TUGAS AKHIR PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN 5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
Karya Ilmiah Akhir sebagai salah satu persyaratan untuk menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis I Ilmu Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret / RSUD Dr. Moewardi Surakarta
Disusun oleh : Mohammad Ali Yusni NIM.S5604002
Pembimbing : Dr.dr.Ida Bagus Metria, SpB(K)BD Dra. Dyah Ratna Budiani, M.Si Prof.Dr.dr. Ambar Mudigdo, SpPA(K)
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS ILMU BEDAH FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET /RSUD Dr.MOEWARDI SURAKARTA 2008
KATA PENGANTAR Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Alloh SWT yang telah melimpahkan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah akhir yang berjudul : PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine palmifolia, L.,Merr) DAN 5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN Karya ilmiah akhir ini disusun sebagai salah satu persyaratan untuk menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis I di bidang Ilmu Bedah di Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta. Karya ilmiah akhir ini tidak akan terselesaikan tanpa dukungan dari berbagai pihak lain, baik berupa dukungan moril maupun material. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar – besarnya kepada : 1. Dr.dr. Ida Bagus Metria,Sp.B(K)BD., selaku pembimbing utama yang telah memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini. 2. Dra. Dyah Ratna Budiani,M.Si., selaku pembimbing pendamping yang telah memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini. 3. Prof.Dr.dr. Ambar Mudigdo, Sp.PA(K)., selaku pembimbing pendamping yang telah memberikan saran dan arahan selama penyusunan karya akhir ini. 4. dr.Bintang Soetjahjo, SPOT., selaku kepala Bagian/SMF Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta. 5. dr. Soebandrijo, Sp.B,Sp.BTKV., selaku Ketua Program Studi PPDS I Ilmu Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta. 6. dr.Soeharto Wijanarko,SpU., selaku Sekretaris Program Studi PPDS I Ilmu Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta.
ii
7. Seluruh senior dan staf Bagian Bedah
Fakultas Kedokteran Universitas
Sebelas Maret/Rumah Sakit Umum Daerah Dr.Moewardi Surakarta. 8. dr.William A.P,SpB, dr. Dyah Andriana, dr.Tumpal Daniel P, dr.Ivan Hendra S yang telah bekerja sama dalam penelitian ini. 9. Seluruh Paramedis dan non Paramedis di RSUD Dr. Moewardi Surakarta. 10. orang tua, mertua, dan seluruh keluarga besar saya yang telah memberikan suport dan semangat dan doa sehingga saya bisa menyelesaikan pendidikan ini. 11. Istri tercinta (dr.Dwi Agustina Ramadani) dan putri tercinta ( Alyssa Rizqia Putri) yang dengan setia, sabar dan tabah telah menemani, membantu dan selalu memberikan motivasi dan doa agar pendidikan ini dapat terselesaikan. 12. Seluruh rekan – rekan residen bedah dan semua fihak yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang telah membantu baik secara langsung maupun tidak langsung. Semoga Alloh SWT melimpahkan rahmat-Nya kepada kita semua. Harapan kami, semoga penelitian akhir ini dapat bermanfaat bagi semua fihak. Terimakasih.
Hormat kami,
Penulis
iii
Telah diuji dan diseminarkan pada hari Sabtu, 13 Desember 2008, di bagian Bedah RSUD Dr. Moewardi Surakarta, penelitian tugas akhir yang berjudul :
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN 5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN
KPS PPDS I Bedah FK UNS/
SPS PPDS I Bedah FK UNS/
RSUD Dr.Moewardi Surakarta
RSUD Dr.Moewardi Surakarta
dr. Soebandrijo,SpB.SpBTKV
dr. Soeharto Widjanarko,SpU
NIP : 140 153 956
NIP : 140 222 096
KSMF Bedah RSUD Dr.Moewardi Surakarta
dr. Bintang Soetjahjo,SpOT NIP : 140 228 594
iv
DAFTAR ISI JUDUL PENELITIAN ……………………………………………………………. i KATA PENGANTAR .............................................................................................. ii DAFTAR ISI ............................................................................................................. iv DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ vi DAFTAR TABEL ..................................................................................................... vii DAFTAR SINGKATAN ........................................................................................... viii ABSTRAK ................................................................................................................ x BAB I : PENDAHULUAN I.1. Latar Belakang Masalah ...................................................... 1 I.2. Perumusan Masalah .............................................................. 3 I.3. Tujuan Penelitian ............................................................... 3 I.4. Manfaat Penelitian ............................................................... 4 I.4.1. Manfaat teoritik ............................................................ 4 I.4.2. Manfaat praktis ............................................................ 4 BAB II : TINJAUAN PUSTAKA II.1. Kanker ............................................................................. 5 II.2. Siklus Sel ............................................................................. 9 II.3. Apoptosis pada Kanker ..................................................... 14 II.4. Adeno Karsinoma Kolon ..................................................... 18 II.4.1. Definisi ................................................................ 18 II.4.2. Anatomi ................................................................ 19 II.4.3. Insidensi ................................................................ 20 II.4.4. Etiologi dan faktor predisposisi .......................... 20 II.4.4.1 Perubahan genetik ............................... 21 II.4.4.1.1. Perubahan genetik pada karsinoma kolon.................. 21 II.4.4.1.2. Gen APC............................... 23 II.4.4.1.3. Gen DCC............................... 24 II.4.4.1.4. Gen p53................................. 24 II.4.4.1.5. K-Ras proto-oncogens........... 26 II.4.4.1.6. Mismatch repair genes......... 26 II.4.4.2 Pengaruh lingkungan ........................... 27 II.4.5. Klasifikasi ............................................................... 28 II.4.5.1 Derajat histopatologi ............................. 28 II.4.5.2 Stadium klinik ....................................... 29 II.4.6. Diagnosis ............................................................... 31 II.4.7. Terapi .................................................................... 32 II.4.7.1 Pembedahan .......................................... 32 II.4.7.2 Terapi adjuvant .................................... 33 II.4.8 Prognosis ............................................................... 34 II.5. Bawang Dayak (Eleutherine Palmifolia L.Merr) .................. 34 II.5.1 Morfologi 35 II.5.2 Kandungan bahan kimia umbi bawang dayak 37 II.5.2.1. Flavonoid 38
iv
II.5.2.2. Antrakinon II.5.2.3. Terpenoid II.5.2.4. Kaumarin II.6. 5-Fluorouracil (5-FU) ............................................................ II.7. Galur Sel Adeno Karsinoma Kolon HT29 ........................... II.8. Kerangka Teori ........................................................................ BAB III : KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS III.1. Kerangka Konseptual ........................................................ III.2. Hipotesis ......................................................................... BAB IV : METODE PENELITIAN IV.1 Jenis Penelitian .................................................................. IV.2. Lokasi dan Waktu Penelitian ............................................. IV.3. Subyek Penelitian ............................................................... IV.4 Besar Sampel ............................................................... IV.5. Alat dan Bahan ............................................................... IV.4.1. Alat ............................................................... IV.4.2. Bahan ............................................................... IV.6. Cara Kerja ........................................................................ IV.6.1. Kultur sel ............................................................ IV.6.2. Starvasi ............................................................ IV.6.3. Uji sitotoksisitas ................................................ IV.6.3.1. Kontrol negatif ................................. ................................. IV.6.3.2. Kontrol positif IV.6.3.3. Perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak........................................ IV.6.4. Imunohistokimia ................................................ IV.6. Variabel Penelitian ........................................................... IV.6.1. Variabel bebas .................................................. IV.6.2. Variabel tergantung ......................................... IV.7. Definisi Operasional Variabel ......................................... IV.8. Rancangan Penelitian ........................................................ IV.9. Analisa Data .................................................................... BAB V HASIL DAN ANALISA DATA V.1 Hasil Penelitian .............................................................. V.2 Analisa Data .............................................................. BAB VI PEMBAHASAN VI.1 Ekspresi p53 Mutan ...................................................... VI.2 Sifat Sitostatik Ekstrak Etanolik Bawang Dayak ...................................................... BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN VII.1 Kesimpulan ........................................................................ VII.2 Saran ........................................................................ DAFTAR PUSTAKA Lampiran 1 Lampiran 2
v
41 42 42 43 44 45 46 47 48 48 48 48 49 49 49 50 50 51 51 52 52 53 53 54 54 54 54 56 57 58 62 65 70 75 75
DAFTAR GAMBAR Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar Gambar Gambar Gambar
10 11 12 13
Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar Gambar
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Gambar Gambar
24 25
Gambar Gambar Gambar
26 27 28
Kelainan allele pada gen penekan tumor ......................................... Skema karsinogenesis ……………………………………………. Siklus sel …………………………………………………………. Siklus sel kanker …………………………………………………. Alur kerja p53 …………………………………………………… Alur kerja Apoptosis …………………………………………….. Perubahan sel akibat apoptosis dan necrosis …………………… Anatomi sistema gastrointestinal ……………………………….. Skema jalur LOH pada perkembangan karsinoma kolon dan rectum …………………………………………………………… Skema jalur RER pada perkembangan karsinoma kolon dan rectum Domain protein p53 dan lokasi hot spot ........................................ Gen penekan tumor p53 dan pRb ………………………………… Hubungan antara faktor genetik dan lingkungan pada karsinogenesis karsinoma kolon dan rectum …………………….. Proses perkembangan karsinoma kolorectal ……………………. Foto pohon bawang dayak ………………………………………. Foto umbi bawang dayak .............................................................. Foto bunga bawang dayak yang mekar .......................................... Foto bunga bawang dayak yang kuncup ........................................ Struktur dasar flavonoid …………………………………………. Struktur dasar atrakinon …………………………………………. Struktur dasar kaumarin …………………………………………. Ekspresi p53 mutan pada uji tanpa perlakuan ............................... Ekspresi p53 mutan pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak 3,125µl/ml ……………………………………….. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan 5-fluorouracil 150 µl/ml ….. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada kelompok ekstrak bawang dayak …………………………………………………… Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada kelompok 5-FU ………. Profil uji regresi bawang dayak ………………………………….. Profil uji regresi 5_FU ……………………………………………
vi
7 9 10 12 13 16 18 19 22 23 25 25 27 29 35 36 36 37 41 42 43 59 60 60 61 62 63 64
DAFTAR TABEL Tabel Tabel Tabel Tabel
1 2 3 4
Perbedaan apoptosis dan necrose …………………………………… Dukes clasification and 5 year survival …………………………….. Stadium klinis dari karsinoma kolon .................................................. Prosentase tampilan p53 mutan pada masing – masing sampel .........
vii
18 20 31 61
DAFTAR SINGKATAN DNA
: Deoxiribo Nukleid Acid
Rb
: Retinoblastoma
DCC
: Deleted in cell Colorectal Carcinoma
APC
: Adenomatous Polyposis Colli
WT-1
:Wilm’s Tumor-1
NF-1
: Neurofibromatosis type-1
RNA
: Ribo Nukleid Acid
CDK
: Cyclin Dependent Kinase
CDKI
: Cyclin Dependent Kinase Inhibitor
DR
: Death Reseptor
IGF-BP3
: Insulin like Growth Factor-Binding Protein 3
c-LAP2
: Celluler Inhibitor of Apoptosis Protein 2
NAIP1
: Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein
Fas-L
: Fas Ligan
Mdm2
: Murine doble minute-2
PARP
: Poly (Adenosine 5’diphosphate-Ribose) Polymerase
TNFR
: Tumor Necrosis Factor Receptor
MAP
: Mitogen Activating Protein
JNK
: c-Jun N Terminal Kinase
PTP
: Permeability Transition Pore
ATP
: Adenosine Tri Phospat
FAP
: Familial Adenomatous Polyposis
HNPCC
: Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer
LOH
: Loss of Heterozygocity
RER
: Replication Error
TAD
: Transcription-Activation Domain
PRD
: Proline Rich Domain
DBD
: DNA-Binding Core Domain
OD
: Oligomerisation Domain
CEA
: Carcino Embrionic Antigen viii
MAP
: Mitogen Activating Protein
dUMP
: Deoxi Uridilate Mono Phosphate
dUTP
: Deoxi Uridilate Tri Phosphate
dTMP
: Deoxi Thymidine Mono Phosphate
dTTP
: Deoxi Thymidine Tri Phosphate
F-dUMP
: 5-Fluoro-2-deoxiuridin 5-Monophosphate
FBS
: Fetal Bovine Serum
USG
: Ultra Sono Gram
CT Scan
: Computed Tomo Scan
ix
PERBEDAAN PENGARUH PEMBERIAN FRAKSI ETANOLIK BAWANG DAYAK (Eleutherine Palmifolia L.Merr) DENGAN 5-FLUOROURACIL TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN GALUR SEL KARSINOMA KOLON HT29 DAN EKSPRESI p53 MUTAN Mohammad Ali Yusni ABSTRAK Latar belakang masalah : Angka kejadian kanker colon semakin meningkat dan dengan perkembangan ilmu pengetahuan dibidang biologi molekuler mempengauhi penatalaksanaan kanker kolon termasuk melihat perilaku sel neoplastik ,salah satunya adalah ekspresi p53mutan. Banyak tanaman obat di Indonesia yang terbukti bersifat sebagai anti kanker termasuk juga bawang dayak tetapi penggunaannya sebagian besar berdasarkan empiris dan belum diteliti secara eksperimental termasuk juga terhadap kanker kolon HT29, karena itu dilakukan penelitian invitro terhadap kanker kolon HT29 dengan melihat ekspresi p53 mutan . Metode : Sel kanker kolon HT29 dilakukan kultur kemudian distarvasi setelah itu dicari LC50 (Lethal Concentration )dari fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU. Setelah ditentukan LC50 dan 3 konsentrasi dibawahnya dilakukan pemeriksaan imunohistokimia dengan melakukan pengulangan sebanyak 6 kali kemudian ekspresi p53 mutan ditampilkan dalam bentuk prosentase sel. Hasil : Untuk 5-FU sebagai kontrol (+) pada konsentrasi 150 μg/ml didapatkan ekpresi p53 mutan sebesar 0%, konsentrasi 75 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 4%, konsentrasi 37,5 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 3,11%, konsentrasi 18,75 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 4,42% sedangkan untuk fraksi etanolik bawang dayak pada konsentrasi 3,125 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 5,49%, konsentrasi 1,516 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 6,55%, konsentrasi 0,78 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 8,89%, konsentrasi 0,39 μg/ml ekspresi p53 mutan sebesar 32,41% Kesimpulan : fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU mempunyai potensi penekanan terhadap ekspresi p53 mutan dan tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara fraksi etanolik bawang dayak dan 5-FU terhadap penekanan ekspresi p53 mutan. Kata kunci : Fraksi etanolik bawang dayak (Eleutherine Palmifolia L.Merr), 5-FU, ekspresi p53 mutan
x
BAB I PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang Masalah Kanker kolon adalah penyebab kematian kedua terutama pada negara berkembang. Pada tahun 2005 di Amerika didapatkan sebanyak 104.950 pasien dengan kanker kolon dengan angka kematian mencapai 47.700 pasien dan ini merupakan 11% dari seluruh kematian yang disebabkan kanker. Dalam setahun didapatkan sekitar 940.000 kasus baru dari kanker kolon dengan angka kematian mencapai 500.000 pasien di seluruh dunia (World Health Organisation,2003). Di Indonesia, angka kejadian yang pasti dari kanker kolon belum ada, tetapi mempunyai kecenderungan meningkat. Dari evaluasi data Departemen Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 1986 didapatkan angka kejadian 1,8 setiap 100.000 penduduk. 1 Berdasarkan data histopatologik kanker di Indonesia tahun 1996 dan 1999, kanker kolon menempati urutan ke-9 yaitu sebanyak 3,11% dan 3,33 %.2,3. Insiden dari kanker kolon sejak tahun 1950 semakin meningkat kemungkinan kebanyakan disebabkan oleh pola konsumsi masyarakat yang sering mengkonsumsi makanan daging dan banyak mengandung lemak dengan sedikit makanan yang mengandung serat.28,33. Masalah yang kita hadapi adalah pengelolaan kanker kolon yang sampai saat ini masih berdasarkan
pada stadium klinik dan tingkat diferensiasi sel secara
histopatologis, yang mungkin belum mencerminkan perilaku biologis sel pada adenokarsinoma kolon. Kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang kedokteran khususnya bidang biologi molekuler yang sangat pesat, mempengaruhi tatacara penanganan
2
kanker kolon, mulai dari deteksi dini , diagnostik, terapi, prediksi tingkat keganasan, prognosis dan penanganan tindak lanjut. Pemeriksaan imunohistokimia dapat memberi informasi mengenai kandungan berbagai unsur protein didalam sel normal maupun neoplastik . Banyak perkembangan baru
dijumpai dalam bidang
biomolekuler, bidang diagnosis, prognosis dan terapi pada kanker kolon.4 Selain prosedur baku secara medis, banyak cara yang dilakukan penderita untuk mencari kesembuhan dari penyakit kanker, salah satunya dengan menggunakan tanaman obat. 5 Banyak jenis tanaman obat yang sudah lama dikenal sebagai obat anti kanker, beberapa sudah diisolasi kandungannya menjadi obat kemoterapi. Obat-obat kemoterapi berkembang dari empirik klinik, ditunjukkan dengan kenyataan bahwa banyak bahan-bahan sitostatika telah mendapat tempat yang tetap di klinik. Hal serupa juga terjadi dalam penggunaan tanaman obat untuk pengobatan kanker, diantaranya kanker colon, meskipun efek dari tanaman obat tersebut dalam menghambat proliferasi sel kanker belum teruji secara ilmiah.5 Tanaman obat Indonesia telah secara sporadis diteliti di berbagai Universitas dan lembaga penelitian di Indonesia. Tujuan beberapa penelitian ini umumnya untuk membuktikan apakah penggunaan suatu tanaman obat terhadap penyakit kanker bisa dibuktikan secara ilmiah.6 Penelitian-penelitian yang pernah ada sebelumnya lebih bersifat pembuktian atas rasionalitas atau irrasionalitas penggunaan tanaman tersebut sebagai obat dan bukan suatu pencarian obat baru. Tanaman-tanaman obat tersebut memang sudah biasa digunakan sebagai obat dan dirasakan efektivitasnya secara empiris, sehingga penelitian yang dilakukan adalah upaya untuk memahaminya.6.7 Berdasarkan uraian diatas maka dianggap perlu dilakukan penelitian untuk membuktikan adanya kemampuan ekstrak bawang dayak dalam menghambat proliferasi sel kanker kolon sekaligus menekan ekspresi protein p53 mutan secara in
3
vitro dengan menggunakan galur sel kanker kolon HT29. Sehingga ekstrak tersebut nantinya dapat digunakan sebagai terapi komplementer atau sebagai terapi substitusi pada pengobatan medis konvensional.21
I.2. PERUMUSAN MASALAH 1. Apakah fraksi etanolik bawang dayak mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro? 2. Apakah 5-fluorouracil mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro? 3. Apakah terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara in vitro antara fraksi etanolik bawang dayak dengan 5-fluorouracil pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro?
I.3.TUJUAN PENELITIAN 1. membuktikan potensi fraksi etanolik bawang dayak dalam mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro 2. Membuktikan potensi 5-fluorouracil dalam mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro 3. Membuktikan tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara in vitro antara fraksi etanolik bawang dayak dengan 5fluorouracil pada biakan kultur sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro.
4
I.4. MANFAAT PENELITIAN I.4.1. Manfaat Teoritik 1. Diharapkan dapat memberi informasi ilmiah mengenai kemampuan fraksi etanolik bawang dayak dalam menghambat proliferasi sel kanker kolon dan penekanan ekspresi P53 mutan secara in vitro. 2. sebagai sarana untuk meningkatkan pengetahuan dan kemampuan peneliti dalam bidang biologi molekuler. 3. Memberi kontribusi ilmiah terhadap penelitian – penelitian kanker kolon selanjutnya. I.4.2. Manfaat Praktis. Sebagai dasar ilmiah untuk mengkaji efek klinis lebih lanjut dari senyawa bioaktif anti kanker dan kemopreventif yang terdapat pada bawang dayak dan diharapkan dapat dikembangkan sebagai obat anti kanker yang baru ataupun sebagai terapi komplementer dari terapi yang ada.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Kanker Kanker adalah suatu penyakit dengan ciri gangguan atau kegagalan mekanisme pengaturan multiplikasi pada organisme multiseluler sehingga terjadi perubahan yang tidak terkontrol. Perubahan sel (transformasi) ini disebabkan oleh perubahan gen di dalam sel. Sel-sel yang telah mengalami transformasi terus menerus berproliferasi dan menekan pertumbuhan sel normal. Pertumbuhan kanker yang tidak terkendali tersebut diikuti dengan invasi ke jaringan sekitar dan metastase ke bagian tubuh lain6,7,8,17. Karsinogenesis
merupakan
proses
pembentukan
sel
kanker
yang
patogenesisnya secara molekuler merupakan penyakit genetik. Proses ini terjadi akibat pengaruh berbagai faktor (multifaktorial) yang menyerang tubuh secara bertahap (multistage). Bahan – bahan yang dapat menyebabkan sel kanker disebut karsinogen. Berdasarkan asalnya, maka karsinogen dapat berasal dari faktor eksogen seperti karsinogen kimiawi, virus dan fisik, dan karsinogen yang berasal dari faktor endogen seperti hormon sex. Adapula yang memasukkan kokarsinogen seperti diet, umur, keturunan, rangsang menahun dan trauma sebagai perangsang terbentuknya sel kanker.35 Perubahan sel normal menjadi sel kanker melalui 3 tahap yaitu tahap inisiasi, promosi dan progresi. Pada tahap inisiasi, terdapat faktor inisiator yang memulai pertumbuhan sel yang abnormal seperti radiasi, bahan kimia mutagenic, virus, mutasi spontan. Pada tahap promosi dipicu oleh promotor seperti tumor promotor, gowth faktor, virus sehingga terbentuk sel – sel yang
6
polimorfis dan anaplastik. Pada tahap progresi ditandai dengan adanya invasi sel ganas ke membrana basalis atau kapsul.11 Perubahan keganasan melibatkan beberapa gen yaitu onkogen, gen penekan tumor, gen yang berperan dalam perbaikan DNA (DNA repair gen), dan gen pengatur apoptosis. 4, 11, 12 Onkogen adalah gen yang berkaitan dengan terjadinya transformasi neoplastik. Onkogen ini berasal dari protoonkogen yang mengalami mutasi. Protoonkogen adalah gen yang mengatur proliferasi normal. Perubahan yang dialami protoonkogen seluler pada aktivasi menjadi onkogen selalu bersifat mengaktivasi, artinya mereka menstimuli suatu fungsi sel yang mengakibatkan pertumbuhan dan diferensiasi sel. Walau ada sel yang mengalami pembelahan diri secara tak terkendali, masih belum mengarah ke bentuk kanker, karena sel-sel sekitar akan bereaksi dengan mengeluarkan growth inhibitor (zat pengahambat pertumbuhan). Zat pengahambat pertumbuhan ini akan mengikat ke reseptor sel yang malfungsi, mengirimkan signal ke inti sel, mengaktifkan gen penekan tumor. Proses timbulnya keganasan pada tingkat molekuler dapat diamati dari produksi protein yang berlebihan yang dihasilkan oleh onkogen. Aktivasi onkogen merangsang produksi reseptor faktor pertumbuhan yang tidak sempurna, yang memberi isyarat pertumbuhan terus-menerus meskipun tidak ada rangsang dari luar. Proses proliferasi yang tidak terkendali tanpa diiringi maturasi sel dapat mengakibatkan gangguan diferensiasi sel. Pada tahap selanjutnya, gangguan diferensiasi sel akan mencerminkan progesifitas sel menjadi ganas.5,8,19,20 Gen penekan tumor berfungsi sebagi penghambat pertumbuhan sel, apabila diaktifkan maka akan menghentikan siklus pembelahan sel, sehingga dapat mencegah pembelahan sel selanjutnya. Tetapi apabila gen penekan tumor malfungsi disebabkan mutasi, maka sel abnormal yang terus membelah diri tidak
7
menanggapi pesan growth inhibitor yang dikeluarkan oleh sel sekitarnya untuk menghentikan pembelahan sehingga terjadi proses malignansi. 19,20 Kelainan pada gen penekan tumor bersifat resesif, artinya baru menimbulkan tumor kalau kedua allele menunjukkan kelainan atau bahkan kehilangan kedua allele.19
TUMOR SUPPRESOR GENE “two-hit”theory
Gambar 1. Kelainan allele pada gen penekan tumor. 54 Contoh gen penekan tumor adalah gen Rb, p53, DCC (Deleted in Cell Colorectal Carsinoma), APC (Adenomatous Polyposis Colli), WT-1 (Wilm’s Tumor-1), NF-1 (Neurofibromatosis type-1) dan NF-2 (Neurofibromatosis type-2). 20
Identifikasi mutasi gen penekan tumor telah membuka era baru pada kemajuan ilmu genetika.
Bila
hasil tes molekuler menunjukkan bahwa
individu memiliki mutasi pada gen penekan tumor maka dapat segera dilakukan tindakan untuk mengurangi kesempatan individu tersebut terserang karsinoma.
8
Apoptosis ialah kematian sel terprogram yang terjadi baik pada beberapa proses fisiologik maupun proses neoplasma. Penumpukan sel pada neoplasma tidak hanya terjadi sebagai akibat aktifasi gen perangsang pertumbuhan atau tidak aktifnya gen penekan tumor, tetapi juga oleh karena mutasi gen pengatur apoptosis. Pertumbuhan sel diatur oleh gen perangsang dan gen penghambat pertumbuhan, maka kehidupan sel ditentukan oleh gen perangsang dan penghambat apoptosis. 8,19,22 Tahap inisiasi diawali dengan kegagalan mekanisme DNA repair sehingga paparan inisiator seperti hormon, radiasi, mutasi spontan dan bahan kimia mutagenik pada sel yang terinisiasi menyebabkan terjadinya perubahan urutan nukleotida DNA proto-onkogen sehingga ekspresi gen berubah meskipun jaringan masih terlihat normal. Tahap inisiasi merupakan proses yang berlangsung cepat dan bersifat reversibel. 19,20,22 Tahap inisiasi akan berlanjut menjadi tahap promosi apabila se1 yang terinisiasi tadi terpapar oleh promotor seperti faktor pertumbuhan dan infeksi virus sehingga sel akan berkembang menjadi sel preneoplasi. Pada sel preneoplasi akan terjadi transformasi urutan DNA sel sehingga ekspresi protein yang dikode gen tersebut ikut berubah. Tahap promosi ini tidak terjadi dalam waktu singkat, selain itu juga harus ada serangan promotor yang terus-menerus. Sebenarnya proses tersebut dapat dihambat oleh anti onkogen, gen penekan tumor dan faktor diferensiasi, akan tetapi bila faktor- faktor anti karsinogenik tadi gagal melaksanakan fungsinya maka sel preneoplasi akan menjadi sel tumor in situ.
19,20,36
Sel tumor in situ jika kembali mendapat paparan inisiator akan berkembang menjadi sel tumor infiltratif yang merupakan tahap akhir karsinogenesis yaitu
9
tahap progresi. Proses perkembangan menjadi sel tumor infiltratif dihambat oleh mekanisme apoptosis, faktor diferensiasi, penghambat angiogenesis dan sistem imun tubuh. 19,36 Pro-carcinogenetic factor
Normal Cell
Anti-carcinogenetic factor
Radiation Mutagenic chemicals. Viruses. Spontaneous Mutation
Tumor Promoters Growth Factor Viruses.
Initiation
DNA Repair
Initiated Cell Promotion
Preneoplasia
Radiation Mutagenic chemicals.
N ormal Phenotype
Progression
Viruses. Spontaneous Mutation
Invasive tumor
Growth inhibitors. Diff. factors Diff. Factors Immunosurveillance Lack of Angiogenesis. Apoptosis.
Malignant Phenotype : Drug resistant, Angiogenesis and Immunotolerant
Gambar 2. Skema Karsinogenesis
36
II.2. Siklus Sel Siklus sel secara normal terbagi dalam empat fase, yaitu: G1, S, G2, M dan diselingi dengan fase istirahat yaitu Go20. Fase awal dimulai dengan G1 , pada fase ini sel mulai mempersiapkan untuk melakukan sintesa DNA dan juga melakukan biosintesa RNA dan protein10,11. Kemudian dilajutkan dengan fase S, dimana pada fase ini terjadi replikasi DNA. Pada akhir fase ini sel telah berisi DNA ganda dan kromosom telah mengalami replikasi 20. Setelah fase S berakhir sel masuk dalam fase pra mitosis (G2) dengan ciri: sel berbentuk tetraploid, mengandung DNA dua kali lebih banyak dari pada sel fase lain dan masih berlangsungnya sintesis RNA dan protein. Sewaktu mitosis berlangsung (fase M) sistesis protein dan RNA berkurang secara tiba-tiba, dan terjadi pembelahan menjadi 2 sel. Setelah itu sel
10
memasuki fase istirahat (Go). Sel dalam fase Go yang masih potensial untuk berproliferasi disebut sel klonogenik atau sel induk (stem cell)10. Jadi yang menambah jumlah sel kanker ialah sel yang dalam siklus proliferasi dan dalam fase Go. 20
Gambar 3. Siklus sel.57 Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh beberapa checkpoint. Kontrol checkpoint berfungsi untuk memastikan bahwa kromosom utuh dan tahap-tahap kritis siklus sel telah sempurna sebelum memasuki tahap selanjutnya6. Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan aktivasi dan degradasi cyclin, aktivasi cyclin dependent kinases (CDKs), cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKIs). Interaksi diantara ketiga kelas protein tersebut berperan mengontrol berbagai tahap siklus sel, mencegah sel ke tahap selanjutnya jika terjadi kerusakan DNA melalui mekanisme checkpoint dan deregulasi proses ini berperan dalam kejadian kanker. 19,20 Pada kanker terjadi perubahan pada pengaturan siklus sel. Selama
11
perkembangan sel kanker, baik secara genetik maupun epigenetik, biasanya mempengaruhi ekspresi protein-protein pengatur siklus sel. Hal ini dapat menyebabkan overekspresi cyclin dan kehilangan ekspresi CDK inhibitor dan mengakibatkan deregulasi aktivitas CDK. Pada sel kanker juga terjadi ketidakmampuan kontrol checkpoint, mengakibatkan respon yang menyimpang terhadap adanya kerusakan seluler. Contohnya, kerusakan DNA pada fase G1 normalnya menyebabkan berhentinya siklus sel atau terjadi apoptosis tergantung pada tingkat kerusakannya, sehingga sel tidak bisa memasuki fase S karena dihentikan pada G1 6 . Ketidakmampuan kontrol checkpoint menyebabkan inisiasi fase S atau mitosis tetap berlangsung meskipun ada kerusakan seluler dan ketidakstabilan genetik yang selanjutnya menimbulkan clone maligna.12,15 Aktivitas dari kompleks cyclin-CDK yang mengontrol checkpoint tersebut diatur dengan cara fosforilasi dan defosforilasi. Satu substrat protein utama dari CDK adalah Rb. Rb saat kondisi hipofosforilasi berikatan dan menginaktifkan faktor transkripsi E2F. Fosforilasi melepaskan E2F dari kompleks Rb dan E2F. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E, cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Cyclin E membentuk kompleks dengan CDK2 dan meningkatkan fosforilasi Rb. E2F yang dihasilkan akan menginduksi transkripsi gen seperti DNA polymerase dan thymidin kinase.7,12,13,15,
12
Gambar 4. Siklus sel kanker. 37 Protein lain yang berperan dalam kontrol checkpoint ini antara lain p53, CDKI, p21. Pada sel yang normal, ekspresi p53 wild type rendah. Ketika terjadi kerusakan DNA maka p53 wild type akan teraktivasi dan mengaktifkan p21 yaitu suatu Cdk Inhibitor7,15. P21 ini akan mengikat dan menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi Rb terhambat dan pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya 6,7,12,15 . Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan memasuki jalur apoptosis. Jalur aktivasi dari p53 dapat terbagi menjadi 5 bagian : 1. Signal stressor yang memacu dan merangsang p53 2. Upstream aktivasi mediator akibat rangsangan p53 protein 3. Core Regulation dari p53. 4. Dowstream efek terhadap sel sebagai respon rangsangan p53 protein 5. Output seluler sebagai respon dari rangsangan p53
13
gambar 5: Alur kerja p53.55 Adanya akumulasi dari protein p53 wild type yang terjadi akibat adanya kerusakan DNA memegang peranan penting di dalam DNA repair. Protein p53 akan merangsang keluarnya p21 yang dapat mengakibatkan terjadinya cell cycle arrest. Cell cycle arrest ini dapat memberikan waktu bagi sel untuk melakukan DNA repair yang mengalami kerusakan sehingga apabila berhasil sel dapat berproliferasi secara normal. Apabila terjadinya kerusakan sel hebat dan tidak bisa dilakukan repair, maka jalur apoptosis akan diaktifkan untuk mengeliminasi sel yang mengalami kerusakan. Apabila normal DNA repair tidak terjadi karena terjadi mutasi dari p53 , maka sel dapat berproliferasi secara abnormal dan dapat terjadi keganasan. p53 dapat merangsang apoptosis dengan merangsang expresi dari gen pro apoptosis seperti Bax, Fas/Apo-1, Death Reseptor 5 (DR5) atau insulin Like Growth Fator-Binding Protein 3 (IGF-BP3), atau dengan merangsang expresi gen anti apoptosis seperti Bcl-2, celluler inhibitor of
14
Apoptosis Protein 2 (c-IAP2) dan Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1 (NAIP1). Jika Apoptosis tidak terjadi karena terjadi mutasi dari p53 atau deregulasi dari interaksi Fas-FasL maka sel dapat berkembang kearah keganasan. Aktivitas protein p53 wild type sebagai tumor supresor dapat diturunkan atau dihambat oleh protein Mdm2 yang mengakibatkan terjadinya degradasi dari p53 wild type menjadi lebih cepat. Gen Mdm2 itu sendiri juga diaktifkan oleh p53 sehingga dapat dikatakan dapat memberikan umpan balik negatif (negative autoregulatory loop).34,37 Tidak berfungsinya kontrol checkpoint yang mengakibatkan gagalnya respon penghentian siklus sel pada sel kanker dapat menjadi target potensial terapi antikanker6,43. Sel dengan kontrol checkpoint yang rusak lebih sensitif terhadap perubahan genotoksik atau kerusakan mikrotubular. Pengembangan obat antikanker yang didasarkan pada regulasi siklus sel selanjutnya diarahkan pada penghambatan terjadinya proses pembelahan sel, sehingga senyawa atau protein yang diberikan pada penderita dapat mencegah sintesis DNA dan mitosis sehingga menghentikan proliferasi sel kanker.6,7,44,45
II.3. Apoptosis Pada Kanker Pada organisme multiseluler, homeostasis jaringan dipengaruhi oleh proliferasi, diferensiasi dan kematian sel. Sebagaimana proliferasi dan diferensiasi, apoptosis penting dalam mengontrol pertumbuhan. Adanya gangguan dalam program tersebut akan mengakibatkan pertumbuhan sel abnormal.8,20 Apoptosis adalah tipe kematian sel yang terprogram melalui serangkaian perubahan
struktural
sebagai
hasil
dari
rangsang
fisiologis
atau
15
patologis8,26. Ciri morfologi apoptosis adalah pengkerutan sel, penonjolan membran (membrane blebbing), kondensasi kromatin, dan fragmentasi inti sel. 26 Gambaran tersebut adalah hasil dari aktivasi caspase, yaitu keluarga protease yang substratnya meliputi prekursor enzim yang dapat menyebabkan destruksi proteolitik sitoskeleton dan metabolit protein yaitu poly (adenosine5’diphosphate-ribose) polymerase (PARP), DNA-dependent protein kinase, lamin, protein kinase, dan aktin.20,50 Apoptosis terjadi melalui dua jalur utama yaitu, jalur ekstrinsik atau death receptor (DR) dan jalur intrinsik atau jalur mitokondria.50,51 Death receptor pathway dimulai dengan pengaktifan tumor necrosis factor receptor (TNFR), yang meliputi Fas, death receptor (DR) 4, TNFRI dan TNFRII. Fas menginduksi apoptosis melalui dua jalur. Jalur pertama dengan mengikat ligan. Ikatan ligan mengaktifkan reseptor TNFRI dan Fas untuk menarik dan mengikat Protein death effector Fadd/Mort-1. Ikatan Fadd/Mort-1 menarik procaspase 8. Procaspase 8 diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu caspase 8 dan dilepaskan kembali ke dalam sitosol 50,52 . Caspase 8 akan memecah dan mengaktifkan caspase 3. Jalur kedua lewat jalur alternatif sinyal transduksi. Reseptor Fas berikatan dengan protein adapter yang akan mengaktifkan mitogen activating protein kinase (MAP3) dan memicu kaskade fosforilasi yang meningkat pada aktivasi c-Jun N terminal kinase (JNK). JNK yang teraktivasi memfosforilasi substrat seperti c-Jun dan p53 dan menginduksi apoptosis lewat berbagai mekanisme, meliputi modifikasi dan pengaturan protein pada famili Bcl-2.50 Pada jalur mitokondria, salah satu kejadian yang menyebabkan apoptosis adalah pelepasan sitokrom c dari mitokondria melalui porus yang
16
dibentuk oleh mitochondrial permeability transition pore (PTP) dan protein pro apoptosis Bax 13,14. Jika PTP berasosiasi dengan Bax maka keduanya dapat membentuk suatu kanal spesifik untuk sitokrom c dan faktor-faktor yang menginduksi apoptosis. Asosiasi antara Bax dengan PTP dan aktivitas pembentukan porus dicegah oleh protein anti apoptosis BcI-2. Sitokrom c yang dilepaskan oleh mitokondria ke sitosol akan berinteraksi dengan Apaf-1 untuk membentuk apoptosom yang akan merekrut dan mengaktivasi
procaspase-9.
Caspase-9
yang
aktif
akan
melakukan
pemecahan terhadap caspase efektor yaitu caspase-3, -6, dan -7. Caspase efektor ini kemudian melakukan pemecahan terhadap banyak substrat di dalam sel yang penting, dan menimbulkan perubahan morfologis yang khas pada apoptosis.50,51.
Gambar 6. Alur kerja Apoptosis50,56
17
Apoptosis dan gen yang mengontrolnya mempunyai efek yang besar pada fenotip keganasan. Gangguan pada program apoptosis akan menyebabkan mortalitas
sel.
Mutasi
onkogenik
yang
mengganggu
apoptosis
mempengaruhi inisiasi tumor, progresifitas tumor dan metastase.50,51,52. Hampir
semua
obat
anti
kanker
yang
digunakan
sekarang,
dikembangkan dengan penyaringan yang dirancang untuk mengidentifikasi bahan yang secara selektif membunuh tumor. 50 Hubungan antara apoptosis dengan terjadinya kanker memberikan ide penelitian tentang target dan mekanisme farmakologi obat-obat anti kanker. yang
poten
untuk
menginduksi
dan
50
Suatu obat anti kanker
mengaktifkan
apoptosis
dapat
menghindari banyaknya efek samping yang tidak diharapkan karena pelepasan material-material sampah akibat nekrosis sel, dan mengurangi kerusakan sel-sel normal yang disebabkan oleh kemoterapi. Proses apoptosis juga dapat digunakan untuk mengevaluasi toksisitas obat. Gangguan dan mutasi gen pada program apoptosis dapat mengurangi sensitivitas terapi dan menyebabkan resistensi obat.50 Disamping apoptosis dikenal cara kematian yang lain yaitu nekrosis yang dapat terjadi oleh karena kegagalan sintesa ATP oleh mitokondria. Nekrosis merupakan kematian sel yang tejadi secara patologis, dengan penyebab utama gangguan produksi ATP. Pada setiap kerusakan jaringan misalnya akibat radikal bebas, bahan toksik, atau bahan infeksius, kedua proses ini berjalan bersama dengan proporsi yang berbeda dan saling berkaitan.50
18
Gambar 7. Perubahan sel akibat apoptosis dan nekrosis50
Apoptosis
Nekrosis
Peran sel
Aktif
Pasif
Distribusi
Tersebar
Terkonsentrasi
pada
satu
daerah atau menyebar dari satu titik ( contiguous) Morfologi
Volume sel menyusut
Volume sel mengembang
Membran
Dipertahankan
Rusak
Induksi
Perlahan ( jam)
Cepat ( detik – menit)
Pembersihan
Cepat
Lambat
Tidak ada
Ada
sel
sel mati Inflamasi
Tabel 1. Perbedaan Apoptosis dan Nekrose
II.4. Adenokarsinoma Kolon II.4.1. Definisi Adenokarsinoma kolon berasal dari sel epitel yang mengalami displasia, yang berkembang menjadi adenoma, dan terus berkembang dan terjadi invasi ke
19
mukosa muskularis menuju proses keganasan. Tahapan-tahapan ini dianggap sebagai dasar terjadinya adenokarsinoma kolon.1,6,7
II.4.2.Anatomi Panjang kolon sekitar 150 cm yang terbagi menjadi beberapa bagian meliputi coecum, kolon ascenden, kolon tranversum, kolon descenden dan kolon sigmoid. Ileocoecal junction, coecum, kolon tranversum dan kolon sigmoid terletak intraperitoneal dan kolon ascenden dan kolon descenden terletak retroperitoneal. Vaskularisasi dari ilocoecal junction sampai dengan fleksura lienalis berasal dari arteri mesenterika superior, sedangkan mulai dari fleksura lienalis sampai kolon sigmoid berasaldari arteri mesenterika inferior.28,31
Gambar 8. Anatomi sistema Gastrointestinal 31
20
II.4.3. Insidensi Resiko terjadinya karsinoma kolon mulai meningkat setelah usia 40 tahun, dan meningkat tajam pada umur 50 sampai 55 tahun. 1 Karsinoma kolon memiliki insidensi dan angka kematian yang cukup tinggi di negara-negara berkembang. Di Amerika Serikat, angka kejadian pertahun lebih dari 150.000 dan rata-rata kejadian kasus baru sekitar 110.000 untuk karsinoma kolon dan 45.000 kasus pada karsinoma rektum, dan merupakan penyebab kematian kedua dari semua kematian akibat kanker. Dengan diagnosa dini dan terapi yang adekuat angka ketahanan hidup mencapai 5 tahun dapat ditingkatkan.29,30 Stage Description
5-Year Survival
A
Limited to the bowel wall
83%
B
Extension to pericolic fat; no nodes
70%
C
Regional lymph node metastases
30%
D
Distant metastases (liver, lung, bone) 10% Table 2. Dukes Classification and 5-Year Survival
II.4.4 Etiologi dan faktor predisposisi Penyebab karsinoma kolon belum diketahui dengan pasti. Secara umum dinyatakan bahwa untuk perkembangan karsinoma kolon merupakan interaksi antara faktor lingkungan dan faktor genetik. Faktor lingkungan multipel beraksi terhadap predisposisi genetik atau defek yang didapat dan berkembang menjadi karsinoma kolon.1,10 Tumor ini muncul pada lesi di tunika mukosa yang dalam perkembangannya mengadakan invasi ke tunika muskularis, struktur vaskuler, kelenjar limfe regional struktur sistemik.29,30
sekitar dan akhirnya dapat metastase secara
21
II.4.4.1. Perubahan Genetik Dengan bertambahnya penelitian di bidang biologi molekuler, pengaruh faktor genetik terbukti mempunyai hubungan yang erat dengan perkembangan karsinoma kolon. II.4.4.1.1. Perubahan Genetik pada Karsinoma Kolon Terdapat 3 kelompok karsinoma kolon berdasarkan perkembangannya, yaitu : 1. Kelompok yang diturunkan (inherited) yang mencakup kurang dari 10 % dari karsinoma kolon dan rektum, terdapat pada mereka yang dilahirkan sudah dengan mutasi germline (germline mutation) pada salah satu allele dan terjadi mutasi somatik pada allele yang lain. Contohnya adalah FAP (Famillial Adenomatous polyposis) dan HNPCC (Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer). HNPCC terdapat pada sekitar 5% dari karsinoma kolon dan rektum. 1 2. Kelompok sporadik, yang mencakup sekitar 70%, pada kelompok ini membutuhkan dua mutasi somatik, satu pada masing-masing allele-nya. 3. Kelompok familial, yang mencakup 20% dari karsinoma kolon dan rektum, lebih dari 35% terjadi pada umur muda. 1 Terdapat 2 model perjalanan perkembangan karsinoma kolon dan rektum (karsinogenesis) yaitu LOH (Loss of heterozygocity) dan RER (Replication Error). Model LOH mencakup mutasi gen penekan tumor meliputi gen APC, DCC, dan p53 serta aktifasi onkogen yaitu K-ras. Model ini contohnya adalah perkembangan polip adenoma menjadi karsinoma.
22
Gambar 9. Skema Jalur LOH pada perkembangan karsinoma kolon dan rektum 53 Sementara model RER karena adanya mutasi gen hMSH2, hMLH1, hPMS1, hPMS2. Model RER terdapat pada perkembangan HNPCC. Pada bentuk sporadik, 80% berkembang lewat model LOH dan 20% berkembang lewat model RER. 1,53 Gen yang terlibat dalam perkembangan karsinoma kolon adalah APC pada kromosom 5q, myc pada kromosom 8, K-ras pada kromosom 12, p53 dan HER2/neu (c-erbB2) pada kromosom 17, pRb pada kromosom 13 dan DCC pada kromosom 18q. K-ras, c-erbB2 dan myc berperan sebagai onkogen. APC, DCC, pRb dan p53 sebagai gen penekan tumor.47,48
23
“RER” PATHWAY TO COLORECTAL CARCINOMA Mutation or loss of mismatch repair genes (inherited in HNPCC) Accumulation of somatic mutations within microsatellites Altered function of microsatellites Altered function of genes that contain or are regulated By microsatellites (type II TGR-ß receptor gene)
Sequential accumulation of genetic changes In carcinoma-related genes Adenoma-carcinoma sequence (ussualy does not involve APC, MCC, K-ras, DCC, p53) Gambar 10. Skema Jalur RER pada perkembangan kanker kolon dan rektum 53
II.4.4.1.2. Gen APC Gen APC (Adenomatous Polyposis Colli) berlokasi pada lengan panjang kromosom 5q. Gen ini mengalami mutasi pada kasus FAP (Famillial Adenomatous polyposis) dan Gardner’s syndrome dan banyak ditemukan pada Turcot’s Syndrome. Gen APC mengkode satu peptida yang terdiri dari 2843 asam amino dengan berat molekul sekitar 300 kDa.53 Mutasi pada gen APC ditemukan secara mayoritas pada kasus adenokarsinoma kolon, hampir 63 % adenoma, 60 % adenokarsinoma, dan tidak dijumpai pada jaringan kolon yang tidak mengalami malignansi. Hal ini mengindikasikan adanya mutasi somatic. Karena APC merupakan gen penekan tumor, inaktivasi allele ke dua akan mengakibatkan sel kehilangan kemampuan
24
aktifitas tumor-penekan. Mutasi gen APC merupakan awal dari karsinogenesis sporadic adenokarsinoma kolon. Beberapa mutasi gen APC menghasilkan hilangnya fungsi protein produknya. Hilangnya kemampuan binding dengan protein EB1 diduga berkaitan dengan hilangnya fungsi gen penekan tumor. 53
II.4.4.1.3. Gen DCC Gen DCC (Delleted in Colorectal Carcinoma) yang berlokasi pada lengan panjang kromosom 18 (18q). Gen ini menghasilkan produk protein yang terlibat dalam adesi antar sel dan interaksi antara sel-matrik, yang sangat berguna pada pencegahan pertumbuhan tumor, invasi, dan metastase. Pada adenokarsinoma kolon dan rektum sporadik, DCC memegang peranan yang penting sebagai satu critical role yang menentukan kemampuan metastase tumor. 53
II.4.4.1.4. Gen p53 Gen p53 merupakan phosphoprotein yang berukuran 53 kDa dan berlokasi pada lengan pendek kromosom 17 (17p13.1). dan mengandung 393 asam amino. Protein ini terdiri atas 5 domain, yaitu : 1. TAD : N-terminal transkription-activation domain . mengaktivasi faktor transkripsi, asam amino 1-42. 2. PRD : Proline Rich Domain, residu asam amino 80-94. 3. DBD : Central DNA-Binding Core Domain, mengandung 1 atom Zn dan beberapa asam amino arginine, residu asam amino 100-300. 4. OD
: Homo-Oligomerisation Domain, asam amino 307-355. Tetramerasi penting untuk aktivasi p53 in vivo.
5. C-terminal : Terlibat dalam regulasi pengikatan DNA pada central domain :
25
residu asam amino 356-393.
Gambar 11. Domain protein p53 dan lokasi Hot Spot(Seemann et al. Clinical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 2004, 41: 551-583) protein p53 merupakan faktor determinan yang sangat penting dalam malignansi selama karsinogenesis adenokarsinoma kolon. Gen yang diaktifkan p53 kebanyakan merupakan gen penekan faktor pertumbuhan tumor. Dengan demikian inaktivasi fungsi p53 berakibat pada unregulated cell growth. 47,48,53
Gambar 12. Gen penekan tumor p53 dan pRb.53 P53 adalah tumor supresor gen yang berfungsi sebagai penentu dari gen dengan bermain pada jalur utama untuk mengetahui kerusakan DNA dan menentukan apakah sel tersebut harus melakukan DNA repair terhadap kerusakan DNA yang ada atau merangsang sel untuk menjalani proses Apoptosis. p53 mutan kehilangan fungsi dari P53 wild type sehingga terjadi proliferasi sel yang berlebihan akibat adanya kerusakan DNA sehingga sel dapat mengalami tranformasi menjadi maligna.40
26
Lebih dari 50% tumor primer pada manusia kehilangan p53 wild type sebagai tumor supresor gen bahkan menunjukkan peningkatan yang cepat dari level p53 mutan. Penelitian kanker selama ini bertujuan untuk mengembalikan fungsi dari p53 wild type dan menekan ekspresi dari p53 mutan. Untuk mencapai tujuan penelitian tersebut dalam jangka panjang dibutuhkan penjelasan tentang mekanisme molekuler yang mengontrol aktivitas dari p53 wild type pada sel normal dan apabila p53 wild type hilang pada perkembangan sel tumor.40
II.4.4.1.5. K-Ras Proto-oncogen Lokasi K-ras sebagai onkogen terletak pada lengan pendek kromosom 12 (12p12.2). protein K-ras berinteraksi dengan molekul efektor, menghadirkan suatu respon pertumbuhan. Mutasi pada K-ras mengakibatkan kacaunya signal transduksi. Mutasi pada K-ras ditemukan sekitar 47 % kasus adenokarsinoma dan 50 % pada large adenoma. 53
II.4.4.1.6. Mismatch Repair genes Mismatch Repair genes diperlukan sel untuk mengadakan reparasi kesalahan DNA yang terjadi selama replikasi atau karena adanya kehilangan basa N secara spontan. Ada 4 DNA mismatch repair genes yang ditemukan pada manusia, yaitu : 1. hMSH2 (kromosom 2p) 2. hMLH1 (kromosom 3p21) 3. hPMS1 (kromosom 2q31-33) 4. hPMS2 (kromosom 7p22) Mutasi pada keempat gen tersebut terlibat dalam kasus HNPCC (Hereditary
27
Non-Polyposis Colorectal Cancer) dan Lynch syndome, dalam variasi prosentase kasus. 53
II.4.4.2. Pengaruh Lingkungan Kejadian malignansi pada karsinoma kolon juga ditentukan oleh faktor lingkungan, yang mempengaruhi faktor molekuler dalam sel. Faktor lingkungan yang majemuk memungkinkan terjadinya predisposisi genetik dan menyebabkan defek. Faktor genetik yang terlahir dengan berbagai lesi genetik akan menginisiasi karsinogenesis atau hal ini dapat juga berawal dari faktor
lingkungan, atau
kombinasi keduanya. Semuanya berakibat adanya genetik alterations dan karsinogenesis.1,33
Gambar 13. Hubungan antara faktor genetik dan lingkungan pada karsinogenesis karsinoma kolon dan rektum. 33
28
II.4.5 Klasifikasi II.4.5.1 Derajat Histopatologi. Adenokarsinoma kolon sangat berbeda secara gambaran histologinya, beberapa tumbuh relatif berdiferensiasi baik, lainnya menjadi lebih buruk. Secara umum pertumbuhan papiliferous cenderung berdiferensiasi lebih baik daripada lesi dengan ulserasi dan infiltrasi lebih dalam. 1 Broders, Grinnell dan Duke’s memperkenalkan suatu modifikasi sistem penderajatan secara histologis, dimana terlihat bahwa ada hubungan erat antara ekstensi penyebaran lesi dengan prognosis akhir setelah terapi pembedahan. 1 Duke’s pada tahun 1946 memodifikasi sistem penderajatan histologi adenokarsinoma kolon menjadi beberapa kategori, yaitu : 1. Derajat keganasan rendah (diferensiasi baik) : gambaran tumor yang menyerupai adenoma dengan tanda-tanda adanya proliferasi aktif epitel, tapi dapat dikenali sebagai malignansi karena adanya infiltrasi ke lapisan muskularis mukosa. 2. Derajat keganasan sedang (diferensiasi sedang) : Gambaran tumor dengan selsel karsinoma yang banyak berkelompok tetapi tetap terbatas dalam bentuk yang cukup rata pada satu atau 2 lapisan lebih dalam di sekitar ruang glandula. Umum terlihat adanya nukleus yang berwarna dan bentuk mitosis yang tidak teratur. 3. Derajat keganasan Tinggi (diferensiasi buruk) : gambaran sel tumor makin anaplastik dan tidak membentuk sistem glandular sama sekali, tetapi meliputi setiap jaringan atau dalam kelompok yang tidak teratur. 1:
29
gambar 14. proses perkembangan karsinoma colorectal.54 II.4.5.2. Stadium Klinik Klasifikasi keganasan pada
kolon berdasarkan ekstensi penyebaran
langsung dan adanya metastase ke sistem limfatik , pertama kali diajukan oleh Duke’s pada tahun 1930, Dibagi menjadi 4 kategori yaitu :
Stadium A : hanya terbatas pada lapisan mukosa
Stadium B : sudah masuk dalam lapisan muskularis propia (B1), masuk dalam lapisan subserosa (B2), masuk sampai struktur yang berdekatan (B3).
Stadium C : bila sudah ada keterlibatan kelenjar, dibagi menjadi stadium C 1 bila penyebarannya sudah melibatkan limfonodi parakolika dan limfonodi epikolika , C 2 bila penyebarannya sudah melampaui limfonodi parakolika dan limfonodi epikolika.
Stadium D : bila sudah ada metastase baik secara limfatik maupun secara hematogen. 1,4,6,9
30
Pada tahun 1987 American Joint Committee on Cancer dan International Union Againts Cancer memperkenalkan sistem klasifikasi TNM, dimana ekstensi tumor (T) dibagi atas T1 s/d T4, adanya keterlibatan kelenjar (N) dibagai atas : N1 bila < 4 kelenjar, N2 bila > 4 kelenjar, dan N3 bila terdapat keterlibatan kelenjar sepanjang pembuluh darah, dan adanya metastase jauh (M1).
1,9
pT – Tumor Primer pTx
: Tumor primer tidak dapat dinilai
pT0
: Tumor primer tidak ditemukan
pTis
: Karsinoma insitu, intraepithelial atau ditemukan sebatas lapisan mukosa saja
pT1
: Tumor menginvasi submukosa
pT2
: Tumor mengivasi lapisan muskularis propia
pT3
: Tumor menembus muskularis propia hingga lapisan serosa atau jaringan perikolika/perirectal belum mencapai peritoneum
pT4
: Tumor menginvasi organ atau struktur disekitarnya atau menginvasi sampai peritoneum visceral
pN – Kelenjar getah bening Regional pNx
: Kelenjar getah bening regional tidak dapat dinilai
pN0
: Tidak ditemukan metastasis pada kelenjar getah bening regional
pN1
: Ditemukan anak sebar pada -3 kelenjar getah bening regional
pN2
: Ditemukan anak sebar pada 4 atau lebih kelenjar getah bening regional
pM – Metastasis jauh pMx
: Metastasis jauh tidak dapat dinilai
pM0
: Tidak ditemukan metastasis jauh
pM1
: Ditemukan metastasis jauh
31
Stadium
T
N
M
Stadium
0
:
Tis
N0
M0
Stadium
IA
:
T1
N0
M0
IB
:
T2
N0
M0
IIA
:
T3
N0
M0
IIB
:
T4
N0
M0
IIIA
:
Semua T
N1
M0
IIIB
:
Semua T
N2
M0
IV
:
Semua T
Semua N
M1
Stadium Stadium Stadium
Tabel 3. Stadium klinis dari karsinoma kolon
II.4.6. Diagnosis Deteksi dini dan diagnosis pada pengelolaan tumor kolon dengan kecurigaan keganasan memiliki peranan yang penting di dalam memperoleh hasil yang optimal yaitu meningkatnya harapan hidup, dan menurunnya tingkat morbiditas dan mortalitas pada penderita karsinoma kolon. 1,4,6 Mendiagnosis adanya tumor kolon dengan kecurigaan keganasan dapat dilakukan dengan cara : 1. Pemeriksaan klinis, yang terdiri dari anamnesis dan pemeriksaan fisik termasuk colok dubur. 2. Pemeriksaan laboratorium, yaitu test darah samar, test faal hati, dan Carcinoembrionic antigen (CEA). Kadar CEA pada keadaan normal adalah 0 – 2,5 ng/mL. Terdapat beberapa keadaan yang dapat meningkatkan kadar CEA, dengan kadar < 10 ng/mL dan bersifat reversible, antara lain pada penderita obstruksi bilier, disfungsi hepatoseluler, bronkitis, divertikulitis, adenomatous polyps, gastric ulcer, perokok, BPH, renal disease. Peningkatan kadar CEA dapat dijumpai pada keganasan lain selain keganasan kolon.
10
Kadar CEA
32
pada karsinoma kolon berhubungan dengan volume tumor dan respon terapi anti tumor, dan berhubungan dengan sisa tumor setelah reseksi. Sensitifitas dan spesifitas CEA untuk mendeteksi kekambuhan antara 70 – 80 %. 1 3. Pemeriksaan penunjang, terdapat pemeriksaan penunjang yang terbukti efektif dalam diagnosis tumor kolon dengan kecurigaan keganasan, yaitu barium enema, kolonoskopi dan biopsi,
Transrectal USG
digunakan untuk
menentukan stadium dari karsinoma rektum, USG Abdomen digunakan untuk mendeteksi adanya metastase ke organ intra abdomen, foto thorak untuk mendeteksi adanya metastase ke paru, dan CT-Scan abdomen. Tingkat akurasi dari pemeriksaan ini tergantung pada persiapan kolon yang baik. 1,14 4. Pemeriksaan Patologi Anatomi sebagai gold standar untuk menentukan diagnosis patologi yang pasti.
II.4.7. Terapi II.4.7.1. Pembedahan Pembedahan masih merupakan standard terapi tumor kolon dengan kecurigaan keganasan. Pembedahan dilakukan sebagai terapi kuratif, simptomatik, diagnostik dan staging penyakit. Pengertian untuk aplikasi yang benar dari pembedahan tumor pada kolon sangat penting baik untuk ahli bedah maupun dokter yang terlibat dengan terapi penyakit ini. Sehingga pembedahan dapat membawa kesembuhan, dan atau perbaikan kualitas hidup dan memperpanjang survival penderita karsinoma kolon. 1,6,7 Terapi pembedahan yang dilakukan adalah reseksi kolon menurut lokasi tumor dan mengikuti aliran darah bersangkutan. Drainase limfe mengikuti aliran vaskuler, sampai pada asalnya pada arteri mesenterika superior atau arteri
33
mesenterika inferior. Teknik reseksi tidak banyak mengalami perubahan sejak beberapa dekade ini. Bila tumor terletak pada kolon ascendens dapat dilakukan hemicolectomy dextra, ditambah reseksi ileum terminal sepanjang kurang lebih 10 cm. Tumor yang terletak pada fleksura hepatika atau kolon transversum proksimal dilakukan extended hemicolectomy dextra dan omentectomy, bila terletak pada kolon transversum distal dan fleksura lienalis dilakukan extended hemicolectomy sinistra disertai omentectomy atau hemicolectomy sinistra. Tumor yang terletak pada kolon desendens dilakukan hemicolectomy sinistra, dan tumor yang terletak pada kolon sigmoid dilakukan hemicolectomy sinistra atau reseksi sigmoid. Tumor yang terletak pada rektum dilakukan operasi low anterior resection dan abdomino-perineal resection. 1,6
II.4.7.2. Terapi adjuvan Pasien dengan karsinoma kolon beresiko tinggi untuk terjadi kekambuhan baik lokal maupun sistemik. Terapi adjuvan bertujuan untuk menanggulangi kedua masalah tersebut. Terapi adjuvan dengan kemoterapi dan radioterapi baik dilakukan sebelum maupun sesudah pembedahan, dari beberapa penelitian terbukti efektif dan dapat dianggap sebagai terapi standar dan menghasilkan angka kekambuhan yang lebih rendah. 1,3 Obat kemoterapi yang biasa digunakan pada karsinoma kolon dan rektum adalah 5-fluorouracil (5-FU), Leukovarin, Irinotecan, Oxiliplatin, Capecitabine, dan perkembangan terbaru pada terapi antibodi monoklonal karsinoma kolon dengan menggunakan bevacizumab dan cetuximab telah digunakan pada terapi karsinoma kolon. 1,3
34
II.4.8.Prognosis Prognosis pada karsinoma kolon tergantung pada stadium tumornya, ada tidaknya metastase jauh, yaitu klasifikasi penyebaran tumor dan tingkat keganasan sel tumor, keadaan umum penderita, umur penderita, adanya komplikasi perforasi dan obstruksi, serta pengelolaan pra dan pasca bedah yang teliti dengan pembedahan dan pengangkatan tumor primer dan metastase seradikal mungkin. 1,6,7
II.5.Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr ) Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr ) merupakan tanaman perdu. Tumbuhan ini dapat ditanam dengan mudah, dalam waktu 6 bulan umbinya sudah dapat dimanfaatkan. Bawang ini mengandung senyawa alkaloid, glikosida, flavonoid, fenolik dan steroid ( Herbone 1987) Penyebaran tumbuhan bawang dayak banyak ditemukan mulai dari semenanjung Malaysia hingga Filipina, Sumatera (Bawang kapal), Kalimantan (Bawang Hantu , bawang makkah), Jawa (Brambang sabrang, bawang siyem, luluan sapi, teki sabrang, bebawangan beureum), Sulawesi, Nusa Tenggara. Secara ekologis tumbuhan bawang dayak tumbuh di daerah pegunungan pada ketinggian 600-2000 meter di atas permukaan laut. Sekilas taksonomi, dari tumbuhan bawang dayak (Eleutherine palmifolia (L), Merr) dapat dijelaskan sebagai berikut :
35
Taxonomy Division
Magnoliophyta Magnoliophytina
Class
Liliatae Liliiflorae
Order
Liliales
Family
Iridaceae Juss.
Genus
Eleutherine Herb.
Species
Eleutherine palmifolia (L.) Merr
II.5.1. Morfologi Tumbuhan bawang dayak merupakan semak, berumpun, tumbuhan semusim, tinggi sekitar 50 cm. Batang : Tumbuh tegak atau merunduk, basah dan berumbi. Tumbuhan ini menyukai tempat terbuka dan tanah kaya akan humus dan cukup lembab. Untuk menanamnya dengan menggunakan umbi.
gambar 15 : foto pohon bawang dayak
36
Daun : Tunggal lonjong berujung runcing dengan pangkal yang tumpul, pertulangan menyirip, warna hijau (daun seperti tanaman anggrek tanah). Umbi : Umbi pada tumbuhan bawang dayak umumnya berbentuk lonjong, bulat telur, merah seperti bawang merah, tidak berbau sama sekali. Umbi dapat dikonsumsi setelah usia 6 bulan, dengan tinggi 20 - 40 cm, lebar 1,5 - 3 cm.
Gambar 16. foto umbi bawang dayak
Bunga : tunggal,warna putih, berkelopak 6 dan mekar pada waktu sore hari dalam beberapa jam.
37
Gambar 17 : Foto bunga bawang dayak yang mekar
Gambar 18 : Foto bunga bawang dayak yang kuncup Tanaman ini ditemukan pada daerah tropis dan tumbuh dengan baik pada ketinggian sekitar 600 – 1500 m dari permukaan laut. Biasanya ditemukan di pinggir jalan yang berumput, di kebun teh, kina dan kebun karet.
II.5.2. Kandungan bahan kimia umbi bawang dayak Hingga saat ini belum banyak dipublikasikan mengenai kajian kimia dan farmakologi dari tumbuhan bawang dayak. Banyak aspek yang dapat diteliti untuk aplikasinya di bidang pengobatan, misalnya aspek kandungan senyawa kimianya, aspek toksisitasnya dan aspek
38
aktifitas farmakologisnya. Penelitian masih terus dilakukan untuk mengungkap lebih lanjut dari khasiat bawang dayak ini. Aulia (2003) menegaskan hasil skrening umbi bawang dayak dengan menggunakan pelarut petroleum eter dan ethanol, menunjukkan bahwa umbi tanaman ini mengandung senyawa terpenoid, flavanoid, antrakinon dan kaumarin. Lebih lanjut Aulia menegaskan bahwa ekstrak petroleum eter bawang ini memiliki aktifitas antibakteri terhadap E. coli, sedangkan
terhadap
S.
dysenteriacea
tidak
berpotensi
sebagai
antibacterial. Sedangkan ekstrak etanol memiliki aktifitas antibakteri terhadap E coli maupun S. dysenteriacea. Nilai KBM ekstrak ethanol masing-masing adalah 20 mg/ml untuk E. coli dan 12 mg/ml untuk S. dysenteriacea.
II.5.2.1.Flavonoid Merupakan golongan senyawa bahan alam yang terbesar dan berasal dari senyawa fenolik yang banyak merupakan pigmen tumbuhan. Saat ini lebih dari 6000 senyawa yang berbeda masuk ke dalam golongan flavanoid (Feye, 1996). Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air dan dapat diextraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah extrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavanoid merupakan bagian penting dari diet manusia karena banyak manfaatnya bagi kesehatan. Fungsi kebanyakan flavanoid dalam tubuh manusia adalah sebagai antioksidan sehingga sangat baik untuk pencegahan kanker. Selain itu flavanoid juga berfungsi untuk melindungi struktur sel
39
dan memiliki hubungan sinergis dengan vitamin C (meningkatkan efektifitas vitamin C)., anti inflamasi, mencegah keropos tulang dan sebagai antibiotic. Flavonoid dapat berperan secara langsung sebagai antibiotik dengan mengganggu secara langsung fungsi mikroorganisme seperti bakteri atau virus. Fungsi flavonoid sebagai antivirus telah banyak dipublikasikan, termasuk untuk virus HIV (AIDS) dan virus herpes. Selain itu, flavonoid juga dilaporkan berperan dalam pencegahan dan pengobatan beberapa penyakit lain seperti asma, katarak, diabetes, encok atau rematik, migren, wasir dan periodontitis sehingga dapat dijelaskan bahwa mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan tradisional. Penelititan-penelitain mutahir telah mengungkap fungsi lain dari flavonoid, tidak saja untuk pencegahan tetapi juga untuk pengobatan kanker. Senyawa flavonoid merupakan senyawa fenol terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuhtumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana 2 cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai propana (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6. Susunan ini dapat menghasilkan 3 jenis struktur senyawa flavonoida yaitu : a. Flavonoida atau 1,3-diarilpropana. b. Isoflavonoida atau 1,2-diarilpropana c. Neoflavonoida atau 1,1-diarilpropana
40
Istilah flavonoida diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kata flavon, yaitu nama dari salah satu jenis flavonoida yang terbesar jumlahnya dari tumbuhan. Senyawa – senyawa flavon ini mempunyi kerangka 2 fenilkroman dimana posisi orto dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1,3-diarilpropana dihubungkan oleh jembatn oksigen sehingga membentuk cincin heterosiklik yang baru (cincin C). Senyawa – senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis tergantung dari tingkat oksidasi dari rantai propane dar system 1,3diarilpropana. Flavon, flavonol dan antasianidin adalah jenis yang terbanyak di alam sehinga sering disebut flavonoid utama. Banyaknya senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi, alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut. Senyawa – senyawa isoflavonoida dan neoflavonoida hanya ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku leguminosol. Masing – masing jenis senyawa flavonoid mempunyai struktur dasar tertentu. Flavonoida mempunyai beberapa ciri struktur yaitu : Cincin A dari struktur flavonoid mempunyai pola oksigenasi yang berselang – seling yaitu pada posisi 2, 4 dan 6. Cincin B pada flavonoida mempunyai satu gugus fungsi oksigen pada posisi para atau 2 pada posisi para dan meta atau tiga pada posisi 1 di para dan 2 di meta. Biosintesa Pertama kali disarankan oleh Birch, yaitu : Pada tahap-tahap pertama biosintesa flavonoid suatu unit C6-C3 berkombinasi dengan 3 unit C2 menghasilkan unit C6-C3 (C2+C2+C2). Kerangka C15 yang
41
dihasilkan dari kombinasi ini telah mengandung gugus – gugus fungsi oksigen pada posisi- posisi yang diperlukan. Cincin A dari struktur flavonoida berasal dari jalur poliketida yaitu kondensasi dari 3 unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propane berasal dari jalur fenilropanoida (Jalur shikimat). Sehingga kerangka dasar karbon dari flavonoida dihasilkan dari kombinasi antara 2 jenis biosintesa utama untuk cincin aromatic yaitu jalur shikimat dan jalur asetat-malonat. Banyak mekanisme kerja dari flavanoid yang sudah terungkap misalnya inaktifasi karsinogen, anti proliferasi, penghambatan siklus sel, induksi
apoptosis
dan
differensiasi,
inhibisi
angiogenesis
serta
pembalikan resistensi multi-obat atau kombinasi dari mekanismemekanisme tersebut.
Gambar 19. Struktur dasar flavonoid II.5.2.2.Antrakinon Golongan kuinon alam terbesar terdiri dari antrakinon. Beberapa antrakinon merupakan zat warna dan sebagai pencahar. Turunan antrakinon umumnya berupa senyawa berwarna kuning kemerahan. Antrakinon mudah larut dalam air panas dan alcohol cair (trease dan evans (1989)). Antrakinon terhidroksilasi jarang terdapat dalam tumbuhan secara bebas tetapi sebagai glikosida. Antrakinon
42
berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, senyawa ini biasanya berwarna merah, dapat juga berwarna kuning sampai coklat.
Gambar 20. Struktur dasar atrakinon II.5.2.3.Terpenoid Berasal dari senyawa isoprena (CH2-C(CH3)-CH-CH2). Banyak terpenoid terdapat secara alami pada tumbuhan tidak dalam keadaan bebas sebagai ester atau glikosida (Robinson, 1995). Terpenoid terdiri dari berbagai macam senyawa antara lain minyak atsiri yang mudah menguap, diterpenin yang sukar menguap, triterpenoid,sterol dan pigmen karotenoid yang tidak menguap. Secara kimia larut dalam lemak dan terdapat dalam sitoplasma sel tumbuhan. Kadang minyak atsiri terdapat dalam kelenjar khusus pada permukaan daun. Sedangkan karotenoid terutama berhubungan dengan kloroplast di dalam daun dan dengan kromoplast di dalam daun bunga (petai). Biasanya terpenoid diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan menggunakan eter minyak bumi, eter atau kloroform (Harbone, 1987). II.5.2.4.Kaumarin Kaumarin adalah senyawa fenol yang pada umumnya berasal dari tumbuhan tinggi dan jarang sekali ditemukan pada mikroorganisme. Dari segi biogenetik, kerangka benzopiran-z-on dari kaumarin berasal dari asam – asam sincimat, melakiorto-hidroksilasi. Asam orto-kumarat yang dihasilkan setelah menjalani isomerisasi cis-trans, menjalani kondensasi.
43
Hampir semua kaumarin alam mempunyai oksigen pada C-7. Posisi lain dapat pula terokigenasi dan sering pula terdapat rantai samping alkil. Kaumarin sering dijumpai sebagai glikosida (Robinson, 1995). Penelitian mengenai biosintesa kaumarin pada beberapa jenis tumbuhan ternyata mendukung biosintesa ini. Walaupun demikian, mekanisme dari sebagian besar tahap – tahap reaksi tersebut masih belum jelas. Misalnya reaksi isomerisasi cis-trans dari asam ortohidroksi kumarat mungkin berlangsung dengan katalis enzim atau melalui proses fotokimia atau melalui proses reduksi-dehidrogenasi yang beruntun.
Gambar 21. struktur dasar kaumarin II.6. 5-Fluorouracil (5-FU) 5-FU merupakan salah satu obat kemoterapi tertua yang telah digunakan beberapa dekade. Obat ini dapat digunakan untuk beberapa jenis kanker seperti kolon, payudara, lambung, pankreas dan kulit. 5-FU berupa cairan jernih dan tidak berwarna, dan diberikan secara intravena, dapat juga berupa krim yang digunakan pada kanker kulit. 5-FU dapat diberikan melalui infus intravena, dalam 4-5 hari, atau diberikan menurut jadwal tertentu, misalnya sekali seminggu, atau sekali tiap 3-4 minggu. Keberadaan 5-FU di dalam darah dan jaringan tubuh sangat singkat, dalam hitungan menit. 5-FU terikat dalam enzyme dalam sel kanker yang disebut
44
Thymidilate Synthetase dan karenanya dapat berefek sebagai anti kanker di dalam sel. Leucovorin dapat mengubah ikatan di dalam enzyme tersebut dan memperlama keberadaan 5-FU dalam sel kanker yang menyebabkan efek anti kanker yang lebih besar. Beberapa penderita dengan defisiensi enzym untuk metabolisme 5-FU dapat mengalami efek samping setelah pemberian 5-FU, walaupun dengan dosis yang kecil. Efek samping yang sering terjadi, antara lain : mulut kering, sulit menelan, diare, nyeri lambung, penurunan jumlah sel darah putih, penurunan jumlah trombosit, anemia, peningkatan sensitifitas kulit, peningkatan jumlah air mata. 54,55
II.7. Galur Sel Adenokarsinoma kolon HT29 Galur sel adenokarsinoma kolon HT29 diisolasi dari tumor primer wanita Kaukasus berusia 44 tahun dengan golongan darah
A, Rh(+),
HLA
A1,A3,B12,B17,Cw5. . Galur sel tersebut dapat menyebabkan terjadinya adenokarsinoma kolon berdiferensiasi baik dari tumor primer grade I pada tikus dan hamster dan differensiasi jelek pada manusia akibat efek tumorigeniknya. Ekspresi reseptor human adrenergic alpha2A urokinase receptor (u-PAR);vitamin D(moderate expression. Ekspresi oncogene pada galur sel ini menunjukkan p53 mutan (+), ras (+), myc (+), Fos (+), Myb (+),sis (+), abl (-), ros (-),src (-). Penderita bisa terinfeksi HIV dan LAV tetapi tidak pada sel tumor. Kultur dilakukan dengan pemisahan hingga 70-80%, aproksimasi 1:3 sampai 1:10 (1-3 x 104 sel/cm2). Pengikatan dengan menggunakan cairan NaCl 0,25% tanpa EDTA dan CO2 5% pada suhu 37 0C. Penyimpanan dilakukan pada es kering dengan suhu -196 0C.21
45
II.8. Kerangka Teori
Sel normal epitel kolon Radiasi Virus Mutagenik kimia Mutasi spontan
inisiasi
Reparasi DNA
Sel terinisiasi Tumor promotors, Growth Factors, Virus
Ekspresi : Inhibitory Growth Factors & Differentiation Factors
promosi
Pada Fase S Siklus Sel :
Sel preneoplasia
Radiasi Virus Mutagenik kimia Mutasi spontan
Daya tahan tubuh Differentiation Factors Lack of angiogenesis
progresi
Neoplasia HT29 : hiperfosforlasi pRB↑, p53 mutan ↑, p21 ↓ CyclinA/B+ CDK1
G2
Fase S akhir & G1 : Bawang Dayak : Flavonoids
M
Siklus Sel Cyclin A/E+CDK2
S
G1
5FU
F-dUMP + Thimidilat sintetase
F-dUMP Thimidilat sintetase kompleks
Cyclin Ds+CDK4/6 Timidilat (dTTP)
dTMP & dTTP ↓↓; dUMP& dUTP ↑↑ Sintesis DNA terhenti
Apoptosis
Siklus Sel Terhenti : P53 mutan ↓, p53 WT ↑, p21↑, HDAC-pRBE2F↑↑, hiperfosforilasi pRB↓↓
BAB III KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS
III.1. Kerangka Konseptual Berdasarkan penjabaran pada bab – bab terdahulu maka dalam naskah tulisan ini diajukan kerangka konseptual yang mendasari rencana penelitian ini sebagaimana dijelaskan pada diagram berikut :
Kultur sel HT29 (p53 Mutan)
Kontrol (-)
5 – Fluorouracil (kontrol (+))
Ekstrak etanolik Bawang Dayak
Pertumbuhan sel
Pertumbuhan sel ↓
Pertumbuhan sel ↓
∑ p53 mutan ↑
∑ p53 mutan↓
∑ p53 mutan↓
ANALISA STATISTIK
Galur sel kanker kolon HT29 dibiakkan pada media RPMI 1640 pada konsentrasi CO2 5%. Selanjutnya dibagi dalam 3 kelompok , yaitu kelompok perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak (Eleutherine Palmifolia (L) Merr),
47
kontrol positif kelompok perlakuan dengan 5-FU dan kontrol negatif kelompok tanpa perlakuan apapun. Pada uji sitotoksisitas diharapkan fraksi etanolik bawang dayak memiliki potensi untuk menghambat pertumbuhan sel kanker kolon HT29 melalui penekanan ekspresi p53 mutan. Pada kontrol positif digunakan bahan uji 5-FU, diharapkan pada kontrol positif ini juga didapatkan penghambatan pertumbuhan sel kanker kolon HT29 melalui penekanan ekspresi p53 mutan . Pada kontrol negatif diharapkan tidak terjadi penghambatan pertumbuhan sel kanker kolon HT29 dengan ekspresi p53 yang meningkat. Pada perlakuan dengan fraksi etanolik bawang dayak, 5-FU dan tanpa perlakuan harus dikendalikan faktor-faktor luar, seperti suhu inkubator dalam media kultur harus dipertahankan 37oC dengan konsentrasi CO2 5%, nutrisi yang cukup dengan menggunakan FBS dan sterilitas media yang optimal.
III.2. Hipotesis 1. Fraksi etanolik bawang dayak mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro. 2. Fraksi 5-fluorouracil mempengaruhi tingkat ekspresi p53 mutan pada biakan kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro. 3. Tidak terdapat perbedaan pengaruh pada tingkat ekspresi p53 mutan secara in vitro antara fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil pada biakan kultur sel karsinoma colon HT29 secara in vitro.
BAB IV METODE PENELITIAN
IV.1. Jenis Penelitian Penelitian ini berupa penelitian analitik eksperimental
IV.2. Lokasi dan Waktu Penelitian IV.2.1.Laboratorium Penelitian Dan Pengujian. Terpadu (LPPT) Universitas Gajah Mada Jogjakarta. IV.2.2.Laboratorium Patologi Anatomi dan Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Dilaksanakan pada bulan April 2008 sampai Juni 2008.
IV.3. Subjek Penelitian Sel kanker kolon HT29 (Sumbangan dari Dra.Dyah Ratna Budiani, M.Si)
IV.4. Besar Sampel Penelitian ini menggunakan 24 well kultur sel HT29 pada medium RPMI 1640, masing – masing well berisi 2x105 sel/200 μl. 6 well pengulangan pada perlakuan dengan 5-FU atau fraksi etanolik bawang dayak, pada konsentrasi LC50 dan 3 serial di bawahnya. Dalam menentukan jumlah sampel tersebut digunakan patokan rule of thumb, sebagaimana dituliskan oleh Murti, (2006), yang menyatakan apabila sampel dibagi dalam sejumlah kelompok studi berdasar tingkat perlakuan maka jangan sampai kurang dari 5 subyek
48
49
1V.5. Alat dan Bahan 1V.5.1. Alat -
Laminar Air Flow Hood / Tissue Culture Cabinet
-
Incubator CO2
-
Sentrifuse
-
Mikroskop Inverted
-
Improved Neubauer Hemocytometer Chamber
-
Microwave oven
-
Shaker inkubator
-
Counter
-
Mikro pipet
-
Mikro tube
-
Yellow tips, Blue tips, white tips
-
Mikrowell plate polistiren 24 dan 96 well
-
Mikroskop cahaya biasa
-
Mikroskop kamera
IV.5.2. Bahan -
Galur sel kanker kolon (sel kanker kolon HT29)
-
Ekstrak Bawang Dayak
-
5 - Fluorourasil
-
RPMI 1640
50
-
Penicillin Streptomicin 2%
-
Fetal Bovine Serum
-
Fungizone : Amphotericin B 0,5%
-
Monoclonal antibodi mouse anti-human p53 mutan
-
Sistem deteksi berbasis avidin-biotin complek
-
Subtrat enzim peroksidase DAB
-
Pewarna tanding hematoksilin MEYER
-
Cover slip plastik (untuk kultur sel), diameter 13 mm
-
Cover slib kotak 20x20 mm
-
Gelas obyek
-
Minyak emersi
-
PBS phosphat buffer saline pH 7,0
-
Sitrat buffer pH 6,4
-
Methanol H2O2 0,3%
IV.6. Cara Kerja IV.6.1. Kultur Sel Kultur sel HT29 dilakukan setelah thawing dari tangki nitrogen cair, sel selanjutnya dikultur pada media RPMI 1640, FBS 10%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5% setelah konfluent sel dipanen dengan tripsin 0,25%.
IV.6.2. Starvasi
51
Tujuan langkah ini adalah mencapai keseragaman umur sel HT29 dalam kultur. Dalam menggunakan RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%, selama 7 hari setiap 3 hari sekali media diganti dengan yang baru dalam inkubator CO 5%. Setelah hari ke-7, sel dilepas dari flask dengan tripsin 0,25%, ditambah RPMI 1640, disentrifuse selama 5 menit dan kemudian supernatan dibuang, jumlah sel dihitung dengan bilik hitung Improved Neubeuer haemocytometer. Disiapkan mikrokultur 96 sumuran yang terdiri baris A sampai dengan H dan kolom 1 sampai 12. Masing – masing sumuran diisi dengan sel karsinoma kolon HT29 yang telah dilakukan starvasi dengan kepadatan sel sama, yaitu 2x105 sel/200 µl.
IV.6.3. Uji Sitotoksisitas Bahan uji fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil sebagai kontrol positif yang telah disiapkan dengan masing-masing tujuh konsentrasi, ditambahkan dengan menggunakan mikro pipet ke dalam sumuran. Setiap konsentrasi dibuat tiga kali ulangan.
A
A
A
A
A
A
52
B
B
B
B
B
B
C
C
C
C
C
C
D
D
D
D
D
D
E
E
E
E
E
E
F
F
F
F
F
F
G
G
G
G
G
G
Keterangan: Bawang dayak: 25µl/ml
5-FU: 300µg/ml
Bawang dayak: 12,5µl/ml
A B
5-FU: 150µg/ml
C D
Bawang dayak: 6,25µl/ml
C
5-FU: 75µg/ml
Bawang dayak: 3,125µl/ml
D
5-FU: 37,5 µg/ml
E
Bawang dayak: 1,51625 µl/ml
E
5-FU: 18,75µg/ml
F G
Bawang dayak: 0,78125 µl/ml
F G
5-FU: 9,75µg/ml
A B
Bawang dayak: 0,390625 µl/ml
5-FU: 4,6875µg/ml
IV.6.3.1. Kontrol Negatif Sel HT29 yang dibiakan dengan media tanpa perlakuan apapun + RPMI 1640, FBS 10%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%. IV.6.3.2. Kontrol Positif LC50 untuk 5 - Fluorourasil ditentukan dengan variasi konsentrasi : 300ug/ml, 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml, 18,75ug/ml, 9,75ug/ml, 4,6875 ug/ml. Pada media RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%. Dilakukan penghitungan jumlah sel yang hidup dengan menggunakan Improved Neubeuer dan mikroskop inverted.
53
IV.6.3.3. Perlakuan dengan Fraksi etanolik Bawang Dayak LC50 untuk Bawang Dayak ditentukan dengan variasi konsentrasi : 25ul/ml, 12,5ul/ml, 6,25ul/ml, 3,125ul/ml, 1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml, 0,390625 ul/ml. Pada media RPMI 1640, FBS 0,5%, Penstrep 2%, Fungizone 0,5%. Dilakukan penghitungan jumlah sel yang hidup dengan menggunakan Improved Neubeuer dan mikroskop inverted
IV.6.4. Imunositokimia Biakan sel HT29 pada media murni dan setelah diberi perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak serta 5 - fluorourasil pada konsentrasi LC50 dan 3 serial dibawahnya dikulturkan pada media RPMI 1640 1% Amphotericin, 2% penstrep, 10% FBS dengan 24 well yang dilengkapi dengan cover slips plastic dengan diameter 1,3 cm. Setelah 3 hari
diperlakukan
dengan konsentrasi
bawang dayak
3,125ul/ml,
1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml, 0,390625 ul/ml dan 5-FU 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml, 18,75ug/ml pada 5% CO2
dan suhu 37oC (dalam inkubator).
Setelah itu media diambil dan diganti dengan PBS formalin 10% selama 30 menit. Kemudian PBS diambil dan dicuci dengan Aquadest kemudian ditambah metanol dan 0,3% H2O2 selama 30 menit. Dilakukan blocking dengan normal serum selama 20 menit, diinkubasi dengan antibodi primer mouse anti p53 mutan (dengan pengenceran 1:100) selama 18 jam pada 40C. Dicuci dengan washing buffer (PBS) 2 kali selanjutnya diinkubasi 20 menit dengan polyvalent universal HRP conjugate. Dicuci dengan PBS 2
54
kali selanjutnya diinkubasi dengan DAB (Deamino Benzidin) sebagai subtrat
enzim.
Pewarnaan
tanding
(counterstain)
menggunakan
Hematoxilin Mayer. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop Olympus DP40. Penilaian makna tampilan p53 mutan dinyatakan sebagai prosentase sel yang dihitung berdasarkan tampilan positif sel dengan inti sel kuning keemasan sampai dengan coklat tua pada pembesaran 400X, dengan pengamatan sebanyak 9 lapang pandang. Nilai prosentase yang ditampilkan adalah nilai rerata prosentase ekspresi protein p53 mutan dari 9 lapang pandang tersebut.
IV.7. Variabel Penelitian IV.7.1. Variabel Bebas a. Konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak b. Konsentrasi 5-Fluorouracil IV.7.2. Variabel Tergantung ekspresi P53 mutan
IV.8. Definisi Operasional Variabel IV.8.1. Fraksi etanolik ekstrak bawang dayak adalah ekstraksi etanolik bawang dayak sehingga berbentuk larutan. Dalam penelitian digunakan fraksi etanolik bawang dayak murni (Eleutherine Palmifolia (L) Merr).
55
IV.8.2. Konsentrasi dosis adalah banyaknya fraksi etanolik bawang dayak dan 5Fluorourasil dalam larutan yang akan dimasukkan kedalam mikrokultur dengan konsentrasi bertingkat permililiter media kultur. IV.8.3. LC50 (Lethal Concentration) aktivitas sitotoksik secara in vitro adalah konsentrasi ekstrak yang menyebabkan kematian 50% sel kanker kolon HT29 pada kultur yang menerima perlakuan fraksi etanolik bawang dayak atau 5-FU IV.8.4. Ekspresi P53 mutan adalah ekspresi protein yang terdapat pada inti sel kanker kolon HT29 sebagai hasil pengecatan imunostaining dengan metode avidin-biotin-complex menggunakan MoAb primer anti-p53 mutan. Sistem enzimatis yang digunakan adalah peroksidase substrat enzim DAB. Nilai tampilan p53 mutan dinyatakan sebagai prosentase sel. IV.8.5. Proliferasi sel dihitung setelah 24 jam inkubasi pada suhu 37oC dan dilakukan penghitungan jumlah sel secara direct counting menggunakan mikroskop inverted dan bilik hitung Improved Neubeuer haemocytometer.
56
IV.8. Rancangan Penelitian
Colon Cancer Cell Line HT29
Kultur
Kontrol Negatif
Kontrol Positif (Media + 5 Fluorourasil)
Media + Ekstrak Bawang Dayak
Serial Konsentrasi
Serial Konsentrasi
LC50
LC50
3 serial dari LC50 ke bawah
3 serial dari LC50 ke bawah
IMUNOHISTOKIMIA
PROSENTASE SEL YANG MENGEKSPRESIKAN P53 MUTAN (+)
UJI STATISTIK
57
IV.9. Analisa Data Dari data yang diperoleh dalam penelitian, dilakukan uji normalitas data dengan menggunakan uji kolmogorov-smirnov. Untuk mengetahui pengaruh terhadap tingkat ekspresi p53 mutan yang dimiliki oleh fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil dilaksanakan dengan menggunakan analisis korelasi regresi pada masing – masing perlakuan (perlakuan kontrol positif dengan 5-FU dan perlakuan menggunakan fraksi etanolik bawang dayak.) dan untuk mengetahui perbedaan pengaruh terhadap tingkat ekspresi p53 mutan antara kontrol positif dan fraksi etanolik bawang dayak dilakukan uji beda TTest .13,14,16
BAB V HASIL DAN ANALISA DATA
V.1. Hasil Penelitian Dalam penelitian ini digunakan galur sel karsinoma kolon HT29 untuk menguji aktivitas
sitostatik dari
fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dalam
penghambatan pertumbuhan sel dan tingkat ekspresi p53 mutan. Galur sel karsinoma kolon HT29 ditumbuhkan pada media kultur, yaitu RPMI 1640 yang telah ditambah dengan FBS 10%, Penstrep 2% dan Fungizone 0,5%, selanjutnya diberi perlakuan dengan bahan uji fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5fluorouracil sebagai kontrol positif dan tanpa perlakuan sebagai kontrol negatif.
Penilaian aktivitas sitostatik fraksi etanolik ekstrak bawang dayak d ilakukan dengan memberikan ekstrak bahan uji tersebut pada kultur galur sel
karsinoma kolon yang kemudian diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasikan selama 24 jam sel yang hidup dihitung secara visual menggunakan bilik hitung hemositometer. Penghitungan tersebut menunjukkan bahwa LC50 dari fraksi etanolik ekstrak bawang dayak adalah 3,125 µl/ml dan LC50 5-FU adalah 150 µg/ml. Pada konsentrasi tertinggi 100µl/ml fraksi etanolik ekstrak bawang dayak menghambat proliferasi sel kanker sebesar 100%, sedangkan 5-FU pada konsentrasi tertinggi 300µg/ml mampu menghambat sebesar 100%. Kultur dengan perlakuan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak atau 5-FU masing-masing ditentukan konsentrasi LC50, selanjutnya pada konsentrasi LC50 dan 3 serial konsentrasi di bawahnya dikulturkan dengan 24 well plate
59
yang dilengkapi cover slips. Konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak yang digunakan adalah 3,125ul/ml, 1,51625ul/ml, 0,78125 ul/ml dan 0,390625 ul/ml sedangkan konsentrasi 5-FU adalah 150ug/ml, 75ug/ml, 37,5ug/ml, 18,75ug/ml. Hasil kultur sel karsinoma kolon HT-29 yang diperlakukan dengan serial konsentrasi fraksi etanolik ekstrak bawang dayak atau 5-FU kemudian dilakukan pemeriksaan imunositokimia dengan menggunakan monoklonal antibodi primer mouse anti p53 mutan. Ekspresi positif kuat dari p53 mutan ditunjukkan dengan adanya granula kecoklatan pada sitoplasma, sedangkan sel yang negatif tidak menampakkan adanya granula tersebut. Pengamatannya menggunakan Mikroskop OLYMPUS DP40. hasilnya ditampilkan dalam bentuk prosentase sel. Intensitas warna dari setiap preparat diamati masing-masing sembilan lapang pandang dengan pembesaran 400 kali. Setelah didapatkan hasilnya dihitung nilai rerata untuk masing-masing preparat. Dari prosentase sel tersebut kemudian dapat ditentukan tingkat ekspresi p53 mutan. Untuk uji tanpa perlakuan didapatkan proliferasi sel dengan ekspresi p53 mutan (+).
Gambar 22.ekspresi p53 mutan pada uji tanpa perlakuan
60
Untuk uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan konsentrasi LC50 yaitu 3,125µl/ml dan juga perlakuan dengan 5-fluorouracil didapatkan proses apoptosis dengan ekspresi p53 mutan yang minimal.
Gambar 23. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak 3,125 μg/ml
Gambar 24. Ekspresi p53 mutan pada uji dengan 5-fluorouracil 150μg/ml
Berdasarkan hasil pengamatan masing – masing preparat baik yang diberi perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun dengan
61
5-FU, dapat ditentukan tingkat ekspresi p53 mutan berdasarkan prosentase sel, untuk masing-masing sampel. Hasilnya sebagai berikut:
No
SAMPEL
PROSENTASE
1
5-FU 150
0
2
5-FU 75
4
3
5-FU 37,5
3,11
4
5-FU 18,75
4,42
5
Bawang dayak 3,125
5,49
6
Bawang dayak 1,51625
6,55
7
Bawang dayak 0,78125
8,89
8
Bawang dayak 0,390625
32,41
Tabel 4. Prosentase tampilan p53 mutan pada sel karsinoma kolon HT29 pada masing-masing sampel.
35 30 25 20 ekspresi p53 mutan
15 10 5 0 3.125
1.516
0.781
0.39
Gambar 25. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada ekstrak bawang dayak
62
4.5 4 3.5 3 2.5
ekspresi p53 mutan
2 1.5 1 0.5 0
150
75
37.5
18.75
Gambar 26. Profil tampilan ekspresi p53 mutan pada 5-FU.
V.2. Analisa Data Analisa data dilakukan dengan menggunakan SPSS 15. Untuk mengetahui data yang diperoleh mempunyai distribusi normal atau tidak dilakukan uji statistik kolmogorov-smirnov untuk masing – masing bahan uji. Dan didapatkan untuk bahan uji dengan menggunakan ekstrak bawang dayak didapatkan berditribusi normal dan untuk bahan uji dengan menggunakan 5FU juga berdistribusi normal. Selanjutnya untuk menguji pengaruh peningkatan konsentrasi pada fraksi etanolik extrak bawang dayak maupun 5-FU terhadap ekspresi p53 mutan dilakukan uji statistik menggunakan analisis korelasi regresi. Dari uji tersebut untuk fraksi etanolik extrak bawang dayak didapatkan persamaan Y = 48,335 - log70,414X, R : 0,843, F hitung : 105,457, F tabel distribusi : 2,87(5%). Dari uji tersebut didapatkan F hitung > F tabel, yang menunjukkan
ada korelasi antara konsentrasi
ekstrak
bawang dayak dengan tingkat ekspresi p53 mutan. Yaitu dengan
63
meningkatnya konsentrasi ekstrak etanolik bawang dayak yang diberikan pada sel carsinoma kolon HT29 ekspresi p53 juga semakin menurun.
ekspresip53mutan Observed Logarithmic
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00 1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
konsentrasiBD
Gambar 27. Profil uji regresi extrak bawang dayak
Persamaan untuk 5-FU didapatkan Y= 48,784 – log65,088X, R = 0,799, F hitung : 76,056, F tabel distribusi : 2,87(5%). Dari uji tersebut didapatkan F hitung > F tabel, yang menunjukkan konsentrasi
ada korelasi antara
5-FU dengan tingkat ekspresi p53mutan. Yaitu dengan
meningkatnya konsentrasi 5-fluoro uracil yang diberikan pada sel carsinoma kolon HT29 ekspresi p53 juga semakin menurun.
64
ekspresip53mutan Observed Logarithmic
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00 1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
konsentrasi5FU
Gambar 28. Profil uji regresi konsentrasi 5-FU terhadap ekspresi p53 mutan.
Kedua persamaan di atas menunjukkan peningkatan konsentrasi baik 5-FU maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak berpengaruh nyata pada penekanan ekspresi p53 mutan. Selanjutnya data dilakukan uji T-test untuk mengetahui perbedaan pengaruh terhadap tingkat ekspresi p53 mutan antara fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5FU, tidak ditemukan perbedaan yang bermakna antar kelompok bahan uji (α = 0,00) yang artinya tidak ada perbedaan yang signifikan antara potensi penekanan ekspresi p53 mutan antara
kontrol positif dan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak
Perhitungan statistik secara lengkap ditampilkan pada lampiran. Baik fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun 5-FU dengan uji T-test tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam penekanan nilai ekspresi p53 mutan, sehingga pemakaian ekstrak bawang dayak dapat diterima sebagai kandidat herba anti tumor.
BAB VI PEMBAHASAN
VI.1. Ekspresi p53 mutan Untuk menguji apakah fraksi etanolik ekstrak bawang dayak bersifat sitostatik dan menghambat proliferasi sel karsinoma kolon HT29 melalui penekanan ekspresi
p53
mutan
terhiperfosforilasi
dilakukan
pemeriksaan
dengan
imunostaining. Hasil penelitian menunjukkan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak mampu menekan ekspresi p53 mutan dengan nilai yang sebanding dengan 5fluorouracil sebagai kontrol positif. Uji statistik menggunakan uji beda T-test terhadap prosentase ekstrak bawang dayak dengan 5-FU dan tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam
penekanan ekspresi p53 mutan pada fraksi
etanolik ekstrak bawang dayak dibandingkan dengan kontrol positif, sehingga pemakaian ekstrak bawang dayak dapat diterima sebagai kandidat herba anti tumor berdasarkan penelitian invitro. Secara statistik yang dilakukan dengan uji korelasi regresi didapatkan ada hubungan yang bermakna antara konsentrasi dengan tingkat ekspresi p53 mutan dimana jika terdapat peningkatan konsentrasi baik pada fraksi etanolik bawang dayak maupun 5 fluorouracil akan terjadi penurunan tingkat ekspresi dari p53 mutan secara signifikan, sedangkan berdasarkan uji T-test tidak didapatkan perbedaan yang bermakna dari penekanan tingkat ekspresi p53 mutan pada bahan uji dan kontrol, (α = 0,171). Hasil uji statistik diatas membuktikan bahwa tidak ada
66
perbedaan pengaruh yang bermakna pada tingkat ekspresi p53 mutan dari kelompok perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dan 5-fluorouracil. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etanolik ekstrak bawang dayak secara invitro dapat menghambat pertumbuhan sel karsinoma kolon HT29, seperti juga pada 5fuorouracil. Proses penghambatan pertumbuhan dapat terjadi antara lain karena penekanan ekspresi p53 mutan dan memacu apoptosis. Apoptosis yang terjadi dapat dipacu oleh penekanan p53 mutan atau peningkatan tumor supressor gen yang lain atau dapat juga melalui jalur lain selain dari kedua hal tersebut. Proses penghambatan pertumbuhan sel kanker bisa melalui berbagai jalur, salah satunya adalah apoptosis yang bisa diinduksi oleh gen p53 wild type. Adanya akumulasi dari protein p53 wild type yang terjadi akibat adanya kerusakan DNA memegang peranan penting di dalam DNA repair. Protein p53 wild type akan merangsang keluarnya p21 yang dapat mengakibatkan terjadinya cell cycle arrest .Cell cycle arrest ini dapat memberikan waktu bagi sel untuk melakukan DNA repair yang mengalami kerusakan sehingga apabila berhasil sel dapat berproliferasi secara normal. Apabila terjadinya kerusakan sel hebat dan tidak bisa dilakukan repair, maka jalur apoptosis akan diaktifkan untuk mengeliminasi sel yang mengalami kerusakan. Apabila normal DNA repair tidak terjadi karena terjadi mutasi dari p53, maka sel dapat berproliferasi secara abnormal dan dapat terjadi keganasan. p53 dapat merangsang apoptosis dengan merangsang expresi dari gen pro apoptosis seperti Bax, Fas/Apo-1, Death Reseptor 5 (DR5) atau insulin Like Growth Fator-Binding Protein 3 (IGF-BP3), atau dengan merangsang expresi gen
67
anti apoptosis seperti Bcl-2, celluler inhibitor of Apoptosis Protein 2 (c-IAP2) dan Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein 1 (NAIP1). Jika Apoptosis tidak terjadi karena terjadi mutasi dari p53 atau deregulasi dari interaksi Fas-FasL maka sel dapat berkembang kearah keganasan. Aktivitas protein p53 sebagai tumor supresor dapat diturunkan atau dihambat oleh protein Mdm2 yang mengakibatkan terjadinya degradasi dari p53 menjadi lebih cepat. Gen Mdm2 itu sendiri juga diaktifkan oleh p53 sehingga dapat dikatakan dapat memberikan umpan balik negatif (negative autoregulatory loop).34,37 Tidak berfungsinya kontrol checkpoint yang mengakibatkan gagalnya respon penghentian siklus sel pada sel kanker dapat menjadi target potensial terapi antikanker6,43. Sel dengan kontrol checkpoint yang rusak lebih sensitif terhadap perubahan genotoksik atau kerusakan mikrotubular. Berdasarkan teori mekanisme efek toksik intra sel, zat kimia atau metabolitnya yang telah masuk pada sel sasarannya dapat menyebabkan gangguan sel melalui pendesakan, pengikatan, subtitusi atau peroksidasi. Gangguan yang ditimbulkan akan direspon oleh sel untuk mengurangi dampaknya dan sel akan beradaptasi atau melakukan perbaikan. Namun apabila sel tidak mampu mengeliminir gangguan yang ada akan terjadi efek toksik dalam hal ini adalah proses repair gen.60 Proses apoptosis dibedakan menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik atau death receptor (DR) dan intrinsik atau jalur mitokondria. DR pathway dimulai dengan pengaktifan tumour necrosis factor receptor (TNFR), yang meliputi Fas, DR 4,
68
TNFR I dan TNFR II. Fas menginduksi apoptosis melalui dua jalur. Jalur pertama dengan mengikat ligan. Ikatan ligan mengaktifkan reseptor TNFRI dan Fas untuk menarik dan mengikat Protein death effector Fadd/Mort-1. Ikatan Fadd/Mort-1 menarik procaspase 8. Procaspase 8 diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu caspase 8 dan dilepaskan kembali ke dalam sitosol. Caspase 8 akan memecah dan mengaktifkan caspase 3. Jalur kedua lewat jalur alternatif sinyal transduksi. Reseptor Fas berikatan dengan protein adapter yang akan mengaktifkan mitogen activating protein (MAP) kinase dan memicu kaskade fosforilasi yang meningkat pada aktivasi c-Jun N terminal kinase (JNK). JNK
yang teraktivasi
memfosforilasi substrat seperti c-Jun dan p53 dan menginduksi apoptosis lewat berbagai mekanisme, meliputi modifikasi dan pengaturan protein pada famili Bcl2 Disamping hal tersebut di atas aktifasi apoptosis bisa terjadi melalui jalur intrinsik. Pada jalur ini inisiasi apoptosis ditimbulkan oleh produk biokimia yang berasal dari intraseluler stress, seperti oksidatif stress, perubahan redoks, ikatan kovalen, peroksidase lipid. Bahan-bahan tersebut memberikan sinyal kepada mitokondria sehingga menyebabkan perubahan pada mitokondria yang dimulai dengan terbukanya membran bagian luar diikuti pembengkakan matriks dan hilangnya potensial membrane yang menyebabkan keluarnya protein-protein mitokondria termasuk cytochrome-c. Apoptosis akan menghasilkan apoptotic bodies yang terdiri dari fragmen sisa-sisa sel yang akan difagositosis oleh sistem retikuloendotelial di sekitarnya.
69
Proses apoptosis tersebut dikendalikan oleh dua perangkat gen yang berfungsi antagonistik yaitu memacu dan menghambat. Termasuk gen yang memacu proses apoptosis adalah p53, pRB dan E2F, yang mana protein gen ini lebih berperan dalam siklus sel. Ketika terjadi kerusakan DNA maka p53 akan teraktivasi dan mengaktifkan p21 yaitu suatu CDK Inhibitor. p21 ini akan mengikat dan menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi Rb terhambat dan pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya. Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan memasuki jalur apoptosis. Komplek E2F dengan pRB merupakan komplek stabil untuk mengaktivasi berbagai promotor untuk sintesis DNA. Pada kondisi tanpa adanya sinyal
pertumbuhan
pRB
dalam
keadaan
hipofosforilasi.
Pada
keadaan
hipofosforilasi pRB berikatan dengan E2F dan HDAC (histone deacetylase) dan menginaktifkan faktor transkripsi E2F. Ikatan antara pRB dengan HDAC dan E2F diatur oleh fosforilasi serine/threonine. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E, cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Fosforilasi tahap pertama oleh cyclin D/CDK 4, dalam stimulus growth factor, melepaskan HDAC dari kompleks HDAC-pRB-E2F. Fosforilasi tahap berikutnya oleh cyclin E/CDK 2 melepaskan E2F dari pRB. E2F yang dihasilkan akan menginduksi transkripsi gen seperti DNA polymerase dan thymidin kinase yang diperlukan untuk masuk dalam fase S.
70
Dari uraian diatas dapat diketahui dengan jelas bahwa proses apoptosis dapat dipacu oleh berbagai faktor, baik dari jalur ekstrinsik maupun jalur intrinsik dan siklus sel juga diatur dan dipengaruhi oleh berbagai macam enzin maupun protein yang berperan sebagai tumor supressor gen. Sehingga dengan demikian penekanan ekspresi p53 mutan sel karsinoma kolon HT29 pada uji dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak, yang menunjukkan adanya penghambatan proliferasi sel dapat terjadi karena adanya apoptosis melalui jalur ekstrinsik atau instrinsik dan faktor mana saja yang mempengaruhinya. Proses apoptosis yang terjadi belum dapat ditentukan. Hal ini tentunya perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk mencari dan membuktikan faktor-faktor mana yang berpengaruh dalam menekan proliferasi sel karsinoma kolon HT29 tersebut. Pengembangan obat antikanker yang didasarkan pada regulasi siklus sel selanjutnya diarahkan pada penghambatan terjadinya proses pembelahan sel, dan pemacu apoptosis sehingga senyawa atau protein yang diberikan pada penderita dapat mencegah sintesis DNA dan mitosis sehingga menghentikan proliferasi sel kanker.
VI.2. Sifat sitostatik ekstrak etanolik bawang dayak Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etanolik ekstrak bawang dayak mempunyai aktivitas sitostatik yang sebanding terhadap sel karsinoma kolon HT29 secara invitro bila dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan 5-fluorouracil. Hal ini terlihat pada LC50 fraksi etanolik ekstrak bawang dayak yaitu 3,125 µg/ml dan LC50 5-FU yaitu 150 µg/ml. Efek sitostatik tersebut disebabkan oleh karena
71
apoptosis yang dipacu oleh berbagai faktor pro apoptotic. Dengan demikian ekstrak bawang dayak merupakan bahan yang mengandung senyawa aktif yang potensial untuk dikembangkan sebagai antikanker, khususnya untuk karsinoma kolon berdasarkan penelitian invitro. Penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian 5-FU maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan konsentrasi yang berbeda memberikan pengaruh yang nyata dalam penekanan proliferasi sel karsinoma kolon HT29 maupun ekspresi p53 mutan. Uji
yang dilakukan menunjukkan ada korelasi antara konsentrasi
5-FU
maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak dengan tingkat ekspresi p53 mutan. Pada penelitian ini evaluasi terhadap proliferasi sel karsinoma kolon HT29 dilakukan dengan menggunakan metode kromogenik menggunakan pewarnaan tryphan blue untuk mempermudah membedakan antara sel hidup dan sel yang mati. Sel karsinoma hidup akan memberikan warna putih mengkilat, sedangkan sel yang mati akan memberikan warna kebiruan. Warna kebiruan ini berasal dari pewarna yang penetrasi
ke dalam sitoplasma karena membran sel telah mengalami
disintegrasi akibat memberian bahan uji. 5-FU digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini karena 5-FU merupakan agen kemoterapi yang poten untuk karsinoma kolon dan saat ini sudah secara luas digunakan baik sebagai agen tunggal maupun kombinasi dengan agen kemoterapi yang lain. Hasil penelitian menunjukan bahwa terdapat penekanan ekspresi p53 mutan yang bermakna pada perlakuan menggunakan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun 5-FU, yang berarti bahwa terdapat efek sitostasik dan
72
sitopatik 5-FU dan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak terhadap sel karsinoma kolon HT29 dimana dengan tertekannya ekspresi dari p53 mutan akan dapat memacu proses apoptosis. Kematian sel HT29 dipacu oleh apoptosis yang disebabkan karena peningkatan berbagai protein pro apoptotic maupun enzim-enzim yang memacu apoptosis, yang ekspresinya kemungkinan diinduksi oleh 5-FU atau fraksi etanolik ekstrak bawang dayak. Ekspresi p53 mutan yang semakin menurun pada konsentrasi 5FU 18,75 µg/ml sampai dengan 75 µg/ml dan mencapai statsioner pada konsentrasi 150 µg/ml, menunjukan bahwa terjadi penghambatan sintesa DNA oleh karena terbentuknya kompleks senyawa F-dUMP-Thymidilate Sintetase, sehingga terjadi penurunan konsentrasi dTMP dan dTTP disertai peningkatan dUMP dan dUTP (Pecorino, 2005). Penghambatan sintesa DNA akan menyebabkan terhentinya siklus sel. Siklus sel yang terhenti akan memberi kesempatan bagi sel untuk melakukan reparasi DNA dan apoptosis. Peran fraksi etanolik ekstrak bawang dayak terhadap ekspresi p53 mutan mengikuti fungsi logaritmik dengan persamaan Y = 48,335 – log70,414 dengan peran kandungan senyawa terpenoid, flavanoid, antrakinon dan kaumarin yang terkandung dalam ekstrak bawang dayak fraksi etanolik yang kemungkinan berperan dalam penghambatan aktivasi kompleks cyclin-CDK yang hadir pada fase G1 dan S dalam siklus sel. Sanderowics (2005), menyatakan bahwa dalam percobaan invitro diketahui bahwa senyawa flavonoid yang berupa flavopiridol mampu mempengaruhi siklus sel dengan cara menekan aktivitas cyclin-CDK yang aktif pada fase G1 dan G2.
73
Perubahan dari satu fase ke fase berikutnya pada siklus sel diatur oleh beberapa checkpoint. Pengaturan checkpoint tersebut melibatkan aktivasi dan degradasi cyclin, aktivasi cyclin dependent kinase (CDK), cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI). Interaksi diantara ketiga kelas protein tersebut berperan mengontrol berbagai tahap siklus sel, mencegah sel ke tahap selanjutnya jika terjadi kerusakan DNA. Aktivitas dari kompleks cyclin-CDK yang mengontrol checkpoint tersebut diatur dengan cara fosforilasi dan defosforilasi. Pada kondisi tanpa adanya sinyal pertumbuhan pRB dalam keadaan hipofosforilasi. Pada keadaan hipofosforilasi pRB berikatan dengan E2F dan HDAC (histone deacetylase) dan menginaktifkan faktor transkripsi E2F. E2F merupakan faktor transkripsi cyclin E, cyclin A dan protein-protein lain yang terlibat dalam siklus sel. Protein lain yang berperan dalam kontrol checkpoint ini antara lain p53, CDKI p21. Ketika terjadi kerusakan DNA maka p53 akan teraktivasi, demikian pula pada keadaan cell stress atau sel hipoksia. p53 yang teraktivasi akan mengaktifkan p21 yaitu suatu CDK Inhibitor. p21 ini akan mengikat dan menginaktifkan kompleks CDK4 yang akan menyebabkan fosforilasi pRB terhambat dan pelepasan faktor transkripsi E2F terhenti sehingga siklus sel terhenti pada tahap G1-S. Saat siklus sel terhenti, DNA mempunyai kesempatan untuk memperbaiki diri sebelum memasuki tahap pembelahan selanjutnya. Jika kerusakan DNA berat dan tidak bisa direparasi maka sel akan memasuki jalur apoptosis. Peningkatan konsentrasi yang diberikan pada penelitian ini akan diikuti oleh respon penekanan terhadap ekspresi p53 mutan dan apabila digambarkan akan
74
membentuk kurva sigmoid seperti yang telah dicantumkan dalam hasil penelitian. Kurva sigmoid ini dapat dibuat linear untuk dapat memungkinkan menganalisa hubungan dosis versus respon yang lebih luas. Dalam kurva ini juga dapat dinilai perubahan efek ekspresi p53 mutan jika terdapat peningkatan konsentrasi. Apabila kurva mempunyai slope yang besar (relatif tegak) zat tersebut memiliki efek yang besar karena dengan perubahan konsentrasi sedikit saja akan terjadi efek yang relatif besar sebagai respon dari peningkatan konsentrasi. Sebaliknya pada kurva yang slopenya relatif kecil peningkatan konsentrasi yang besar akan diikuti respon yang relatif kecil. Hal ini berlaku juga untuk obat sehingga bisa dikatakan relatif aman. Berbagai penyebab yang kemudian mengaktivasi p53 akan memberi pengaruh pada tahap selanjutnya. p21 yang terekspresi akibat aktivasi p53 akan mengikat kompleks cyclin-CDK yang menyebabkan siklus sel terhenti. p21 juga akan mengikat PCNA, yang bersama dengan XPC yang terekspresi akibat aktivasi p53 akan mereparasi DNA. p53 yang teraktivasi akan mengekspresikan beberapa protein pro apoptotic, seperti Bax dan sekaligus menghambat ekspresi protein inhibitor apoptotic Bcl yang akan menyebabkan terjadinya apoptosis. Ekspresi thrombospondin, yang juga akibat aktivasi p53, akan menghambat angiogenesis.
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN
VII.1. Kesimpulan Dari penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Fraksi etanolik ekstrak bawang dayak mempunyai efek sitotoksik terhadap sel karsinoma kolon HT29 secara in vitro yang ditunjukkan dengan nilai LC50 adalah sebesar 3,125 µl/ml. 2. Didapatkan adanya penekanan ekspresi dari p53 mutan yang signifikan pada perlakuan dengan fraksi etanolik ekstrak bawang dayak maupun dengan 5-FU dengan konsentrasi yang berbeda mengikuti kurva logaritme sesuai dengan perhitungan statistik, hal ini menunjukkan bahwa pemberian 5-FU maupun fraksi etanolik ekstrak bawang dayak memberikan pengaruh yang nyata dalam penekanan pertumbuhan sel kanker kolon HT29 maupun ekspresi p53 mutan. 3. Potensi penghambatan terhadap ekspresi p53 mutan dari sel kanker kolon HT29 dari fraksi etanolik bawang dayak tidak menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan dengan 5-fluorouracil.
VII.2. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian terhadap ekspresi p53 mutan pada galur sel karsinoma kolon yang lain atau penelitian secara invivo dengan konsentrasi pada LC50 dan atau di bawahnya.
76
2. Perlu dilakukan penelitian dalam bidang biologi molekuler lebih lanjut mengenai pengaruh ekstrak bawang dayak terhadap pertumbuhan sel karsinoma kolon HT29, khususnya terhadap produk downstream dari protein p53 seperti p21, puma ,noxa, bax dan lain – lain.. 3. Perlu dilakukan penelitian lain mengenai genomik p53 dengan aras DNA/mRNA
77
DAFTAR PUTAKA 1. Kelompok Kerja Adenokarsinoma Kolorektal,. 2006., Adenokarsinoma Kolorektal,. pp. 1-56.
Panduan Pengelolaan
2. Tjarta, A,. 2001. Neoplasia : In Patologi Umum,. Sagung Seto,. Jakarta,. pp. 198 -199 3. Ashariati, A,. 2004., Adjuvant Chemotherapy of Colorectal Cancer,. In: Recent Advances and Challenges In General Surgeons in Indonesia,. Surabaya,. 4. Helena, R, C,. Kirby, I, B,. 1997,. Tumors of the Colon, In: Maingot’s Abdominal Operations,. Volume II, Tenth edition , Appleton & Lange, USA, pp.1281-1301 5. Tannock, I.E. Hil, R.P. 1998, . The Basic Science of Oncology, 3rd Edition, Mc Graw Hill, Singapore. 6. Alfred, M, C,. Bruce,D, M,. 1997., Cancer of The Colon,. In : Cancer, Principles & Practice of Oncology., 5th Ed,. Editors : Devita. V, T., Lippincott-Raben., USA., pp. 1144- 1185 7. Kodner, I,J,. Robert, D, F,. 1999.. Colon, Rectum, and Anus., In : Principles of Surgery,. 7th Ed., Vol. 2., Editors : Seymour I. Schwartz., McGraw-Hill Health Professions Division., NBew York., USA., pp. 1265 – 1380. 8. Allen, J,I,. 1995,. Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,. Perspect Colon Rectal Surgery., 8: 181 m- 202. 9. Carolyn, C,. Compton,. 2005., The Staging of Colorectal Cancer: 2004 and Beyond,. Ca Cancer Journal for Clinicians,., Vol. 54. No. 6. pp. 295 – 308. 10. Soetamto, W, P,. 2004., Pembedahan Karsinoma Kolon dan Rektum,. In : Recent Advance and Challenges in General Surgeon in Indonesia,. pp. 12-19. 11. Sjamsuhidayat, R,. Wim, D, J,. 1997., Buku Ajar Ilmu Bedah,. EGC,. Jakarta,. pp. 876-99 12. Janne, P, A,. 2000., Chemoprevention of colorectal cancer,. The New England Journal of Medicine. Vol. 342. no. 26: pp. 1960 – 1966. 13. Murti, B., 1996,, Penerapan Metode Statistik Nonparametrik untuk Ilmu-ilmu Kesehatan, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, hal:37 14. Sudigdo, S,A,. Ismael, S,. 2002., Dasar-dasar Metodologi Penelitian Klinis., ed. 2.,Sagung Seto., Jakarta,
78
15. Budiani, D,R,. Retnaningsih, D,. et al ,. 2005.. Expression of LMP1 in Javanese Colon Carcinoma Patient’s with Duke’s classification System : indicated The Association of Epstein-Barr Virus infection In colon malignancies., Department of Patology anatomy, school of medicine, Sebelas Maret University, Surakarta,. 16. Arief T.Q.M., 2004, Pengantar Metodologi Penelitian untuk Ilmu Kesehatan, Cetakan Kedua, Penerbit CSGF, Klaten 17. Compton C.C., 2005, The Staging of Colorectal Cancer : 2004 and Beyond, Ca Cancer Journal for Clinicians, Vol. 54. No. 6, pp. 295 – 308 18. Katzung B.G., 2001, Basic & Clinical Pharmacology, 8th Ed, Mc Graw-Hill Companies, Philadelphia 19. Pusztai L., et al., 1996, Cell Proliferation in Cancer ; Regulatory Mechanisms of Neoplastic Cell growth, Oxford University Press, New York 20. Shengli C., 2001, Cell Cycle and Tumor Suppressor Genes, Charles Cai Tech, edit Tom Beron, pp. 1 – 36 21. Sigma A, 2007, HT29 http://sigmaaldrich.com
Cell
Line
Human
Colon
Adenocarcinoma,
22. Teich N.M., 1997, Oncogenes and Cancer, In : Cellular and Molecular Biology of Cancer 3rd Ed, Editors : Franks L.M., Teich N.M., Oxford University Press, New York, pp. 169 – 201 23. Tim Skripsi FK UNS., 2007, Buku Panduan Skripsi, Fakultas kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta 24. Wolf J.C, Ginn P.E, HomerB, Fox L.E, Kurzman I.D., 1997 Immunohistochemical Deecion of p53 Tumor Suppressor Gene Protein in Canine Epithelial Colorectal Tumors.Vet Pathol;34:394-404 25. leonart ME, Vidal F,Gallardo D, Fuertez MD, Rojo F, Cuatrecasas M et all , 2006, New p53 Related Genes in Human Tunord:Significant down reguatin in Colon and Lung Carcinoma .Onkology reports;16:603-608 26. Petak I, Tilman DM, Hougthon JA. 2000, P53 Dependence of Fas Induction and Acute Apoptosis in Response to 5-Fluorouracil-Leucovrin in Human Colon Carcinoma Cell Lines. Clinical Cancer Research;6:4432-4441 27. Yang B, Stambrook P.J, Markowitz S.D, 1996. Wild Type p53 Demonstrates Functional Dominance in a Human Colon Carcinoma Cell Line in which it induces Reversible Growth Arrest. Clnical Cancer Research;2:1639-1647
79
28. Deiry W.S.Colon Cancer,Adenocarcinoma.http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007 29. Shalkow J. Colorectal Tumor. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007 30. Cirinaone E. Rectal Cancer. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007 31. Hassan I.Colon,Adenocarcinoma. http://www.emedicine.com diakses pada tanggal 23/9/2007 32. Tullo A, D’erchia A.M, Honda K, Mitry R.R, Kelly M.D, Hbib N.A, 1999.Characterization of p53 mutations in colorectal liver metastases and correlation with clinical parameters.Clinical Cancer Research;5:3523-3528 33. Slatery M.L, Curtin K, Edwards S, Schaffer D, Anderson K, Samowitz W., 2002 Diet,activity and lifestyle associations with p53 mutations in colon tumor.Cancer Epydemiology,Biomarker&Prevention .;11:541-548 34. Chen F, Chang D, Goh M, Klibanov S, Ljungman M. 2000. Role of p53 in Cell Cycle Regulation and Apoptosis following Exposure to Proteasome Inhibitor.;11:239-246 35. Tjarta A, 1973, Neoplasma in PATOLOGI. Bagian Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,pp:77-82 36. Pusztai, L,. et al., 1996., Cell Proliferation in Cancer ; Regulatory Mechanisms of Neoplastic Cell growth., Oxford University Press., 37. Anonim,2002.The Central Role of p53 Cell-Cycle Arrest, DNA Repair and Apoptosis Following UV Irradiation.http://www.expertreviews.org/ 38. Basu A.,Haldar S.,1998. The Relationship between Bcl2,Bax and p53:Qonsequences for cell cycle progression and cell death.Molecular Human Reproduction;4:10991109. 39. Mohanna M.A.,Khodairy F.M.,Krezolek Z.,Bertilsson P.,Houssein K.A.,Aboussekhra A,2001.p53 is dispensable for UV-induced cell cycle arrest at late G1 in mammalian cells. Carcinogenesis;22:573-578. 40. Rotter V, 2002.Expression of the wild type p53 tumor supressor gene in normal cells and its deregulation in cancer cells. Departement of Molecular Cell Biology :p:176177.
80
41. Offer H.,Zurer I.,Bontalvi G.,Reha’k M.,Falcovitz A.,Milyavsky M.,et all,2001. P53 modulates base excission repair activity in a cell cycle-spesific Manner after Genotoxic Stress. Cancer Research;61:88-96. 42. Sato T.,Koseki T.,Yamato K.,Saiki K.,Konishi K.,Yoshikawa M., et all.2002.p53Independent Expression of P21CIPI/WAFI in Plasmacytic Cells During G2 Cells Cycle Arrest Induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans Cyto Lethal Distending Toxin.Infection and Immunity;70:528-534. 43. Abrhamson J.A.,Lee J.M.,Bernstein A., 1995. Regulation of p53-Mediated Apoptosis and Cell Cycle Arrest by Steel Factor. Molecular and Celluler Biology;15:6953-6960. 44. Pellegata N.,Antoniono R.J.,Redpath J.L.,Stanbridge E.J.,1996. DNA Damage and p53-mediated Cellcycle Arrest:A Reevaluation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA;93:1520915214. 45. Sablino A.A., Ilyinskaya G.V.,Rubtsova S.N.,Aqapova L.S.,Chumakov P.M.,Kopnin B.P.,1998. Activation of p53-mediated cell cycle checkpoint in Response to Micronuclei Formation.Journal of Cell Science;111:977-984. 46. Moll.U.,Ostermeyer A.G.,Haladay R.,Winkfield B.,Frazier M.,Zambetti G., 1996. Cytoplasmic Sequestration of Wild Type p53 Protein Impairs the G1 Checkpoint After DNA Damage. Molecular and Celluler Biology;16:1126-1137. 47. Pines J. 1997.Tumor Suppressors and Cell Cycle Control.Oncogenes and Tumor Suppressors.Oxford University Press;p:189-214. 48. Gangopadhyay S.B.,Abraham J., Lin Y.P.,Benchimol S.,1997. The Tumour Suppressor gene p53. Oncogenes and Tumor Suppressors.Oxford University Press;p:261-280. 49. Yuwono T., 2005, Biologi Molekular, Penerbit Erlangga, Jakarta 50. Ghobrial I.M.,Witzig T.E.,Adjei A.A.,2005. Targeting Apoptosis Pathways in Cancer Therapy.CA Cancer J Clin;55:178-194 51. Schuler M.,Green D.R.,2001.Mechanisms of p53-dependent Apoptosis.Biochemical Society Transactions;29:684-688 52. Murphy M.E., 2000. Ellucidation of the p53- Dependent Apoptosis Pathway.Medical Science division:p:244-247 53. Allen, J,I,. 1995,. Molecular Biology of Colorectal Cancer : a Clinician’s View,. Perspect Colon Rectal Surgery., 8: 181 – 202
81
54. Bruce blumberg,.2000. Oncogenes and Cancer.BioSci 145 A lecture 18.Page 1 – 15 55.Levine A.J., Hu W., Feng Z. 2006. The p53 Pathway: What Questions Remain to be Explored?.Cell Death and Differentiation.,13:1027-1036 56. Aguda B.D., 2006. Oncogene and Tumor Suppressor gene networks in cell cycle check points,Apoptosis & cell Survival. 57. Wongpalee S.,2006. RNA interfere (RNAi) Screening of non coding RNAs (ncRNA) Essential for Cancer Cell Proliferation. 58. Winarto W.P.,2007. Tanaman obat indonesia untuk pengobatan herbal, 1:55-57. 59. Lenny S.,2006. Senyawa Flavonoida, Fenil-propanoida, dan Alkaloida. Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,Universitas Sumatera Utara, Medan. 60. Priyanto, 2007. Toksisitas Obat, Zat Kimia dan Terapi Antidotum,I:1-31
LAMPIRAN 1
Gambar 29.Foto sel karsinoma kolon HT29 tanpa perlakuan (kontrol negatif)
Gambar 30.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 18,755µl/ml
Gambar 31.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 37,5µl/ml
Gambar 32.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 75µl/ml
Gambar 33.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5-FU dengan konsentrasi 150µl/ml
Gambar 34.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan Bawang Dayak dengan konsentrasi 0,390625µl/ml
Gambar 35.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan 5awang Dayak dengan konsentrasi 0,78125µl/ml
Gambar 36.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan bawang dayak dengan konsentrasi 1,51625µl/ml
Gambar 37.foto sel karsinoma kolon HT29 dengan perlakuan bawang dayak dengan konsentrasi 3,125µl/ml
Uji Kolmogorov Smirnov Bawang dayak One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
N Normal Parameters a,b Most Extreme Differences
Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative
Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)
PROSEN TASEP53 4 13.3350 12.79575 .386 .386 -.270 .772 .591
a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.
5-fluorouracil One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
N Normal Parameters a,b Most Extreme Differences
Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative
Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.
PROSEN TASEFU 4 2.8825 1.99777 .295 .221 -.295 .591 .876
Regression Descriptive Statistics ekspresip53mutan konsentrasiBD
Mean 30.5100 1.1626
Std. Deviation 39.97126 1.23178
N 5 5
Variables Entered/Removedb Model 1
Variables Entered konsentra a siBD
Variables Removed
Method .
Enter
a. All requested variables entered. b. Dependent Variable: ekspresip53mutan
Model Summaryb Model 1
R .663a
R Square .440
Adjusted R Square .254
Std. Error of the Estimate 34.53323
a. Predictors: (Constant), konsentrasiBD b. Dependent Variable: ekspresip53mutan
ANOVAb Model 1
Regression Residual Total
Sum of Squares 2813.174 3577.632 6390.806
df 1 3 4
Mean Square 2813.174 1192.544
F 2.359
Sig. .222a
a. Predictors: (Constant), konsentrasiBD b. Dependent Variable: ekspresip53mutan
Coefficientsa
Model 1
(Constant) konsentrasiBD
Unstandardized Coefficients B Std. Error 55.541 22.452 -21.530 14.018
a. Dependent Variable: ekspresip53mutan
Standardized Coefficients Beta -.663
t 2.474 -1.536
Sig. .090 .222
95% Confidence Interval fo Lower Bound Upper Bo -15.913 126. -66.140 23.
ekspresip53mutan Observed Logistic
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00 0.00
1.00
2.00
konsentrasiBD
3.00
4.00
Regression Descriptive Statistics ekspresip53mutan konsentasi5FU
Mean 22.1480 56.2500
Std. Deviation 43.11370 59.29271
N 5 5
Variables Entered/Removedb Model 1
Variables Entered konsentasi a 5FU
Variables Removed
Method .
Enter
a. All requested variables entered. b. Dependent Variable: ekspresip53mutan
Model Summaryb Model 1
R .560a
R Square .314
Adjusted R Square .085
Std. Error of the Estimate 41.23382
a. Predictors: (Constant), konsentasi5FU b. Dependent Variable: ekspresip53mutan
ANOVAb Model 1
Regression Residual Total
Sum of Squares 2334.478 5100.685 7435.163
df 1 3 4
Mean Square 2334.478 1700.228
F 1.373
Sig. .326a
a. Predictors: (Constant), konsentasi5FU b. Dependent Variable: ekspresip53mutan
Coefficientsa
Model 1
(Constant) p53mutan
Unstandardized Coefficients B Std. Error 73.318 29.246 -.771 .658
a. Dependent Variable: konsentrasi5FU
Standardized Coefficients Beta -.560
t 2.507 -1.172
Sig. .087 .326
95% Confidence Interval for B Lower Bound Upper Bound -19.755 166.390 -2.864 1.322
ekspresip53mutan Observed Logarithmic
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00 1.00
2.00
3.00
konsentrasi5FU
4.00
5.00
T-Test Paired Samples Statistics
Pair 1
ekspresip53BD ekspresip535FU
Mean 30.5100 22.1480
N
Std. Deviation 39.97126 43.11370
5 5
Std. Error Mean 17.87569 19.28103
Paired Samples Correlations N Pair 1
ekspresip53BD & ekspresip535FU
Correlation 5
.966
Sig. .007
Paired Samples Test Paired Differences
Mean Pair 1
ekspresip53BD ekspresip535FU
8.36200
Std. Deviation
Std. Error Mean
11.22359
5.01934
95% Confidence Interval of the Difference Lower Upper -5.57393
22.29793
t 1.666
df 4
