Fotogerjesztett biofizikai rendszerek. Barócsi Attila

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek

Barócsi Attila

1

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Tartalom • • • •

Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Fotoszintézis – növények – Halobacterium • Retinál • ChR2 – csatorna-rodopszin • Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás

2

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Sugárzások biológiai hatásának alapja – élő rendszer atomjainak / molekuláinak gerjesztése v. ionizálása – energiaátadás Elektromágneses sugárzás emissziója / abszorpciója – olyan állapotváltozáskor, amikor a rendszer elektromos dipólus-momentuma megváltozik (elektronátmenet, rezgési/forgási állapotváltozás) Elektromágneses spektrum – • Fényérzetet a ~400-760 nm (VIS) tartomány ad, tágabban fény az IR-UV, ún. optikai tartomány:

100-280 nm 280-315 nm 315-400 nm 400-760 nm 760-1400 nm 1,4-3,0 m 3-1000 m

UV-C (távoli) UV-B* (középső) UV-A (közeli) (látható, VIS) IR-A (közeli) IR-B (középső) IR-C (távoli) 3

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Elektromágneses spektrum – • Atommagon kívüli folyamatokban (elektronok, atomok, molekulák állapotváltozásaikor): fény- és röntgensugárzás  duális jelleg • Rövidebb  felé: magfolyamatokból -sugárzás  részecskejelleg dominál • Hosszabb  felé: mikrohullámok  hullám leírás Radiometria – Fotometria – optikai sugárzás mint energiát szállító fényérzet keltő fény – átlagos nappali folyamat (fizikai mennyiségekkel) emberi látására jellemző színképi függvénnyel korrigálva. • Színmérés: színészleléshez objektíven mérhető mennyiségeket rendel Sugárzott teljesítmény,  e = P

W

Fényáram,  v

lm

Sugárerősség, Ie = P

W sr–1

Fényerősség, Iv

cd

Ki- (adó) / besugárzott (vevő) intenzitás, I = PA

W m–2

Felületi fényáram (adó) / megvilágítás (vevő), Ev

lx

Sugársűrűség, Le = PA,

W m–2sr–1

Fénysűrűség, Lv

cd m–2

4

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Emisszió: Rendszer gerjesztett állapotú. Gerjesztések: – termikus – lángfestés fémsókkal – elektromos – kisülési csövek – optikai – zöld növények fotoszintézisében • Spontán: E2E1 átmenet foton kibocsátással; külső hatás nélkül bekövetkező, statisztikus eloszlású, inkoherens: I  n  i • Indukált: belépő E energiájú foton kölcsönhat a már E2 állapotú atom elektronjával, amely visszatér E1-be két foton kibocsátásával   frekvenciájuk, polarizációjuk és fázisuk is azonos  monokromatikus és koherens sugárzás:

E2

h

E1 E2

h

E1

h h

A  n  a  I  n 2 a 2  n 2i 5

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Sugárzás kölcsönhatása atomi/molekuláris rendszerekkel Abszorpció – optikai gerjesztéskor elnyelődő foton 3 módon adhat át energiát: • Perturbálja egy elektron állapotát (időtartama ~ foton be rezgésideje, ~10–15 s), majd beesőével azonos foton emittálódik: koherens (klasszikus v. Rayleigh-szórás). Eltérő  foton kis valószínűséggel: Raman-szórás. Fényszórást bármilyen foton kiválthat. • Gerjeszti a rendszert bizonyos-tartományok esetén sokkal nagyobb időállandóval (megengedett optikai be –8 –3 átmenet:10 s, metastabil állapot: 10 s). Gerjesztési energia emissziója: fotonként (lumineszcencia); kémiai folyamatban (fotokémiai reakció); fononként (hővé alakul: szűkebben vett fényabszorpció)  áthaladó fényintenzitás csökken, mely-szerinti eloszlása jellemző az abszorbens rendszerre. be • fényelektromos hatást vált ki. Röntgen- és -sugárzás esetén jelentős lehet a Compton-szórás és párkeltés.

ki

ki

6

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Abszorpció és pigmentméret:

7

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Abszorpció és pigmentméret:

e 

2L n

pe2 nh n2 h 2 pe    Ee   e 2 L 2 m e 8 m e L2 h

Ee 

2 2 (nLUMO  nHOMO )h2

8 m e L2

8

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fényelnyelés biológiai makromolekulákban Abszorpció és pigmentméret:

e 

2π R n

9

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Jablonski-diagram – molekuláris átmenetek energiahelyes ábrázolására: E • Kasha-szabály: vibrációs kaszkád (hő)

• Szinglet / triplet állapotok: S, S = 0

belső konverzió (hő) szinglet  triplet átalakulás (nem sugárzó)

 A gerjesztett molekula energiája

S2S1 mindig hő, sugárzás S1 legalsó vibrációs (LUMO) szintjéről • T1S0: spinváltás (kis valószínűség  élettartam nő)

 S2

2 1

r

r0



  S1

  T1

10–9 s

10–15 s E2

10–3 s 10–15 s

ET

E1 

T, S = 1

Fluoreszcencia

S0

Foszforeszcencia

10

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Sugárzásmentes átmenetek:

Lumineszcencia: nem fonontér rovására, hanem egyéb gerjesztésre >100 ps-nál hosszabb idő után bekövetkező fénykibocsátás. Lumineszcencia centrumok nem egy időben emittálnak  lumineszcencia élettartam (~s … néhány nap). • Ilum(T) > Iterm(T)  hidegfény • fluoreszcencia – késleltetett: metastabil állapot esetén – kioltás: reabszorpciós / transzfer folyamatoknál • foszforeszcencia – gyorsabb transzfer-reakciók miatt ritka a természetes folyamatokban 11

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Lumineszcencia – fotolumineszcencia: – gerjesztett állapot g foton hatására g f • Fluoreszcens foton energiája g nem lehet nagyobb, mint a gerjesztő fotoné: f  g • Köztes nemsugárzó átmenetek is lehetségesek • Két / több foton egymást követő elnyelésekor a kilépő foton csapda h 2 energiája lehet nagyobb  frekvencia felkonvertálás hc ( 1 2) h 1 (f < {g1, g2}) feltétele: csapda, mely az g elektront tárolja a következő foton elnyeléséig g • Két / több foton egyidejű elnyelése: virtuális köztes állapoton keresztül (f < g)

f

f 12

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Energia- és töltéstranszfer:

• Energiatranszfer reakciók:

 gerjesztett elektron–lyuk pár  exciton transzfer (nettó töltés = 0) 13

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése FRET – Förster (fluoreszcens) rezonáns energiatranszfer: • monopólus indukálta dipólus–dipólus kölcsönhatás ~ (r–3)2: 2 I D ( )k r DA 1 1 kE ~ ,   ,   DA E k r  k nr  k E kE n4r 6 kE i átmenet száma E   k E E , ki  [ ] k r  k nr  k E s

E 

1 1 1  0,5  k E  k r  k nr  ~ 6 k  k nr  D R0 1 r kE

I D ( ) ~  D  k r D   DA  k r DA ~ I DA ( ) 1 r6 E  , E ~ 6 6 1  (r / R0 ) R0 I DA ( )  DA   1  E I D ( ) D

14

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Foto-gerjesztett molekulák viselkedése Fluoreszcencia kioltás: • Fluoreszcencia csökken olyan molekulák / ionok jelenlétében melyek elektronszerkezete megfelelő ahhoz, hogy a gerjesztett állapotú fluorofór gerjesztési energiáját átvegyék és disszipálják (pl. hő, fotokémiai munka). DQ 

kr kr  kr DQ ~ I DQ  I D ~ kr D  kr  knr  kQ kr  knr

• Statikus kioltás: Nem fluoreszkáló (sötét) komplex kialakulása alapállapotú fluorofórral – gerjesztett molekulák száma csökken – fluorofór élettartam nem változik – diffúziónak nincs szerepe • Dinamikus kioltás: Ütközés a gerjesztett fluorofórral – gerjesztett állapot relaxál  – fluorofór élettartam csökken – diffúzió kontrollált: I DQ / I D  1  K[Q]

15

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis Autotróf élőlények (növények, bizonyos baktériumok és más egysejtűek) a fény energiáját kémiai energiává alakítva szervetlen anyagból (legtöbbször CO2 + H2O) szerves anyagot (pl. glükózt) állítanak elő O2 képződés mellett.

• Növények: “alkalmazkodtak” (???) a fény látható tartományához  különböző pigmentek (konjugált kettős kötések). Hatékony abszorpció  kétféle fotorendszer (PSI–II), reakcióközpontjukban egy-egy (chl-a) molekula-dimer áll. 16

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények • Fotoszintézis akkor hatékonyan, ha (a többi biokémiai folyamathoz hasonlóan) térben elkülönül a sejt más részétől  színtest

17

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények h 2 NADPH  2 H  3 ATP  O2 ) Fényszakasz: 6 ( 2H2O  2NADP  3 ADP  3Pi  1. Tilakoidba ágyazott fehérjealapú PSI–II a szerkezetének megfelelő  fény energiáját elnyeli, és továbbítja a reakcióközpont felé. A többletenergiától a chl-a elektront ad le (oxidálódik), amely szállítómolekulákra (antenna) kerül. • Mindkét PS energiacsapdaként (LHC) működik, de: • PSI – gyenge oxidáló- / erős redukálószert termel (NADP+-t redukálja)

18

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények Fényszakasz: • PSII – erős oxidáló- / gyenge redukálószert termel (+1,1 V: természetes biológiai rendszerekben legnagyobb: víz-oxidáció feltétele) • Gerjesztett állapot élettartama ~10–9 s  a reakcióközpont feladata ezalatt eljuttatni az elektront a szállítórendszerhez (P680*  Pheo feofitin: elsődleges e–-akceptor  QA  QB kinon e–-akceptorok)

19

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények 2. PSINADP+, és PSIII között működik elektronszállító rendszer. • Nem ciklikus elektronáram: PSII  PSI  NADP+ • Ciklikus elektronáram: Fd ferredoxin a NADPH mennyiségétől függően elektronokat csatol vissza PSI-ből a PQ plasztokinon protonpumpa működtetésére.

20

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények Fotogerjesztés és lehetséges relaxációs útvonalai:

21

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények Klorofill fluoreszcencia:

22

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények Klorofill fluoreszcencia kioltás: • F0: minimális fluoreszcencia, PSII nyitott (sötétadaptált) • F'0: fényadaptált (PSI gerjesztett) • Fm: maximális fluoreszcencia, PSII zárt (sötétadaptált) • F'm: fényadaptált • Fv/Fm: max. PSII kvantumhatásfok • PQ: fotokémiai kioltás (nyitott/ összes centrum)

23

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – növények Klorofill fluoreszcencia kioltás:

• • • • •

F0: minimális fluoreszcencia, PSII nyitott (sötétadaptált) F'0: minimális fluoreszcencia (fényadaptált, PSI gerjesztett) Fm: maximális fluoreszcencia, PSII zárt (sötétadaptált) F'm: maximális fluoreszcencia (fényadaptált) Fs: állandósult fluoreszcencia (fényadaptált)

24

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – Halobacterium • O2 jelenlétében ATP termelés oxidatív foszforilációval. • Kevés O2: átkapcsol fotoszintetézisre. Fényenergiával hajtott protonpumpa által felépített gradiens hajtja az ATP-ázt az ATP szintézishez (Mitchell kemiozmozis). • Ha nincs BR, nincs fényválasz  O2 nélkül nem áll vissza az ATP szint.

» Danon, Stoeckenius, “Photophosphorylation in Halobacterium halobium”, PNAS Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, 1234-38 (1974)

25

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fotoszintézis – Halobacterium • Respirációs/foszforilációs elektrontraszport-lánc gátlása nem befolyásolja a fényválaszt. • Membrán proton-permeabilitás növelése mind a fény-, mind az O2 választ gátolja. • A bíbormembrán egyetlen fehérjealkotója a BR, mely sűrű pakolással épül be (csak 25% lipid), szabályos 2D hexagonális rácsba (6 nm-enkénti rácspontok körül 3 BR). • Termelt ATP mennyisége ~ bíbormembrán frakció (és nem a teljes sejt) abszorpciójával.

26

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Retinál Bakteriorodopszin (BR): • 248 aminosav + transz-retinál (440 nm abszorpció) • C=N kovalens kötés opszinhoz (560 nm abszorpció) Protonpumpa (Halobacterium): • Fényadaptált BR: transz-retinál h 13-cisz-retinál   fotociklus  proton szállítás extracelluláris térbe  ATP-szintézis.

27

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Retinál

» Mak-Jurkauskas et al, “Energy transformations early in the bacterio-rhodopsin photocycle revealed by DNP-enhanced solid-state NMR”, PNAS, 105 883-8 (2008)

BR fotociklus • VIS fényimpulzussal megvilágítva a bíbormembrán abszorpciója 410 nm-re tolódik, majd visszatér a hosszú  állapotába ciklikus protonfelvétel / -leadással. • Folyamatos megvilágításra a BR oszcillál a 2 állapot között. Membránba ágyazva a proton transzlokáció irányítottá válik (kifelé). • Fotokémiai elágazás: OP Q, mely stabil, de legerjeszthető (memória) retinál fehérjéről leválik, de a kötőhelynél marad

28

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Retinál Látás: • 11-cisz-retinál h transz-retinál   disszociál  opszin enzimatikus aktiválódása. • transzducin-GDP  transzducin-GTP  cGMP  5’-GMP hidrolízis. • cGMP-függő Na+ csatornák bezáródása  hiperpolarizáció  gátlás csökken  akciós potenciál. 29

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek ChR2 – csatorna-rodopszin A membránpotenciál optikai változtatása: • ChR2: nem-szelektív kationpumpa • HR: halorodopszin kloridpumpa

» Pastrana, “Optogenetics: controlling cell function with light”, Nature Methods,8 , (2011)

30

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia-detektálás és alkalmazása • Fluoreszcencia jelenségéből analitikai eszköz – oka: egy-foton detektálási érzékenység • Jelentősége a biológiai tudományokban a legnagyobb – fluoreszcenciát a fiziológiai folyamatokra közvetlenül jellemző idő- és méretskálák befolyásolják (pl. fehérjék, látás, fotoszintézis, DNS, sejtek és membránok vizsgálata) • Aromás molekulák fluoreszcenciája = {, kvantumhatásfok, I, td, polarizáció, pozíció} • Fluoreszcencia alkalmazások 4 csoportja: – spektroszkópia – lecsengési idő (élettartam) mérés – mikroszkópia – szenzorok

» Birch, “Fluorescence detections and directions”, Meas. Sci. Technol., 22, 052002, (2011)

31

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Spektroszkópia – fluorimetria: • „Szoftver forradalom” – automatikus vezérlés és gyors online adatelemzés • Hardver oldal keveset változott: gázkisüléses lámpa + monokromátor (MC) + mintatartó + kimenő MC + PMT

32

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Lecsengési idő – fluorometria: • Másik 3 alkalmazási csoportban látványos fejlődés molekuláris területen – közvetve / közvetlenül a lecsengési idő mérésén keresztül • Korai fluorofór mérések: kvantumhatásfok és lecsengési idő alapján felállított mérlegegyenletekkel – abszolút kvantumhatásfok (emittált/elnyelt fotonszám meghatározás nehéz) – relatív kvantumhatásfok (spektrális korrekciók szükségesek) f 

nemittált nemittált kr   nabsz N gerj kr  knr

• Jelen irány: pontosan mérhető abszolút lecsengési időből meghatározni mindent, amit lehet (lecsengés nem feltétlenül multi-exponenciális: ps-ns komponensek) – idő-korrelált fluoreszcens spektroszkópia N  (k r  k nr )t  N (t )  N 0,gerj e  ( kr  knr)t

 gerj 1 1  gerj  , r 0   f  k r  k nr kr 0

33

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Lecsengési idő – fluorometria: • Kapuzásos (direkt) időmérés: – nagy fotonszám esetén (analóg mintavétel) – periodikus gerjesztés léptetéssel – gyors – t: időfelbontás / integrálási idő (érzékenység) kompromisszum • Fázisfluorometria: f (t   )  e j 2 π F ( )

– több időállandós lecsengés  több gerjesztési frekvenciával mérni 34

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás

» Wahl, “Tech Note TCSPC 1.2”, PicoQuant GmbH, (2000)

TCSPC – Time-Correlated Single Photon Counting: • Feladat: időfüggő intenzitásprofil felvétele. Egyetlen gerjesztési ciklus alatt a lecsengés rögzítése problémás: 1. Lecsengési idő rövid (~100 ps … ~100 ns). Pl. 500 ps élettartamot elfogadható 10 pontos rögzítéséhez 50 ps időfelbontás kell. 2. Intenzitás túl kicsi analóg mintavételezéshez (néhány foton / emisszió  diszkrét jel). 3. Gerjesztési intenzitás növelése fakuláshoz vezethet. • TCSPC: periodikus gerjesztés  adatgyűjtés több cikluson át  egyciklusú profil rekonstrukció egy-fotonos eseményekből.

35

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás TCSPC – Time-Correlated Single Photon Counting: • Start/stop számlálás alapelve

CFD = Constant Fraction Discriminator TAC = Time-to-Amplitude Converter

36

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás TCSPC – Time-Correlated Single Photon Counting: • Blokkvázlat

• Fordított Start/stop (ne legyen várakozás, ha nincs foton) 37

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia: • (Hagyományos fluoreszcens) • Konfokális • 2-fotonos • Időfelbontásos – FLIM – fluorescent lifetime imaging

38

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia: • Hagyományos: – párhuzamos képalkotás – egyidejűleg nagy látótér és felbontás – Abbé-elv: xlat ~  / NA • Pásztázó: – pontdetektorral képsík letapogatása – pontforrással tárgy letapogatása – egyetlen tárgypontot kell leképezni – kép elektronikus formában • Konfokális: – szimmetrikus: mindkét oldalon leképző lencse – szinkron pásztázás – mélységi felbontás: z ~  / NA 39

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia – konfokális: – reflexiós elrendezés (szinkron pásztázás automatikusan) NA  n sin 

» Radiance2100™ Confocal Imaging Systems, Bio-Rad, (2005)

40

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia – konfokális:

» Puskár Z., SOTE Anatómiai Intézet 41

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia – 2-fotonos: • If ~ Ig2  – nagy (lokalizált) fotonsűrűség szükséges (térbeli fókusz) – egy időben (időbeli fókusz) • f < g • Miért IR? Nincs rövid pulzus rövidebb  esetén.

42

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia – 2-fotonos:

» Radiance2100™ MP Multi-photon Imaging Systems, Bio-Rad, (2005)

43

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Mikroszkópia – 2-fotonos (kontra konfokális): • Nagyobb : – behatolási mélység nagyobb: max. 1000 m (konfokális ~40 m) – optikai károsodás (fakulás) kisebb – UV fluorofórok / élő szövet vizsgálata UV károsodás nélkül – auto-fluoreszcencia vizsgálat (gerjesztés / emisszió nem fed át) – 2 v. több fluorofór egyidejű detektálása (pl. kék / zöld emisszió) (konfokális: több gerjesztés + utólagos képösszerakás  korrekcióval) • 3D diffrakció-limitált gerjesztés: – detektor pásztázás (tűlyuk) nem kell  direkt detektor  sejtjelölő indikátorokból származó szóródó fotonok is detektálhatók – gerjesztett térfogaton kívüli háttér kisebb (~nincs) – FRET analízis • „Időfókusz”: – 4D vizsgálatok (pl. FCS / FLIM) • 3-fotonos gerjesztéssel több fluorofór, pl. 930 nm  465 (2P) / 310 nm (3P) 44

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Fluoreszcencia detektálás és alkalmazás Időfelbontásos mikroszkópia: • FLIM – fluorescent lifetime imaging

» Suhling et al, “Time-resolved fluorescence microscopy”, Photochem. Photobiol. Sci., 4, 13-22 (2005)

45

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Optikai csipesz • Optikai csapda: – geometriai optikai leírás (d > ) – Fresnel-formulák – elektromágneses leírás (d < ) • Biológiai mintához: –

46

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Optikai csipesz • Optikai csipesz alkalmazások: – mikromanipulátor – erőmérő – deformáció vizsgálat • Molekuláris motorok teljesítményviszonyai: – normál fiziológia: GC  –20 kBT = 83 pN nm /s – ATP-szintetáz aktivitás: r  20 ATP/s  PC  400 kBT/s – motor sebesség:   800 nm/s  Fstop  2 pN

47

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek Optikai csipesz • DVD-pickup mint optikai manipulátor:

» Kasukurti et al, “Single-cell isolation using a DVD optical pickup”, Optics Express, 19, 10377-86 (2011)

48

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek BME Atomfizika Tanszék • IFS – Intelligens FluoroSzenzor:

» Barócsi: SPICY – Smart tools for Predicting of Crop Yield, KBBE211347, 2008-2012

49

Fotogerjesztett biofizikai rendszerek BME Atomfizika Tanszék • 2-fotonos mikroszkóp idegsejtek fiziológiás vizsgálatára: Ti:sapphyre laser

Material dispersion precompensation Beam expander X drift compensation

Drift compens. unit

Y drift compensation Angular dispersion precompensation Y scanner

AO scanner unit

X scanner

50% ΔF/F

Angular dispersion compensation

Aspheric surface

500ms

PMT

20µm

Sample

» Maák P., BME & Femtonics Ltd., Hungary

50