UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN Garcinia benthami Pierre TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT) Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
OLEH : Aulia Ajrina NIM: 1110103000065
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1434 H/2013 M
ii
iii
iv
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan penelitian ini. Shalawat dan salam semoga selalu tercurahkan kepada junjungan Nabi Muhammad SAW. Penelitian ini dapat terselesaikan tepat pada waktunya karena adanya dukungan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terimakasih kepada : 1.
Prof. Dr (hc). dr. M.K Tadjudin,Sp.And selaku Dekan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan arahan kepada penulis selama menempuh pendidikan di PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ini.
2.
dr. Witri Ardini, M.Gizi,Sp.GK selaku Ketua Program Studi Pendidikan Dokter atas bimbingan yang diberikan selama penulis menempuh pendidikan di PSPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ini.
3.
dr. Nurul Hiedayati,PhD selaku pembimbing 1 yang telah banyak meluangkan waktu, pikiran dan tenaga untuk membimbing penulis dalam menyusun dan menyelesaikan laporan penelitian ini.
4.
Puteri Amelia,M.Farm,Apt selaku pembimbing 2 yang telah memberikan masukan judul penelitian dan banyak mencurahkan waktu, pikiran dan tenaga untuk membimbing penulis dalam menyusun dan menyelesaikan laporan penelitian ini.
5.
drg. Laifa Annisa Hendarmin, PhD selaku penanggung jawab modul riset yang selalu memberikan arahan dan mengingatkan penulis untuk segera menyelesaikan penelitian ini.
6.
Pusat Konservasi Tumbuhan-Kebun Raya Bogor, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah bersedia memberikan daun Garcinia benthami Pierre untuk digunakan dalam penelitian ini.
7.
Ayah dan Ibu atas limpahan kasih sayang yang telah diberikan, pengorbanan tanpa pamrih dan doa-doa yang selalu dipanjatkan, senantiasa memberikan arahan, dorongan semangat kepada penulis selama melaksanakan penelitian. v
Terimakasih atas segala kebaikan dan pelajaran hidup yang luar biasa hingga kini penulis telah beranjak dewasa. 8.
Ibu Zeti Hariyati, M.Biomed selaku PJ Laboratorium Biologi dan Ibu Puteri Amelia, M.Farm,Apt selaku PJ Laboratorium PNA yang telah memberikan izin penggunaan laboratorium.
9.
Mbak Rani, Mbak Suryani, Mbak Dina, Mas Rachmadi, dan laboran-laboran lain yang telah membantu penulis dalam pengambilan data.
10. Teman-teman satu kelompok penelitian, Ratu, Eri, Fitri, Nur dan Nurraisya. Terimakasih atas kerja sama dan dukungannya selama melakukan penelitian ini. 11. Teman-teman, kakak-kakak dan adik-adik di PSPD, CIMSA, dan temanteman lain yang penulis kenal namun tidak sempat tersebutkan. Penulis menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik dari berbagai pihak. Demikian laporan penelitian ini penulis susun, semoga dapat bermanfaat dengan baik.
Ciputat, 11 September 2013
Penulis
vi
ABSTRAK Aulia Ajrina. Program Studi Pendidikan Dokter. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Metanol Daun Garcinia benthami Pierre Terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2013 Daun Garcinia benthami Pierre termasuk famili Clusiaceae. Daun ini mengandung senyawa triterpen dan benzofenon. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi toksisitas akut ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang ditunjukkan dengan nilai LC 50. Penelitian eksperimental ini menggunakan 180 larva udang (Artemia salina Leach) yang dibagi menjadi 1 kontrol negatif dan 5 kelompok seri konsentrasi ekstrak, masing-masing terdiri dari 10 ekor larva dengan replikasi 3 kali untuk tiap kelompok perlakuan. Konsentrasi ekstrak berturut-turut adalah 100,50,20,10, dan 5 ppm. Hasil pengamatan adalah terhadap larva yang mati 24 jam setelah pemberian ekstrak. Hasil dari analisis probit menunjukkan harga LC50 dari ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre adalah 73,43 ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach menurut metode BSLT yang ditunjukkan dengan harga LC50<1000 ppm. Kata kunci: Uji Toksisitas Akut, Garcinia benthami Pierre, Artemia salina Leach, BSLT, LC50 ABSTRACT Aulia Ajrina. Medical Education Study Program. Acute Toxicity Test of Methanol Extract of Garcinia benthami Pierre Leaves Against Artemia salina Leach Larvae Using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Method. 2013 Garcinia benthami Pierre leaf belong to Clusiaceae family. This leaf contains triterpen and benzofenon compounds. The purpose of this research is to determine the potency of acute toxicity of methanol extract of Garcinia benthami Pierre leaves against Artemia salina Leach larvae using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method which is shown by LC50 value. This research was done by using 180 brine shrimps were divided into 1 negative control, and 5 treatment groups, which contained 10 larvaes for each group with 3 times replication group. The extract concentration consecutively is 100,50,20,10,and 5 ppm. The result is against larvae that died 24 hours after extract was given.The result of probit analysis indicated that LC50 value of methanol extract of Garcinia benthami Pierre leaves is 73,43 ppm. It means that methanol extract of Garcinia benthami Pierre leaves had acute toxicity potency against Artemia salina Leach larva according to BSLT method. It is indicated by LC50 value <1000 ppm. Keywords: Acute Toxicity Test, Garcinia benthami Pierre, Artemia salina Leach, BSLT, LC50
vii
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL ....................................................................................... i LEMBAR PERNYATAAN ........................................................................ ii LEMBAR PERSETUJUAN........................................................................ iii LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................ iv KATA PENGANTAR ................................................................................. v ABSTRAK ................................................................................................... vii DAFTAR ISI ............................................................................................... viii DAFTAR TABEL ....................................................................................... x DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xi DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………… xii BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang .............................................................................. 1 1.2 Rumusan masalah ........................................................................ 2 1.3 Tujuan penelitian ......................................................................... 2 1.3.1 Tujuan umum ...................................................................... 2 1.3.2 Tujuan khusus ..................................................................... 2 1.4 Manfaat penelitian ........................................................................ 3 1.4.1 Bagi masyarakat................................................................... 3 1.4.2 Bagi institusi........................................................................ 3 1.4.3 Bagi peneliti........................................................................ 3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Landasan teori............................................................................... 4 2.1.1 Tumbuhan dalam Islam........................................................4 2.1.2 Keamanan penggunaan obat tradisional Indonesia.............. 5 2.1.3 Genus Garcinia.................................................................... 6 2.1.4 Tumbuhan Garcinia benthami Pierre.................................. 8 2.1.5 Definisi toksikologi.............................................................. 11 2.1.6 Uji toksisitas akut................................................................. 13 2.1.7 Metode ekstraksi simplisia................................................... 14 2.1.8 Larva udang Artemia salina Leach...................................... 18 2.1.9 Metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)……...............22 2.1.10 Metode penentuan nilai LD50 atau LC50............................ 23 2.2 Kerangka konsep........................................................................... 25 2.3 Definisi operasional...................................................................... 26 BAB 3 METODE PENELITIAN 1.1 Desain penelitian .......................................................................... 27 1.2 Lokasi dan waktu penelitian.......................................................... 27 1.3 Populasi dan sampel...................................................................... 27 3.3.1 Populasi................................................................................ 27 viii
1.4 1.5 1.6
1.7
1.8 1.9
3.3.2 Sampel.................................................................................. 27 3.3.2.1 Kriteria inklusi......................................................... 27 3.3.2.2 Kriteria ekslusi......................................................... 27 3.3.2.3 Besar sampel............................................................ 27 3.3.2.4 Cara pengambilan sampel........................................ 28 Determinasi tanaman.................................................................... 28 Bahan yang diuji........................................................................... 28 Alat dan bahan penelitian.............................................................. 28 3.6.1 Alat penelitian...................................................................... 28 3.6.2 Bahan penelitian................................................................... 29 Cara kerja penelitian...................................................................... 29 3.7.1 Ekstraksi daun Garcinia benthami Pierre dengan maserasi..................................................................... 29 3.7.2 Penetasan larva udang Artemia salina Leach....................... 31 3.7.3 Pembuatan konsentrasi ekstrak yang akan diuji................... 31 3.7.4 Prosedur uji toksisitas dengan metode BSLT.......................32 Alur penelitian............................................................................... 33 Pengolahan dan analisis data......................................................... 34
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil ekstraksi daun Garcinia benthami Pierre………….… 35 4.2 Hasil uji toksisitas dengan metode BSLT………………...... 36 4.3 Penetapan nilai LC50………………………………….......... 40 BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan ....................................................................................... 43 5.2 Saran.............................................................................................. 43 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 44 LAMPIRAN................................................................................................. 48
ix
DAFTAR TABEL Tabel 2.1 Tabel 3.1 Tabel 4.1 Tabel 4.2
Kategori toksisitas berdasarkan nilai LC50................................... 22 Data konsentrasi ekstrak pada tabung reaksi………...……….… 32 Data berat ekstrak kental daun Garcinia benthami Pierre…...…. 36 Pengaruh berbagai konsentrasi ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach.........................................................................................… 37 Tabel 4.3 Perhitungan LC50 dengan metode probit…………….………….. 40 Tabel 6.1 Transformasi persen-probit........................................................... 53 Tabel 6.2 Output hasil analisis probit dengan SPSS 16.0 for windows......... 57
x
DAFTAR GAMBAR Pohon Garcinia benthami Pierre...…………………….…….. 9 Daun Garcinia benthami Pierre………...……………………. 10 Sifat–sifat fisika dan kimia metanol…………...…………..… 17 Metabolisme metanol……...…………………………………. 17 Siklus hidup Artemia salina Leach ….......…………………... 19 Tahap penetasan telur Artemia................................................. 19 Larva Artemia salina Leach setelah menetas A) 24 jam, B) 48 jam, C) 72 jam.......…………………..….… 20 Gambar 2.8 Bagian tubuh larva Artemia salina Leach…….......…………..20 Gambar 2.9 Karakteristik morfologi larva Artemia tingkat instar I,II, dan III.......................................................... 21 Gambar 3.1 Bagan alur ekstraksi daun Garcinia benthami Pierre…...….... 30 Gambar 3.2 Bagan alur penelitian………………………………………… 33 Gambar 4.1 Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap kematian larva Artemia salina Leach……………………………………38 Gambar 4.2 Grafik regresi linier konsentrasi ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap nilai probit……..…. 41 Gambar 6.1 Keterangan determinasi tanaman.............................................. 48 Gambar 6.2 Keterangan bahan penelitian kista Artemia.............................. 49 Gambar 6.3 Destilasi pelarut metanol...........................................................50 Gambar 6.4 Botol maserasi........................................................................... 50 Gambar 6.5 Proses evaporasi dengan Rotary Evaporator............................ 50 Gambar 6.6 Ekstrak kental daun Garcinia benthami Pierre......................... 50 Gambar 6.7 Ekstrak kental 250 mg.............................................................. 50 Gambar 6.8 Larutan induk 1000 ppm........................................................... 50 Gambar 6.9 Proses penyaringan................................................................... 51 Gambar 6.10 Hasil uji BSLT......................................................................... 51 Gambar 6.11 Wadah penetasan telur Artemia salina Leach.......................... 51 Gambar 6.12 Larva Artemia salina Leach umur 48 Jam............................... 51 Gambar 6.13 Serbuk simplisia daun Garcinia benthami Pierre.................... 51 Gambar 6.14 Konsentrasi ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre……………………………………. 51 Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 2.5 Gambar 2.6 Gambar 2.7
xi
DAFTAR LAMPIRAN Surat keterangan determinasi tanaman………………………..… 48 Keterangan bahan penelitian kista Artemia……………............... 49 Gambar bahan dan alat penelitian…………………………….…. 50 Perhitungan konsentrasi ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre……………………………….… 52 Lampiran 5. Tabel transformasi persen – probit…………………………..…. 53 Lampiran 6. Hasil analisis probit dengan SPSS 16.0 for windows................... 57 Lampiran 7. Daftar riwayat hidup………………..…………………………… 63 Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4.
xii
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Masalah Masyarakat Indonesia sering menggunakan tumbuhan dalam kehidupan sehari-hari, baik untuk sumber makanan maupun pengobatan. Tumbuhan mengandung berbagai jenis bahan kimia alami yang dapat dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai obat tradisional. Penggunaan obat tradisional sebagian besar berbahan dasar alami, yaitu berasal dari daun, kulit batang, biji, buah, atau akar tumbuhan. 1 Salah satu tumbuhan yang telah dikenal dan digunakan oleh masyarakat Indonesia adalah genus Garcinia. Garcinia termasuk famili Clusiaceae. Masyarakat mengenal genus ini sebagai tumbuhan keluarga manggis yang dapat bermanfaat untuk obat tradisional dan sumber makanan. Genus Garcinia memiliki beberapa kandungan kimia yang telah berhasil diisolasi, yaitu senyawa xanton, benzofenon, golongan flavonoid, dan triterpen.2 Genus Garcinia terdiri dari 500 jenis yang tersebar luas di kawasan tropis dan didapatkan hampir di seluruh Indonesia. 3 Beberapa spesies Garcinia tidak dimanfaatkan secara baik dan sering ditebang oleh masyarakat sehingga dapat menimbulkan kepunahan bagi keberadaan Garcinia di masa mendatang.2 Garcinia telah dikenal sebagai sumber senyawa xanton dan bioflavonoid dengan berbagai macam bioaktivitas seperti antibakteri, antioksidan, antikanker, antijamur, dan antiinflamasi.4 Berdasarkan penelitian antioksidan ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre didapatkan nilai IC50 29,91 μg/mL sehingga tergolong antioksidan sangat kuat.2 Namun, masih terdapat beberapa spesies dari Garcinia yang belum diketahui potensi toksisitasnya sehingga perlu dilakukan uji toksisitas. Salah satu spesiesnya adalah Garcinia benthami Pierre. Penelitian uji toksisitas akut ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Sifat pelarut yang akan digunakan dalam penelitian ini 1
2
bergantung pada polaritas. Metanol tergolong sebagai pelarut polar sehingga dapat mengekstraksi senyawa polar.5 BSLT merupakan suatu bioassay sebagai metode awal untuk penelitian bahan alam yang bersifat toksik. Metode ini sering digunakan karena relatif mudah, murah, cepat, dan hasilnya dapat dipercaya.6 Metode BSLT menggunakan hewan coba berupa larva udang Artemia salina Leach, organisme sederhana dari biota laut yang sangat kecil dan mempunyai kepekaan yang cukup tinggi terhadap toksik. Uji toksisitas dengan metode ini merupakan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian larutan uji.7 Untuk mengetahui manfaat dan potensi toksisitas dari daun Garcinia benthami Pierre yang hampir punah maka peneliti mencoba melakukan uji toksisitas akut dari ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre dengan metode BSLT.
1.2
Rumusan Masalah Berdasarkan uraian dalam latar belakang masalah di atas, dapat dirumuskan pertanyaan penelitian, yaitu apakah ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)?
1.3
Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum Mengetahui potensi toksisitas akut dari ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
1.3.2 Tujuan Khusus a) Mengetahui persentase kematian larva Artemia salina Leach setelah pemberian ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre.
3
b) Mengetahui nilai LC50 dari ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
1.4
Manfaat Penelitian 1.4.1
Bagi Masyarakat Menambah informasi tentang tumbuhan keluarga manggis yang berpotensi sebagai tanaman obat.
1.4.2 Bagi Institusi a) Penelitian ini dapat menambah jumlah dan jenis penelitian yang telah dilakukan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. b) Penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan referensi untuk melakukan penelitian lebih lanjut bagi peneliti yang lain.
1.4.3 Bagi Peneliti a) Penelitian ini menjadi salah satu syarat mendapatkan gelar sarjana kedokteran di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. b) Memperoleh suatu pengalaman dalam bidang penelitian eksperimental terutama dalam bidang kesehatan.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Landasan Teori
2.1.1 Tumbuhan dalam Islam Allah SWT menciptakan tumbuhan sebagai salah satu makhluk hidup yang memiliki banyak manfaat. Tumbuh-tumbuhan memiliki kandungan kimia yang dapat dimanfaatkan oleh makhluk hidup lainnya. Allah SWT berfirman, yang artinya : “Apakah kamu tidak memperhatikan, bahwa sesungguhnya Allah menurunkan air dari langit, maka diaturnya menjadi sumber-sumber air di bumi kemudian ditumbuhkan-Nya dengan air itu tanam-tanaman yang bermacammacam warnanya, lalu ia menjadi kering lalu kamu melihatnya kekuningkuningan, kemudian dijadikan-Nya hancur berderai-derai. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar terdapat pelajaran bagi orang-orang yang mempunyai akal.” (Q.S Az-Zumar : 21). Di dalam ayat-ayat Al-Qur’an, Allah menyuruh manusia untuk merenungkan dan memperhatikan keanekaragaman serta keindahan ciptaanciptaan-Nya yang amat menakjubkan. Firman Allah dalam QS. Al-An’am: 99 yang artinya : “Dan Dialah yang menurunkan air hujan dari langit, lalu Kami tumbuhkan dengan air itu segala macam tumbuh-tumbuhan maka Kami keluarkan dari tumbuh-tumbuhan itu tanaman yang menghijau. Kami keluarkan dari tanaman yang menghijau itu butir yang banyak; dan dari mayang korma mengurai tangkai-tangkai yang menjulai, dan kebun-kebun anggur, dan (Kami keluarkan pula) zaitun dan delima yang serupa dan yang tidak serupa. Perhatikanlah buahnya di waktu pohonnya berbuah dan (perhatikan pulalah) kematangannya. Sesungguhnya pada yang demikian itu ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi orang-orang yang beriman.” (QS Al-An’am: 99) Allah SWT telah menganugerahkan akal dan pikiran kepada manusia. Allah SWT memerintahkan manusia untuk berpikir mengenai salah satu kejadian di bumi ini, yaitu proses tumbuhnya tanam-tanaman di permukaan bumi. Maka tumbuhlah tanam-tanaman, sejak dari benih kemudian menjadi besar, berbunga 4
5
yang beraneka warna, dan berbuah. Tumbuhan bermanfaat bagi manusia maupun binatang. Tumbuhan dapat dijadikan sebagai bahan makanan atau diolah untuk keperluan-keperluan lain, salah satunya dapat dijadikan sebagai obat. 8
2.1.2 Keamanan Penggunaan Obat Tradisional Indonesia Tumbuhan mengandung banyak senyawa murni yang dapat digunakan dalam obat konvensional maupun modern. Obat dari tumbuhan digunakan sebagai pilihan terapeutik dan sering menjadi bentuk terapi yang aman. Masyarakat harus mengetahui tentang keamanan, efektivitas, dan penggunaan obat secara tepat. 9 Definisi obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berasal dari tumbuhan, hewan, mineral, atau campuran dari bahan tersebut yang digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman. Obat tradisional Indonesia atau lebih dikenal dengan nama jamu, umumnya obat herbal, yaitu obat yang berasal dari tumbuhan. Bagian tumbuhan yang digunakan dapat berupa akar, batang, daun, umbi atau dapat juga seluruh bagian tumbuhan.10 Penggunaan bahan alam sebagai obat tradisional di masyarakat dijamin keamanannya Permenkes
oleh
pemerintah
dengan
No.760/Menkes/Per/IX/1992
mengimplementasikannya tentang
obat
tradisional
dalam dan
fitofarmaka.11 Fitofarmaka adalah obat dari bahan alam terutama dari alam nabati, yang khasiatnya jelas dan terbuat dari bahan baku dan telah memenuhi persyaratan minimal, sehingga terjamin keseragaman komponen aktif, keamanan dan kegunaannya.10 Penelitian obat tradisional Indonesia meliputi penelitian budidaya tanaman obat, analisis kandungan kimia, toksisitas, farmakodinamik, formulasi, dan uji klinik. Kandungan kimia obat herbal dipengaruhi beberapa faktor yaitu letak geografis/tempat tumbuh tanaman, iklim, cara pembudidayaan, cara dan waktu panen, dan cara perlakuan pascapanen (pengeringan, penyimpanan).10 Apabila terdapat bukti ilmiah adanya khasiat dan keamanan penggunaan obat tradisional pada manusia, maka obat tradisional dapat menjadi pertimbangan untuk digunakan di pelayanan kesehatan formal/profesi dokter. Bukti tersebut hanya dapat diperoleh berdasarkan penelitian yang dilakukan secara sistematik dan bertahap. Tahapan penelitian dalam pengembangan obat tradisional menjadi
6
fitofarmaka adalah sebagai berikut : 10 a)
Seleksi Jenis obat tradisional/obat herbal yang diutamakan untuk diteliti adalah : 10
berkhasiat untuk penyakit yang menduduki peringkat atas dalam angka kejadiannya.
b)
berkhasiat untuk penyakit tertentu berdasarkan pengalaman
merupakan alternatif jarang untuk penyakit tertentu, seperti kanker.
Uji preklinik, terdiri atas uji toksisitas dan uji farmakodinamik Uji preklinik dilakukan secara in vitro dan in vivo pada hewan uji agar dapat
diketahui
toksisitas
dan
efek
farmakodinamiknya.
Uji
farmakodinamik pada hewan uji digunakan untuk memprediksi efek pada manusia, sedangkan uji toksisitas digunakan untuk melihat dan mengetahui keamanannya.10 c)
Standarisasi sederhana, penentuan identitas dan pembuatan sediaan terstandar Bentuk sediaan obat herbal dan prosedur ekstraksi dapat mempengaruhi efek yang ditimbulkan. Ekstrak yang dihasilkan dengan jenis pelarut tertentu dapat memiliki efek terapi yang berbeda karena zat aktif yang terlarut berbeda.10
d)
Uji klinik Obat tradisional/obat herbal harus dibuktikan khasiat dan keamanannya melalui uji klinik agar dapat menjadi fitofarmaka. Apabila obat tradisional/obat herbal telah terbukti aman dan berkhasiat pada uji preklinik, maka uji klinik pada manusia dapat dilakukan.10
2.1.3 Genus Garcinia Genus Garcinia merupakan salah satu genus dari famili Clusiaceae. Di Indonesia, pemanfaatan Garcinia secara umum masih kurang dilakukan. Jenis Garcinia yang umumnya ditanam yaitu G.mangostana L. untuk diambil buahnya. Garcinia mangostana merupakan spesies dari genus Garcinia yang banyak terdapat di Asia Tenggara.2
7
Di daerah Sumatera Utara, salah satu jenis Garcinia yang dapat pula diambil buahnya yaitu jenis G.atroviridis. Selain itu, G.atroviridis memiliki daya tarik tersendiri yaitu saat tunas muda tumbuh bersama-sama dalam satu pohon sehingga menimbulkan dua warna daun muda yang menarik yaitu hijau muda dan merah muda. Tumbuhan Garcinia umumnya memiliki ukuran yang tidak terlalu besar.3 Genus Garcinia memiliki struktur kayu yang keras dengan warna beragam mulai dari kuning sampai coklat kemerahan. Habitus pohon memiliki tinggi mencapai 25-33 m. Diameter batang pohon sekitar 60-100 cm dan mengecil ke arah ujung. Garcinia jarang yang berupa semak dan bentuk pohon umumnya kerucut dengan percabangan berselang-seling. Umumnya daun berwarna hijau. Bunga betina biasanya memiliki ukuran yang lebih besar dibandingkan bunga jantan dan bunga terdapat di bagian ketiak daun. Seluruh bagian pada tumbuhan ini dapat mengeluarkan getah yang kental dan lengket berwarna putih atau kuning.2 Berdasarkan kemotaksonomi, spesies tumbuhan dalam satu genus memiliki aktivitas kimiawi yang sama secara kualitatif dan akan berbeda secara kuantitatif. Perbedaan kuantitatif dari setiap senyawa dipengaruhi oleh ekosistem tumbuhan tersebut. Bagian tertentu pada tumbuhan seperti kulit batang dan akar juga dapat ditemukan senyawa-senyawa yang sama atau berbeda. Selain itu afinitas kimiawi dalam satu genus memiliki hubungan kekerabatan molekul yang dapat dilihat pada jalur biogenesis pembentukan senyawa-senyawa tersebut.12 Genus Garcinia mengandung senyawa xanton yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan, antibakteri, antidiabetes, antikanker dan antiinflamasi. Pada G. mangostana diketahui terdapat senyawa alfamangostin dan garcinone E yang berperan untuk menghambat proliferasi sel kanker dengan mengaktivasi enzim kaspase 3 dan 9 untuk memicu apoptosis sel kanker. Alfamangostin mampu menghambat pertumbuhan sel kanker dengan nilai IC50 sebesar 1 µg/1µL (2.44 µM).13,14 Garcinia mangostana Linn telah diketahui menghasilkan 6 turunan xanton yaitu senyawa alfamangostin, betamangostin, gamamangostin, mangostinone, garcinone, garcinone E, dan 2-isoprenyl-1,7-dihydroxy-3-methoxyxanthone. Jenis
8
xanton yang paling berperan sebagai antikanker, antioksidan, dan mengaktifkan sistem imun tubuh yaitu alfamangostin, betamangostin, dan garcinone E. 15 Beberapa senyawa xanton dari berbagai spesies Garcinia diantaranya adalah porsaton A dari G. parvifolia; 1,4-dihidroksi-2-(3’-metilbut-2’-enil) xanton dari G. polyanta Oliv; 1,7-dihidroksi-6’,6’-dimetilpiran-(2’,3’:6,5) xanton dari G. nigrolineata; 1,6-dihidroksi xanton, 1,4,5-trihidroksi xanton dari G. vieillardii. Senyawa – senyawa ini melalui penelitian bioaktivitas secara in vitro maupun in vivo telah menunjukan aktifitas sebagai antijamur, antibakteri, antikanker, antifungal, dan antimalaria.16 Spesies lain dari Genus Garcinia yang memiliki khasiat antikanker adalah Garcinia griffithii T.Anders yang dikenal dengan nama kandis gajah. Ekstrak metanol dari kulit batang tumbuhan Garcinia griffithii T. Anders dapat menghambat pertumbuhan sel kanker payudara MCF-7. Nilai IC50 dari ekstrak metanol sebesar 68,613 μg/mL.16 Pada umumnya tumbuhan dapat menghasilkan senyawa metabolit primer dan metabolit sekunder. Metabolit primer yaitu protein, lemak, asam nukleat, dan polisakarida merupakan penyusun dari makhluk hidup. Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis tumbuhan untuk mempertahankan eksistensi dalam berinteraksi dengan ekosistem dan berperan pada kelangsungan hidup suatu spesies. Senyawa metabolit sekunder diantaranya adalah flavonoid, benzofenon, dan xanton.12,17 Di habitat aslinya, Garcinia dapat dijadikan pohon tropis yang memiliki potensi sebagai tanaman hias, koleksi buah, pohon tepi jalan, reboisasi, penghijauan, atau sumber makanan bagi satwa. Walaupun tumbuhan Garcinia belum terlalu dibudidayakan oleh masyarakat, tetapi secara alami dapat beradaptasi dengan baik.3
2.1.4 Tumbuhan Garcinia Benthami Pierre Garcinia benthami Pierre dapat tumbuh di hutan dataran rendah dan termasuk tumbuhan tahunan, masa hidupnya dapat mencapai puluhan tahun. Warna daun tanaman ini selalu berwarna hijau. Genus Garcinia termasuk ke
9
dalam Famili Clusiaceae yang umumnya dikenal sebagai tumbuhan keluarga manggis dan sering digunakan untuk obat tradisional atau tanaman pangan. 3
Gambar 2.1 Pohon Garcinia benthami Pierre Sumber : Dokumentasi pribadi
Taksonomi tumbuhan Garcinia benthami Pierre memiliki klasifikasi sebagai berikut :2 Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledoneae
Sub kelas
: Archichlamydeae
Ordo
: Guttiferales
Familia
: Clusiaceae
Genus
: Garcinia
Species
: Garcinia benthami Pierre
Pada umumnya, tinggi pohon Garcinia benthami Pierre mencapai 30 m dan pohon berbentuk kerucut dengan percabangan berselang-seling. Pohon ini memiliki batang yang lurus dan daun berwarna hijau. Bunga jantan memiliki benang sari dan ukuran bunga jantan lebih kecil dibandingkan bunga betina. Bunga terdapat di ketiak daun, memiliki daun kelopak dan daun mahkota sekitar
10
4-5 helai.2 Menurut data koleksi Kebun Raya Bogor pada tahun 2000, ukuran tumbuhan G.benthami Pierre yaitu tinggi 17 m, diameter batang 43,13 cm, dan diameter tajuk 12 m.3 a.
b.
Gambar 2.2 Daun Garcinia benthami Pierre Sumber : a) http://www.asianplant.net/Clusiaceae/Garcinia_benthami.htm b) dokumentasi pribadi
Hasil isolasi dari daun Garcinia benthami Pierre yaitu ditemukan kandungan senyawa kimia triterpen dan benzofenon. Selain itu, ekstrak n-heksan, etil asetat, aseton, dan metanol dari daun Garcinia benthami Pierre menunjukkan nilai IC50 berturut-turut 82222 μg/mL, 235,81 μg/mL, 34,69 μg/mL dan 29,91 μg/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa pada ekstrak aseton dan metanol
11
terdapat aktivitas antioksidan, sedangkan ekstrak n-heksan dan etil asetat tidak memiliki aktivitas antioksidan.2
2.1.5 Definisi Toksikologi Definisi toksin atau racun adalah zat yang jika masuk ke dalam tubuh dalam dosis yang cukup dan bereaksi secara kimiawi dapat menimbulkan kematian atau kerusakan berat pada orang yang sehat. 18 Efek toksik atau keracunan dapat berakibat fatal dan mengancam kehidupan. Adanya interaksi dari zat kimia yang berlebihan dapat menimbulkan efek toksik. Jumlah zat kimia atau metabolitnya di sel sasaran akan berpengaruh dalam menentukan efek toksik. 19 Dalam kehidupan sehari-hari, manusia sering berinteraksi dengan zat kimia disekitarnya. Zat kimia tersebut ada yang berdampak positif dan ada pula yang berdampak negatif. Apabila terjadi interaksi dari zat kimia atau metabolitnya yang berlebihan, maka dapat menimbulkan efek toksik. Pada beberapa spesies atau individu yang homogen, adanya peningkatan dosis zat toksik yang diberikan maka akan sebanding dengan peningkatan respon toksik. 20 Toksikologi merupakan suatu ilmu yang mempelajari aksi berbahaya zat kimia atas sistem biologi. Definisi ketoksikan atau toksisitas adalah kapasitas suatu zat kimia/beracun (xenobiotics) untuk dapat menimbulkan efek toksik tertentu pada makhluk hidup.19 Lamanya paparan zat toksik berhubungan erat dengan efek toksik yang ditimbulkan. Taraf toksisitas dipengaruhi berbagai faktor antara lain :20 a) Spesies uji b) Cara racun masuk ke dalam tubuh c) Frekuensi dan lamanya paparan d) Konsentrasi zat pemapar e) Bentuk, sifat kimia/fisika zat pencemar f) Kerentanan berbagai spesies terhadap pencemar Kehidupan manusia sangat bergantung dengan keadaan lingkungan disekitarnya. Oleh karena itu, salah satu manfaat penentuan LC (Lethal Concentration) yaitu agar dapat menentukan konsentrasi zat yang boleh atau aman ada di lingkungan.20
12
Umumnya, penelitian toksikologi dibagi menjadi tiga kategori : a) Uji toksisitas akut, dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji sebanyak satu kali atau beberapa kali dalam jangka waktu 24 jam. Takaran konsentrasi yang dianjurkan yaitu dari konsentrasi terendah yang tidak atau hampir tidak mematikan seluruh hewan uji sampai dengan konsentrasi tertinggi yang dapat mematikan seluruh atau hampir seluruh hewan uji. 21 b) Uji toksisitas jangka pendek, dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji secara berulang-ulang. Umumnya setiap hari atau lima kali seminggu selama jangka waktu sekitar 10% dari masa hidup hewan uji.21 Uji ini bertujuan untuk melihat pengaruh paparan suatu zat yang berulang-ulang dengan dosis yang tidak mematikan atau dosis yang kemungkinan akan diberikan pada manusia.19 Uji ini terbagi menjadi dua macam :
Uji toksisitas subakut adalah uji untuk menentukan besarnya dosis pada penelitian toksisitas subkronik, menentukan dosis atau kadar tanpa efek, dan lama uji 14 hari.19
Uji toksisitas subkronik adalah uji yang menggunakan minimal 3 dosis uji dan 1 kontrol, menggunakan 2 spesies hewan uji, dan lama uji 90 hari.19
c) Uji toksisitas jangka panjang (kronik), dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji secara berulang-ulang selama masa hidup hewan uji atau sebagian besar masa hidupnya.21 Wujud efek toksik yaitu adanya perubahan atau gangguan biokimiawi, fungsional atau struktural suatu sel. Dapat pula kerusakan sel akibat gabungan dua atau ketiga gangguan di atas. Terdapat dua jenis efek toksik :19 a) Ciri efek toksik reversible (terbalikan) :
Reseptor dapat kembali seperti keadaan semula ketika jumlah zat toksik dalam tempat kerjanya atau reseptornya telah habis.
Efek toksik yang ditimbulkan akan cepat hilang atau kembali normal.
Taraf toksisitas tergantung dari dosis, kecepatan absorpsi, distribusi, dan eliminasi zat toksik.
b) Ciri efek toksik irreversible (tidak terbalikan) :
Kerusakan yang ditimbulkan bersifat permanen.
13
Dapat terjadi akumulasi efek toksik apabila ada paparan berikutnya yang menimbulkan kerusakan dengan sifat sama.
menimbulkan zat racun yang sangat sukar dieliminasi.
paparan dengan takaran sangat kecil dalam jangka panjang akan menimbulkan efek toksik yang sama efektifnya dengan efek pada paparan dosis besar jangka pendek.
2.1.6 Uji Toksisitas Akut Tujuan memahami toksikologi yaitu agar dapat menilai keamanan suatu zat yang akan kita gunakan dalam pengobatan. Efek berbahaya yang terjadi segera setelah terpapar suatu zat tunggal atau kombinasi zat sekali atau beberapa kali dalam waktu yang singkat merupakan pengertian dari toksisitas akut. Makna akut menunjukkan bahwa efek berbahaya yang terjadi segera setelah terpapar dosis tunggal atau berulang dalam waktu 24 jam. Toksisitas atau efek berbahaya yang ditimbulkan dapat menyebabkan gangguan fungsional, biokimiawi, atau fisiologis (struktural).19 Pengujian yang dilakukan untuk mengukur derajat efek suatu senyawa yang diberikan pada hewan coba tertentu dan pengamatan dilakukan pada 24 jam pertama setelah perlakuan yang dilakukan dalam satu kesempatan saja disebut sebagai uji toksisitas akut, yang data kuantitatifnya dapat diperoleh melalui LD50 atau LC50.22 Dosis atau konsentrasi yang diberikan sekali (tunggal) atau beberapa kali dalam 24 jam dari suatu zat yang secara statistik diharapkan dapat mematikan 50 persen hewan coba disebut sebagai LD50 (median lethal dose) atau LC50 (median lethal concentration).19 Perbedaan istilah untuk menyatakan toksisitas suatu zat : a) Lethal Dose (LD) menyatakan jumlah zat yang masuk ke dalam tubuh organisme atau hewan coba yang menyebabkan respon berupa kematian hewan coba. Tujuannya untuk mencari dosis aman menggunakan LD50.19 b) Lethal Concentration (LC) menyatakan konsentrasi zat yang berada di luar tubuh organisme atau hewan coba yang menyebabkan respon berupa kematian hewan coba. Pada
14
umumnya, semakin besar nilai LC50 maka semakin rendah toksisitasnya. Namun sebaliknya, semakin kecil nilai LC50 maka semakin toksik senyawa tersebut.19
2.1.7 Metode Ekstraksi Simplisia Simplisia merupakan bahan alam yang digunakan sebagai obat dan belum mengalami pengolahan kecuali dinyatakan berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia yang berasal dari tanaman utuh, bagian tanaman, dan eksudat tanaman dengan tingkat kehalusan tertentu disebut simplisia nabati. 23 Proses ekstraksi merupakan suatu kegiatan untuk menarik kandungan senyawa kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan menggunakan pelarut cair. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan cara dingin atau cara panas. 2 Metode ekstraksi cara dingin yaitu dalam pengerjaannya tidak ada proses pemanasan selama proses ekstraksi berlangsung, tujuannya untuk menghindari rusaknya senyawa. Dalam melakukan ekstraksi, maka perlu diperhatikan hal-hal berikut :5 a)
Tipe ekstraksi
b)
Jumlah simplisia yang akan diekstrak
c)
Derajat kehalusan simplisia Semakin halus, maka luas kontak permukaan akan semakin besar sehingga mengoptimalkan proses ekstraksi.
d)
Jenis, konsentrasi, dan polaritas pelarut Senyawa yang memiliki kepolaran yang sama akan lebih mudah tertarik atau larut dengan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang sama.
Pada ekstraksi terjadi pemisahan suatu zat dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut yang didasarkan karena adanya perbedaan kelarutan. Ekstrak dapat berupa ekstrak kental, padat atau cair dengan cara menyaring simplisia. Prosedur umum untuk mendapatkan kandungan senyawa organik dari jaringan tumbuhan kering (galih, biji kering, akar, daun) yaitu dengan mengekstraksi serbuk bahan.24
15
Ada dua cara metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut : 1. Cara dingin a. Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan cara perendaman menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengadukan pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya. Metode ini paling sesuai digunakan untuk simplisia dengan zat khasiat yang tahan pemanasan atau tidak tahan pemanasan.5 b. Perkolasi Perkolasi adalah proses ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi pengekstrakan sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Metode ini dengan cara melewatkan pelarut yang sesuai secara lambat pada simplisia dalam suatu perkolator.2 Proses perkolasi : Pengembangan bahan Tahap maserasi antara Tahap perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak) Pelarut yang digunakan tidak mudah menguap dan dapat melarutkan senyawa kimia dalam simplisia dengan baik. Dalam teknik ini, dibutuhkan jumlah pelarut yang lebih banyak.23 2. Cara panas a. Refluks Refluks adalah proses ekstraksi dengan menggunakan alat pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Metode ini digunakan untuk mengektraksi bahan-bahan yang tahan terhadap pemanasan dan bahan yang memiliki tekstur kasar.2 b. Digesti Digesti adalah proses pengekstrakan dengan pengadukan terus-menerus atau disebut maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur lebih tinggi daripada temperatur ruangan, yaitu umumnya pada temperatur 40-50°C.2
16
c. Soxhlet Soxhlet yaitu proses ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru dan dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ektraksi terus-menerus dengan jumlah pelarut yang relatif konstan dan adanya pendingin balik.2 c. Infudasi Infudasi adalah proses ekstraksi yang umum digunakan untuk mengekstraksi zat kandungan aktif yang larut dalam air. Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan mengekstrak simplisia dengan air pada suhu 900C selama 15 menit.23 d.
Dekoktasi Dekoktasi adalah metode infudasi dengan waktu yang lebih lama (≥ 300C) dan temperatur sampai mencapai titik didih air.2
Penentuan zat aktif dari bahan tanaman sebagian besar tergantung pada jenis pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi. Pelarut yang digunakan umumnya dibedakan berdasarkan tingkat kepolaran sehingga dapat diketahui sifat kepolaran dari senyawa yang terkandung.5 Pelarut n-heksana digunakan untuk menarik lemak dan senyawa non polar. Senyawa non polar akan larut dalam pelarut yang non polar. Pelarut etil asetat untuk menarik senyawa bersifat semi polar. Pelarut metanol untuk menarik senyawa polar. Senyawa polar akan larut dalam pelarut bersifat polar.2 Komponen zat aktif tumbuhan yang dapat diekstraksi dengan pelarut metanol diantaranya terpenoid, saponin, tanin, flavones, phenones, dan polyphenols.5 Dilakukan pengukuran berat masing-masing ekstrak yang diperoleh dari hasil maserasi bertingkat. Persentase rendemen ekstrak dapat dihitung dengan rumus:2 Rendemen (%) =
Berat ekstrak (gram) x 100% Berat simplisia awal (gram)
Metode maserasi memiliki keuntungan karena pengerjaannya mudah dan sederhana. Dengan menggunakan metode maserasi, maka terjadi pemisahan komponen aktif dalam bahan yang memiliki kelarutan yang sama dengan pelarut yang digunakan. Sifat pelarut yang akan digunakan bergantung pada polaritas,
17
stabil secara fisika dan kimia, toksisitas, kemudahan menguap, reaktivitas, ketersediaan, dan harga.23 Metanol adalah bentuk alkohol paling sederhana dengan rumus kimia yaitu CH3OH dan dikenal dengan nama lain metil alkohol, metal hidrat, metil karbinol, atau spiritus. Pada keadaan atmosfer, metanol berbentuk cairan yang ringan, mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar dan berbau yang khas (berbau lebih ringan daripada etanol). Metanol biasanya dimanfaatkan sebagai bahan pendingin anti beku, pelarut, dan bahan bakar.25 Sifat Fisik dan Kimia Metanol Massa molar
: 32,04 gram/mol
Wujud
: Cairan tidak berwarna
Specific gravity
: 0,7918
Titik leleh
: -970C, -142,90F, 176 K
Titik didih
: 64,70C, 148,40F, 337,8 K
Kelarutan dalam air
: Sangat larut
Keasaman (pKa)
: ~15,5
Gambar 2.3 Sifat – sifat fisika dan kimia metanol Sumber : Perry RH, Green DW. Perry’s chemical engineering handbook. 6th ed. New York : McGraw Hill Book Company, Inc;1984.
Di dalam tubuh, metanol akan dimetabolisme di hati oleh enzim Alkohol Dehidrogenase (DHA) menjadi formaldehide dan selanjutnya oleh enzim Formaldehide dehidrogenase ( FDH ) diubah menjadi asam format. Kedua hasil metabolisme tersebut merupakan zat beracun bagi tubuh terutama asam format.26 Adanya korelasi antara konsentrasi asam format dalam cairan tubuh dengan terjadinya keracunan metanol. Berat ringannya gejala akibat keracunan metanol tergantung dari jumlah kadar metanol yang tertelan. Dosis toksik minimum (kadar keracunan minimal) metanol sekitar 100 mg/kg dan dosis fatal keracunan metanol diperkirakan 20 – 240 mL (20 – 150 g).27
CH3-OH Metanol
Alkohol
Formaldehide
tetrahidrofolate-
dehidrogenase
dehidrogenase
dependent pathway
O=CH2 Formaldehide
O=CH-OH
CO2+H2O
Formate
Gambar 2.4 Metabolisme metanol Sumber : Barile FA.Clinical toxicology: principles and mechanisms.Florida:CRC Press LLC;2004.
18
2.1.8 Larva Udang Artemia salina Leach Artemia salina Leach merupakan hewan uji brine shrimp (udang laut), sejenis udang-udangan primitif dan hidup sebagai zooplankton. Artemia pada tahun 1778 diberi nama cancer salinus yang kemudian diubah namanya oleh Leach pada tahun 1819 menjadi Artemia salina. Hewan ini diperdagangkan dalam bentuk telur istirahat yang disebut kista, berbentuk bulat kecil berwarna kelabu kecoklatan dengan diameter 200-300 µm.23 Kista Artemia dapat diperoleh dari San Francisco Bay (California, USA), Great Salt Lake (Utah, USA), Tsingtao (China) atau Burgas-Pomorije (Bulgaria).28 Klasifikasi & Morfologi Artemia salina Leach29 Kingdom
: Animalia
Phylum
: Arthropoda
Classis
: Crustaceae
Subclassis
: Branchiopoda
Ordo
: Anostraca
Famili
: Artemiidae
Genus
: Artemia
Species
: Artemia salina Leach
Siklus hidup udang (Artemia salina) secara umum dapat dilihat dalam tiga fase yaitu bentuk telur, larva (nauplii) dan artemia dewasa. Telur berbentuk bulat dengan ukuran 0,2-0,3 mm. Selanjutnya telur akan menetas menjadi larva. Telur yang baru menetas ini berukuran kurang lebih 300 µ. Sebelum berubah menjadi artemia dewasa, larva mengalami 15 kali perubahan bentuk dalam satu tingkatan hidup. Waktu yang dibutuhkan hingga menjadi artemia dewasa umumnya sekitar 2 minggu. Pada fase artemia dewasa, berbentuk silinder dengan panjang 12-15 mm dan tubuh terbagi atas bagian kepala, dada dan perut. Hewan ini dapat bertahan hidup dalam air dengan suhu 25o-30oC, perairan yang berkadar garam tinggi (antara 15-30 permil), oksigen terlarut sekitar 3 mg/L,dan pH sekitar 8-9.29
19
Gambar 2.5 Siklus hidup Artemia salina Leach Sumber : Mudjiman, A. Udang renik air asin. Jakarta : Bhrata Karya Aksara;1995.
Tahapan penetasan Artemia yaitu tahap hidrasi, tahap pecah cangkang, dan tahap payung atau pengeluaran. Tahap hidrasi terjadi penyerapan air sehingga kista dalam bentuk kering akan menjadi bulat dan aktif bermetabolisme. Tahap pecah cangkang dan kemudian tahap pengeluaran yang terjadi beberapa saat sebelum nauplii keluar dari cangkang. Artemia yang baru menetas disebut nauplii, berwarna orange dan berbentuk bulat lonjong. 23
Gambar 2.6 Tahap penetasan telur Artemia Sumber :Baraja M. Uji toksisitas ekstrak daun Ficus elastica Nois ex Blume terhadap larva Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis. [Skripsi]. Surakarta : Universitas Muhammadiyah Surakarta;2008.
20
Di dalam air laut yang bersuhu 25 oC, telur-telur yang kering direndam dan akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Setelah telur menetas, maka menjadi larva yang juga disebut dengan istilah nauplius. Larva akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Larva tingkat I dinamakan instar, tingkat II instar II, tingkat III Instar III, demikian seterusnya sampai Instar XV. Setelah itu, baru berubah menjadi artemia dewasa.29
Gambar 2.7. Larva Artemia salina Leach setelah menetas A) 24 jam, B) 48 jam, C) 72 jam. Sumber : Biological Research Articles “Chronic toxicity bioassay with populations of the crustacean Artemia salina exposed to the organophosphate diazinon”. Laboratory of Biology of Reproduction, School of Medicine, University of Chile, Santiago.
Larva yang baru saja menetas atau tingkat instar I, berbentuk bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron (0,4 mm) dan beratnya 15 mikrogram. Nauplius instar II panjangnya sekitar 0,6 mm, sedangkan nauplius instar III sudah sepanjang 0,7 mm. Warna tubuhnya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan sehingga belum perlu makanan. Anggota badannya terdiri dari antenula atau antena I dan sepasang antena II. Dibagian depan diantara kedua antena I terdapat bintik merah yang merupakan mata larva (oselus). 29
Gambar 2.8 Bagian tubuh larva Artemia salina Leach Sumber :http://www.ecotao.co.za/html/artemia.html
21
Pada pangkal antena II terdapat bentuk seperti duri yang menghadap ke belakang dan dinamakan gnotobasen seta, merupakan ciri khusus untuk membedakan larva instar I, instar II dan instar III. Pada larva instar I, gnotobasen setanya masih belum berbulu dan juga belum bercabang. Sekitar 24 jam setelah menetas, larva akan berubah menjadi instar II dimana gnotobasen setanya sudah berbulu tetapi masih belum bercabang. Sedangkan pada instar III, gnotobasen setanya sudah berbulu dan bercabang.29
Gambar 2.9 Karakteristik morfologi larva Artemia tingkat instar I, II, dan III Sumber : Panjaitan RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae cortex) dengan metode brine shrimp lethality test. [Skripsi]. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma; 2011.
Pada tingkatan instar II, larva mulai mempunyai mulut dan saluran pencernaan sehingga mereka mulai mencari makan untuk memenuhi cadangan makanan yang mulai berkurang. Pengumpulan makanan dilakukan dengan cara menggerakkan antena II-nya. Selain itu, antena II juga berfungsi untuk pergerakan larva. Tubuh instar III lebih panjang dibandingkan instar I dan instar II.29 Pada tingkatan instar selanjutnya, mulai terbentuk sepasang mata majemuk. Selain itu, dibagian samping tubuhnya (kanan dan kiri) juga mulai tumbuh tunas kakinya yang disebut torakopada. Awalnya tumbuh dibagian depan kemudian diikuti oleh bagian-bagian yang lebih ke belakang. Setelah menjadi instar XV, sudah memiliki kaki lengkap sebanyak 11 pasang sehingga berakhirlah fase larva dan berubah menjadi artemia dewasa.29 Artemia sering digunakan sebagai hewan uji untuk skrining aktivitas antikanker di National Cancer Institute (NCI), Amerika Serikat. Artemia salina
22
Leach
digunakan
dalam
metode
BSLT
karena
memiliki
kesamaan
tanggapan/respon dengan mamalia, misalnya DNA-dependent RNA polymerase serupa dengan yang terdapat pada mamalia dan organisme yang memiliki ouabaine sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase. Jika RNA polimerase dihambat, maka DNA tidak dapat mensintesis RNA dan RNA tidak dapat terbentuk sehingga sintesis protein juga dihambat. Protein merupakan komponen utama sel yang berfungsi sebagai unsur struktural, hormon, imunoglobulin dan berperan dalam transport oksigen. Jika protein tidak terbentuk maka metabolisme sel terganggu dan pada akhirnya dapat menyebabkan kematian sel. Apabila suatu senyawa menganggu kerja sistem pada Artemia dan menyebabkan kematian Artemia, maka senyawa tersebut bersifat toksik dan dapat mematikan sel mamalia.29 Artemia memiliki respon stress yang sama dengan manusia, yaitu respon perilaku dan fisiologis terhadap stressor lingkungan. 30
2.1.9 Metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) BSLT merupakan salah satu metode skrining untuk menentukan toksisitas suatu senyawa dan sering digunakan sebagai bioassay dalam mengisolasi senyawa toksik dari ekstrak tumbuhan.23 Penentuan toksisitas
senyawa
atau
ekstrak secara
akut
dengan
menggunakan hewan coba larva udang (Artemia salina Leach) merupakan uji pendahuluan/praskrining aktivitas biologis yang sederhana. Metode BSLT ini dapat digunakan sebagai uji praskrining pada penelitian senyawa-senyawa yang mengarah pada uji aktivitas sitotoksik. Bila suatu senyawa bahan alam memberikan efek toksik pada LC50 dengan konsentrasi lebih dari 1000 ppm maka termasuk ke dalam kategori senyawa tidak toksik. Sedangkan apabila LC50 dengan konsentrasi kurang dari 1000 ppm maka termasuk kategori senyawa toksik.31 Tabel 2.1 Kategori toksisitas berdasarkan nilai LC50 Kategori Sangat toksik Toksik Tidak toksik
LC50 (μg/ml) < 30 30-1000 >1000
Sumber : Batubara I, Sudirman S, Ramadhan W, Oktavia Y, Tirta F.P. Kandungan kimia, senyawa aktif, dan toksisitas dari Eucheuma Cottonii, Caulerpa sp. dan Solen sp. Departemen Kimia FMIPA IPB.
23
Tolok ukur atau parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologi suatu senyawa pada Artemia salina Leach yaitu dengan menghitung jumlah kematian larva udang akibat pengaruh pemberian senyawa dengan konsentrasi yang telah ditetapkan. Hasil uji dikatakan efektif terhadap larva Artemia salina Leach apabila ekstrak yang diujikan menyebabkan 50% kematian pada konsentrasi kurang dari 1000 ppm. 32 Beberapa kelebihan dari uji toksisitas dengan BSLT diantaranya :11 a)
metode penapisan farmakologi awal yang mudah, cepat, dan relatif tidak mahal.
b)
metode yang telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaan 95% untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak kasar tumbuhan.
c)
sering digunakan dalam tahap awal isolasi senyawa toksik yang terkandung dalam suatu ekstrak.
d)
metode ini sering dihubungkan sebagai metode penapisan untuk pencarian senyawa antikanker dari tumbuhan.
BSLT sebagai suatu bioassay yang pertama untuk penelitian bahan alam. Apabila didapatkan hasil uji BSLT menunjukkan bahwa ekstrak tanaman mempunyai potensi toksik, maka dapat dilanjutkan penelitian untuk mengisolasi senyawa yang bersifat sitotoksik sebagai upaya mengembangkan obat alternatif antikanker. Namun sebaliknya, apabila hasilnya menunjukkan tidak mempunyai potensi toksik, maka dapat dilanjutkan penelitian mengenai manfaat dan khasiat lain dari ektrak tanaman tersebut.33
2.1.10 Metode Penentuan Nilai LD50 atau LC50 Terdapat beberapa cara untuk menentukan nilai LD50 atau LC50, diantaranya metode Weil, cara Farmakope III, dan metode probit. 19 a) metode Weil, menggunakan rumus : Log m = Log D + d (f +1) keterangan : 19 m = nilai LD50 D = dosis terkecil yang digunakan d = log dari kelipatan dosis
24
f = suatu nilai dalam tabel Weil b) cara Farmakope Indonesia III (FI III), menggunakan rumus :19 m = a-b (∑pi-0,5) keterangan : m = log LD50 a = logaritma dosis terendah yang masih menyebabkan jumlah kematian 100% tiap kelompok b = beda log dosis yang berurutan pi = jumlah hewan mati menerima dosis i dibagi jumlah hewan seluruhnya yang menerima dosis i syarat uji FI III :
Seri dosis atau konsentrasi yang digunakan berkelipatan tetap
hewan coba atau biakan jaringan pada tiap kelompok harus berjumlah sama
pengaturan dosis agar menghasilkan respon dari 0-100% dan hitungan dapat dibatasi pada rentang tersebut.
c) Metode Probit Analisis probit merupakan jenis regresi yang digunakan untuk menganalisis variabel respon binomial. Analisis probit merupakan metode statistik dalam memahami hubungan dosis-respon dan membandingkan hubungan antara variabel respon atau variabel dependen terhadap variabel independen. Analisis ini umumnya digunakan dalam toksikologi untuk menentukan toksisitas relatif dari bahan kimia untuk organisme hidup dengan menguji respon organisme pada berbagai konsentrasi masing-masing bahan kimia. 34 Nilai LC50 atau LD50 adalah hasil yang paling sering digunakan pada percobaan dosis-respon. Syarat menghitung nilai LD50 atau LC50 menggunakan metode probit : 19
adanya tabel probit
menentukan nilai probit dari % kematian tiap kelompok hewan uji
menentukan log dosis tiap-tiap kelompok
25
menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis, Y=mX+b
memasukkan nilai 5 (probit dari 50% kematian hewan coba) pada persamaan garis lurus pada nilai Y. Nilai LD50 atau LC50 dihitung dari nilai anti log X pada saat Y=5. Regresi adalah pengukur hubungan dua variabel atau lebih yang
dinyatakan dalam bentuk hubungan atau fungsi. Untuk menentukan bentuk hubungan (regresi) diperlukan pemisahan yang tegas antara variabel bebas yang biasanya diberi simbol X dan variabel tak bebas dengan simbol Y. Kedua variabel biasanya bersifat kausal atau memiliki hubungan sebab akibat yaitu saling berpengaruh.35 m dan b merupakan konstanta atau koefisien regresi linier sederhana atau parameter garis regresi linier sederhana. b disebut intercept coefficient atau intersep yaitu jarak titik asal atau titik acuan dengan titik potong garis regresi dengan sumbu Y, sedangkan m disebut slope coefficient atau slup yang menunjukkan kemiringan atau kecondongan garis regresi terhadap sumbu X sebagai tangen sudut yang dibuat oleh garis regresi dengan sumbu X. Dari persamaan garis regresi, dalam hubungan tersebut terdapat satu variable bebas X dan satu variabel tak bebas Y.35
2.2
Kerangka Konsep ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre
mengandung senyawa kimia yang berpotensi memiliki bioaktivitas
uji toksisitas akut
metode BSLT dengan hewan coba larva Artemia salina Leach
Kematian larva Artemia salina Leach Nilai LC50
26
2.3
Definisi Operasional
No
Variabel
1.
Definisi
Cara ukur
V1M1=V2M2
Alat
Skala
ukur
ukur
-
Numerik
Hasil ukur
Konsentrasi
Konsentrasi
ekstrak
ekstrak dalam
500 ppm
metanol daun
ppm (1
200 ppm
Garcinia
μg/mL)
100 ppm
benthami
1000 ppm
50 ppm
Pierre 2.
Persentase
Hasil perkalian
Jumlah larva mati
-
Numerik
Jumlah
mortalitas
rasio dengan
dibagi jumlah larva
persentase
larva Artemia
100%, yaitu
awal dikali 100%
kematian
salina Leach
larva yang
larva
mati dibagi jumlah larva awal dikali 100% untuk tiap replikasi. 3.
LC50
Konsentrasi
Ditentukan dari
yang diberikan
persamaan garis
dari 1000
sekali
lurus y=mX+b
ppm maka
(tunggal) atau
dengan
senyawa
beberapa kali
memasukkan nilai 5
toksik.
dalam 24 jam
(probit dari 50 %
LC50 lebih
dari suatu zat
kematian hewan
dari 1000
yang secara
coba) sebagai y
ppm maka
statistik
sehingga dihasilkan
senyawa
diharapkan
x sebagai nilai log
tidak toksik.
dapat
konsentrasi dan
mematikan
antilog x sebagai
50% hewan
LC50
coba.
-
Kategorik
LC50 kurang
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1
Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan post test only control group design untuk menguji toksisitas dari ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode BSLT.
3.2
Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari 2013 sampai bulan Agustus 2013 di Laboratorium Farmasi dan Laboratorium Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3
Populasi dan Sampel 3.3.1 Populasi Populasi pada penelitian ini adalah larva Artemia salina Leach. 3.3.2 Sampel 3.3.2.1. Kriteria inklusi Larva Artemia salina Leach berumur 48 jam sebagai hewan uji. 3.3.2.2. Kriteria eksklusi Larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas pergerakan sebelum perlakuan. 3.3.2.3. Besar sampel Jumlah larva Artemia salina Leach yang digunakan adalah 10 ekor larva untuk tiap konsentrasi ekstrak. Pada penelitian ini terdapat lima konsentrasi dan satu kontrol negatif. Kemudian dilakukan replikasi tiga kali (triplo) untuk tiap konsentrasi dan kontrol negatif. Jadi, jumlah sampel total yang diperlukan adalah 180 ekor larva Artemia salina Leach setiap kali perlakuan. 27
28
3.3.2.4. Cara pengambilan sampel Sampel diambil secara purposive random sampling. Larva Artemia salina Leach dengan jenis dan cara penyediaan yang sama sehingga mempunyai kesempatan yang sama untuk diseleksi sebagai sampel. Hal ini karena anggota populasi telah bersifat homogen.36
3.4
Determinasi Tanaman Identifikasi atau determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor. Dengan melakukan determinasi, maka dapat menetapkan kebenaran yang berkaitan dengan struktur dan morfologi secara makroskopis tanaman daun Garcinia benthami Pierre terhadap kepustakaan.
3.5
Bahan yang Diuji 6 kg daun basah Garcinia benthami Pierre yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor. Penyiapan bahan ini dilakukan dengan memisahkan daun dari tangkainya dan membersihkan daun dari sisa-sisa tanah dan kotoran kemudian dicuci dengan air yang bersih dan mengalir. Kemudian daun dikeringkan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balitro),Bogor. Daun yang telah kering, dihaluskan dengan menggunakan blender sampai berbentuk serbuk halus. Didapatkan 1 kg serbuk halus simplisia kering daun Garcinia benthami Pierre yang akan digunakan untuk membuat ekstrak.
3.6
Alat dan Bahan Penelitian 3.6.1 Alat Penelitian 1.
Rotary evaporator
2.
Batang pengaduk
3.
Corong
4.
Gelas ukur 10 mL
29
5.
Mikropipet
6.
Neraca analitik
7.
Pipet tetes
8.
Tabung reaksi
9.
Seperangkat alat penetasan telur (wadah plastik dan sterofoam)
10.
Cawan penguap
11.
Labu ukur
12.
Bejana kaca maserasi
13.
Lup
14.
Cawan petri
15.
Kaca arloji
3.6.2 Bahan Penelitian 1.
Air laut
2.
Akuades
3.
Aluminium foil
4.
serbuk kering daun Garcinia benthami Pierre
5.
Kertas saring
6.
Pelarut metanol
7.
Telur udang Artemia salina Leach yang diperoleh dari LIPI, Bogor
3.7
Cara Kerja Penelitian 3.7.1 Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre dengan Maserasi Metode ekstraksi dilakukan secara maserasi. Simplisia daun yang sudah berbentuk serbuk kering dan halus sebanyak 1000 gram dimasukkan ke dalam bejana kaca maserasi. Sampel yang telah ditimbang lalu direndam dengan n-heksana dan dimaserasi. Kemudian hasil rendaman disaring untuk memisahkan filtrat dan ampasnya. Perendaman dilakukan sampai filtrat mendekati bening. Filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak n-heksana. Kemudian ampas
30
diangin-anginkan agar terbebas dari pelarut n-heksana. Ampas kering direndam dengan etil asetat. Melakukan penyaringan kembali dan filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak etil asetat.37 Ampas hasil rendaman etil asetat, diangin-anginkan kembali agar pelarut etil asetat menguap. Setelah ampas kering, lalu dituang ke bejana dan direndam dengan 6 liter pelarut metanol yang telah di destilasi. Maserasi dilakukan selama 5 hari dan terlindung dari cahaya. Dilakukan pengadukan beberapa kali sehari agar pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia dan meratakan konsentrasi larutan. Setelah 5 hari, maka dilakukan penyaringan dan diambil filtratnya. Selanjutnya filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 450C hingga didapatkan ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre. Filtrat dituang dalam cawan penguap, kemudian diuapkan di dalam lemari asam. Hasil akhir didapatkan ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre sebanyak 15,5 gram.
6 kg daun basah Garcinia benthami Pierre dibersihkan dan dikeringkan dihaluskan dengan blender dan disaring 1 kg serbuk kering daun Garcinia benthami Pierre maserasi dengan pelarut n-heksana, disaring dan dievaporasi ekstrak n-heksana
ampas maserasi dengan pelarut etil asetat, disaring dan dievaporasi
ekstrak etil asetat keterangan bagan : : dikerjakan oleh peneliti : dikerjakan oleh rekan peneliti
ampas
maserasi dengan pelarut metanol, disaring dan dievaporasi ekstrak metanol
ampas
uji toksisitas akut dengan metode BSLT
Gambar 3.1
Bagan Alur Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre
31
3.7.2 Penetasan Larva Udang Wadah plastik disiapkan untuk penetasan telur udang. Wadah dibagi menjadi dua bagian, yaitu ruang terang dan ruang gelap. Kedua bagian tersebut dibatasi dengan sterofoam yang pada tepi bawahnya telah dilubangi sebagai tempat keluarnya telur yang telah menetas. Memasukkan 1 liter air laut ke dalam wadah hingga kedua lubang pada sterofoam terendam. Salah satu ruang dalam wadah tersebut diberi penerangan dengan cahaya lampu pijar/neon untuk menghangatkan suhu dalam penetasan dan merangsang proses penetasan. Untuk penerangan, lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Untuk ruangan yang satunya, diisi 1 gram telur udang di bagian gelap tanpa penyinaran ditutup dengan aluminium foil dan lakban hitam. Setelah 48 jam, telur akan menetas menjadi larva dan akan bergerak secara alamiah menuju ruang terang. Larva yang sehat bersifat fototropik dan dapat dijadikan hewan uji pada metode BSLT.38 Pada proses penetasan dilakukan dalam kondisi yang sama yaitu air laut yang digunakan dengan pH sekitar 8-9 dan penerangan cahaya lampu yang sesuai untuk penetasan telur.
3.7.3 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak yang Akan Diuji Melakukan trial atau orientasi dengan uji coba untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak yang efektif membunuh larva Artemia salina Leach, yaitu dengan menggunakan konsentrasi desimal, yaitu 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1%, dan 0,05%. Konsentrasi ekstrak yang digunakan yaitu 1000 ppm, 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm. 33 Ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre ditimbang menggunakan neraca analitik hingga mencapai berat 250 mg. Melarutkan 250 mg ekstrak dengan akuades secukupnya. Setelah larut, kemudian dituangkan ke dalam labu ukur 250 mL dan menambahkan akuades hingga batas yang tertera di labu ukur. Larutan uji dihomogenkan dengan cara membolak-balik labu ukur. Larutan uji yang didapatkan yaitu larutan induk dengan konsentrasi 1000 ppm. Selanjutnya membuat larutan uji
32
dengan konsentrasi 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm dengan menggunakan rumus pengenceran: V1M1=V2M2 keterangan : V1 = volume awal M1 = konsentrasi awal V2 = volume akhir M2 = konsentrasi akhir
3.7.4 Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. 5 buah tabung reaksi disiapkan sebagai media uji. Menuangkan 5 mL air laut ke dalam masing-masing tabung reaksi. Memindahkan sebagian larva Artemia salina Leach berumur 48 jam ke dalam cawan petri untuk memudahkan pengambilan larva. Pada masing-masing tabung reaksi, dituangkan 10 larva udang menggunakan pipet tetes. Untuk memudahkan pengamatan, maka digunakan lup. Setelah itu, meneteskan 1 mL ekstrak pada tabung reaksi menggunakan mikropipet. Kemudian, menambahkan air laut sehingga volume dalam masing-masing tabung reaksi menjadi 10 mL. Tabel 3.1 Data Konsentrasi Ekstrak pada Tabung Reaksi Tabung
Tabung reaksi II
reaksi I
Tabung reaksi
Tabung reaksi
III
IV
Tabung reaksi V
10 larva
10 larva udang +
10 larva udang +
10 larva udang +
10 larva udang +
udang + 1
1 mL konsentrasi
1 mL konsentrasi
1 mL konsentrasi
1 mL konsentrasi
mL
ekstrak 500 ppm +
ekstrak 200 ppm +
ekstrak 100 ppm +
ekstrak 50 ppm +
konsentrasi
9 mL air laut
9 mL air laut
9 mL air laut
9 mL air laut
ekstrak 1000 ppm + 9 mL air laut
Masing-masing tabung reaksi ditutup atasnya dengan alumunium foil yang sedikit dilubangi untuk aliran udara. Dilakukan 3 kali pengulangan (triplo) pada setiap konsentrasi. Dilakukan pengadukan agar
33
larutan menjadi homogen. Menyiapkan kontrol negatif, yaitu tabung reaksi yang berisi air laut dan 10 larva udang tanpa penambahan larutan ekstrak. Setelah itu, larutan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang masih hidup pada masing-masing tabung reaksi. Kriteria standar untuk mengukur kematian larva udang yaitu apabila larva udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik pengamatan. Perhitungan larva secara manual yaitu dengan mengamati larva di dalam tabung reaksi dengan bantuan lup, kemudian diamati dalam kaca arloji dengan bantuan cahaya. Jumlah larva yang mati dihitung dengan mengurangkan jumlah total larva pada tiap konsentrasi dengan jumlah larva yang masih hidup.33,39
3.8
Alur Penelitian 1 gram telur Artemia salina Leach Penetasan telur Artemia salina Leach Larva Artemia salina Leach berumur 48 jam Larva Artemia salina Leach dengan jenis dan cara penyediaan yang sama dan telah bersifat homogen
Pengambilan larva secara random kontrol (-) : 10 larva+10 mL air laut tabung reaksi I : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 1000 ppm+9 mL air laut tabung reaksi II : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 500 ppm+9 mL air laut tabung reaksi III : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 200 ppm+9 mL air laut tabung reaksi IV : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 100 ppm+9 mL air laut tabung reaksi V : 10 larva+1 mL konsentrasi ekstrak 50 ppm+9 mL air laut volume akhir pada masing-masing tabung reaksi adalah 10 mL dilakukan replikasi 3 kali pada tiap konsentrasi 24 jam setelah pemberian ekstrak, dilakukan perhitungan jumlah larva yang masih hidup diketahui jumlah larva yang mati menghitung persentase kematian larva pada tiap konsentrasi menentukan nilai LC50 dengan metode probit
Gambar 3.2 Bagan Alur Penelitian
34
3.9
Pengolahan dan Analisis Data Melakukan pengamatan dengan menghitung persentase kematian (mortalitas) larva Artemia salina Leach pada tiap konsentrasi. Persen kematian diperoleh dari hasil perkalian rasio dengan 100%, yaitu larva yang mati dibagi jumlah larva awal dikali 100% untuk tiap konsentrasi. Setelah itu, dibandingkan dengan kontrol negatif dan dilakukan analisis hasil sehingga didapatkan nilai
LC50. Dengan menggunakan metode
analisis probit manual, maka dapat mengetahui nilai probit dengan mengkonversi nilai persen kematian larva pada tiap konsentrasi ke nilai probit dalam tabel probit.37 Persentase kematian =
Jumlah larva mati x 100% Jumlah larva total awal
Setelah mendapatkan persen kematian, lalu mencari nilai probit dari tiap kelompok hewan uji melalui tabel probit. Kemudian menentukan log konsentrasi dan dibuat grafik dengan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi dengan rumus y = mX+b. Keterangan : y adalah angka probit dan x adalah log konsentrasi. Nilai slope (m) dihitung dengan rumus : ∑(X)∑(Y) - n∑(XY) (∑(X))2 - n∑(X2) Nilai Intersep (b) dihitung dengan rumus : ∑(X)∑(XY) -∑(X2)∑(Y) (∑(X))2 - n∑(X2) Metode analisis dapat pula menggunakan Microsoft Office Excel dengan membuat grafik persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi. Nilai LC50 dapat dihitung dari persamaan garis lurus tersebut dengan memasukkan nilai 5 (probit dari 50 % kematian hewan uji) sebagai y sehingga dihasilkan x sebagai nilai log konsentrasi. Antilog nilai x tersebut merupakan nilai LC50.19 LC50 juga dapat ditentukan dengan analisis probit menggunakan SPSS 16.0 for windows.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Hasil Ekstraksi Daun Garcinia benthami Pierre Penelitian ini menggunakan daun Garcinia benthami Pierre. Determinasi
tanaman bertujuan untuk memastikan identitas tanaman yang digunakan sehingga dapat dihindari adanya kesalahan dalam pengambilan spesies tanaman. Daun kering kemudian diblender sehingga diperoleh serbuk halus dan dapat mempermudah proses ekstraksi karena semakin kecil ukurannya maka semakin besar luas permukaannya.23 Pada penelitian ini digunakan bentuk simplisia kering karena kadar air yang lebih sedikit memudahkan cairan pengekstrak masuk ke dalam sel dan menarik zat aktif secara sempurna. 38 Metode ekstraksi yang dilakukan yaitu secara maserasi. Metode maserasi dipilih dalam penelitian ini dikarenakan proses pengerjaannya sederhana, mudah, dan tidak dilakukan proses pemanasan untuk menghindari rusaknya senyawa.5 Maserasi dilakukan dengan cara merendam simplisia dengan pelarut dalam botol yang berwarna gelap, pada suhu kamar, dan ditempatkan pada tempat yang terlindung cahaya untuk mencegah reaksi yang dikatalis cahaya atau perubahan warna. Metode maserasi dapat diterapkan pada simplisia dengan zat khasiat yang tahan pemanasan atau tidak tahan pemanasan. Perendaman sampel dilakukan selama 3-5 hari, lalu diaduk sesekali agar mempercepat proses pelarutan senyawa kimia yang terdapat dalam sampel dan dapat meratakan konsentrasi larutan.38 Sampel terekstraksi secara sempurna yang ditandai dengan pelarut pada sampel berwarna bening. Dilakukan penyaringan sampel menggunakan kertas saring, lalu dievaporasi dengan rotary evaporator. Cairan pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Larutan yang pekat akan terdesak keluar karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel. Hasil akhir didapatkan keseimbangan konsentrasi antara larutan diluar sel dengan larutan di dalam sel. 38 Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol yang mempunyai kepolaran berbeda. Serbuk simplisia direndam dalam n-heksana untuk menghasilkan senyawa nonpolar. 35
36
Ampas hasil dari ekstraksi n-heksana direndam dalam pelarut etil asetat untuk mengekstraksi senyawa yang lebih polar dari ekstrak n-heksana. Maserasi ampas hasil dari ekstraksi etil asetat menggunakan pelarut metanol untuk mengekstraksi senyawa polar. Setelah didapatkan hasil maserasi, kemudian dilakukan pemekatan/ evaporasi dengan rotary evaporator untuk menguapkan pelarut dan air yang masih tersisa. Pelarut metanol telah diuapkan sehingga dalam penelitian ini kematian larva terjadi karena pengaruh ekstrak tanpa dipengaruhi pelarut metanol.38 Berdasarkan penelitian uji toksisitas pelarut metanol 96% dengan konsentrasi 1% terhadap larva Artemia sp terbukti tidak menimbulkan mortalitas pada larva Artemia sehingga mortalitas murni karena pengaruh ekstrak tumbuhan yang diteliti.40 Selain itu, pelarut metanol memiliki sifat yang mudah menguap. Pada penelitian ini, daun Garcinia benthami Pierre telah dilakukan pengeringan sehingga semakin sedikit kadar air yang terdapat dalam sel daun tersebut. Peneliti melakukan pengukuran berat ekstrak kental metanol daun Garcinia benthami Pierre yang diperoleh dari hasil maserasi.
Tabel 4.1 Data Berat Ekstrak Kental Daun Garcinia benthami Pierre Nama Simplisia
Bobot ekstrak kental
Ekstrak metanol
15,5 gram
4.2
Hasil Uji Toksisitas dengan Metode BSLT Larutan ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre dibuat menjadi 5
konsentrasi, yaitu konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm. Disiapkan pula kontrol negatif hanya air laut dan larva udang tanpa penambahan ekstrak. Tabung kontrol negatif digunakan untuk menguji pengaruh lain diluar ekstrak uji seperti kondisi air laut, yang dapat menyebabkan kematian larva. Uji toksisitas ini diteliti sebanyak 3 kali perlakuan dan pada masingmasing perlakuan dikerjakan 3 kali pengulangan/replikasi (triplo) untuk mendapatkan keakuratan data dan memperoleh data yang baik. Apabila dilakukan hanya satu kali, mungkin dapat terjadi kesalahan dan tidak ada data lain yang
37
dapat digunakan. Dalam setiap konsentrasi masing-masing ekstrak, digunakan sepuluh larva udang Artemia salina Leach berumur 48 jam sebagai hewan uji. Jumlah kematian larva Artemia salina Leach pada setiap tabung reaksi dalam berbagai konsentrasi perlakuan ekstrak daun Garcinia benthami Pierre ditunjukkan pada tabel 4.2. Berdasarkan tabel tersebut dapat diketahui bahwa adanya pengaruh yang berbeda berkaitan dengan berbagai konsentrasi ekstrak terhadap kematian larva Artemia salina Leach. Ekstrak merupakan bahan yang mengandung campuran komponen kimia dari suatu tumbuhan yang terlarut dalam pelarut yang digunakan. Jenis ekstrak menunjukkan banyaknya jenis senyawa kimia yang terlarut di dalamnya dan berkaitan dengan bahan aktif biologik yang terlarut.7 Hasil penelitian seperti yang disajikan pada tabel 4.2 berikut.
Tabel 4.2. Pengaruh Berbagai Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Garcinia benthami Pierre Terhadap Larva Artemia salina Leach.
Perlakuan ke-
Angka Kematian Larva Artemia salina Leach dari 10 Larva
Kontrol negatif
Konsentrasi ekstrak pada tabung uji (ppm) 5
10
20
50
100
0
1 2 3 Total kematian
0 1 0
1 1 1
2 3 2
4 4 5
5 6 5
0 0 0
1
3
7
13
16
0
Rata-rata kematian
0.333
1.000
2.333
4.333
5.333
0.000
Persen kematian (%)
3.333
10.000
23.333
43.333
53.333
0.000
Standar deviasi
0.577
0.000
0.577
0.577
0.577
0.000
Jumlah total larva dalam tiap konsentrasi dengan tiga kali replikasi adalah 30 ekor. Jumlah total larva Artemia salina Leach yang digunakan seluruhnya adalah 180 ekor larva. Menjumlahkan larva yang mati pada setiap konsentrasi untuk menghitung total kematian. Pelaksanaan uji dilakukan dengan konsentrasi ekstrak yaitu 1000 ppm, 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, dan 50 ppm, yang diencerkan dengan menambahkan 5
38
mL air laut terlebih dahulu ke dalam masing-masing tabung uji, kemudian baru dimasukkan larva udang yang telah berumur 48 jam ke dalam seri tabung uji masing-masing sebanyak 10 ekor dan meneteskan 1 mL ekstrak ke dalam tabung uji. Menambahkan air laut hingga volume dalam masing-masing tabung menjadi 10 mL sehingga konsentrasi ekstrak yang terdapat di dalam tabung uji menjadi 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, dan 5 ppm.
Gambar 4.1 Grafik Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Garcinia benthami Pierre Terhadap Kematian Larva Artemia salina Leach.
Berdasarkan grafik, didapatkan jumlah kematian larva terbanyak yaitu pada konsentrasi 100 ppm. Hasil yang didapatkan sesuai dengan teori, yaitu semakin tinggi konsentrasi ekstrak menyebabkan semakin tinggi pula jumlah kematian larva yang menunjukkan semakin tinggi sifat toksiknya. 32 Rata-rata kematian larva diperoleh dengan membagi total kematian larva pada tiap konsentrasi dengan jumlah replikasi yang dilakukan yaitu tiga kali. Kemudian dihitung persentase kematian larva dari rata-rata kematian pada tiap konsentrasi dikali 100%.38 Artemia salina Leach digunakan dalam metode BSLT karena memiliki kesamaan tanggapan/respon dengan mamalia, misalnya DNA dependent RNA polimerase.29 Pada penelitian ini menggunakan fase larva karena pada saat itu Artemia salina Leach membelah secara mitosis yang identik dengan sel kanker yang juga membelah secara mitosis. Hal ini menyebabkan uji BSLT sering
39
digunakan sebagai uji pendahuluan aktivitas antikanker yang bersifat sitotoksik. Aktivitas sitotoksik adalah aktivitas yang dapat menyebabkan kematian pada sel. 38 Berdasarkan morfologinya, larva Artemia salina Leach berumur 48 jam sudah mulai mempunyai mulut dan saluran pencernaan serta cadangan makanannya sudah mulai habis sehingga larva mulai mencari makan. Larva berumur 48 jam paling sensitif terhadap suatu zat yang dimasukkan, berbeda dengan larva berumur 24 jam yang belum mempunyai saluran pencernaan sehingga ekstrak atau senyawa luar tidak dapat diabsorbsi oleh larva. 29 Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan hewan coba larva Artemia salina Leach berumur 48 jam. Genus Garcinia mengandung senyawa flavonoid yang dapat menghambat daya makan larva sebagai stomach poisoning atau racun perut. Mekanisme kematian larva dikarenakan senyawa tersebut masuk ke dalam tubuh larva sehingga mengakibatkan larva gagal mendapatkan stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya. Senyawa ini menghambat reseptor perasa pada daerah mulut larva sehingga larva mati kelaparan.38 Untuk memastikan apakah larva tersebut benar-benar mati, peneliti melakukan uji dengan cara menambahkan volume air laut ke dalam masingmasing tabung sehingga konsentrasi ekstrak dalam tabung berkurang dan selanjutnya diamati selama 24 jam untuk memastikan apakah jumlah larva yang hidup dan mati sama dengan hasil perhitungan sebelumnya yaitu saat 24 jam setelah pemberian ekstrak. Sebenarnya terdapat uji yang lazim digunakan untuk mengetahui kematian sel atau larva yaitu dengan pewarnaan menggunakan trypan blue 0,4% kemudian diamati dibawah mikroskop.41 Larva yang mati akan berwarna biru karena membran pada larva telah rusak sehingga memudahkan trypan blue terserap oleh larva yang mati. Uji ini tidak dilakukan oleh peneliti karena keterbatasan waktu untuk memperoleh trypan blue. Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kontrol positif dengan menggunakan obat anti kanker seperti doxorubicin atau methotrexat untuk membandingkan potensi toksisitasnya, dikarenakan keterbatasan waktu untuk memperoleh obat anti kanker tersebut.
40
4.3
Penetapan Nilai LC50 Tabel 4.3. Perhitungan LC50 dengan Metode Probit
Perhitungan LC50 dengan metode manual yaitu dengan menggunakan rumus : Nilai slope (m) dihitung dengan rumus : ∑(X)∑(Y) - n∑(XY)= 1.497 (∑(X))2 - n∑(X2)
Nilai Intersep (b) dihitung dengan rumus : ∑(X)∑(XY) -∑(X2)∑(Y) = 2.206 (∑(X))2 - n∑(X2)
Sehingga didapatkan persamaan garis lurus hubungan antara Y (nilai probit dari persentase kematian) dengan X (log konsentrasi) adalah Y=mX+b Y =1.497x + 2.206 5 =1.497x + 2.206 2.794= 1.497x X = 1.8659 LC50 = antilog X= antilog 1.8659 = 73.43 ppm Perhitungan LC50 menggunakan Microsoft Office Excel dengan membuat grafik untuk mendapatkan persamaan garis lurus Y=mX+b. Didapatkan hasil grafik sebagai berikut :
41
Gambar 4.2 Grafik Regresi Linier Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Garcinia benthami Pierre Terhadap Nilai Probit
Dari grafik di atas menunjukkan log konsentrasi terhadap nilai probit yang didapat dari persen mortalitas larva. Didapatkan persamaan garis lurus Y=1,497X+2,206. Dapat dilihat juga hubungan korelasi yang positif karena nilai R2 = 0,982.32 Uji toksisitas dengan metode BSLT dapat mengetahui efek toksik dari suatu senyawa yang ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian ekstrak sehingga disebut uji toksisitas akut. Efek toksik diketahui dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salina Leach. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC50<1000 ppm, sehingga memiliki korelasi antara uji toksisitas akut ini dengan uji sitotoksik. Metode ini menghubungkan jumlah kematian larva udang dengan konsentrasi uji. 42 Dalam penelitian ini dilakukan variasi konsentrasi yang berbeda yaitu konsentrasi 5, 10, 20, 50, dan 100 ppm untuk membandingkan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut dan untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang mengalami LC50. Digunakan air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan
42
bukan dari air laut. Air laut yang digunakan telah dilakukan pengukuran pH dan hasilnya sesuai untuk media pertumbuhan larva yaitu pH sekitar 8-9. Larva udang digunakan dalam metode ini karena hewan ini merupakan general bioassay sehingga semua zat dapat menembus masuk ke dinding sel larva tersebut dan hewan ini memiliki kepekaan yang cukup tinggi terhadap zat toksik.36 Berdasarkan hasil perhitungan dengan metode manual dan Microsoft Office Excel menunjukkan nilai LC50 yaitu 73,43 ppm, sehingga terdapat kesamaan nilai LC50 setelah dihitung dengan dua metode perhitungan. Selain itu, peneliti juga mencoba menggunakan program analisis probit dengan SPSS 16.0 for windows sehingga didapatkan nilai LC50 sebesar 69,64 ppm dan tidak berbeda signifikan dengan hasil metode manual maupun Microsoft Office Excel. Suatu spesies tumbuhan dalam satu genus umumnya akan menunjukkan kandungan kimia yang serupa. Garcinia memiliki kandungan kimia diantaranya senyawa fenol tipe flavonoid, xanton dan benzofenon yang memiliki aktivitas biologi.43 Berdasarkan penelitian lain mengenai uji toksisitas akut pada salah satu spesies Garcinia yaitu ekstrak metanol daun Garcinia parvifolia Miq. didapatkan hasil LC50 adalah 78,25 ppm dengan metode BSLT terhadap larva Artemia salina Leach.44 Penelitian tersebut dengan penelitian yang dilakukan ini memiliki kesamaan dalam penggunaan daun dari genus Garcinia yang diekstraksi dengan pelarut metanol dan metode BSLT terhadap larva udang Artemia salina Leach. Nilai LC50 pada penelitian tersebut dengan penelitian yang dilakukan yaitu tidak jauh berbeda dan memiliki potensi toksisitas akut. Pengujian terhadap ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre didapatkan bahwa konsentrasi untuk mematikan 50% larva udang (Artemia salina L) atau LC50 adalah 73,43 ppm sehingga dapat dikatakan ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre pada penelitian ini memiliki potensi toksisitas akut menurut metode BSLT yaitu pada perlakuan dengan hewan coba larva Artemia salina Leach. Validitas pada penelitian ini dijaga dengan33 :
Menyamakan kondisi larva Artemia salina Leach.
Mengambil secara random.
Menggunakan kriteria standar dalam menilai kematian larva.
Reliabilitas data dijaga dengan replikasi tiga kali pada tiap uji.33
BAB 5 SIMPULAN DAN SARAN
5.1
Simpulan 1.
LC50 ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre adalah 73,43 ppm berdasarkan hasil perhitungan manual dengan metode probit dan Microsoft Office Excel.
2.
Ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) karena dihasilkan nilai LC50 kurang dari 1.000 ppm.
5.2
Saran 1.
Dilakukan penelitian untuk mengisolasi senyawa dari ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre yang mempunyai potensi toksisitas.
2.
Dilakukan penelitian dari senyawa isolat yang berpotensi toksik pada sel kanker seperti sel Hela dan sebagainya.
3.
Dilakukan perbandingan potensi senyawa isolat yang berpotensi toksik dengan obat anti kanker seperti doxorubicin atau methotrexat.
43
DAFTAR PUSTAKA
1.
Sukandar D, Hermanto S, Lestari E. Uji potensi aktivitas antikanker ekstrak daun pandan wangi (Pandanus amaryllifolius Roxb) dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). JKTI Vol.11 No.1. Juni 2009.
2.
Amelia P. Isolasi, elusidasi struktur dan uji aktivitas antioksidan senyawa kimia dari daun Garcinia benthami Pierre. [Tesis]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia; 2011.
3.
Sari R, Hanan A. Garcinia (Clusiaceae) di Kebun Raya Bogor : fisiognomi, keragaman dan potensi. Prosiding Seminar Hari Cinta Puspa dan Satwa Nasional; 5 November 2000; Kebun Raya Bogor.
4.
Jamal Y, Praptiwi, Agusta A. Penapisan fitokimia, uij toksisitas, dan anti bakteri dari ekstrak kulit batang Garcinia celebica dan G.tetandra. Majalah Farmasi Indonesia, 12; 2001:97-102.
5.
Tiwari P, Kumar B, Kaur M, Kaur G, Kaur H. Phytochemical screening and extraction : a review. Internationale Pharmaceutica Sciencia (IPS). Vol.1. Jan-March 2011.
6.
Meyer BN, N.R. Ferrighni, J.E. Put-nam, L.B. Jacobson, D.E. Nichols, J.L McLaughlin. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica;1982.
7.
Suherman S, Hernani, Syukur C. Uji toksisitas ekstrak lempuyang gajah (Zingiber zerumbet) terhadap larva udang (Artemia salina Leach.) Bul. Littro. Vol. XVII No. 1; 2006; 30 – 38.
8.
Anonim.Tafsir Az-Zumar ayat 21-31. 2013[cited 9 September 2013]. Available from : http://www.tafsir.web.id/2013/04/tafsir-az-zumar-ayat21-31.html.
9.
Heinrich M, Barnes J, Gibbons S, Williamson EM. Fundamentals of pharmacognosy and phytotherapy. In : Syarief WR, Aisyah C, Elviana E, Fidiasari ER, Hadinata AH, alih bahasa. Farmakognosi dan Fitoterapi. Jakarta : EGC; 2009.
10.
Dewoto HR. Pengembangan obat tradisional Indonesia menjadi fitofarmaka. Majalah Kedokteran Indonesia Volume 57 Nomor 7. Juli 2007.
11.
Lisdawati V, Wiryowidagdo S, Kardono LB. Brine Shrimp Lethality Test 44
45
(BSLT) dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan kulit biji mahkota dewa (Phaleria macrocarpa). Bul.Penelitian Kesehatan Vol.34 No.3. 2006:111-118. 12.
Lukis PA, Ersam T. Dua senyawa mangostin dari ekstrak n-heksana pada kayu akar manggis (Garcinia mangostana Linn) asal Kab.Nganjuk Jawa Timur. Prosiding Akhir Semester Genap 2010/2011; Kimia-FMIPA ITS.
13.
Nurchasanah.Khasiat sakti manggis tumpas berbagai penyakit : teruji secara medis. Jakarta : Dunia Sehat; 2013.
14.
Jung AH, Su BN, Keller WJ, Metha RG, Kinghorn AD. Antioxidant xanthones from the pericarp of Garcinia mangostana (Mangosteen). J. Agric. Food Chem. 2006; 54: 2077-2082.
15.
Lalage Z. Libas bermacam penyakit dengan sirsak, manggis, dan binahong. Klaten : Cable Book; 2013.
16.
Wahyuni FS, Lusianti M, Almahdy, Dachriyanus. Isolasi senyawa sitotoksik terhadap sel kanker payudara dari kulit batang Garcinia griffithii. Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 4 No. 4; Juli 2009: 177 -187.
17.
Hendrawati AR. Uji toksisitas akut ekstrak etanol daun kemangi (Ocimum sanctum Linn.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). [Skripsi]. Semarang : Universitas Diponegoro; 2009.
18.
Goodman dan Gilman. The pharmacological basis of terapeutics. 10th Ed. London : McGraw Hill; 2004.
19.
Priyanto. Toksikologi : mekanisme, terapi antidotum, dan penilaian resiko. Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi Indonesia (LESKONFI); 2009.
20.
Soemirat J, et.al.Toksikologi lingkungan. Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada; 2005.
21.
Lu Frank C. Toksikologi dasar : asas, organ sasaran, dan penilaian resiko.Edisi ke-2. Jakarta : Penerbit Universitas Indonesia (UI press); 1995.
22.
Sulastry F. Uji toksisitas akut yang diukur dengan penentuan LD50 ekstrak daun pegagan (Centella asiatica L. Urban) terhadap mencit BALB/C. [Laporan Akhir Karya Tulis Ilmiah]. Semarang : Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro; 2009.
23.
Baraja M. Uji toksisitas ekstrak daun Ficus elastica Nois ex Blume terhadap larva Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis. [Skripsi]. Surakarta : Universitas Muhammadiyah Surakarta; 2008.
46
24.
Harborne JB. Metode fitokimia : penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Bandung : Penerbit ITB; 1987.
25.
Nurul H, Maharani, Zuliyana. Pembuatan metil ester (biodiesel) dari minyak dedak dan metanol dengan proses esterifikasi dan transesterifikasi [Skripsi]. Semarang : Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Diponegoro; 2010.
26.
Barile FA. Clinical toxicology : principles and mechanisms. Florida : CRC Press LLC; 2004.
27.
Anonim. Keracunan akibat penyalahgunaan metanol. 2011 [cited 27 Agustus 2013]. Available from: http://ik.pom.go.id/wpcontent/uploads/2011/11/RacunSalahMeta.pdf
28.
Sorgeloos P, Van Der Wielen CR, Persoone G. The use of Artemia nauplii for toxicity test : a critical analysis. Laboratory for Biological Research in Aquatic Pollution, Artemia Reference Center. Ecotoxicology and Environtmental Safety 2;1978:249-255.
29.
Panjaitan RB. Uji toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari (Alyxiae cortex) dengan metode brine shrimp lethality test. [Skripsi]. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma; 2011.
30.
Gajardo GM, Beardmore JA. The brine shrimp artemia : adapted to critical life conditions. Front Physiol 2012 [cited 8 September 2013]. Available from : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381296/
31.
Batubara I, Sudirman S, Ramadhan W, Oktavia Y, Tirta F.P. Kandungan kimia, senyawa aktif, dan toksisitas dari Eucheuma Cottonii, Caulerpa sp. dan Solen sp. Departemen Kimia FMIPA IPB.
32.
Aprilia HA, Pringgenie D, Yudiati E. Uji toksisitas ekstrak kloroform cangkang dan duri landak laut (Diadema setosum) terhadap mortalitas nauplius Artemia sp. Journal of Marine Research. Volume 1, Nomor 1; 2012: 75-83.
33.
Cahyadi R. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah pare (Momordica charantia L.) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Semarang : Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro; 2009.
34.
Kim V. Probit analysis. [cited 10 Agustus 2013]. Available from : http://userwww.sfsu.edu/efc/classes/bioI710/probit/Probit Analysis.pdf
35.
Anonim. Analisis regresi linier sederhana. [cited 10 Agustus 2013]. Available from: http://www.fp.unud.ac.id/ind/wp-
47
content/uploads/mk_ps_agribisnis/ekonomitrika/2_.%2520%2520Analisis %2520Regresi%2520Linier%2520Sederhana.pdf 36.
Mutia D. Uji toksisitas akut ekstrak etanol buah anggur (Vitis vinifera) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Universitas Diponegoro : Semarang; 2010.
37.
Juniarti, et al. Kandungan senyawa kimia, uji toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) dan antioksidan (1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) dari ekstrak daun saga (Abrus precatorius L.). Makara, SAINS, VOL. 13, NO. 1; APRIL 2009: 50-54. Jakarta : Bagian Kimia, Fakultas Kedokteran, Universitas YARSI.
38.
Kurniawan H. Uji toksisitas akut ekstrak metanol daun Kesum (Polygonum minus Huds) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). [Tesis]. Pontianak : Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tanjungpura; 2009.
39.
Indiastuti DN, et.al. Skrining pendahuluan toksisitas beberapa tumbuhan Benalu terhadap larva udang Artemia salina Leach. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia Vol.6 No.2; September 2008.
40.
Suryono, Yudiati E. Toksisitas ekstrak metanol Spirulina sp terhadap nauplii Artemia sp. Buletin Oseanografi Marina Vol.1; Oktober 2011:1-6.
41.
Anonim. In situ trypan blue staining of monolayer cell cultures for permanent fixation and mounting. Benchmarks BioTechniques 22; June 1997: 1020-1024.
42.
Ramadhani AN. Uji toksisitas akut ekstrak etanol daun Sukun (Artocarpus altilis) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Semarang : Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro; 2009.
43.
Muharni. Profil kandungan kimia dan potensi tumbuhan manggis hutan (Garcinia Bancana Miq.) sebagai sumber senyawa antioksidan. Jurnal Pembangunan Manusia Vol.4 No.12; 2010.
44.
Syamsudin, Shirly K, Broto S. Screening of some extracts from Garcinia parvifolia Miq. (Guttiferae) for antiplasmodial, antioxidant, cytotoxic and antibacterial activities. Asian Journal of Plant Sciences, 6; 2007: 972-976.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Surat Keterangan Determinasi Tanaman
Gambar 6.1 Keterangan Determinasi Tanaman
48
49
Lampiran 2 Keterangan Bahan Penelitian Kista Artemia
Gambar 6.2 Keterangan Bahan Penelitian Kista Artemia
50
Lampiran 3 Gambar Bahan dan Alat Penelitian
Gambar 6.3 Destilasi Pelarut Metanol
Gambar 6.4 Botol Maserasi
Gambar 6.5 Proses Evaporasi dengan Rotary Evaporator
Gambar 6.6 Ekstrak Kental Daun Garcinia benthami Pierre
Gambar 6.7 Ekstrak Kental 250 mg
Gambar 6.8 Larutan Induk 1000 ppm
51
Lanjutan
Gambar 6.9 Proses Penyaringan
Gambar 6.10 Hasil Uji BSLT
Gambar 6.11 Wadah Penetasan Telur Artemia salina Leach
Gambar 6.12 Larva Artemia salina Leach Umur 48 jam
Gambar 6.13 Serbuk Simplisia Daun Garcinia benthami Pierre
Gambar 6.14 Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Garcinia benthami Pierre
52
Lampiran 4 Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Garcinia benthami Pierre
Konsentrasi = ekstrak metanol daun Garcinia benthami Pierre (µg) Volume aquades (mL) = 0,25 g =250.000 µg= 1.000 µg/mL = 1.000 ppm 250 mL 250 mL Untuk mendapatkan ekstrak dengan konsentrasi 500, 200, 100, dan 50 ppm dapat dilakukan dengan menggunakan rumus pengenceran yaitu V1M1=V2M2. a) konsentrasi ekstrak 500 ppm V1M1=V2M2 1.000 µg/mL x V1= 500 µg/mL x 25 mL V1 = 12.500 µg = 12,5 mL 1.000 µg/mL Maka kita mengambil 12,5 mL larutan ekstrak 1.000 ppm. b) konsentrasi ekstrak 200 ppm V1M1=V2M2 1.000 µg/mL x V1= 200 µg/mL x 25 mL V1 = 5.000 µg = 5 mL 1.000 µg/mL Maka kita mengambil 5 mL larutan ekstrak 1.000 ppm. c) konsentrasi ekstrak 100 ppm V1M1=V2M2 1.000 µg/mL x V1= 100 µg/mL x 25 mL V1 = 2.500 µg = 2,5 mL 1.000 µg/mL Maka kita mengambil 2,5 mL larutan ekstrak 1.000 ppm. d) konsentrasi ekstrak 50 ppm V1M1=V2M2 1.000 µg/mL x V1= 50 µg/mL x 25 mL V1 = 1.250 µg =1,25 mL 1.000 µg/mL Maka kita mengambil 1,25 mL larutan ekstrak 1.000 ppm.
53
Lampiran 5 Tabel Transformasi Persen - Probit Tabel 6.1 Transformasi persen - probit
54
Lanjutan
55
Lanjutan
56
Lanjutan
57
Lampiran 6 Hasil Analisis Probit dengan SPSS 16.0 for windows Tabel 6.2 Output hasil analisis probit dengan SPSS 16.0 for windows Notes Output Created
09-Sep-2013 19:44:29
Comments Input
Active Dataset
DataSet0
Filter
<none>
Weight
<none>
Split File
<none>
N of Rows in Working Data File Missing Value Handling
Definition of Missing
5 User-defined missing values are treated as missing.
Cases Used
Statistics are based on all cases with valid data for all variables in the model.
Syntax
PROBIT mortalitas OF total WITH konsentrasi /LOG 10 /MODEL PROBIT /PRINT FREQ CI /CRITERIA P(0.15) ITERATE(20) STEPLIMIT(.1).
Resources
Processor Time
00:00:00.327
Elapsed Time
00:00:00.281
58
Lanjutan
Warnings Relative Median Potency Estimates are not displayed because there is no grouping variable in the model.
Data Information N of Cases Valid Rejected
5 Missing
0
LOG Transform Cannot be
0
Done Number of Responses >
0
Number of Subjects Control Group
0
Convergence Information Number of
Optimal Solution
Iterations
Found
PROBIT
10 Yes
Parameter Estimates 95% Confidence Interval Parameter
Estimate
Std. Error
Z
Sig.
Lower Bound Upper Bound
59
Lanjutan a
PROBIT
konsentrasi Intercept
1.353
.272
4.968
.000
.819
1.886
-2.492
.420
-5.939
.000
-2.912
-2.073
a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10.000 logarithm.)
Chi-Square Tests Chi-Square PROBIT
Pearson Goodness-of-Fit Test
df
2.666
a
Sig. 3
.446b
a. Statistics based on individual cases differ from statistics based on aggregated cases. b. Since the significance level is greater than .150, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.
Cell Counts and Residuals
Number PROBIT
konsentrasi
Number of
Observed
Expected
Subjects
Responses
Responses
Residual
Probability
1
.699
30
1
1.827
-.827
.061
2
1.000
30
3
3.814
-.814
.127
3
1.301
30
10
6.955
3.045
.232
4
1.699
30
13
12.685
.315
.423
5
2.000
30
16
17.524
-1.524
.584
60
Lanjutan Confidence Limits 95% Confidence Limits for log(konsentrasi)a
95% Confidence Limits for konsentrasi Probability Estimate Lower Bound Upper Bound PROBIT
Estimate
Lower Bound
Upper Bound
0.01
1.327
.163
3.414
.123
-.788
.533
0.02
2.111
.347
4.810
.324
-.459
.682
0.03
2.833
.560
5.990
.452
-.252
.777
0.04
3.536
.801
7.074
.548
-.096
.850
0.05
4.234
1.071
8.108
.627
.030
.909
0.06
4.935
1.370
9.115
.693
.137
.960
0.07
5.646
1.699
10.110
.752
.230
1.005
0.08
6.368
2.057
11.101
.804
.313
1.045
0.09
7.105
2.447
12.097
.852
.389
1.083
0.1
7.858
2.868
13.104
.895
.458
1.117
0.15
11.928
5.472
18.458
1.077
.738
1.266
0.2
16.619
8.948
24.761
1.221
.952
1.394
0.25
22.089
13.295
32.696
1.344
1.124
1.514
0.3
28.520
18.424
43.217
1.455
1.265
1.636
0.35
36.139
24.210
57.625
1.558
1.384
1.761
0.4
45.243
30.603
77.621
1.656
1.486
1.890
0.45
56.229
37.673
105.520
1.750
1.576
2.023
0.5
69.642
45.606
144.682
1.843
1.659
2.160
61
Lanjutan 0.55
86.254
54.688
200.269
1.936
1.738
2.302
0.6
107.198
65.324
280.582
2.030
1.815
2.448
0.65
134.204
78.094
399.614
2.128
1.893
2.602
0.7
170.058
93.887
582.407
2.231
1.973
2.765
0.75
219.568
114.157
877.376
2.342
2.058
2.943
0.8
291.837
141.513
1388.659
2.465
2.151
3.143
0.85
406.611
181.288
2377.957
2.609
2.258
3.376
0.9
617.181
246.875
4692.217
2.790
2.392
3.671
0.91
682.631
265.897
5531.303
2.834
2.425
3.743
0.92
761.623
288.188
6614.606
2.882
2.460
3.821
0.93
859.068
314.817
8053.323
2.934
2.498
3.906
0.94
982.710
347.421
10034.641
2.992
2.541
4.002
0.95
1145.586
388.676
12898.225
3.059
2.590
4.111
0.96
1371.757
443.350
17326.844
3.137
2.647
4.239
0.97
1711.887
521.065
24913.529
3.233
2.717
4.396
0.98
2298.017
645.595
40389.528
3.361
2.810
4.606
0.99
3655.149
904.308
86561.278
3.563
2.956
4.937
a. Logarithm base = 10.
62
Lanjutan
63
Lampiran 7 Keterangan Daftar Riwayat Hidup
DAFTAR RIWAYAT HIDUP Nama
:
Aulia Ajrina
Tempat, tanggal lahir :
Jakarta, 19 September 1992
Alamat
Perumahan Pulo Nirwana Regency, Jalan Charlie
:
Blok A No.26 RT/RW 007/004 Kel.Pinang Ranti, Kec.Makasar, Jakarta Timur. No. HP
:
08568068048
Email
:
[email protected]
Riwayat Pendidikan : 1. TK Angkasa 4 Halim PK.
(1996-1998)
2. SDAngkasa 7 Halim PK.
(1998-2004)
3. SMP Negeri 109 Jakarta
(2004-2007)
4. SMA Negeri 48 Jakarta
(2007-2010)
5. PSPD FKIK UIN Jakarta
(2010-sekarang)
