UJI BIOAKTIFITAS EKSTRAK LIPID DALAM Zymomonas mobilis DENGAN METODE BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)
Oleh ELOK WIDAYANTI 1406 201 808
PROGRAM MAGISTER KIMIA FMIPA ITS Surabaya 2008
Divisio Sub Divisio Kelas Famili Genus Spesies
: Bacteria : Proteobacteria : Alpha Proteobacteria : Sphingomonadaceal : Zymomonas : Zymomonas mobilis Klasifikasi
Zymomonas mobilis
Kelebihan
Zymmomonas
mobilis
mampu bertahan hidup pada lingkungan dengan kadar alkohol yang tinggi (Herman, dkk; 1991)
Zymomonas mobilis
Zymomonas mobilis o Sahm,1991Total hopanoid pada Zymomonas mobilis ATCC 29191 adalah 30 mg/g berat sel kering o Flesch dan Rohmer 1989Hopanoid dalam Z.mobilis yang terdeteksi : diplopten (0,2 mg/g berat sel kering), diplopterol (0,8 mg/g), bakteriohopanotetrol (1 mg/g), bakteriohopanotetrol eter (1,7 mg/g) o Nagumo, 1991 Bacteriohopane-32-ol mempunyai efek citotoxic dengan mencegah dua lines sel leukemia o Chen, 1994 Bakteriohopan-32,33,34,35-tetrol (Tetrol), bakteriohopan-32-ol , diplopten, diplopterol dan bakteriohopan-32-ol terasetilasi yang diisolasi dari bakteri Acetobacter aceti mempunyai efek citotoksik terhadap sel leukemia L1210 dan P388.
o Diharapkan dapat digunakan sebagai sumber bioaktif
Bioaktif dapat dapat diuji melalui aktifitas ekstrak lipid uji pendahuluan dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) (Meyer dan Ferrigini,1982) Keunggulan BSLT : perkembangbiakannya cepat, harganya murah, metode percobaannya mudah, sampel yang diperlukan sedikit, tidak memerlukan laboratorium yang khusus dan hasilnya dapat dipercaya (Steven dan Russel, 1993).
RUMUSAN MASALAH Bagaimana efek ekstrak lipid Zymomonas mobilis terhadap pertumbuhan Artemia salina (BSLT)?
Tujuan Penelitian
Untuk memperoleh LC50 ekstrak lipid pada
Artemia salina Senyawa--senyawa yang terdapat dalam Senyawa ekstrak lipid
Metodologi Penelitian P
Pembuatan kurva pertumbuhan
R O
Produksi Biomassa
P
S E
Ekstraksi lipid total
D U R
Uji toksisitas dengan metode BSLT Skrining Hopanoid
Hasil dan Pembahasan Ekstrak lipid yang diperoleh adalah sebesar 0,37 g atau 19,47% terhadap berat sel kering. Menurut Ketchum (1988) kandungan lipid total dari sebagian spesies-spesies bakteri berkisar 1%-10%. Dengan demikian kandungan lipid pada bakteri Zymomonas mobilis tergolong cukup besar, hal ini kemungkinan disebabkan adanya lipid membran seperti hopanoid, glikolipid, fosfolipid, dan asam lemak
Jumlah rata-rata udang laut (Artemia salina L) yang mati pada larutan uji ekstrak lipid
Konsentrasi (ppm)
Rata-rata hidup
Hidup
Rata-rata mati
Mati
500
0
0
0
0
10
10
10
10
250
5
0
0
2
5
10
10
8
125
6
5
5
5
4
5
5
5
62,5
5
7
7
6
5
3
3
4
31,25
6
7
8
7
4
3
2
3
Perhitungan % mortalitas udang laut (Artemia salina L) pada larutan uji ekstrak lipid
Konsentrasi Log Mati (ppm) Konsentrasi Akumulasi (A)
Hidup Akumulasi (C)
Ratio Mati total
Mortalitas (%)
500
2,6990
30
0
1
100
250
2,3979
20
2
0,9090
90,9
125
2,0969
12
7
0,6316
63,2
62,5
1,7959
7
13
0,35
35
31,25
1,4949
3
20
0,1304
13,0
Ratio Mati Total =
A− B D
A= jumlah Artemia salina yang mati pada larutan uji B= jumlah Artemia salina yang mati pada kontrol D= jumlah Artemia salina total (A+C)
log konsentrasi vs %m ortalitas 120
y = 76.346x - 99.672
%mortalitas
100 80 60 40 20 0 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
log konsentrasai
Grafik hubungan antara konsentrasi ekstrak lipid dengan % mortalitas larva udang (Artemia salina L)
Regresi linier y = 76,346x – 99,672 50 = 76,346x – 99,672 x = 1,96 x = log c c = 91,2 ppm LC50 = 91,2 ppm
Ekstrak lipid memiliki nilai LC50 sebesar 91,2 ppm. Suatu senyawa dikatakan aktif jika memiliki harga LC50 ≤ 250 ppm dan dikatakan tidak aktif jika memiliki harga LC50 > 250 ppm (Meyer dan Ferrigini ,1982). Nilai LC50 untuk ekstrak lipid adalah 91,2 ppm, hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut bersifat aktif dan memiliki sifat bioaktifitas tinggi, yang artinya pada konsentrasi yang kecil sudah bersifat toksik dan mematikan terhadap larva udang.
Analisis Hopanoid Terasetilasi dengan KG-MS
Kromatogram SM puncak ke 28 Waktu retensi (tR) 27,317 menit
Spektra Massa puncak ke 28 dengan waktu retensi 27,317 menit merupakan spektra dari asam palmitat mempunyai peak dasar m/z 43 yang merupakan ciri dari fragmen asetil. Fragmen yang lain merupakan rantai alkil, yaitu m/z 115, 171, 185. Fragmen dengan m/z 256 merupakan Mr dari asam lemak ini. Struktur asam palmitat ditunjukkan pada gambar berikut : O
OH
Kromatogram SM puncak ke 30 Waktu retensi (tR) 27,763 menit
Fragmen-fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. dimana teridentifikasi m/z 196 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 30 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C14H28. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :
Kromatogram SM puncak ke 35 Waktu retensi (tR) 28,944 menit % 100.0 43
75.0
57
50.0
55
69
83 Gambar 4.9 Kromatogram SM puncak ke 35
97
25.0
111
84
109
0.0 50.0
75.0
100.0
125 129 139 125.0
154 150.0
182
167 175.0
210 195 200.0
Beberapa fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. Kemudian teridentifikasi m/z 210 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 35 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C15H30. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :
Kromatogram SM puncak ke 42 Waktu retensi (tR) 31,486 menit % 100.0
43
75.0 50.0
55
83
69
97
25.0 0.0
111
84
125
44
116 50.0
75.0
100.0
125.0
139
153 150.0
168
182 175.0
196 207 200.0
224 225.0
Beberapa fragmen ion yang muncul pada gambar di atas adalah m/z 83, 97, 55 dan 69 dimana fragmen ion ini khas dari alkilsikloheksana. Kemudian teridentifikasi m/z 224 sebagai massa molekul relatifnya. Berdasarkan identifikasi tersebut, maka senyawa pada puncak ke 42 adalah alkil sikloheksana dengan rumus molekul C16H32. Struktur senyawanya dapat dilihat pada gambar berikut :
Struktur teridentifikasi Asam Palmitat
Asam Palmitat Alkil sikloheksan LC50
Aktif pada uji BSLT
Pernyataan ini didukung oleh penelitian yang telah dilakukan oleh Ratna Djamil dkk menyebutkan pada ekstrak metanol mempunyai nilai LC50 178,2 ppm. Dari ektrak metanol telah diisolasi tiga senyawa yaitu kolesta-2,4-dien3ol asetat (24-dehidrokolesterol asetat) atau desmosterol asetat, asam tetradekanoat (asam miristat) dan asam heksadekanoat (asam palmitat).
KESIMPULAN Ekstrak lipid pada Zymomonas mobilis memiliki nilai LC50 sebesar 91,2 ppm dimana menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung didalamnya bersifat aktif pada uji BSLT Senyawa yang terdeteksi pada ekstrak lipid adalah asam palmitat dan alkil sikloheksan
Produksi Biomassa 1 jarum ose Zymomonas mobilis dari biakan miring - diinokulasikan pada 10 mL media cair steril - diinkubasi 20 jam dengan dishaker kecepatan 120 rpm - ditambah media cair sampai volume 100 mL - diinkubasi 20 jam dengan dishaker kecepatan 120 rpm - disentrifuse pada 3000 rpm selam 30 menit Sel basah - diliofilisasi Sel kering
Ekstraksi Lipid Total 0,2 gr sel kering - diekstrak 2 kali dengan 50 mL kloroform/metanol (2:1 v/v) - disaring filtrat - dievaporasi
Ekstrak Lipid
Kloroform/metanol
Ekstrak Lipid - diambil 1 mg - ditambah etanol 100 µL - ditambah aquades sampai volume 1000 µL Larutan uji 1000 ppm - divariasi konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25 ppm Larutan uji
1 mg telur Artemia salina - dibiarkan 48 jam Telur menetas - dimasukkan dalam 16 wadah masingmasing 10 ekor - ditambahkan larutan uji - diamati selama 24 jam Angka kematian artemia salina
Skrining Hopanoid Lipid total - dioksidasi dengan 300 mg H5IO6 dalam THF/air (4:1 v/v) - distirer selama 1 jam, ditambah air 10 mL - diekstrak dengan n-heksan 3 kali Fasa organik (mengandung hopanoid)
Fasa air - dibuang
- ditambah Na2SO4 anhidrat - didekantasi dekantir
residu
- dievaporasi Aldehid hopanoid
n-heksan
Aldehid hopanoid - direduksi dengan 100 mg NaBH4 dalam 5 mL etanol - distirer selama 1 jam, ditambah 15 mL 0,1 M KH2PO4 - diekstrak dengan n-heksan 3 kali Fasa organik (mengandung alkohol hopanoid)
Fasa air
- ditambah Na2SO4 anhidrat - didekantasi dekantir
residu
- dievaporasi Alkohol hopanoid
n-heksan
Alkohol hopanoid - pemisahan dengan kromatografi kolom 20 mL kedua alkohol hopanoid - diasetilasi hopanoid tersetilasi - dianalisa KGMS Kromatogram
2 mL pertama asam lemak
