2011.04.15.
Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése
Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Biofizika szeminárium Tóth Mónika Ágnes PTE ÁOK Biofizikai Intézet 2011.04.11-12-13.
Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek
Milyen funkcókra képes egy flow citométer?
Fogalmak
Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait – fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni
Részecskék – sejtek - számlálása sejtszupenzióban
“Biologiai” és “nem biologiai” elkülönítése
“Élő” és “nem élő” részecskék, sejtek elkülönítése
105 - 106 számú részecske mérése 1 percen belül
Flow Sorting Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint
FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül).
Részecskék fényszórásának és/vagy belső fluorescenciájának mérése Sorting: egyedi részecskék elkülönítése
1
A mérések alapelvei
Technikai felépítés
A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.)
Fény szórásjelek detektálása
Specifikus fluoreszcencia detektálása
Multiparaméteres adat analízis
Electrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás:
szorting
2011.04.15.
Fényforrás Áramlási rendszer (folyadék) Optikai rendszer Detektáló rendszer Adatgyűjtés Adat analízis Szorting
Áramlási citométer cella
Az áramlási tér jelentősége, tulajdonságai:
Hidrodinamikai fókuszálás
2
Hidrodinamikai rendszer
2011.04.15.
Hidrodinamikai fókuszálás
A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak,ahol a lézer megvilágítja őket.
Sejtszeparálás - szorting
A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot. A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcencia jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel.
3
2011.04.15.
Technikai komponensek
Az áramlási citométer optikai felépítése, optikai jelek detektálása
Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek
(350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest
Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak
Detektáló rendszer Fotomultiplier csövek (PMTs) Régebben 1-2 cső Jelenleg akár 12-15 db.
Fotodiódák Többnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére
Előre irányuló szórás (FSC)
4
2011.04.15.
2D Scatter Plot of Blood
5
2011.04.15.
SSC=Oldalszórás (sejtgranuláltság)
FSC=Előreszórás (sejtméret)
Analóg jelek
A memóriában megjelenő számok digitális készülékben
FSC SSC FITC Lézer késleltetés
APC
6
2011.04.15.
A számok konvertálása paraméterekké
Jelszélesség:
Mintavételek száma
Csúcsmagasság: számérték
A legnagyobb
Terület:
A számok összege
Nincs holtidő!!!
Mérési eredmények tárolása, mentése
Az adatok megjelenítése
Az adatok tárolása Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file
Kétdimenziós ábrázolási módok: 1.
2.
3.
4.
Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze. 3D (surface,felszín) ábra: a sejtek számát a „z” tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott)
7
Kapuzás
2011.04.15.
1-nél több fluoreszcencia jel detektálása (dot plot)
Az összes lemért FL4 eloszlása.
Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása.
Felületi marker analízis A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén,ami függ
Fluoreszcens jelölés A fluoreszcencia alapjai
•
A sejtek típusától
•
A sejtek differenciálódási stádiumától
•
A sejtek aktivációjától, inaktivációjától
•
A sejtek egyéb funkcionális állapotától
•
A kóros elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól
Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcencen jelöljük: direkt, indirekt
8
2011.04.15.
Fluoreszcens jelölés
„Single‟ fluoreszcens festékkel Önálló (Single) festékek
Tandem festékek
„Tandem‟ festékkel Akceptor Akceptor Donor
Donor
Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények:
Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia
Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció)
Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység)
Aspecifikus kötődésük legyen kicsi
Legyenek olcsók
A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható
Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait
Fluorokrómok
9
2011.04.15.
Sejtciklus és DNS tartalom analízis A sejteket fixáljuk és permeabilizáljul, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez. A DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával.
1.
Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai
2.
3.
•
Alkalmazási terület: Daganatos sejtek • •
A normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek Magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek
Gucker - 1947
A flow citometria fejlődése
Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban A fejlesztés a II. Világháború idején történ, 1947-ben publikálták A cél a levegőben terjedő baktériumok gyors detektálása volt, a biológiai fegyverek kimutatására Készülék: Egy sötét-látóteres mikroszkóp cellájában áramoltatták a szűrt levegőt. A lámpa a Ford autógyár reflektor-lámpája volt, detektálásra PMT-t használtak.
10
2011.04.15.
Wallace Coulter - Coulter orifice (1956)
1953-ban szabadalmaztatott technika
Az elektromos vezetőképesség (ellenállás) változásait detektálta miközben a sóoldatban (pufferban) szuszpendált sejtek áthaladnak egy vékony nyíláson.
Photo by J.Paul Robinson
A szabadalmi bejelentés kézirata
Kamentsky (1965) Az első sejt szorter. A fényszórást HeNe lézerrel mérte. A fluoreszcenciát detektáló modell elődje.
Photo by J.Paul Robinson
Az első kereskedelmi forgalomba került számláló (Coulter Counter)
Mack Fulwyler sorter (1965)
A sejtek elválasztása térfogatuk alapján történ, a Coulter counter elv szerint. A kiválasztott sejtek elkülönítése elektrosztatikus eltérítéssel történt (a nagysebességű szorting alapja ma is ez). A felhasznált elv: Tintasugaras nyomtató (Richard Sweet, Stanford, 1965). Neutrofil sejteket és limfocitákat tudtak elválasztani vérből.
11
2011.04.15.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET
12
