Halászatfejlesztés 34 - Fisheries & Aquaculture Development 34 2012 ISBN 978-963-7120-32-9
Mycobacterium fajok terjedése kereskedelmi forgalomban kapható fagyasztott haleleségek útján
Eszterbauer Edit1, Rónai Zsuzsanna2, Marton Szilvia1, Ursu Krisztina2, Baska Ferenc3 és Láng Mária2 1
2
MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézet, Budapest MezĘgazdasági Szakigazgatási Hivatal, Állategészségügyi Diagnosztikai Igazgatóság (MgSzH ÁDI), Budapest 3 Szent István Egyetem, Állatorvos-tudományi Kar, Budapest
Kivonat Vizsgálatainkat a laboratóriumban nevelt fehér busa (Hypophthalmichthys molitrix) állomány bakteriális fertĘzĘdése indította el. A pikkelyborzolódást, idült esetben izomzatba terjedĘ fekélyes bĘrtüneteket mutató egyedek boncolása során a vér bakteriális fertĘzése (szeptikémia), halvány, megnagyobbodott máj és a belsĘ szervekben Ziehl-Neelsen festéssel pozitivitást mutató granulómák voltak kimutathatók. A szövettani vizsgálatok megerĘsítették a nagyszámú gümĘ jelenlétét a májban, a vesékben és a lépben. Az RNS-polimeráz béta-alegység (rpoB) és az elongációs faktor Tu (tuf) gének egy-egy szakaszának szekvenálása a M. chelonae jelenlétét igazolta a fertĘzött hal egyedekben. Mivel a fehér busa állomány természetes vízforrással nem érintkezett és más halak sem kerültek az állomány közelébe, a kizárólag a busa állomány etetésére használt, kereskedelmi forgalomban kapható fagyasztott haleleségek (homár ikra, zooplankton) voltak gyanúsíthatók a fertĘzés terjesztésével. A haleleségeken végzett molekuláris vizsgálatok megerĘsítették számos Mycobacterium faj elĘfordulását mind a homár ikrákban, mind a zooplankton mintákban. Az eleségmintákból és a fertĘzött halakból élĘ mycobaktériumokat izoláltunk és leves táptalajban tenyésztettük. Az izolált mycobaktériumok genotipizálása és további DNS szekvenálások többek között a M. arupense, M. nonchromogenicum fajokat azonosította a homár ikrából és M. fortuitum-ot a zooplankton mintákból. Vizsgálataink során elsĘként mutattuk ki M. chelonae jelenlétét és kórokozó képességét fehér busában. Eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható haleleségek olyan veszélyes kórokozók terjesztésében játszhatnak szerepet, mint a halgümĘkórt okozó mycobaktériumok. Kulcsszavak: halgümĘkór, Mycobacterium chelonae, szeptikémia, fehér busa, fagyaszott haleleség, genotipizálás.
Bevezetés A halakban elĘforduló Mycobacterium fajok nemcsak a halgazdálkodás szempontjából fontos kórokozók, hanem humán egészségügyi szerepük is jelentĘs a zoonózist
71
okozó fajok miatt. A halak mycobacteriosis-át általában három faj, a Mycobacterium fortuitum, a M. marinum és a M. chelonae váltja ki. A mycobaktériumok széles körĦ elterjedésérĘl számos tanulmány született az elmúlt évtizedekben (Belas és mtsai. 1995, Bruno és mtsai. 1998, Decostere és mtsai. 2004, Whipps és mtsai. 2007, stb.). Magyarországon elĘször 1975-ben mutatták ki a halgümĘkór jelenlétét akváriumi halakban, valamint compóban (Tinca tinca) és dévérkeszegben (Abramis brama). A szerzĘk közleményükben kiemelték a tógazdasági pontyfélék veszélyeztetettségét és a betegség gazdasági és közegészségügyi jelentĘségét (Molnár és Sziklai, 1975). 1979-ben szintén magyar szerzĘk számoltak be nyolc különbözĘ országból származó kínai paradicsomhal (Macropodus opercularis) egyedek bakteriológiai vizsgálatának eredményeirĘl. A 25 izolált Mycobacterium törzsbĘl öt fajt, a M. marinum-ot, a M. aqua-t, a M. terrae-t, a M. fortuitum-ot, a M. parafortuitum-ot és a M. smegmatis-t sikerült azonosítaniuk e díszhal fajban (Körmendy és mtsai. 1979). Jelen vizsgálataink elindítója egy laboratóriumban nevelt fehér busa (Hypophthalmichthys molitrix) állomány hirtelen bekövetkezĘ megbetegedése volt, ami nagyszámú egyed elhullásával járt. Célunk a betegség diagnosztizálása mellett a kórokozó faj szintĦ meghatározása, és nem utolsó sorban a kórokozó laboratóriumi rendszerbe való bejutási módjának azonosítása volt. Anyag és módszer A fehér busa ivadékokat a többi laboratóriumi körülmények között nevelt halfajtól elkülönítve, vízátfolyás nélküli, levegĘztetett akváriumokban tartottuk. Etetésükhöz haltápot (Perla larva, Skretting) és többféle fagyasztott haleleséget (zooplanktont és homár ikrát) használtunk (Van Gerven). A kórtani tünetek jelentkezése után a halak egy részét elhullott állapotban vizsgáltuk. A bakteriológiai és szövettani vizsgálatokhoz azonban minden esetben frissen kiirtott halból származó mintát használtunk. A elváltozott szervekbĘl (elsĘsorban a májból és a lépbĘl) lenyomatokat készítettünk és a jelenlévĘ alkohol- és saválló baktériumokat Ziehl-Neelsen festéssel mutattuk ki. A szövettani vizsgálatokhoz halszerveket (májat, lépet, vesét) fixáltunk 10%-os pufferolt formalin oldatban, majd a paraffinos beágyazást követĘen 5 µm-s metszeteket készítettünk, amiket hematoxillin-eozinnal festettünk meg. Molekuláris vizsgálatokhoz a klinikai tüneteket mutató egyedek májából illetve a késĘbbiekben a különféle haleleségekbĘl vettünk mintákat. Az RNS polimeráz béta alegység (rpoB) gén PCR-rel történĘ felsokszorozása során Adékambi és mtsai (2006) módszerét követtük. Az elongációs faktor Tu (tuf) gén egy szakaszának PCR-s vizsgálatához Mignard és mtsai (2007) által leírt módszert alkalmaztuk. Miután a kapott PCR termékek nukleotidsorrendjét DNS szekvenálással meghatároztuk, a DNS szekvenciákat BLASTn homológiakeresĘ program segítségével összevetettük a GenBank adatbázisban szereplĘ szekvenciákkal. A baktérium-tenyésztéshez frissen boncolt, tüneteket mutató hal máját és PCRpozitív, fagyasztott haleleségeket használtunk. ElĘször Middlebrook 7H9 táplevest, majd Löwenstein-Jensen-féle szilárd táptalajt használtunk a tenyésztéshez. Az elszaporított élĘ baktériumokat GenoType Mycobacterium CM kit segítségével, valamint DNS szekvenálással azonosítottuk, elĘbbinél a gyártó által javasolt protokollt követve (Hain Lifescience).
72
Eredmények és értékelés A klinikai tünetek megjelenése után 1-2 nappal már nagyszámú egyed pusztulását tapasztaltuk. A beteg halak egy része lesoványodott, más részénél viszont a hasfal nagymértékĦ kidomborodása volt észlelhetĘ. Idült esetekben pikkelyborzolódás és mélyre terjedĘ fekélyes bĘrtünetek is megjelentek (1.a. ábra). a
b
1. ábra Izomzatba terjedĘ fekélyes bĘrtüneteket mutató fehér busa ivadékok (a), melyek boncolása során halvány, erĘsen megnagyobbodott máj (fekete nyíl) képe volt makroszkóposan látható (b). A boncolás során az esetek túlnyomó többségében a vér bakteriális fertĘzése (szeptikémiája), halvány, jelentĘsen megnagyobbodott máj (1.b. ábra) és a belsĘ szervekben (vese, máj, lép, vékonybél) granulómák voltak kimutathatók, amik a Mycobacterium fajok által okozott halgümĘkór tüneteire engedtek következtetni. a
b
2. ábra Mycobaktériumokat tartalmazó gümĘk fehér busa belsĘ szerveiben. Ziehl-Neelsen festés. Fiatal gümĘ májban (a) és többrétegĦ kötĘszövetes tokkal körülvett, idült fertĘzésre utaló gümĘ lépben (b). Natív preparátum (a) és szövettani metszet (b).
73
a
b
c
d
P
3. ábra Heveny és idült fertĘzésre utaló Mycobacterium chelonae által okozott gümĘk fehér busa belsĘ szerveiben. KötĘszövetes tokkal körülvett érett gümĘ vesében (a) és lépben (b). Fiatal gümĘk lép (c) és máj parenchymában (d). Hematoxillin-eozinnal festett szövettani metszetek. A diagnózist a Ziehl-Neelsen festéssel liláspirosan (a képen sötétszürkén) festĘdĘ baktériumok nagy számának jelenléte erĘsítette meg a gümĘkben (2. ábra). Még egy évvel a betegség kitörése után is találtunk gümĘkkel teli, de tünetmentes hordozó egyedeket. A szövettani metszetekben a máj, vese és lép állományában nagyszámú gócot találtunk. A fiatal gümĘkben (3.c. és 3.d. ábra) a parenchyma sejteknél világosabban festĘdĘ, ezáltal azoktól jól elkülönülĘ epitheloid sejteket láttunk. A gócokat ekkor még kötĘszöveti sejtek egysoros rétege vette körül. Az idĘsebb gümĘket (3.a. és 3.b. ábra) kötĘszöveti sejtek többsoros rétege határolta el a belsĘ szervek parenchyma sejtjeitĘl. Az idĘs gümĘk közepén élénk eozinofil festĘdés mellett az epitheloid sejtek elhalása volt észlelhetĘ (3.b. ábra), és jóval kevesebb mycobaktérium volt kimutatható (2.b. ábra). Mivel a fehér busa állomány természetes vízforrással nem érintkezett és más halak sem kerültek az állomány közelébe, a kizárólag az állomány etetésére használt, kereskedelmi forgalomban kapható fagyasztott haleleség volt gyanúsítható a fertĘzés terjesztésével. A haleleségek molekuláris vizsgálata megerĘsítette a gyanút. A busa ivadékok etetésére használt fagyasztott haleleségek közül a zooplankton és a homár ikra minták mutattak erĘs pozitivitást a rpoB és tuf gének PCR-es vizsgálata során (4.a. és 4.b. ábra). A DNS szekvencia elemzésekkel több, faj szinten nem azonosított Mycobacterium törzs mellett M. arupense és M. nonchromogenicum jelenlétét mutattuk ki homár ikrából és M. fortuitum-ot zooplanktonból. A halmájban jelenlévĘ
74
baktérium DNS egy nukleotid különbséggel megegyezett a génbankban megtalálható M. chelonae rpoB génjének (génbanki azonosítója: EU109288) szekvenciájával. a
b
c
4. ábra (a) Az RNS-polimeráz béta-alegység (rpoB) gén kb. 770 bp hosszú szakaszát felsokszorozó PCR eredménye különbözĘ fagyasztott haleleségekbĘl származó mintákból. I: homár ikra, II-IV: zooplankton, M: molekulasúly marker. (b-c) A haleleség mintákból leves táptalajban kitenyésztett mycobaktériumok genotipizálása: (b) A DNS amplifikálás eredménye: 200 és 230 bp hosszú PCR termékek. Zárójelben a DNS szekvenálással azonosított Mycobacterium faj neve látható (tuf gén alapján). 1: homár ikra (M. arupense). 2: zooplankton (M. fortuitum), 3: homár ikra (M. arupense), 4: homár ikra (M. nonchromogenicum), 5: homár ikra, M: molekulasúly marker. (c) Fordított DNS hibridizációval kapott fajspecifikus DNS mintázat. Faj szintĦ azonosítás ezzel a módszerrel csak a 2. minta esetében volt lehetséges (M. fortuitum). A tenyésztett baktérium mintákon végzett genotipizálás igazolta élĘ M. chelonae baktériumok jelenlétét a klinikai tüneteket mutató busa egyedek májában. A haltápokból kitenyésztett Mycobacterium törzsek közül genotipizálással csupán egyet sikerült azonosítani: a M. fortuitum-ot zooplanktonból, azonban az ezt kiegészítĘ, már említett DNS szekvenálás összesen három Mycobacterium fajt (M. fortuitum, M. arupense, M. nonchromogenicum) azonosított. Ugyanabból a haleleség típusból több különbözĘ gyártási dátumú és Lot számú mintát is megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a baktérium-összetétel eltérĘ volt a különbözĘ mintákban. SĘt egyes mintákból nem sikerült baktériumokat kitenyészteni, ami arra utalt, hogy élĘ baktériumot nem tartalmazott az adott minta. Sajnos a busa ivadékokat fertĘzĘ M. chelonae kimutatása egyik haleleség mintából sem sikerült. Ennek valószínĦsíthetĘen éppen az volt az oka, hogy az eleségek baktérium-összetétele változó volt, és a betegség tüneteinek megjelenése elĘtt használt eleségbĘl már nem állt rendelkezésünkre minta, így csak késĘbbi szállítmányból származó mintákat tudtunk vizsgálni. Ennek ellenére eredményeink kétséget kizáróan bizonyították, hogy a vizsgált fagyasztott eleségek élĘ és fertĘzĘképes mycobaktériumokat tartalmaztak (4.c. ábra). Vizsgálataink során elsĘként mutattuk ki M. chelonae jelenlétét és kórokozó képességét fehér busában, ami újabb fontos adattal egészíti ki a korábbi vizsgálati eredményeket a hazánkban elĘforduló pontyfélék halgümĘkórra való fogékonyságának tekintetében. Ezenkívül eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a keres-
75
kedelmi forgalomban kapható haleleségek olyan veszélyes kórokozók terjesztésében játszhatnak szerepet, mint a halgümĘkórt okozó mycobaktériumok. Köszönetnyilvánítás Köszönetet mondunk Dr. Dán Ádámnak egyes DNS minták szekvenálásában való közremĦködéséért és Dr. Jánosi Szilárdnak a baktériumtenyésztésben nyújtott segítségéért.
Irodalomjegyzék Adékambi, T., Berger, P., Raoult, D., Drancourt, M. 2006. RpoB gene sequence-based characterization of non-tuberculous mycobacteria with descriptions of Mycobacterium bolletti sp. nov., Mycobacterium phocaicum sp. nov. and Mycobacterium aubagnense sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 133-143. Belas, R., Faloon, P., Hannaford, A. 1995. Potential applications of molecular biology to the study of fish mycobacteriosis. Annu. Rev. Fish Dis. 5: 133-173. Bruno, D.W., Griffiths, C.G., Mitchell, C.G., Wood, B.P., Fletcher, Z.J., Drobniewski, F.A., Hastings, T.S. 1998. Pathology attributed to Mycobacterium chelonae infection among farmed and laboratoryinfected Atlantic salmon Salmo salar. Dis. Aquat. Org. 33: 101-109. Decostere, A., Hermans, K., Haesebrouck, F. 2004. Piscine mycobacteriosis: a literature review covering the agent and the disease it causes in fish and humans. Vet. Microbiol. 99: 159-166. Körmendy B., Tuboly S., Bánki M., Csaba Gy., Békési L., Kovács-Gáyer É. 1979. Mykobakteriose der Fische. I. Die Eigenschaften der aus Fischen isolierten Mykobakterienstämme. Schweiz. Arch. Tierheilk. 121: 201-205. Mignard, S., Flandrois, J-P. 2007. Identification of Mycobacterium using the EF-Tu encoding (tuf) gene and the tmRNA encoding (ssrA) gene. J. Med. Microbiol. 56(Pt 8): 1033-1041. Molnár K., Sziklai F. 1975. A halgümĘkor elĘfordulása Magyarországon akváriumi, tógazdasági és természetes vízi halakban. Magyar Állatorvosok Lapja 10: 715-718. Whipps, C.M., Butler, W.R, Pourahmad, F., Watral, V.G., Kent, M.L. 2007. Molecular systematics support the revival of Mycobacterium salmoniphilum (ex Ross 1960) sp. nov., nom. rev., a species closely realted to Mycobacterium chelonae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 2525-2531.
76
Dissemination of Mycobacterium spp. via commercial fish food
Edit Eszterbauer, Zsuzsanna Rónai, Szilvia Marton, Krisztina Ursu, Ferenc Baska and Mária Láng
Abstract Our study was initiated when a bacterial infection was observed in laboratoryreared silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). The dissection of several specimens with ulcerated skin and abnormal swimming behaviour revealed septicaemia, pale and enlarged livers, and Ziehl-Neelsen positive granulomas in the internal organs. Histology confirmed the presence of a great number of granulomas in the liver, kidney and spleen. By sequencing of a DNA fragment of the RNA polymerase ß-subunit (rpoB) and elongation factor Tu (tuf) genes, Mycobacterium chelonae was identified in the affected fish specimens. As the silver carp stock had no connection to natural water, and there were no other fish introduced to the laboratory, the diet consisting of commercial fish food (frozen lobster eggs, and frozen zooplankton) was suspected as possible source of infection. The molecular examination of the food indeed proved the presence of several Mycobacterium spp. both in frozen lobster eggs and in zooplankton. Mycobacteria from infected fish and from the food were isolated and cultured in liquid media. The genotyping of isolated mycobacteria and additional DNA sequencing identified among others M. arupense and M. nonchromogenicum in the frozen lobster eggs and M. fortuitum in the frozen zooplankton. This is the first report of M. chelonae infection in silver carp. Besides the detection of a mycobacteriosis in a yet different fish species, the findings draw attention to the dangerous dissemination of living bacteria via frozen fish food as sold in pet shops. Keywords: fish mycobacteriosis, Mycobacterium chelonae, septicaemia, silver carp, commercial frozen fish food, genotyping.
77
