala žádná patrná změna v postupném poklesu příjmu a inkorporaci leucinu. Cykloheximid inhiboval příjem i inkorporaci leucinu při všech testovaných osmotických podmínkách. Jednotlivé enzymatické preparáty s celulázou se významně lišily ve vlivu na příjem a inkorporaci leucinu. 30) Látky upravující pH Pro minimalizaci změn pH a tím zvýšení stability izolovaných protoplastů se používají vápenaté anorganické soli a organické pufry (např. MES, Tris). Pufry zbraňují poklesu pH, které může při trávení pletiva nastat, a udržují pH na hodnotě 5, 5–6. 16) 29) 41) Látky chránící před nežádoucími účinky nečistot a uvolněných hydrolytických enzymů Další problém vzniká uvolňováním hydrolytických enzymů z poškozených nebo lyzovaných buněk během působení roztoku enzymů. Hydrolytické enzymy mohou poškozovat ostatní buňky a již uvolněné protoplasty. Proto jsou do roztoku přidávány látky eliminující tyto nežádoucí účinky a zároveň i nežádoucí účinky kontaminantů (jedná se zpravidla o proteiny) obsažených v samotných komerčních

39


Dana Kettnerová

enzymatických přípravcích. Toto využití má např. dextran sulfát draselný (zpravidla v koncentraci 0,5 %), BSA či PMSF. 29) 41)

Antioxidanty Dále mohou být přidávány antioxidanty, např. PVP mající pozitivní vliv na životaschopnost protoplastů, zejména pak genotypů vzdorujících enzymatickému působení. Pro izolaci protoplastů z pletiv, zejména z mezofylu listů různých druhů opadavých dřevin, se využívá přídavek 1 % PVP-10 (MW=10000). PVP-10 je pro izolaci životaschopných protoplastů nepostradatelný. 29)

5.4.3.2.5 Purifikace protoplastů Po inkubaci vzniká v baňce směs uvolněných protoplastů spolu s nestrávenými buňkami, poškozenými protoplasty a zbytky buněk v enzymovém roztoku. Tyto nečistoty je třeba oddělit a získat čisté protoplasty, které bude možno dále kultivovat. 24) 22) V průběhu let bylo zkoumáno několik metod purifikace. Jako nejúspěšnější se ukázala dnes nejčastěji využívaná metoda čištění průchodem přes několik sít, následovaná centrifugací a resuspendací protoplastů v promývacím roztoku. 22) Enzymový roztok s protoplasty je filtrován přes nylonové nebo kovové sítko (30-100 μm, závisí na velikosti protoplastu). Filtrem neprojdou nestrávené buňky, buněčné shluky a vodivé tkáně. Filtrát obsahující protoplasty a zbytky buněk (vakuoly, plastidy, zásobní krystaly) je centrifugován takovou rychlostí, aby došlo k sedimentaci

většiny

protoplastů,

zatímco

kousky

buněk

zůstanou

stále

suspendovány. Obvykle se centrifugace provádí 5–10 min. při 100 x g. Supernatant obsahující malé zbytky je vyhozen. Pelet je resuspendován v promývacím mediu (obsahuje soli a osmotikum) a opět centrifugován (50 x g, 3–5 min.). Centrifugace a promývání se mohou opakovat (obvykle třikrát), dokud nejsou získány čisté protoplasty. 29) 25) Pro roztoky protoplastů obsahující velké množství buněčného odpadu (zejména pro protoplasty mezofylu listů) je možné přidat krok s flotací. Protoplasty jsou po filtraci přes síto a po promytí, které slouží k odstranění zbytků enzymového roztoku, promíchány s 21 % sacharózou v roztoku CPW solí a centrifugovány (10 min. při 100 x g). Prstenec čistých protoplastů nalezneme na spojení bloku 40


Dana Kettnerová

sacharózy a suspenzního média protoplastů, zatímco buněčný odpad se nachází u dna centrifugační zkumavky. Protoplasty se pomocí Pasteurovy pipety opatrně odeberou do další centrifugační zkumavky. Následuje resuspendace v promývacím médiu a opakovaná centrifugace, stejně jako v předchozím případě. Promývání se uskutečňuje třikrát. Nakonec jsou protoplasty suspendovány do kultivačního média o vhodné hustotě. 22) 25) Ca2+ ionty přidané do promývacího média zvyšují stabilitu membrány protoplastu. 16) Výhodou této metody je využití roztoku o stejné osmotické hodnotě v průběhu izolace i purifikace protoplastů, čímž se předchází jakékoli možné záměně roztoků vedoucí následně k osmotickému stresu protoplastů. S úspěchem je tato metoda využívána u suspenzních a kalusových kultur mnoha druhů rostlin. 29) Protoplasty mají oproti ostatním organelám a ostatním částem buňky poměrně malou hustotu, čehož se využívá k jejich separaci pomocí gradientu roztoku či hustých roztoků (např. sacharóza). K roztoku sacharidu (0,3–0,6 M roztok sacharózy) či alkoholického cukru (nejčastěji sorbitol) je přidána enzymová směs protoplastů s buněčnými zbytky. Za použití 3-10 min. centrifugace, jejíž rychlost se zjišťuje empiricky, dochází k oddělení protoplastů od zbytku buněčného obsahu a odpadu. Protoplasty se nachází v oddělené horní vrstvě, kterou lze bez problémů odebrat. Rychlost centrifugace je zpravidla 350 x g pro odolnější protoplasty, např. druhů Nicotiana Solanum a 100 x g pro méně odolné protoplasty, např. Lycopersicum, Prunus, Pyrus. Z dalších látek je k tvorbě hustotního gradientu využitelný polysacharid Ficoll, 6 % roztok navrchu, pod ním 9 %. Ficoll je rozpuštěn v MS médiu spolu se 7 % roztokem sorbitolu. Následuje 5 min. centrifugace při 150 x g. Ficoll byl využit k izolaci protoplastů z mrkve, tabáku a dalších protoplastových systémů. Pro tvorbu diskontinuálního gradientu jsou vhodné vysokomolekulární látky Percoll a Ficoll, jejichž výhodou je, že oproti sacharóze nevyvolávají osmotické změny, což vede k zisku více životaschopných protoplastů. Nevýhodou této metody je nutnost opakované resuspendace v promývacím roztoku a centrifugace, což může vést k poškození křehčích protoplastů. 29)

41


Dana Kettnerová

5.4.3.2.6 Vyhodnocení úspěšnosti izolace Vizualizace zbytků buněčné stěny Ke kultivaci mohou být použity pouze čisté preparáty protoplastů prosté jakýchkoli zbytků a nestrávených buněk. V případě nečistot by byla ohrožena následná regenerace buněčné stěny, buněčné dělení i regenerace celé rostliny. Z tohoto důvodu jsou suspenze izolovaných protoplastů kontrolovány. Kontrola protoplastů se může uskutečňovat několika způsoby. První ze způsobů je nepřímé vyhodnocení, tedy kontrola tvaru protoplastů. Protoplasty musí mít sférický tvar. Spolu s tím nesmí být při pozorování protoplastů pod mikroskopem pozorován dvojlom. Přesnější je však využití fluorescenčních agens. Z fluorescenčních agens se využívá Calcofluor white (0,1 %) vykazující při přítomnosti zbytků buněčné stěny pod UV světlem modrou fluorescenci a Tinapol, který v případě přítomnosti buněčných stěn (prokazuje přítomnost celulózy) vykazuje pod fluorescenčním mikroskopem žlutou fluorescenci. 22) 29) Určení životaschopnosti protoplastů I pro určení životaschopnosti protoplastů je možné využít několik metod: pozorování cytoplazmatického proudění jako indikátoru probíhajícího aktivního metabolismu protoplastu (nevýhoda: z důvodu velkého množství periferních chloroplastů nevyužitelné pro protoplasty mezofylu), příjem kyslíku měřený kyslíkovou elektrodou jako důkaz buněčného dýchání, fotosyntetická aktivita a barvení pomocí: FDA, Evansovy modři (neporušená membrána zabrání vstupu Evansovy modři do protoplastu) 25), fenosafraninu (neprojde přes plazmatickou membránu živých protoplastů), methylenové modři (v živých protoplastech dochází k její redukci na žluté barvivo) a MTT (živými protoplasty je metabolizován na formazanové barvivo). 14) Molekuly FDA samy fluorescenci nevykazují. Procházejí však přes plazmatickou membránu protoplastu do cytosolu, kde dochází pomocí esteráz k štěpení, čímž se uvolňuje fluorescein. Fluorescein již nemůže projít plazmatickou membránou zpět a tak živé protoplasty vykazují při fluorescenční mikroskopii za použití modrého světla zelenožlutou fluorescenci. Zatímco neživé protoplasty zůstávají nezabarvené. 22)

42


Dana Kettnerová

5.4.3.2.7 Stanovení výtěžnosti izolace Stanovení se provede pomocí Bürkerovy komůrky. Následně se protoplasty naředí kultivačním médiem na optimální hustotu (asi 5x104-106/ml média). 14) 5.4.3.2.8 Příklady enzymatických izolací Takebe I., Nagata T. a kol., 1968 Výzkum zaměřený na aseptickou izolaci a kultivaci protoplastů palisádového parenchymu tabáku virginského (Nicotiana tabacum L.). Materiál Rostliny Nicotiana tabacum L., kultivar Xanthi a Xanthi nc, použity mohou být i další kultivary. Do 15 cm květináčů byly zasazeny sazenice o velikosti přibližně 5 cm. Květináče obsahovaly směs rašeliníku a vermikulitu v poměru 2:1, která se nacházela v horní a dolní třetině. V prostřední části byla vrstva přibližně 15 g chemického hnojiva. Hnojivo se skládalo ze směsi AgNO3, Ca(H2PO4)2 a KCl v poměru 2:3:1. Po 2 týdnech růstu se na povrch půdy přidaly 3 g chemického hnojiva. Pěstování rostlin probíhalo ve skleníku s denní dobou 16 hod., teplotou 28 °C a noční dobou 8 hod. při teplotě 20 °C. Během období s krátkými dny bylo zajištěno doplňující osvětlení bílou fluorescentní lampou, čímž byly zajištěny stejné podmínky jako v případě delších dnů. K izolaci protoplastů byly využívány plně rozvinuté listy padesáti až šedesátidenních rostlin. Roztoky enzymů - enzymový roztok pro maceraci listů Pektolyáza Y-23, 0,5% dextransulfát draselný rozpuštěný v 0,6 M roztoku mannitolu s pH upraveným 0,1 M HCl na 5,8. Roztok celulázy (1 % celuláza Onozuka RS rozpuštěná v 0,6 M roztoku mannitolu, pH=5,2). Roztoky byly sterilizovány filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,22 µm.

Proces izolace Povrchová sterilizace listů Odtrhnuté lístky byly opláchnuty v roztoku domácího prostředku na mytí zeleniny, povrch byl sterilizován ponořením do 2 % roztoku NaCl na 20–30 min., následně byly lístky opláchnuty sterilizovanou destilovanou vodou, vše bylo prováděno v aseptickém prostředí.

43


Dana Kettnerová

Odstranění spodní epidermis Spodní epidermis se za použití sterilizovaných kleští a plastových rukavic oloupe. Oloupané listy se nakrájí žiletkou přibližně na kousky o velikost 4 cm2. Macerace kousků listů Kousky listů o čerstvé hmotnosti 2 g byly v 100 ml Erlenmeyerově baňce se šroubovacím uzávěrem namočeny do 20 ml maceračního roztoku. Baňka byla umístěna do vakuového exsikátoru, kde byla pomocí rotačního čerpadla přibližně na 2 min. odvzdušněna. Poté byl do exsikátoru skrze filtr ze skleněných vláken přiveden vzduch. Kousky lístků měnily díky nasáknutí enzymovým roztokem barvu na tmavě zelenou. Baňka s kousky lístků byla následně třepána frekvencí 120 třepů za minutu s výchylkou 4 cm ve vodní lázni o teplotě 25 °C. Přibližně po 2 min. inkubaci se do roztoku uvolnila většina buněk houbovitého parenchymu, stejně jako poškozené buňky z povrchu řezu. Tyto buňky byly spolu s maceračním roztokem pomocí Pasteurovy pipety odebrány a nahrazeny 20 ml nového maceračního roztoku. Následovala další inkubace s třepáním, díky které došlo ke kompletní maceraci mezofylu. Tato inkubace trvala 15–20 min. Macerační roztok s izolovanými palisádovými buňkami byl filtrován skrze nylonovou filtrační membránu s oky o velikosti 200 μm. Filtrací došlo k odstranění nestrávených částí horní epidermis a žil. Filtrát byl centrifugován při 100 x g po 2 min, aby mohlo dojít k odebrání palisádových buněk. Zpracování celulázou Isolované palisádové buňky suspendované v 10 ml roztoku celulázy byly v 50 ml Erlenmeyerově baňce se šroubovacím uzávěrem za občasného kroužení inkubovány při 30 °C ve vodní lázni. Do 20 min. byly všechny živé buňky kulaté. Kompletní odstranění buněčné stěny může být zkontrolováno pomocí Calkofluoru white ST, dnes Bioglo od Calbiochem Behring (La Jolla, California) 12) 35) Calkofluor white ST se váže na celulózu buněčné stěny a emituje fluorescenci. 13) Protoplasty byly shromažďovány 1–2 min. centrifugací při 100 x g. Následně byly dvakrát promývány suspendací v 10 ml roztoku mannitolu a centrifugovány. Rychlost a doba centrifugace byly přizpůsobeny tak, aby v roztoku supernatantu s poškozenými buňkami a buněčnými nečistotami zůstalo jen malé množství

44


Dana Kettnerová

protoplastů. Ty jsou takto částečně odstraněny, protože sedimentují pomaleji než neporušené protoplasty. 12)

Uchimiya H., Murashige T., 1974 Uchimiya a Murashige provedli zhodnocení parametrů vhodných pro izolaci životaschopných protoplastů z kultury tabákových buněk (Nicotiana tabacum L.). Stanovili tyto podmínky jako nejvhodnější pro izolaci protoplastu za účelem co největšího zisku životaschopných protoplastů: buněčná kultura v počáteční fázi růstu; enzymová směs 1 % celulázy (Ozonuka) a 0,2 % Macerozymu; pH enzymového roztoku 4,7-5,7; inkubační doba 2–3 hod.; 5 ml enzymového roztoku na 500 mg buněk v 50 ml DeLong®baňce; 50 třepů za min.; použití 0,3–0,8 M roztok mannitolu jako osmotika v enzymatické směsi; inkubační teplota 22–37 °C. Tyto podmínky umožnily uvolnění protoplastu z 30 % buněk, z nichž následně 80% bylo schopno do 4 dnů regenerovat buněčnou stěnu a 40% znovu započalo v kultivačním mediu buněčné dělení. Jedná se o simultánní metodu. 27)

Gall E. A., Chiang Y. M., Kloareg B., 1993 Tento tým provedl výzkum zaměřený na izolaci a regeneraci protoplastů z rostlin Porphyra dentata a Porphyra crispata. Rostliny byly po důkladném očištění filtrovanou mořskou vodou kultivovány (při 10 či 15 °C a osmi až šestnácti hodinách denního světla) v Erlenmeyerově baňce. Následně byly dezinfikovány roztokem Betadine (jodovaný povidon, Purdue Frederick, Norwalk, Conn.) zředěným na koncentraci 0,5 % a pětkrát intenzivně promyty filtrovanou mořskou vodou. Některé z nich byly vystaveny 1–2 dennímu působení antibiotické směsi (penicilin G, streptomycin sulfát, kanamycin, nystatin, neomycin). Přibližně 0,5 mm2 velké kousky byly v Petriho miskách macerovány v roztoku enzymů lyzujících buněčnou stěnu (ve tmě při 18-22 °C). Za použití roztoku mannitolu či sorbitolu v mořské vodě byl testován osmotický potenciál v rozmezí 1350–1900 mosmol/kg. S využitím 50 mM MES či 50 mM Tris bylo pH upraveno na hodnotu 5,0; 6,0 či 7,0. Byly testovány různé kombinace enzymů: β–agaráza, celulázy Onozuka R–10 a RS, Macerozym R–10, Abalone aceton powder a papain. Papain byl testován jako pre–enzymová terapie i jako přídavek k ostatním enzymům. Z důvodu proteolytické aktivity papainu byly ke směsi přidány dextran sulfát, BSA nebo PMSF. Enzymatická směs byla filtrována přes membránu s 45


Dana Kettnerová

velikostí pórů 0,8 μm a po přidání rifampicinu skladována při – 20 °C. Výtěžek izolovaných protoplastů byl počítán pomocí Neubauerova hemocytometru. Životnost buněk byla kontrolována pomocí autofluorescence plastidů. Po vystavení modrému světlu emitují živé plastidy oranžovo – červenou autofluorescenci (díky přítomnosti fykoerytrinu

a

chlorofylu),

zatímco

degenerující

protoplasty

mají

žlutou

autofluorescenci. Odstranění, stejně jako následná regenerace buněčné stěny, byly kontrolovány pomocí Calcofluoru a UV světla. U obou druhů Porphyra byl největší výtěžek protoplastů pozorován po inkubaci 400 mg kousků stélky v 5–6 ml mořské vody (pH=6,0) s přídavkem 0,6 M mannitolu, 2 % papainu, 2 % celulázy a 2 jednotky/ml β–agarázy. Hodnota výtěžku byla 1,0x106 až 3–2x107 na gram čerstvé hmotnosti. Přídavek BSA, PMSF či dextran sulfátu nevedl ke zlepšení životaschopnosti protoplastů. 41)

Mukhtar I., Bajwa R., Nasim G, 2013 Výzkum zaměřený na izolaci protoplastů z mezofylu listů vždyzeleného stromu Dalbergia sissoo Roxb. mající za cíl využít izolované protoplasty pro testy patogenity, které by mohly poskytnout výsledky důležité pro zahájení léčby stromů a zabránění jejich vymizení z místa přirozeného výskytu. Pro izolaci byly využity třídenní až čtyřdenní plně rozvinuté listy Dalbergia sissoo Roxb., očištěné a vysušené. K odstranění buněčné stěny použili autoři roztok macerozymu a celulázy, využili tedy rychlejší simultánní metodu. Enzymy celuláza R–10 a pektináza R–10 byly rozpuštěny v CPW médiu o pH=5,8. Za účelem inaktivace DNáz, protoeáz a zvýšení rozpustnosti enzymů byl roztok udržován 10 min. při teplotě 55 °C. Následně byl zchlazen na 25–30 °C. Bylo zkoušeno několik koncentrací obou enzymů

s mannitolem.

Testovány

byly:

celuláza 0,1 %; 0,2 %; 0,3 %,

pektináza 0,1 %; 0,5 % a mannitol (5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %) rozpuštěné v CPW médiu. Mannitol má roli osmotika a zároveň izolačního média. Roztok byl filtrován přes 0,45 mm filtr do 50 mm Petriho misek. Enzymatickému působení byly podrobeny kousky listů o velikosti 0,5–1 mm. Kultivace probíhala při 28 °C, za 8 hod. nepřetržitého osvětlení. Délky kultivace byly různé. K čištění protoplastů byla využita filtrace přes nylonovou mřížku (60–72 μm), CPW roztok a centrifugace (100 x g, 5 min.). Výsledek izolace byl hodnocen pomocí hemocytometru s hloubkou komůrky 0,2 mm. K zhodnocení viability bylo využito barvivo fenosafranin (zelené protoplasty jsou živé a červeně zbarvené protoplasty jsou mrtvé). Pro izolaci 46


Dana Kettnerová

dostatečného množství protoplastů bylo třeba užít enzymatického roztoku o složení pektináza 0,5 %, celuláza 1,5% a délku inkubace 6 hod. Po přidání ještě vyšších koncentrací celulázy docházelo ke snížení výtěžnosti izolace, při koncentracích celulázy nižších než 1,5 % nedocházelo k uvolnění dostatečného množství protoplastů. Izolovány byly 20–30 μm velké protoplasty s výtěžností izolace 2x105/g mezofylu listu. Viabilita prokázaná fenosafraninem byla 77 %. Jedná se o rychlou metodu poskytující poměrně velké množství protoplastů s vysokou viabilitou. 42)

5.5

Chloroplasty

Obrázek č. 1: Stavba chloroplastu 112)

5.5.1

Definice Jedná se o fotosynteticky aktivní barevné plastidy. Chloroplasty vznikají

diferenciací ve fotosyntetických pletivech (mezofyl, vnější vrstvy mladých stonků, některé části květů a plodů) z proplastidů. Množství a velikost chloroplastů se u jednotlivých rostlinných buněk liší. U vyšších rostlin mají čočkovitý či kulovitý tvar. Jejich rozměr je přibližně 5-10 µm na délku a 2-4 µm na šířku. Jejich nejčastější počet nacházející se v jedné buňce se pohybuje v rozmezí 20-50. U řas jsou chloroplasty často rozlišovacím znakem a nabývají nejrůznějších tvarů (např. 47


Dana Kettnerová

hvězdicovitý, miskovitý). Je-li jich v buňce větší počet, jsou zpravidla drobnější, což je výhodnější z hlediska fotosyntézy (větší povrch umožní zvýšení transportu CO2 do chloroplastů). Povrch chloroplastů tvoří dvojitá selektivně permeabilní membrána mající tloušťku 10-20 nm. Vnější membrána je dobře propustná pro většinu metabolitů, vnitřní membrána je membránou transportní. Mezi membránami se nachází neprotoplazmatický prostor. Značná část vnitřního prostoru chloroplastu je tvořena složitým membránovým systémem, tzv. thylakoidy. Tvoří ho vzájemně propojené zploštělé membránové vaky, které obklopují společný vnitřní prostor. Jedná se o membrány, které jsou odvozeny od vnitřní membrány obalu. Z této membrány se nejprve vychlipují a následně zcela oddělují. Mezi povrchem thylakoidů a vnitřní membránou se nachází plastidoplazma tvořená bílkovinnou hmotou – stroma. Na některých místech se thylakoidy vychlipují a tvoří tzv. grana. Průměrný chloroplast obsahuje přibližně 50 gran. Typická grana se nevytvářejí u řas, kde jsou přítomna jiná funkční uskupení thylakoidů (trojice, dvojice thylakoidů). U C4 rostlin (např. u Zea mays, Saccharum officinarum) je přítomný chloroplastový dimorfismus. Jsou přítomny chloroplasty s grany (mezofylové chloroplasty) i agranální chloroplasty (v pochvách kolem cévních svazků). Jedná se o semiautonomní organely. V chloroplastech se nachází malé ribozomy a molekuly DNA. Ribozomy mají podobnou strukturu jako ribozomy prokaryotní. Tyto znaky, spolu s velkou mírou automacie a dvojitou membránou, podporují teorii, že se chloroplasty vyvinuly z endosymbiotických sinic. V thylakoidech probíhají primární děje fotosyntézy. Prostorové oddělení jednotlivých fází fotosyntézy umožňuje současný průběh odlišných reakcí bez vzájemného ovlivňování a poškozování. Světelná fáze probíhá na thylakoidech. V thylakoidech gran převažuje fotosystém II, v thylakoidech stromatu pak fotosystém I. V thylakoidech jsou zároveň vázány pro fotosyntézu nezbytné fotosyntetické pigmenty (chlorofyly, karotenoidy, fykobiliny). Fotosyntetické pigmenty jsou přítomny buď v podobě protein-pigmentových komplexů přímo v membránách (chlorofyly, karotenoidy), nebo jsou vázány ve zvláštních tělískách (fykobilizómy) připojených k povrchu thylakoidní membrány ze strany stromatu (fykobiliny). Při světelné fázi fotosyntézy dochází k pohlcení světelných kvant a následnému průběhu dějů, které umožní vznik ATP, NADPH+H+. ATP a NADPH+H+ jsou poté využity v temnostní fázi fotosyntézy. Průběh temnostní fáze 48


Dana Kettnerová

je lokalizován v kapalné části chloroplastu – ve stromatu, kde jsou přítomny enzymy pro fixaci CO2. Zde může též probíhat tvorba asimilačního škrobu. 2) 4)

5.5.2

Izolace Snaha porozumět procesům odehrávajícím se uvnitř chloroplastů, zejména

fotosyntéze, možnost ovlivnit množství produkovaného kyslíku, porozumět transportním procesům, metabolickým procesům a další, to vše byly důvody vedoucí ke snaze izolovat z rostlinné tkáně co největší množství intaktních chloroplastů. V roce 1886 popsal botanik Haberlandt výskyt chloroplastů obalených v kapsulích u mechů. Následně poukázal pomocí výzkumu na izolovaných chloroplastech na fakt, že kyslík je rostlinami produkován pouze za světla (pokusy na mechu Funaria hygrometrica Hedw.). 59) 60) Snaha o izolaci chloroplastů souvisela v této době nejen s touhou porozumět struktuře, složení a metabolismu chloroplastů, ale i se snahou pochopit a popsat jeden z nejdůležitějších procesů probíhajících v rostlinné buňce – fotosyntézu. 73) V roce 1882 pozorovat Theodor Engelmann pohybující se bakterie, které se shlukovaly nad povrchem řasy rodu Spirogyra. Chloroplasty této řasy byly osvětleny a tak docházelo k produkci kyslíku, který se na povrchu řasy uvolňoval a byl bakteriemi využíván. Engelmann takto prokázal produkci kyslíku chloroplasty nacházejícími se uvnitř buňky probíhající za přítomnosti světla. 61) 62) K prokázání vývoje kyslíku izolovanými chloroplasty využil roku 1890 Beyerinck bakterie, které jsou schopny světélkovat pouze za přítomnosti kyslíku. 62) Izolace chloroplastů vyšších rostlin je známa od roku 1938, kdy Sam Granick proved kvantitativní analýzu chloroplastů izolovaných z listů rajčete a tabáku. 73) Granickovu metodu nelze využít u velmi mladých listů, jejichž buňky se ještě dělí a izolace malých chloroplastů z cytoplazmy je velmi obtížná. Stejně tak je nevyužitelná u starých žlutě zbarvených listů, které obsahují již degradující chloroplasty. Dalším omezujícím faktorem je využití pouze u takových listů, jejichž buněčná stěna se při maceraci pískem snadno rozpadá a může tak dojít k uvolnění chloroplastu. Nejprve Granick předběžně testoval podmínky majících vliv na izolaci chloroplastů i na jejich následné uchovávání. Bylo zjištěno, že je možné pomocí centrifugace zajistit částečnou separaci jednotlivých částí rostlinné buňky. Listy rostliny rozemleté s 0,5 M roztokem glukózy byly centrifugovány. Po centrifugaci 49


Dana Kettnerová

bylo ve zkumavce zřetelných několik vrstev. Spodní vrstvu tvořily zbytky buněčné stěny a nerozrušené buňky, směrem vzhůru se dále nacházely větší krystaly, rozpadlá škrobová zrna chloroplastů, koagulovaná cytoplazma, menší krystaly a škrobová zrna, chloroplasty a úplně navrchu byla drobná zrníčka. Jádro se při pH suspenze rostlinné tkáně (pH=6,0–6,5) úplně rozpadá, proto se nevyskytuje po centrifugaci ve vrstvě s chloroplasty. Tento pokus umožnil izolaci co nejméně kontaminovaných chloroplastů. Vyhovující rychlost centrifugace byla velmi individuální a závisela na stáří a druhu použitých listů. Všeobecně však byla využita rychlost v rozmezí 400 – 800 x g. K vyhodnocení čistoty izolovaných chloroplastů se jako nejvhodnější ukázala mikroskopie s využitím imerzního oleje. Uchovávání izolovaných chloroplastů je možné v takovém prostředí, které je izotonické nebo hypertonické vůči cytoplazmě buněk listu. Z testovaných látek byly jako nejvhodnější pro uchovávání chloroplastů určeny 0,5 M roztoky glukózy či sacharózy. Tyto roztoky nezpůsobovaly koagulaci cytoplazmatických proteinů ani vysrážení krystalků v chloroplastu, jako tomu bylo u solných roztoků. Chloroplasty mohly být v těchto roztocích uchovávány několik hodin a nedocházelo u nich k výraznějším změnám, až na výskyt poměrně rychle vznikajících drobných krystalků. Stanovení

výtěžku

izolace

bylo

provedeno

nepřímo.

Vycházelo

z předpokladu, že se barvivo chlorofyl nachází v rostlinné buňce pouze v chloroplastech. Tím pádem je pak izolací získané množství chlorofylu přímo úměrné množství izolovaných chloroplastů. Ke stanovení byl použit extrakt připravený ze suspenze izolovaných chloroplastů a 75 % acetonu. Aceton rozpouští pigment chloroplastů a zároveň sráží proteiny. Centrifugací byl následně získán zelený roztok, který byl podroben kolorimetrickému stanovení. Během experimentu se vyskytl problém s blednutím acetonového extraktu, který v některých případech vedl k získání chybných výsledků měření. Bylo však vyzkoumáno, že k eliminaci této chyby dochází v případě použití ledově vychlazeného aceton a je–li stanovení provedeno bezprostředně po přípravě acetonového extraktu. Místo acetonu může být použita směs alkohol–ether v poměru 3:1.

50


Dana Kettnerová

Postup izolace dle Granicka S. (1938) 3 g listu, získaného z rostliny rajčete nebo tabáku a zbaveného středního žebra a nejvýraznější žilnatiny, byly umístěny do vlhkého froté ručníku na dobu, než došlo k dostatečné absorpci vody buňkami. Tím bylo usnadněno následující drcení, při kterém byla opláchnutá část rostlinné tkáně vložena spolu s gramem křemičitého písku a 25 ml 0,5 M roztoku glukózy (o teplotě cca 5 °C) do porcelánové třecí misky. Zde byla jemně roztírána až do uvolnění chloroplastů do studeného hypertonického roztoku glukózy, který následně změnil svou barvu na tmavě zelenou. Když se tak stalo, byla do tohoto roztoku přidána zbývající částí rostlinné tkáně a proces se opakoval. Zelená suspenze chloroplastů byla poté slita do 50 ml centrifugační zkumavky. K zbývající části rostlinné tkáně v třecí misce bylo přidáno 20 ml chladného roztoku glukózy a byla znovu drcena. Takto získaná suspenze chloroplastů byla přilita do centrifugační zkumavky k prvně získané suspenzi chloroplastů. Následně byla provedena centrifugace při 400 x g. Supernatant byl přelit do další centrifugační zkumavky a objem byl pomocí roztoku glukózy doplněn na 45 ml. 5 ml této suspenze (suspenze A) bylo odpipetováno do další zkumavky, aby mohla být stanovena koncentrace chlorofylu. Zbytek z první centrifugační zkumavky byl přenesen do třecí misky, kde byl spolu se zbytky listů a roztokem glukózy rozetřen. Následně byl přelit do 50 ml odměrné baňky (suspenze D). 5 ml této suspenze bylo odpipetováno do čisté centrifugační zkumavky ke stanovení koncentrace

chlorofylu.

Zbývajících

40 ml

suspenze

A

bylo

5–8 min.

centrifugováno. Supernatant byl slit do další centrifugační zkumavky (suspenze B). Zbylé chloroplasty na dně zkumavky byly označeny jako centrifugát B a byly určeny k přímé analýze dusíku, fosforu, enzymů apod. 5 ml suspenze B bylo odpipetováno do nové centrifugační zkumavky za účelem zjištění koncentrace chloroplastu v suspenzi B. Zbývajících 35 ml suspenze B bylo dále 5–10 min. centrifugováno, supernatant byl odlit do zkumavky (suspenze C). Chloroplasty nacházející se dně zkumavky byly nazvány centrifugát C a sloužily k přímé analýze. 5 ml suspenze C bylo odpipetováno do centrifugační zkumavky za účelem zjištění koncentrace chlorofylu. Ke každému 5 ml vzorku suspenzí A, B, C a D bylo přidáno 10 až 15 ml ledového acetonu a obsah zkumavek byl pečlivě vířením promíchán. Následně byly vzorky postaveny do kádinky s vodou a ledem a na 15 min. uloženy na tmavé místo. Po vyndání byl obsah zkumavek opět promíchán a následovala 5 min. centrifugace. 51


Dana Kettnerová

Získané křišťálově čisté zelené supernatanty byly dekantovány do 25 ml odměrných baněk., označeny a uloženy do ledové vody. Zbytky v centrifugačních zkumavkách byly extrahovány 5 ml 75 % acetonu a extrakt byl přidán do hlavních buněk se suspenzemi A–D. Zelené roztoky byly porovnány (roztoky A-B, B-C a C-A) pomocí Duboscqova kolorimetru. Následně byl vypočítán procentuální obsah chloroplastů v centrifugátu B a C, k čemuž bylo třeba znát množství chlorofylu přítomného v suspenzi A. 73) Kvantitativní měření kyslíku produkovaného izolovanými chloroplasty za různých podmínek pak provedl v roce 1945 Franck. 62) 63) Aktivita chloroplastů, které byly izolovány pomocí dezintegrace rostlinné tkáně listu a diferenciální centrifugací hmoty, však byla tak malá, že probíhající výměna plynů nemohla být pomocí manometrických metod v té době prakticky detekována. Z tohoto důvodu byl velmi vítán objev Roberta Hilla (1939), který prokázal, že při přidání šťavelanu železitého k čerstvě připravenému roztoku chloroplastů dochází za světla ke značnému uvolňování kyslíku. Železitý iont je při této reakci redukován na železnatý a voda je oxidována na kyslík. Kvantitativní měření prokázala takovýto průběh reakce: 4 Fe3+ + 2 H2O ↔ 4 Fe2+ +4 H+ + O2. Tato reakce může být zjednodušena: 2 H2O → 4 H+ + 4 e- + O2. Jedná se o tzv. hydrolýzu vody, která je též po svém zakladateli nazývána Hillovou reakcí. 59) 62) Warburg a Lüttgens pak v roce 1944 publikovali, že analogická reakce probíhá i při použití p–benzochinonu a to i za použití pouhých gran chloroplastu, nikoli nutně chloroplastu celého: p–benzochinon + 2 H2O ↔ 2-hydrochinon + O2. Tento objev byl dvojnásobným přínosem. Jednak byla k reakci potřebná namísto složité skupiny reaktantů jediná látka a pak bylo využito organické oxidační

52


Dana Kettnerová

činidlo, což poukazovalo na to, že bude tato reakce pravděpodobně využitelná obecně. 62) 64) Obecnou využitelnost reakce potvrdil svým výzkumem publikovaným v roce 1946 Aronoff, který provedl reakci při ostrém světle za využití grana chloroplastu a různých druhů chinonů (např. nafto- a antrachinony), jejichž použité množství se odvíjelo přibližně od jejich redoxního potenciálu. 62) 65) Další metodu představil Boichenko v letech 1943–44, který za použití roztoku 0,1 % fruktózy v téměř nasyceném roztoku octanu hořečnatého prokázal uvolňování kyslíku z vysušených i čerstvě izolovaných chloroplastů. 66) 67) Výzkum, který provedl Aronoff a jehož výsledky byly uveřejněny v roce 1946, byl proveden na granech získaných z listů špenátu získaného z tamního trhu. Původně měla být provedena kontrola pomocí gran získaných z izolovaných chloroplastů tabáku, u jehož listů je známo mnoho analytických dat. Bohužel však nemohla být grana z chloroplastů listů tabáku použita, neboť během 48 hodin v destilované vodě nedošlo k dezintegraci chloroplastů. Listy špenátu z tamního trhu byly temperovány na teplotu 2–3 °C, která byla v průběhu experimentu až do provedení měření manometrem udržována. Do elektrického mixéru značky Waring bylo vloženo přibližně 100 g listů zbavených řapíků a velkých žil, přidáno bylo 175 ml fosfátového pufru (0,05 M, pH=6,5) a směs byla 30 min. mixována při napětí 55–57 V. Roztok byl přes bavlnu přefiltrován do centrifugačních zkumavek a 15 min. centrifugován při 125 x g (jako dostačující se však ukázalo i 45 g). Takto získaný roztok obsahující částice vyskytující se na hranici vysokého mikroskopického rozlišení s obsahem chlorofylu přibližně 0,1 mg/ml, byl centrifugován 15 min. při 6700 x g. Získaný žlutozelený supernatant byl uschován pro další práci. Grana byla dvakrát promyta a dezintegrována tyčinkou za použití minimálního množství pufru. Obsah chlorofylu nabýval obvykle hodnot okolo 0,75 mg/ml, případně 1,0 mg/ml, někdy ale dosahoval hodnot až 2,5 mg/ml. Obsah chlorofylu byl 2–3x vyšší u zimního špenátu. Žlutozelený roztok získaný po centrifugaci vykazoval Tyndallův efekt, proto byl 36 hod. dialyzován proti destilované vodě, čímž došlo k vysrážení dalšího materiálu obsahujícího chlorofyl a žlutozelený roztok vykazoval jen velmi malý Tyndallův efekt. Oba materiály s obsahem chlorofylu byly lyofilizovány. Pro experiment byly využity látky 1,4–benzochinon; 1,4–naftochinon–2sulfonát draselný; 1,2–naftochinon draselný; 9,10–antrachinon–4–sulfonát draselný, 53


Dana Kettnerová

které musely být kvůli nedostatečné čistotě rekrystalizovány. U ostatních látek, jako byla narkotika, jedy a další látky, nemusela být rekrystalizace prováděna. 62) Chlorofyl a + b byl připraven pomocí metody dle Mackinneyho 68) s úpravou metody sušení. Sušení bylo místo využití exsikátoru prováděno za vysokého vakua. 62 Výměna plynů byla měřena manometricky, jako zdroj světla byla použita 2000 W wolframová lampa, intenzita světla 19 000 lux. Předchozí experimenty (Hill a Scarisbrick; Kumm a French), poukázaly na poměrně malou stabilitu chloroplastů při skladování. Poločasy se pohybovaly v rozmezí 1,5 –3 hod., současně však nebyla uvedena teplota skladování. Granula využitá při experimentu Aronoffa však měla při dodržení skladovací teploty 2–3 °C podstatně vyšší poločas a to kolem 11 hod., přibližně 25–30 % aktivity byla ztraceno během samotné přípravy. Ztráta aktivity během pokusu však byla mnohem větší, pravděpodobně z důvodu fotolytického efektu. Významně klesaly hodnoty po 25– 30 min. Na rychlosti poklesu hodnot se podílela kvalita materiálu využitého pro izolaci, stejně jako roční období ovlivňující kvalitu pěstovaného špenátu. Při nízké světelné intenzitě byla u samostatných listů špenátu v 0,1 M roztoku KHCO3 prokázána vyšší produkce kyslíku než u gran s chinony. Množství uvolněného kyslíku se s využitím různých chinonů lišilo. Malý efekt v uvolňování kyslíku byl zaznamenán i u benzaldehydu, benzoylperoxidu a salicylaldehydu. Minimální též u fruktózy a kyseliny dehydroaskorbové. 62) Jedním z důležitých kroků při studiu uvolňování kyslíku z chloroplastů se ukázalo porozumění jejich enzymatickému složení. Pozornost byla věnována především enzymům podílejícím se na oxidačně – redoxních reakcích. Důkaz výskytu polyfenoloxidázy v chloroplastech červené řepy byl podán výzkumem v roce 1949. Pro studium přítomnosti polyfenoloxidázy v chloroplastu byla využita izolovaná grana chloroplastů, při jejíž izolaci bylo vycházeno z metody izolace popsané v roce 1946 Aronoffem. 50 g listové čepele zbavené větších žil a středního žebra bylo zalito 60 ml 1/15 M fosfátového pufru nebo destilované vody a mixováno v mixéru. Směs byla přecezena přes fáčovinu a filtrována přes vatu. Filtrát byl centrifugován na centrifuze s úhlovým rotorem 1 min. při 3000 otáčkách/min. Supernatant byl slit a centrifugován 20 min. při 4 °C a přibližně 25000 x g. Centrifugací byl získán světle žlutozelený supernatant obsahující pouze nepatrné množství chlorofylu a sediment skládající se z částí chloroplastů. Sediment byl 54


Dana Kettnerová

promyt fosfátovým pufrem, (pH=6,5), aby došlo k odstranění zbytků cytoplazmy. Následně byl v tomto pufru resuspendován a přefiltrován přes chomáček vaty. Takto získaná suspenze obsahující chloroplasty, resp. jejich části, obsahovala 40x až 50x více chlorofylu než žlutozelený supernatant. Měření enzymatické aktivity polyfenoloxidázy bylo provedeno manometricky při 20 °C. Při reakci byl použit katechol (jako látka katalyzující oxidaci kyseliny askorbové) a kyselina askorbová. Experiment prokázal přítomnost polyfenoloxidázy v chloroplastech. Po přidání katecholu do suspenze chloroplastů s přídavkem kyseliny askorbové došlo k významnému zvýšení absorpce kyslíku. Absorpce kyslíku byla naopak významně redukována, nebyl–li katechol ve směsi přítomen, nebo v případě, že přítomen byl, ale nebyla přítomna kyselina askorbová. 69) Studium

enzymů

nacházejících

se

v chloroplastech

bylo

ztěžováno

skutečností, že byla pro izolaci chloroplastů využívána vodná média. Díky tomu docházelo ke ztrátám ve vodě rozpustných enzymů a jejich kofaktorů. Následně docházelo k nechtěnému zkreslení výsledků experimentů. Jedním z enzymů, jejichž výskyt byl prokázán především v supernatantu získaném izolací chloroplastů ve vodném médiu, jsou aldolázy a fosforylázy. S obdobným problémem se potýkal i výzkum živočišných tkání. Zde byl však výzkum týkající se nevodných médií využitelných pro izolaci poněkud napřed. Již v roce 1932 byla publikována studie Behrense, který objevil metodu umožňující izolaci jádra z lyofilizovaného srdečního svalu bez použití vodného roztoku. Behrensova metoda byla následně upravena a využívána k izolaci jádra z živočišné tkáně. 70) 71) Jakákoli studie popisující podobnou metodu v rostlinné říši však nebyla, s výjimkou izolace jader pšeničných klíčků, v této době publikována. 71) 72) Stockingova metoda bezvodé izolace chloroplastů z listů rostliny Nicotiana rustica L. z roku 1959 vychází z metody popsané Behrensem. Před začátkem experimentu byla rostlina Nicotiana rustica L., uchovávána po 36–48 hod. v nepřetržité tmě. Po této době z ní byly otrhány listy, které byly po odstranění středního žebra a výrazných žilek vhozeny do lyofilizační baňky a ponořeny do mrazící směsi obsahující aceton a suchý led. Baňka se zmrazenými listy byla uchovávána ve směsi soli a ledu při teplotě – 10 °C. Zmrazené listy byly rozbity na kousky velké přibližně 1 mm2 a po kompletní lyofilizaci byly skladovány ve vakuu při teplotě – 5 °C. Celý proces izolace probíhal přibližně při 0 °C, přidávaná rozpouštědla byla předchlazena a pro centrifugaci byla využita chladící centrifuga. K rozdrcení rostlinné tkáně se jako nejvhodnější ukázalo využití 55


Dana Kettnerová

ručního mlýnku. Dva 0,1 g vzorky listu tabáku byly rozemlety spolu s 20 ml ledově vychlazené směsi hexan/tetrachlormethan (o hustotě 1,32, příp. 1,28; 1,30) v ručním mlýnku Ten Broeck. Pro dostatečné rozemletí vzorku byla dostačující délka jemného mletí okolo 2–4 min. Rozemleté vzorky byly spojeny, přefiltrovány přes tampon ze skelné fáčoviny a zředěny homogenizační kapalinou na známý objem. Z toho roztoku byly odebrány vzorky pro stanovení chlorofylu, dusíku a enzymů. Zbývající část homogenátu byla v polyethylenových zkumavkách centrifugována 15 min. při 12000 x g. Obsah zkumavky byl, až na hustý materiál nacházející se na samotném dně zkumavky, odebrán a zředěn stejným množstvím hexanu. Následovala 5 min. centrifugace při 1000 x g. Centrifugací byl získán pelet obsahující převážně chloroplasty. Hustota chloroplastů je proměnlivá a závisí mimo jiné na stáří listů dané rostliny. Tento pelet (o hustotě 1,32) byl buď vakuově vysušen, nebo promyt hexanem či tetrachlormethanem. Pokud bylo použito promytí, následovala další centrifugace a vakuové sušení. Materiál získaný po první centrifugaci ze dna zkumavky, mající hustotu větší než 1,32, byl resuspendován ve směsi hexanu a tetrachlormethanu o hustotě 1,34. Získaný roztok byl centrifugován při 12000 x g. Opět byl odebrán obsah ze dna zkumavky a zředěn hexanem. Následovala 5 min. centrifugace při 1000 x g. Hlavním přínosem této metody je fakt, že chloroplasty nepřicházejí během izolace do kontaktu s vodnými rozpouštědly. Díky tomu nejsou z chloroplastů vyplavovány ve vodě rozpustné enzymy. Takto izolované chloroplasty vykazují vysokou aktivitu aldolázy a minimálně z 54 % jsou spojeny s buněčnou fosforylázou. Ač se bezvodá metoda izolace chloroplastů neobejde bez problémů souvisejících s využitím hydrofobních rozpouštědel, je využitelná jako doplňková metoda k vodné metodě izolace chloroplastů. 71) Pomocí diferenciální centrifugace se podařilo izolovat více či méně znečištěné chloroplasty. U některých izolovaných chloroplastů byla popsána přítomnost kataláz, nukleových kyselin či cytochromoxidáz. V roce 1954 vyvinuli Jagendorf a Wildman snahu nalézt takovou metodu, která by umožnila izolovat z listů rostlin intaktní chloroplasty prosté jakéhokoli znečištění. Pro svůj experiment použili listy rostliny Nicotiana tabacum var. Samsun. Rostliny byly skladovány před izolací v temnu (1–3 dny) z důvodu, aby se v chloroplastech nenacházela škrobová zrna. Při rozemletí rostlinné tkáně byl použit 1/15 M fosfátový pufr a 0,4 M sacharóza. K homogenizaci bylo použito mletí i míchání (v Omni mixéru). 56


Dana Kettnerová

Následovalo přefiltrování a centrifugace. Vše bylo prováděno za teploty 4 °C. V resuspendovaných peletách byl měřen proteinový dusík. Stanovena byla přítomnost nukleových kyselin, katalázy a cytochromoxidázy (ta byla zjištěna manometricky). U zelených pelet získaných po homogenizaci byla zjištěna přítomnost nejen chloroplastů, ale i dalších komponent. Jádro a velké krystaly se dařilo částečně odstranit pomocí nízkorychlostní centrifugace a částečně pomocí opakované filtrace přes Shark Skin filtrační papír. Menší nezelené částice byly odstraněny pomocí opakovaného promývání. Experiment ukázal, že 50 % dospělých chloroplastů bylo narušeno využitím metody drcení pomocí hmoždíře a drtící paličky, zatímco většina chloroplastů zůstala intaktní, byl–li k homogenizaci použit homogenizační mixér. U jader bylo naopak výhodnější použít k homogenizaci hmoždíř. Z hodnot poměrů chlorofyl/dusík v sérii pelet se dalo vyvodit, že se v homogenátu vyskytovaly menší částice. Tyto částice vykazovaly katalázovou aktivitu, obsahovaly velké množství nukleové kyseliny a vzhledově se podobaly mitochondriím. Nejednalo se však o chloroplasty nebo o části chloroplastů. Ještě menší částice (na hranici viditelnosti) mohly být z roztoku odstraněny pomocí centrifugace. Tyto částice obsahovaly méně nukleových kyselin než střední částice a vykazovaly slabou katalázovou aktivitu. Tento pokus přinesl metodu, pomocí které je možné chloroplasty oddělit od menších částic a získat tak čisté

chloroplasty

vykazující

malou

nebo

žádnou

katalázovou

a

cytochromoxidázovou aktivitu. Hillova reakce však probíhá v těchto chloroplastech beze změny. Uvedené izolované chloroplasty obsahují železo, síru i velmi malé množství nukleové kyseliny. 74) Další experiment zabývající se diferenciální centrifugací byl publikován v roce 1955. Provedený experiment prokázal, že je možné získat diferenciální centrifugací velké množství velmi čistých chloroplastů. Metodě však musí předcházet předběžná sedimentace za nízké rychlosti. Nejvyšší čistoty chloroplastů bylo dosaženo pomocí opakovaného promývání a centrifugace vzorku následovaných separací pomocí hustoty. K pokusu byly využity listy rostlin salátu, tureckého tabáku (var. Samsun) a primární listy červené fazole. Listy, ke kterým byl přidán 1/5 M fosfátový pufr (pH=7,0) a 0,4 M roztok sacharózy, byly rozemlety

v homogenizačním

mixéru

Omni,

filtrovány

a

centrifugovány.

Resuspendovaný pelet byl použit k diferenciální centrifugaci. Vzorek byl přidán k roztoku sacharózy a glycerolu v centrifugační zkumavce, obsah zkumavky byl řádně 57


Dana Kettnerová

promíchán a centrifugován. Tekutina ve zkumavce měla hustotu 1,17 g/ml. Bylo provedeno testování s různou hustotou sacharózo–glycerolového média. Změny hustoty

byly

prováděny

změnou

množství

glycerolu.

Sedimentace/flotace

chloroplastů byla téměř kompletní již po 15 min., úplně kompletní po 30 min. Chloroplasty vykazovaly různé hodnoty hustoty, proto se některé nacházely v horní vrstvě zkumavky, jiné i v sedimentu a další v sacharózo–glycerolovém médiu. Celkově vykazovaly poměrně malou hustotu, která je nejspíš způsobena poměrně vysokým obsahem lipidů v jejich struktuře. Obsah lipidů ve struktuře chloroplastu je proměnlivý a závisí na použitém rostlinném materiálu. Při použití diferenciálního média o hustotě 1,17 se v případě tabáku vznášelo na hladině 60 až 90 % chloroplastů, u špenátu 90 % a více. Největší rozpětí hodnot vykazovaly chloroplasty izolované z červené fazole, kdy se v horní vrstvě nacházelo od 5 % do 90 % chloroplastů. Pomocí diferenciální centrifugace jsou chloroplasty očištěny od nukleové kyseliny, kataláz a ne–plastidových částí. Metoda je bohužel nevyužitelná v případě mladých chloroplastů, které mají malou hustotu, takže se nedaří je pomocí diferenciální centrifugace pořádně oddělit od malých balastních částic. Pro to, aby byly mladé chloroplasty odděleny do horní vrstvy, je navíc třeba zvýšit hustotu diferenciačního média a to minimálně na 1,2. Potom se v horní vrstvě nachází 50 % chloroplastů. Zatímco při využití hustoty média 1,17 se jich v případě dospělých chloroplastů nachází v horní vrstvě 80 %. 75) Roku 1964 byla snaha stanovit metodu, která by umožnila izolovat čisté neporušené chloroplasty z mladých listů Vicia faba L. K izolaci byl použit 0,15 M fosfátový pufr (pH 7,3) a 0,3 M roztok sacharózy. K homogenizaci nebyl použit žádný drsný způsob (jako písek či drcení). Následovala filtrace přes nylonovou síťku. Filtrát byl centrifugován při 600 x g 2 min., při čemž došlo k odstranění částí buněčné stěny a jádra. Supernatant obsahující chloroplasty, části chloroplastů a mitochondrie byl rozdělen díky diferenciální centrifugaci s použitím 6 ml 46 % sacharózy (ρ=1,2) a 10 ml 50 % sacharózy (ρ=1,229). Oba roztoky sacharózy byly rozpuštěny v 0,15 M fosfátovém pufru (pH=7,3). Následovala 20min. centrifugace při 1000 x g. Čisté chloroplasty se nacházely v podobě zeleného kroužku na rozhraní mezi jednotlivými koncentracemi roztoků sacharózy. Vrstva intaktních chloroplastů byla odebrána Pasteurovou pipetou a zředěna stejným množstvím fosfátového pufru a roztoku sacharózy. Následovala 10 min. centrifugace při 1000 x g, při které 58


Dana Kettnerová

utvořily chloroplasty pelet. Touto metodou se podařilo izolovat jen malé množství chloroplastů (z homogenátu obsahujícího 50 mg chlorofylu bylo získáno 5–10 mg chlorofylu). Nejlepších výsledků bylo dosaženo při použití listů z rostlin, které byly vystaveny slunečním paprskům víc než 6 hod. denně a při použití malého množství materiálu (10 g). 76) V témže roce zkoumal Walker fixaci CO2 probíhající při fotosyntéze v izolovaných chloroplastech. Přidáním ribózy–5–fosfátu k izolovaným chloroplastům špenátu se zvýšila fixace CO2 z 1,1 µmol CO2/mg Chl/hod. na 24,3 µmol CO2/mg Chl/hod. 77), při jeho výzkumu v roce 1965 dokonce na hodnotu 36,9 µmol CO2/mg Chl/hod. 78) 79) O dva roky později navázali na Walkerův výzkum fixace CO2 při fotosyntéze Jensen a Bassham, kteří Walkerovu metodu izolace chloroplastů značně obměnili. K izolaci a chemické analýze využili listy špenátu (Spinacia oleracea L., var. Viroflay) a tři připravené roztoky. Roztoky měly toto společné složení: 0,33 M sorbitol; 0,002 M NaNO3; 0,002 M EDTA; 0,002 M isosorbát sodný; 0,001 M MnCl2; 0,001 M MgCl2; 0,0005 M K2HPO4. Navíc obsahovaly jednotlivé roztoky: roztok A: 0,05 M MES upravený pomocí NaOH na pH 6,1, 0,02 M NaCl; roztok B: 0,05 M HEPES upravený na pH 6,7 pomocí NaOH, 0,02 M NaCl; roztok C: 0,05 M HEPES upravený na pH 7,6 pomocí NaOH, 0,005 M Na4P2O7.10 H2O. 10 g čerstvě utržených vychlazených listů bylo homogenizováno za vysoké rychlosti pomocí homogenizačního mixéru Waring (pouze 5 s). Následovala filtrace přes fáčovinu a centrifugace filtrátu 50 s při 2000 x g. Vzniklý pelet byl před pokusem suspendován při 0 °C v roztoku B. Obsah chlorofylu v této suspenzi chloroplastů byl přibližně 1,4 mg Chl/ml. Roztok C byl využit při studiu fixace CO2 během fotosyntézy. Pokusem byl zjištěn obsah fixovaného CO2 v izolovaných chloroplastech 155 µmol CO2/mg Chl/hod., což představovalo 63 % CO2 získaného z čerstvých listů téže rostliny (245 µmol CO2/mg Chl/hod.). 79) Walker, Jensen a Bassham vyslovili myšlenku, že míra fixace CO2 izolovanými chloroplasty při fotosyntéze souvisí s intaktností chloroplastu. Proto bylo třeba hledat takové metody pro izolaci, které by umožnily zisk co největšího množství chloroplastů s nepoškozenou vnější membránou. I s touto otázkou se potýkal výzkum v roce 1968 zaměřený na studium fotosyntézy pomocí chloroplastů izolovaných z listů Pisum sativum L. var. Green Feast. K izolaci bylo využito smísení 10 g vychlazených listů se 100 ml 0,4 M roztoku sacharózy obsahujícího 1,0 mM MgCl2, 1,0 mM EDTA, 30 mM kyselinu tris (hydroxymethyl) methylethan 59


Dana Kettnerová

sulfonovou, 0,5 % BSA a mající pH 7,2. Následovala filtrace přes mušelín a centrifugace filtrátu 2–3 min. při 300 x g a následná centrifugace supernatantu dalších 10 min. při 1000 x g. Pelet byl resuspendován v 10 ml 0,4 M roztoku sacharózy s obsahem 0,5 % BSA, a po převrstvení 1,0 M roztokem sacharózy byl centrifugován při 1000 x g. Chloroplasty byly resuspendovány v 2 ml 0,4 M roztoku sacharózy obsahujícího 0,5 % BSA a následně uchovávány v ledové lázni až do provedení pokusů a následných analýz souvisejících s fotosyntézou (koncentrace chlorofylu, ADP, měření procentuální saturace CO2). Tento experiment prokázal, že cyklický i necyklický elektronový tok jsou spojeny s fosforylací. Zároveň se ukázalo, že rozhodujícím faktorem ovlivňujícím míru probíhající fotosyntézy je neporušenost struktury chloroplastu. Naopak zkrácení doby přípravy izolovaného chloroplastu (z přibližně 35–40 min. na 13 min.) nevedlo k zvýšení hodnot charakterizujících míru proběhlé fotosyntézy. 80) Výzkum řady vědeckých skupin týkající se faktorů ovlivňujících fotosyntézu probíhající v izolovaných chloroplastech shrnuli ve své práci publikované v roce 1967 Kalberer, Buchanan a Arnon. Výzkum izolačních metod byl započat po objevu Hilla, který prokázal, že kyslík může produkovat nejen rostlinná buňka jako celek, ale i jedna její izolovaná část, a to chloroplast. Zprvu byly k izolaci využívány izotonické roztoky sacharidů, následované později izolacemi za využití izotonických roztoků NaCl. Tento krok měl podat důkaz, že jediným zdrojem energie pro syntézu sacharidů z CO2 je sluneční energie. Stejná úvaha vedla k použití solných médií pro izolaci chloroplastů sloužících k pokusům zaměřeným na fosforylaci. Nicméně metoda izolace pomocí NaCl poskytovala chloroplasty, které byly schopné jen malé asimilace CO2 1,5 µmol CO2/mg Chl/hod., což představovalo asi 1 % fotosyntetické aktivity očekávané u nejlepších listů matečné rostliny. Lepších výsledků bylo dosaženo chloroplastů s narušenou strukturou a přídavkem fruktóza–1,6–bisfosfátu (6 µmol CO2/mg Chl/hod.). I tato hodnota však nebyla nikterak vysoká. Nicméně vysoké výtěžky probíhající fotosyntézy byly vítány, nebyly však zásadní. Klíčové bylo pomocí extracelulární fotosyntézy pochopit biochemické a biofyzikální aspekty celého procesu. A zároveň během tohoto in vitro extracelulárního procesu dosáhnout stejných intermediátů a konečných produktů jako v procesu in vivo. Jeden z důvodů, proč docházelo k nízké asimilaci CO2, byl objasněn v momentě, kdy byla objevena přítomnost enzymů katalyzujících asimilaci CO2 ve stroma chloroplastu. Rozpustnost enzymů ve vodě mohla být, v případě využití vodných médií k izolaci chloroplastů, 60


Dana Kettnerová

důvodem ke snížení koncentrace enzymů a tedy i ke snížení efektivity asimilačního procesu. Z tohoto důvodu se jevilo jako výhodné učinit takové úpravy v izolačních postupech, aby nebyla narušována struktura chloroplastu (tedy především jeho dvojitá membrána), případně byla využita pro izolaci nevodná média. Proto byly upraveny ty kroky izolace, které mohly jakýmkoli způsobem narušovat strukturu chloroplastu (snížení doby macerace, šetrnější rozemílání materiálu, nevyužívání rozmělňování pomocí písku, zrychlení celého izolačního procesu). Zkoumáno bylo též srovnání izolace pomocí roztoku sacharidů a roztoku NaCl. Přičemž bylo zjištěno, že sacharóza, sorbitol, mannitol, inositol a glukóza vykazovaly přibližně stejný efekt. V případě použití roztoku soli jako média pro izolační roztok i pro roztok určený pro chemickou analýzu, byla míra asimilace asi čtvrtinová oproti využití mannitolu a sorbitolu jako médií pro chemickou analýzu. Pokud byly chloroplasty izolovány pomocí mannitolu a sorbitolu a pro analyzační roztok byl použit roztok NaCl, byla asimilace poloviční. Nicméně pouze malý pokles asimilace byl zaznamenán při využití NaCl pro izolaci a roztoku sorbitolu pro analyzační roztok. Nahrazení NaCl sacharidem či derivátem sacharidu za použití v té době nových pufrů a anorganického fosfátu spolu s využitím kratší a jemnější izolační metody vede k fotosyntetické aktivitě chloroplastu listu špenátu odpovídající asi 30 % fotosyntetické aktivity intaktního listu. Dalším faktorem negativně ovlivňujícím asimilaci CO2 bylo použití Tris pufru jako složky analyzačního roztoku, hodnota asimilace rostla, byl–li tento pufr nahrazen Tricinem a částečně HEPES. 81) 82) Vynechání EDTA a isoaskorbátu v přípravném i analyzačním roztoku mělo na hodnoty asimilace negativní vliv (pokles až o 20 %). Malé změny hodnot pH přípravného (pH 7,2–8,0) a analyzačního roztoku (pH 7,6–8,0) neměly na hodnoty asimilace prakticky vliv. V případě větších výkyvů hodnot pH se však již vliv na hodnoty asimilace projevily. Rozdíly ve fotosyntetické aktivitě izolovaných chloroplastů jsou též závislé na stavu listů matečné rostliny (především stáří rostliny), době skladování utržených listů i na vnitřních faktorech (jako je např. množství zásobních sacharidů rostliny). Asimilace CO2 je zcela závislá na světle a k jejímu zvýšení nedochází přidáním ribóza–5–fosfátu, fruktóza–1,6–bisfosfátu a 3–fosfoglycerátu. 82) Se snahou popsat izolační metodu, která bude co nejjednodušší a zároveň bez ambicí dosahovat při této metodě izolace vysokých hodnot asimilovaného CO2, popsali v roce 1968 Cockburn, Walker a Baldry další z metod izolace chloroplastu. 61


Dana Kettnerová

Vychlazené listy špenátu byly za použití domácího mixéru krátce (3–5 s) homogenizovány spolu s 200ml média (0 °C) skládajícího se z 0,33 M sorbitolu, 5,0 mM MgCl2, 2 mM isoaskorbátu sodného, 10 mM Na4P2O7.10 H2O a upraveného pomocí HCl na pH 6,5. Následovala filtrace přes mušelín a asi 90 s chlazená centrifugace při 4000 x g. Pelety byly jemně resuspendovány v 1,0 ml ledového roztoku obsahujícího 0,33 M sorbitol, 1,0 mM MgCl2, 1,0 mM MnCl2, 2,0 mM EDTA, 50 mM HEPES pomocí NaOH upraveného na pH 7,6. Suspenze byla skladována v ledové lázni, aby mohlo dojít k provedení analýz. Byly porovnány takto izolované chloroplasty s chloroplasty získanými metodou Jensena a Basshama (1966). Při využití pyrofosfátového pufru bylo uvolňování kyslíku rychlejší a často dosahovalo uvolněné množství kyslíku vyšších hodnot než v případě metody Jensena a Basshama (použití MES místo pyrofosfátu). 79) 100) Jedna z dalších izolací využívající izolační médium popsané v roce 1966 79) byla provedena v roce 1979 s využitím gradientu Percollu vedoucím k zisku čistých intaktních chloroplastů. Za použití čerstvě sebraných listů Spinacia oleracea L. var. Kyoho nakrájených na malé kousky a 120 ml izolačního média o složení: 50 mM pufru MES–NaOH (pH=6,1) s obsahem 0,33 M sorbitolu; 2 mM Na2EDTA, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 0,02 M NaCl a 2 mM kyseliny isoaskorbové. Získaný homogenát byl filtrován přes Miracloth a filtrát byl centrifugován za chladu (4 °C) 70 s při 2500 x g. Získaný chloroplastový pelet byl suspendován v 5 ml izolačního média. Následovala gradientová centrifugace v Percollu, která vedla k zisku chloroplastů patřících do třídy A (intaktní chloroplasty). Pro gradientové rozdělení chloroplastové suspenze byla využita směs o hustotě 1,142 g/cm3 skládající se z 5 g PEG 6000, 1 g BSA, 1 g Ficollu 400 rozpuštěných ve 100 ml Percollu (dále jako PPBF). Pomocí PPBF s přídavkem 0,33 M sorbitolu; 2 mM Na2EDTA, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM pyrofosfátu sodného, 5 mM kyseliny isoaskorbové, 5 mM glutathionu a 50mM pufru HEPES–NaOH (pH=6,8) byl automaticky vytvořen, díky přístroji Hitachi DGK–U, lineární gradient (11–90 % v/v). Na 35 ml tohoto gradientu byly naneseny 2 ml chloroplastové suspenze. Následovala 15 min. centrifugace

pomocí

rotoru

s kolébkovým

závěsem

při

7000 otáčkách/min

(maximálně 8820 x g). Separovaná fáze chloroplastů byla přenesena do centrifugační zkumavky a třikrát zředěna pomocí média obsahujícího 0,33 M sorbitolu; 2 mM Na2EDTA, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM pyrofosfátu sodného, 5 mM kyseliny isoaskorbové, 5 mM glutathionu a 50mM pufru HEPES–NaOH (pH=6,8) (dále jako 62


Dana Kettnerová

G–R médium). Chloroplasty byly znovu sedimentovány pomocí dříve popsaného postupu využitého při přípravě „surových“ chloroplastů. Získaný pelet byl následně resuspendován v G–R médiu a až do provedení analýz uchován v ledové lázni. Pomocí aktivity jednotlivých enzymových markerů byla zkoumána kontaminace chloroplastů mitochondriemi a peroxizomy. Změřená aktivita katalázy v „surovém“ izolátu chloroplastů byla 13 % celkové aktivity, v suspenzi intaktních chloroplastů byla její aktivita výrazně redukována (1,4 %). V případě cytochrom–c–oxidázy byla aktivita v „surovém“ izolátu 22 %, po pročištění pomocí gradientu Percollu již jen 2,8 %. Mimo jiné byla též použita mikroskopie s fázovým kontrastem, která prokázala přítomnost neporušeného dvojitého obalu chloroplastu. Provedení Hillovy reakce s využitím ferrokyanidu bylo zjištěno, že suspenze chloroplastů pročištěná pomocí gradientu Percollu obsahovala 90 % chloroplastů třídy A. Gradient Percollu je tedy výborným purifikačním médiem využitelným pro izolaci čistých intaktních chloroplastů. (92) Metodu izolace s využitím sorbitol–pyrofosfátového média 82) využili pro svůj výzkum týkající se asimilace CO2 pomocí izolované ribulosa–1,5bisfosfátkarboxylázy, listů špenátu a chloroplastů izolovaných z Spinacia oleracea Lilley a Walker v roce 1975. Procentuální zisk neporušených chloroplastů byl určen pomocí kyslíku uvolňujícího se po přidání ferrokyanidu k suspenzi chloroplastů před a po osmotickém šoku. 83) Tato metoda umožňuje rozlišit poškozené chloroplasty, u nichž dochází po přidání ferrokyanidu k uvolňování kyslíku, od chloroplastů s nepoškozenou dvojitou membránou a chloroplastů, u nichž došlo po prasknutí obalu a vylití bílkovin stromatu k znovuuzavření obalu. Bohužel však tato metoda neumožňuje rozlišit chloroplasty nepoškozené od chloroplastů znovuuzavřených. Intaktnost chloroplastů může být určována pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem. Jedná se však o metodu, která je časově náročná a z mnoha důvodů může být i značně nepřesná (např. u některých chloroplastů není jednoznačně rozpoznatelné, jestli se jedná o nepoškozený či poškozený chloroplast). Proto je možné některým těmto problémům předejít využitím skenovacího zařízení. Rozpoznání na základě jasu má však též svá rizika, např. špatné rozlišení a považování dvou izolovaných chloroplastů za jeden rezultující v chybný celkový součet izolovaných chloroplastů. 84) Další možností je využití měření poměru absorbancí A550/A680. Je–li hodnota poměru rovna přibližně 1 jedná se o intaktní chloroplasty, nabývá–li hodnoty 0,2 – 63


Dana Kettnerová

0,3 jedná se o poškozené chloroplasty. Možnostmi stanovení intaktních chloroplastů se zabýval výzkum v roce 1975. K pokusům byl použit postup publikovaný v roce 1973 (Schwenn, Lilley a Walker). Byl však použit obměněný izolační roztok o složení: 0, 33 M sorbitol, 10 mM Na4P2O7, 5, 0 mM MgCl2, 2 mM D – isoaskorbát upravený na hodnotu pH 6, 5 pomocí HCl. A resuspendaci chloroplastů v roztoku obsahujícím: 0,33 M sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl2, 1,0 mM MnCl2 a 50 mM HEPES upravený pomocí KOH na hodnotu pH 7,6. 84) 85) Jednou z možností, jak získat vysoké množství intaktních chloroplastů byla izolace chloroplastů z protoplastů. Nishimura, Graham a Akazawa (1976) využili svého předchozího výzkumu 86) k izolaci protoplastu z listů Spinacia oleracea L. var. Kyoho. Metodu obměnili pouze snížením koncentrace mannitolu na 0,7 M. Izolace chloroplastu z protoplastu proběhla pomocí 2 ml 0,05 M Tricin–NaOH pufru obsahujícího 0,5 M sacharózu a 0,1 % BSA. Protoplasty byly prasknuty pomocí injekční stříkačky (0,5 x 4 cm, Termo). Po každém vpichu byl obsah jehly pozorován pod mikroskopem. Pro rozbití protoplastu byly obvykle dostačující tři vpichy. Následně bylo 0, 5 ml suspenze prasklých protoplastů navrstveno na 15 ml lineárního gradientu sacharózy (35–60 % w/w) a po rozpuštění v 0,02 M Tricin–NaOH pufru (pH=7,5) centrifugováno v chlazené centrifuze (4 °C) 3 hod. při 24000 otáčkách za minutu. Následně byly měřeny enzymatické aktivity a obsahy jednotlivých frakcí. Chloroplasty

vytvořily

v sacharózovém

gradientu

oddělený

prstenec

(d=1,21), který byl prakticky prostý jakýchkoli jiných protoplastových částic a zbytků. V mikroskopu bylo kolem chloroplastů pozorováno haló, což značilo, že byly izolovány intaktní chloroplasty. Výtěžnost této procedury činila 93 %. 87) Izolace chloroplastů z protoplastů obiloviny Triticum aestivum L. byla provedena v 1976. Izolované protoplasty byly poměrně stabilní - více než 20 hod., během kterých mohla být provedena izolace chloroplastů bez toho, aby došlo ke ztrátě původní CO2 fixační kapacity. Oproti chloroplastům získaným mechanickým mletím vykazovaly takto izolované chloroplasty vysokou míru intaktnosti. Chloroplasty izolované pomocí mechanického mletí vyžadovaly pro maximální fixaci CO2 přídavek ADP a ribóza–5–fosfátu. U chloroplastů získaných z protoplastů bylo pro maximální fixaci CO2 potřebné přidat do média 0,75 mM hořčík. Přidání askorbátu sodného do média vedlo k lineárnější CO2 fixaci/čas. Oproti ostatním izolacím bylo v případě izolace chloroplastů z pšenice třeba více alkalické pH (8,2– 8,6). 89) 64


Dana Kettnerová

Další izolace chloroplastů z protoplastů praporovitých listů Triticum aestivum L. sloužila opět ke studiu průběhu fotosyntézy. K 0,4–1 ml suspenze protoplastů (obsahující přibližně 20 µg Chl/0,1 ml) bylo přidáno 5 ml 0,5 M sorbitolu a 1 mM CaCl2. Pelet získaný 2 min. centrifugací při 250 x g byl suspendován v 0,4–1 ml 0,4 M sorbitolu, 50 mM HEPES–KOH (pH=7,6), 10 mM NaHCO3 a 1 mM EDTA. K získání protoplastového extraktu byla použita jednorázová injekční stříkačka, špička stříkačky byla odříznuta a na její konec byla připevněna 20 µm nylonová sítka. Protoplasty byly rozbity pomocí nasátí suspenze do stříkačky a vypuštění ven (opakováno 3 x). Protoplastový extrakt byl centrifugován 90 s při 250 x g a získaný chloroplastový pelet byl suspendován pomocí třepání v 0, 1 ml 0, 4 M sorbitolu, 50 mM HEPES – KOH (pH 7, 6), 10 mM NaHCO3 a 1 mM EDTA. Chloroplasty byly použity do 1 hod. od izolace. Intaktnost chloroplastů byla kontrolována pomocí ferrokyanidu a dosahovala hodnoty 90 %. 88) Izolaci z praporovitých listů provedli v témže roce i Leegood a Walker s využitím izolační metody popsané výše 88) 90) Centrifugace byla provedena za stejné rychlosti, ale kratší dobu (40 s při 250 x g). Místo HEPES–KOH pufru se objevil v izolační směsi Tricin, byla přítomna nižší koncentrace sacharózy, vyšší koncentrace EDTA a alkaličtější pH (8,4). Izolační médium a médium pro resuspendaci obsahovalo: 0,33 M sorbitolu, 25 mM Tricin (pH 8, 4), 10 mM NaHCO3 a 10 mM EDTA. Pro prokázání nevhodnosti mechanické izolace chloroplastů pro tento rostlinný druh, byla provedena i izolace mechanická. Mechanická metoda izolace byla provedena s 20 g listů, které byly nasekány na malé kousky a homogenizovány se 150 ml rozmělňovacího média, obsahujícího 0,33 M sorbitol, 10 mM NaHCO3, 10 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0,1 % (w/v) BSA, 0,2 % (w/v) D–isoaskorbát sodný a 20 mM HEPES (pH 7,6), 4 s v mixéru Polytron. Homogenát byl filtrován přes mušelín a vatu. Filtrát byl centrifugován pomocí rotoru s kolébkovým závěsem z klidu na 6000 otáček/min. a do klidu po 90 s. Intaktnost chloroplastů byla ověřena pomocí přidání ferrokyanidu do směsi (před osmotickým šokem a po něm). Díky metodě izolace pomocí protoplastů bylo získáno z buněk mladých listů pšenice 70–80 % intaktních chloroplastů, zatímco mechanická izolace těchto listů neposkytla žádné intaktní chloroplasty. Izolace z praporovitých listů vedla k izolaci chloroplastů, které byly z více než 90 % intaktní. Pro dosažení maximálních hodnot

65


Dana Kettnerová

fotosyntézy bylo třeba jak v případě mladých listů pšenice, tak v případě listů praporovitých, dodat do média EDTA. 90) Požadavky na chelataci při získávání funkčních chloroplastů z pšenice a slunečnice stanovil Edwards (1978). Fotosyntetické aktivita chloroplastů slunečnice izolované při pH 8,4 pomocí 0, 2 mM EDTA byla silně inhibována přidáním 2 mM CaCl2, MgCl2 či MnCl2 do média. Chloroplasty pšenice izolované bez chelatace při pH 8,4 vykazovaly malou míru fotosyntetické aktivity, která byla navíc inhibována po přidání 2–4 mM CaCl2, MgCl2 či MnCl2 do média. 91) Izolaci chloroplastů z protoplastů modelové rostliny Arabidopsis thaliana uskutečnili v roce 1981 C. R. Somerville, S. C. Somerville a W. L. Ogren. Zlepšení stability fotosyntetické kapacity chloroplastů bylo pozorováno po přidání Mg2+ iontů k médiu s izolovanými chloroplasty uloženému ve tmě. U ostatních rostlinných druhů je po přidání Mg2+ pozorován spíše opačný fenomén. Jako nezbytná součást izolačního média pro izolaci funkčních chloroplastů se ukázala EDTA resp. EGTA. Množství chloroplastem uvolňovaného kyslíku dosahovalo hodnoty 97 µmol O2/mg Chl/hod. 98) Upravený izolační postup vycházející z předchozí metody 98) byl publikován v roce 1998. K izolaci chloroplastů byl použit izolační roztok (pH 8,4) o složení: 330 mM sorbitol, 20 mM Tricin-KOH, 5 mM EGTA, 5 mM EDTA, 10 mM Na2CO3, 0,1 % BSA a isoaskorbát (330 mg/l). Pelet získaný po první centrifugaci byl resuspendován v izolačním roztoku s přídavkem 40 % (v/v) Percollu a navrstven na krokový gradient Percollu: 2 ml 70 % (v/v) Percollu, 4 ml 50 % (v/v) Percollu, 4 ml 40 % (v/v) Percollu. K naředění Percollu byl použit izolační roztok doplněný o isoaskorbát (330 mg/l) a glutathion (132 mg/l). K dalšímu pročištění pomocí izolačního roztoku byl použit prstenec chloroplastů nacházející se na rozhraní mezi 50 % a 70 % Percollem. Hodnocení

intaktnosti

bylo

provedeno

pomocí

fázově – kontrastní

mikroskopie. Neporušených bylo více než 90 % chloroplastů. 104) Dalším výzkumem týkajícím se izolace chloroplastů z Arabidopsis thaliana byl výzkum Fitzpatricka a Keegstry (2001) zabývají se optimalizací metody pro izolaci vysokého množství chloroplastů využitelných pro import prekurzorových proteinů. 108) Chloroplasty byly izolovány pomocí izolačního postupu popsaného v roce 1994 (Bruce a kol.) 107) nebo z protoplastu. V případě první možnosti byl využit izolační postup Bruce a kol. s malou obměnou - homogenizační médium 66


Dana Kettnerová

neobsahovalo askorbát sodný a glutathion. Centrifugace byla provedena při 350 x g, chloroplasty byly pročištěny pomocí kontinuálního gradientu 50 % (v/v) Percollu a resuspendovány v médiu (pH 8, 0) určeném pro import (0, 33 mM sorbitol, 50 mM HEPE - KOH). V druhém případě byly celé rostliny rozsekány v médiu majícím pH 5,2 a složení: 0,4 M sorbitol, 20 mM MES-OH, 0,5 mM CaCl2. Protoplasty byly izolovány enzymovou metodou (4 % celuláza Onozuka R–10, 0,08% Macerozym R – 10) v pufru (pH 5,2) složeném z 400 mM sorbitolu, 20 mM MES-KOH, 0,5 mM CaCl2. Pufrem stejného složení, ale rozdílného pH (pH 6,0) byly po filtraci a centrifugaci (100 x g) promyty. Pelet byl resuspendován v médiu složeném z 0,3 mM sorbitolu, 20 mM Tricin-KOH (pH=8,4), 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 10 mM NaHCO3, 0,1 % BSA a filtrován. Uvolněné chloroplasty byly pročištěny pomocí kontinuálního gradientu 50 % Percollu, případně centrifugací při 250 x g a resuspendovány v importním médiu. Intaktnost

byla

kontrolována

pomocí

latence

glyceraldehyd–3–

fosfátdehydrogenázy (NADP+) podle Zeemana (1995). 108) 109) Metoda izolace chloroplastů ovlivňuje následnou kapacitu chloroplastů pro proteinový import. 108) Roku 1989 byla provedena izolace chloroplastů z protoplastů Phaseolus vulgaris L. Protoplasty získané enzymatickou izolací byly opatrně zlyzovány, čímž došlo k uvolnění chloroplastů. Izolované chloroplasty byly purifikovány pomocí Percollu. Izolované chloroplasty byly z více než 90 % intaktní a hodnota uvolňovaného kyslíku byla přibližně 100-120 µmol O2/mg Chl/hod. Pro maximální průběh fotosyntézy se jako zásadní ukázala přítomnost EDTA v purifikačním médiu i v médiu určeném pro analýzu. 99) Porovnání některých faktorů ovlivňujících míru průběhu fotosyntézy mezi dvěma rostlinnými druhy provedli v roce 1977 Stankovic a Walker. Zaměřili se na ovlivnění fotosyntézy chloroplastů pomocí přidaného PPi a ADP. Pro studium použili chloroplasty izolované z rostlin Pisum sativum var. Feltham First a Spinacia oleracea. Pro izolaci chloroplastů ze špenátu byl použit izolační postup popsaný v roce 1974.

93)

Chloroplasty hrachu byly izolovány z listů a výhonků. 80 g rostlinného

materiálu bylo přidáno do 250 ml rozmělňovacího média (pH=6,5) obsahujícího: 0,33 M sorbitolu 0,1 % (w/v) NaCl, 0,1 % BSA, 0,2 % D–isoaskorbátu sodného a 0,1 M MES a homogenizováno 2–4 s v mixéru Polytron. Následovala filtrace přes 67


Dana Kettnerová

mušelín a vatu a centrifugace filtrátu z klidu na 6000 otáček/min. a do klidu po 90 s. Pelet byl promyt v 4 % koncentraci resuspendačního média (pH=7,6), které obsahovalo: 0,33 M sorbitol, 1 mM EDTA, 10 mM KCl, 50 mM HEPES. U chloroplastů špenátu a hrachu bylo prokázáno rozdílné chování, čímž by mohly být objasněny některé nesrovnalostí z předchozích výzkumů, kdy se předpokládalo, že vlastnosti chloroplastů C3 rostlin jsou v zásadě podobné. V experimentu byl testován vliv PPi a ADP na průběh fotosyntézy. U chloroplastů hrachu bylo zjištěno, že při použití média obsahujícího ADP i PPi dochází ke stimulaci fotosyntézy. Pokud byly ADP i PPi přidány do média samostatně, docházelo naopak k inhibici fotosyntézy. Přídavek ATP vykazoval menší, případně žádnou inhibici. Pokud bylo ATP přidáno spolu s PPi, docházelo opět k stimulaci fotosyntézy. U hrachu byl však pozorován úplně jiný průběh. Samostatný přídavek PPi do média vedl k stimulaci fotosyntézy a přídavek exogenních adenylátů většinou nevyvolal vůbec žádnou reakci. 94) Vylepšenou

metodu

izolace

intaktních

chloroplastů

s vysokou

fotosyntetickou kapacitou představili v roce 1984 Cerović a Plesničar. Při izolaci vycházeli s Walkerova izolačního postupu 77) 96) 97), použili však obměněné médium s nízkým obsahem kationtů, které bylo použito jak pro rozmělňování rostlinného materiálu, tak pro promývání izolovaných chloroplastů. Pro izolaci byly použity výhonky hrachu Médium o pH=7,8 se skládalo z: 343 mM sorbitolu, 0,4 mM KCl, 0,04mM EDTA a 2 mM HEPES. Namísto dvou pufrů s rozdílným pKA byl použit HEPES pufr (preferován před Tris) o co nejnižší koncentraci, díky čemuž mohlo být dosaženo nízké koncentrace kationtů v médiu. Získaný pelet čistých chloroplastů byl opatrně resuspendován v 0,5 ml až 1 ml média (pH=7,9) o složení: 330 mM sorbitolu, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1% BSA a 50 mM HEPES pufru. Tento izolační postup umožnil zisk chloroplastů s vysokou mírou intaktnosti a malou variabilitou. 96) Vliv stresu, vyvolaného přídavkem NaCl do živného média rostliny, na listy Spinacia oleracea byl zkoumán v roce 1983. K listům rostliny Spinacia oleracea var. Hybrid 102 byl přidáván každý den 3 M roztok NaCl, a to v takovém množství, aby bylo pokaždé dosaženo zvýšení koncentrace NaCl o 25 mM. Roztok NaCl byl přidáván do živného média až do dosažení koncentrace 200 mM. Po třech týdnech byl pokus ukončen a listy špenátu byly podrobeny analýze. Chloroplasty byly 68


Dana Kettnerová

izolovány za použití roztoků neobsahujících Na+, K+ a Cl- ionty. Izolace probíhala při 0 °C za použití mixéru Polytron a rozmělňovacího média obsahujícího 330 mM sorbitolu, 30 mM MES, 2 mM askorbátu a 0,1 % BSA, pH bylo pomocí Tris upraveno na hodnotu 6,5. Následovala filtrace přes Miracloth a vatu. Filtrát byl centrifugován 1 min. při 1200 x g. Pelet byl resuspendován v resuspendačním médiu složeném z 330 mM sorbitolu, 30 mM HEPES a 0,2 % BSA, jehož pH bylo upraveno pomocí Tris na 7,6. K pročištění chloroplastů byla jejich suspenze umístěna spolu s 40 % Percollem a resuspendačním médiem do centrifugační zkumavky a 1 min. centrifugována při 1200 x g. Pelet byl znovu resuspendován pomocí resuspendačního média. Ukázalo se, že špenát je poměrně odolný vůči osmotickým změnám. Přídavek NaCl způsobil retardaci růstu rostliny špenátu, nedošlo však k úplné zástavě jejího růstu ani k jiným pozorovatelným změnám. Vysoké koncentrace Na+ a Cl- v listech špenátu ukázaly, že rostlina není schopna NaCl vyloučit tak, jak to dělají některé rostliny, které zvýšené koncentraci soli tolerují. Fotosyntetická kapacita však zůstala vůči kontrolnímu vzorku prakticky nezměněna. Míra elektronového transportu byla jen o něco málo nižší než u kontrolního vzorku, stejně jako množství uvolněného kyslíku. 101) Příjmem exogenního askorbátu chloroplasty a redukcí dehydroaskorbátu závislé na světle se s využitím chloroplastů izolovaných z listů Spinacia oleracea var. Yates hybrid 102 podle Walkera 97) zabýval vědecký tým v roce 1983. Malá změna byla provedena ve složení izolačního média, při jehož přípravě nebyl tentokrát použit askorbát. Neporušenost izolovaných chloroplastů byla zkontrolována pomocí ferrokyanidu postupem, který popsali Lilley a kol. 83) Izolaci chloroplastů z buněk hnědé řasy Laminaria digitata uskutečnili v roce 1994 Strbac, Rodrigues, Santos a Hall. Při izolaci bylo použito izolační médium (pH=8,0) o složení 1,0 M sorbitol, 150 mM TBE, 5 mM EDTA, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 0,5 mM K2HPO4, 2 mM NaNO3, 1,2 % (w/v) BSA a 4 mM cystein. Pelet získaný centrifugací byl kvůli odstranění přebytečného slizu opatrně promyt pomocí izolačního média. Následovala opatrná resuspendace v izolačním médiu a opětovná centrifugace. V dalším kroku byl získaný pelet resuspendován v reakčním médiu (pH= 7,8) obsahujícím 1, 0 M sorbitol, 50 mM HEPES–KOH, 2 mM EDTA, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2, 0, 5 mM K2HPO4 s přídavkem BSA. Všechny kroky izolace byly prováděny za teploty 0 °C. 69


Dana Kettnerová

Intaktnost chloroplastů byla ověřena mimo jiné pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem. Díky vysokému obsahu slizu, který nepříznivě ovlivňoval izolované chloroplasty, nebylo možné opakování celé izolace, které by mohlo zvýšit výtěžnost provedené izolační metody. Jeden z cílů experimentu se týmu bohužel nepodařilo naplnit. Tímto cílem byla opakovatelnost izolační metody, která nebyla možná zejména kvůli vysokému obsahu slizu, který nepříznivě ovlivňoval izolované chloroplasty. 103) Chloroplasty izolované z Nicotiana tabacum L. a Triticum aestivum L. využili Benková a kol. (1999) k prokázání přítomnosti cytokininů v chloroplastech. K izolaci chloroplastů z listů tabáku bylo použito homogenizační médium (pH=7,5) o složení: 0,33 M sorbitol, 50 mM Tris, 0,4 mM KCl, 0,04 mM Na2EDTA, 0,1 % (w/v) BSA, 1 % (w/v) PVP a 5 mM kyseliny isoaskorbové a resuspendační médium (pH=7,6) skládající se z: 0,33 M sorbitolu, 2 mM Na2EDTA, 1 mM MgCl2,1 mM MnCl2 a 50 mM HEPES. K oddělení chloroplastů s neporušeným obalem byla využita diferenciální centrifugace s využitím 20 ml 40 % (w/v) a 10 ml (w/v) Percollu. 105) V roce 2011 byla publikována izolační metoda sloužící k simultánní izolaci chloroplastů a mitochondrií z mechu Physcomitrella patens. Při izolaci byl použit izolační pufr obsahující 1 % (w/v) PVPP, 0,3 mM D-sorbitol, 50 mM HEPES, 2 mM NaEDTA, 1 mM MgCl2, 0,1 % BSA a inhibitor proteázy (0,1 % (v/v) Sigma Plant Protease Inhibitor Cocktail P 9599). K filtraci byl použit Miracloth, filtrát byl centrifugován při 1500 x g 10 min. Slitý supernatant byl použit k izolaci mitochondrií. Získaný pelet byl resuspendován v resuspendačním médiu o složení: 0,3 mM D-sorbitol, 50 mM HEPES, 2 mM NaEDTA, 1 mM MgCl2 a 0,1 % BSA. K oddělení intaktních chloroplastů byl využit hustotní gradient Percollu (navrstveno bylo po 5 ml 10 %, 40 % a 80% Percollu). Po 20 min. centrifugaci při 16000 x g se poškozené chloroplasty nacházely na rozhraní 10 % a 40 % Percollu, intaktní chloroplasty pak na rozhraní 40 % a 80 % Percollu (viz obrázek č. 2). Frakce obsahující intaktní chloroplasty byla odebrána pomocí skleněné pipety, dvakrát promyta pomocí promývacího média, které mělo, až na absenci BSA, složení totožné s resuspendačním médiem, a centrifugována 10 min. při 1500 x g. Čistota chloroplastů byla kontrolována pomocí fluorescentní mikroskopie. 106)

70


Dana Kettnerová

Obrázek č. 2: Purifikace chloroplastů v hustotním gradientu Percollu 106) Roku 2012 byly izolovány dimorfní chloroplasty z C4 rostliny Bienertia sinuspersici. Chloroplasty byly uvolněny z protoplastu Bienertia sinuspersici pomocí hypoosmotické lýzy za stanovených podmínek. Chloroplasty byly pročištěny pomocí krokového gradientu Percollu. 110)

5.5.3

Souhrn Míra fotosyntézy vykazovaná chloroplasty se odvíjí od izolační metody. Ve

většině případů jsou preferovány takové metody, které umožňují zisk homogenní populace chloroplastů typu A schopných fixace velkého množství CO2. Jednou z metod umožňující zisk takovýchto chloroplastů je izolace z protoplastu. I přes to jsou však většinou preferovány chloroplasty izolované mechanickou metodou. Důvodů této preference je více, patří mezi ně jednoduchá proveditelnost izolace, stabilita, rychlost metody a nízké náklady. Naopak mezi nevýhody této metody se řadí omezení na poměrně malé množství rostlinných druhů (špenát, hrách), rozdílná míra intaktnosti chloroplastů, rozdílná aktivita lišící se preparát od preparátu. Tento problém byl vyřešen použitím izolačního média neobsahujícího ionty 95), nicméně toto použití vykazovalo pro změnu jiné nedostatky, především nestabilitu izolované suspenze a lišící se míru aktivity chloroplastů. 96) Izolace chloroplastů z protoplastů je využívána především pro izolaci chloroplastů z pšenice a částečně i ze slunečnice, které při mechanické izolaci

71


Dana Kettnerová

poskytují, i přes užití nejrůznějších protektivních agens, malé množství intaktních chloroplastů. Po mechanických izolacích, používaných k izolaci především u hrachu a špenátu, poskytla tedy tato nová metoda poměrně účinný nástroj k vysokému zisku intaktních chloroplastů. 90) Pokud jsou chloroplasty izolovány z listů, je nejprve z listu odstraněno střední žebro a ostatní výraznější žilky.

5.5.3.1 Složky izolačního a resuspendačního pufru Jednou z nejdůležitějších součástí pufrů je osmotikum. Osmotikum zabraňuje při izolaci prasknutí chloroplastu v důsledku hypotonického šoku. Jako osmotika se používají mannitol, sorbitol a sacharóza. Preferovány jsou sorbitol (používá se u většiny izolací) a mannitol, protože nejsou obvykle metabolizovány. Jelikož je rostlinná buňka při rozemílání rostlinného materiálu v průběhu mechanické izolace chloroplastu vystavena velké síle (nutné k rozrušení buněčné stěny), dochází zpravidla i k prasknutí vakuoly (vakuol). V důsledku prasknutí vakuol dochází k uvolnění jejich obsahu a roste riziko poškození izolovaných chloroplastů hydrolytickými enzymy, sekundárními metabolity a dalšími složkami vakuolárního obsahu. Aby se tomuto předešlo, jsou součástí pufrů protektivní látky, např. PVP, BSA a redukující činidla (cystein, β-merkaptoethanol, askorbát). Další možností je využít izolaci chloroplastu z protoplastu, kdy tento problém nevzniká. Přídavek EDTA chrání membránu chloroplastu před poškozením iondependentními lipázami a fosfolipázami. 111) K stabilizaci izolované suspenze chloroplastů se využívá solí s obsahem Mg2+ a Mn2+ iontů. 96) Pufry samotné (Tris, HEPES, MES) slouží k udržování příslušného pH izolačního a resuspendačního média. Z důvodu kontaminace chloroplastů získaných diferenciální centrifugací nejrůznějšími nečistotami (rozpustnými hydrolázami, fragmenty membrány a dalšími buněčnými částmi, případně bakteriemi), je vhodné provést další purifikaci. Nejvíce se ověřila centrifugace v hustotním gradientu Percollu či sacharózy. 111)

72


Dana Kettnerová

K purifikaci chloroplastů může být použit resuspendační roztok spolu s 40 % Percollem. Resuspendační roztok může obsahovat tyto složky: sacharóza, sorbitol, EDTA, EGTA, NaHCO3, MgCl2, MnCl2, MgSO4, HEPES, Tris, BSA (tučně zvýrazněny jsou nejčastěji přítomné složky). V resuspendačním roztoku musí být udržováno příslušné pH, aby nedošlo k poškození izolovaných chloroplastů, to zajišťuje přítomný pufr. Po centrifugaci (1200 x g, 1 min.) vytváří poškozené chloroplasty prstenec na rozhraní resuspendačního média a Percollu, zatímco intaktní chloroplasty vytváří pelet, který je většinou dále resuspendován a použit k analýze. 102) Délka a rychlost centrifugace se u jednotlivých metod liší a je třeba je stanovit experimentálně.

5.5.3.2 Izolace detailní příklad Níže je detailně popsána metoda izolace chloroplastů podle Aranssona H. a Jarvise P. (2002). Po objevení metody izolace chloroplastů z protoplastů byl vyřešen problém týkající se nízké výtěžnosti provázející izolační metody, nikoli však problém časové finanční náročnosti. S takovouto metodou izolace přišli v roce 2002 Aransson H. a Jarvis P. z Leicesterské univerzity. Jimi publikovaná metoda izolace chloroplastů byla rychlá a vyžadovala méně finančních prostředků než metody předcházející. Kromě izolace samotné se zaměřili i na problematiku proteinů a popsali způsob, jakým mohou být proteiny importovány do izolovaných chloroplastů. Ke svým pokusům využili rostlinný materiál z Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., tedy z modelového a velmi dobře popsaného rostlinného organismu. Chloroplasty huseníčku se staly po chloroplastech hrachu (Pisum sativum L.) druhým modelovým systémem využívaným k importu proteinů. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 58) Rostlinný materiál využitý pro izolaci Semena

Arabidopsis

thaliana

(ekotyp

Columbia – 0)

byla

5 min.

sterilizována v 70 % (v/v) ethanolu a 0,05 % (v/v) Tritonu X-100. Následovala sterilizace v 100 % ethanolu a sušení vzduchem v boxu s laminárním prouděním. Semena byla zasazena do média v Petriho miskách (průměr 9 cm, v jedné misce 100–120). Médium se skládalo z MS směsi vitamínů a solí, 0,5 % (w/v) sacharózy a 73


Dana Kettnerová

0,6 % (w/v) Bacto agaru. Každá mistička byla utěsněna páskou Leukopor a inkubována 48 hodin při 4 °C s cílem aktivovat semena. Následně byla pěstována 10, 14 či 28 dní za bílého světla (120 μmol/m2/s) s využitím dlouhodenního cyklu (16 hodin světlo/8 hodin tma) v boxu pro rostlinné tkáňové kultury (Percival). Izolační postup Pro každou izolaci bylo použito 25–40 Petriho misek s rostlinami starými 10, 14 a 28 dní. V případě desetidenních rostlin to odpovídá zhruba množství 2500 – 4000 rostlin či hmotnosti 7,5 až 12 g rostlinné tkáně. Rostlinný materiál byl udržován při teplotě 4 °C. Rostliny byly v 50 ml kádince za použití izolačního pufru a mixéru Polytron (Kinematica PT20) s malým rotorem 3–4 s homogenizovány. Izolační pufr měl složení: 0,3 M sorbitol, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 5 mM EDTA, 20 mM HEPES-KOH, pH=8,0, 10 mM NaHCO3. Homogenát byl filtrován přes dvojitou vrstvu Miracloth filtru (Calbiochem). Zbytek, který zůstal na filtru, byl vrácen do kádinky s 20 ml čerstvého izolačního roztoku a homogenizace byla opakována, celkově byla homogenizace provedena pětkrát. Veškerý získaný homogenát byl centrifugován při 1000 x g 5 min. Pelet byl resuspendován přibližně v 500 ml izolačního pufru.

Purifikace Resuspendované chloroplasty byly naneseny na dvoukrokový (v 20 ml zkumavkách Corex) či lineární (30 ml zkumavky Nalgene) gradient Percollu. Dvoukrokové gradienty byly připraveny z dolní 3 ml vrstvy skládající se z 2,55 ml roztoku Percollu (95 % (w/v) Percoll, 3 % (w/v) PEG 6000, 1 % (w/v) Ficoll, 1 % (w/v) BSA) a 0,45 ml gradient tvořící směsi (25 mM HEPES–NaOH, pH=8,0, 10 mM EDTA, 5 % (w/v) sorbitol) a 7 ml vrchní vrstvy skládající se z 2,94 ml roztoku Percollu a 4,06 ml gradient tvořící směsi. Takto připravené gradienty byly centrifugovány pomocí rotoru s kolébkovým závěsem při 1500 x g 10 min. Lineární gradienty složené z 13 ml Percollu, 13 ml izolačního pufru a 5 mg glutathionu byly pre–centrifugovány na rotoru s fixním úhlem při 43000 x g 30 min. Po přidání chloroplastů byly lineární gradienty centrifugovány pomocí rotoru s kolébkovým závěsem při 7800 x g po dobu 10 min.

74


Dana Kettnerová

Chloroplasty byly obsaženy v prstenci vytvořeném mezi fázemi (u dvoukrokového gradientu) či ve spodním prstenci (u lineárního gradientu). Poškozené chloroplasty nacházející se v horním prstenci byly odebrány a vyhozeny. Nepoškozené chloroplasty byly získány ze zkumavky pomocí špičky Gilsonovy pipety, která byla na konci uříznuta. Dále bylo k chloroplastům přidáno 30 ml HMS pufru (50 mM HEPES, 3 mM MgSO4, 0,3 M sorbitol), případně 30 ml HS pufru (50 mM HEPES, 0,3 M sorbitol), a zkumavka byla opatrně otočena, aby došlo k vymytí Percollu. Chloroplasty byly centrifugovány pomocí rotoru s kolébkovým závěsem při 1000 x g 5 min. Supernatant byl slit a vyhozen. Pelet byl resuspendován ve zbylém HMS (či HS) pufru. Hodnocení Stanovení výtěžku chloroplastů bylo provedeno pomocí hemocytometru a neporušenost chloroplastů byla ověřena pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem a transmisní elektronové mikroskopie. Izolované chloroplasty byly využity k importu proteinů. Izolace chloroplastů z protoplastů byla provedena dle postupu uveřejněného v roce 2001 108), ovšem s malými úpravami. Koncentrace celulázy byla zredukována dvakrát a to na koncentraci 2 %. Nižší koncentrace celulázy se ukázala jako dostatečná pro izolaci chloroplastů dále využitelných pro studium transportu elektronů během fotosyntézy. Zároveň tato změna nijak výrazně neovlivnila množství získaných chloroplastů. V některých případech byl místo lineárního gradientu použit gradient dvoukrokový. Rozhodujícím faktorem pro izolaci se ukázal být poměr mezi množstvím rostlinné tkáně a objemem izolačního pufru. Důležitý byl též typ homogenizačního zařízení, velikost a rychlost rotoru mixéru Polytron, velikost homogenizační kádinky. Vyšší množství poškozených chloroplastů bylo zaznamenáno při zvyšování velikosti či rychlosti rotoru mixéru Polytron, případně při využití kuchyňského mixéru namísto mixéru Polytron. Za klíčový prvek celé izolace bylo prohlášeno opakování homogenizace. Právě tento krok izolace je klíčem k zisku vysokého množství neporušených chloroplastů. Typická izolace využívající přibližně 2500 rostlin, což představuje přibližně 7, 5 g rostlinné tkáně, vede k zisku neporušených chloroplastů přesahujícím množství 15 x 107. Toto množství odpovídá přibližně 40 μg chlorofylu na gram rostlinné 75


Dana Kettnerová

tkáně, což představuje množství přibližně osmkrát vyšší než množství chlorofylu získané z dříve uveřejněných přímých metod izolace chloroplastů z Arabidopsis thaliana, ale o trošku nižší množství v porovnání s izolací chloroplastů z protoplastů. Stanovení neporušenosti získaných chloroplastů pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem prokázalo, že porušené chloroplasty tvořili z celkového množství chloroplastů méně než 15 %. Metoda minimalizuje náklady a je méně časově náročná, nejen díky přímé izolaci chloroplastů z rostlinného materiálu, ale i díky možnosti využití již desetidenních rostlin. 58)

5.6 5.6.1

Vakuoly Definice Vakuoly jsou intracelulární membránové buněčné kompartmenty vznikající

činností endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu. 1) 2) 4) Rostlinné vakuoly oplývají velikou rozmanitostí. Liší se navzájem nejen tvarem, velikostí, obsahem, ale i funkční dynamikou. Přičemž jedna rostlinná buňka může obsahovat více druhů vakuol. 9) Na povrchu vakuol se nachází membrána – tonoplast, tvořící bariéru mezi obsahem vakuoly a cytoplazmou. Obsah vakuoly tvoří vodný roztok (buněčná šťáva). Tento vodný roztok se skládá z nejrůznějších typů látek. Některé složky vodného roztoku vakuoly jsou charakteristické pro všechny rostlinné vakuoly, jiné jsou specifické pro určitou taxonomickou jednotku, stádium rostlinného vývoje či typ rostlinného pletiva. 2) 4) V raných fázích vývoje se u rostlinné buňky nachází zpravidla několik malých vakuol, tzv. provakuol. S pokračujícím vývojem rostlinné buňky dochází k postupnému zvětšování provakuol. Provakuoly začínají navzájem fúzovat, pohlcují částečky cytoplazmy, až vytvoří jednu velkou vakuolu. Vakuola dospělé rostlinné buňky zabírá značnou část objemu buňky, zpravidla okolo 80%, toto číslo však může být i vyšší. Vakuola je u dospělé buňky lokalizována zpravidla ve středu, jako tzv. centrální vakuola. 2) 4) Vakuola tedy u dospělé buňky zaujímá většinu jejího obsahu a je zásadní pro většinu fyziologických procesů rostlinného organismu. Velikostí vakuoly je utlačována cytoplazma. Cytoplazma tak vytváří nástěnný povlak, ve kterém se nacházejí velké buněčné organely - jádro, plastidy a

76


Dana Kettnerová

mitochondrie. Dalším možným uspořádáním cytoplazmy jsou provazce. Provazce protínají vakuolu, v těchto provazcích se mohou nacházet i organely a jádro. 2) 4) 9)

5.6.2

Funkce vakuoly Vakuola zastává v rostlinné buňce velice široké spektrum funkcí. Mezi jednu

z nejdůležitějších patří udržování turgoru, který je pro existenci buňky zásadní. Vytváření osmotického tlaku, následně turgoru, pomáhá zajišťovat vakuolu kryjící tonoplast, který hraje důležitou roli v aktivním transportu iontů do vakuoly a jejich následném uchovávání ve vakuole. Díky tonoplastu se mohou ionty hromadit ve vakuole v podstatně vyšší koncentraci než v cytoplazmě, což vede k vytvoření potřebného osmotického tlaku a turgoru (tlak až o velikosti 2 MPa). 2) 9) Mezi další velice důležité funkce vakuoly patří udržování protoplazmatické homeostázy, skladování produktů látkové výměny, oddělování xenobiotik a trávení cytoplazmatických složek. 9)

5.6.2.1 Zachování homeostázy cytoplasmy Rostlinná buňka postrádá oproti buňce živočišné tělní tekutiny, skrze které by mohlo docházet k udržování konstantních fyziologických hodnot. Proto tuto funkci zastává

v rostlinné

buňce

vakuola.

Cytoplazma

potřebuje

k plnění

svých

fyziologických funkcí udržování relativně konstantní koncentrace metabolitů a iontů. Důležité je udržování hodnoty pH, tedy regulace koncentrace zejména H+ iontů, pH cytoplazmy musí být udržováno přibližně na hodně pH=7. Účinné udržování pH je možné díky nižší hodnotě pH (pH=5-6) obsahu vakuoly, tedy pH buněčné šťávy. Buněčná šťáva je díky vyšší koncentraci H+ iontů schopná kompenzovat změny pH cytoplazmy, které vznikají v důsledku změn pH v okolí rostlinné buňky. Dochází tedy ke změně pH buněčné šťávy, pH cytoplazmy však zůstává konstantní. Podobné vyrovnávací schopnosti vykazuje vakuola i vzhledem k jiným iontům a metabolitům. Vakuola zastává v podstatě funkci jakéhosi nárazníkového systému. 4)

5.6.2.2 Zásobní funkce Vakuola plní též funkci rezervoáru látek. Rostlina si vytváří ve vakuole krátkodobé nebo dlouhodobé rezervy. Krátkodobé rezervy jsou představovány 77


Dana Kettnerová

látkami, které jsou běžnou součástí metabolismu buňky. Dle aktuálních potřeb buňky mohou být tyto látky ze zásobního poolu kdykoli odčerpávány. Jedná se např. o aminokyseliny, sacharidy, organické kyseliny a anorganické ionty. Dlouhodobé rezervy představují látky, které jsou uskladňovány zejména ve vakuolách nejrůznějších druhů zásobních pletiv.

Mezi

tento

druh rezerv

počítáme

např. aleuronová zrna semen, rozpustné polysacharidy v kořenových hlízách či oddencích trav. 4)

5.6.2.3 Odpadní, detoxifikační funkce Vakuoly zastávají funkci odkladiště zplodin buněčného metabolismu. Jde o odpadní produkty či látky potencionálně toxické. Vakuola v tomto případě plní funkci, kterou v živočišném organismu zastávají krev a vylučovací orgány. Látky jsou ve vakuole uloženy většinou bez možnosti dalšího transportu do cytoplazmy.

5.6.2.4 Zprostředkování interakcí Pomocí vakuoly může rostlinný organismus komunikovat s ostatními organismy, příp. vnějším prostředím. Interakce s vnějšími organismy je uskutečňována skrze látky uložené ve vakuole. Tyto látky mohou být barevné či nejrůznějších chutí, mohou též způsobovat trávicí obtíže potencionálním konzumentům. Např. díky barvě květů se však rostlinný organismus stává atraktivnějším pro potencionální opylovače či roznašeče plodů, což je zásadní pro zachování jeho existence.

5.6.2.5 Funkce lysozomálního kompartmentu, význam pro vodní hospodářství a růst buněk

5.6.3

Výskyt látek ve vakuolách a jejich význam pro rostlinnou buňku Ve vakuolách se mohou vyskytovat nejrůznější látky, které plní v rostlinné

buňce rozmanité funkce. Tyto látky je možné rozdělit do několika skupin. 5.6.3.1 Meziprodukty buněčného metabolismu - aminokyseliny, sacharidy, organické kyseliny 78


Dana Kettnerová

Jedná se o krátkodobé rezervy vytvářející ve vakuole tzv. zásobní pooly. 5.6.3.2 Anorganické ionty -zejména K+, Na+, Ca2+, Cl-,NO3Tyto ionty mohou, stejně jako předchozí skupina, vytvářet zásobní pooly. Jedná se zejména o NO3- ionty. Riziko nadměrného hromadění těchto iontů, spolu s následnou potencionální toxicitou rostlinných produktů nejen pro živočichy, ale i pro člověka, roste, nachází-li se velké množství dusičnanů v půdě. Tato zvýšená koncentrace může být způsobena nadměrným hnojením. Jako další mohou vytvářet zásobní pool Ca2+ ionty. Následně mohou být uvolňovány do cytoplazmy a podílet se na řadě regulačních funkcí. 5.6.3.3 Rezervní sacharidy Jako rezervní sacharidy jsou ve vakuole skladovány monosacharidy (glukóza, fruktóza), disacharidy (zejm. sacharóza) i ve vodě rozpustné polysacharidy. Monosacharidy se nachází nejvíce v plodech rostlin. Z polysacharidů nalezneme ve vakuolách zejm. různé druhy fruktantů, např. inulin (u čeledi Asteraceae). 5.6.3.4 Rezervní bílkoviny Zásobní bílkoviny se nejvíce nacházejí ve velmi drobných vakuolách semen. Během zrání semene dochází k postupnému úbytku vody v semeni, díky čemuž se rozpuštěné bílkoviny proměňují v tzv. aleuronová zrna. 5.6.3.5 Sekundární metabolity Představují velice širokou a rozmanitou skupinu látek, z nichž je jich řada využívána, či zkoumána pro farmaceutické účely. Jedná se o flavonoidy, ostatní glykosidy, alkaloidy, třísloviny a polyterpeny. 5.6.3.6 Hydrolytické enzymy Díky hydrolytickým enzymům může ve vakuole probíhat rozklad látek, jak rostlinné buňce vlastních, tak látek z vnějšího prostředí. Enzymy se účastní autolýzy, programované buněčné smrti a mobilizace látek ze zásobních orgánů. (4) 5.6.4

Izolace vakuol Rostlinné vakuoly jsou z hlediska farmacie zajímavé zejména díky kumulaci

specifických sekundárních metabolitů. Snaha popsat jednotlivé faktory ovlivňující kumulaci pro rostlinu specifických látek ve vakuole, zkoumání vlivu vnějších 79


Dana Kettnerová

podmínek (např. osmotického stresu) na koncentraci látek a iontů ve vakuole, popis transportérů nacházejících se v tonoplastu a řada dalších prozatím nezodpovězených otázek ohledně vakuol vedla k řadě experimentů, díky nimž máme nyní k dispozici celou řadu izolačních postupů pro vakuoly jednotlivých rostlinných druhů. Důvodem velkého množství izolačních postupů je již zmíněná značná diverzita jednotlivých vakuol a to nejen v rámci jednotlivých druhů, ale i v rámci jediné rostliny. V roce 1974 byl při prokazování přítomnosti toxin vázajícího proteinu na povrchu plazmatické membrány představen izolační postup pro izolaci protoplastů a tonoplastu z cukrové třtiny. Protoplasty byly izolovány z 0,5-1 mm plátků pletiva třtiny inkubovaných v médiu připraveném podle Shepardovy modifikace izolačního postupu Power a Cockinga121). V inkubační médium, složeném z 0,3 M sacharózy, 1 % macerozymu, 4 % celulózy, 10 mM citrátového pufru o pH=5,6 a 0,03 mg loridinu na mililitr, byly plátky inkubovány při 23 °C po dobu 30-40 hod. Po inkubaci byl roztok filtrován a získaný filtrát byl centrifugován při 500 x g po dobu 5 min. Intaktní protoplasty byly opatrně odebrány z hladiny média injekční stříkačkou či pipetou a promyty v promývacím médiu (0,3 M glukózový roztok o pH=5,4 obsahující 10 mM CaCl2 a 1 mM MgSO4). Následnou 5 min. centrifugací při 100 x g byl získán pelet protoplastů. 122) Roku 1975 byl představen poměrně účinný postup izolace intaktních vakuol (výtěžek 106 vakuol) z protoplastů dospělých listů, okvětních lístků, stonků, stopek, vláken, čnělek a mladých plodů. Izolace byla uskutečněna osmotickým rozrušením protoplastu pomocí pufru (0,2 M K2HPO4 doplněného HCl na pH=8) za pomalého míchání. Většina struktur nacházejících se uvnitř protoplastu, až na vakuoly, vytvořila po osmotickém prasknutí protoplastu agregáty, které mohly být odstraněny filtrací. Vakuoly byly z filtrátu následně získány pomalou centrifugací. 113) Modifikace předchozí metody 113) podobná metodě Strobela a Hesse 122) byla využita při výzkumu zabývajícím se imunologickou identifikací inhibitorů proteinázy ve vakuolách izolovaných z listů Lycopersicon esculentum Mill. Inkubační médium bylo se skládalo z 1,5 % (w/v) cellulysinu a 0,25 M sacharózy, pH bylo za pomoci NaOH upraveno na 5,75. Inkubace trvala 20 hod., následně byla směs 30 min. míchána v Omni mixéru a poté přefiltrována. Filtrát byl centrifugován při 500 x g 5 min. Po centrifugaci byla na vakuoly bohatá vrstva nacházející se na horní hladině zkumavky opatrně odebrána

pomocí Pasteurovy pipety a

resuspendovány v 0,195 M sacharóze, čímž došlo k dalšímu uvolněné vakuol 80


Dana Kettnerová

z protoplastů. Poté byla provedena centrifugace, která byla spolu s resuspendací opakována až do získání vakuol prostých buněčného odpadu a protoplastů. Vakuolové extrakty určené k analýze byly připraveny zředěním získané vakuolové frakce na koncentraci 0,2 M Tris (pH=8) obsahujícího 0,2 M sacharózu a 1,5 mM EDTA. Pro stanovení karboxypeptidázy a kyselé fosfatázy byl k extraktu přidán 3merkaptoethanol (0,1 % v/v). Extrakty byly sonikovány, aby došlo k lýze vakuol, ihned poté byly provedeny příslušné analýzy. 123) V roce 1976 byla provedena izolace vakuol ze zásobního pletiva kořenů Beta vulgaris L. Na základě četných pokusů s menším množstvím vzorku byla stanovena optimální metoda vhodná pro izolaci vakuol ve velkém měřítku. K izolaci byla použita červená řepa z místního trhu. 450 g čerstvé, oloupané řepy bylo při pokojové teplotě nakrájeno pomocí přístroje do 1 litru sběrného média (pH=7,6) o složení 1 M sorbitol, 5 mM EDTA, 0,1 mg/ml 2-merkaptobenzothiazol sodný, 50 mM Tris-HCl. S kousky, které byly zachyceny při filtraci přes Miracloth, byl předchozí postup zopakován (do 1 litru čerstvého sběrného média) a opět byla provedena filtrace. Následovaly kroky prováděné při 4 °C. Nejprve byl filtrát centrifugován (2000 x g, 10 min.). Získaný pelet byl jemně resuspendován (s cílem předejít co nejvíce poškození

vakuol)

v 15 %

(w/v)

Metrizamidu

methylacetamido-2,4,6-triodobenzamido]2-deoxy-D-glukóza)

(2-[3-acetamido-5-Nv izolačním

pufru

(pH=7,6) složeném z 1,5 M sorbitolu, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl. Izolované vakuoly byly z takto získané suspenze separovány pomocí centrifugace (650 x g, 10 min.) s využitím krokového gradientu Metrizamidu (5 ml 10 % (w/v), 2,5 ml 2,5 % (w/v) a 2,5 ml 0 % Metrizamidu). Bylo-li třeba, byl prstenec vakuol zředěn s izolačním médiem a znovu centrifugován při 650 x g 10 min. Pelet s vakuolami byl následně resuspendován v požadovaném množství pufru. Byly získány vakuoly osmoticky reagující na okolí, schopné absorpce neutrální červeně. Čistota izolovaných vakuol byla potvrzena pomocí biochemické analýzy. 114) Byly získány vakuoly přibližně stejné čistoty jako u metody předchozí. 113) Jedná se o metodu poměrně rychlou avšak neefektivní a vyžadující velké množství počátečního rostlinného pletiva. Na rozdíl od metody předcházející 113) je však využitelná i u pletiv, u nichž je obtížná izolace velkého množství protoplastů. Centrifugace byla provedena za vyšší akcelerace (2000 x g po 10 min.) než u metody předcházející (100 x g po 3 min.). 114)

81


Dana Kettnerová

Modifikace této metody 114) byla použita při experimentu v roce 1979 zabývajícím se potvrzením přítomnosti sacharózy a kyselé invertázy v rostlinné vakuole. Po nakrájení 450 g řepy na plátky pomocí přístroje bylo použito sběrné médium (pH=8,0) o složení 1 M sorbitol, 5 mM EDTA, 25 mM 2-merkaptoethanol, 50 mM tris-HCl, vše prováděno při teplotě 17-20 °C. Pro centrifugaci (při 4 °C) byla použita nižší akcelerace, ale delší čas (1300 x g, 20min.). Pelet byl rozpuštěn v 15 % Metrizamidu v resuspendačním médiu (pH=8,0) o složení 1,2 M sorbitol, 1 mM EDTA, 25 mM merkaptoethanol, 25 mM Tris/MES. 4 ml tohoto vzorku bylo dáno do 15 ml zkumavky a převrstveno 5 ml 10 % (w/v) Metrizamidu v resuspendačním médiu a 2 ml resuspendačního média. Následovala 10 min. centrifugace při 430 x g a resuspendace peletu v 4 ml resuspendačního média. Pokus byl proveden i s řepou, u níž předcházela izolaci promývací procedura. Izolace proběhla po promytí stejně, jako je uvedeno výše, až na dále popsané změny. 1 kg promytých plátků byl plazmolyzován při 17 °C 1 hod. 1,0 M roztokem sorbitolu. Použité sběrné médium (pH=7,6) se v tomto případě skládalo z 1,0 M sorbitolu, 5 mM EDTA, 20 mM metadisiřičitanu draselného, 0,1 % (w/v) dextran sulfátu, 50 mM Tris/HCl. Resuspendační médium (pH=7,6) tvořil 1,2 M sorbitol, 10 mM EDTA, 20 mM metadisiřičitanu draselného, 25 mM Tris-HCl. V těch částech, u kterých byl měřen obsah sacharózy, byl Metrizamid nahrazen diatrizoátem sodným, který mohl být z analyzovaného roztoku odstraněn kationtovou výměnou. 115) Tohoto modifikovaného postupu izolace bylo využito ke stanovení aktivity ATPázy a kyselé fosfatázy uvnitř izolovaných vakuol. Byla prokázána přítomnost obou enzymů. Tyto dva enzymy byly rozlišeny na základě rozdílné citlivosti k molybdenanu amonnému, který způsobil při koncentraci 100 μm inhibici kyselé fosfatázy, zatímco aktivitu ATPázy neovlivnil. Izolace vakuol byla provedena dle metody Leigha a Brantona 114) modifikované v roce 1979 115). Centrifugace homogenátu však proběhla při 3500 x g 15 min. Sběrné médium obsahovalo 25 mM 2-merkaptoethanol, další roztoky pak 5 mM 2-merkaptoethanol. Lýza vakuol byla provedena pomocí ředícího pufru (pH=7,6) složeného z 1 mM Na2EDTA, 5 mM 2merkaptoethanolu, 10 mM Tris/MES. Lýza všech vakuol byla ověřena pomocí světelné mikroskopie. Část lyzovaných vakuol byla ponechána pro analýzu, zbytek byl

2,5 hod.

centrifugován

při

100000 x g. 116)

Pelet

byl

resuspendován

v resuspendačním médiu 115) a zředěn ředícím pufrem tak, aby byla ve všech frakcích

82


Dana Kettnerová

stejná koncentrace sorbitolu. Následně byly s takto izolovanými vakuolami provedeny chemické a enzymatické analýzy. 116) Stejný postup izolace byl využit v roce 1981 při experimentu zabývajícím se charakterizací anorganické fosfatázy pomocí monovalentních či bivalentních kationtů ovlivňujících její aktivitu. Oproti metodě Leigha a Brantona 114) upravené v roce 1979 115) byla při izolaci vakuol z červené řepy opět využita centrifugace při 3500 x g po dobu 15 min. a sběrné médium s obsahem 25 mM 2-merkaptoethanolu, ve všech ostatních médiích použitých při izolaci byl využit 5 mM 2merkaptoethanol. Pro jeden z experimentů bylo využito izolační médium bez EDTA. K purifikaci vakuol byl použit Metrizamidový hustotní gradient. 117) Modifikaci metody Leigha a Brantona 114) představil další výzkumný tým v roce 1979 při studiu zabývajícím se akumulací sacharózy ve vakuolách izolovaných z Beta vulgaris L. Na kostky nakrájená čerstvá řepa byla nejprve plazmolyzována v médiu (pH=7,6) skládajícím se z 1 M sorbitolu, 5 mM EDTA, 1 mM MgCl2 , 0,7 M cystein, 50 mM HEPES-NaOH. Poté byla pomocí přístroje nakrájena na plátky. Následovala filtrace pomocí Miracloth a 10 min. centrifugace při 2000 x g. Pelet byl resuspendován v resuspendačním médiu, které bylo modifikováno. Médium mělo pH=7,6 a obsahovalo: 1 M sorbitol, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH. K purifikaci byl použit dextranový hustotní krokový gradient o složení: 1 ml 25 %, 2 ml 17,5 %, 4 ml 10,2 %, 4 ml 2,5 % (w/v) roztoku dextranu v modifikovaném resuspendačním médiu a 30 min. centrifugace při 26000 x g. Největší množství izolovaných vakuol bylo získáno na rozhraní hustot 1,008 g/ml a 1,100 g/ml. Izolované vakuoly byly resuspendovány v resuspendačním médiu a dvakrát 10 min. centrifugovány při 650 x g. Následovala resuspendace peletu v požadovaném množství resuspendačního média. Znečistění izolovaných vakuol nebylo velké, nejrůznější cytoplazmatické části představovaly zhruba 1% ze získaných izolovaných vakuol. 118) Další modifikace metody Leigha a Brantona 114) upravené v roce 1979 115) byla publikována v roce 1981 při studii zabývající se hodnocením glycinbetainu a prolinu uvnitř vakuol červené řepy. V některých případech bylo použito obměněné resuspendační médium obsahující 10 mM Tris-HCl (pH=7,6) místo 10 mM tris-MES (pH=8,0). V případech, kdy byl analyzován obsah Na+ a K+ iontů byla místo Na2EDTA použita EDTA a všechny zásobní roztoky Metrizamidu a sorbitolu byly deionizovány pomocí ionexové pryskyřice Dowex 50. 134) Při další modifikaci v roce 83


Dana Kettnerová

1983 byla využita původní metoda pouze s vyloučením Na2EDTA ze všech médií. 139) Roku 1975 byla na kvasinkách zkoumána lýza sféroplastu pomocí DEAEdextranu. K suspenzi (o pH=6,0) obsahující 108 sféroplastů na mililitr v 0,7 M sorbitolu a 5 mM Tris-MES byl přidán DEAE-dextran (5-10 μg/ml). Vše bylo provedeno při teplotě 0-4 °C. Sféroplasty byly ponechány 1 min. při 0-4 °C, aby naabsorbovaly DEAE-dextran a následně byly 3-6 min. inkubovány při 30 °C. Kontrola lýzy byla provedena mikroskopicky. 119) Modifikace této metody byla využita pro rychlou a efektivní izolaci vakuol ze zásobní tkáně Beta vulgaris L. Vakuoly byly izolovány z protoplastů buněk. Protoplasty byly dvakrát promyty vychlazeným pufrem (5 mM Tris-MES, pH=6,0) s přídavkem 1,2 M sorbitolu. Poté byly protoplasty o koncentraci 106/ml suspendované v pufru (5 mM Tris-MES, pH=6,0) uloženy na 10 min. do ledu. Následně byl k suspenzi protoplastů přidán DEAE-dextran

(50 μg/ml).

Po

1 min.

sloužící

k absorpci

DEAE-dextranu

protoplastem (při 0-4 °C) byl k suspenzi přidán dextran sulfát (100 μg/ml) sloužící ke kompenzaci případného přebytku DEAE-dextran, který by mohl případně vakuolu poškodit. Za účelem stabilizace vakuol byly k suspenzi vakuol přidány další látky. K suspenzi vakuol byly přidány tyto složky přispívající ke stabilizaci vakuol: 100 μl 500 mM pufru Tris-HCl (pH=7,5) obsahujícího 1 M KCl a 50 mM MgCl2 na 900 μl suspenze vakuol. Ve vakuolární suspenzi se po provedení této izolace nacházelo méně než 3 % protoplastů. 120) Další izolace vakuol získaných pomocí lýzy protoplastů izolovaných ze suspenzních kultur Nicotiana glutinosa L. byla představena v roce 1979. K uvolnění vakuol došlo po přidání suspenze protoplastů k 10 dílům pufru (pH=7,5) obsahujícímu 0,3 M sorbitol, 2 mM EDTA-Tris a 2,5 mM DTT. Směs byla jemně 10 min. míchána. Rychlá lýza protoplastů a uvolnění intaktních vakuol (viz obrázek č. 3) byly způsobeny redukovanou osmotickou silou pufru sorbitolu a chelatačním efektem EDTA.

84


Dana Kettnerová

Obrázek č. 3: Osmotická lýza protoplastů tabáku a uvolnění vakuol 124) A-protoplasty ihned po přidání H2O, B-30 s po přidání H2O, C-45 s, D-60 s Mřížka představuje 10 μm. Vakuoly byly získány 10 min. centrifugací při 500 x g. Pelet byl jemně resuspendován v 0,5 ml suspenzního pufru (pH=7,2) tvořeného 0,5 M sorbitolem, 0,25 mM EDTA-Tris a 1,0 mM DTT a po resuspendaci navrstven na hustotní gradient Ficollu (3 ml 7,5% (w/v) Ficollu v suspenzním pufru a 5 ml suspenzního pufru). Následovala 30 min. centrifugace při 1000 x g. Purifikované vakuoly se nacházely na rozhraní Ficollu. 124) Tato izolační metoda byla o rok později modifikována. Finální suspenze protoplastů byla přidána k 10 dílům pufru (pH=7,5) o složení 0,3 M sorbitol, 2 mM EDTA-Tris a 2,5 mM DTT. Lýza protoplastů nastala po 10-15 min. Lyzát byl zfiltrován a filtrát byl 10 min. centrifugován při 500 x g. Získaný pelet byl resuspendován v suspenzním pufru (pH=7,2) složeném z 0,5 M sorbitolu, 0,25 mM EDTA-Tris a 1,0 mM DTT. Purifikace vakuol byla provedena pomocí gradientu Ficollu, který byl modifikován (3 ml 3,5 % (w/v) Ficollu v suspenzním pufru a 5 ml suspenzního pufru). Následná centrifugace byla prodloužena na 45 min, akcelerace 85


Dana Kettnerová

1000 x g byla ponechána. Snížení gradientu Ficollu z 7,5 % na 3,5 % (w/v) vedlo ke snížení výtěžku vakuol z přibližně 11 % z celkového množství protoplastů na řádově 5 %. Avšak počet nezlyzovaných protoplastů nacházejících se s vakuolami na Ficollovém rozhraní klesl ze 4 % na méně než 0,25 %. 125) V roce 1978 byly izolovány vakuoly z protoplastů rostliny Sorghum bicolor (L.) Moench. Pufr s protoplasty (pH=8) obsahující 25 mM Tris-HCl a 0,4 M mannitol byl zředěn. Zředěním byl získán pufr (pH=8) obsahující 0,15 M mannitol s 25 mM tris-HCl a obsahem BSA (10 mg/ml). Pro usnadnění lýzy byla suspenze několikrát pipetována a následně navrstvena na diskontinuální gradient Ficollu 400 složený ze 7,5 ml frakcí 3; 9; 12,5 a 20 % (w/w) roztoku Ficollu obsahujícího pufr (pH=8) o složení 0,5 M mannitol, 25 mM Tris-HCl. Následovala 2 hod. centrifugace při 26000 otáčkách za minutu. Prstenec vakuol se vytvořil na rozhranní 3 % a 9 % Ficollu. Vakuoly mohou být v prstenci více koncentrovány, je-li tato frakce zředěna 0,4 M mannitolem v 25 mM Tris-HCl pufru (pH=8) a 3 min. centrifugována při 1000 x g. 126) Modifikace této metody byla využita při izolaci vakuol z listů CAM rostliny Sedum telephium. Experiment se zabýval studiem změn obsahu kyseliny jablečné ve vakuolách během dne. 132) V témže roce byly izolovány vakuoly z protoplastu buněk suspenzní kultury Daucus carota. Uvolnění vakuol z protoplastu bylo realizováno pomocí osmotického šoku v pufru (pH=7,8) skládajícím se z 0,15 M sorbitolu, 3 mM MgCl2, 0,5 % (w/v) BSA a 1 mM HEPES. Po 5 minutové inkubaci byla suspenze s uvolněnými vakuolami navrstvena na krokový gradient Metrizamidu skládající se z 2,0 ml frakcí 2, 4, 8 a 16 % (w/v) Metrizamidu, 0,5 % BSA a 0,55 M sorbitolu v 1 mM HEPES (pH=8,0). Připravený gradient byl centrifugován 2 hod. při 100000 x g. Silně zabarvené frakce obsahující vakuoly byly dále analyzovány. Použity byly vakuoly získané ze tří izolovaných prstenců. Množství vakuol bylo počítáno pomocí hemocytometru a pomocí obsahu anthocyaninu. K izolaci byl též použit hypertonický roztok Na2HPO4 s 3 mM MgCl2 a DTE. Při použití DTE však docházelo ke slepování cytoplazmy a vakuol, což činilo purifikaci velmi obtížnou. K přípravě gradientů byly využity roztoky sacharózy, mannitolu, Ficollu a Metrizamidu. Nadále byl využíván pouze Metrizamid, který poskytoval nejlepší výsledky. 127) Izolovány byly i vakuoly křene, které byly získány izolační metodou založenou na plazmolýze pletiva kořene křenu. Množství izolovaných vakuol bylo 86


hodnoceno

pomocí

množství

fenolických

látek.

Dana Kettnerová

Toto

hodnocení

vychází

z předpokladu, že jsou fenolické látky lokalizovány výhradně ve vakuolách. 128) Roku 1980 byla přestavena metoda pro izolaci vakuol z protoplastů listů Sedum telephium L. Rozchodník velký je rostlina z čeledi Crassulaceae, tedy tzv. CAM rostlina, u níž se vyskytuje specifický metabolismus uzpůsobený životu rostliny v suchých oblastech. 129) 130) Pro izolaci vakuol byly použity již částečně zlyzované protoplasty, získané enzymatickou metodou izolace, suspendované v resuspendačním pufru (pH=8,0; 22 °C) o složení 0,5 M mannitol, 25 mM Tris-HCl a 5 mM EGTA. Vakuoly byly získány pomocí tříkrokového diskontinuálního gradientu Ficollu-400. 1 ml suspenze protoplastů byl navrstven na Ficollový gradient složený z 10 ml 5, 10 a 15 % (w/v) roztoku Ficollu-400 rozpuštěného v pufru (pH=8,0; 22 °C) skládajícím se z 0,5 M mannitolu a 25 mM Tris-HCl. Gradient byl 30 min. ultracentrifugován při 100000 x g. Vakuoly byly odebrány pomocí kanyly připevněné na injekční stříkačku. Částečná lýza protoplastů proběhla díky změně koncentrace mannitolu z 0,7 M na 0,5 M (koncentrace v inkubačním a resuspendačním médiu). Došlo k malé změně osmotického potenciálu, která v přítomnosti EGTA vyvolala částečnou lýzy protoplastu. Největší množství vakuol se nalézalo na rozhraní 5 % a 10 % (w/v), na rozhraní 10 % a 15 % Ficollu se nacházely vakuoly, malé množství protoplastů a buněčný odpad. Pro zviditelnění vakuol byla k resuspendačnímu médiu přidána neutrální červeň. Výtěžek izolace byl počítán dvěma způsoby. První a pravděpodobně také značně nepřesnou metodou bylo počítání výtěžku podle množství protoplastů vložených do Ficollového gradientu. Zde se však vyskytuje problém případné lýzy vakuol, případně vzniku menších vakuol z vakuol větších. Oba dva případy vedou k chybnému výpočtu zisku. Předpokládaný výtěžek počítaný pomocí této metody byl 44 %. Druhou možností je porovnání obsahu kyseliny jablečné v protoplastech vkládaných na gradient Ficollu a obsahu kyseliny jablečné v prstencích izolovaných vakuol. Tato metoda nevyžaduje pouze intaktní vakuoly. Podle této metody byl výtěžek reakce odhadnut na 54 %. Vyšší stabilitu si zachovávaly izolované vakuoly uchovávané v ledu. Nicméně v průběhu času klesala integrita vakuol bez ohledu na teplotu. 130) Izolace vakuol z protoplastů získaných enzymatickou izolací z buněk mezofylu listů pšenice a kukuřice byla publikována v roce 1981. K izolaci vakuol bylo použito médium o složení 0,2 M (pšenice) či 0,15 M (kukuřice) K2HPO4 87


Dana Kettnerová

(pH=8,0) s 0,5 mM DTT. Toto médium bylo přidáno k peletu izolovaných protoplastů nacházejícímu se ve zkumavce. Za jemného promíchávání došlo po 5 min. k uvolnění intaktních vakuol. Následovala 5 min. centrifugace při 2000 x g. Supernatant byl odstraněn a vakuoly s protoplasty byly pročištěny pomocí gradientu Ficollu (po 6 ml 1,5; 5; 7; 12,5 a 20 % Ficollu v pufru (pH=7,5) skládajícím se z 0,5 M mannitolu, 0,5 mM DTT, 0,2 mM CaCl2 a 25 mM Tris-HCl. Gradient byl 2 hod. centrifugován při 100000 x g a teplotě 4 °C. Intaktní vakuoly se nacházely na rozhraní 1,5 % a 5 % Ficollu. Intaktnost vakuol byla zkontrolována pomocí mikroskopu, množství vakuol bylo spočítáno pomocí počítací komůrky. Byly izolovány vakuoly o velikosti 20-60 μm v průměru. 131) Stejného roku byly izolovány vakuoly z protoplastů rostliny Melilotus alba. Vakuoly byly uvolněny pomocí centrifugace v gradientu obsahujícím DEAE-dextran a Ficoll v médiu složeném z 25 mM MES-Tris pufru (pH=6,5) v 0,7 M mannitolu. Na dně zkumavky se nacházela vrstva 2 ml média o složení 25 mm HEPES-Tris pufr (pH=8,0) v 0,7 M mannitolu obsahující 20 % Ficoll, na ni byla navrstvena 2 ml vrstva roztoku obsahujícího 5 % Ficoll a 4 mg/ml dextran sulfátu v pufru o složení 25 mm HEPES-Tris pufr (pH=8,0) v 0,7 M mannitolu, třetí vrstvu tvořilo 5 ml 2 % Ficollu a DEAE-dextranu (4 g/ml) v pufru o složení 25 mm HEPES-Tris (pH=8,0) v 0,7 M mannitolu. Navrch byla navrstvena suspenze chloroplastů v 25 mm HEPESTris pufru (pH=8,0) v 0,7 M mannitolu. Následovala 30 min. centrifugace při 2000 x g, prováděna při 17 °C. Dextran sulfát slouží k neutralizaci DEAE-dextranu, který se může vázat na tonoplast a může tak poškodit vakuolu. Prstenec vakuol se nacházel na rozhraní 5 % a 20 % Ficollu, odkud byly vakuoly pomocí mikropipety odebrány. Intaktnost vakuol byla kontrolována pomocí světelné mikroskopie, jejich množství bylo počítáno pomocí hemocytometru (Fuchs-Rosenthal). Ke kontrole neporušenosti vakuol byla též využita 2,5 % (w/v) Evansova modř v 25 mM MESTris pufru (pH=6,5) v 0,7 M mannitolu a 0,05 % (w/v) neutrální červeň v médiu o složení 25 mm HEPES-Tris pufr (pH=8,0) v 0,7 M mannitolu. Výtěžek tohoto izolačního postupu činil 25 %- 45 %. Průměr vakuol byl podobný průměru protoplastů, tedy průměrně 10-30 μm. Po izolaci byly vakuoly uchovávány při 4 °C, čímž byla zaručena vyšší stabilita než při pokojové teplotě. 133) Roku 1982 byl publikován experiment mající za cíl prokázat, že vakuoly slouží jako hlavní zásobní struktury po nitráty. Pro izolaci vakuol byly použity protoplasty získané enzymatickou izolací z buněk listů Hordeum vulgare var. 88


Dana Kettnerová

Numar. Protoplasty byly lyzovány pomocí 12.5 ml 60 mM K2HPO4 pufru (pH=8,0) obsahujícího 12 % (w/v) Ficoll a 1 mM DTT. Směs byla jemně 5 min. míchána. Poté bylo přidáno 5 ml 0,6 M mannitolu, 50 mM K-fosfátu (pH=7,0) a 1 mM (Na+) EDTA byla navrstvena na povrch lyzátu. Následovala 15 min. centrifugace při 1000 x g. Po centrifugaci se vakuoly nacházely na povrchu 0 % Ficollové frakce, nezlyzované protoplasty se nacházely na rozhraní 0 % a 10 % Ficollu. Koncentrace vakuol byla určena pomocí hemocytometru. Izolovaná suspenze vakuol obsahovala 0-2 % protoplastů. 135) V roce 1984 byla tato metoda modifikována. Místo dvoukrokového Ficollového gradientu byl použit gradient čtyřkrokový s cílem zajistit větší purifikaci vakuol. Jinak byl použit stejný lyzační roztok o složení 60 mM K2HPO4 pufru (pH=8,0) obsahujícího 12 % (w/v) Ficoll a 1 mM DTT. Lýza protoplastů byla pozorována pod mikroskopem, dokud zcela neproběhla. K suspenzi byl přidán stejný objem 10 % Ficollu obsahujícího 50 mM K-fosfátu (pH=7,0), 0,85 M mannitol 2 mM Na4EDTA. Tento roztok byl v každé zkumavce postupně převrstven 5 ml 3,5 %; 2,0% a 0 % Ficollu v 50 mM K-fosfátu (pH=7,0) s obsahem 0,6 M mannitolu, a 1 mM Na4EDTA. Gradient byl stejně jako v původní metodě centrifugován 15 min. při 1000 x g. Vakuoly se hromadily na hladině 0 % Ficollu. Výtěžek izolace vakuol z protoplastů mezofylu ječmene činil 12-40 % a byl počítán pomocí hemocytometru. Koncentrace vakuol byla 1,0-5,3x106/ml. 141) Lýza protoplastů pomocí jehly a injekční stříkačky byla představena při izolaci vakuol z protoplastů mezofylu ječmene. Protlačováním purifikované suspenze (3x106 protoplastů na mililitr při 4 °C) skrze dlouhou jehlu (10cmx0,2 mm) došlo k uvolnění vakuol. Touto metodou došlo k prasknutí poloviny protoplastů a dvě třetiny z takto prasknutých protoplastů uvolnily velkou intaktní vakuolu. Následovala okamžitá purifikace vakuol pomocí flotace přes třístupňový hustotní gradient. První vrstva byla tvořena 5 ml lyzátu v 0,4 M sacharóze, 2,5 % Ficollu, druhá 5 ml 0,2 M sacharózy, 0,2 M sorbitolu a třetí 2 ml 0,4 M sorbitolu. Do všech vrstev byly přidány ještě další doplňkové látky. Hustotní gradient byl centrifugován nejprve 2 min při 200 x g, následně 3 min. při 1000 x g. Vakuoly byly získány z třetí vrstvy. Výhodou této metody je její rychlost. Izolace vakuol (počítáno od prasknutí protoplastu) netrvá více jak 8 min. Izolované vakuoly byly počítány pomocí aktivity α-mannosidázy. 137) Modifikace této metody byla využita při studiu transportu citrátu do vakuol ječmene. Izolované protoplasty byly suspendovány v 10 ml média obsahujícího 89


Dana Kettnerová

500 mM sorbitol, 30 % (v/v) Percoll, 1 mM CaCl2 a 10 mM MES-imidazol (pH=5,6). Suspenze protoplastů byla převrstvena 8 ml média (médium A) obsahujícího (400 mM sacharózu, 3 % (w/v) Ficoll, 30 mM HEPES-imidazol (pH=7,2) a 4 ml média (médium B) složeného z 400 mM sorbitolu, 30 mM Kglukonátu, 20 mM HEPES-imidazolu (pH=7,2). Hustotní gradient byl centrifugován 3 min. při 200 x g a 4 min. při 1200 x g. Protoplasty se nacházely na horní mezifázi a po protlačení skrze injekční stříkačku (tentokrát bez jehly) uvolnily vakuoly. Vakuoly byly purifikovány opět pomocí flotace. Lyzát protoplastů byl převrstven 10 ml média B a 2 ml média obsahujícího 400 mM glycin-betain, 30 mM Kglukonát, 20 mM HEPES-imidazol (pH=7,2). Vakuoly byly odebrány z horní mezifáze. K izolované suspenzi vakuol byl přidán Percoll (upraven na finální koncentraci 10 %, v/v) a suspenze byla ihned použita k experimentu. 138) Novou a rychlou metodou pro izolaci vakuol z protoplastů mezofylu ječmene představovalo prasknutí protoplastu pomocí jehly injekční stříkačky. Uvolněné vakuoly byly flotovány přes vrstvu silikonového oleje. 136) Izolace vakuol z buněk Lycopersicon esculentum var. Lukullus byla uskutečněna pomocí DEAE-dextranu nebo třepáním v alkalickém pufru s obsahem EDTA. Purifikace byla provedena pomocí centrifugace za použití diskontinuálního gradientu sorbitolu, sacharózy a Ficollu. Izolované vakuoly byly jen velmi málo znečištěny ostatním buněčným odpadem. Vakuoly mohou být uchovávány 6 hod. při 4 °C, případně 1 hod. při 30 °C bez změny vlastností za předpokladu, že jsou uchovávány v médiu s obsahem 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 a0,5 % (w/v) HSA. 140) V roce 1987 byla představena izolace vakuol pomocí digitoninu, který způsobil lýzy plazmatické membrány buněk Acer pseudoplatanus. K oddělení vakuol byla použita flotace přes diskontinuální gradient Ficollu, což zajistilo rozrušení plazmalemy v hustém médiu (0,7 M mannitol doplněný 10,8 % (w/v) Ficollu 400. Touto metodou byly izolovány vakuoly s asi 20 % výtěžkem. Jedná se o rychlou metodu umožňující izolaci různě velkých vakuol. 142) Izolace z vakuol z protoplastu rostlinných buněk halofytu Atriplex gmelini C. A. Mey byla uskutečněna v roce 1987 za účelem stanovení koncentrace sodíku, draslíku, chloridu a betainu ve vakuole. Díky tomu nemohlo být použito činidlo obsahující ionty. Pro izolaci byla využita metoda Lörze a kol. 143) Metoda popsaná Wagner a Siegelmanem, 113) u níž je místo 0,2 M pufru fosforečnanu draselného (pH=8,0) použit 0,5 M pufr kyselina fosforečná-Tris, zajistila přibližně stejné 90


Dana Kettnerová

množství izolovaných vakuol, ale vznikající cytoplazmatický agregát ztěžoval izolaci a tak bylo od využití této metody upuštěno. Díky přídavku EGTA nedošlo k agregaci celulárního odpadu. Při izolaci byl použit CHAPS, který usnadnil izolaci vakuol z protoplastů, nesměl však být použit dlouho, aby nedošlo k nežádoucímu uvolnění iontů z protoplastu (použití kratší než 10 min.). K lýze protoplastu došlo díky snížení osmolarity média. 144) Modifikace této metody byla představena o tři roky později při experimentu zabývajícím se studiem přítomnosti kadmia a kadmium vázajících proteinů v listech tabáku.

Lýza

protoplastů

byla

vyvolána

smísením

suspenze

protoplastů

s vakuolárním izolačním médiem složeným z 0,18 M mannitolu, 1,0 mM EGTA, 0,5 mM a 20 mM HEPES o pH=8,0 upraveným na tuto hodnotu pomocí 1 M Tris roztoku. Jemným promícháním bylo během 5 min. zlyzováno 90 % protoplastů. K izolaci intaktních vakuol byl využit gradient Ficollu (0 %, 3,9 % 10 %) v médiu složeném z mannitolu, EGTA, CHAPS a HEPES-Tris. Hustotní gradient byl centrifugován při 150 x g 15 min. (výrazná redukce akcelerace). Vakuoly se nacházely na rozhraní 0 % a 3,9 % Ficollu. 145) Tento izolační postup byl využit znovu s drobnými modifikacemi v roce 2000 při studiu kumulace niklu v rostlině Thlaspi goesingense Ha´la´csy. Protoplasty byly vystaveny lehkému osmotickému šoku v kombinaci se zvýšením pH s přítomností malého množství detergentu (CHAPS) 113) Pomocí gradientu Ficollu byly izolovány vakuoly nacházející se na rozhraní 0 % a 10 % Ficollu. (146) V dalším experimentu byl k inkubačnímu médiu s protoplasty určenými k izolaci vakuol přidán 2,6-dichlorbenzonitril, který zabránil opětovné regeneraci buněčné stěny. Jedná se o inhibitor specificky blokující syntézu celulózy. 147) Následovala studie využívající vakuoly izolované z buněk ječmene a huseníčku. K izolaci ječmene byla pouze s malou obměnou využita metoda popsaná v roce 1991. 138) Modifikace spočívala v záměně K-glukonátu (složka izolačního média) za 30 mM KCl. Vakuoly huseníčku byly izolovány za pomoci média obsahujícího mannitol, Ficoll, EDTA, HEPES-KOH, BSA a DTT. K purifikaci vakuol byl využit gradient Ficollu a 20 min. centrifugace při 1500 x g). 148)

91

Izolace rostlinných organel a studium transportních dějů 5.6.5

Dana Kettnerová

Souhrn

Izolovat vakuoly je možné z mnoha rostlinných druhů. Ač jsou již u nejčastěji využívaných rostlin známy izolační metody, je vždy třeba danou metodu optimalizovat podle rostliny, kterou máme k dispozici Při izolaci vakuol je nejčastěji jako pufr využíván Tris-HCl, případně EDTA či EGTA a BSA. Nejčastěji využívaným osmotikem je sorbitol, který však může být v některých případech vyměněn za mannitol. K usnadnění lýzy protoplastu byl v některých případech použit detergent CHAPS, který však nesmí být v suspenzi s protoplasty déle než 10 min, aby nedošlo k poškození vakuol. Byla též představena nová metoda lýzy protoplastu pomocí jehly a injekční stříkačky. Izolované vakuoly jsou využitelné k detailní analýze. Jelikož vakuola slouží jako „detoxikační“ organela buňky, může analýza jejího obsahu poskytnout cenné informace například o tom, jak se buňka vyrovnává s nepříznivými podmínkami ve svém okolí (produkce sekundárních metabolitů, kumulace toxických kovů a další), může též poskytnout model pro studium transportních dějů, které mohou být u jednotlivých rostlin velmi odlišné.

92


6

Dana Kettnerová

DISKUSE Cílem této diplomové práce bylo vypracovat přehled jednotlivých izolačních

metod používaných pro izolaci rostlinných organel a dalších částí rostlinné buňky se vztahem k transportním dějům. Z tohoto důvodu byl zvolen přehled izolačních metod využívaných k izolaci protoplastu, který může být následně využit k izolaci dalších buněčných složek. Byla též projevena snaha shrnout metody využívané k izolaci chloroplastů, stěžejních organel pro průběh fotosyntézy a vypracovat přehled izolačních metod vakuol, které jsou zejména díky obsahu sekundárních metabolitů velmi zajímavé z hlediska farmaceutického využití. Byla popsána i metoda izolace buněčné stěny a to zejména proto, že se jedná o strukturu, která musí být ve všech ostatních případech při izolaci překonána, neboť představuje poměrně rigidní ochrannou strukturu rostlinné buňky. Její izolace slouží především k další chemické analýze a popisu jejích jednotlivých složek. Pochopením struktury buněčné stěny můžeme zasahovat do její syntézy a ovlivnit tak například využitelnost lignocelulózové biomasy jakožto zdroje pro biopaliva a také zrání ovocných plodů. Buněčná stěna též poskytuje látky využitelné v potravinářství, kosmetice, ale i v medicíně, ať už se jedná o látky využitelné pro přístroje v lékařství či o imunomodulancia. Protoplasty jsou dobrou modelovou strukturou rostlinné buňky. Díky absenci buněčné stěny umožňují studium transportních dějů, zároveň jsou však velmi citlivé na osmotické změny, čehož je využíváno právě při izolacích, kdy změna osmolarity resuspendačního média způsobí lýzu protoplastu a uvolnění obsahu rostlinné buňky. Protoplasty mohou být, stejně jako chloroplasty, izolovány enzymaticky nebo mechanicky. Při použití mechanických metod roste riziko poškození požadované organely a tím riziko nižší výtěžnosti dané izolační metody. I přesto, že je popsána již celá řada izolačních postupů pro jednotlivé rostlinné druhy a variety, musí být každá izolační metoda s ohledem na příslušný rostlinný druh, případně varietu a rostlinnou část optimalizována. Protoplasty mohou být využity i ke studiu rostlinné virové a bakteriální infekce, případně k testování účinných léčiv. Izolované protoplasty jsou využitelné i v oblasti genetiky – při somatické hybridizaci a šlechtění rostlin. Mohou být využity při studiu makromolekul in situ (například za pomoci imunofluorescence). 93


Dana Kettnerová

Izolované chloroplasty poskytují výborný nástroj pro detailní studium fotosyntézy in situ. Zároveň je průběh fotosyntézy dobrým vodítkem odrážejícím stav rostlinné buňky, čehož se dá využít například při testování odolnosti rostliny na zhoršené vnější podmínky (například změna osmotických podmínek, toxiny nebo zvýšené množství hnojiva v půdě, reakce rostliny na virovou infekci). Z hlediska izolace je velmi důležité, aby bylo izolováno co největší množství intaktních chloroplastů, neboť pouze ty jsou schopny dostatečné asimilace. Proto je jednou z metod využívaných pro zhodnocení úspěšnosti izolace přidání ferrokyanidu k suspenzi izolovaných chloroplastů. Podle množství uvolněného kyslíku dochází k vyhodnocení intaktnosti izolovaných chloroplastů. Studium enzymů chloroplastů ztěžuje fakt, že je řada těchto enzymů, stejně jako jejich kofaktorů, rozpustná ve vodě. Proto může vlivem izolace ve vodném médiu dojít k negativnímu ovlivnění výsledků experimentů. Tento problém byl částečně řešen objevem izolační metody využívající nevodná rozpouštědla. 71) Izolované vakuoly mohou být využity ke studiu transportu látek přes tonoplast. Největší pozornost je však věnována produkci sekundárních metabolitů a možnostem ovlivnění produkce těchto látek. Značnou část produktů sekundárního metabolismu tvoří farmaceuticky významné látky.(flavonoidy, třísloviny, polyterpeny a ostatní glykosidy). Pro možnost dalšího využití je třeba, aby byly izolovány pokud možno purifikované a intaktní organely. Purifikace se zpravidla provádí pomocí promývání v promývacím roztoku a centrifugací za využití hustotního gradientu. K tvorbě hustotního gradientu jsou využívány polymery: Percoll (zejména protoplasty), Ficoll (protoplasty, chloroplasty, vakuoly), Metrizamid (vakuoly), dextran (vakuoly). Nejčastěji využívanou izolační metodou pro protoplasty je enzymatická izolace. Většinou je volena rychlejší metoda jednokroková. Enzymatická metoda je nepoužitelná pro buňky se zdřevnatělou buněčnou stěnou. Nejlépe probíhá enzymatická izolace u embryonálních či meristematických buněk. Protoplasty obiloviny a trav je nejvhodnější izolovat ze zárodečných buněk suspenzních kultur. Mechanická izolace protoplastů není v současné době v podstatě využívána. Je použitelná pouze pro silně vakuolizované buňky. Chloroplasty mohou být izolovány enzymaticky, respektive z protoplastu nebo mechanicky. Izolace z protoplastu je užívána méně často než izolace mechanická, zejména z časových a finančních důvodů. Nicméně izolace chloroplastů je 94


Dana Kettnerová

s úspěchem využívána u buněk pšenice a slunečnice, které při mechanické izolaci neposkytují prakticky žádné chloroplasty. Mechanická

metoda

může

být

provedena

s využitím

hmoždíře

nebo

homogenizačního mixéru. Použití mixéru je šetrnější a vede k menšímu poškození buněk. Vakuoly jsou izolovány zpravidla díky osmotickému narušení a ruptuře protoplastu. Protoplast může být lyzován i pomocí injekční stříkačky, nebo může být jemně propíchnut pomocí jehly. Jemné narušení protoplastu způsobuje též CHAPS. Nejčastěji využívanou a modifikovanou metodou izolace vakuol je metoda určená pro izolaci vakuol červené řepy, kterou popsali v roce 1976 Leigh a Branton 114) a v roce 1979 byla upravena. 115). Díky veliké rozmanitosti a přítomnosti i několika druhů vakuol u jediného rostlinného druhu je izolace vakuol velmi obtížná a musí být vždy optimalizována. Nicméně už jen proto, že se jedná o strukturu, která zastává celou řadu funkcí a chrání buňku před poškozením, je snaha vakuoly izolovat a popsat co nejvíce vakuolárních transportních mechanismů. Složitost vakuolárního systému dokládá i fakt, že k transportu identické látky využijí dvě vakuoly z rozdílných rostlinných druhů naprosto odlišné transportní mechanismy. 148)

95


7

Dana Kettnerová

ZÁVĚR Prostřednictvím vědeckých článků bylo provedeno seznámení s metodami

izolace jednotlivých rostlinných organel a částí rostlinné buňky. Byl vypracován přehled metod užívaných k izolaci jednotlivých organel. A zhodnoceny faktory ovlivňující jejich využitelnost, omezení jednotlivých metod. Popsány byly též metody využívané k průkazu intaktnosti jednotlivých organel, stejně jako metody vedoucí k vyhodnocení výtěžku dané izolační metody. V některých případech byly popsány i faktory ovlivňující účinnost dané metody. Vypracování této diplomové práce mi umožnilo získat přehled o poměrně širokém využití izolovaných organel jak ve vědeckém výzkumu, tak v běžném životě.

96


8

Dana Kettnerová

POUŽITÁ LITERATURA A ZDROJE

(1) Dostál P., Řeháček Z., Ducháč V.: Kapitoly z obecné biologie, SPN, Praha 1994, s. 33-38 ISBN 80-04-26070-5 (2) Hejnák V. a kol.: Fyziologie rostlin, Česká zemědělská univerzita v Praze, Praha 2005, s. 9-83 ISBN 80-213-1341-2 (3) Rosypal S. a kol.: Přehled biologie, SPN, Praha 1987, s. 82-86 (4) Votrubová O.: Anatomie rostlin, Karolinum, Praha 1997, s. 8-35 ISBN 80-7184046-7 (5) Joza V.: Zemědělská fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích, osobní sdělení, 23.3.2015 (6) Votrubová O.: Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy, osobní sdělení, 16.4.2012 (7) Romanovský A. a kol.: Obecná biologie, SPN, Praha 1985, s. 148 (8) Nováková K.: Modelové biologické membrány: jejich charakterizace a využití. Chem. Listy, 2015, 109, 166-175. (9) Marty F.: Plant vacuoles. The Plant Cell, 1999, 11 (4), 587-599. (10) Davey M. R., et al.: Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnology advances, 2005, 23 (2), 131-171. (11) Tomar U. K., Dantu P. K.: Protoplast Culture and Somatic Hybridization. In: Tripathi G.: Cellular and Biochemical Science, I. K. International Publishing House, New Delhi 2010, s. 876-891 ISBN 978-81-88237-85-X (12) Takebe I., Nagata T.: Isolation and culture of protoplasts: tobacco. In: Vasil I. K.: Cell culture and somatic cell genetics of plants, Vol. 1; Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, San Diego 1984, s. 328-339 ISBN 0-12715001-3 (13) Melter O., Malmgren A.: Principy a praktika lékařské mikrobiologie, Karolinum, Praha 2014, s. 21 ISBN 978-80-246-2545-4 (14) Petřivalský M. a kol.: Experimentální metody studia obranné reakce rostlin, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Olomouc 2010, s. 17-18 (15) Šenková K.: Izolace protoplastů a vakuol u jednoděložných rostlin, Bakalářská práce, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Olomouc 2014, s. 1

97


Dana Kettnerová

(16) Navrátilová B.: Protoplast cultures and protoplast fusion focused on Brassicaceae - a review. Hort Sci (Prague), 2004, 31 (4), 140-157. (17) Wikipedia. [Online] [Citace: 5. červenec 2015.] https://cs.wikipedia.org/wiki/%C5%98ezan_pilolist%C3%BD (18) Chawla H. S.: Introduction to plant biotechnology, Second edition, Science Publishers, Enfield, New Hampshire 2002, s. 87-89 ISBN 1-57808-228-5 (19) Park J. K., Park S., Craven J., E.: Protoplast Isolation and Fusion. In: Smith R. H.: Plant tissue culture Techniques and Experiments, Third edition, Academic Press, London 2012, s. 147-149 ISBN 978-0-12-415920-4 (20) Willison J. H. M., Klein A. S.: Cell-wall regeneration by protoplasts isolated from higher plants. In: Brown R. M., Jr.: Cellulose and other natural polymer systems, Plenum Press, New York 1982, s. 61-85 ISBN 978-1-4684-1116-4 (21) Kurkdjian A. et al.: Non-enzymatic access to the plasma membrane of Medicago root hairs by laser microsurgery. Journal of Cell Science, 1993, 105 (1), 263-268. (22) Blackhall N. W., Davey M. R., Power J. B.: Isolation, culture and regeneration of protoplasts. In: Dixon R. A., Gonzales R. A.: Plant Cell Culture: A Practical Approach, Second edition, Oxford University Press, New York 1994, s. 27-39 ISBN 0-19-963402-5 (23) Rao P. S.: Protoplast culture. In: Johri B. M.: Experimental embryology of vascular plants, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York 1982, s. 231-232 ISBN 978-3-642-67798-4 (24) Korhoňová M.: Regenerační procesy v protoplastových kulturách rodu Brassica, Bakalářská práce, Přírodovědecká fakulta. Univerzita Palackého, Olomouc 2011, s. 11-18 (25) Bhojwani S. S., Razdan M. K.: Plant tissue culture: theory and practice, a revised edition, Elsevier, Amsterdam 1996, s. 338–345 ISBN 0-444-81623-2 (26) Razdan M. K.: Introduction to plant tissue culture, Second edition, Science Publishers, Enfield, New Hampshire 2003, s. 148-154 ISBN 1-57808-237-4 (27) Uchimiya H., Murashige T.: Evaluation of parameters in the isolation of viable protoplasts from cultured tobacco cells. Plant Physiology, 1974, 54 (6), 936-944. (28) Mukhtar I., Bajwa R., Nasim G.: Isolation of Mesophyll Protoplasts from Leaves of Dalbergia sissoo Roxb. Journal of Applied Sciences and Environmental Management, 2013, 16 (1), 11-15. 98


Dana Kettnerová

(29) Ochatt S. J., Power J. B.: Plant Regeneration from Cultured Protoplasts of Higher Plants. In: Fowler M. W., Warren G. S., Moo-Young M.: Plant Biotechnology: Comprehensive Biotechnology Second Supplement, Pergamon Press, Oxford; New York 1992, s. 99-104 ISBN 0-08-034731-2 (30) Ruesink A. W.: Leucine uptake and incorporation by Convolvulus tissue culture cells and protoplasts under severe osmotic stress. Physiologia Plantarum, 1978, 44 (1), 48-56. (31) Shen R. et al.: Compartmentation of aluminium in leaves of an Al-accumulator, Fagopyrum esculentum Moench. Planta, 2002, 215 (3), 394-398. (32) Cocking E. C.: A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature, 1960, 187, 962-963. (33) Klercker J. A. F.: Eine methode zur isolierung lebenderprotoplasten. Ofvers. Vetensk. Akad. Forh. Stokh., 1892, 9, 463-475. (34) Power J. B., Cocking E. C.: A simple method for the isolation of very large numbers of leaf protoplasts by using mixtures of cellulase and pectinase. Biochem. J, 1969, 111 (5), 33. (35) Nagata T., Takebe I.: Cell wall regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts. Planta, 1970, 92 (4), 301-308. (36) Nagata T., Takebe I.: Plating of isolated tobacco mesophyll protoplasts on agar medium. Planta, 1971, 99 (1), 12-20. (37) Takebe I., Labib G., Melchers G.: Regeneration of whole plants from isolated mesophyll protoplasts of tobacco. Naturwissenschaften, 1971, 58 (6), 318-320. (38) Takebe I., Otsuki Y.: Infection of tobacco mesophyll protoplasts by tobacco mosaic virus. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1969, 64 (3), 843848. (39) Carlson P. S., Smith H. H., Daering R. D.: Parasexual interspecific plant hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1972, 69 (8), 22922294. (40) Melchers G., Sacristán M. D., Holder A. A.: Somatic hybrid plants of potato and tomato regenerated from fused protoplasts.Carlsberg research communications, 1978, 43 (4), 203-218. (41) Gall E. A., Chiang Y. M., Kloareg B.: Isolation and regeneration of protoplasts from Porphyra dentata and Porphyra crispata.European Journal of Phycology, 1993, 28 (4), 277-283. 99


Dana Kettnerová

(42) Mukhtar I., Bajwa R., Nasim G.: Isolation of Mesophyll Protoplasts from Leaves of Dalbergia sissoo Roxb. Journal of Applied Sciences and Environmental Management, 2013, 16 (1), 11-15. (43) Bacic A., Harris P. J., Stone B. A.: Structure and function of plant cell walls. The biochemistry of plants, 1988, 14, 297-371. (44) Mořkovská T.: Význam významných polysacharidů heteroglukanů (β – glukanů) ve výživě člověka, Bakalářská práce, Technologická fakulta, Univerzita Tomáše Bati, Zlín 2007, s. 13 (45) Varner J. E., Lin L. S.: Plant cell wall architecture. Cell, 1989, 56 (2), 231-239. (46) Hatfield R. D. et al.: Grass lignin acylation: p-coumaroyl transferase activity and cell wall characteristics of C3 and C4 grasses. Planta, 2009, 229 (6), 1253-1267. (47) Lamport D. T. A.: The protein component of primary cell walls. In: Preston R. D.: Advances in botanical research, Vol. 2, Academic Press, New York 1965, s. 151–153 ISBN 0-12-005902-9 (48) Reiter W. D.: Biosynthesis and properties of the plant cell wall. Current opinion in plant biology, 2002, 5 (6), 536-542. (49) Scheller H. V., Ulvskov P.: Hemicelluloses. Plant Biology, 2010, 61 (1), 263. (50) Mohnen D.: Pectin structure and biosynthesis. Current opinion in plant biology, 2008, 11 (3), 266-277. (51) Reňák D.: Buněčná stěna, doplňkový text k přednáškám z Anatomie rostlin. [Online] [Citace: 17. červenec 2015.] http://wwwueb.asuch.cas.cz/laboratory_of_pollen_biology/pdf_subor/bunecna_stena _1.pdf (52) Srba M.: Úloha hybridního prolinem bohatého proteinu NtHyPRP1 v růstu a dělení buněk tabákové linie BY – 2, Diplomová práce, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova, Praha 2006, s. 13–15 (53) Lamport D. T. A. et al.: Role of the extensin superfamily in primary cell wall architecture. Plant physiology, 2011, 156 (1), 11-19. (54) Lamport D. T. A., Clark L.: Isolation and partial characterization of hydroxyproline-rich glycopeptides obtained by enzymic degradation of primary cell walls. Biochemistry, 1969, 8 (3), 1155-1163. (55) Josè M., Puigdomènech P.: Structure and expression of genes coding for structural proteins of the plant cell wall. New Phytologist, 1993, 125 (2), 259-282.

100


Dana Kettnerová

(56) Josè-E. M., Puigdomènech P.: Plant cell wall glycoproteins and their genes. Plant Physiology and Biochemistry, 2000, 38 (1), 97-108. (57) Ahn J. H. et al.: A novel extensin gene encoding a hydroxyproline-rich glycoprotein requires sucrose for its wound-inducible expression in transgenic plants. The Plant Cell, 1996, 8 (9), 1477-1490. (58) Aronsson H., Jarvis P.: A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS letters, 2002, 529 (2), 215-220. (59) Hill R.: Oxygen produced by isolated chloroplasts. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 1939, 127 (847), 192-210. (60) Al-Hasan R. H. et al.: Lipids of the gametophyte and sporophyte of Funaria hygrometrica. Comparison with lipids from leaves of vascular plants. The Bryologist, 1990, 93 (1), 44-49. (61) Wikipedia. [Online] [Citace: 21. červenec 2015.] https://cs.wikipedia.org/wiki/Chloroplast (62) Aronoff S.: Photochemical reduction of chloroplast grana. Plant physiology, 1946, 21 (4), 393. (63) Franck J.: Photosynthetic activity of isolated chloroplasts. Reviews of Modern Physics, 1945, 17 (2-3), 112. (64) Warburg O., Lüttgens W.: Carbon dioxide assimilation. Naturwiss, 1944, 32, 161. (65) Aronoff S.: Redox potentials and photoreduction by chloroplast granules. Science, 1946, 104 (2709), 503-505. (66) Boichenko E. A.: Conditions necessary for the activity of chloroplasts outside the cell. Compt. Rend. Acad. Sci. URSS, 1943, 38, 181-184. (67) Boichenko E. A.: Catalysts of activity of isolated chloroplasts. Compt. Rend. Acad. Sci. URSS, 1944, 42, 345-347. (68) Mackinney G.: Criteria for purity of chlorophyll preparations. Journal of Biological Chemistry, 1940, 132 (1), 91-109. (69) Arnon D. I.: Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant physiology, 1949, 24 (1), 1. (70) Behrens M.: Untersuchungen an isolierten Zell-und Gewebsbestandteilen. I. Mitteilung: Isolierung von Zellkernen des Kalbsherzmuskels. Hoppe-Seyler´ s Zeitschrift für physiologische Chemie, 1932, 209 (1-2), 59-74.

101


Dana Kettnerová

(71) Stocking C. R.: Chloroplast Isolation in Nonaqueous Media. Plant physiology, 1959, 34 (1), 56. (72) Stern H., Mirsky A. E.: The isolation of wheat germ nuclei and some aspects of their glycolytic metabolism. The Journal of general physiology, 1952, 36 (2), 181. (73) Granick S.: Quantitative isolation of chloroplasts from higher plants. American Journal of Botany, 1938, 25 (8), 558-561. (74) Jagendorf A. T., Wildman S. G.: The Proteins of Green Leaves. VI. Centrifugal Fractionation of Tobacco Leaf Homogenates and Some Properties of Isolated Chloroplasts. Plant physiology, 1954, 29 (3), 270. (75) Jagendorf A. T.: Purification of Chloroplasts by a Density Technique. Plant physiology, 1955, 30 (2), 138. (76) Leech R. M.: The isolation of structurally intact chloroplasts. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Specialized Section on Biophysical Subjects, 1964, 79 (3), 637-639. (77) Walker D. A.: Improved rates of carbon dioxide fixation by illuminated chloroplasts. The Biochemical journal, 1964, 92 (3), 22C-23C. (78) Walker D. A.: Correlation between photosynthetic activity and membrane integrity in isolated pea chloroplasts. Plant physiology, 1965, 40 (6), 1157. (79) Jensen R. G.; Bassham J. A.: Photosynthesis by isolated chloroplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1966, 56 (4), 1095. (80) West K. R., Wiskich J. T.: Photosynthetic control by isolated pea chloroplasts. Biochem. J, 1968, 109, 527-532. (81) Good N. E. et al.: Hydrogen ion buffers for biological research*. Biochemistry, 1966, 5 (2), 467-477. (82) Kalbere P. P., Buchanan B. B., Arnon D. I.: Rates of photosynthesis by isolated chloroplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1967, 57 (6), 1542. (83) Lilley R. M., Walker D.: A. Carbon dioxide assimilation by leaves, isolated chloroplasts, and ribulose bisphosphate carboxylase from spinach. Plant Physiology, 1975, 55 (6), 1087-1092. (84) Lilley R. et al.: Criteria of intactness and the photosynthetic activity of spinach chloroplast preparations. New Phytologist, 1975, 75 (1), 1-10. (85) upol. [Online] [Citace: 26. červenec 2015.] 102


Dana Kettnerová

http://biofyzika.upol.cz/userfiles/file/5-stavba-fotosyntetickeho-aparatu.pdf (86) Nishimura M., Akazawa T.: Photosynthetic activities of spinach leaf protoplasts. Plant physiology, 1975, 55 (4), 712-716. (87) Nishimura M., Graham D., Akazawa T.: Isolation of intact chloroplasts and other cell organelles from spinach leaf protoplasts. Plant physiology, 1976, 58 (3), 309-314. (88) Edwards G. E. et al.: Photosynthesis by Isolated Protoplasts, Protoplast Extracts, and Chloroplasts of Wheat Influence of Orthophosphate, Pyrophosphate, and Adenylates. Plant Physiology, 1978, 62 (2), 313-319. (89) Rathnam C. K. M.; Edwards G. E.: Protoplasts as a tool for isolating functional chloroplasts from leaves. Plant and Cell Physiology, 1976, 17 (1), 177-186. (90) Leegood R. C., Walker D. A.: Isolation of protoplasts and chloroplasts from flag leaves of Triticum aestivum L. Plant physiology, 1979, 63 (6): 1212-1214. (91) Edwards G. E., et al.: A requirement for chelation in obtaining functional chloroplasts of sunflower and wheat. Archives of biochemistry and biophysics, 1978, 190 (2), 421-433. (92) Takabe T., Nishimtjra M., Akazawa T.: Isolation of intact chloroplasts from spinach

leaf

by

centrifugation

in

gradients

of

the

modified

silica

“Percoll”. Agricultural and Biological Chemistry, 1979, 43 (10), 2137-2142. (93) Lilley R. M., Walker D. A.: The reduction of 3-phosphoglycerate by reconstituted chloroplasts and by chloroplast extracts. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1974, 368 (3), 269-278. (94) Stankovic

Z. S., Walker D. A.: Photosynthesis

by isolated pea

chloroplasts. Some effects of adenylates and inorganic pyrophosphate. Plant Physiology, 1977, 59, 428-432. (95) Nakatani, H. Y., Barber J.: An improved method for isolating chloroplasts retaining their outer membranes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1977, 461 (3), 510-512. (96) Cerović Z. G., Plesnicar M.: An improved procedure for the isolation of intact chloroplasts of high photosynthetic capacity. Biochemical Journal, 1984, 223 (2), 543. (97) Walker D. A.: Preparation of higher plant chloroplasts. In: San Pietro A.: Methods in enzymology, Vol. 69; Photosynthesis and Nitrogen Fixation-Part C, Academic Press, London; New York 1980, s. 94-104 ISBN 978-0-12-181969-9 103


Dana Kettnerová

(98) Somerville C. R., Somerville S. C., Ogren W. L.: Isolation of photosynthetically active protoplasts and chloroplasts from Arabidopsis thaliana. Plant Science Letters, 1981, 21 (1), 89-96. (99) Kobza J., Moore B. D., Seemann J. R.: Isolation of photosynthetically active protoplasts and intact chloroplasts from Phaseolus vulgaris. Plant Science, 1989, 65 (2), 177-182. (100) Cockburn W., Walker D. A., Baldry C. W.: The isolation of spinach chloroplasts in pyrophosphate media. Plant physiology, 1968, 43 (9), 1415-1418. (101) Robinson S. P., Downton W. J. S., Millhouse J. A.: Photosynthesis and ion content of leaves and isolated chloroplasts of salt-stressed spinach. Plant Physiology, 1983, 73 (2), 238-242. (102) Robinson S. P.: 3 - Phosphoglycerate phosphatase activity in chloroplast preparations as a result of contamination by acid phosphatase. Plant physiology, 1982, 70 (3), 645-648. (103) Strbac D. et al.: Chloroplast isolation from Laminaria digitata (Phaeophyceae): A reproducible methodology yielding photosynthetically active chloroplasts. Planta, 1994, 195 (1), 138-141. (104) Rensink W. A., Pilon M.,Weisbeek P.: Domains of a transit sequence required for in vivo import in Arabidopsis chloroplasts. Plant physiology, 1998, 118 (2), 691699. (105) Benková E. et al.: Cytokinins in tobacco and wheat chloroplasts. Occurrence and changes due to light/dark treatment. Plant Physiology, 1999, 121 (1), 245-252. (106) Lang E. G. E. et al.: Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant cell reports, 2011, 30 (2), 205-215. (107) Bruce B. D. et al.: In vitro import of proteins into chloroplasts. In: Gelvin S. B., Schilperoort R. A.: Plant Molecular Biology Manual, Second Edition, Springer Netherlands, 1994. s. 497-511 ISBN 978-94-011-0511-8 (108) Fitzpatrick L. M., Keegstra K.: A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins. The Plant Journal, 2001, 27 (1): 59-65. (109) Zeeman S. Ch.: Starch degradation in the leaves of Arabidopsis thaliana, PhD Thesis, University of Cambridge, Cambridge 1996

104


Dana Kettnerová

(110) Lung S. Ch., Yanagisawa M., Chuong S. D. X.: Isolation of dimorphic chloroplasts from the single-cell C4 species Bienertia sinuspersici. Plant methods, 2012, 8 (1), 8. (111) Gualberto J. S. et al. Isolation and Fractionation of Plant Mitochondria and Chloroplasts: Specifis Examples. In: Wilson L. et al.: Methods in plant cell biology, Vol. 50, Academic Press, London 1995, s. 161-175 ISBN 0-12-564152-4 (112) Nature. [Online] [Citace: 1. srpna 2015.] http://www.nature.com/scitable/topicpage/plant-cells-chloroplasts-and-cell-walls14053956 (113) Wagner G. J., Siegelman H. W.: Large-scale isolation of intact vacuoles and isolation of chloroplasts from protoplasts of mature plant tissues. Science, 1975, 190 (4221), 1298-1299 (114) Leigh R. A., Branton D.: Isolation of vacuoles from root storage tissue of Beta vulgaris L. Plant physiology, 1976, 58 (5), 656-662. (115) Leigh R. A. et al.: The location of acid invertase activity and sucrose in the vacuoles of storage roots of beetroot (Beta vulgaris). Biochem. J, 1979, 178, 539547. (116) Leigh R. A., Walker R. R.: ATPase and acid phosphatase activities associated with vacuoles isolated from storage roots of red beet (Beta vulgaris L.). Planta, 1980, 150 (3), 222-229. (117) Walker R. R., Leigh R. A.: Mg2+-dependent, cation-stimulated inorganic pyrophosphatase associated with vacuoles isolated from storage roots of red beet (Beta vulgaris L.). Planta, 1981, 153 (2), 150-155. (118) Doll S., Rodier F., Willenbrink J.: Accumulation of sucrose in vacuoles isolated from red beet tissue. Planta, 1979, 144 (5), 407-411. (119) Dürr M., Boller T., Wiemken A.: Polybase induced lysis of yeast spheroplasts. Archives of microbiology, 1975, 105 (1), 319-327. (120) Schmidt R., Poole R. J.: Isolation of protoplasts and vacuoles from storage tissue of red beet. Plant physiology, 1980, 66 (1), 25-28. (121) Power J. B., Cocking E. C.: Isolation of leaf protoplasts: macromolecule uptake and growth substance response. Journal of experimental botany, 1970, 21 (1), 64-70.

105


Dana Kettnerová

(122) Strobel G. A., Hess W. M.: Evidence for the presence of the toxin-binding protein on the plasma membrane of sugarcane cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1974, 71 (4), 1413-1417. (123) Walker-Simmons M., Ryan C. A.: Immunological identification of proteinase inhibitors I and II in isolated tomato leaf vacuoles. Plant physiology, 1977, 60 (1), 61-63. (124) Mettler I. J., Leonard R. T.: Isolation and partial characterization of vacuoles from tobacco protoplasts. Plant physiology, 1979, 64 (6), 1114-1120. (125) Briskin D. P., Leonard R. T.: Isolation of tonoplast vesicles from tobacco protoplasts. Plant physiology, 1980, 66 (4), 684-687. (126) Saunders J. A., Conn E. E.: Presence of the cyanogenic glucoside dhurrin in isolated vacuoles from Sorghum. Plant physiology, 1978, 61 (2), 154-157. (127) Sasse F., Backs-Hüsemann D., Barz W.: Isolation and characterization of vacuoles from cell suspension cultures of Daucus carota. Zeitschrift für Naturforschung C, 1979, 34 (9-10), 848-853. (128) Grob K., Matile P. H.: Vacuolar location of glucosinolates in horseradish root cells. Plant Science Letters, 1979, 14 (4), 327-335. (129) Wikipedia. [Online] [Citace: 5. srpna 2015.] https://cs.wikipedia.org/wiki/CAM_cyklus (130) Kringstad R., Kenyon W. H., Black C. C.:The rapid isolation of vacuoles from leaves of Crassulacean acid metabolism plants. Plant physiology, 1980, 66 (3), 379382. (131) Lin W., Wittenbach V. A.: Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant physiology, 1981, 67 (5), 969-972. (132) Kenyon W. H., Kringstad R., Black C. C.: Diurnal changes in the malic acid content of vacuoles isolated from leaves of the Crassulacean acid metabolism plant, Sedum telephium. FEBS Letters, 1978, 94 (2), 281-283. (133) Boudet A. M., Canut H., Alibert G.: Isolation and characterization of vacuoles from Melilotus alba mesophyll. Plant physiology, 1981, 68 (6), 1354-1358. (134) Leigh R. A., Ahmad N., Jones R. G. W.: Assessment of glycinebetaine and proline compartmentation by analysis of isolated beet vacuoles. Planta, 1981, 153 (1), 34-41. (135) Granstedt R. C., Huffaker R. C.: Identification of the leaf vacuole as a major nitrate storage pool. Plant Physiology, 1982, 70 (2), 410-413. 106


Dana Kettnerová

(136) Kaiser G., Martinoia E., Wiemken A.: Rapid appearance of photosynthetic products in the vacuoles isolated from barley mesophyll protoplasts by a new fast method. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie, 1982, 107 (2), 103-113. (137) Martinoia E., Heck U.Wiemken A.: Vacuoles as storage compartments for nitrate in barley leaves. Nature, 1981, 289 (5795), 292-294. (138) Rentsch D., Martinoia E.: Citrate transport into barley mesophyll vacuoles— comparison with malate-uptake activity. Planta, 1991, 184 (4), 532-537. (139) Leigh R. A., Tomos A. D.: An attempt to use isolated vacuoles to determine the distribution of sodium and potassium in cells of storage roots of red beet (Beta vulgaris L.). Planta, 1983, 159 (5), 469-475. (140) Glund K. et al.: Vacuoles from cell suspension cultures of tomato (Lycopersicon

esculentum)-Isolation

and

characterization. Zeitschrift

für

Pflanzenphysiologie, 1984, 113 (2), 151-161. (141) Thayer S. S., Huffaker R. C.: Vacuolar localization of endoproteinases EP1 and EP2 in barley mesophyll cells. Plant physiology, 1984, 75 (1), 70-73. (142) Le-Quoc K., Le-Quoc D., Pugin A.: An efficient method for plant vacuole isolation using digitonin for plasmalemma lysis. Journal of plant physiology, 1987, 126 (4), 329-335. (143) Lörz H., Harms C. T., Potrykus I.: Isolation of vacuoplasts from protoplasts of higher plants. Biochem. Physiol. Pflanzen, 1976, 169, 617-620. (144) Matoh T., Watanabe J., Takahashi E.: Sodium, potassium, chloride, and betaine concentrations in isolated vacuoles from salt-grown Atriplex gmelini leaves. Plant Physiology, 1987, 84 (1), 173-177. (145) Vögeli-Lange R., Wagner G. J.: Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves implication of a transport function for cadmium-binding peptides. Plant Physiology, 1990, 92 (4), 1086-1093. (146) Krämer U. et al.: Subcellular localization and speciation of nickel in hyperaccumulator and non-accumulator Thlaspispecies. Plant Physiology, 2000, 122 (4), 1343-1354. (147) Gomez L., Chrispeels M. J.: Tonoplast and soluble vacuolar proteins are targeted by different mechanisms. The Plant Cell, 1993, 5 (9), 1113-1124. (148) Frangne N. et al.: Flavone glucoside uptake into barley mesophyll and Arabidopsis cell culture vacuoles. Energization occurs by H+-antiport and ATPbinding cassette-type mechanisms. Plant Physiology, 2002, 128 (2), 726-733. 107


9

Dana Kettnerová

ABSTRAKT

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakognozie Diplomová práce Autor: Dana Kettnerová Školitel: PharmDr. Jan Martin, Ph.D. Název diplomové práce: Izolace rostlinných organel a studium transportních dějů Klíčová slova: izolace, chloroplast, protoplast, vakuola, buněčná stěna Izolace rostlinných organel a ostatních buněčných komponent je nezbytnou podmínkou pro studium fyziologických i patologických procesů uvnitř rostlinné buňky. Díky izolaci je možné provádět analýzu buněčných struktur, zjišťovat kumulaci určitých metabolitů, iontů, enzymů a dalších látek. Cílem této diplomové práce bylo poskytnout přehled izolačních metod využívaných při izolaci buněčné stěny, protoplastů, chloroplastů a vakuol rostlinných buněk. Byly popsány izolační procesy využívané pro jednotlivé typy buněčných struktur, klady a zápory jednotlivých izolačních metod, složky použitých médií a jejich funkce, stejně jako struktura a funkce jednotlivých rostlinných struktur.

108


Dana Kettnerová

10 ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacognosy Diploma thesis Author: Dana Kettnerová Supervisor: PharmDr. Jan Martin, Ph.D. Title of diploma thesis: Isolation of plant organelles and study of transport mechanisms Key words: isolation, chloroplast, protoplast, vacuole, cell wall

Isolation of plant organelles and other cellular components is essential for the study of physiological and pathological processes within the plant cell. It is possible to analyze cell structures, detect accumulation of certain metabolites, ions, enzymes and other substances thanks to the isolation. The goal of this diploma thesis was to provide an overview of isolation methods used for the isolation of cell wall, protoplasts, chloroplasts and vacuoles of plant cells. Isolation processes used for individual types of cell structures, the pros and cons of the various isolation methods, components of used media and their functions, as well as the structure and function of individual plant structures were described.

109

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE IZOLACE ROSTLINNÝCH ORGANEL A STUDIUM TRANSPORTNÍCH DĚJŮ

Recommend Documents