UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE

UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535 SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Sains

Oleh: Mita Mutia Rahman NIM. M0406041

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING SKRIPSI UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535 SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF Oleh : Mita Mutia Rahman M 0406041 Telah disetujui oleh Tim Pembimbing

Tanda Tangan Pembimbing I

: Dr. Artini Pangastuti, M.Si NIP. 197505312000032001

........................

Pembimbing II

: Rita Rakhmawati, S.Farm., M.Si.,Apt. NIP. 198005102005012002

........................

Surakarta, Mei 2010 Mengetahui Ketua Jurusan Biologi

Dra. Endang Anggarwulan, M. Si NIP. 195003201978032001

PENGESAHAN SKRIPSI UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535 SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF Oleh : Mita Mutia Rahman M 0406041 Telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 26 Maret 2010 dan dinyatakan telah memenuhi syarat Surakarta, …………… Penguji I

Penguji II

Widya Mudyantini, M.Si., 197305051999032001

Tjahjadi Purwoko, M.Si., 197011302000031002

Penguji III

Penguji IV

Dr. Artini Pangastuti, M.Si. NIP. 197505312000032001

Rita Rakhmawati, S.Farm., M.Si.,Apt. NIP. 198005102005012002 Mengesahkan

Dekan FMIPA UNS

Mengetahui Ketua Jurusan Biologi

Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D. NIP. 196008091986121001

Dra. Endang Anggarwulan, M.Si. NIP. 195003201978032001

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila dikemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar kesarjanaan yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.

Surakarta, Mei 2010

Mita Mutia Rahman NIM. M0406041

UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535 SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF Mita Mutia Rahman Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret, Surakarta ABSTRAK Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek mutagenik hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 dan profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar. Penelitian ini menggunakan metode Ames dengan bakteri termutasi Salmonella typhimurium TA 98 sebagai indikator frameshift mutation dan Salmonella typhimurium 100 dan 1535 sebagai indikator mutasi substitusi pasangan basa. Sampel yang diuji adalah hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut dan bagian tidak larut wasbensin dengan konsentrasi 10, 100, 500 dan 1000 µg/mL. Hasil uji mutagenisitas bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan 500 µg/mL dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL. Hasil uji mutagenisitas bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 tidak dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL. Hasil uji deteksi bagian larut wasbensin pada plat KLT dengan berbagai deteksi senyawa semprot menunjukkan hasil positif untuk deteksi terpenoid menggunakan vanilin-H2SO4 dan flavonoid menggunakan FeCl3. Senyawa terpenoid dan flavonoid ini diduga merupakan senyawa yang menyebabkan mutasi. Kata kunci: Geranium radula Cavan., metode Ames, frameshift mutation, mutasi substitusi pasangan basa, partisi.

MUTAGENIC TEST OF PARTITION CHLOROFORM EXTRACT RESULT OF AMBRE LEAVES (Geranium radula Cavan.) TO THE BACTERIA Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 AND TA 1535 AND PROFILE OF THE MOST ACTIVE PART OF CHEMISTRY COMPOUND Mita Mutia Rahman Department of Biology, Faculty of Mathematic and Science, University of Sebelas Maret, Surakarta ABSTRACT

The purpose of research was to know the mutagenic effect of partition chloroform extract of Ambre leaves to the tested bacteria Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 and TA 1535 and profile of the most active part of bioactive showing the biggest mutagenic characteristic. The research used Ames method with mutated bacteria Salmonella typhimurium TA 98 as frameshift mutation indicator and Salmonella typhimurium 100 and 1535 as substitution mutation of base pair indicator. Tested sample was the result of partition chloroform extract of Ambre leaves of the dissolved and non dissolved part in wasbensin at concentration of 10, 100, 500, and 1000 µg/ml. Mutagenic test result showed chloroform extract of Ambre leaves of the dissolved part in wasbensin used Salmonella typhimurium TA 100 and 1535 could cause substitution mutation of base pair in concentration 100 µg/mL and 500 µg/mL and used Salmonella typhimurium TA 98 could cause frameshift mutation in concentration 10 µg/mL. Mutagenic test result showed chloroform extract of Ambre leaves of non dissolved part in wasbensin used Salmonella typhimurium TA 100 and 1535 couldn’t cause substitution mutation of base pair and used Salmonella typhimurium TA 98 could cause frameshift mutation in concentration 10 µg/mL. Result of detection on result compound of partition chloroform extract of Ambre leaves of dissolved part in wasbensin on KLT plat with various detection of sprayed compound showed a positive result for detection of terponoid used vanillin-H2SO4 and flavonoid used FeCl3. Terpenoid and flavonoid presumed as compound that causing mutation. Keywords: Geranium radula Cavan., Ames method, frameshift mutation, substitution mutation of base pair, partition.

MOTTO Dengan menyebut nama Allah yang maha pengasih dan penyayang (Al-Fatihah ayat 1) Allah tidak membebani seseorang melainkan sesuai dengan kesanggupannya (Al-Baqarah ayat 286) Rahmat sering datang kepada kita dalam bentuk kesakitan, kehilangan dan kekecewaan; tetapi kalau kita sabar, kita segera akan melihat bentuk aslinya. (Joseph Addison) Belajarlah dari kesalahan orang lain. Anda tak dapat hidup cukup lama untuk melakukan semua kesalahan itu sendiri. (Martin Vanbee) Orang-orang yang sukses telah belajar membuat diri mereka melakukan hal yang harus dikerjakan ketika hal itu memang harus dikerjakan, entah mereka menyukainya atau tidak. (Aldus Huxley) Bersikaplah kukuh seperti batu karang yang tidak putus-putusnya dipukul ombak. Ia tidak saja tetap berdiri kukuh, bahkan ia menenteramkan amarah ombak dan gelombang itu. (Marcus Aurelius) Jadilah kamu manusia yang pada kelahiranmu semua orang tertawa bahagia, tetapi hanya kamu sendiri yang menangis; dan pada kematianmu semua orang menangis sedih, tetapi hanya kamu sendiri yang tersenyum. (Mahatma Gandhi) Kita melihat kebahagiaan itu seperti pelangi, tidak pernah berada di atas kepala kita sendiri, tetapi selalu berada di atas kepala orang lain. (Thomas Hardy)

PERSEMBAHAN

Skripsi ini aku persembahkan untuk Allah SWT yang menjadikan aku lebih sabar, lebih semangat menjalani hidup dan selalu yakin bahwa Allah selalu memberiku yang terbaik. Bapak Dadun Abdurahman dan Ibu Iis Nuriah yang selalu mendukungku dengan doa-doa terbaiknya, mudah-mudahan aku bisa memberi yang terbaik untuk kalian Kakakku Tika Kandita Rahman, Adik-adiku Amelia Rahman dan Naura Azkiya Rahman

KATA PENGANTAR Segala puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat, karunia serta hidayah-Nya yang tak tehingga sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul : “Uji Mutagenisitas Hasil Partisi Ekstrak Kloroform Daun Ambre (Geranium radula Cavan.) terhadap Bakteri Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 dan TA 1535 Serta Profil Kandungan Kimia Bagian Teraktif”. Penyusunan skripsi ini merupakan suatu syarat untuk memperoleh gelar kesarjanaan strata 1 (S1) pada Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret Surakarta. Dalam pelaksanaan penelitian maupun penyusunan skripsi ini penulis mendapatkan banyak masukan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak yang sangat bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih yang setulusnya kepada: Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D., selaku dekan FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta atas ijin penelitian untuk keperluan skripsi. Dra. Endang Anggarwulan, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan arahan serta ijin penelitian skripsi. Tim Research Grand PHK A2 Jurusan Biologi FMIPA UNS, atas kesempatan dan fasilitas sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan lancar. Dr. Okid Parama Astirin, MS., selaku pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan, arahan serta dukungan. Dr. Artini Pangastuti, M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi. Rita Rakhmawati, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi.

Tjahjadi Purwoko, M.Si., selaku dosen penelaah I yang telah memberikan bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya penyusunan skripsi. Widya Mudyantini, M.Si., selaku dosen penelaah II yang telah memberikan bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya penyusunan skripsi. Dinar Sari C.W., M.Si., Apt. yang telah memberikan bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya penelitian. Kepada segenap dosen dan staf jurusan Biologi FMIPA UNS atas segala bentuk dukungan yang diberikan. Keluarga besar Dadun Abdurahman, atas dukungan dan doanya. Keluarga besar biologi 2006 untuk semangat, kebersamaan, dan persaudaraan yang luar biasa. Dengan kerendahan hati penulis menyadari bahwa dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik yang membangun dari para pembaca akan sangat membantu. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Surakarta, Mei 2010 Penyusun

DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL…………………………………………………........ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………………..

ii

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………….……….

iii

HALAMAN PERNYATAAN…………………………………………….

iv

ABSTRAK…………………………………………………………...……

v

ABSTRACT……………………………………………………………….

vi

HALAMAN MOTTO……………………………………………………..

vii

HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………..

viii

KATA PENGANTAR…………………………………………………….

ix

DAFTAR ISI………………………………………………………………

xi

DAFTAR TABEL…………………………………………………………

xiv

DAFTAR GAMBAR………………………………………………….......

xv

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………

xvi

DAFTAR SINGKATAN………………………………………………….

xvii

BAB I. PENDAHULUAN………………………………………………...

1

A. Latar Belakang…………………………………………………

1

B. Rumusan Masalah………………………………………...……

3

C. Tujuan Penelitian……………………………………………….

3

D. Manfaat Penelitian……………………………………………..

3

BAB II. LANDASAN TEORI…………………………………………….

4

A. Tinjauan Pustaka……………………………………………….

4

1. Uraian Ambre (Geranium radula Cavan.)…………………..

4

a. Klasifikasi…………………………………………….......

4

b. Habitat…………………………………………………….

4

c. Morfologi…………………………………………………

5

d. Kandungan Kimia dan Manfaat Daun Ambre……………

5

2. Uji Mutagenisitas dan Bakteri Salmonella typhimurium……

7

3. Pemisahan Komponen Bioaktif dengan Ekstraksi dan

......Partisi.....................................................................................

11

4. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)…………………………...

12

B. Kerangka Pemikiran……………………………………………

15

BAB III. METODE PENELITIAN……………………………………….

18

A. Waktu dan Tempat Penelitian………………………………….

18

B. Alat dan Bahan Penelitian ..………………………………........

18

1. Alat Penelitian..……………………………………………...

18

a. Alat untuk pemisahan komponen bioaktif ……………….

18

b. Alat untuk uji mutagenisitas ……………………………..

18

c. Alat untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia….

18

2. Bahan Penelitian..…………………………………………...

18

a. Bahan untuk pemisahan komponen bioaktif ……………..

18

b. Bahan untuk uji mutagenisitas …………………………...

19

c. Bahan untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia..

19

C. Cara Kerja…….………………………………………………...

19

1. Pengambilan Sampel…………………………………….......

19

2. Pemisahan Komponen Bioaktif...............................................

19

a. Ekstraksi…………………………………………………..

19

b. Partisi.......................................…………………………...

20

3. Uji Mutagenisitas.....................................................................

20

a. Penanganan bakteri uji……………………………………

20

b. Pembuatan biakan semalam………………………………

21

c. Uji mutagenesitas larutan uji……………………………...

21

d. Uji kontrol positif………………………………………....

21

e. Uji kontrol negatif………………………………………...

22

f. Larutan uji……………………………………………......

22

4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Penentuan Profil ......Kandungan Senyawa Kimia..................................................

22

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)........................................

22

b. Penentuan profil kandungan senyawa kimia.......................

23

D. Analisis Data…………………………………………………...

25

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………

26

A. Ekstraksi dan Partisi……………………………………………

26

1. Ekstraksi…………………………………………………......

26

2. Partisi……………………………………………….………..

29

B. Uji Mutagenisitas…..…………………………………………..

31

C. Deteksi Golongan Senyawa Partisi Teraktif...............................

43

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………..

48

A. Kesimpulan…………………………………………………….

48

B. Saran……………………………………………………………

48

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………..

50

RIWAYAT HIDUP PENULIS……………………………………………

64

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Rata-rata hasil uji mutagenisitas hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre............................................................

33

Tabel 2. Rata-rata hasil uji mutagenisitas kontrol.................................

33

Tabel 3. Perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok kontrol negatif ...........................................

34

Tabel 4. Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik............................................

46

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Geranium radula Cavan...................................................

6

Gambar 2.

Bunga Geranium radula Cavan........................................

6

Gambar 3.

Alur Kerangka Pemikiran……………………………….

17

Gambar 4.

Skema Cara Kerja.………………………………………

24

Gambar 5.

Kromatogram hasil KLT ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat ........................................................................

28

Gambar 6. Kromatogram hasil KLT partisi ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat.............................................................

30

Gambar 7.

Gambar 8.

Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat...........................................

43

Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan Vanilin-H2SO4, Liebermenn-burchard, FeCl3……………………………

45

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Kunci determinasi tumbuhan Ambre (Geranium radula Cavan.) ……………………………………………………

56

Lampiran 2. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98…………………………..

57

Lampiran 3. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100........................................

58

Lampiran 4. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 1535......................................

59

Lampiran 5. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98..............................

60

Lampiran 6. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100............................

61

Lampiran 7. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 1535..........................

62

Lampiran 8. Komposisi media dan larutan stok.......................................

63

Lampiran 9. Daftar riwayat hidup penulis………………………………

64

Daftar Singkatan Singkatan BST B2P2TOOT Ce(IV)(SO4)2 DMSO DNA EBPI Faktor R FeCl3 GF254 G2 His IQ KLT LB LC50 MGMT MIPA MMS MNU NOPD OECD PLDB Rf RNA S SA Trp UV uvr A uvr B UV366 UV254 Vanilin H2SO4 2AA 9-AAD 4NQO

Keterangan Brine Shrimp Letality Test Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Serium (IV) sulfat Dimethyl sulfoxide Deoksiribonukleic acid/ Asam deoksiribonukleat Enviromental Bio-Detection Products inc. Faktor resistensi Ferri clorida Gypsum Fosforesense pada panjang gelombang 254 Gap 2 Histidin 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f-)-quinoline Kromatografi Lapis Tipis Luria Bertani Letal Concentrate 50 % O6-methylguanine-DNA methyltransferase levels Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Methyl methanesulponate N-nitroso-N-methylurea 4-Nitro-o-phenylenediamine Organisasion for Economic Coorperation and Development Protein Linked DNA Breaks Retardation factor Ribonukleic acid/ Asam ribonukleat Sintesis Sodium azide Triptofan Ultraviolet Ultraviolet radiation A Ultraviolet radiation B Ultraviolet panjang gelombang 366 Ultraviolet panjang gelombang 254 Vanilin-asam sulfat 2-aminoanthrancene 9-aminoacridine 4-nitroquinoline-N-oxide

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian terbesar di dunia terutama di negara-negara maju (Pato, 2003). Kanker merupakan penyakit sel yang ditandai dengan adanya perubahan (transformasi) pada sel sehingga bentuk, sifat dan kinetiknya berubah. Sel tumbuh menjadi autonom, liar, tidak terkendali, terlepas dari koordinasi petumbuhan normal, dan bersifat ganas (Aulia dkk., 2002; Maliya, 2004). Kejadian dan jenis penyakit kanker erat hubungannya dengan berbagai faktor antara lain adalah jenis kelamin, usia, ras dan paparan terhadap beberapa zat yang bersifat karsinogenik (Katzung, 1994). Zat yang bersifat karsinogenik dapat berupa zat kimia organik maupun anorganik. Selain itu, virus dan radiasi sinar dapat pula menyebabkan kanker (Dalimartha, 2004). Dalam pengobatan kanker dibutuhkan pendekatan sistemik melalui kemoterapi kanker, disamping pembedahan, radiasi, dan kemoterapi ajuvan (Nafrialdi dan Gan, 1995). Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber obatobatan kemoterapi yang potensial sehingga pencarian obat-obatan kemoterapi dari tumbuh-tumbuhan masih terus dilakukan (Sukardiman dkk., 2006). Berdasarkan penelitian skrining toksisitas beberapa tanaman di kawasan Tawangmangu Surakarta dengan menggunakan metode Brine Shrimp Letality Test (BST) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dari daun Ambre (Geranium radula

Cavan.) memiliki aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan Rakhmawati, 2008). Suatu ekstrak berpotensi sebagai kandidat antikanker berdasarkan metode BST jika harga LC50 kurang dari 1000 µg/mL dan hasil uji toksisitas menggunakan metode BST ini dapat diasosiasikan dengan sifat sitotoksik yang digunakan sebagai prasyarat antikanker (Erma dkk., 2004). Berdasarkan penelitian, Ames telah membuktikan bahwa 90% senyawa yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982). Disisi lain banyak teori yang menyebutkan bahwa mekanisme kerja dari beberapa senyawa yang digunakan sebagai obat antikanker mirip dengan mekanisme kerja senyawa karsinogen terhadap protein, DNA atau sel normal (Foye, 1996). Ini membuktikan bahwa senyawa antikanker dapat pula menyebabkan mutasi. Hal ini dapat dimengerti mengingat ada beberapa obat antikanker yang berasal dari tanaman dapat secara langsung menghambat perkembangan siklus sel kanker dan menyebabkan terjadinya kerusakan DNA (Katzung, 1994). Berdasarkan hal tersebut, maka perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik dari daun Ambre dengan melakukan uji mutagenisitas terhadap hasil partisi dari ekstrak kloroform daun Ambre menggunakan metode Ames. Pada uji mutagenisitas ini digunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535. Daun Ambre diperiksa untuk melihat efek mutagenik dengan melakukan pengamatan terhadap ada tidaknya pertumbuhan bakteri dalam media. Selanjutnya dicari profil kandungan senyawa kimia teraktif dari hasil partisi yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.

B. Perumusan Masalah Adapun rumusan masalah dalam penelitian ini adalah : a. Bagaimana efek mutagenik hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 ? b. Bagaimana profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar ?

C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah : a. Mengetahui efek mutagenik dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535. b. Mengetahui profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.

D. Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari adanya penelitian ini adalah : a. Memberikan informasi ilmiah dan pengetahuan tentang efek mutagenik dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre sehingga dapat digunakan sebagai dasar penelitian berikutnya. b. Menambah nilai ilmiah dan ekonomi tanaman Ambre sehingga dapat dimanfaatkan sebagai bahan dasar untuk pembuatan obat dari bahan alam.

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka 1. Uraian Ambre (Geranium radula Cavan.) a. Klasifikasi Divisi

: Spermatophyta

Sub divisi

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyledoneae

Ordo

: Geraniales

Famili

: Geraniaceae

Genus

: Geranium

Spesies

: Geranium radula Cavan.

Sinonim

: Pelargonium odoratissimum Hort.; Pelargonium roseum Hort.

Nama daerah : Daun Ambre (Sumatra), Ambre (Melayu) (Depkes RI, 2009). b. Habitat Tumbuh baik pada tanah yang sedikit asam dengan pH 6,0-6,5, pada kondisi lingkungan yang lembab dan terkena sinar matahari penuh (Rothman, 2009).

c. Morfologi Ambre merupakan tanaman perdu, dengan tinggi + 1,5 m. Memiliki batang berkayu berbentuk bulat dengan permukaan kasar dan berbulu. Pada waktu muda batang berwarna hijau setelah tua berwarna coklat. Berdaun tunggal dengan panjang tangkai 5-12 cm dan memiliki rambut yang kasar. Pada daun bagian tepi bergerigi dengan ujung tumpul dan pangkalnya berlekuk. Pertulangan daun menyirip dengan panjang + 13 cm dan lebar + 9 cm, daunnya berwarna hijau muda sampai hijau (Backer dan Bakhuizen,1968). Memiliki bunga majemuk yang berbentuk payung, panjang tangkainya 5-12 cm, dengan kelopak lepas terdiri dari 5 helai, daun mahkota berjumlah 5 helai berbentuk bulat telur dengan panjang 1-5 cm dan lebar 5-7 mm. Bunga berwarna merah muda dengan benang sari sebanyak sepuluh buah yang pangkalnya berlekatan dan memiliki bakal buah sebanyak 5 ruang. Buahnya merupakan buah buni yang berbentuk kerucut dengan panjang 5-6 mm, berwarna hijau. Berbiji kecil dan berwarna putih. Perakarannya tunggang dan berwarna coklat muda (Backer dan Bakhuizen,1968). d. Kandungan kimia dan manfaat daun Ambre Daun Ambre dipercaya berkhasiat sebagai obat reumatik, obat jerawat dan bahan baku kosmetika. Biasanya digunakan hanya untuk dipakai di luar tubuh dengan cara mengoleskan hasil tumbukkan daun pada bagian yang sakit. Daun mengandung minyak atsiri, saponin, flavonoida dan tannin (Depkes RI, 2009). Saponin, flavonoida dan tannin telah dilaporkan memiliki aktivitas antikanker (Zakaria, 2007). Berdasarkan penelitian ternyata ekstrak daun Ambre memiliki

aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan Rakhmawati, 2008). Pada konsentrasi 80% ekstrak daun Ambre efektif menunjukkan daya tolak terhadap nyamuk Aedes aegypti (Linn.) (Dewi dan Leni, 2006).

Gambar 1. Geranium radula Cavan.

Gambar 2. Bunga Geranium radula Cavan (Depkes RI, 2009)

2. Uji Mutagenisitas dan Bakteri Salmonella typhimurium Uji mutagenisitas digunakan untuk mengetahui apakah suatu bahan uji bersifat mutagen atau tidak. Ada beberapa metode uji untuk mengetahui suatu bahan bersifat mutagenik diantaranya dengan menggunakan mencit yang terdiri dari metode mikronukleus pada tulang sumsum, metode spot test atau dengan menggunakan mencit transgenik dan dengan menggunakan bakteri (Wegrzyn dan Czyz, 2003; Wahnschaffe dkk1., 2005; Wahnschaffe dkk2., 2005; Sumpena dkk., 2009; Shoebi dkk., 2009). Uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri lebih banyak digunakan dengan alasan lebih mudah dilakukan dan waktu yang digunakan lebih singkat bila dibandingkan dengan uji mutagenisitas lainnya. Uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri memiliki banyak macam diantaranya adalah uji Ames, uji mutatox, uji vitotox, dan uji dengan menggunakan bakteri Vibrio harveyi yang dikenal dengan Vibrio harveyi assay (Ames dkk1., 1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003). Uji Ames telah diperkenalkan sejak 30 tahun lalu, karena uji ini banyak digunakan untuk mengetahui sifat mutagenik suatu senyawa lambat laun uji ini mengalami modifikasi, namun tetap dengan prinsip dasar yang sama misalnya dengan bioluminescent assay yang dipadukan dengan metode Ames (Guadano dkk., 1999; Wegrzyn dan Czyz, 2003 ). Prinsip dari uji Ames adalah bakteri yang digunakan sudah dimutasi sehingga tidak mampu mensintesis salah satu jenis asam amino esensial misalnya histidin dan triptofan untuk pertumbuhannya, oleh karena itu bakteri butuh media

yang mengandung histidin atau triptofan agar bisa tumbuh normal. Bila bahan uji yang diperiksa bersifat mutagen, maka bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke fungsinya yang semula. Dengan demikian, gen his dan gen trp yang termutasi akan mengalami mutasi balik. Gen his dan gen trp tersebut kembali normal sehingga bakteri uji dapat mensintesis sendiri histidin dan triptofan yang dibutuhkan dalam pertumbuhannya, ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri di dalam media yang kekurangan histidin atau triptofan (Radji dkk., 2004). Uji mutagenisitas dengan menggunakan uji Ames ini umumnya menggunakan strain bakteri Salmonella typhimurium yang sudah dimodifikasi. Bakteri tersebut termutasi pada bagian gen his yang menyebabkan terganggunya proses sintesis histidin (Ames dkk1., 1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003). Selain itu, digunakan juga galur Escherichia coli WP2 yang mengandung gen mutasi uvrA (OECD, 1997). Beberapa contoh bakteri Salmonella typhimurium termutasi diantaranya adalah TA 97, TA 97a, TA 98, TA100, TA 102, TA 104, TA1535, TA 1537, dan TA 1975. Masing-masing galur mengandung gen termutasi histidin, mutasi rfa, mutasi uvrB, faktor R (pKM101) dan plasmid pAQ1 untuk meningkatkan kepekaan bakteri terhadap senyawa mutagenik (Ames dkk1., 1973; OECD, 1997; Suzuki dkk., 1997; Dillon dkk., 1998). Mutasi DNA repair (uvr A/B) menghilangkan sistem excision repair pada DNA. Sistem excision repair merupakan jalur perbaikan DNA yang rusak akibat terkena sinar UV dan mutagen tertentu. Adanya mutasi uvr A/ B membuat strain tersebut lebih sensitif terhadap beberapa partikel yang diujikan. Mutasi uvr

A/B juga menyebabkan terjadinya delesi pada gen bio yang mengakibatkan bakteri tidak dapat mensintesis biotin dan membutuhkan biotin untuk pertumbuhannya, mutasi uvr A/B ditandai dengan kepekaan terhadap sinar UV (Genpharmtox, 2009). Gen rfa merupakan gen yang berfungsi dalam mengatur biosintesis lipopolisakarida (Sanderson dan Saeed, 1972). Adanya mutasi gen rfa menyebabkan hilangnya sebagian kapsul lipopolisakarida yang membungkus permukaan bakteri sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas terhadap molekul besar seperti benzo-a-piren yang tidak dapat berpenetrasi ke dalam sel normal. Mutasi rfa ditandai dengan adanya kepekaan terhadap kristal violet (OECD, 1997; Tejs, 2008; Genpharmtox, 2009). Plasmid faktor R (pKM101) membuat strain bakteri lebih responsif terhadap berbagai mutagen. Plasmid ini membawa gen resisten ampisilin. Plasmid pAQ1 yang terdapat pada strain TA 102 mengandung mutasi hisG428 dan gen resisten tetrasiklin (McCann dkk., 1975; Levin dkk., 1984; OECD, 1997). Galur TA 100 mempunyai mutasi hisG46 pada gen hisG yang mengkodekan enzim untuk biosintesis histidin. Galur TA 100 ini termutasi pasangan basanya secara substitusi dan bisa digunakan untuk mendeteksi adanya mutagen yang menyebabkan adanya salah satu substitusi pasangan basa dari enam kemungkinan terjadinya mutasi substitusi pasangan basa (A-T à T-A, G-C, C-G ; G-Cà C-G, A-T, T-A) (Skopek dkk., 1978; Burgess dkk., 1985). Galur TA 1535 memiliki mutasi substitusi pasang basa yang sama dengan TA 100, hanya saja galur TA 1535 tidak memiliki plasmid pKM101. Hal

ini membuat galur TA 100 secara umum lebih sensitif bila dibandingkan dengan TA 1535 (McCann dkk., 1975; Prival dan Zeiger, 1998, Akerele dan Ebor, 2002; Tejs 2008). Mutasi hisD3052 pada TA 98 adalah gen hisD pengkode histidinol dehidrogenase. Galur ini dapat mendeteksi beberapa mutagen frameshift. Mutagen dapat memantapkan pasangan tergeser yang sering terjadi pada pengulangan urutan DNA atau hot spot DNA yang menghasilkan mutasi frameshift yang memulihkan pembacaan frame yang benar untuk sintesis histidin. Mutasi hisD3052 mempunyai urutan pengulangan –GC- atau –CG- dalam urutan -C-G-CG-C-G-C-G- yang terdapat di dekat tempat mutasi frameshift a-1 pada gen hisD (Levine dkk., 1994; DeMarini dkk., 1998). Bakteri galur TA 98, 100 dan TA 1535 tidak sensitif terhadap mutagen oksidatif seperti radikal bebas dan senyawa penaut silang (cross linked) yang biasanya menyerang pasangan basa A-T (Dillon dkk., 1998; OECD, 1997; Sotto dkk., 2009). Pemberian suspensi dari sel tumor payudara dapat meningkatkan mutasi balik bakteri galur TA 98 dan 100 (Fulton dkk., 1984). Pada tahun 1973 Ames melakukan penelitian untuk mendeteksi adanya mutagen dengan menambahkan aktivator metabolik dan sampai saat ini masih banyak dilakukan (Ames dkk2.,1973; Shoeibi dkk., 2009). Aktivator metabolik tersebut berupa ekstrak hati tikus yang disebut S-9 mix yang mengandung enzim microsomal seperti enzim retikulum endoplasmik yang mampu melakukan hidroksilasi atau mengubah banyak senyawa organik menjadi bentuk akhirnya, karena banyak senyawa menjadi bersifat karsinogenik setelah mengalami proses

metabolisme oleh sel (Ames dkk2.,1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003; Lehninger, 1982). Beberapa penelitian melakukan uji konfirmasi genotip, uji viabilitas dan banyaknya reversi spontan sesaat setelah menerima strain bakteri. Tujuannya adalah membuktikan keutuhan strain uji (Setiadarma, 2002). Selain konfirmasi genotip, perlu juga dilakukan uji mutagen standar. Walaupun hasil konfirmasi sifat genotip memenuhi syarat, tetapi jika mutagen standar tidak memberikan hasil positif, bakteri tersebut tidak dapat digunakan untuk pengujian (Radji dkk., 2004). Mutagen

standar

yang

sering

digunakan

diantaranya

adalah

Methyl

methanesulponate (MMS), 4-nitroquinoline-N-oxide (4NQO), 2-minoanthrancene (2AA),

2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f-)-quinoline

(IQ),

N-nitroso-N-

methylurea (MNU), 4-Nitro-o-phenylenediamine (NOPD), Sodium azide (SA) dan 9-aminoacridine (9-AAD) (Haworth dkk., 1983; OECD, 1997; Guadano dkk., 1999; Totusek dkk., 2009).

3. Pemisahan Komponen Bioaktif dengan Ekstraksi dan Partisi Ekstraksi suatu senyawa dalam tumbuhan dapat dilakukan dengan cara maserasi, perkolasi, sokletasi dan destilasi uap. Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan karena dengan perendaman maka pada sampel tumbuhan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan

sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam tersebut (Leny, 2006). Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut (Rohman, 2007). Hukum distribusi atau partisi dapat dirumuskan bila suatu zat terlarut terdistribusi antara dua pelarut yang tidak dapat campur, maka pada suatu temperatur yang konstan untuk setiap spesi molekul terdapat angka banding distribusi yang konstan antara kedua pelarut itu, dan angka banding distribusi ini tidak tergantung pada spesi molekul lain apapun yang mungkin ada. Harga angka banding berubah dengan sifat dasar pelarut, sifat dasar zat terlarut, dan temperatur (Svehla, 1990). Hasil dari partisi yang diperoleh kemudian akan diuji dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui pemisahan komponen bioaktifnya kemudian dilakukan uji bioassay untuk mengidentifikasi komponen aktif dengan uji Ames.

4. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT) Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berbentuk bercak atau pita (awal), kemudian pelat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan

kapiler (pengembangan). Senyawa yang tidak berwarna selanjutnya harus ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat. Beberapa keuntungan kromatorafi lapis tipis diantaranya : 1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. 2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. 3. Dapat dilakukan elusi secara menarik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. 4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Rohman, 2007). Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penyerap. Penyerap yang umum adalah silika gel, alumunium oksida, selulosa, kiselgur, selulosa dan turunannya. Dua sifat yang penting dari penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada hal tersebut. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang

memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus (Sastrohamidjojo, 1991). Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Ia bergerak di dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Laju rambat tergantung kepada viskositas pelarut dan struktur lapisan (misalnya butiran penyerap). Pemisahan yang baik dan reproducible perlu diperhatikan pemilihan kondisi kerja yang meliputi sifat pengembangan, kejenuhan bejana dan lain-lain (Stahl, 1985). Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Rohman, 2007). Terdapat berbagai kemungkinan untuk deteksi senyawa tak berwarna pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan di daerah ultraviolet (UV) gelombang pendek (radiasi utama pada kira-kira 254 nm) atau jika senyawa tersebut dapat dieksitasi ke flourosensi radiasi UV gelombang pendek dan atau gelombang panjang (366 nm). Jika dengan kedua cara itu senyawa tidak dapat dideteksi, maka harus dicoba dengan menggunakan reaksi kimia. Pada sistem KLT dikenal istilah kecepatan rambat suatu senyawa yang diberi simbol Rf (Retardation factor). Harga Rf ditentukan oleh jarak rambat senyawa dari titik awal dan jarak rambat fase gerak dari titik awal. Harga Rf ini dapat digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisa. Penentuan harga Rf adalah sebagai berikut:

Jarak perambatan bercak dari titik awal Rf = Jarak perambatan fase gerak dari titik awal (Stahl, 1985).

B. Kerangka Pemikiran Berdasarkan penelitian skrining toksisitas beberapa tanaman di kawasan Tawangmangu Surakarta dengan menggunakan metode Brine Shrimp Letality Test (BST) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dari daun Ambre memiliki aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan Rakhmawati, 2008). Suatu ekstrak berpotensi sebagai kandidat antikanker berdasarkan metode BST jika harga LC50 kurang dari 1000 µg/mL dan hasil uji toksisitas menggunakan metode BST ini dapat diasosiasikan dengan sifat sitotoksik yang digunakan sebagai prasyarat senyawa antikanker (Erma dkk., 2004). Berdasarkan penelitian, Ames telah membuktikan bahwa 90% senyawa yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982). Disisi lain banyak teori yang menyebutkan bahwa mekanisme kerja dari beberapa senyawa yang digunakan sebagai obat antikanker mirip dengan mekanisme kerja senyawa karsinogen terhadap protein, DNA atau sel normal (Foye, 1996). Ini membuktikan bahwa senyawa antikanker dapat pula menyebabkan mutasi. Berdasarkan hal tersebut, maka perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik dari daun Ambre dengan melakukan uji mutagenisitas terhadap hasil partisi dari ekstrak kloroform daun Ambre menggunakan metode Ames. Setiap tahap ekstraksi dan partisi pemisahannya dimonitor dengan kromatografi lapis tipis

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi dengan pelarut yang digunakan adalah kloroform. Ekstrak kloroform tersebut dipartisi dengan menggunakan pelarut wasbensin, sehingga dihasilkan bagian yang larut dan tidak larut wasbensin. Selanjutnya dilakukan uji mutagenisitas dengan uji Ames dan ditentukan profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.

Ekstrak kloroform daun Ambre berdasarkan uji BST berpotensi sebagai kandidat antikanker (Wahyuni dan Rakhmawati, 2008)

Sebesar 90% senyawa yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982)

Mekanisme kerja beberapa obat antikanker mirip dengan senyawa karsinogen terhadap protein, DNA dan sel normal (Foye, 1996)

Perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik

Senyawa antikanker dapat menyebabkan mutasi

daun Ambre

Ekstrak kloroform daun Ambre Pemisahannya dimonitoring dengan KLT Partisi ekstrak kloroform daun Ambre

Uji mutagenisitas

Profil kandungan kimia bagian teraktif yang menunjukkan sifat mutagenik

Gambar 3. Alur Kerangka Pemikiran

BAB III METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat MIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta selama bulan Juli-Desember 2009.

B. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Penelitian a. Alat untuk pemisahan komponen bioaktif Alat-alat gelas, Rotary Evaporator (Heidolph vv 2000, Germany), Sentrifuge, corong buchner. b. Alat untuk uji mutagenisitas Tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, mikropipet, gelas beker, jarum ose, drigalsky, bunsen, laminar air flow. c. Alat untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia Lampu UV254 dan UV366, pipa kapiler, syringe, chamber, pompa vakum, alat-alat gelas. 2. Bahan Penelitian a. Bahan untuk pemisahan komponen bioaktif Bahan utama untuk pemisahan adalah simplisia kering daun Ambre, kloroform (untuk maserasi), pelarut wasbensin untuk partisi, plat silika gel 60 GF254 sebagai fase diam dan fase gerak yang digunakan yaitu kloroform.

b. Bahan uji mutagenisitas Bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 beserta growth medium yang diperoleh dari Enviromental Bio-Detection Products inc. (EBPI) California. Media yang digunakan adalah media Luria Bertani (LB), media histidin-biotin, dan media minimal yang ditambah glukosa. Bahan kimia yang digunakan adalah d-biotin, l-histidin, amonium sulfat, dextrose, dipotasium fosfat, magnesium fosfat, monopotasium fosfat, sodium sitrat, sodium azide (EBPI), 2nitrofluorene (EBPI) dan Dimethyl sulfoxide (DMSO). c. Bahan untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia Plat silika gel 60 GF254, kloroform, pereaksi kimia Ce(IV)(SO4)2 , FeCl3, vanilin H2SO4, dan Lieberman-Burchard.

C. Cara Kerja 1. Pengambilan Sampel Sampel berupa simplisia kering daun Ambre sebanyak 290 gram dan telah dideterminasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) pada bulan Mei tahun 2009.

2. Pemisahan Komponen Bioaktif a. Ekstraksi Serbuk daun Ambre dimaserasi menggunakan kloroform selama 24 jam disertai pengadukan, maserasi dilakukan hingga 3 kali. Setelah 24 jam, rendaman disaring dengan corong buchner, ampasnya dipisahkan dan filtrat I yang diperoleh

diuapkan dengan bantuan rotary evaporator sehingga didapat ekstrak kloroform yang kemudian dikeringkan dengan bantuan kipas angin dan disimpan di eksikator. Ampas dimaserasi kembali dengan kloroform seperti cara diatas sehingga diperoleh filtrat II dan III lalu diuapkan menggunakan rotary evaporator, ekstrak yang didapat digabung dengan ekstrak kloroform yang pertama. Profil hasil senyawa pada ekstrak dimonitor dengan kromatografi lapis tipis. b. Partisi Ekstrak kloroform daun Ambre dipartisi dengan cara partisi padat-cair dengan pelarut wasbensin menggunakan sentrifuge sehingga dihasilkan dua bagian yaitu bagian larut dan tidak larut wasbensin untuk kemudian pelarut diuapkan. Kedua bagian yang telah diuapkan dimonitor hasil pemisahannya dengan kromatografi lapis tipis, apabila hasil pemisahan tidak tumpang tindih antara keduanya, maka dilakukan uji mutagenisitas dengan uji Ames.

3. Uji Mutagenisitas Uji mutagenisitas dilakukan dengan menggunakan uji Ames tanpa aktivator metabolik S-9 mix. a. Penanganan bakteri uji Masing-masing bakteri yang akan diuji disimpan pada frezer -4oC dan growth media disimpan pada lemari pendingin 40C.

b. Pembuatan biakan semalam Bakteri yang disimpan pada frezer -4oC kemudian dihidrasi dengan menambahkan growth media kedalam tempat yang berisi bakteri, divortex dan diinkubasi selama 16-18 jam. Sebanyak 50-100 µL bakteri tersebut diinokulasi pada media LB dan diinkubasi selama 16-18 jam. Dalam proses pengujian kondisi harus dalam keadaan fresh yaitu antara jam ke 16-18 setelah proses inokulasi, karena pada periode jam tersebut bakteri berada pada fase eksponensial sampai awal fase stasioner, lewat dari itu bakteri tidak boleh digunakan. c. Uji mutagenesitas larutan uji Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan 50 µL biakan semalam bakteri uji dan larutan uji sesuai konsentrasi, medium tersebut dituangkan pada cawan petri yang berisi media minimal yang ditambah glukosa. Setelah medium yang mengandung histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu 370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh. d. Uji kontrol positif Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan 50 µL biakan semalam bakteri uji dan masing-masing sebanyak 17,1 µL sodium azide untuk Salmonella typhimurium TA 100 dan 1535 dan 2-nitroflourene untuk Salmonella typhimurium TA 98 sebagai kontrol positif. Sodium azide dan 2nitroflourene sebagai kontrol positif karena keduanya telah digunakan sebagai mutagen standar untuk masing-masing bakteri. Medium histidin-biotin tersebut dituangkan ke dalam cawan petri berisi media minimal yang ditambah glukosa.

Setelah medium histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu 370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh. e. Uji kontrol negatif Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan 50 µL biakan semalam bakteri uji dan sebanyak 100 µL DMSO sebagai kontrol negatif. Medium tersebut dituang ke dalam cawan petri berisi media minimal yang ditambah glukosa. Setelah medium histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu 370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh. f. Larutan uji Konsentrasi larutan uji yang digunakan 1000, 500, 100, dan 10 µg/mL. Larutan uji dibuat dengan menimbang sebanyak 50 mg sampel hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre, dilarutkan dengan 100 µL DMSO dan air suling steril hingga volumenya 5 mL. Selanjutnya larutan uji disaring dengan penyaring bakteri. Data hasil uji mutagenisitas diperoleh dengan penghitungan jumlah koloni yang tumbuh dari setiap bakteri uji pada masing-masing cawan petri

4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Penentuan Profil Kandungan Senyawa Kimia a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Proses pemisahan pada tahap ekstraksi dan partisi dimonitor profil kandungan senyawa kimianya dengan kromatografi lapis tipis. Hasil setiap tahapan tersebut dilarutkan di pelarut kemudian ditotolkan pada lempeng KLT yaitu silika gel 60 GF254 menggunakan pipa kapiler. Pengembangan dilakukan

dalam bejana pengembang menggunakan fase gerak kloroform. Hasil KLT dideteksi dengan sinar UV254 nm, UV366 nm dan disemprot dengan serium (IV) sulfat untuk mendeteksi keberadaan senyawa organik secara umum dengan hasil positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi coklat. b. Penentuan profil kandungan senyawa kimia Penentuan golongan senyawa dilakukan setelah diketahui bagian teraktif dari hasil partisi yang telah dimonitor dengan kromatografi lapis tipis dan uji mutagenisitas dengan uji Ames. Profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat mutagenik kemudian ditentukan dengan menggunakan pereaksi semprot khusus yaitu FeCl3 untuk mendeteksi senyawa flavonoid dengan hasil positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning. Vanilin H2SO4 untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dengan hasil positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi biru sampai ungu setelah pemanasan pada suhu 110oC selama 10 menit. Lieberman-Burchard untuk mendeteksi keberadaan senyawa triterpenoid (steroid) dengan hasil positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi merah untuk triterpenoid dan biru untuk steroid setelah pemanasan pada suhu 110 oC selama 10 menit.

Skema cara kerja dalam penelitian ini tergambar dari bagan di bawah ini : Serbuk simplisia (290 g)

Maserasi dengan kloroform selama 24 jam (3x)

Residu/Ampas

Filtrat yang diuapkan

Ekstrak kloroform (11 g)

dipartisi dengan wasbensin

Bagian tidak larut wasbensin (3,6 g)

Bagian larut wasbensin (5,9 g)

Uji Ames

Bagian larut wasbensin sebagai bagian yang teraktif dengan efek mutagenik terbesar

Menyebabkan mutasi pasangan basa dan frameshift mutation

Kandungan Kimia : Terpenoid dan flavonoid

Gambar 4. Skema Cara Kerja

Pemisahannya dimonitoring dengan KLT

D. Analisis Data Data hasil uji mutagenisitas diperoleh secara kuantitatif dengan penghitungan jumlah koloni yang tumbuh dari setiap bakteri uji pada konsentrasi yang diberikan. Analisis data uji mutagenisitas dilakukan dengan menghitung pertumbuhan koloni bakteri dimana jumlah koloni yang tumbuh dibandingkan dengan jumlah koloni bakteri pada kontrol negatif. Apabila hasilnya : 1,8- 2 kali atau lebih dari kelompok kontrol negatif maka sampel yang di uji bersifat sangat mutagen, 1,6 – 1,7 kali dari kelompok kontrol negatif maka sampel yang di uji kemungkinan bersifat mutagen dan 1< - 1,5 kali dianggap tidak mutagen. Batas suatu bahan uji dikatakan bersifat mutagen jika konsentrasi sampel yang memberikan hasil positif kurang dari 10.000 µg/mL (Suprastiwi, 2009; Radji, 2004). Profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar dimonitor kromatografi lapis tipis dengan fase gerak dan fase diam yang sesuai serta pereaksi semprot yang spesifik. Profil kromatografi lapis tipis hasil deteksi semprot spesifik dianalisis secara kualitatif dengan analisis deskriptif berdasarkan bercak warna yang terbentuk dan nilai Rf yang ditentukan dengan rumus :

Jarak perambatan bercak dari titik awal Rf = Jarak perambatan fase gerak dari titik awal (Stahl, 1985)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek mutagenik dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 beserta profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar. Uji mutagenisitas dilakukan dengan menggunakan metode Ames.

A. Ekstraksi dan Partisi 1. Ekstraksi Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode maserasi. Maserasi adalah proses ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan merendam serbuk simplisia dalam pelarut yang sesuai selama periode waktu tertentu pada suhu ruang dan terlindung dari cahaya matahari, tujuannya adalah mencegah terjadinya reaksi yang dikatalis oleh cahaya atau mencegah terjadinya perubahan warna. Metode

maserasi

dipilih

dalam

penelitian

ini

karena

proses

pengerjaannya mudah dan peralatan yang digunakan sederhana, selain itu karena metode maserasi termasuk metode ekstraksi tanpa pemanasan sehingga senyawa yang diharapkan tidak menjadi rusak akibat pemanasan. Dalam penelitian ini pelarut yang digunakan adalah kloroform untuk menarik senyawa-senyawa yang bersifat nonpolar sampai semi polar (Ristiningsih, 2009). Selain alasan tersebut,

penggunaan kloroform sebagai pelarut dalam proses ekstraksi mengacu pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wahyuni dan Rakhmawati (2008) yang menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun Ambre memiliki aktivitas toksisitas pada uji Brine Shrimp Letality Test (BST). Berat ekstrak yang diperoleh adalah 11 gram dari 290 gram serbuk daun Ambre yang diekstraksi. Proses pemisahan pada tahap ekstraksi dimonitor profil kandungan senyawa kimianya dengan kromatografi lapis tipis, kemudian dilakukan deteksi terhadap keberadaan senyawa kimia organik secara umum yang ada di dalamnya menggunakan pereaksi semprot serium (IV) sulfat dengan bercak yang terbentuk berwarna coklat setelah pemanasan. Warna coklat terbentuk disebabkan karena dalam serium (IV) sulfat terdapat H2SO4 10% yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga serapan panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) dan noda menjadi tampak oleh mata. Deteksi UV digunakan untuk mengetahui senyawa yang tidak terlihat atau dengan sinar tampak (Tim Pengajar Teknik Laboratorium, 2009). Profil senyawa pada ekstrak kloroform daun Ambre hasil KLT dapat dilihat pada Gambar 5.

Rf 1

0,75

0,5

0,25 0 A

B

C

D

Gambar 5. Kromatogram hasil KLT ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak pengembangan : 8 cm Deteksi hasil KLT menggunakan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat menunjukkan adanya beberapa bercak yang terlihat pada masing-masing deteksi. Deteksi kromatogram dengan sinar tampak (Gambar 5.A) memperlihatkan bercak berwarna hijau tua dan kuning. Deteksi kromatogram dengan sinar UV254 (Gambar 5.B) memperlihatkan terjadinya peredaman yang ditandai dengan adanya beberapa bercak yang berwarna gelap pada latar belakang yang berflourosensi hijau yang menunjukkan adanya senyawa. Deteksi dengan sinar UV366 (Gambar 5.C) memperlihatkan bercak yang berpendar menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran UV

gelombang panjang. Deteksi dengan pereaksi serium (IV) sulfat (Gambar 5.D) memperlihatkan beberapa bercak berwarna coklat gelap. Hal ini menunjukkan bahwa pada ekstrak kloroform daun Ambre tersebut terdapat senyawa organik.

2. Partisi Tahapan partisi yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan pelarut wasbensin. Partisi bertujuan untuk memisahkan ekstrak kloroform daun Ambre menjadi dua bagian yaitu bagian non polar dan bagian polar. Wasbensin bersifat non polar, sehingga berdasarkan prinsip like disolve like (Harbone, 1987) bagian non polar akan larut wasbensin, sedangkan bagian yang polar tidak larut wasbensin. Berat hasil partisi ekstrak kloroform bagian larut wasbensin yang diperoleh adalah 5,9 gram dan hasil partisi ekstrak kloroform bagian tidak larut wasbensin adalah 3,6 gram. Analisis profil kandungan kimia pada hasil partisi dilakukan untuk mengetahui kesempurnaan pemisahan senyawa dengan partisi. Hasil dari KLT partisi ekstrak kloroform daun Ambre dilihat pada Gambar 6.

Rf 1

0,75

0,5

0,25

0 1

2 A

1

2 B

1

2 C

1

2 D

Gambar 6. Kromatogram hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak pengembangan : 8 cm Keterangan : 1. Larut wasbensin 2. Tidak larut wasbensin Deteksi hasil KLT menggunakan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat terlihat adanya bercak-bercak pada posisi yang berbeda antara bercak yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform bagian larut wasbensin dengan bercak yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform bagian tidak larut wasbensin. Hal ini menunjukkan bahwa partisi yang dilakukan dapat memisahkan senyawa-senyawa yang terdapat ekstrak kloroform daun Ambre.

B. Uji Mutagenisitas

Uji mutagenisitas dilakukan untuk mengetahui apakah suatu senyawa bersifat mutagenik atau tidak. Uji mutagenisitas dapat dilakukan dengan berbagai metode salah satunya dengan menggunakan bakteri yang dikenal dengan uji Ames seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Prinsipnya bakteri yang digunakan sudah dimutasi sehingga tidak mampu mensintesis salah satu jenis asam amino esensial misalnya histidin untuk pertumbuhannya, oleh karena itu bakteri butuh media yang mengandung histidin agar bisa tumbuh normal. Bila bahan uji yang diperiksa bersifat mutagen, maka bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke fungsinya yang semula. Dengan demikian gen his yang termutasi akan mengalami mutasi balik, gen his tersebut kembali normal sehingga bakteri uji dapat mensintesis sendiri histidin yang dibutuhkan dalam pertumbuhannya, ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri di dalam media yang kekurangan histidin (Radji dkk., 2004) Bahan uji berupa hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yaitu bagian larut dan bagian tidak larut wasbensin, masing-masing dilarutkan dengan DMSO dan aquades. Tujuan penambahan DMSO adalah untuk mempermudah proses pelarutan sampel uji. Pemberian DMSO tidak boleh melebihi 2% total pelarut, karena DMSO dapat merusak senyawa jika terlalu banyak diberikan. Selain itu DMSO bersifat tidak membunuh bakteri sehingga cocok digunakan sebagai pelarut sampel. Pengujian dilakukan menggunakan 3 bakteri uji dengan 4 seri konsentrasi bahan uji dengan 3 ulangan. Bakteri dan bahan uji dimasukkan pada

media yang mengandung histidin-biotin. Medium yang mengandung histidinbiotin sangat dibutuhkan oleh bakteri karena bakteri uji kehilangan kemampuan dalam mensintesis histidin dan biotin sehingga bakteri membutuhkan histidin dan biotin dari luar untuk pertumbuhannya (Radji dkk., 2004). Medium yang mengandung histidin-biotin tersebut dituang pada cawan petri berisi media minimum yang ditambahkan glukosa, diinkubasi selama 72 jam dan dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh. Bakteri dihitung dengan prinsip satu bakteri akan membentuk satu koloni tanpa memperdulikan besar kecilnya koloni yang terbentuk. Sebagai kontrol positif digunakan sodium azide untuk Salmonella typhimurium TA 100 dan 1535 serta 2-nitroflourene untuk Salmonella typhimurium TA 98. Sodium azide dan 2-nitroflourene adalah mutagen standar untuk masing-masing bakteri. Sodium azide dapat menyebabkan terjadinya mutasi pasangan basa, sedangkan 2-nitrofluorene dapat menyebabkan terjadinya frameshift mutation. Kontrol positif bertujuan untuk melihat kemampuan mutagenisitas bakteri uji (Suprastiwi, 2009). Sebagai kontrol negatif digunakan DMSO untuk melihat bahwa mutasi yang terjadi bukan disebabkan karena pengaruh DMSO, melainkan dari sampel yang diuji. Rata-rata hasil uji mutagenisitas partisi ekstrak kloroform daun Ambre dengan menggunakan tiga bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 dan TA 1535 dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.

Tabel 1. Rata-rata hasil uji mutagenisitas partisi ekstrak kloroform daun Ambre

Strain bakteri uji

Sampel uji A

S. typhimurium TA 98

S. typhimurium TA 100

S. typhimurium TA 1535

B A B A B

Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri pada konsentrasi sampel uji (µg/mL) 1000

500

100

10

102

99,3

84,3

115

96,7

93,3

76

79,3

Tidak Tidak Tidak Terhingga Terhingga Terhingga 81

56

Tidak Tidak Terhingga Terhingga 79,7

28,7

119

55

50

64

41

26,7

41

Keterangan : A. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre B. Bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre

Tabel 2. Rata-rata hasil uji mutagenisitas kontrol

Strain bakteri uji S. typhimurium TA 98 S. typhimurium TA 100 S. typhimurium TA 1535

Kontrol

Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri

DMSO (-) 2-nitroflourene (+) DMSO (-) Sodium azide (+) DMSO (-) Sodium azide (+)

40 99 99,7 173 41,3 93,7

Adapun perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok kontrol negatif dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok kontrol negatif

Strain bakteri uji

Sampel uji A

S. typhimurium TA 98

B A

S. typhimurium TA 100

B A

S. typhimurium TA 1535

B

Perbandingan jumlah koloni bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok kontrol negatif (µg/mL) 1000 500 100 10 2,5

2,5

2,1

2,9

2,4

2,3

1,9

2

Tidak Tidak Tidak Terhingga Terhingga Terhingga 0,8

0,6

Tidak Tidak Terhingga Terhingga 1,9

0,7

1,2

0,5

0,5

1,5

1

0,6

1

Keterangan : A. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre B. Bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre

Berdasarkan hasil uji mutagenisitas hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535, terlihat bahwa bagian larut wasbensin relatif lebih bersifat mutagenik dibandingkan bagian yang tidak larut wasbensin. Hal ini dapat dilihat dari rata-rata hasil uji yang menunjukkan bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada cawan petri yang berisi sampel bagian larut wasbensin lebih banyak bila dibandingkan dengan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada kontrol negatif dan jumlahnya rata-rata melebihi 1,8 kali jumlah bakteri yang tumbuh pada kontrol negatif. Ini menunjukkan pada bagian larut wasbensin terdapat senyawa mutagenik karena mampu membalikkan mutasi substitusi pasangan basa pada bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535.

Senyawa mutagenik tersebut bersifat non polar karena dapat larut dalam pelarut wasbensin. Pada bagian tidak larut wasbensin dengan menggunakan Salmonella typhimurium TA 1535 sebagai bakteri ujinya, terdapat jumlah koloni bakteri yang tumbuh lebih banyak bila dibandingkan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada kontrol negatif yaitu 1,9 kali jumlah koloni bakteri pada kontrol negatif. Hal ini terjadi karena pada bagian tidak larut wasbensin terdapat senyawa yang bersifat mutagenik, namun tidak begitu kuat sehingga senyawa tersebut bisa bersifat mutagenik pada konsentrasi tinggi. Ini dapat dilihat dari hasil uji yang menunjukkan bahwa hanya pada konsentrasi 1000 µg/mL bagian tidak larut wasbensin yang menunjukkan sifat mutagenik. Senyawa mutagenik tersebut bersifat polar karena tidak dapat larut dalam pelarut wasbensin. Pada pengujian sampel dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 menunjukkan bagian larut wasbensin maupun tidak larut wasbensin bersifat mutagenik. Keduanya menunjukkan jumlah pertumbuhan koloni bakteri yang lebih banyak bila dibandingkan dengan kontrol negatif yaitu rata-rata jumlahnya melebihi 1,8 kali jumlah bakteri pada kontrol negatif. Hasil uji ini menunjukkan bahwa terdapat senyawa non polar pada bagian larut wasbensin dan senyawa polar pada bagian tidak larut wasbensin hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang mampu membalikkan frameshift mutation pada bakteri Salmonella typhimurium TA 98. Dilihat jumlah koloni bakteri yang tumbuh, senyawa atau zat aktif yang terdapat pada bagian larut wasbensin dapat menyebabkan mutasi substitusi

pasangan basa dan frameshift mutation karena bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535 merupakan indikator jenis mutasi substitusi pasangan basa, sedangkan Salmonella typhimurium TA 98 yang merupakan indikator jenis mutasi frameshift mutation dapat tumbuh pada pengujian ini. Berbeda dengan hasil uji bagian larut wasbensin, untuk bagian tidak larut wasbensin hanya dapat menyebabkan terjadinya mutasi frameshift saja, hal ini terbukti dengan banyaknya bakteri Salmonella typhimurium TA 98 yang tumbuh. Sifat mutagenik yang terdapat pada bagian larut wasbensin yang dapat menyebabkan frameshift mutation lebih kuat bila dibandingkan sifat mutagenik yang menyebabkan substitusi pasangan basa, karena pada konsentrasi 10 µg/mL sudah mampu membalikkan frameshift mutation pada bakteri Salmonella typhimurium TA 98. Sementara itu, hasil partisi bagian larut wasbensin yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 sudah mampu membalikkan mutasi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan galur TA 1535 pada konsentrasi 500 µg/mL. Perbedaan hasil antara galur TA 100 dan TA 1535 disebabkan karena galur TA 1535 tidak memiliki plasmid pKM101. Gen his46 yang dimiliki oleh galur TA 100 bekerjasama dengan plasmid pKM101 dalam mengkodekan gen mucAB yang analog dengan gen umuDC pada E.coli K-12 yang berperan dalam SOS-repair, sehingga galur TA 100 secara umum lebih sensitif bila dibandingkan dengan TA 1535 ( Little dkk., 1989; Prival dan Zeiger, 1998). Ini dapat dilihat dari jumlah bakteri yang tumbuh pada galur TA 100 jumlah bakteri tidak

terhingga muncul pada sampel dengan konsentrasi 100 µg/mL dan pada galur TA 1535 muncul pada konsentrasi 500 µg/mL. Mutagen adalah segala sesuatu yang dapat menyebabkan mutasi, baik berasal dari alam maupun sintetik. Mutasi adalah perubahan dalam materi genetik, dapat diturunkan dan mencakup mikrolesi dan makrolesi. Mikrolesi adalah perubahan pada struktur DNA (point of mutation), sedangkan makrolesi adalah perubahan kromosom atau aberasi kromosom (Isnawati dan Alegantina, 2004). Mutasi bisa bersifat merugikan bisa juga bersifat menguntungkan. Menurut Ames menyatakan bahwa 90% senyawa yang menyebabkan mutasi dapat pula bersifat karsinogenik (Lehninger, 1984). Namun tidak semua senyawa yang menyebabkan mutasi dapat menyebabkan kanker, bahkan sebaliknya dapat menghentikan aktivitas sel kanker dengan mekanisme tertentu. Mutasi

yang dapat

menyebabkan kanker adalah mutasi

yang

menyebabkan kelainan fungsi genetik yang merupakan akibat dari peristiwaperistiwa mutasional berganda. Mutasi-mutasi tersebut mengubah fungsi normal suatu sel sehingga sel itu memiliki ciri-ciri berikut : (1) gangguan diferensiasi dari sel dan jaringan akibat sel yang menjadi immortal (2) sel menjadi independen dari kontrol-kontrol selular normal yang membatasi pertumbuhan dan pembelahan sel (3) sel menjadi invasif dengan menyebar ke jaringan-jaringan lain dalam sebuah proses yang disebut metastasis, (4) dan adanya pergeseran metabolisme ke arah pembentukkan makromolekul dari nukleosida dan asam amino serta peningkatan katabolisme karbohidrat untuk energi sel (Nafrialdi dan Gan, 1995: Elrod dan Stansfield, 2002).

Selain itu, senyawa mutagen yang dapat menyebabkan kanker harus memiliki kemampuan menyebabkan mutasi pada sel yang mengarahkan pada pertumbuhan kanker. Diperlukan 5-10 mutasi genetik, untuk menjadi sel kanker (Zakaria, 2001). Ada dua tipe mutasi yang berbeda yang bisa mengarah pada pertumbuhan kanker. Tipe pertama adalah mutasi “pemerolehan fungsi” atau “gain of function”. Pada sebuah gen yang dalam keadaan normal berfungsi dalam pertumbuhan dan pembelahan sel. Pembelahan sel adalah suatu proses yang amat rumit dan kemungkinan besar dikontrol oleh banyak gen berbeda (sebagian merangsang, sebagian menghambat). Interferensi pada waktu gen-gen tersebut bekerja, pada jumlah produk gen yang dihasilkan, atau pada aktivitas produk gen, bisa mengarah pada kanker (Elrod dan Stansfield, 2002). Kebanyakan sel dalam tubuh telah terdiferensiasi dan tidak membelah secara aktif, dengan demikian gen-gen pembelahan sel biasanya dimatikan. Jika gen-gen itu teraktivasi secara tidak benar, bisa mengakibatkan pembelahan sel yang tidak terkendali, Gen tersebut diantaranya adalah onkogen, yang aktif akibat mutasi akan memicu pertumbuhan sel yang mengarah pada terjadinya kanker (Elrod dan Stansfield, 2002; Sofyan, 2005). Tipe mutasi kedua adalah mutasi “hilangnya fungsi” atau “loss-offunction” dalam gen supresor tumor. Peran normal gen supresor tumor adalah sebagai supresor pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen supresor tumor diaktifkan dalam sel-sel normal. Jika gen tersebut dinonaktifkan secara tidak benar, sel bisa memasuki siklus sel dan membelah (Elrod dan Stansfield, 2002; Sofyan, 2005 ).

Sebaliknya senyawa mutagen juga bisa bersifat sebagai antikanker bisa dilihat dari mekanisme kerja beberapa obat antikanker yang berpengaruh langsung terhadap asam nukleat sebagai target sasarannya. Adanya ganguan replikasi DNA, transkripsi, translasi, dan sebagai zat pengalkil merupakan beberapa mekanisme yang dapat menyebabkan gangguan fungsi dalam sel kanker yang sedang berlipat ganda dengan cepat (Katzung, 1994; Myek dkk., 1997; Nogrady, 1992). Berdasarkan hasil yang diperoleh, terlihat bahwa bagian larut wasbensin memiliki sifat mutagenik terbesar dibandingkan bagian tidak larut wasbensin dengan kemampuan dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa dan frameshift mutation. Mutasi substitusi pasangan basa terdiri dari transisi dan transversi. Mutasi ini mengakibatkan terjadinya pergantian asam amino oleh asam amino lain pada urutan polipeptida yang disandi oleh suatu gen. Pada kasus tertentu residu asam amino yang digantikan dapat bersifat kritis dan menyebabkan protein sama sekali tidak dapat melakukan fungsi biologis normalnya. Mutasi tersebut seringkali mematikan sel (Lehninger, 1982; Roberts, 2000). Frameshift mutation merupakan peristiwa pergeseran bingkai pembacaan yang disebabkan oleh adanya delesi atau insersi dari satu atau beberapa nukleotida (Elrod dan Stansfield, 2002). Frameshift mutation dapat menyebabkan perubahan yang ekstensif pada produk gen sehingga produk gen menjadi tidak aktif, terjadi kerusakan kolinearitas diantara kodon-kodon pada urutan DNA dan urutan asam amino polipeptida (Lehninger, 1982 ; Roberts, 2000).

Senyawa yang dapat menyebabkan frameshift mutation memiliki kemampuan melakukan interkalasi atau penyisipan (Lehninger, 1982; Roberts, 2000). Sifat inilah yang dapat dimanfaatkan sebagai agen antikanker dengan mekanisme yang sama yang dilakukan oleh beberapa obat antikanker. Beberapa obat antikanker yang melakukan mekanisme tersebut adalah daktinomisin yang dikenal dengan aktinomisin D, doksorubisin, adriamisin, dan daunorubisin (Myek dkk., 1997; Foye, 1996; Nogrady, 1992). Mekanisme yang dilakukan oleh daktinomisin adalah dengan cara melakukan interkalasi pada celah kecil heliks rangkap antara pasangan basa DNA guanin dan sitosin, membentuk suatu kompleks daktinomisin-DNA. Kompleks ini mengganggu polimerase RNA dan pada dosis tinggi mampu menghambat sintesis DNA dan menstabilkan kompleks DNA-topoisomerase II (Myek dkk., 1997). Doksorubisin dan daunorubisin yang maksimal bekerja pada fase S dan G2 melakukan interkalasi pada pasangan basa yang berdekatan dan mengikat ruas fosfat-gula DNA sampai melingkar, sehingga menghambat sintesis DNA dan RNA. Interkalasi ini dapat mengganggu reaksi lepas sambung pilah DNA yang dikatalisasi oleh topoisomerase II sehingga pecah dan tidak dapat diperbaiki (Myek dkk., 1997). Enzim DNA topoisomerase II mempunyai fungsi yang penting dalam proses intraseluler, yaitu berperan dalam proses replikasi, transkripsi, rekombinasi DNA, dan proses proliferasi dari sel kanker. Adanya interkalasi yang dilakukan suatu senyawa dapat mengganggu reaksi lepas sambung DNA yang dikatalisasi oleh enzim topoisomerase II. Hal ini disebabkan karena ikatan antara enzim

dengan DNA sel kanker menjadi semakin lama. Akibatnya akan terbentuk Protein Linked DNA Breaks (PLDB), dan terjadi fragmentasi atau kerusakan DNA sel kanker dan selanjutnya berpengaruh terhadap proses di dalam sel khususnya proses replikasi sel yang diakhiri dengan kematian sel kanker secara apoptosis (Cumming dan Smyth, 1993; Sukardiman dkk., 2005; Yuwono, 2005; Myek dkk., 1997). Contoh obat antikanker lain yang melakukan mutasi dalam membunuh sel kanker adalah cisplatin (cis-diamindikloroplatinum [II]). Cisplatin merupakan obat kemoterapi yang cukup efektif karena dapat membunuh sel kanker pada setiap siklus sel dengan menghambat biosintesis DNA, mengikat DNA melalui pembentukan “interstrand cross-links”. Tempat ikatan utama adalah pada N7 guanin, tetapi interaksi kovalen dengan adenin dan sitosin juga terjadi (Katzung, 1994; Savitri dkk., 2008). Selain itu terdapat beberapa obat antikanker yang berasal dari tanaman yang saat ini banyak digunakan, salah satunya adalah paclitaxel. Paclitaxel atau yang dikenal dengan nama dagang taxol, merupakan senyawa diterpenoid. Senyawa ini umumnya diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang diisolasi dari tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia dan T. wallichiana yang efektif untuk mengatasi kanker rahim, kanker payudara stadium lanjut, kanker paru-paru, dan sarcoma karposi. Molekul taxol di dalam tubuh akan berinteraksi dengan tubulin. Tubulin merupakan komponen dominan dalam mikrotubulus, berbentuk seperti silinder dan merupakan bagian dari sistem kerangka sel. Interaksi taxol dengan tubulin akan membentuk ikatan taksol-tubulin sehingga

menciptakan sel yang stabil yang berakibat terhalangnya perubahan formasi protein. Taxol juga disebut sebagai penstabil mitosis, karena jika taxol membentuk ikatan dengan tubulin maka protein akan kehilangan fleksibilitasnya dan mikrotubulus tidak akan bisa dirombak lebih lanjut. Studi lain memperlihatkan bahwa taxol hanya berikatan dengan tubulin yang telah terpolimerisasi dalam suatu rantai protofilamen yang biasa terdapat pada sel kanker, bukan dengan protein bebas (Katzung, 1994; BPOM RI, 2003; Strobel dan Daisy, 2003; Radji, 2005). Berdasarkan beberapa contoh obat antikanker tersebut, sifat mutagenik yang dimiliki suatu senyawa dapat dimanfaatkan sebagai antikanker. Selain itu, senyawa mutagenik dapat juga mencegah terjadinya mutasi. Kaleeswaran dkk. (2009) melaporkan hasil penelitiannya tentang senyawa sylimarin yang diisolasi dari tanaman Silybum marianum. Senyawa ini memiliki sifat mutagenik, dan dapat berfungsi sebagai antimutagenik. Sifat mutagenik yang dimiliki oleh senyawa ini efektif meningkatkan sintesis MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase levels). MGMT merupakan suatu enzim yang berfungsi dalam proses perbaikan protein DNA, melindungi sel dan oncogen yang dapat aktif jika terkena induksi oleh senyawa mutagenik pengalkil baik yang berasal dari dalam sel (endogenous alkilating agent) atau yang berasal dari luar sel (exogenous alkylating agent) (Niture dkk., 2007).

C. Deteksi Golongan Senyawa Partisi Teraktif Setelah melakukan uji mutagenisitas dengan menggunakan 3 bakteri uji, diperoleh hasil bahwa hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut wasbensin menunjukkan sifat mutagenik yang lebih besar bila dibandingkan bagian yang tidak larut wasbensin, sehingga bagian larut wasbensin dideteksi golongan senyawanya dengan metode KLT dan beberapa pereaksi semprot. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan berbagai deteksi penampak bercak dapat dilihat pada Gambar 7. Rf 1

0,75

0,5

0,25

0 A

B

C

D

Gambar 7. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak Pengembangan : 7 cm

Deteksi hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan sinar tampak (visibel) (Gambar 7.A) memperlihatkan beberapa bercak berwarna kuning, hijau dan coklat. Deteksi dengan sinar UV254 (Gambar 7.B) memperlihatkan terjadinya peredaman yang ditandai dengan adanya beberapa bercak yang berwarna gelap berlatar belakang flouresensi hijau. Peredaman yang terjadi pada UV254 ini menunjukkan adanya suatu senyawa. Deteksi dengan sinar UV366 (Gambar 7. C) memperlihatkan beberapa bercak yang berflouresensi. Ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran dengan UV gelombang panjang. Deteksi untuk senyawa organik secara umum dilakukan penyemprotan dengan pereaksi semprot serium (IV) sulfat yang memperlihatkan bercak berwarna coklat (Gambar 7. D) dengan nilai Rf 0,24, 0,39, 0,63, 0,69, 0,77, 0,84 dan 0,79. Deteksi dilanjutkan dengan menggunakan berbagai pereaksi semprot yang spesifik untuk mengetahui jenis golongan senyawa yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut wasbensin. Pereaksi semprot yang digunakan diantaranya FeCl3 untuk mendeteksi senyawa flavonoid dengan respon positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning (Ristiningsih, 2009). Vanilin H2SO4 untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dengan respon positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi biru sampai ungu (Sulistijowati dan Gunawan, 2001). Lieberman-Burchard untuk mendeteksi keberadaan senyawa triterpenoid (steroid) dengan respon positif menunjukkan

adanya perubahan warna menjadi merah untuk triterpenoid atau biru untuk steroid (Ristiningsih, 2009). Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan berbagai deteksi pereaksi semprot spesifik dapat dilihat pada Gambar 8. Rf R 1

0,75

0,5

0,25

0 A

B

C

Gambar 8. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan (A) Vanilin- H2SO4 (B) Liebermenn-burchard (C) FeCl3 Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak Pengembangan : 7 cm Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik disajikan pada Tabel 4.

Tabel 4. Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik Rf UV254

visibel 0,24 kuning peredaman 0,39 hijau gelap peredaman 0,63 kuning peredaman 0,69 hijau gelap peredaman 0,77 coklat peredaman 0,84 peredaman 0,97 kuning peredaman Keterangan : 1. SS = Serium (IV) sulfat 2. VA = Vanilin –asam sulfat 3. LB = Lieberman-Burchard

Penampakan Bercak SS VA Coklat coklat Coklat hijau tua Coklat ungu putih Coklat ungu Coklat Coklat coklat Putih Coklat ungu UV366

LB hijau ungu coklat hijau hijau ungu

FeCl3 coklat ungu ungu ungu kuning -

Berdasarkan data yang diperoleh hasil positif ditunjukkan oleh deteksi dengan vanilin-H2SO4 dan FeCl3. Hasil positif untuk vanilin-H2SO4 ditunjukkan dengan bercak berwarna ungu yang menunjukkan adanya senyawa terpenoid dengan nilai Rf 0,63, 0,69 dan 0,97. Hasil positif untuk FeCl3 ditunjukkan dengan adanya bercak berwarna kuning yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid dengan nilai Rf 0,77. Senyawa terpenoid dan flavonoid ini diduga merupakan senyawa yang menyebabkan mutasi. Senyawa terpenoid golongan diterpenoid dan senyawa flavonoid dari beberapa tanaman telah diketahui memiliki aktivitas antimutagenik dan antikanker dengan berbagai metode penelitian. Sotto dkk. (2009) melaporkan, senyawa diterpenoid secoisopimarane dari tanaman Salvia cinnabarina yang diteliti dengan uji mutagenisitas, memiliki akitivitas sebagai antimutagenik dengan menghambat senyawa mutagen. Senyawa diterpenoid andrografolida dari tanaman Sambiloto (Andrographis paniculata Nees), senyawa clerocidin dari jamur dan

senyawa kuinon salvicina mampu membunuh sel kanker dengan mekanisme apoptosis (Sukardiman dkk., 2005; Jamora dkk., 2001; Miao dkk., 2003). Senyawa sylimarin yang merupakan salah satu jenis flavonoida dari tanamanan Silybum marianum dilaporkan memiliki aktivitas antimutagenik terhadap beberapa mutagen dengan uji mutagenisitas (Kaleeswaran, 2009). Isolat flavonoid

dari

herba

benalu

mangga

(Dendropthoe

petandra)

mampu

menghambat pertumbuhan kanker pada mencit yang diinduksi dengan benzopirena (Sukardiman dkk., 1999). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa daun Ambre mengandung senyawa terpenoid dan flavonoid yang berpotensi sebagai antikanker dengan sifat mutasi yang dimilikinya. Diperlukan penelitian yang lebih lanjut untuk mengetahui apakah sifat mutasi yang dimiliki daun Ambre benar-benar bersifat selektif atau tidak, sehingga dapat dimanfaatkan untuk kepentingan manusia khususnya dalam mengobati penyakit kanker.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka dapat disimpulkan bahwa : 1.

Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan 500 µg/, sedangkan bagian tidak larut wasbensin hanya dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL.

2.

Pada bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre ditemukan senyawa golongan flavonoid dan terpenoid.

B. Saran 1.

Perlu adanya uji mutagenisitas lanjutan misalnya dengan menggunakan aktivator metabolik untuk mengetahui apakah senyawa yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre masih bersifat mutagenik atau tidak setelah mengalami proses metabolisme.

2.

Perlu adanya penelitian untuk mengetahui daya hambat hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap senyawa mutagenik dengan uji antimutagenik.

3.

Perlu adanya uji lanjutan dengan meneliti hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre pada sel kanker atau pada enzim topoisomerase II.

4.

Perlu adanya identifikasi lebih lanjut terhadap senyawa yang memiliki sifat mutagenik tersebut dengan melakukan isolasi.

DAFTAR PUSTAKA Akrele, J. O. and E. E. O. Ebor. 2002. Studies on the Genotoxic and Mutagenic Potentials of Mefloquine. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 1 (2): 91-98. Ames, B.N., F. D. Lee and W. E. Durston. 1973. An Improved Bacterial Test System for the Detection and Classification of Mutagens and Carcinogens. Proc. Nat. Acad. Sci. 70 (3) : 782-786.1 Ames, B. N., W. E Durston, E. Yamasaki, and F. D. Lee. 1973. Carcinogens are Mutagens: A Simple Test System Combining Liver Homogenates for Activation and Bacteria for Detection. Proc. Nat. Acad. Sci. 70 (8) : 22812285.2 Aulia, Y., J. Sugiyanto dan Y. Aida. 2002. Efek Klorambusil Terhadap Perkembangan Fetus Tikus Putih (Rattus norvegicus) Galur SpragueDowley. Biota. 7 (3) : 101-108. Backer, C. A. and Bakhuizen V.d. B. Jr. 1968. Flora of Java Volume 3. Netherlands: Netherlands Organisation for the Advancement of Research. BPOM RI. 2003. Beberapa Tanaman yang Berkhasiat Sebagai Antikanker. InfoPOM. Vol. 6. Burgess, J. A., C. W. Stevens and W. E. Fahl. 1985. Mutation at Separate Gene Loci in Salmonella typhimurium TA 100 Related to DMA Nucleotide Modification by Stereoisomeric Benzo(a)pyrene 7, 8–Dio l-9, 10Epoxides. Cancer Research. 45 : 4257-4262. Cumming, J. and J. F. Smyth. 1993. DNA Topoisomerase I and II as Target of Rational Design of New Anticancer Drugs. Ann. Oncology. 3(7): 533534. Dalimartha, S. 2004. Deteksi Dini Kanker dan Simplisia Antikanker. Swadaya, Jakarta. DeMarini, D.M., M. L. Shelton, A. Abu-Shakra, A. Szakmary, and J. G. Levine. 1998. Spectra of Spontaneous Frameshift Mutations at the hisD3052 Allele of Salmonella typhimurium in Four DNA Repair Backgrounds. Genetics. 149 : 17-36. Departemen Kesehatan RI. 2009. Ambre. http://tanamanobat.org//artikel//tentang tanaman obat/depkes/ buu/ 1-134.pdf [10 April 2009].

Dewi dan M. Leni. 2006. Efektivitas Daya Tolak Ekstrak Geranium radula Cavan. Terhadap Nyamuk Aedes aegypti (Linn.). Koleksi Skripsi, Tesis dan Disertasi Perpustakaan UPI. http://digilib.upi.edu/pasca/available/etd-0626106-084844/ [ 2 Mei 2009]. Dillon, D., R. Combes, and E. Zeiger.1998. The Effectiveness of Salmonella Strains TA100, TA102 and TA104 for Detecting Mutagenicity of Some Aldehydes and Peroxides. Mutagenesis. 13 (1): 19-26. Erma, N. N. S., T. Sundari, A. I. Susanty, D. R. O. Palupi, Isnaeni, dan Sukardiman. 2004. Kajian Pendahuluan Uji Toksisitas Ekstrak Air Miselia dan Tubuh Buah Jamur Shiitake (Lentinus edodes) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Berk. Penel Hayati. 10 : 1318. Erold, S. L. dan W. D. Stansfield. 2002. Genetika edisi keempat. Erlangga, Jakarta. Foye, W. 1996. Prinsip-prinsip Kimia Medisinal Edisi II. UGM press, Yogyakarta. Fulton, A. M., S. E. Loveless and G. H. Heppner. 1984. Mutagenic Activity of Tumor-associated Macrophages in Salmonella typhimurium Strains TA98 and TA100. Cancer Research. 44 : 4308-4311. Gernpharmtox. 2009. AMES TEST: Bacterial Reverse Mutation Assay. http://www.genpharmtox.com/[ 1 Januari 2010]. Guadano, A., E.D.L. Pena, A. Gonzalez-Coloma, and J.E. Alvarez. 1999. Development of New Bioluminescent Mutagenicity Assay Based on the Ames Test. Mutagenesis. 14 (4): 411-415. Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia. ITB, Bandung. Haworth, S., T. Lawlor, K. Mortelmans, W. Specks, and E. Zeiger. 1983. Salmonella Mutagenicity Test Result for Chemicals. Enviromental Mutagenesis Suplement. Vol. 1. Isnawati, A. dan S. Alegantina. 2004. Efek Mutagenik Ekstrak Etanol Daun Kajibeling (Strobilantus crispus). Bul. Penel. Kesehatan. 32 (3): 112118. Jamora, C., M. A. Theodoraki, V. Malhotra, and E. A. Theodorakis. 2001. Investigation of the Biological Mode of Action of Clerocidin Using Whole Cells Assay. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 9 : 13651370.

Kaleeswaran, S., P. Sriram, D. Prabhu, C. Vijayakumar, and L. N. Mathuram. 2009. Anti- and Pro-Mutagenic Effects of Silymarin in the Ames Bacterial Reverse Mutation Assay. Phytother. Res. 23 : 1378–1384. th

Katzung, B. G. 1994. Basic and Clinical Pharmacology, 6 Edition. Prentice Hall International Inc., London. Lehninger, A.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 3. Erlangga, Jakarta Leny, S. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Pudding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp. USU Repository, Medan. Levin, D. E., L. J. Marnett, and B. N. Ames. 1984. Spontaneous and MutagenInduced Deletions: Mechanistic Studies in Salmonella Tester Strain TA102. Proc. Nal. Acad. Sci. 81: 4457-4461. Levine, J. G., R. M. Schaaper and D. M. DeMarini. 1994. Complex Frameshift Mutations Mediated by Plasmid pKM101: Mutational Mechanisms Deduced From 4-Aminobiphenyl-Induced Mutation Spectra in Salmonella. Genetics. 136 : 731-746. Little, C. A., D. J. Tweats and R. J. Pinney. 1989. Relevance of plasmid pKM101mediated mutagenicity in bacteria to genotoxicity in mammalian cells. Mutagenesis. 4 (5): 371-376. Maliya, A. 2004. Perubahan Sel Menjadi Kanker dari Sudut Pandang Biologi Molekuler. Infokes. 8 (1). Miao Z. H., T. Tao, Z. Y. Xiang, Z. J. Sheng, and D. Jian. 2003. Cytotoxicity, Apoptosis Induction and Downregulation of MDR-1 Expression by the Anti-Topoisomerase II Agent, Salvicine, in Multidrug-Resistant Tumor Cells. International Journal of Cancer. 106 (1) : 108-115. McCann, J., N. E. Spingarn, J. Kobori, and B. N. Ames. 1975. Detection of Carcinogens as Mutagens: Bacterial Tester Strains With R Factor Plasmids. Proc. Nat. Acad. Sci. 72 (3) : 979-983. Myek, M. J., R. A. Harvey, P. C. Champe, and B. D. Fisher. 1997. Farmakologi Ulasan Bergambar Edisi 2. Widya Medika, Jakarta. Nafrialdi dan S. Gan. 1995. Farmakologi dan Terapi. Fakultas Kedokteran UI, Depok. Niture, S. K., C. S. Velu, Q. R. Smith, G. J. Bhat, and K. S. Srivenugopa. 2007. Increased Expression of the MGMT Repair Protein Mediated by Cysteine Prodrugs and Chemopreventative Natural Products in Human Lymphocytes and Tumor Cell Lines. Carcinogenesis. 28 (2) : 378-389.

Nogrady, T. 1992. Kimia Medisinal Pendekatan secara Biokimia. ITB, Bandung. OECD. (Organisasion for Economic Coorperation and Development). 1997. Guideline for the testing of Chemical : Bacteria Reverse Mutation Test. Guideline.471. Pato, U. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dadih Untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia. 5 (2): 162-166. Prival M. J. and E. Zeiger.1998. Chemicals Mutagenic in Salmonella typhimurium Strain TA1535 But Not in TA100. Mutation research. Genetic toxicology and environmental mutagenesis. Vol. 412 : 251-260. Radji, M., A. Sumiaty, dan N. Indani. 2004. Uji Mutagenisitas dan Anti Kanker Ekstrak Aseton dan N-Heksana dari Kulit Batang Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.). Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(2): 69-78. Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2 (3) : 113-126. Ristiningsih, T. 2009. Uji Antibakteri Komponen Bioaktif Daun Lobak (Raphanus sativus L var. hortensis Back.) Terhadap Staphylococcus aureus Rosenbach. dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya. Skripsi. Universitas Sebelas Maret. Surakarta. Roberts, G. 2000. Bacterial Genetics. University of Wisconins, Madison. http://lecturer.ukdw.ac.id/dhira/BactGenetics/TOC.html [ 1 Januari 2010]. Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Jakarta. Rothman, S. 2009. Flower Morphology Of Pelargonium Odoratissimum And Pelargonium Ionidiflorum Using Scanning Electron Microscopy. Smith College, Northampton MA. Sanderson, K. E. and Y. A. Saeed. 1972. P22-Mediated Transduction Analysis of The Rough A (rfa) Region of the Chromosome of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 112 (1): 58-63. Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Liberti, Jakarta. Savitri, E., Eryadi D. dan Nur Q. 2008. Audiology Figures for Nasopharynx Carcinoma Patients from Wahidin Sudirohusodo Hospital, Makassar Before and After Treatment with Cisplatin. The Indonesian Journal of Medical Science. 1 (1) : 17-21.

Setiadarma, K. 2001. Penentuan Mutagenesis berbagai Zat Kimia dengan Bakteria untuk Kepentingan Manusia (Pendahuluan). Badan Litbang Kesehatan, Jakarta. Shoeibi S., Rahimifard N., Pirouz N., Yalfani R., Pakzad S. R., Mirab S., and Pirali H.M. 2009. Mutagenicity of Four Natural Flavors: Clove, Cinnamon, Thyme and Zataria multiflora Boiss. Journal of Medicinal Plants. 8 (5) : 89-96. Skopek, T.R., H. L. Liber, J.J Krolewski, and W. G. Thilly. 1978. Quantitative Forward Mutation Assay in Salmonella typhimurium Using 8Azaguanine Resistance as a Genetic Marker. Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1) : 410-414. Sofyan, R. 2005. Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler. Cermin Dunia Kedokteran No. 127. Sotto, A. D., S. Mastrangelo, G. Romussi, A. Bisio, and G. Mazzanti. 2009. Antimutagenic Activity Of a Secoisopimarane Diterpenoid From Salvia cinnabarina M. Martens et Galeotti in The Bacterial Reverse Mutation Assay. Food and Chemical Toxicology 47 : 2092–2096. Sukardiman, IGP Santa dan Rahmadhany. 1999. Efek Antikanker Isolat Flavonoid dari Herba Benalu Mangga (Dendrophtoe petandra). Cermin Dunia Kedokteran 122 : 5-8. Sukardiman, A. Rahman, W. Ekasari, dan Sisimandari. 2005. Induksi Apoptosis Senyawa Andrografolida dari Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) terhadap Kultur Sel Kanker. Media Kedokteran Hewan. 21 (3): 105-110. Sukardiman, W. Ekasari, dan P. P. Hapsari. 2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma. Media Kedokteran. 22 (2): 104111. Sulistijowati, A., dan Gunawan, D. 2001. Efek Ekstrak Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) Terhadap Candida albicans Serta Profil Kromatografinya. Cermin Dunia Kedokteran 130: 32-36. Sumpena, Y., R. Sofyan dan R. Rusilawati. 2009. Uji Mutagenisitas Benzo(a)piren dengan Metode Mikronukleus pada Sumsum Tulang Mencit Albino (Mus musculus). Cermin Dunia Kedokteran. Vol. 36 (1). Suprastiwi, E. 2009. Analisis Mutagenisitas Tiga Jenis Semen Ionomer Kaca (SIK). Departement of Conservative Dentistry, Faculty of Dentistry University of Indonesia.

Suzuki M., Matsui K., Yamada M., Kasai H., Sofuni T., and Nohmi T. 1997. Construction of Mutants of Salmonella typhimurium Deficient in 8Hydroxyguanine DNA Glycosylase and Their Sensitivities to Oxidative Mutagens and Nitro Compounds. Mutation Research. 393 (3) : 233-246. Stahl, E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, diterjemahkan oleh Kokasih Padmawinata dan Iwang Soedira. ITB, Bandung. Strobel, G. and B. Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (4): 491-502. Svehla, G. 1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Mikro dan Semimikro. PT. Kalman Media Pustaka, Jakarta. Tejs, S. 2008. The Ames Test: A Methodological Short Review. Environmental Biotechnology. 4 (1) : 7-14. Tim Pengajar Teknik Laboratorium. 2009. Mata Kuliah Teknik Laboratorium. Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Totušek, J., D. Lefnerová, M. Kyseláková, J. Balík, J. Veverka, J. Tříska, and N. Vrchotová. 2009. Antimutagenic Activity of Raw Materials and ByProducts from Production of Grape Wines .Czech J. Food Sci. 26: 55-59. Wahnschaffe, U. A. Bitsch, J. Kielhorn and I. Mangelsdorf. 2005. Mutagenicity Testing with Transgenic Mice. Part I: Comparison with the Mouse Spot Test. Journal of Carcinogenesis. 4 :3.1 Wahnschaffe, U. A. Bitsch, J. Kielhorn and I. Mangelsdorf. 2005. Mutagenicity Testing with Transgenic Mice. Part II: Comparison with the Mouse Borne Marrow Micronucleus Test. Journal of Carcinogenesis. 4 :4.2 Wahyuni, D. S. C. dan R. Rakhmawati. 2008. Skrining Toksisitas Beberapa Tanaman di Kawasan Tawangmangu Surakarta dan Profil Kandungan Kimianya. Laporan Penelitian LPPM, Universitas Sebelas Maret. Wegrzyn G. and A. Czyz. 2003. A REVIEW : Detection of Mutagenic Pollution of Natural Environment Using Microbiological Assays. Journal of Applied Microbiology 95 : 1175–1181. Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga, Jakarta. Zakaria, F.R. 2001. Pangan dan Pencegahan Kanker. Teknol dan Industri Pangan. 12 (2). Zakaria, Z. A. 2007. Free Radical Scavenging Activity of Some Plants Available in Malaysia. Pharmacology and Therapeutics. 5 (1): 87-91.