UJI IN VITRO EFEK PROPOLIS TERHADAP POPULASI BAKTERI RUMEN SAPI
I GUSTI BAGUS DATASENA
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Uji In Vitro Efek Propolis Terhadap Populasi Bakteri Rumen Sapi adalah karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembeimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebut dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2009
I Gusti Bagus Datasena NIM G851060101/BIK
ABSTRACT
I GUSTI BAGUS DATASENA. In Vitro Assay of Propolis Effect on Population of Cattle Rumen Bacterium. Under Direction of I MADE ARTIKA, BUDI HARYANTO, AND A. E. ZAINAL HASAN. Rumen is the important part of digestive in animal ruminansia. There are various microorganism types in rumen which consisting of bacterium, protozoa, and fungi. These microorganism in each symbiosis have function for doing fermentation process assisting feed ingestion. Rumen microorganism control naturally the amount of their populations with the existence of protozoas. Protozoa exploiting bacterium and vitamin B complex as source of protein, since protozoa have ability for synthesizing protein and low vitamin B complex. Beyond natural controlling of microorganisms populations, there are some controlling methods in rumens which antibiotic usage, but this matter will reduce the quality of flesh obtained from animal ruminansia because the existency of antibiotic material residue at flesh, therefore it will be necessary the natural compound as the inhibitor either the controller of the bacterium growth in rumen. Propolis indicates the ability as the bioactive which capable to inhibit the bacteri growth in rumen. In order to show that ability, the in vitro test has been done using specific media which will be used to determine the concentration of minimum inhibitory concentrations (MICs) which applied by colony counter method . The result is indicating there are 4% extract of propolis to goup of rumen dilution test bacterium consisting of bacteri proteolytic, bacteri lipolytic, and bacteri cellulolytic with the numeric are 16,00 cfu/ml, 5,78 cfu/ml, and 7,56 cfu/ml. The biggest value of inhibitor propolis extract is in proteolytic bacteria which indicating the capability of propolis as the additional compound in feed ingestion as the processor for rumen manipulating. . Keywords : Rumen, Lipolytic bacteria, Proteolytic bacteria, Cellulolytic bacteria, Propolis, Trigona spp.
RINGKASAN I GUSTI BAGUS DATASENA, Uji In Vitro Efek Propolis Terhadap Populasi Bakteri Rumen Sapi. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA, BUDI HARYANTO, dan A. E. ZAINAL HASAN
Rumen merupakan bagian terpenting dalam pencernaan hewan ruminansia. Rumen terdiri dari beberapa bagian yang memiliki fungsi-fungsi yang spesifik, didalam rumen terdapat mikroorganisme yang berfungsi dalam membantu proses metabolisme untuk melakukan pencernaan terhadap rumput yang merupakan sumber selulosa bagi sapi. Secara umum selulosa adalah sumber utama karbon bagi pembentukan asam amino sedangkan sumber nitrogen adalah NH3. Asam amino yang dihasilkan memiliki dua implikasi yaitu sebagai sumber pembentuk protein bagi sapi atau sebagai sumber nitrogen bagi mikroflora yang terdapat dalam rumen sapi. Jika dua implikasi diatas mengalami gangguan oleh adanya mikroorganisme yang bersifat patogen maka proses peningkatan bobot sapi melalui penyediaan asam amino oleh bakteri akan terganggu. Didalam rumen umumnya terdapat berbagai jenis mikroorganisme yang terdiri dari bakteri, protozoa, dan fungi. Mikroorganime ini saling bersimbiosis untuk melakukan proses fermentasi untuk membantu proses pencernaan di dalam rumen. Pada ruminansia proses pencernaan dibantu oleh proses fermentasi yang dilakukan oleh beberapa mikroorganisme yang saling bersimbiosis. Bakteri yang terdapat pada bagian dalam rumen umumnya bersifat anaerobik. Pada ruminansia bakteri yang terdapat pada rumen tidak seluruhnya bersifat menguntungkan bagi hewan ruminansia. Pada beberapa metode pengontrolan mikroorganisme di dalam rumen sering dimanfaatkan beberapa golongan antibiotik namun hal ini akan menurunkan tingkat kualitas daging yang diperoleh dari hewan ruminansia tersebut oleh adanya residu bahan antibiotik pada daging yang diperoleh. Adanya permasalahan ini menyebabkan timbulnya suatu pemikiran penggunaan antimikroba alami yang mampu mengatur pertumbuhan mikroorganisme yang terdapat pada rumen. Bahan antimikroba alami yang umum digunakan pada beberapa percobaan adalah ekstrak yang berasal dari beberapa tumbuhan yang memiliki kemampuan metabolisme sekunder seperti pada jahe, bawang putih, teh, dan oregano (Busquet et al, 2006). Propolis adalah suatu senyawa yang dihasilkan oleh lebah madu, dikumpulkan oleh lebah madu dari tanaman yang mengeluarkan resin untuk kemudian dicampurkan dengan liurnya, digunakan untuk menambal dan mensterilkan sarang sebab propolis memiliki kemampuan disinfektan atau anti bakteri. Pada penelitian ini digunakan propolis sebagai bahan antimikroba alami untuk digunakan sebagai senyawa pengatur jumlah populasi mikroorganisme yang terdapat di dalam rumen, agar proses pencernaan hewan ruminansia dapat berjalan dengan baik. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan uji in vitro kemampuan propolis Trigona spp asal Pandeglang sebagai senyawa bahan antimikroba alami dalam mengontrol populasi bakteri yang terdapat di dalam rumen. Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi potensi propolis sebagai antimikroba alami untuk mengontrol populasi bakteri di dalam rumen, sehingga berfungsi sebagai Growth promoter bagi hewan ternak terutama ternak ruminansia. Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini
yaitu propolis mampu mengontrol pertumbuhan dari populasi bakteri di dalam rumen baik yang bersifat proteolitik, selulolitik, dan lipolitik. Pada hasil ekstraksi terhadap sarang lebah Trigona spp diperoleh rendeman sebesar 7,2 % dengan menggunakan metode ekstraksi Hasan (2006). Secara fisik rendemen yang diperoleh memiliki warna merah kecoklatan dan berbentuk pasta yang sedikit larut dalam air, tetapi larut baik pada pelarut propilen glikol. Hasil penelitian ini menunjukkan adanya kemampuan aktivitas penghambatan pertumbuhan koloni bakteri rumen dengan menggunakan metode sumur. Uji awal terhadap kemampuan ekstrak propolis menghambat pertumbuhan koloni bakteri rumen dapat dilihat dengan adanya pembentukan daerah bening di sekitar sumur. Pada proses inokulasi cairan rumen didapatkan beberapa bentuk koloni yang beragam pada beberapa media yang spesifik terhadap kemampuan hidrolisis substrat yang terdiri dari media agar susu skim untuk bakteri proteolitik, media CMC untuk bakteri selulolitik, dan media M. Sarley untuk bakteri lipolitik. Pada media proteolitik didapatkan adanya suatu koloni bakteri yang memiliki ciri yang sama dengan bakteri Salmonella sp adanya jenis bakteri ini dapat terdeteksi dengan media spesifik Xylose Lysine Desoxycholate (XLD). Selanjutnya setelah diketahui adanya kemampuan ekstrak propolis untuk menghambat pertumbuhan koloni bakteri rumen maka dilakukan penentuan nilai Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM). Pada penentuan KHTM ini di dapatkan adanya pengaruh nilai kerapatan yang tinggi pada bakteri rumen secara tidak langsung mempengaruhi penentuan nilai perhitungan koloni. Populasi bakteri di dalam rumen memiliki kerapakan (>1010 sel per g), dengan melihat tingginya nilai kerapatan sel bakteri di dalam rumen maka diperlukan pengenceran terhadap cairan rumen sebelum proses inokulasi pada media spesifik. Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) terhadap kelompok bakteri proteolitik, lipolitik, selulolitik, dan Salmonella sp adalah 4%. Pada konsentrasi 4% nilai penghambatan terhadap kelompok bakteri proteolitik, lipolitik, selulolitik dan Salmonella sp secara berturut-turut 16,00 cfu/ml, 5,78 cfu/ml, 7,56 cfu/ml, dan 20,44 cfu/ml. Propolis asal pandeglang memiliki potensi sebagai bahan tambahan pakan yang berfungsi melakukan manipulasi proses fermentasi di dalam rumen dengan mekanisme melindungi protein pakan dari proses proteolitik di dalam rumen dengan menghambat pertumbuhan kelompok bakteri proteolitik di dalam rumen serta bakteri Salmonella sp. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan metode yang lebih mendekati dengan keadaan di dalam rumen dengan menggunakan media yang lebih spesifik. Kemampuan propolis Trigona spp sebagai bahan yang memiliki potensi sebagai bahan manipulasi rumen juga perlu diperhatikan dengan menghitung nilai produk akhir fermentasi di dalam rumen yang berupa VFA dan uji lanjutan secara in vivo. Kata Kunci : Rumen, bakteri proteolitik , bakteri lipolitik, bakteri selulolitik, Salmonella sp, Propolis, Trigona spp.
©Hak cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa Mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan, atau makalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
UJI IN VITRO EFEK PROPOLIS TERHADAP POPULASI BAKTERI RUMEN SAPI
I GUSTI BAGUS DATASENA
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Departemen Biokimia
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Tesis Nama Mahasiswa Nomor Pokok Program Studi
: Uji In Vitro Efek Propolis Terhadap Populasi Bakteri Rumen Sapi : I Gusti Bagus Datasena : G851060101 : Biokimia
Disetujui, Komisi Pembimbing :
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua
Ir. A. E Zainal Hasan, MSi. Anggota
Dr. Budi Haryanto Anggota
Diketahui
Ketua Program Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian : 15 Juli 2009
Tanggal lulus :
PRAKATA
Propolis adalah suatu senyawa resin yang berasal dari sarang lebah yang merupakan
suatu
bahan
alam
yang
saat
ini
mendapatkan
perhatian
pemanfaatannya sebagai antibiotik dan sumber senyawa aktif alternatif yang berasal dari alam. Penelitian ” Uji In Vitro Efek Propolis Terhadap Populasi Bakteri Rumen Sapi” yang dilakukan merupakan suatu upaya kearah pencarian bahan aktif alami sebagai pengganti pengunaan antibiotik pada sistem pengaturan populasi bakteri di dalam rumen. Dengan mengucapkan Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena dengan kehendak dan ide yang diberikanNya sehingga proses penelitian dan penulisan tesis ini dapat terselesaikan. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu, terutama kepada: 1) Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc selaku Ketua Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan motivasi, arahan, masukan dan ilmu pengetahuan selama studi hingga penyelesaian penulisan tesis ini. 2) Bapak Dr. Budi Haryanto sebagai dosen Pembimbing yang telah banyak memberikan masukan dan pandangannya mengenai rumen, pencernaan pada ruminansia serta teknik penulisan dalam tesis ini. 3) Bapak Ir. H. A. E. Zainal Hasan, M. Si sebagai dosen Pembimbing yang telah banyak memberikan arahan, masukan, serta ilmu pengetahuan selama proses penelitian hingga penulisan tesis ini. 4) Ibu Prof. Dr. drh. Maria Bintang. M.S selaku ketua program studi biokimia IPB dan Penguji Luar Komisi yang telah memberikan ilmu pengetahuan dan masukan untuk perbaikkan penulisan tesis dan teknik penelitian penulis. 5) Segenap staf pengajar dan manajemen Program Studi Biokimia IPB 6) Keluarga dan orang tua serta adik yang telah banyak memberikan dukungan moril serta pengertian karena waktu yang tersita selama belajar. 7) Istri Fresti Dwi Kartini dan anakku Nanda yang memberikan inspirasi dan semangat untuk menyelesaikan penulisan makalah ini. 8) Rekan-rekan pasca sarjana biokimia angkatan 2006.
Semoga karya tulis ini dapat bermanfaat untuk dunia ilmu pengetahuan dan meningkatkan optimisme membangun masa depan yang lebih baik
Bogor, Juli 2009
I gusti Bagus Datasena
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 12 Desember 1982 dari ayah I Gusti Gede Danendra dan ibu Tanita Meliani. Penulis merupakan putra pertama dari dua bersaudara. Tahun 2000 penulis menjadi mehasiswa strata satu Program Studi Kimia pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Lampung, lulus pada tahun 2005. Pada tahun 2006 penulis memperoleh kesempatan untuk melanjutkan pendidikan pada sekolah pascasarjana pada Program Studi Biokimia Institut Pertanian Bogor.
HALAMAN PERSEMBAHAN
Saya dedikasikan penulisan ini untuk I Gusti Gede Danendra & Tanita Meliani I Gusti Ayu Ditasari I Gusti Ayu Taman I Gusti Gede Muditha S.Si Yang tercinta Fresti Dwi Kartini
Ananda tersayang I Gusti Ayu Fredananda
Semoga sedikit pengetahuan ini berguna untuk semua
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ...................................................................................
xvii
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................
xviii
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
xix
PENDAHULUAN .................................................................................... Latar Belakang .................................................................................. Tujuan Penelitian ............................................................................... Manfaat Penelitian ............................................................................. Hipotesis Penelitian ...........................................................................
1 1 2 2 3
TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... Pencernaan Hewan Ruminansia ........................................................ Mikroorganisme Rumen .................................................................... Propolis .............................................................................................. Lebah Madu Trigona spp ..................................................................
4 4 5 8 10
METODOLOGI PENELITIAN ............................................................... Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... Bahan dan Alat ................................................................................. Metode Penelitian ............................................................................. Ekstraksi Propolis ............................................................................. Uji Aktivitas Antibakteri .................................................................. Uji Pendahuluan Aktivitas Antibakteri Pada Salmonella sp ............ Penyiapan Bakteri Rumen ................................................................ Uji Hidrolisis Protein Bakteri Cairan Rumen .................................... Uji Hidrolisis Lipid Bakteri Cairan Rumen ...................................... Uji Hidrolisis Selulosa Bakteri Cairan Rumen ................................. Uji Aktivitas Antibakteri Pada Bakteri Cairan Rumen ..................... Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum ........................ Perhitungan Jumlah Populasi Bakteri .............................................. Analisis Statistik ..............................................................................
12 12 12 12 13 13 14 14 15 15 15 16 16 17 18
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... Rendemen Ekstrak Propolis ............................................................ Penyiapan Bakteri Rumen .............................................................. Uji Aktivitas Propolis Pada Salmonella sp ...................................... Uji Aktivitas Propolis Pada Bakteri Rumen .................................... Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum Pada Bakteri Rumen .................................................................................
20 20 21 24 25 25
xv
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum Pada Bakteri Salmonella sp .......................................................................
42
KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ Kesimpulan ...................................................................................... Saran ................................................................................................
50 50 50
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................
51
LAMPIRAN .............................................................................................
55
xvi
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1.
Tabel 2.
Tabel 3.
Tabel 4.
Tabel 5.
KHTM ekstrak propolis asal Pandeglang terhadap beberapa kelompok bakteri Rumen ................................................................
26
Pengaruh pengenceran terhadap nilai hambat pertumbuhan koloni beberapa kelompok bakteri cairan rumen ..........................
32
Hasil penentuan nilai KHTM dengan interaksi konsentrasi ekstrak propolis dan pengenceran kelompok bakteri uji ..........................................
38
Hasil penentuan KHTM ekstrak propolis asal Pandeglang terhadap Salmonella sp ..................
43
Hasil penentuan pengaruh pengenceran terhadap nilai hambat pertumbuhan koloni Salmonella sp
46
xvii
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1. Saluran pencernaan hewan ruminansia ...............................................
5
2. Sarang lebah Trigona spp ....................................................................
11
3. Diagram alir penelitian ........................................................................
19
4. Hasil ekstraksi propolis asal Pandeglang setelah proses freeze dry ....
20
5. Hasil positif uji aktivitas proteolitik bakteri cairan rumen ..................
22
6. Hasil positif aktivitas lipolitik bakteri cairan rumen setelah pencucian dengan larutan CuSO4 pada media terbentuk endapan hijau disekitar koloni ...................................................................................................
23
7. Uji aktivitas selulolitik bakteri rumen hasil positif ditunjukkan oleh terbentuknya daerah bening atau biru kemerahan setelah pencucian dengan larutan kongo red pada koloni didalam media uji ..................
24
8. Grafik daya hambat pertumbuhan koloni oleh ekstrak propolis asal Pandeglang pada beberapa nilai konsentrasi ......................................
29
9. Grafik nilai penghambatan dengan interaksi konsentrasi ekstrak propolis dan pengenceran kelompok bakteri uji ...............................
35
10. Grafik daya hambat pertumbuhan koloni Salmonella sp oleh ekstrak propolis asal Pandeglang ...................................................................
44
11. Grafik nilai penghambatan dengan interaksi konsentrasi ekstrak propolis dan pengenceran bakteri Salmonella sp ..............................
48
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Formulasi media yang digunakan .........................................................
56
2. Pembuatan larutan standar McFarland .................................................
57
3. Dokumentasi Ekstraksi Propolis ..........................................................
58
4. Dokumentasi Uji Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) ...
59
5. Data hasil analisis KHTM dengan metode hitung cawan ....................
60
6. Struktur golongan senyawa dan senyawa-senyawa yang terdapat dalam ekstrak propolis ............................................................
73
xix
BAB I PENDAHULUAN
Latar Belakang Rumen merupakan bagian terpenting dalam sistem saluran pencernaan hewan ruminansia. Rumen terdiri dari beberapa bagian yang memiliki fungsifungsi spesifik, didalam rumen terdapat mikroorganisme yang berfungsi dalam membantu proses metabolisme untuk melakukan pencernaan terhadap rumput yang merupakan sumber selulosa bagi sapi. Secara umum selulosa adalah sumber utama karbon bagi pembentukan asam amino sedangkan sumber nitrogen adalah NH3. Asam amino yang dihasilkan memiliki dua implikasi yaitu sebagai sumber pembentuk protein bagi sapi atau sebagai sumber nitrogen bagi mikroflora yang terdapat dalam rumen sapi. Jika kedua implikasi diatas mengalami gangguan oleh adanya mikroorganisme yang bersifat patogen maka proses peningkatan bobot sapi melalui pembentukan asam amino akan terganggu. Didalam rumen umumnya terdapat berbagai jenis mikroorganisme yang terdiri dari bakteri, protozoa, dan fungi. Mikroorganime ini saling bersimbiosis untuk melakukan proses fermentasi untuk membantu proses pencernaan di dalam rumen. Pada ruminansia proses pencernaan dibantu oleh proses fermentasi yang dilakukan oleh beberapa mikroorganisme yang saling bersimbiosis. Bakteri yang terdapat pada bagian dalam rumen umumnya bersifat anaerobik. Pada ruminansia bakteri yang terdapat pada rumen tidak seluruhnya bersifat menguntungkan bagi hewan ruminansia. Bakteri yang terdapat pada rumen pada umumnya ada yang bersifat patogen dan nonpatogen. Bakteri di dalam rumen juga memiliki populasi serta kemampuan hidrolisis yang berbeda seperti proteolitik, selulolitik, dan lipolitik. Adanya berbagai mikroorganisme ini akan menimbulkan efek terhadap keadaan rumen serta kemampuan melakukan pencernaan pada hewan ruminansia tersebut, oleh karena itu maka diperlukan suatu sistem pengontrolan untuk mengatur jumlah mikroorganisme yang bersifat patogen yang terdapat pada rumen, maupun jumlah bakteri yang memiliki kemampuan hidrolisis yang beragam di dalam rumen. Secara alami protozoa di dalam rumen berfungsi sebagai pengatur
2
populasi bakteri, protozoa memangsa bakteri karena kemampuan mensintesis asam amino dan vitamin B komplek sangat rendah (Arora, 1989). Pada beberapa metode pengontrolan mikroorganisme di dalam rumen sering dimanfaatkan beberapa golongan antibiotik namun hal ini akan menurunkan tingkat kualitas daging yang diperoleh dari hewan ruminansia tersebut oleh adanya residu bahan antibiotik pada daging yang diperoleh. Adanya permasalahan ini menyebabkan timbulnya suatu pemikiran penggunaan antimikroba alami yang mampu mengatur pertumbuhan mikroorganisme yang terdapat pada rumen. Bahan antimikroba alami yang umum digunakan pada beberapa percobaan adalah ekstrak yang berasal dari beberapa tumbuhan yang memiliki kemampuan metabolisme sekunder seperti pada jahe, bawang putih, teh, dan oregano (Busquet et al, 2006). Propolis adalah suatu zat yang dihasilkan oleh lebah madu, dikumpulkan oleh lebah madu dari pucuk daun-daun yang muda untuk kemudian dicampurkan dengan liurnya, digunakan untuk menambal dan mensterilkan sarang sebab propolis memiliki kemampuan disinfektan atau anti bakteri (Wikipedia, 2008). Pada penelitian ini digunakan propolis sebagai bahan antimikroba alami untuk dimanfaatkan sebagai senyawa pengatur jumlah populasi mikroorganisme yang terdapat di dalam rumen, agar proses pencernaan hewan ruminansia dapat berjalan dengan baik.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk melakukan uji in vitro kemampuan propolis Trigona spp sebagai senyawa bahan antimikroba alami dalam mengontrol populasi bakteri yang terdapat di dalam rumen.
Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi potensi propolis sebagai antimikroba alami untuk mengontrol populasi bakteri dalam rumen, sehingga berfungsi sebagai growth promoter bagi hewan ternak.
3
Hipotesis Propolis mampu mengontrol pertumbuhan dari populasi bakteri di dalam rumen baik yang bersifat proteolitik, selulolitik, dan lipolitik.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Pencernaan Hewan Ruminansia Pencernaan hewan ruminansia sangat berbeda dengan hewan monogastrik. Pada hewan ruminansia terjadi dua proses penting dalam melakukan pencernaan yaitu pada tahap pertama pencernaan secara mekanik yang terjadi pada mulut dengan bantuan gigi dan saliva. Di dalam mulut pakan yang berupa serat dihaluskan dan dicampurkan dengan saliva kemudian dilanjutkan ketahapan pencernaan
kedua
berupa
pencernaan
fermentatif
yang
melibatkan
mikroorganisme yang terdapat di dalam organ pencernaan yang disebut sebagai rumen. Rumen merupakan organ pencernaan berupa lambung yang terdiri dari rumen, retikulum, omasum, dan abomasum. Proses pencernaan fermentatif di dalam retikulum-rumen terjadi sangat intensif dan dalam kapasitas yang sangat besar. Proses pencernaan tersebut terletak sebelum usus halus atau organ penyerapan utama, hal tersebut sangat menguntungkan karena pakan yang didapatkan dapat diubah dan disajikan dalam bentuk produk fermentasi yang mudah diserap oleh
hewan ruminansia,
serta
menjadikan
kemampuan
pemanfaatan pakan serat dalam jumlah yang lebih banyak akan lebih efisien (Erwanto, 1995). Selain hal diatas pembeda lain pada hewan ruminansia yaitu adanya suatu proses yang disebut memamahbiak (ruminasi). Pada proses ini pakan yang berserat tinggi yang dimakan ditahan untuk sementara di dalam rumen. Pada masa hewan beristirahat, pakan dalam rumen lalu dikembalikan ke mulut (proses regugirtasi) untuk dikunyah kembali (proses remastikasi), kemudian pakan ditelan kembali (proses redegulasi). Selanjutnya pakan tersebut dicerna lagi oleh enzimenzim mikroorganisme rumen. Kontraksi retikulum-rumen yang terkoordinasi dalam rangkaian proses tersebut bermanfaat pula untuk pengadukan, inokulasi, dan penyerapan nutrien dari pakan, serta bermanfaat untuk pergerakan pakan meninggalkan retikulum-rumen (Erwanto, 1995). Kemampuan itu menunjukkan bahwa ruminansia memiliki proses pencernaan yang khas. Ruminansia memiliki lambung yang khas, lambung pada
5
hewan ruminansia terdiri dari empat bagian yaitu rumen atau lambung pertama dan merupakan bagian terbesar dengan kapasitas 100-230 liter, retikulum merupakan lambung kedua atau yang disebut juga sebagai perut jala, omasum atau lambung ketiga yang disebut sebagai perut buku, dan abomasum atau perut keempat atau perut sejati. Perut pada ruminansia berfungsi dengan sempurna setelah usianya menginjak 12 minggu, dengan struktur perut serupa itu ruminansia dapat menelan banyak pakan dalam waktu singkat (Sarwono, 2006). Pakan yang baru dikunyah sebentar bersama saliva (air liur) ditelan masuk ke dalam rumen.
Gambar 1. Saluran pencernaan pada hewan ruminansia (Jenifer, 2001) Rumen berfungsi sebagai tempat penampungan sementara sebelum pakan mengalami pencernaan yang sebenarnya. Di dalam rumen, pakan yang telah ditelan akan mengalami fermentasi dan penguraian oleh enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme anaerobik, yang terdapat secara alami di dalam rumen (Sarwono, 2006). Peranan mikroorganisme rumen dalam proses pencernaan pakan berserat adalah mengurai senyawa-senyawa kompleks seperti selulosa dan hemiselulosa menjadi senyawa-senyawa sederhana yang dapat dimanfaatkan oleh ternak sebagai sumber energi, protein, dan vitamin bagi proses pertumbuhan badannya. Tanpa kehadiran mikroorganisme tersebut tidak mungkin sapi dapat memanfaatkan jerami dan bahan berserat tinggi sebagai sumber pakan utama. Laju proses pencernaan pakan ditentukan oleh lamanya pakan tertahan di dalam
6
rumen dan populasi mikroorganisme yang berkembang (Sarwono, 2006). Di dalam rumen semakin banyak mikroorganisme rumen dan semakin lama pakan berada di rumen maka semakin besar potensi pakan dapat diuraikan. Mikroorganisme
di
dalam
rumen
menghasilkan
enzim
yang
mampu
menghidrolisis selulosa, hemiselulosa serta pati dengan adanya simbiosis dengan mikroorganisme lain yang terdapat dalam rumen hasil hidrolisis yang berupa rantai karbon sederhana hasil hidrolisis selulosa, hemiselulosa serta pati mampu dimanfaatkan menjadi asam lemak volatil yang mampu diserap tubuh dan dijadikan sumber energi bagi hewan ruminansia (Hobson, 1988) Pada rumen terdapat tidak kurang dari 4 jenis mikroorganisme yang terdiri dari populasi bakteri, protozoa, jamur, dan virus yang pada umumnya bersifat anaerobik (Preston dan Leng, 1987). Di dalam rumen populasi berbagai spesies bakteri dan virus saling berinteraksi melalui hubungan simbiosa dan menghasilkan produk-produk khas yang berasal dari proses fermentatif selulosa, hemiselulosa dan pati yang berasal dari tumbuhan. Bakteri tertentu yang terdapat dalam rumen dapat menggunakan CO2, H2, dan format yang diproduksi pada saluran pencernaan rumen untuk membentuk metana (Arora, 1989). Selulosa, hemiselulosa, dan pektin yang tergolong karbohidrat struktural yang berupa serat dan karbohidrat yang dapat difermentasi seperti glukosa, pati mampu dicerna dengan baik, sedangkan lignin sama sekali tidak dapat dicerna. Lignin mengurangi kemampuan pencernaan karbohidrat melalui pembentukan ikatan hidrogen pada sisi kritis sehingga membatasi aktivitas selulase, kitin dengan struktur non aromatik merupakan komponen lain dinding sel yang mencegah proses pencernaan oleh mikroorganisme (Arora, 1989). Mikroorganisme Rumen Mikroorganisme
rumen
pada
umumnya
bersifat
anaerobik,
dan
kebanyakan spesies yang diisolasi dari rumen sangat sensitif terhadap O2 meskipun dalam jumlah yang kecil. Mikroorganisme rumen secara umum ditentukan oleh tipe pakan yang dikonsumsi ternak dan perubahan pakan akan mengakibatkan perubahan populasi dan proporsi dari spesies mikroorganisme (Czerkawski, 1986). Mikroorganisme tersebut terdiri dari bakteri, protozoa, dan
7
fungi yang memegang peranan penting dalam pencernaan pakan (Preston dan Leng, 1987). Adanya bakteri dan protozoa dalam rumen menyebabkan hewan ruminansia dapat mencerna bahan makanan berkadar serat tinggi, mampu mengubah nitrogen seperti urea menjadi protein berkualitas tinggi (Sutardi, 1977). Pada tahun 1981 Ogimoto dan Imai menyatakan bahwa telah diidentifikasi sekitar 200 spesies bakteri, dan lebih dari 20 spesies protozoa. Jumlah bakteri sekitar 1010-1012 per ml cairan rumen, sedangkan populasi protozoa sekitar 105-106 per ml cairan rumen. Mikroorganisme lain yang terdapat dalam rumen adalah fungi anaerob dengan populasi berupa zoospora sekitar 103-105 per ml cairan rumen (Oparin, 1988). Senyawa non nutrisi seperti asam amino non protein, glikosida, polifenol, alkaloid, saponin, dan oksalat bersifat racun bagi mikroorganisme rumen (Odeyo et al. 1999). Berat total protozoa rumen hampir sama dengan berat total bakteri rumen, karena ukuran protozoa lebih besar dari bakteri yaitu mencapai 20-200µm (Church, 1988). Walaupun jumlah protozoa lebih sedikit dari bakteri namun kontribusinya sebesar 60% dari biomassa rumen (McDonald et al, 2002). Protozoa berperan dalam pola fermentasi rumen dengan cara mencerna partikelpartikel pati sehingga kadar asam lemak volatil rendah, selain itu protozoa juga memangsa bakteri untuk memenuhi kebutuhan karena kemampuan protozoa untuk mensintesis asam amino dan vitamin B komplek sangat rendah (Arora, 1989). Mikroorganisme rumen tidak saja terdiri dari bakteri maupun protozoa yang bersifat nonpatogen tetapi juga terdapat bakteri serta protozoa yang bersifat patogen, bakteri maupun protozoa ini tidak saja merugikan tetapi juga akan menimbulkan ganguan pada kemampuan konsumsi pakan pada hewan ruminansia. Pada rumen terdapat beberapa jenis bakteri yang mampu melakukan proses hidrolisis terhadap substrat pakan yang terdiri dari lipid, karbohidrat, dan selulosa melalui proses fermentasi. Karena rumen merupakan bentuk habitat yang bersifat anaerobik maka substrat yang diperoleh dari pakan hanya secara parsial dioksidasi serta direduksi dengan menggunakan jumlah yang sama dengan jumlah reoksidasi kembali NADH. Pada proses fermentasi ini asetat merupakan produksi dominan pada proses fermentasi di dalam rumen tetapi produksi asetat ini bergantung pada kemampuan hidrogenase untuk memproduksi gas hidrogen dari
8
reduksi kofaktor. Hidrogen yang dihasilkan secara termodinamika bereaksi dengan gas lain yang dihasilkan dari proses fermentasi dan juga digunakan untuk membentuk gas metana oleh bakteri metanogenik. Pada beberapa penelitian yang telah dilakukan kompleksitas bakteri rumen hal ini juga menyebabkan adanya keberlanjutan perubahan taksonomi pada bakteri rumen (James et al, 2001). Hasil Penelitian
James
pada
tahun
2001
menyatakan
bakteri
rumen
dapat
diklasifikasikan berdasarkan kemampuan hidrolisis terhadap pakan yang terdapat pada rumen yang terdiri dari substrat selulosa, hemiselulosa, dekstrin, dan pati. Propolis Istilah Propolis berasal dari kata yunani yang terdiri dari dua kata yaitu pro yang berarti sebelum dengan polis yang berarti kota dalam artian ini berarti sebelum kota atau penjaga kota (Fearnley, 2005). Propolis merupakan hasil produk dari lebah yang berupa lem yang berfungsi sebagai perekat dalam membentuk sarang. Propolis dihasilkan dari proses pengumpulan getah dari tumbuhan hidup oleh lebah. Propolis umumnya berfungsi sebagai antimikroba dalam dunia kesehatan, propolis pada beberapa penelitian dapat berfungsi sebagai antimikroba, antiinflamatori, anti jamur, antioksidan, dan antiviral. Lebah pada umumnya menghasilkan madu, wax lebah, venom, propolis, pollen, dan royal jeli. Propolis pada lebah berfungsi sebagai senyawa untuk melawan mikroorganisme patogen. Propolis telah lama digunakan oleh manusia untuk penyembuhan luka seperti luka bakar, sakit perut, dan lainnya. Untuk alasan ini maka farmakologi dan studi kimia pada 30 tahun belakangan ini, sangat gencar mempelajari tentang propolis. Propolis adalah bahan perekat atau dempul yang bersifat resin yang dikumpulkan oleh lebah pekerja dari pucuk, kulit tumbuhan atau bagian-bagian lain dari tumbuhan, resin yang diperoleh dari tanaman dicampur dengan saliva dan enzim lebah sehingga merubah bentuk dari resin awal (Gojmerac, 1983). Propolis umumnya memiliki warna kuning sampai coklat tua, bahkan ada yang transparan. Hal ini disebabkan oleh adanya perbedaan kadar flavonoidnya. Propolis sangat dipengaruhi oleh temperatur. Pada temperatur di bawah 15 0C propolis bersifat keras dan rapuh, tapi akan kembali lebih lengket pada temperatur
9
yang lebih tinggi (25-45 0C). Propolis umumnya meleleh pada temperatur 60-69 0
C dan beberapa sample mempunyai titik leleh di atas 100 0C (Woo, 2004).
Persentase lebah kerja yang mengumpulkan propolis sangat rendah tetapi dilakukan setiap saat. Di lokasi sumber lebah pekerja pencari propolis menggigit propolis dengan mandibulanya (rahang bawah) dan dengan bantuan sepasang kaki pertamanya. Propolis ditransfer ke keranjang polen, kegiatan ini membutuhkan waktu 15-60 menit. Di dalam sarang lebah penjaga sarang memindahkan propolis dan meraciknya, serta kadang ditambahkan sedikit lilin yang kemudian diangkut pada tempat yang membutuhkan ataupun disimpan sebagai cadangan. Lebah madu jenis Kaukasian mempunyai kemampuan mengumpulkan propolis yang lebih banyak (Gojmerac, 1983). Di dalam propolis terdapat kandungan bahan campuran kompleks yang terdiri dari lilin, resin, balsam, minyak dan sedikit polen. Komposisinya bervariasi tergantung dari tumbuhan asal. Propolis juga memiliki kandungan senyawa aromatik, zat wangi, dan berbagai mineral (Pusat Pelebahan Apiari Pramuka, 2003). Propolis dan jumlah senyawa-senyawanya menunjukkan bermacam efek biologis serta aktivitas farmakologis. Lebih dari 200 senyawa yang terkandung di dalam propolis sudah diketahui (Khismatullina, 2005). Unsur aktif yang penting dalam aktivitas biologis dan farmakologis adalah flavonoid dan senyawa fenolat serta senyawa aromatik. Propolis juga mengandung senyawa organik diantaranya yang terbanyak resin (45-50%), malam (20-25%), minyak yang mudah menguap (10%), dan mineral (1,5-2%) (Sarwono, 2007). Dalam propolis juga terdapat senyawa fenolat, namun nilai nutrisi langsung propolis sangat kecil yang berasal dari protein, asam amino, mineral, dan glukosa serta vitamin dalam jumlah kecil seperti vitamin A, B1, B2, B6, C, dan E (Khismatullina, 2005). Propolis dianggap sebagai pencemar bagi malam, tetapi propolis berfungsi untuk melindungi sarang dari bakteri serta virus dan melindungi telur dari Bacillus larvae yang menyebabkan kebusukan telur tersebut serta mensterilkan simpanan makanan. Bangsa Romawi dan Yunani menggunakan propolis sebagai obat dan lem dalam membuat kano. Di dalam dunia medis propolis dimanfaatkan dalam penyembuhan berbagai penyakit. Manfaat propolis yang bermacam-macam ini dapat dimungkinkan karena kandungan senyawa di dalam propolis yang
10
beragam. Pada beberapa penelitian propolis menunjukkan keefektifan sebagai antivirus, antikanker, antioksidan, antifungi, antibakteri, antibiotik, antinflamasi, dan meningkatkan imunitas serta manfaat lainnya. Ada juga beberapa penelitian yang menyebutkan propolis memiliki sifat bakterisida, bakteriostatik, dan memiliki sifat antibiotik. Sebagai senyawa antibiotik alami propolis memiliki kelebihan dibandingkan senyawa antibiotik sintetik karena lebih aman, memiliki efek samping yang sedikit berupa alergi, dan memiliki selektifitas yang tinggi (Winingsih, 2004). Lebah Madu Trigona spp Lebah madu Trigona spp merupakan salah satu serangga sosial yang hidup berkelompok membentuk koloni. Satu koloni lebah ini berjumlah 300-80000 lebah. Trigona spp banyak ditemukan hidup didaerah tropis dan subtropis, ditemukan di Amerika Selatan, setengah Afrika bagian Selatan, dan Asia Selatan (Free, 1982). Trigona spp diklasifikasikan secara taksonomi oleh Sihombing pada tahun 1997 yaitu
Divisi
: Animalia
Filum
: Arthopoda
Kelas
: Insekta
Ordo
: Hymenoptera
Famili
: Apidea
Genus
: Trigona
Spesies
: Trigona spp
Trigona spp dalam bahasa daerah disebut sebagai klanceng atau lonceng (Jawa), teuweul (Sunda), kele (Bali) gala-gala atau lebah lilin. Ukurannya sangat kecil fungsinya sebagai penyerbuk bunga-bunga kecil. Serangga ini membuat sarang dalam lubang pohon, celah dinding, dan lubang bambu. Untuk tempat keluar masuk tersedia lubang kecil sepanjang 1 cm yang dilingkupi zat perekat. Tempat tinggalnya tersusun atas beberapa bagian. Setiap bagian digunakan untuk menyimpan madu, menyimpan tepung sari, tempat bertelur, dan tempat larvanya. Di bagian tengah terdapat karangan-karangan bola berisi telur, tempayak, dan
11
kepompong. Di bagian sudut terdapat bola-bola agak kehitaman untuk menyimpan madu dan tepung sari. Lebah ini selain mencari nektar dan tepung sari, lebah ini gemar mengambil getah pohon untuk menutup celah sarangnya. Lebah ini juga tidak memiliki sengat serta menghasilkan madu dan lilin namun madu yang dihasilkan bersifat asam (Sarwono, 2007). Trigona spp lebih banyak mencari makan pada pagi hari dibandingkan sore hari. Hal ini dipengaruhi oleh intensitas cahaya matahari. Ukuran tubuh juga mempengaruhi jarak terbang lebah mencari makan. Makin besar tubuh lebah maka semakin jauh jarak terbangnya. Trigona spp memiliki ukuran 5 mm sehingga hanya mampu terbang sekitar 600 m (Amano et al, 2000, diacu dalam Nelli, 2004).
Gambar 2. Sarang lebah Trigona spp dengan delapan kali perbesaran (datasena)
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Mei sampai dengan Oktober 2008. Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia IPB, Laboratorium Bakteriologi Balai Besar Penelitian Veteriner Bogor, dan Laboratorium Bioteknologi LIPI. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah sarang lebah Trigona spp yang berasal dari Pandeglang. Bakteri yang berasal dari cairan rumen sapi, media spesifik yang digunakan; media padat PYG (pepton, yeast, glukosa), media agar Briliant-geen, media CMC, media XLD, media M. Sarley, media agar susu skim, media nutrien cair (Nutrien Broth), media padat (Nutrien Agar), etanol 70%, selulosa, pepton, amilum, minyak zaitun, kertas saring whatman,
aquades,
aqubides, CuSO4, iodin, kaliumiodida, propilen glikol (PG teknis). Alat-alat yang digunakan ialah laminar air flow cabinet, inkubator autoklaf, penangas air, lemari es, autopipet, kromatogafi lapis tipis (KLT), jangka sorong, termometer, pH meter, shaker, jarum ose, neraca analitik, cawan petri, spektrofotometer, freeze dryer, toples anaerob, dan alat-alat gelas lainnya. Metode Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahapan. Tahap pertama meliputi ekstraksi propolis dari sarang lebah Trigona spp asal
Pandeglang, dan uji
aktivitas antibakteri. Tahap kedua adalah penentuan nilai konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) dari ekstrak propolis terhadap bakteri uji, dan penentuan populasi bakteri.
13
Esktraksi Propolis Ekstraksi propolis dilakukan dengan metode Hasan (2006). Sebanyak 350 g sarang lebah Trigona spp asal Pandeglang dimaserasi dengan etanol 70%. Sampel sarang lebah Trigona dimaserasi dengan 650 ml etanol 70% pada wadah tertutup dan digojog menggunakan shaker dengan kecepatan 80 rpm. Setelah tujuh hari, maserasi dihentikan dan disaring. Residu dimaserasi kembali dengan 50 ml etanol 70%. Setelah 24 jam, maserasi dihentikan dan disaring. Perlakuan maserasi selama 24 jam, dilakukan secara berulang sampai hari ke tujuh, dimana warna etanol tidak mengalami perubahan (tetap bening). Dengan demikian, total waktu maserasi adalah 14 hari, dan etanol 70% yang digunakan adalah 1000 ml. Filtrat ditampung, dan pelarut etanol dibebaskan melalui freeze dryer, hingga dihasilkan ekstrak propolis yang berupa pasta. Preparasi Propolis Uji Ekstrak propolis yang diperoleh dari hasil ekstraksi, didalam aquades steril yang digunakan untuk membuat media uji. Pelarutan ekstrak propolis dilakukan dengan dosis yang berbeda yaitu 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% (b/v). Preparasi Media. Media bakteri yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 5 jenis media, yaitu, media Pepton + Yeast ekstrak + glukosa (media PYG), media proteolitik (media kasein), media CMC, media M.Sarley, dan media briliant-geen. Komposisi setiap media adalah sebagi berikut ; a. Media PYG Untuk volume 1 l aquades memiliki perbandingan pepton : yeast ekstrak : glukosa adalah 10 : 10 : 20 b. Media susu skim agar untuk volume 1 l aquades, terdapat 100 g susu skim, dan 15 g agar. c. Media lipolitik (media M.Sarley) terdiri dari 0,05 g pepton, 0,5 g gum arab, 0,5 g glukosa, 1,5 g agar dan 1,5 ml minyak zaitun yang dilarutkan dalam 100 ml aquadest. d. Media CMC terdiri dari 10 g media CMC, dan 15 g agar yang dilarutkan kedalam 1 l aquades.
14
e. Media agar Briliant-geen terdiri dari 58 g media agar Briliant-geen dilarutkan dalam 1 l aquades. Penyiapan Bakteri Rumen Sebanyak 1 ml cairan rumen yang mengandung bakteri-bakteri, diencerkan dengan larutan garam fisiologis dengan pengenceran 10-2 dan 10-6 kemudian ditepatkan secara turbidimetri mengunakan larutan standar Mac Farland nomor 0,5 dan kemudian diinokulasikan kedalam media PYG cair.
Hal ini
bertujuan agar jumlah populasi bakteri rumen tidak terlalu tinggi karena terbatasnya substrat yang terkandung dalam media yang berada di dalam cawan petri. Uji Hidrolisis Protein Bakteri Cairan Rumen Bakteri
cairan
rumen
diuji
kemampuan
proteolitiknya
dengan
menggunakan media agar susu skim. Ke dalam media agar susu skim steril, di inokulasikan bakteri cairan rumen dari hasil inokulasi pada media PYG cair, dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC, dalam keadaan anaerob. Hasil uji positif jika pada media terdapat pembentukkan zona bening. Uji Hidrolisis Lipid Bakteri Cairan Rumen Bakteri cairan rumen diuji kemampuan lipolitiknya dengan menggunakan media M. Sarley, yang disterilkan menggunakan autoklaf. Inokulasi dilakukan dengan menggunakan metode cawan tuang. Hasil uji positif jika setelah masa inkubasi selama 48-72 jam pada suhu 37 0C dalam keadaan anaerob, terdapat endapan biru disekitar koloni bakteri setelah dilakukan pencucian menggunakan 5 M larutan CuSO4. Uji Hidrolisis Selulosa Bakteri Cairan Rumen Bakteri
cairan
rumen
diuji
kemampuan
selulolitiknya
dengan
menggunakan media CMC. Cara inokulasi untuk uji dilakukan dengan menggunakan metode cawan tuang. Media CMC terlebih dahulu disterilkan menggunakan autoklaf, kemudian dilakukan inkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0
C dalam keadaan anaerob. Hasil uji positif bakteri memiliki kemampuan
15
selulolitik jika terbentuk zona berwarna ungu ataupun bening disekitar koloni dengan pencucian menggunakan larutan kongo red 5 M ataupun larukan iodin 5 M Uji Aktivitas Antibakteri Propolis Pada Salmonella sp Uji aktivitas antibakteri juga dilakukan pada bakteri patogen yang terdapat pada rumen yaitu Salmonella Sp dengan menggunakan metode difusi sumur. Media agar Briliant-geen dan media XLD yang telah didalamnya diinokulasikan bakteri Salmonella Sp dituangkan 20 ml ke dalam setiap cawan petri kemudian digoyangkan agar media merata, dan didiamkan hingga memadat. Setelah memadat maka media padat dilubangi dengan diameter ± 5 mm. Ke dalam lubang tersebut dimasukkan ekstrak propolis sebanyak 50 µl lalu diinkubasi pada suhu 37 0
C selama 24 jam. Daerah bening yang terbentuk disekeliling sumur yang juga
dikelilingi koloni berwarna coklat sampai kehitaman dengan pendaran warna metalik, menandakan adanya aktivitas antibakteri pada bakteri Salmonella sp dari ekstrak propolis. Uji Aktivitas Antibakteri Propolis Terhadap Bakteri Rumen Uji pendahuluan aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumur. Sebanyak 1 ml cairan rumen yang telah diinokulasi kedalam 100 ml media selektif padat untuk bakteri proteolitik, lipolitik, dan selulolitik yang masih cair yang memiliki suhu ± 40 0C, lalu media yang telah di dalamnya diinokulasikan bakteri cairan rumen dituangkan 20 ml ke dalam setiap cawan petri kemudian digoyangkan agar media merata, dan didiamkan hingga memadat. Setelah media memadat maka media selektif padat dilubangi dengan diameter ± 5 mm. Ke dalam lubang tersebut dimasukkan ekstrak propolis sebanyak 50 µL lalu diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam dalam keadaan anaerob. Zona bening yang terbentuk disekeliling sumur, menandakan adanya aktivitas antibakteri pada sampel ekstrak propolis. Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum Setelah diketahui ekstrak propolis memiliki aktivitas antibakteri pada bakteri yang memiliki kemampuan proteolitik, lipolitik, selulolitik serta
16
Salmonella sp, kemudian ditentukan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM). Penentuan konsentrasi hambat tumbuh minimum digunakan untuk mengetahui nilai konsentrasi minimum dari suatu larutan antimikroba terhadap pertumbuhan mikroba tertentu. Cara kerjanya ialah dengan membuat pengenceran propolis dengan beberapa konsentrasi (0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3,5%; 4% (w/v)). Kemudian setelah dilakukan pengeceran terhadap ekstrak propolis dan dilanjutkan dengan penyiapan media yang terdiri dari empat jenis media spesifik untuk setiap kelompok bakteri cairan rumen dan Salmonella sp yang terdiri dari media proteolitik dengan media PYG yang diperkaya dengan kasein, media lipolitik dengan media M. Sarley, media selulolitik dengan media CMC, dan media Salmonella sp dengan briliant-geen. Setiap media dibuat sebanyak 20 ml pada setiap erlenmeyer. Setelah disterilkan maka dilakukan penanaman bakteri cairan rumen berdasarkan kemampuan tumbuh pada media spesifiknya. Erlenmeyer yang telah diinokulasikan dengan bakteri cairan rumen yang memiliki kemampuan tumbuh pada media spesifiknya dipisahkan menjadi dua kelompok yaitu erlenmeyer kelompok kontrol dan erlenmeyer kelompok perlakuan. Pada erlenmeyer kontrol tidak dilakukan penambahan apapun hanya media spesifik, bakteri cairan rumen dan media Briliant-geen yang telah diinokulasikan bakteri Salmonella sp. Sedangkan pada erlenmeyer kelompok perlakuan dilakukan penambahan 10 ml larutan propolis dengan
konsentrasi
berbeda pada setiap erlenmeyer. Kemudian seluruh erlenmeyer kontrol dan perlakuan diinkubasi selama 24- 48 jam pada suhu 37 0C dalam keadaan anaerob. Penentuan KHTM dilakukan dengan melihat pengaruh perlakuan terhadap jumlah populasi bakteri menggunakan metode perhitungan jumlah populasi bakteri. Perhitungan Jumlah Populasi Bakteri Perhitungan jumlah populasi bakteri rumen sapi menggunakan metode hitung cawan, dasar metode ini adalah setiap sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni, dengan demikian jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi sel bakteri yang dapat hidup terkandung dalam sampel. Setelah waktu inkubasi untuk penentuan KHTM berakhir maka selanjutnya dilakukan penanaman kembali terhadap dua kelompok erlenmeyer
17
yang terdiri dari erlenmeyer kontrol, dan erlenmeyer perlakuan dengan terlebih dahulu melakukan pengenceran terhadap biakan bakteri yang berasal dari medium cair spesifik untuk masing-masing kelompok bakteri cairan rumen menggunakan larutan garam fisiologis steril dengan seri pengenceran 10-2, 10-4, 10-6, dan 10-8 dengan ditepatkan secara turbidimetri mengunakan larutan standar Mac Farland nomer 0,5. kemudian biakan bakteri yang telah diencerkan dimasukkan kedalam media agar spesifik yang masih cair dan dituangkan ke dalam cawan petri. Cawan petri yang telah berisi media dan biakan bakteri diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 370C dalam keadaan anaerob, setelah waktu inkubasi berakhir maka dilakukan perhitungan jumlah populasi bakteri. Analisis Statistik Analisis yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Seluruh data yang diperoleh dari setiap pengamatan terhadap empat kelompok bakteri yang diberikan taraf konsentrasi propolis yang terdiri (0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3,5%; 4% (w/v)) yang dilakukan dengan sembilan ulangan kemudian keseluruhan dari setiap data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan model rancangan : 1. Untuk kelompok bakteri proteolitik Yij = µ + αi + εij Dimana: Yij µ εij
: nilai pengamatan pengaruh kelompok bakteri proteolitik dengan pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j. : rataan umum : pengaruh pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j
2. Untuk kelompok bakteri selulolitik Yij = µ + αi + εij Dimana: Yij µ εij
: nilai pengamatan pengaruh kelompok bakteri selulolitik dengan pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j. : rataan umum : pengaruh pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j
18
3. Untuk kelompok bakteri lipolitik Yij = µ + αi + εij Dimana: Yij µ εij
: nilai pengamatan pengaruh kelompok bakteri lipolitik dengan pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j. : rataan umum : pengaruh pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j
4. Untuk bakteri Salmonella sp Yij = µ + αi + εij Dimana: Yij µ εij
: nilai pengamatan pengaruh kelompok bakteri Salmonella sp dengan pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j. : rataan umum : pengaruh pemberian taraf konsentrasi propolis ke-i dan ulangan ke-j
Rancangan ini digunakan pada uji antibakteri penentuan KHTM, data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% dan 99% dengan taraf α 0,05 dan 0,01. Uji lanjut yang digunakan adalah uji kontras dan uji Duncan. Semua data dianalisis menggunakan progam SPSS 15.0.
19
DIAGAM ALIR PENELITIAN Sarang lebah Trigona spp
Ekstraksi Propolis dengan Pelarut Etanol 70% Penyiapan Bakteri CairanRumen Ekstrak Propolis Trigona spp Uji Proteolitik, Selulolitik, Lipolitik pada Populasi Bakteri Rumen
Uji Aktivitas Antibakteri Pada Bakteri Rumen dan Bakteri Salmonella sp
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM)
Penentuan KHTM terhadap Populasi bakteri menggunakan metode hitung cawan Gambar 3. Diagam alir penelitian
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Rendemen Ekstrak Propolis Metode ekstraksi yang digunakan untuk mengekstrak propolis dilakukan adalah metode Hasan (2006). Sarang lebah Trigona spp asal Pandeglang memiliki berat total 1119,17 g, kemudian sarang lebah tersebut ditempatkan kedalam empat erlenmeyer, masing-masing erlenmeyer diberikan 279,79 g sarang lebah. Setiap erlenmeyer ditambahkan etanol 70% dengan perbandingan satu banding lima. Penggunaan etanol 70% dilakukan karena etanol merupakan senyawa yang memiliki sifat yang polar sehingga komponen aktif yang terdapat di dalam sarang lebah yang memiliki tingkat kepolaran yang beragam dapat dipaksa melarut dengan baik didalam etanol guna memudahkan proses ekstraksi.
Gambar 4. Hasil ekstraksi propolis asal Pandeglang setelah proses freeze dry Propolis larut di dalam pelarut etanol dan sedikit larut dalam air (Woo. 2004). Total penambahan etanol 70% pada setiap erlenmeyer adalah 1398,95 ml. Etanol 70% pada awal satu minggu pertama ditambahkan sebanyak 1048,95 ml kedalam setiap erlenmeyer, setelah satu minggu dilakukan penyaringan ekstrak propolis. Maserasi dilanjutkan pada masing-masing erlenmeyer yang berisi sarang lebah Trigona spp
selama satu minggu namun pada maserasi lanjutan ini
dilakukan penambahan 50 ml etanol 70% yang dilakukan setiap hari pada erlenmeyer setelah penyaringan ekstrak propolis setiap 24 jam. Setelah dua
21
minggu (waktu maserasi berakhir) didapatkan total ekstrak propolis dalam etanol 70% sebanyak 5595,8 ml. Total ekstrak propolis etanol 70% dilanjutkan ketahapan freeze dry untuk membebaskan propolis dari pelarut. Pemilihan penggunaan freeze dry pada tahapan setelah ekstraksi dilakukan untuk mencegah terjadinya perusakan struktur kimia senyawa dalam ekstrak propolis akibat suhu. Pada saat freeze dry terjadi proses penurunan titik uap pelarut etanol 70% yang diakibatkan oleh penurunan tekanan sehingga volume etanol akan berpindah dari labu menuju alat penampung pelarut pada freeze dry. Freeze dry dilakukan selama 120 jam yang bertujuan agar seluruh etanol 70% yang terdapat pada ekstrak tertarik sehingga didapatkan ekstrak propolis kering yang berupa kerak pada dinding labu. Rendemen propolis yang diperoleh sebesar 7,2% (b/b) dari keseluruhan sarang lebah Trigona spp yang dimaserasi. Penyiapan Bakteri Rumen Bakteri rumen yang teramati pada tahapan ini memiliki kemampuan melakukan hidrolisis protein, lipid maupun selulosa dalam beberapa media yang dibentuk secara spesifik untuk mengamati setiap kemampuan hidrolisis bakteri cairan rumen. Pengamatan terhadap kemampuan hidrolisis protein kelompok bakteri cairan rumen menunjukkan hasil yang positif seperti pada Gambar 5 dengan adanya daerah bening disekitar koloni bakteri yang ditumbuhkan di dalam media agar susu skim yang digunakan. Susu skim adalah suatu jenis susu yang memiliki kandungan lemak yang rendah dan memiliki kandungan protein yang sama seperti pada susu umumnya, kandungan protein pada susu berkisar antara 2,8% hingga 4%. Kasein adalah partikel yang besar berupa protein yang terdapat
pada susu, di dalamnya tidak hanya terdiri dari zat-zat organik, melainkan mengandung juga zat-zat anorganik seperti kalsium, phosphor, dan magnesium. Molekul kasein yang merupakan partikel yang besar dan senyawa yang kompleks tersebut dinamakan juga misel kasein (casein micell). Misel kasein tersebut besarnya tidak seragam, berkisar antara 30 – 300 μm, kasein juga mengandung sulfur (S) yang terdapat pada metionin (0,69%) dan sistin (0,09%) (Adnan. 1984). Kelompok bakteri yang mampu hidup pada media agar susu skim terjadi akibat adanya proses hidrolisis protein yang berasal dari sumber protein susu skim yang
22
terdapat didalam media. Proses hidrolisis ini mengakibatkan meningkatnya kelarutan protein dalam bentuk asam amino pembentuknya. Pada bakteri rumen kemampuan menghidrolisis protein sangat penting untuk proses pembentukan protein bagi bakteri rumen maupun ketersediaan nitrogen-amonia (N-NH3) di dalam rumen (Wallace. 1996). Pada hewan ruminansia peranan nitrogen atau protein erat kaitannya dengan pengolahan pada abomasum dan segmen saluran pencernaan beserta mikroba dan protein pakan yang dapat terbebas dari proses degradasi didalam rumen. Pada kondisi yang normal protein mikroba minimal dapat memenuhi kebutuhan hidup pokok dari hewan ruminansia tersebut (Prakkasi. 1998).
Gambar 5. Hasil positif uji aktivitas proteolitik bakteri cairan rumen Pada hasil pengamatan terhadap kemampuan hidrolisis lipid dengan mengunakan media M. Sarley teramati nilai uji yang positif. Adanya endapan biru disekitar koloni kelompok bakteri cairan rumen. Endapan biru terjadi akibat adanya interaksi antara asam lemak dengan ion Cu setelah pencucian dengan menggunakan larutan CuSO4 seperti yang ditunjukan pada Gambar 6. Bakteri cairan rumen yang memiliki kemampuan menghidrolisis lemak sedikit jumlahnya dibandingkan dengan bakteri cairan rumen yang mampu menghidrolisis protein maupun selulosa ini mungkin diakibatkan sumber pakan utama yang dimakan oleh hewan ruminansia pada umumnya merupakan jenis pakan yang kaya akan serat. Jenis bakteri yang menghidrolisis lipid atau mampu melakukan lipolisis
23
didalam rumen memiliki kemampuan untuk menghidrolisis trigliserida menjadi mono ataupun digliserida (Hobson. 1988). Enzim-enzim yang terdapat pada bakteri rumen umumnya terdapat secara ekstraseluler dan berasosiasi dengan permukaan sel atau struktur membran ekstraseluler bakteri, dan akan bekerja optimum pada pH 7,4 (Hobson. 1988). Pada uji lipolitik ini digunakan sumber lipid berupa minyak zaitun. Minyak zaitun memiliki nilai komponen lemak tak jenuh yang tinggi dibandingkan dengan lemak jenuh serta kandungan triasilgliserol (Mailer. 2006). Bakteri ruminansia yang dapat melakukan lipolitik dinamai oleh Hungate pada tahun 1966 sebagai organisme Anaerovibrio lipolytica (Hobson. 1988).
Gambar 6. Hasil positif aktivitas lipolitik bakteri cairan rumen setelah pencucian dengan larutan CuSO4 pada media terbentuk endapan hijau disekitar koloni. Hasil uji yang positif juga teramati pada uji selulolitik bakteri cairan rumen, hal ini teramati dengan adanya pembentukan daerah bening atau biru kemerahan setelah pencucian dengan larutan kongo red seperti pada Gambar 7. Interaksi pembentukan daerah bening diakibatkan kemampuan kongo red berinteraksi dengan hasil pemecahan ikatan ß (1,4) (1,3) D-glukan (Ronald, et al. 1982). Kongo red akan menghasilkan daerah yang jelas dalam mengGambarkan adanya aktivitas selulolitik pada uji. Bakteri selulolitik di dalam cairan rumen secara umum memiliki jumlah koloni yang lebih banyak dibandingkan dengan bakteri proteolitik, dan lipolitik. Jumlah koloni yang besar dikarenakan
24
kecenderungan ruminansia untuk memakan jenis pakan yang lebih kaya akan serat yang berasal dari tanaman. Serat pada tanaman umumnya dalam bentuk selulosa yang terbentuk dari ikatan ß (1,4) (1,3) D-glukosida.
Gambar 7. Uji aktivitas selulolitik bakteri rumen hasil positif ditunjukkan oleh terbentuknya daerah bening atau biru kemerahan setelah pencucian dengan larutan kongo red pada koloni didalam media uji.
Uji Aktivitas Antibakteri Propolis Pada Salmonella sp Propolis asal Pandeglang memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Salmonella sp. Salmonella sp umumnya terdapat didalam rumen, bakteri ini dapat menginfeksi hewan ruminansia melalui pakan (Bender, et al. 1997). Pada penelitian ini keberadaan bakteri Salmonella sp didapatkan pada cairan rumen dengan bentuk koloni yang spesifik dibandingkan dengan koloni bakteri lain, hal ini yang mengakibatkan dipilihnya penggunaan media spesifik untuk lebih memudahkan proses penentuan jenis spesies bakteri. Aktivitas antibakteri ekstrak propolis dapat teramati dengan adanya pembentukan daerah bening disekitar sumur. Penelitian terdahulu yang dilakukan dengan menggunakan bahan propolis asal Pandeglang oleh Angraini (2006), Lasmayanty (2007), dan Tukan (2008) menunjukkan adanya aktivitas propolis sebagai antibakteri. Aktivitas antibakteri dari propolis dapat diamati secara kualitatif dengan adanya pembentukan daerah bening sedangkan untuk menilai besarnya aktifitas antibakteri maka dapat
25
dihitung dengan memperhatikan nilai jari-jari daerah bening yang terbentuk disekitar sumur. Pada penelitian ini adanya aktivitas antibakteri ditentukan dengan mengamati adanya pembentukan zona bening yang dilanjutkan dengan penentuan nilai konsentrasi hambat tumbuh minimum propolis terhadap bakteri Salmonella sp dengan memperhatikan jumlah penghambatan pertumbuhan koloni pada media yang bersifat spesifik.
Uji Aktivitas Antibakteri Propolis Pada Bakteri Rumen Hasil uji propolis pada tiga jenis bakteri cairan rumen menunjukkan adanya aktivitas antibakteri dengan pembentukan daerah bening di sekitar sumur pada tiga jenis media spesifik yang berbeda. Hal ini menunjukkan adanya kemampuan propolis asal Pandeglang untuk menghambat pertumbuhan tiga jenis bakteri yang terdiri dari bakteri proteolitik, lipolitik, dan selulolitik. Kemampuan propolis asal Pandeglang untuk menghambat pertumbuhan bakteri cairan rumen yang secara fisiologis penting bagi keberadaan populasi bakteri di dalam rumen, sehingga dilakukan tahapan lanjutan untuk menentukan nilai konsentrasi hambat tumbuh minimum propolis terhadap tiga kelompok bakteri tersebut. Propolis asal Pandeglang memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen maupun non patogen pada usus sapi dengan nilai penghambatan dan konsentrasi yang berbeda (Tukan. 2008)
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum Pada Bakteri Rumen Hasil uji aktivitas antibakteri propolis asal Pandeglang yang positif pada tiga jenis kelompok bakteri cairan rumen dan Salmonella sp kemudian dilanjutkan dengan menentukan konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM). Hasil KHTM pada tiga jenis kelompok bakteri cairan rumen yang terdiri dari kelompok bakteri proteolitik, kelompok bakteri lipolitik, dan kelompok bakteri selulolitik dapat dilihat pada Tabel dibawah ini.
26
Tabel 1, Hasil penentuan KHTM ekstrak propolis asal Pandeglang terhadap beberapa kelompok bakteri rumen Konsentrasi Propolis (g/100 ml)
Nilai hambat pertumbuhan koloni (cfu/ml)
Proteolitik Lipolitik Selulolitik 0,5 7,00 3,44 3,52 1 7,64 3,69 3,78 1,5 7,72 1,64 3,00 2 6,75 1,67 3,75 2,5 4,75 1,31 3,56 3 4,25 3,22 3,79 3,5 6,25 3,61 3,89 4 11.50 4,36 4,84 Keterangan : Dengan derajat alpha 0,05 dilakukan dengan sembilan ulangan pada setiap konsentrasi propolis dan berbeda nyata (P<0,05)
Dari Tabel 1 diatas dapat dilihat bahwa larutan ekstrak propolis pada konsentrasi tertinggi (4 %) mampu memberikan hambatan pertumbuhan terhadap semua jenis kelompok bakteri uji, hal ini dapat ditunjukkan dengan besarnya nilai penghambatan pertumbuhan bakteri pada setiap media spesifik yang digunakan untuk setiap kelompok bakteri. Nilai penghambatan pertumbuhan koloni terbesar adalah pada kelompok bakteri bakteri proteolitik (11,50 cfu/ml) sedangkan nilai penghambatan pertumbuhan koloni terendah adalah pada kelompok bakteri lipolitik (4,36 cfu/ml), sedangkan untuk kelompok bakteri selulolitik (4,84 cfu/ml). Nilai penghambatan yang besar pada kelompok bakteri proteolitik dapat diakibatkan oleh adanya komponen kimia yang beragam yang terkandung pada propolis asal Pandeglang. Propolis asal Pandeglang memiliki kandungan komponen kimia yang terdiri dari tanin, flavonoid, steroid, dan alkaloid (Tukan, 2008). Nilai konsentrasi ekstrak propolis yang besar juga mempengaruhi tingkat kemampuan propolis dalam menghambat pertumbuhan koloni bakteri uji. Propolis dengan konsentrasi 4% (b/v) mampu menghambat pertumbuhan kelompok bakteri proteolitik sebesar 11,50 cfu/ml hal ini memberikan Gambaran kemampuan propolis untuk mempengaruhi pertumbuhan kelompok bakteri rumen yang bersifat proteolitik. Pada rumen terdapat beberapa jenis bakteri yang mampu melakukan proses proteolisis. Bakteri proteolitik tersebut antara lain Bacteroides amylophilus, B. ruminocola, Butyrivibrio spp, Selenomonas ruminantium, Lachnospira
multiparus,
Peptostreptococcus
elsdinii,
dan
Clostridium
bifermentans (Fulghum dan Moore, 1962; Hungate, 1969; Arora, 1989). Pada
27
rumen hewan ruminansia terjadi beberapa reaksi yang umumnya terjadi karena adanya kelompok bakteri bersifat proteolitik yang melakukan proses pemecahan protein dan pembebasan asam amino dari ikatan peptida serta proses deaminasi yang menyertainya (Arora, 1989). Bakteri kelompok proteolitik yang dapat melakukan deaminasi asam amino adalah Bacteroides ruminicola, Selenomonas ruminantium, Peptostreptococcus elsdenii, Clostridium, Butyrivibrio spesies (Bladen et al. 1961). Kelompok bakteri proteolitik akan menyediakan bentuk asam amino bagi dirinya sendiri serta bagi penyusunan protein hewan ruminansia itu sendiri. Seluruh protein yang berasal dari makanan pertama kali dihidrolisis oleh mikroba rumen walaupun ada beberapa bentuk protein tertentu yang terbebaskan dari proses didalam rumen dan diserap langsung pada organ pencernaan setelah rumen . Tingkat hidrolisis protein sangat tergantung dari kemampuan daya larutnya yang juga berhubungan dengan kenaikan kadar amonia di dalam rumen, namun juga ada beberapa jenis protein ataupun asam amino yang terlindungi dari proses hidrolisis di dalam rumen. Pada kondisi protein mikroba minimal umumnya dapat memenuhi kebutuhan hidup pokok dari hewan ruminansia (Parakkasi, 1998). Pada proses proteolisis yang dilakukan oleh mikroba rumen diikuti juga reaksi deaminasi asam amino menghasilkan amonia, kondisi ini akan mengakibatkan kenaikan kadar amonia didalam rumen yang mengakibatkan bakteri akan melakukan pembentukan protein dari amonia yang dibebaskan sehingga akan mengganggu proses hidrolisis pakan yang dicerna masuk kedalam rumen oleh hewan ruminansia (Arora, 1989). Proteolisis yang dilakukan oleh kelompok bakteri rumen sangat perlu dikontrol. Kemampuan propolis untuk melakukan penghambatan terhadap kelompok bakteri yang bersifat proteolitik memberikan harapan bagi pengaturan jumlah populasi kelompok bakteri yang mampu melakukan proses proteolisis dan deaminasi di dalam rumen. Pada bakteri kelompok lipolitik pengaruh penghambatan pertumbuhan koloni memiliki nilai yang sangat kecil (4,3611 cfu/ml) dibandingkan dengan penghambatan pertumbuhan koloni kelompok bakteri lain. Hal ini terjadi karena sedikitnya jenis bakteri yang bersifat lipolitik di dalam rumen yang diakibatkan bentuk substrat yang umumnya terdapat dalam rumen berupa pakan yang kaya
28
akan serat seperti selulosa. Bakteri lipolitik yang umumnya terdapat pada rumen hewan ruminansia adalah Anaerovibrio lipolityca, Butyrivibrio fibrisolvens, Micrococcus sp, Eubacterium, dan Fusocilllus babrahamensis (Harfoot, et al. 1988). Pada hewan ruminansia bakteri yang mampu melakukan lipolisis dengan menggunakan metabolisme yang bersifat anerobik dan kombinasi media yang berbeda serta bersifat spesifik (Hungate, 1966). Kelompok bakteri lipolitik di dalam rumen melakukan proses pemecahan lipid serta melakukan biosintesis lipid untuk kebutuhan dirinya sendiri serta untuk ketersediaan asam lemak bagi hewan ruminansia itu sendiri. Proses pemecahan lipid oleh bakteri dilakukan dengan proses hidrolisis, fermentasi (gliserol dan galaktosa), hidrogenasi, dan beberapa proses lain (Parakkasi, 1998). Proses lipolisis yang dilakukan pada kelompok bakteri rumen adalah melakukan pelepasan asam lemak dari ikatan ester, melepaskan galaktosa dari ester galaktosil dari asam lemak lenoleat yang umumnya merupakan fraksi lemak yang berasal dari hijauan, sedangkan untuk proses fermentasi yang terjadi di dalam rumen yang dilepaskan dari proses hidrolisis rumen menghasilkan VFA (Volatile Fatty Acid), selain itu proses hidrogenasi terhadap lipid juga merupakan reaksi yang sering terjadi dalam proses fermentasi pemecahan lipid yang dilakukan oleh bakteri rumen. Pada proses hidrogenasi ini asam lemak tak jenuh mengalami hidrogenasi menjadi asam lemak yang bersifat jenuh sehingga akan mempermudah proses masuknya asam lemak tersebut menuju duodenum yang selanjutnya akan diserap oleh hewan ruminansia tersebut (Parakkasi, 1998). Nilai penghambatan yang terlihat rendah pada kelompok bakteri yang bersifat lipolitik hal ini juga dimungkinkan oleh adanya pengenceran cairan rumen sebelum proses inokulasi kedalam media spesifik dan jumlah kelompok bakteri lipolitik yang memang rendah di dalam cairan rumen yang diencerkan, namun demikian secara keseluruhan dapat teramati adanya kemampuan propolis untuk menghambat pertumbuhan koloni kelompok bakteri lipolitik.
29
Nilai Hambat Koloni Bakteri Rumen
Nilai Penghambatan Kkoloni (cfu/ml)
16 14 12 10 8 6 4 2 0
selulolitik 0,5
1
1,5
lipolitik 2
2,5
Konsentrasi Propolis (%(b/b)) proteolitik
lipolitik
3
proteolitik 3,5
4 selulolitik
Gambar 8. Grafik daya hambat pertumbuhan koloni oleh ekstrak propolis asal Pandeglang pada beberapa nilai konsentrasi Ekstrak propolis asal Pandeglang juga memberikan efek penghambatan terhadap kelompok bakteri selulolitik sebesar 4,8429 cfu/ml. Kelompok bakteri selulolitik adalah kelompok bakteri yang memiliki nilai populasi tertinggi di dalam rumen. Kelompok bakteri selulolitik melakukan proses pemecahan pakan yang berupa selulosa. Selulosa terhidrolisis menjadi molekul-molekul sakarida di dalam rumen oleh bakteri-bakteri anaerobik yang selanjutnya akan digunakan sebagai substrat fermentasi di dalam rumen. Proses fermentasi yang dilakukan oleh kelompok bakteri selulolitik di dalam rumen merupakan proses pemecahan selulosa yang reaksinya bersifat spesifik memutuskan ikatan ß (1-4) glikosidik, pada proses selanjutnya fermentasi selulosa yang telah terpecah menjadi molekulmolekul sakarida akan menghasilkan VFA yang terdiri dari asetat, propionat, dan butirat dengan hasil samping berupa gas metana (CH4) dan karbon dioksida (CO2).
30
Pada proses fermentasi di dalam rumen adanya gas metana yang dihasilkan dari proses fermentasi akan berakibat pada hilangnya energi kimia pakan tercerna pada hewan ruminansia (Thalib, et al. 2004). Proses pembentukan gas metana melalui proses fermentasi di dalam rumen dapat dipengaruhi dengan beberapa cara yang bertujuan mengurangi hilangnya energi kimia pakan yang tercerna. Proses yang digunakan pada prinsipnya adalah melakukan inhibisi produksi gas metana yang berasal dari keseluruhan proses yang terjadi pada fermentasi di dalam rumen. Pada kelompok bakteri selulolitik pengaruh ekstrak propolis asal Pandeglang terlihat mampu mempengaruhi pertumbuhan koloninya, sehingga penghambatan ini memberikan adanya kemampuan ekstrak propolis asal Pandeglang untuk mempengaruhi ketiga jenis kelompok bakteri yang penting dalam proses fermentasi pakan di dalam rumen hewan ruminansia. Bakteri proteolitik menyediakan protein ataupun asam amino bagi hewan ruminansia yang sangat dipengaruhi oleh substrat fermentasi yang diperoleh dari pakan. Pada rumen terdapat bakteri dalam jumlah yang sangat besar serta dengan nilai keragaman yang besar dengan jenis Gram negatif maupun Gram positif didalamnya. Secara normal jumlah bakteri di dalam rumen sangat tinggi dengan nilai kandungan sel (>1010 sel per g), dan bakteri memiliki peranan dominan dalam keseluruhan proses fermentasi di dalam rumen hewan ruminansia (James, et al. 2001). Ekstrak propolis secara keseluruhan memiliki efek penghambatan pada setiap kelompok bakteri namun memiliki nilai penghambatan yang berbeda, namun secara konsentrasi efisiensi penggunaan ekstrak propolis juga perlu diperhatikan. Pada nilai konsentrasi propolis yang terendah (0,5 %) daya hambat pertumbuhan koloni terbesar dibandingkan tiga jenis bakteri cairan rumen dialami oleh bakteri kelompok proteolitik. Hal ini menunjukkan adanya kemampuan ekstrak propolis untuk menghambat bakteri kelompok proteolitik tanpa mengganggu pertumbuhan bakteri cairan rumen yang penting untuk proses fermentasi di dalam rumen. Pada nilai konsentrasi yang terendah ekstrak propolis memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan koloni kelompok bakteri proteolitik. Penghambatan pada kelompok bakteri proteolitik semakin besar nilainya dengan bertambahnya nilai konsentrasi propolis. Hal ini diakibatkan oleh
31
kandungan ekstrak propolis yang semakin besar pada konsentrasi terbesar. Efek propolis asal Pandeglang pada bakteri proteolitik juga dapat dijelaskan dengan adanya perbedaan pada komposisi struktur dinding sel bakteri dimana pada kelompok bakteri proteolitik terdapat dua jenis Gram positif dan Gram negatif. Pada kelompok bakteri proteolitik ber-Gram negatif memiliki komposisi yang lebih kompleks pada dinding selnya dibandingkan dengan dinding sel bakteri berGram positif, yang mengakibatkan bakteri Gram negatif tersebut lebih dapat bertahan terhadap infiltrasi propolis. Hal ini mengakibatkan penghambatan terhadap pertumbuhan koloni bakteri kelompok bakteri proteolitik membutuhkan nilai konsentrasi ekstrak propolis yang lebih tinggi. Adanya nilai penghambatan yang tinggi pada satu jenis kelompok bakteri proteolitik di dalam cairan rumen memberikan suatu Gambaran adanya potensi propolis untuk mengontrol laju pertumbuhan koloni bakteri di dalam rumen. Konsentrasi
ekstrak
propolis
yang
berbeda
memberikan
efek
penghambatan yang berbeda pada setiap kelompok bakteri cairan rumen dengan nilai pengeceran koloni yang berbeda, maka adanya faktor pengenceran bakteri juga menjadi suatu penentu jumlah koloni yang mempengaruhi nilai penghambatan pertumbuhan koloni kelompok bakteri oleh ekstrak propolis asal Pandeglang. Pengeceran koloni bakteri cairan rumen dilakukan dengan menggunakan nilai pengenceran 10-2, 10-4, 10-6, dan 10-8. Pengenceran koloni bakteri secara teori bertujuan untuk menurunkan nilai kerapatan koloni bakteri sehingga akan mempermudah pengamatan dalam menentukan jumlah sel bakteri yang tumbuh dalah suatu cawan petri (Owens, et al. 1990; Shyamapada, et al. 2003; Makut, et al. 2008). Pada Tabel 2 dibawah ini dapat dilihat adanya pengaruh pengenceran cairan rumen yang mempengaruhi jumlah penentuan penghambatan pertumbuhan koloni kelompok bakteri uji.
32
Tabel 2, Hasil penentuan pengaruh pengenceran terhadap nilai hambat pertumbuhan koloni beberapa kelompok bakteri cairan rumen Pengenceran Bakteri
Nilai hambat pertumbuhan koloni (cfu/ml)
Proteolitik Lipolitik Selulolitik 10-2 7,75 3,25 5,44* -4 * 10 11,61 2,92 4,03 10-6 4,69 1,87 3,33 10-8 3,75 3,43* 2,20 Keterangan : Superskrip (*) yang berbeda nyata dengan menggunakan derajat alpha 0,05 dilakukan dengan sembilan ulangan pada setiap konsentrasi propolis dan berbeda nyata (P<0,05)
Pada Tabel 2 dapat teramati adanya nilai hambatan yang terjadi karena adanya proses pengenceran, proses pengenceran ini tidak secara langsung mempengaruhi penghambatan pertumbuhan koloni namun dengan mempengaruhi nilai pertumbuhan koloni di dalam media uji dan media kontrol. Cairan rumen yang tidak diencerkan terlebih dahulu sebelum inokulasi
memberikan
pertumbuhan koloni yang sangat rapat di dalam media sehingga mempersulit proses pengamatan untuk perhitungan jumlah bakteri. Penentuan nilai aktivitas penghambatan propolis juga ditentukan dengan nilai pertumbuhan kelompok bakteri uji pada dua media spesifik, sehingga selisih antara media kontrol dengan media uji merupakan nilai penghambatan dari pertumbuhan kelompok bakteri uji. Pada setiap kelompok bakteri uji baik proteolisis, lipolitik, dan selulolitik memberikan nilai pertumbuhan yang berbeda setelah proses pengenceran. Secara teori pengenceran bertujuan untuk menurunkan tingkat populasi suatu bakteri di dalam media pertumbuhan sehingga akan memungkinkan proses perhitungan secara lebih teliti (Ratna. 1993; Jennifer. 2001; Basquet, et al . 2004). Perhitungan pada setiap cawan petri dapat dilakukan dengan memperhatikan jumlah koloni yang muncul, jumlah koloni yang teramati merupakan suatu indeks jumlah organisme yang dapat hidup di dalam sampel (Ratna. 1993). Pada kelompok bakteri lain seperti proteolitik, lipolitik, dan selulolitik dapat terlihat bahwa efek pengenceran memberikan efek pertumbuhan koloni yang berbeda pada setiap kelompok bakteri. Bakteri di dalam rumen umumnya memiliki jumlah yang sangat tinggi (>1010 sel dalam setiap gram), dan memiliki fungsi sangat dominan dalam proses fermentasi di dalam rumen (James B, et al.
33
2001). Bakteri yang dapat tumbuh di dalam media bersifat spesifik dengan penggunaan substrat yang beragam dalam jumlah yang sedikit dibandingkan di dalam rumen akan mengakibatkan jumlah bakteri yang tumbuh semakin sedikit dibandingkan dengan jumlah yang ada di dalam rumen, sedangkan adanya efek pengenceran pada setiap kelompok bakteri memperlihatkan adanya perbedaan pertumbuhan di dalam media yang spesifik untuk proteolisis, lipolitik, dan selulolitik. Pada bakteri proteolisis nilai pengenceran 10-4 memberikan nilai yang optimal dalam pengamatan koloni dimana dapat dilihat adanya nilai penghambatan pertumbuhan yang besar dibandingkan pada kelompok bakteri lain dengan nilai (11,61 cfu/ml). Bakteri proteolisis di dalam rumen memiliki nilai populasi terbesar setelah bakteri selulolitik dan jumlah populasi keseluruhan populasi bakteri di dalam rumen secara umum dapat berubah dengan adanya pengaruh dari jenis pakan serta perubahan kondisi nilai pH, dan kondisi produksi VFA yang sangat mempengaruhi laju fermentasi dan perolehan pakan oleh hewan ruminansia (Wallace. 1994; Kamra. 2005). Pada rumen nilai pH sangat mempengaruhi jumlah populasi bakteri di dalam rumen, saat nilai pH rendah maka kondisi pertumbuhan bakteri akan mengalami penurunan yang diikuti dengan peningkatan pertumbuhan protozoa rumen sedangkan pada kondisi yang berkebalikan saat nilai pH meningkat maka jumlah pertumbuhan bakteri akan meningkat. Pada proses perolehan pakan hewan ruminansia produksi VFA yang dihasilkan dari proses fermentasi di dalam rumen sangat mempengaruhi, seluruh pakan yag diperoleh oleh hewan ruminansia melalui proses fermentasi di dalam rumen yang sangat berbeda dengan hewan monogastris. Rumen memiliki fungsi sebagai penyedia nutrisi bagi hewan ruminansia maupun sebagai habitat bagi mikroorganisme baik yeast, bakteri maupun protozoa yang membantu proses pencernaan secara fermentatif, dalam proses fermentasi ini bentuk pakan yang berupa pakan kaya serat seperti hijauan yang berasal dari tumbuhan maupun bentuk nutrisi komplek lainnya diubah menjadi VFA sebagai sumber energi bagi hewan ruminansia tersebut. Hewan ruminansia memiliki perbedaan dalam penggunaan komponen pakan yang berupa protein, karbohidrat,
34
dan lemak. Pada hewan ruminasia protein dan karbohidrat mengalami proses fermentasi di dalam rumen dan retikulum oleh mikroba membentuk VFA yang merupakan energi utama pada hewan ruminansia, sedangkan untuk metabolisme lemak hewan non ruminansia atau monogastris hanya dapat memanfaatkan dalam bentuk
senyawa
lemak
sederhana
sedangkan
pada
ruminansia
dapat
memenfaatkan senyawa yang lebih kompleks seperti fosfolipid atau lesitin (Arora. 1989; James, et al. 2001). Pada proses fermentasi pakan yang berupa protein, karbohidrat yang berasal dari selulosa, maupun lemak mengalami proses hidrolisis dan pembentukan senyawa turunan maupun VFA yang berfungsi sebagai sumber nutrisi bagi hewan ruminansia yang dilakukan oleh seluruh bakteri maupun mikroorganisme yang bersifat anaerobik di dalam rumen. Setelah proses ini barulah nutrisi hasil fermentasi dapat dimanfaatkan oleh hewan ruminansi tersebut dengan terlebih dahulu diserap melalui omasum, dan usus (Arora. 1989). Pada rumen terdapat beberapa jenis bakteri yang berfungsi melakukan fermentasi dan pembentukan senyawa-senyawa sederhana yang dapat diserap oleh hewan ruminansia guna memenuhi kebutuhan nutrisi di dalam metabolismenya. Konsumsi pakan yang diperoleh oleh hewan ruminansia selanjutnya akan diproses pada mulut secara mekanik untuk merubah bentuk pakan secara mekanik yang dilanjutkan dengan proses fermentasi di dalam rumen. Pada proses di dalam rumen ini seluruh mikroorganisme berperan dalam penyediaan nutrisi bagi kebutuhan hewan ruminansia tersebut dalam hal ini terdapat tiga jenis konsumsi pakan yang dijadikan sebagai substrat utama yang berupa protein, karbohidrat, dan lemak (Hobson. 1988; Arora. 1989; Parakkasi. 1999). Untuk substrat yang berupa protein bakteri akan melakukan proses fermentasi yang meliputi reaksi hidrolisis protein oleh bakteri untuk penyediaan mesdia bagi proses fermentasi selanjunya yang berupa peptida dan asam amino. Peptida dan asam amino di dalam rumen merupakan suatu senyawa antara yang dihasilkan oleh bakteri dalam suatu proses konversi protein menjadi amonia, namun terdapat beberapa peptida yang dapat bertahan dari proses fermentasi untuk beberapa saat guna keluar dari proses pencernaan rumen yang selanjunya akan dilewatkan melalui dinding rumen, namun secara keseluruhan peptida dan asam amino oleh mikroorganisme
35
bakteri maupun ruminansia akan meningkat setelah proses proteolisis kemudian akan dimetabolisme kembali untuk pembentukan kembali protein atau diubah menjadi amonia (Wallace. 1996). Substrat berupa serat yang merupakan bentuk polimer yang berasal dari karbohidrat yang umumnya berupa selulosa berasal dari tumbuhan akan mengalami proses fermentasi di dalam rumen. Selulosa, hemiselulosa, dan pektin dapat dicerna dengan baik sedangkan lignin tidak dapat dicerna sama sekali. Lignin mengurangi kemampuan pencernaan terhadap karbohidrat melalui pembentukan ikatan hidrogen pada sisi aktif sehingga membatasi aktivitas selulase (Arora. 1989). Selulosa mengalami proses fermentasi yang sama dengan pati. Selulosa secara fermentasi anaerobik akan diubah menjadi sakarida yang kemudian akan termetabolisme oleh bakteri menjadi VFA yang berupa senyawa asetat, propionat, butirat, dan suksinat serta CO2, H2 dan H2O yang juga berperan dalam pembentukan metan (CH4) oleh bakteri yang memiliki kemampuan metanogenesis di dalam rumen. Lipid yang terdapat didalam pakan juga mengalami fermentasi di dalam rumen, lipid pada awal fermentasi diubah dalam bentuk asam-asam lemak melalui proses hidrolisis ikatan ester selanjutnya reaksi biohidrogenasi pada asam lemak tak jenuh untuk menghasilkan asam lemak jenuh sehingga akan mempermudah penyerapan pada duodenum (Parakkasi, 1998). Proses fermentasi pada pencernaan hewan ruminansia secara keseluruhan menghasilkan beberapa jenis kelompok senyawa penting antara lain VFA, metana, amonia, nitrogen, asam amino, dan asam lemak yang berasal dari keseluruhan proses komsumsi pakan. Pada proses fermentasi yang terjadi di dalam rumen jumlah pakan serta populasi kelompok bakteri sangat mempengaruhi produksi VFA, metana, amonia dan nitrogen amonia (N-NH3) yang terbentuk. Secara alami di dalam rumen jumlah populasi bakteri telah pengalami pengaturan dengan adanya protozoa serta efek dari perubahan nilai pH di dalam rumen. Pada proses di dalam rumen terdapat berbagai jenis reaksi kimia yang berhubungan dengan metabolisme fermentatif yang dilakukan terhadap substrat yang berasal dari pakan oleh bakteri yang bersifat anaerobik. Substrat yang terdapat di dalam rumen diubah menjadi bentuk yang lebih sederhana untuk mempermudah proses penyerapan nutrisi oleh hewan ruminansia. VFA sebagai sumber energi utama
36
bagi hewan ruminansia merupakan bentuk perubahan utama proses fermentasi, sedangkan untuk senyawa-senyawa lain yang dihasilkan dari proses ini seperti CO2, metana, amonia, dan nitrogen-amonia digunakan oleh bakteri untuk melakukan sintesis asam amino penyusun protein bakteri untuk ketersediaan protein bagi hewan ruminansia. Metana yang dihasilkan dari fermentasi bakteri di dalam rumen haruslah diturunkan nilai produksinya sebab, adanya metana akan merugikan tubuh inang. Proses pembebasan metana merupakan penghilangan energi. Energi yang dibebaskan selama pembentukkan metana digunakan mikroba, namun tubuh inang dapat menggunakan secara lebih efisien jika elekttron-elektron yang dipakai untuk membentuk metana dialihkan menjadi produk tereduksi lain seperti VFA (Bryant, 1965). Setelah memperhatikan keseluruhan pengaruh konsentrasi ekstrak propolis dan adanya efek pengenceran bakteri terhadap kemampuan penghambatan pertumbuhan kelompok bakteri uji maka didapatkan suatu data hubungan antara jumlah koloni serta perlakuan konsentrasi ekstrak propolis terhadap kemampuan penghambatan pertumbuhan koloni kelompok bakteri uji yang ditentukan dengan menggunakan penilaian KHTM seperti pada Tabel 3. Nilai analisis yang diperoleh menunjukkan pada perlakuan penggunaan konsentrasi ekstrak propolis sebesar 4% memberikan efek terhadap keseluruhan kelompok bakteri uji dengan nilai respon penghambatan yang berbeda.
37
Tabel 3, Hasil penentuan nilai KHTM dengan interaksi konsentrasi ekstrak propolis dan pengenceran kelompok bakteri uji kelompok proteolisis
Nilai KHTM (cfu/ml)
kelompok lipolitik
Nilai KHTM (cfu/ml)
kelompok selulolitik
Nilai KHTM (cfu/ml)
A1B6C3
0,00
A2B6C1
0,00
A3B3C4
1,00
A1B7C4
1,00
A2B5C4
0,22
A3B6C3
1,89
A1B2C3
1,50
A2B3C1
1,00
A3B1C4
2,00
A1B5C4
2,00
A2B3C2
1,00
A3B2C3
2,00
A1B1C3
3,00
A2B3C3
1,00
A3B4C4
2,00
A1B1C4
3,00
A2B5C3
1,00
A3B2C4
2,22
A1B3C1
3,00
A2B2C3
1,17
A3B5C4
2,22
A1B4C4
3,00
A2B7C3
1,22
A3B6C4
2,29
A1B6C1
3,00
A2B4C1
1,33
A3B7C4
2,33
A1B3C4
4,00
A2B5C4
1,33
A3B1C3
3,00
A1B5C3
4,00
A2B6C3
1,33
A3B3C3
3,00
A1B6C4
4,00
A2B1C3
2,00
A3B5C3
3,00
A1B2C4
5,00
A2B4C2
2,00
A3B6C2
3,11
A1B4C3
5,00
A2B8C2
2,67
A3B5C2
3,22
A1B5C1
5,00
A2B1C4
2,78
A3B4C3
3,44
A1B7C1
6,00
A2B5C2
2,89
A3B8C4
3,56
A1B8C3
7,00
A2B2C2
3,00
A3B1C2
4,00
A1B3C3
8,00
A2B4C3
3,00
A3B3C1
4,00
A1B5C2
8,00
A2B6C1
3,00
A3B3C2
4,00
A1B7C3
8,00
A2B3C4
3,56
A3B4C2
4,00
A1B8C4
8,00
A2B6C2
3,89
A3B7C1
4,00
A1B4C2
9,00
A2B7C2
3,89
A3B7C2
4,00
A1B1C1
10,00
A2B1C2
4,00
A3B8C2
4,14
A1B2C1
10,00
A2B8C3
4,00
A3B1C1
5,11
A1B4C1
10,00
A2B7C4
4,33
A3B2C1
5,11
A1B6C2
10,00
A2B6C4
4,67
A3B8C3
5,11
A1B7C2
10,00
A2B2C4
4,78
A3B7C3
5,22
A1B1C2
12,00
A2B1C1
5,00
A3B4C1
5,56
A1B2C2
12,00
A2B2C1
5,00
A3B2C2
5,78
A1B8C1
15,00
A2B7C1
5,00
A3B5C1
5,78
A1B3C2
15,89
A2B8C1
5,00
A3B8C1
6,44
A1B8C2
**
16,00
A2B8C4
****
5,78
A3B6C1
***
7,56
Keterangan : A1,A2,A3,A4 secara berurutan adalah kelompok bakteri proteolisis, lipolitik, selulolitik, dan Salmonella sp. B1-B8 adalah taraf konsentrasi propolis dari 0,5-4% .C1-C4 adalah taraf pengenceran koloni bakteri dari 102-108. * pengaruh terbesar penghambatan dibandingkan dengan kelompok perlakuan lain pada bakteri Salmonella sp, ** pengaruh kedua terbesar penghambatan pada kelompok perlakuan lain pada kelompok bakteri proteolisis, *** pengaruh ketiga terbesar penghambatan pada kelompok perlakuan lain pada kelompok bakteri selulolitik, **** pengaruh terbesar penghambatan pada kelompok perlakuan lain pada kelompok bakteri lipolitik. Dengan derajat alpha 0,05 dilakukan dengan sembilan ulangan pada setiap konsentrasi propolis dan berbeda nyata (P<0,05)
38
Nilai terbesar penghambatan adalah pada kelompok bakteri uji proteolisis sebesar (16,00 cfu/ml) yang nilainya lebih tinggi dibandingkan nilai penghambatan untuk kelompok bakteri selulolitik (7,56 cfu/ml) dan lipolitik (5,78 cfu/ml). Ekstrak propolis asal Pandeglang secara keseluruhan memberikan efek terhadap pertumbuhan kelompok bakteri uji, kemampuan propolis asal Pandeglang ini sesuai dengan penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Angraini (2006), Lasmayanty (2007), dan Tukan (2008) bahwa propolis Trigona spp asal Pandeglang
memiliki
kemampuan
dalam
menghambat
pertumbuhan
mikroorganisme khususnya bakteri. Propolis memiliki pengaruh pada kelompok bakteri hidrolitik di dalam rumen ekstrak propolis memiliki efek penghambatan yang beragam namun efek terbesar terjadi pada kelompok bakteri proteolisis dibandingkan dengan kelompok bakteri lipolitik dan kelompok bakteri selulolitik. Ekstrak propolis asal Pandeglang yang memiliki kemampuan penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri dirumen memungkinkan untuk menjaga kestabilan mikroflora di dalam rumen ataupun manipulasi rumen. Manipulasi rumen adalah suatu bentuk sistem proses yang dilakukan untuk mempengaruhi proses fermentasi di dalam rumen sehingga memungkinkan peningkatan perubahan pakan menjadi produk hewani (Baran, 1999). Pada manipulasi rumen ini terdapat lima hal utama yang perlu diperhatikan dalam proses perubahan pakan menjadi nutrisi bagi hewan ruminansia yaitu meningkatkan kemampuan daya cerna terhadap karbohidrat struktural, melindungi protein yang berasal dari pakan dari proses degradasi bakteri proteolisis di dalam rumen, merubah secara mikroba produk akhir dari proses fermentasi, meningkatkan jumlah pertumbuhan mikroba, serta menurunkan laju pembentukan NH3 dan metana dari nitrogen non protein (NPN) (Van Nevel, dan Mayer. 1988). Pada penelitian yang dilakukan oleh Sittisak Khampa dan Metha Wanapat (2007) terhadap pengaruh suplementasi asam organik terhadap manipulasi rumen menyebabkan nilai pH yang tetap tinggi, mengoptimumkan amonia-nitrogen (NH3-N) serta menurunkan produksi metana dan meningkatkan sintesis protein bakteri serta VFA yang berguna bagi tubuh inang. Ekstrak propolis asal pandeglang memiliki potensi sebagai pelindung protein yang dibutuhkan dalam
39
proses manipulasi rumen maupun mempengaruhi mikroflora rumen dengan menghambat pertumbuhan kelompok bakteri yang bersifat proteolisis, sedangkan untuk kelompok bakteri yang bersifat lipolitik dan selulolitik yang penting dalam proses pembentukan VFA tidak memiliki pengaruh besar dalam penghambatan pertumbuhannya walaupun pada nilai konsentrasi ekstrak propolis tertinggi (4% (b/v)) hal ini dapat diperhatikan pada Gambar 9 dibawah ini
KELOMPOK PROTEOLITIK
Nilai Penghambatan koloni (cfu/ml)
16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Konsentrasi propolis (% (b/b)) 1/100
1/10000
3,00
1/100000000 1/1000000 1/10000 1/100 3,50
1/1000000
4,00 1/100000000
40
KELOMPOK LIPOLITIK
Nilai Penghambatan koloni (cfu/ml)
6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Konsentrasi propolis (%(b/b)) 1/100
1/10000
1/100000000 1/1000000 1/10000 1/100 3,50
4,00
1/1000000
1/100000000
KELOMPOK SELULOLITIK
Nilai Penghambatan Koloni (cfu/ml)
8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 1/100000000 1/1000000 1/10000 1/100
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
2,50
3,00
3,50
Konsentrasi propolis (% (b/b)) 1/100
1/10000
1/1000000
4,00
1/100000000
Gambar 9. Grafik nilai KHTM pada masing- masing kelompok bakteri cairan rumen
41
Senyawa yang memiliki sifat antimikroba antaranya adalah alkohol, senyawa-senyawa fenolik, klor, iodium dan etilen oksida (Palezar dan Chan, 1988). Senyawa fenolik memiliki beberapa kelompok diantaranya senyawa flavonoid, senyawa fenol hidrokuinon, dan tanin. Propolis mengadung flavonoid yang merupakan senyawa antibakteri, dan merupakan satu dari kelompok senyawa polifenolik dengan jenis terbanyak adalah aglikon. Senyawa aglikon adalah flavonoid dalam tumbuhan yang terikat pada gula sebagai glikosida, dan memiliki sifat menghambat pertumbuhan bakteri secara kuat. Di alam aglikon ditemukan juga pada buah jeruk. Keberadaan aglikon di dalam sarang lebah dimungkinkan karena lebah mengkoleksi resin propolis menggunakan enzim βglukosidase dari kelenjar hypoharingeal. Aglikon dan podofillotoksin merupakan lignan paling aktif alami dan mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri. Senyawa lignin pada kelompok bakteri rumen yang memiliki kemampuan selulolitik memiliki pengaruh melalui proses pemhambatan kerja dari enzim selulase yang diakibatkan adanya kemampuan lignin untuk membentuk ikatan hidrogen dengan sisi aktif enzim. Ekstrak propolis asal Pandeglang memiliki kemampuan penghambatan terhadap kelompok bakteri uji terutama pada jenis kelompok bakteri proteolitik . Mekanisme penghambatan yang terjadi pada kelompok bakteri uji yang berasal dari cairan rumen dapat dijelaskan dengan keberadaan senyawa-senyawa yang terdapat di dalam ekstrak propolis asal Pandeglang. Senyawa yang terdapat di dalam ekstrak propolis asal Pandeglang terdiri dari senyawa tanin, flavonoid, steroid, dan alkaloid, namun keberadaan alkaloid dalam ekstrak propolis sangat dipengaruhi oleh perbedaan waktu dan pengkoleksian sampel propolis (Tukan. 2008). Komposisi suatu zat aktif di dalam propolis berbeda dipengaruhi oleh tumbuhan asal resin, iklim, waktu pengkoleksian dan jenis lebah (Bankova, 2000). Senyawa tanin yang terdapat pada ekstrak propolis merupakan satu faktor penghambatan beberapa kelompok bakteri rumen. Senyawa tanin pada beberapa penelitian memberikan efek terhadap penghambatan proses degradasi protein di dalam rumen melalui penghambatan inhibisi pembentukan kompleks substrat enzim terutama pada kelompok enzim proteolitik. Tanin yang terdapat didalam rumen setelah meningkatnya kemampuan adaptasi beberapa kelompok bakteri
42
rumen juga akan mengalami degradasi (Nelson, et al. 1998). Senyawa flavonoid dan alkaloid juga memberikan pengaruh terhadap penghambatan pertumbuhan koloni bakteri rumen. Senyawa flavonoid dan alkaloid memiliki kemampuan aktivitas biologis sehingga mengakibatkan terjadinya penghambatan pertumbuhan koloni bakteri rumen maupun protozoa (Hart, et al. 2007). Nilai penghambatan yang tinggi pada kelompok bakteri proteolitik dikarenakan adanya komplektisitas senyawa serta adanya kandungan senyawa spesifik yang terdapat pada ekstrak propolis asal Pandeglang. Pada penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Tukan (2008) didapatkan senyawa senyawa yang memiliki kemiripan dengan senyawa asam lenoleat, dan senyawa Cyloartenol
yang memiliki nilai kelimpahan
tertinggi. Pada beberapa penelitian yang menggunakan penambahan suatu jenis minyak atau bentuk turunannya yang berupa asam lemak diketahui bahwa hal ini akan mengakibatkan terjadinya proses penyabunan di dalam rumen yang hampir sama mekanismenya dengan penggunaan senyawa saponim sebagai senyawa manipulator rumen. Proses penyabunan akan mengakibatkan tergangunya tegangan permukaan sehingga keseluruhan dinding sel bakteri akan mengalami perubahan tekanan osmotik sehingga akan mematikan sel bakteri, namun pada senyawa minyak atau bentuk turunannya yang berupa asam lemak proses kematian sel bakteri diawali dengan kemampuan senyawa minyak yang bersifat hidrofobik dan memiliki afinitas dengan lipid membran sel bakteri, sehingga hal ini akan mengganggu permeabilitas membran sehingga cairan sitosol dapat keluar dan sel mangalami kehilangan pola pergerakan proton yang berakhir dengan proses lisis sel bakteri. (Hart, et al. 2007). Struktur senyawa dan nama senyawa yang terdapat pada ekstrak propolis dapat dilihat pada Lampiran 6
Penentuan Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum Pada Bakteri Salmonella sp Salmonella sp umumnya terdapat didalam rumen, bakteri ini dapat menginfeksi hewan ruminansia melalui pakan (Bender, et al. 1997). Pada penelitian ini keberadaan bakteri Salmonella sp didapatkan pada cairan rumen dengan bentuk koloni yang spesifik dibandingkan dengan koloni bakteri lain, hal ini yang mengakibatkan dipilihnya penggunaan media spesifik untuk lebih
43
memudahkan proses penentuan jenis spesies bakteri. Pada Tabel 4 dapat dilihat nilai
konsentrasi
ekstrak
propolis
terendah
(0,5%(b/b)
memiliki
nilai
penghambatan sebesar 8,75 cfu/ml sedangkan pada nilai konsentrasi ekstrak propolis terbesar (4%(b/b) memiliki nilai penghambatan terbesar dibandingkan kelompok bakteri cairan rumen yaitu 13,69 cfu/ml. Tabel 4, Hasil penentuan KHTM ekstrak propolis asal Pandeglang terhadap Salmonella sp Konsentrasi Propolis (g/100 ml)
Nilai hambat pertumbuhan koloni (cfu/ml)
Salmonella sp 0,5 8,75 1 8,00 1,5 7,83 2 8,97 2,5 10,00 3 10,25 3,5 10,61 4 13,69 Keterangan : Dengan derajat alpha 0,05 dilakukan dengan sembilan ulangan pada setiap konsentrasi propolis dan berbeda nyata (P<0,05)
Nilai penghambatan yang didapatkan pada bakteri Salmonella sp dapat diakibatkan oleh adanya komponen kimia yang beragam yang terkandung pada propolis asal Pandeglang. Pada penelitian yang dilakukan oleh Tukan (2008) didapatkan bahwa pada propolis yang berasal dari Pandeglang didapatkan adanya kelompok senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, dan tanin. Nilai konsentrasi propolis juga memberikan efek penghambatan yang berbeda dengan semakin tingginya nilai konsentrasi maka semakin besar nilai penghambatan pada kelompok bakteri Salmonella sp. Pada Gambar 10 nilai konsentrasi tertinggi ekstrak propolis asal Pandeglang memberikan efek penghambatan sebesar 13,69 cfu/ml pada kelompok bakteri Salmonella sp. Bakteri Salmonella sp termasuk dalam keluarga Enterobacteriaceae yang memiliki kedekatan dengan E. coli dan Shigella. Salmonella sp juga termasuk dalam kelompok bakteri Gram negatif yang memiliki sifat dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan bakteri Gram positif. Salmonella sp pada umumnya merupakan bakteri patogen yang menyebabkan terjadinya suatu penyakit pada hewan yang menjadi tempat
44
hidupnya, bakteri ini dapat mengganggu proses pencernaan pada bagian rumen dan bagian alat cerna lain selain rumen. Bakteri Salmonella sp juga mampu melakukan hidrolisis terhadap protein-protein terutama protein-protein yang memiliki unsur sulfida di dalam struktur, hal ini yang dimanfaatkan untuk memvisualisasikan koloni bakteri Salmonella sp dengan menggunakan media spesifik.
Salmonella sp nilai hambat pertumbuhan koloni (cfu/ml)
16 14 12 10 8 6 4 2 0 0,5
1
1,5
2
2,5
konsentrasi propolis (g/ml)
3
salmonella sp 3,5
4
salmonella sp
Gambar 10. Grafik daya hambat pertumbuhan koloni Salmonella sp oleh ekstrak propolis asal Pandeglang Pada media spesifik seperti pada XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) kemampuan Salmonella sp untuk mereduksi sulfida dari asam amino protein akan mengakibatkan terbentuknya H2S yang akan memberikan ciri spesifik pada media dengan bentuk koloni yang berwarna merah dengan pusat yang berwarna hitam pada bagian pusatnya. Bakteri Salmonella sp yang bersifat Gram negatif dan memiliki kemampuan melakukan proteolisis memungkinkan salmonella menjadi kompetitor dalam proses proteolisis di dalam rumen.
45
Penyediaan protein ataupun asam amino bagi hewan ruminansia memang dilakukan oleh bakteri yang sangat dipengaruhi oleh substrat fermentasi yang diperoleh dari pakan. Pada rumen terdapat bakteri dalam jumlah yang sangat besar serta dengan nilai keragaman yang besar dengan jenis Gram negatif maupun Gram positif didalamnya. Secara normal jumlah bakteri di dalam rumen sangat tinggi dengan nilai kandungan sel (>1010 sel per g), dan bakteri memiliki peranan dominan dalam keseluruhan proses fermentasi di dalam rumen hewan ruminansia (James, et al. 2001). Ekstrak propolis secara keseluruhan memiliki efek penghambatan pada setiap kelompok bakteri namun memiliki nilai penghambatan yang berbeda, namun secara konsentrasi efisiensi penggunaan ekstrak propolis juga perlu diperhatikan. Pada nilai konsentrasi propolis yang terendah (0,5 %) daya hambat pertumbuhan koloni terbesar dibandingkan tiga jenis bakteri cairan rumen dialami oleh bakteri Salmonella sp (8,7500 cfu/ml). Hal ini menunjukkan adanya kemampuan ekstrak propolis untuk menghambat bakteri Salmonella sp tanpa mengganggu pertumbuhan bakteri cairan rumen yang penting untuk proses fermentasi di dalam rumen. Pada nilai konsentrasi yang terendah ekstrak propolis memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri yang umumnya bersifat patogen pada hewan ruminansia seperti Salmonella sp. Penghambatan pada bakteri Salmonella sp semakin besar nilainya dengan bertambahnya nilai konsentrasi propolis. Hal ini diakibatkan oleh kandungan ekstrak propolis yang semakin besar pada konsentrasi terbesar. Efek propolis asal Pandeglang pada Salmonella sp juga dapat dijelaskan dengan adanya perbedaan pada komposisi struktur dinding sel bakteri dimana salmonella sp adalah salah satu jenis bakteri Gram negatif yang memiliki komposisi yang lebih kompleks pada dinding selnya dibandingkan dengan dinding sel bakteri Gram positif, yang mengakibatkan bakteri Gram negatif tersebut lebih dapat bertahan terhadap infiltrasi propolis. Hal ini
mengakibatkan
penghambatan
terhadap
pertumbuhan
koloni
bakteri
Salmonella sp membutuhkan nilai konsentrasi ekstrak propolis yang lebih tinggi. Hal ini bersesuaian dengan penelitian yang dilakukan oleh Tukan Tukan pada tahun 2008 dengan menggunakan ekstrak propolis asal Pandeglang membutuhkan konsentrasi yang tinggi untuk menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella sp.
46
Adanya efek yang berbeda pada setiap konsentrasi terhadap kelompok bakteri cairan rumen dan bakteri Salmonella sp memberikan suatu Gambaran adanya potensi propolis untuk mengontrol laju pertumbuhan koloni bakteri di dalam rumen. Konsentrasi
ekstrak
propolis
yang
berbeda
memberikan
efek
penghambatan yang berbeda pada setiap kelompok bakteri cairan rumen dengan nilai pengeceran koloni yang berbeda, maka adanya faktor pengenceran bakteri juga menjadi suatu penentu jumlah koloni yang mempengaruhi nilai penghambatan pertumbuhan koloni kelompok bakteri oleh ekstrak propolis asal Pandeglang. Pengeceran koloni bakteri Salmonella sp dilakukan dengan menggunakan nilai pengenceran 10-2, 10-4, 10-6, dan 10-8. Pengenceran koloni bakteri secara teori bertujuan untuk menurunkan nilai kerapatan koloni bakteri sehingga akan mempermudah pengamatan dalam menentukan jumlah sel bakteri yang tumbuh dalah suatu cawan petri (Owens, et al. 1990; Shyamapada, et al. 2003; Makut, et al. 2008). Pada Tabel 5 dibawah ini dapat dilihat adanya pengaruh pengenceran cairan rumen yang mempengaruhi jumlah penentuan penghambatan pertumbuhan koloni kelompok bakteri uji. Tabel 5, Hasil penentuan pengaruh pengenceran terhadap nilai hambat pertumbuhan koloni Salmonella sp Pengenceran Bakteri
Nilai hambat pertumbuhan koloni (cfu/ml) Salmonella sp 10-2 15,94* -4 10 11,89 10-6 5,54 10-8 5,68 Keterangan : Superskrip (*) yang berbeda nyata dengan menggunakan derajat alpha 0,05 dilakukan dengan sembilan ulangan pada setiap konsentrasi propolis dan berbeda nyata (P<0,05)
Pada Tabel 5 dapat teramati adanya nilai hambatan yang terjadi karena adanya proses pengenceran, proses pengenceran ini tidak secara langsung mempengaruhi penghambatan pertumbuhan koloni namun dengan mempengaruhi nilai pertumbuhan koloni di dalam media uji dan media kontrol. Cairan rumen yang tidak diencerkan terlebih dahulu sebelum inokulasi
memberikan
pertumbuhan koloni yang sangat rapat di dalam media sehingga mempersulit
47
proses pengamatan untuk perhitungan jumlah bakteri. Penentuan nilai aktivitas penghambatan propolis juga ditentukan dengan nilai pertumbuhan kelompok bakteri uji pada media spesifik XLD, sehingga selisih antara media kontrol dengan media uji merupakan nilai penghambatan dari pertumbuhan kelompok bakteri uji. Pada setiap kelompok bakteri Salmonella sp memberikan nilai pertumbuhan yang berbeda setelah proses pengenceran. Pada pengenceran bakteri 10-2 dapat teramati adanya nilai penghambatan yang tinggi pada kelompok bakteri Salmonella sp hal ini diakibatkan oleh penggunaan bakteri yang didapatkan dari proses penanaman cairan rumen pada media spesifik untuk bakteri Salmonella sp sehingga secara keseluruhan dapat teramati adanya pengaruh pengenceran pada bakteri, memungkinkan semakin kecilnya nilai penghambatan pertumbuhan koloni bakteri uji. Secara umum bakteri Salmonella sp terdapat di dalam rumen melalui proses pencernaan dengan adanya kontaminasi pada pakan, namun walupun keberadaannya di dalam rumen efek patogen dari bakteri ini lebih diakibatkan oleh tingginya kerapatan populasinya di dalam rumen (Bender, et al. 1997). Patogenesis bakteri Salmonella sp pada hewan ruminansia umumnya diakibatkan oleh tingginya kerapatan populasi bakteri sehingga meningkatkan jumlah kemampuan bakteri berikatan dengan silia-silia rumen maupun silia-silia pada organ pencernaan setelah rumen sehingga mengakibatkan terhalangnya bakteri-bakteri hidrolitik untuk berikatan dengan silia-silia tersebut sebagai proses awal penyediaan nutrisi bagi hewan ruminansia tersebut (Bender, et al. 1997; Fallon, et al. 2002). Secara teori pengenceran bertujuan untuk menurunkan tingkat populasi
suatu
bakteri
di
dalam
media
pertumbuhan
sehingga
akan
memungkinkan proses perhitungan secara lebih teliti (Ratna. 1993; Jennifer. 2001; Basquet, et al . 2004). Perhitungan pada setiap cawan petri dapat dilakukan dengan memperhatikan jumlah koloni yang muncul, jumlah koloni yang teramati merupakan suatu indeks jumlah organisme yang dapat hidup di dalam sampel (Ratna. 1993). Setelah didapatkan adanya pengaruh pengenceran bakteri dan konsentrasi ekstrak propolis terhadap penentuan nilai KHTM maka kedua jenis variabel tersebut digunakan. Dari hasil pengamatan didapatkan nilai hambat pertumbuhan
48
koloni Salmonella sp seperti pada Gambar 11. Ekstrak propolis yang memberikan efek pada kelompok bakteri Salmonella sp (20,44 cfu/ml) yang termasuk dalam kelompok bakteri yang bersifat Gram negatif diduga karena propolis memiliki sifat seperti antibitotik polimiksin, antibiotik ini merupakan bahan antibiotik yang sensitif menghancurkan membran spesies Gram negatif secara khususnya polimiksin berinteraksi dengan fosfolipid membran sel yang berakibat hilangnya kontrol osmotik membran sehingga mengakibatkan kebocoran dan mempermudah penetrasi dan merusak struktur membran sel (Tukan. 2008). Kemampuan ekstrak propolis asal Pandeglang menghambat pertumbuhan kelompok bakteri Salmonella sp dimungkinkan dengan adanya keragaman senyawa di dalam propolis.
KELOMPOK Salmonella sp
Nilai pen g hambatan (cfu /ml)
20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 Konsentrasi propolis (%(b/b))
1/100
1/10000
1/1000000
1/100000000 1/1000000 1/10000 1/100
1/100000000
Gambar 11. Grafik nilai penghambatan dengan interaksi konsentrasi ekstrak propolis dan pengenceran bakteri Salmonella sp
49
Pada Gambar 11 dapat diketahui bahwa ekstrak propolis asal Pandeglang memberikan efek penghambatan yang lebih dominan pada kelompok bakteri patogen Salmonella sp di dalam rumen. Hal ini juga dukung oleh pernyataan Tukan (2008) yang menyatakan kemampuan hambat tumbuh minimum propolis Trigona spp asal pandeglang, lebih dominan terhadap bakteri patogen. Ekstrak propolis Trigona spp asal Pandeglang yang dominan terhadap kelompok bakteri patogen dan Gram negatif dibandingkan dengan pengaruhnya terhadap kelompok bakteri hidrolitik di dalam rumen. Mekanisme penghambatan yang terjadi pada kelompok bakteri uji yang berasal dari cairan rumen dapat dijelaskan dengan keberadaan senyawa-senyawa yang terdapat di dalam ekstrak propolis asal Pandeglang. Senyawa yang terdapat di dalam ekstrak propolis asal Pandeglang terdiri dari senyawa tanin, flavonoid, steroid, dan alkaloid, namun keberadaan alkaloid dalam ekstrak propolis sangat dipengaruhi oleh perbedaan waktu dan pengkoleksian sampel propolis (Tukan. 2008). Komposisi suatu zat aktif di dalam senyawa propolis berbeda dipengaruhi oleh tumbuhan asal resin, iklim, waktu pengkoleksian dan jenis lebah (Bankova, 2000). Adanya golongan senyawa yang beragam pada propolis merupakan satu hal yang terpenting dalam kemampuan propolis menghambat pertumbuhan bakteri, namun secara jelas mekanisme kerja propolis dan target reaksi senyawa propolis terhadap sel bakteri hingga saat ini belum diketahui.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan Propolis Trigona spp asal Pandeglang mempunyai kemampuan daya hambat terhadap pertumbuhan beberapa kelompok bakteri di dalam rumen, terutama pada kelompok bakteri Salmonella sp dan kelompok bakteri proteolitik. Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM) terhadap kelompok bakteri proteolitik, lipolitik, selulolitik, dan Salmonella sp adalah 4%. Pada konsentrasi 4% nilai penghambatan terhadap kelompok bakteri proteolitik, lipolitik, selulolitik dan Salmonella sp secara berturut-turut 16,00 cfu/ml, 5,78 cfu/ml, 7,56 cfu/ml, dan 20,44 cfu/ml. Propolis asal pandeglang memiliki potensi sebagai bahan tambahan pakan yang berfungsi melakukan manipulasi proses fermentasi di dalam rumen. Proses manipulasi di dalam rumen dapat dilakukan oleh propolis dengan mekanisme melindungi protein pakan dari proses proteolitik di dalam rumen dengan menghambat pertumbuhan kelompok bakteri proteolitik di dalam rumen serta bakteri Salmonella sp. Saran Penelitian efek pengaruh propolis Trigona spp asal Pandeglang terhadap populasi bakteri rumen yang telah dilakukan, merupakan uji in vitro. Oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan menggunakan metode yang lebih mendekati dengan keadaan di dalam rumen dengan menggunakan media yang lebih spesifik. Namun perlu diperhatikan juga bahwa laju fermentasi di dalam keadaan in vivo diikuti juga dengan laju penyerapan VFA sedangkan, pada keadaan in vitro laju pembentukkan VFA terhambat melalui proses penghambatan produk akhir fermentasi.
DAFTAR PUSTAKA
Adnan, B. 1984. Pengolahan Susu Perah dan Kandungannya, Jakarta: Penebar Swadaya. Andrews, J. 2001. Determination of Minimum Inhibitory Concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 48: 5-16. Angraini, D. 2006. Potensi Propolis Lebah Madu Trigona spp sebagai Bahan Antibakteri [skripsi]. Bogor: Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Arora, S. 1989. Introduction of rumen bacteria. New York: Prectice Hall. Arora, S. 1983. Pencernaan Mikroba Pada Ruminansia, Retno Murwani, Penerjemah; Yogyakarta: UGM. Terjemahan dari Microbial Digestion in Ruminants.
Dietary
and chemical
manipulation
Baran, M. 1999. Dietary and chemical manipulation of rumen fermentation. Rumen Microbial Ecosystem Symposium. Bankova, V. 2005. Recent Trends and Important Developments in Propolis Research. eCAM. 2(1): 29-32. Bender, B, et al. 1997. Animal By-Product Contaminated with Salmonella in the Diets of Lactating Dairy Cows. Journal of Dairy Science. 80: 3064-3067. Bryant, M. 1965. Accounting for the effects of a ruminal nitrogen deficiency within the structure of the Cornell Net Carbohydrate and Protein System. Journal Animal Science. 78:1648–1658. Busquet, et al. 2006. Plant extracts affect in vitro rumen microbial fermentation. Journal American dairy science asociation. 89: 761-771. Czerkawski. 1986. Introduction of rumen. New York: Prectice Hall. Debroas D, Blanchart G. 1993. Interaction Between Proteolytic and Cellulolytic Rumen Bacteria During Hydrolysis of Plant Cell Wall Protein. Journal Reproduction and Nutrition. 33: 283-288. Erwanto, Budi. 1995. Pencernaan pada ruminansia. Jakarta: PT Penebar Swadaya. Fulghum, R. S, dan Moore, W. E. C. 1962. Isolation Enumeration and Characteristics of Proteolytic Ruminal Bacteria. Journal Bacteriology. 808-815.
52
Fallon, D, et al. 2002. An evaluation of the Performance of XLD, DCA, MLCB, and ABC Agars as Direct Plating Media for the Isolation of Salmonella enterica from Faeces. Journal Clinical Pathology. 55: 286-288. Gojmerac, WL. 1983. Bee, beekeeping Honey and Pollination. Westport: Avi. Hadioetomo. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia. Hasan, Zainal. 2006. Potensi Propolis Lebah Madu Trigona spp Sebagai Zat Antimikrobial. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Harbone, HB. 1987. Metode Fitokimia I. Ed ke-2, Padmawinata K, Penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari Phytochemical Methode. Hobson, P.N. 1988. The Rumen Microbial Ecosystem. London and New York: Elsivier Applied Science. Harfoot, B, et al. 1988. Lipolytic Bacteria in Rumen. Current Science. Vol: 79, No 5: 124-131. Hart, K. et al. 2007. Plant Extracts to Manipulate Rumen Fermetation. London and New York: Elsivier Animal Feed and Technology. James B, Aourora C, et al. 2001. Factor That Alter Rumen Microbial Ecology. Science. Vol 292: 1119-1122. Jennifer, M. 2001. Bacteria in Ruminant. London and New York: Elsivier Applied Science. Jouany, J. P. 2006. Rumen Ciliate Protozoa; Their Multiple Roles in the Digestive Trac of Ruminants. Endocytobiosis Cell Res. 17: 93-102. Kamra, D. N. 2005. Rumen Microbial Ecosystem. Current Science. Vol: 89, No 1: 124-131. Khampa, Sittisak, Wanapat, Metha. 2007. Manipulation of Rumen Fermentation with Organic Acids Supplementation in Ruminants Raised in the Tropics. Pakistan Jornal of Nutrition. 6(1): 20-27. Khismatullina N. 2005. Apitherapy. Rusia: Mobile Ltd. Lasmayanty, Metty. 2007. Potensi Antibakteri Propolis Lebah Madu Trigona spp terhadap Bakteri Kariogenik [Skripsi]. Bogor: Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
53
McDonald R, Carwrith B, et al. 2002. Experiment on the Culture and Phsiology of Holotrichs from the Bovine Rumen. Journal of National Microbiological Institute Washington. Vol 60: 516-522.
Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab Jilid I. Bogor: IPB Press. Mailer, C. 2006. Ruminal Microbial Metabolism of Lipid and Fatty Acids. American Institute of Nutrition. 98: 1235-1243. Makut, A, et al. 2008. MIC’s Method. Journal of National Microbiological Institute Washington. Vol 35: 467-470. Nelli. 2004. Waktu pencarian serbuk sari lebah pekerja Trigona (Apidae: Hymenoptera) [skripsi]. Bogor: Program Studi Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nelson, Karen, et al. 1998. Phenotypic and Phylogenetic Characterization of Ruminal Tanin-Tolerant Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 3824-3830 Owens, M, et al. 1990. Antibiotic and Infection. New York: Publisher Churchill Livingstone Incorporation. Pelezar MJ, Chan ESC. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. Ratna SH dkk, penterjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Prakkasi, A. 1998. Ilmu Nutrisi dan Makanan Ternak Ruminan. Jakarta: UI Press. Ratna, S. 1993. Bakteri dalam Pencernaan Hewan Ruminansia dan Non Ruminansia. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Russell, J. B, and Rychlik, J. L. 2001. Viewpoint Factor That Alter Rumen Microbial Ecology. Sciencemag. 292: 1119-1122. Ronald, M, et al. 1982 Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology. 43: 777-780. Rampersad, K, Goldstone, L A, et al, 1998. Study of Methods for Cultivation of Anaerobic Cellulose-Degrading Bacteria. Water SA. 24: 343-346. Sarwono, B. 2007. Penggemukan Sapi Potong Secara Cepat. Jakarta: PT Penebar Swadaya.
54
Shyamapada, R, et al. 2003. The Quantity of Bacteria in MIC’s. Applied and Environmental Microbiology. 1972: 703-710. Sihombing DTH. 1997. Ilmu Ternak Lebah Madu. Yogyakarta: Gajah Mada University Press. Khampa, Sittisak, dan Wanapat, Metha. 2007. Manipulation of Rumen Fermentation with Organic Acids Supplementation in Ruminants Raised in the Tropics. Pakistan Journal of Nutrition. 6 (1): 20-27 Soetanto, H. R. 1989. Peranan Protein Bagi Ruminansia dan Non-Ruminansia, Khususnya Unggas untuk Produksi. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Teather RM, Wood PJ. 1982. Use of Congo Red-Polysaccharide Interaction in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology. 1982: 777-780. Thalib, A, et al. 2004. Ruminal Microbiology and Nutrition. Journal Animal Science. 58: 2954-2960. Tukan, Gerardus. 2008. Pengaruh Propolis Trigona spp Asal Pandeglang Terhadap Beberapa Isolat Bakteri Usus Sapi dan Penelusuran Komponen Aktifnya [tesis]. Bogor: Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Van Nevel, dan Mayer. 1988. Microbial Activity and Ruminal Methanogenesis as Affected by Plant Secondary Metabolites in Different Plant Extracts. Journal Animal Science. 45: 2992-3003 Wallace, R. J. 1994. Ruminal Microbiology, Biotechnology, and Ruminant Nutrition: Progress and Problems. Journal Animal Science. 72: 2992-3003. Wallace, R. J. 1996. Ruminal Microbial Metabolism of Peptides and Amino Acids. American Institute of Nutrition. 96: 1326-1334. Winingsing W. 2004. Kediaman lebah Sebagai antibiotik dan antikanker. http://www.Pikiranrakyat.com/cetak/0904/16/cakrawala/lainnya6.html [28 januari 2008]. Woo KS. 2004. Use Venom and Propolis for apitherapi in Korea. Di dalam Proceeding Conference of 7th Asian Agricultural Association Conference and 10th BEENET Symposium and Technofora: Los Banos, Februari 2004. Los Banos: Univ Philippines: Hlm 311-315.
LAMPIRAN
56 Lampiran 1. Formulasi media yang digunakan Formulasi Media PYG (pepton yeast glukosa) per 1000 ml terdiri dari Pepton = 10 g Ekstrak yeast = 10 g Glukosa = 20 g Agar = 20 g Formulasi media agar susu skim Media agar susu skim dengan formula per 1000 ml terdiri dari Susu skim = 100 g Agar = 15 g
Formulasi media M. Sarley Media M. Sarley dengan formula per 1000 ml terdiri dari Pepton = 0,5 g Gum arab =5g Glukosa =5g Minyak Zaitun = 15 ml Agar = 15 g Formulasi media CMC Media CMC dengan formula per 1000 ml terdiri dari Media CMC = 10 g Agar = 15 g Formulasi Media Xylose Lysine deoxycholate agar (XLD) Yeast ekstrak L-lisin Xylosa Lactosa Sodium deoxycholate Sucrose Sodium chloride Sodium thiosulfate Ferric ammonium sitrat Fenol merah Agar
3 g/l 5 g/l 3,75 g/l 7,5 g/l 1 g/l 7,5 g/l 5 g/l 6,8 g/l 0,8 g/l 0,08 g/l 12,5 g/l
57 Lampiran 2. Pembuatan larutan standar McFarland Penomeran standar Mc Farland 1.0% Barium klorida(ml)
0,5
1
2
3
4
0,05
0,1
0,2
0,3
0,4
1.0% Asam sulfat(ml)
9,95
9,9
9,8
9,7
9,6
Kerapatan sel (108 cfu/ml)
1,5
3,0
6,0
9,0
12,0
Pengukuran OD pada 600 nm Jika OD>0,5 untuk inokulasi diambil 50 µl Jika OD<0,5 untuk inokulasi diambil 100 µl Pada penelitian digunakan larutan standar Mc Farland 0,5
58 Lampiran 3. Dokumentasi Ekstraksi Propolis
Maserasi sarang lebah dengan etanol 70%
Endapan hasil penyaringan ekstrak
Sarang lebah Trigona Spp
Ekstrak propolis
59 Lampiran 4. Dokumentasi Uji Konsentrasi Hambat Tumbuh Minimum (KHTM)
Hasil uji aktivitas antibakteri propolis
Media uji proteolitik
Media kontrol lipolitik
Koloni bakteri cairan rumen yang dominan
Media uji lipolitik
Media kontrol proteolitik
60 Lampiran 5. Data hasil analisis KHTM dengan metode cawan hitung Seluruh Kelompok Bakteri Rumen Hasil rancangan percobaan Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept A B C A*B A*C B*C A*B*C Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 22249.570a 38379.164 8512.365 1385.388 4682.619 1092.930 4033.538 648.422 1827.196 3157.063 64560.000 25406.634
df 127 1 3 7 3 21 9 21 63 1011 1139 1138
Mean Square 175.193 38379.164 2837.455 197.913 1560.873 52.044 448.171 30.877 29.003 3.123
F 56.103 12290.324 908.650 63.378 499.845 16.666 143.520 9.888 9.288
Sig. .000 .000 .000 .000 .000 .000 .000 .000 .000
a. R Squared = .876 (Adjusted R Squared = .860)
Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa interaksi antara A*B*C signifikan. Oleh karena itu perlu dilakukan uji lanjut pada interaksi A*B*C. Faktor Kelompok Bakteri Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Subset Kelompok Bakteri A2 A3 A1 A4 Sig.
N 282 284 285 288
1 2.8723
2
3
4
3.7606 6.9754 1.000
1.000
9.7639 1.000
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 3.123. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 284.734. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
Faktor Taraf Konsentrasi Propolis Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Taraf Konsentrasi Propolis B5 B3 B4 B6 B1 B2 B7 B8 Sig.
N 144 144 141 142 144 138 144 142
1 4.9028 5.0486
.486
Subset 3
2 5.0486 5.3617 5.4014
.112
5.3617 5.4014 5.6806 5.7826
.066
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 3.123. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 142.347. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
4
5
5.6806 5.7826 6.0903 .064
8.6549 1.000
61 Faktor Taraf Koloni Bakteri Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Taraf Koloni Bakteri C4 C3 C2 C1 Sig.
N
1 3.7762 3.8723
286 282 286 285
Subset 2
3
7.6364 .516
8.1474 1.000
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 3.123. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 284.741. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept ABC Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 22249.570a 38379.164 22249.570 3157.063 64560.000 25406.634
df 127 1 127 1011 1139 1138
Mean Square 175.193 38379.164 175.193 3.123
F 56.103 12290.324 56.103
Sig. .000 .000 .000
a. R Squared = .876 (Adjusted R Squared = .860)
Kelompok Bakteri Proteolitik Hasil rancangan percobaan Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept B C B*C Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 5194.439a 13572.842 1223.250 2733.895 1266.058 92.389 19154.000 5286.828
df 31 1 7 3 21 253 285 284
Mean Square 167.563 13572.842 174.750 911.298 60.288 .365
F 458.857 37168.203 478.540 2495.521 165.095
Sig. .000 .000 .000 .000 .000
a. R Squared = .983 (Adjusted R Squared = .980)
Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa interaksi antara B*C signifikan. Oleh karena itu perlu dilakukan uji lanjut pada interaksi B*C. Faktor Taraf Konsentrasi Propolis
62
Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Subset
Taraf Konsentrasi Propolis B6 B5 B7 B4 B1 B2 B3 B8 Sig.
N
1 4.2500
36 36 36 36 36 33 36 36
2
3
4
5
6
4.7500 6.2500 6.7500 7.0000 7.6364 7.7222 1.000
1.000
1.000
.082
.549
11.5000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .365. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 35.596. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
Faktor Taraf Koloni Bakteri Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Subset Taraf Koloni Bakteri C4 C3 C1 C2 Sig.
N 72 69 72 72
1 3.7500
2
3
4
4.6957 7.7500 1.000
1.000
1.000
11.6111 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .365. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 71.226. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
Hasil rancangan percobaan pada interaksi B*C Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept BC Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 5194.439a 13572.842 5194.439 92.389 19154.000 5286.828
df 31 1 31 253 285 284
Mean Square 167.563 13572.842 167.563 .365
a. R Squared = .983 (Adjusted R Squared = .980)
F 458.857 37168.203 458.857
Sig. .000 .000 .000
63 Uji Lanjut untuk Interaksi B*C Nilai Hambat Koloni a,b,c
Duncan
Interaksi BC B6C3 B7C4 B2C3 B5C4 B1C3 B1C4 B3C1 B4C4 B6C1 B3C4 B5C3 B6C4 B2C4 B4C3 B5C1 B7C1 B8C3 B3C3 B5C2 B7C3 B8C4 B4C2 B1C1 B2C1 B4C1 B6C2 B7C2 B1C2 B2C2 B8C1 B3C2 B8C2 Sig.
N
1 9 .0000 9 6 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 1.000
2 1.00 1.50
3
4
5
6
Subset 7 8
9
10
11
12
13
14
1.50 2.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 4.00 4.00 4.00 5.00 5.00 5.00 6.00 7.00 8.00 8.00 8.00 8.00 9.00 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 12.0 12.0 15.0
.083
.083 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .365. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.862.
15.9 16.0 .699
64 Kelompok Bakteri Lipolitik Hasil rancangan percobaan Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept B C B*C Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 742.571a 2250.189 319.325 100.471 318.913 104.833 3174.000 847.404
df 31 1 7 3 21 250 282 281
Mean Square 23.954 2250.189 45.618 33.490 15.186 .419
F 57.124 5366.111 108.787 79.865 36.215
Sig. .000 .000 .000 .000 .000
a. R Squared = .876 (Adjusted R Squared = .861)
Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa interaksi antara B*C signifikan. Oleh karena itu perlu dilakukan uji lanjut pada interaksi B*C. Faktor Taraf Konsentrasi Propolis Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Taraf Konsentrasi Propolis B5 B3 B4 B6 B1 B7 B2 B8 Sig.
N
1 1.3056
36 36 33 36 36 36 33 36
Subset 3
2
4
5
1.6389 1.6667 3.2222 3.4444
1.000
.857
3.4444 3.6111 3.6970
.151
4.3611 1.000
.124
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .419. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 35.200. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
Faktor Taraf Koloni Bakteri Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Taraf Koloni Bakteri C3 C2 C1 C4 Sig.
N
Subset 2
1 69 72 69 72
2.9167
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .419. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 70.468. b.
The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed.
c. Alpha = .05.
3
1.8696
1.000
3.2464 3.4306 .093
65 Hasil rancangan percobaan pada interaksi B*C Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept BC Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 742.571a 2250.189 742.571 104.833 3174.000 847.404
df 31 1 31 250 282 281
a. R Squared = .876 (Adjusted R Squared = .861)
Mean Square 23.954 2250.189 23.954 .419
F 57.124 5366.111 57.124
Sig. .000 .000 .000
66 Uji Lanjut untuk Interaksi B*C Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Interaksi BC B5C1 B4C4 B3C1 B3C2 B3C3 B5C3 B2C3 B7C3 B4C1 B5C4 B6C3 B1C3 B4C2 B8C2 B1C4 B5C2 B2C2 B4C3 B6C1 B3C4 B6C2 B7C2 B1C2 B8C3 B7C4 B6C4 B2C4 B1C1 B2C1 B7C1 B8C1 B8C4 Sig.
N 9 9 9 9 9 9 6 9 6 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
1 .0000 .2222
2
1.00 1.00 1.00 1.00 1.17 1.22 1.33 1.33 1.33
3
4
.377
6
7
8
9
1.33 1.33 1.33 2.00 2.00 2.67 2.78 2.89 3.00 3.00 3.00
.474
Subset 5
.055
.358
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = .419. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.727.
2.89 3.00 3.00 3.00 3.56
.055
3.56 3.89 3.89 4.00 4.00
.208
3.89 3.89 4.00 4.00 4.33
.208
4.33 4.67 4.78 5.00 5.00 5.00 5.00 .064
5.78 1.000
67 Kelompok Bakteri Selulolitik Hasil rancangan percobaan Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept B C B*C Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 652.544a 3985.266 62.157 391.186 192.914 327.175 4996.000 979.718
df 31 1 7 3 21 252 284 283
Mean Square 21.050 3985.266 8.880 130.395 9.186 1.298
F 16.213 3069.575 6.839 100.435 7.076
Sig. .000 .000 .000 .000 .000
a. R Squared = .666 (Adjusted R Squared = .625)
Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa interaksi antara B*C signifikan. Oleh karena itu perlu dilakukan uji lanjut pada interaksi B*C. Faktor Taraf Konsentrasi Propolis Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Taraf Konsentrasi Propolis B3 B1 B5 B4 B2 B6 B7 B8 Sig.
N
Subset 2
1 36 36 36 36 36 34 36 34
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 1.298. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 35.478. b.
The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed.
c.
Alpha = .05.
3.0000 3.5278 3.5556
.052
3
3.5278 3.5556 3.7500 3.7778 3.7941 3.8889 .252
4.8529 1.000
68 Faktor Taraf Koloni Bakteri Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b,c
Subset Taraf Koloni Bakteri C4 C3 C2 C1 Sig.
N
1 2.2000
70 72 70 72
2
3
4
3.3333 4.0286 1.000
1.000
1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 1.298. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 70.986. b. The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Type I error levels are not guaranteed. c. Alpha = .05.
Hasil rancangan percobaan pada interaksi B*C Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept BC Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 652.544a 3985.266 652.544 327.175 4996.000 979.718
df 31 1 31 252 284 283
Mean Square 21.050 3985.266 21.050 1.298
a. R Squared = .666 (Adjusted R Squared = .625)
F 16.213 3069.575 16.213
Sig. .000 .000 .000
5.4444 1.000
69 Uji Lanjut untuk Interaksi B*C Nilai Hambat Koloni Duncan Interaksi BC B3C4 B6C3 B1C4 B2C3 B4C4 B2C4 B5C4 B6C4 B7C4 B1C3 B3C3 B5C3 B6C2 B5C2 B4C3 B8C4 B1C2 B3C1 B3C2 B4C2 B7C1 B7C2 B8C2 B1C1 B2C1 B8C3 B7C3 B4C1 B2C2 B5C1 B8C1 B6C1 Sig.
a,b,c
Subset N 9 9 9 9 9 9 9 7 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 7 9 9 9 9 9 9 9 9 9
1 1.00 1.89 2.00 2.00 2.00 2.22 2.22
.051
2 1.89 2.00 2.00 2.00 2.22 2.22 2.29 2.33 3.00 3.00 3.00 3.11
.063
3
2.00 2.00 2.00 2.22 2.22 2.29 2.33 3.00 3.00 3.00 3.11 3.22
.063
4
2.22 2.22 2.29 2.33 3.00 3.00 3.00 3.11 3.22 3.44
.059
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 1.298. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 8.842.
5
2.33 3.00 3.00 3.00 3.11 3.22 3.44 3.56
.054
6
3.00 3.00 3.00 3.11 3.22 3.44 3.56 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.14
.087
7
4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.14 5.11 5.11 5.11 5.22
.061
8
5.11 5.11 5.11 5.22 5.56 5.78 5.78
.299
9
10
5.56 5.78 5.78 6.44 .137
7.56 1.000
70 Kelompok Bakteri Salmonella sp Hasil rancangan percobaan Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept B C B*C Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 7147.278a 27456.056 898.278 5559.528 689.472 2632.667 37236.000 9779.944
df
Mean Square 230.557 27456.056 128.325 1853.176 32.832 10.284
31 1 7 3 21 256 288 287
F 22.419 2669.822 12.478 180.202 3.193
Sig. .000 .000 .000 .000 .000
a. R Squared = .731 (Adjusted R Squared = .698)
Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa interaksi antara B*C signifikan. Oleh karena itu perlu dilakukan uji lanjut pada interaksi B*C. Faktor Taraf Konsentrasi Propolis Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b
Taraf Konsentrasi Propolis B3 B2 B1 B4 B5 B6 B7 B8 Sig.
Subset N
1 7.8333 8.0000 8.7500 8.9722
36 36 36 36 36 36 36 36
2
3
8.7500 8.9722 10.0000 10.2500
.173
4
10.0000 10.2500 10.6111
.070
.451
13.6944 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 10.284. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 36.000. b. Alpha = .05.
Faktor Taraf Koloni Bakteri Nilai Hambat Koloni Duncan
a,b
Taraf Koloni Bakteri C3 C4 C2 C1 Sig.
N 72 72 72 72
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 10.284. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 72.000. b.
Alpha = .05.
Subset 2
1
3
5.5417 5.6806 11.8889 .795
1.000
15.9444 1.000
71 Hasil rancangan percobaan pada interaksi B*C Tests of Between-Subjects Effects Dependent Variable: Nilai Hambat Koloni Source Corrected Model Intercept BC Error Total Corrected Total
Type III Sum of Squares 7147.278a 27456.056 7147.278 2632.667 37236.000 9779.944
df 31 1 31 256 288 287
Mean Square 230.557 27456.056 230.557 10.284
a. R Squared = .731 (Adjusted R Squared = .698)
F 22.419 2669.822 22.419
Sig. .000 .000 .000
72 Uji Lanjut untuk Interaksi B*C Nilai Hambat Koloni Duncan Interaksi BC B2C3 B4C3 B5C4 B4C4 B1C3 B5C3 B1C4 B2C4 B7C4 B6C4 B3C2 B3C3 B7C3 B3C4 B6C3 B2C2 B8C3 B8C4 B1C2 B5C2 B3C1 B1C1 B7C2 B4C2 B6C2 B4C1 B6C1 B2C1 B8C2 B7C1 B5C1 B8C1 Sig.
a,b
N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
1 3.67 3.67 3.67 4.00 4.33 4.89 5.00 5.33 5.44 5.56 5.67 6.00 6.00 6.67 7.11
.065
2
4.89 5.00 5.33 5.44 5.56 5.67 6.00 6.00 6.67 7.11 8.00
.089
3
5.33 5.44 5.56 5.67 6.00 6.00 6.67 7.11 8.00 8.67
.065
4
6.67 7.11 8.00 8.67 9.78
.067
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on Type III Sum of Squares The error term is Mean Square(Error) = 10.284. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 9.000.
Subset 5
9.78 12.3 12.7 13.0
.051
6
12.3 12.7 13.0 13.3 13.3 13.6 13.7 14.7 14.7 15.0 15.9
.050
7
14.7 14.7 15.0 15.9 17.7
.078
8
15.9 17.7 18.8 .071
9
17.7 18.8 20.4 .083
73 Lampiran 6. Struktur golongan senyawa dan senyawa yang terdapat dalam propolis CH 2 OH CH
CHO H CH 2 OH HC CH O
OH OH
OCH 3 CH 2 OH O CH
HO
O CH
OH H 3 CO
OH
Tanin (epikatekin) HO
OCH 3 OH
O
Lignin
OH
N Glk HO
CH3 O
N
OH
Flavonoid
Alkaloid (nikotina)
CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH Asam linoleat
HO
Steroid (ergosterol)
3
R H
H
1
HO 2
H
Cyloartenol
