TINJAUAN PUSTAKA Biologi Reproduksi Lele Dumbo Klasifikasi lele dumbo termasuk Ordo Siluriformes, Famili Clariidae dan Genus Clarias dengan Spesies Clarias gariepinus (Burchell 1822). Lele dumbo merupakan ikan omnivora yaitu pemakan jasad hewani dan tumbuh-tumbuhan air, seperti serangga, plankton, invertebrata, ikan dan alga benang. Gonad ikan jantan berjumlah sepasang, simetris atau satu lebih panjang daripada yang lain, memanjang dalam rongga badan di bawah gelembung renang dan di atas usus (Cek &Yilmaz 2005). Struktur testes terdiri dari rongga-rongga yang banyak dan tidak teratur. Spermatid dihasilkan dari dinding rongga tersebut yang
nantinya
akan
berkembang menjadi
spermatozoa melalui
proses
spermatogenesis. Spermatogonia dihasilkan dari dinding rongga tersebut yang nantinya akan berkembang menjadi spermatozoa melalui proses spermatogonia. Secara umum perkembangan kematangan testes hampir sejalan dengan tingkat perkembangan ovarium. Adapun tingkat perkembangan testes menurut Cek dan Yilmaz (2005), adalah sebagai berikut : 1. Remaja : testes sangat kecil, transparan sampai kelabu. 2. Remaja berkembang : testes jernih dan berwarna abu-abu sampai kemerahan. 3. Perkembangan I : testes berbentuk bulat telur, berwarna kemerahan karena adanya pembuluh darah kapiler, mengisi hampir setengah bagian dari rongga badan bagian ventral. 4. Perkembangan II : testes berwarna kemerahan sampai putih, mengisi dua pertiga bagian rongga badan bagian bawah, semen belum keluar bila abdomen diurut. 5. Dewasa : testes berwarna putih, keluar tetesan semen bila abdomen diurut. 6. Mijah : semen menetes keluar dengan sedikit tekanan pada abdomen. 7. Mijah/salin : testes sudah kosong sama sekali. 8. Salin : testes sudah kosong dan berwarna kemerahan. 9. Putih salin : testes sudah jernih, berwarna abu-abu sampai merah.
Perkembangan Gamet Jantan Alat kelamin jantan meliputi kelenjar kelamin dan saluran kelamin. Kelenjar kelamin jantan disebut testes. Pembungkus testikular yang mengelilingi testes, secara luas menghubungkan jaringan-jaringan testes, membentuk batasanbatasan lobular yang mengelilingi germinal epithelium. Spermatozoa dihasilkan dalam lobul yang dikelilingi sel-sel sertoli yang mempunyai fungsi nutritif. Spermatosit berkembang dari spermatogonium tunggal dan spermatozoa dilepaskan ke dalam saluran semen pada akhir spermatogenesis. Hal ini berbeda dengan testes anuran ampibia, lobul terbuka sebelum spermatogenesis sempurna. Saluran semen terdiri dari dua bagian: pertama berbatasan dengan testes, berguna untuk membuka lobul (juxta-testicular part) dan bagian lainnya adalah saluran sederhana yang menghubungkan bagian posterior testes ke genital papilla. Pada beberapa ikan, misalnya pada salmon, tidak memiliki kantung seminal, tetapi bagian luar saluran semen terdapat sel-sel yang berfungsi mengatur komposisi ion-ion cairan seminal dan mensekresi hormon. Spermatogenesis Perkembangan gamet jantan dari spermatogonium menjadi spermatozoa melalui dua tahap, yakni spermatogenesis dan spermiogenesis. Spermatogenesis adalah tahap perkembangan spermatogonium menjadi spermatid, sedangkan spermiogenesis adalah metamorfosa spermatid menjadi spermatozoa. Awal spermatogenesis ditandai dengan berkembang biaknya spermatogonia beberapa kali melalui pembelahan mitosis, untuk memasuki tahap spermatosit primer. Selanjutnya terjadi pembelahan meiosis, dimulai dengan kromosom berpasangan, yang diikuti dengan duplikasi membentuk tetraploid (4n). Satu spermatosit primer tetraploid membentuk dua spermatosit sekunder yang diploid (2n). Satu spermatosit sekunder diploid membelah diri menjadi dua spermatid haploid (n). Spermiasi Proses spermiasi berhubungan dengan pelepasan spermatozoa dari lumen lobulus masuk ke dalam saluran semen. Pelepasan ini mungkin disebabkan oleh kenaikan tekanan hydrostatik di dalam lobul untuk mengeluarkan cairan-cairan oleh sel-sel sertoli dibawah rangsangan gonadotropin. Spermatozoa kemudian
6
didorong ke dalam sistem pengeluaran, di sini akan bercampur dengan cairan semen (milt). Perangsangan perkembangan spermatozoa tidak terlepas dari peran serta hormon androgen, yakni testosteron. Sedangkan, testosteron yang memegang peranan utama pada spermatogenesis dan spermiasi adalah 11-Ketotestosteron (11-KT). Selanjutnya 11-KT akan merangsang sel-sel sertoli sehingga aktif menstimulasi
pembelahan
mitosis
spermatogonia
dan
menyempurnakan
spermatogenesis. Biokimiawi Cairan Spermatozoa Cairan semen adalah cairan seminal yang dihasilkan dari dehidrasi testes. Cek dan Yilmaz (2005) menyatakan warna semen lele dumbo adalah putih susu dengan konsistensi kental. Untuk ikan tilapia semennya berwarna bening dengan konsistensi encer, mengandung glukosa 11.53 mg/100 mL, lipid 4.73mg/100 mL, plasma protein 0.01 mg/100 mL, pH 7.32. Sedangkan semen salmon salar mengandung 0.13 – 0.19% bahan organik (trace protein) dan 0.65 - 0.75% garamgaram mineral. Glukosa yang terdapat di dalam cairan seminal merupakan bahan energetik (Hidayaturrahmah 2007). Sedangkan menurut Billard et al. (1995), bahwa ion utama dalam cairan seminal adalah K+ dan Na+, namun berbagai literatur mengungkapkan variasi yang luas mengenai komposisi ion dalam semen ikan mas. Motilitas dan Metabolisme Spermatozoa Spermatozoa bersifat immotil dalam cairan plasmanya dan akan bergerak apabila bercampur dengan air. Pergerakan spermatozoa jarang berupa garis lurus, biasanya mereka berenang menikung atau mengarah berbentuk spiral. Gerak progresif secara berkesinambungan hanya terjadi 1 menit setelah bersentuhan dengan air dan hanya 50% yang masih dapat berenang setelah 3 menit. Sebagian besar spermatozoa ikan air tawar dapat bergerak (motil) tidak lebih dari 2 – 3 menit setelah bersentuhan dengan air. Sedangkan spermatozoa ikan air laut dapat motil lebih lama bahkan ada yang lebih dari 60 menit (Iromo 2006). Lamanya spermatozoa motil dipengaruhi oleh umur dan kematangan spermatozoa, temperatur dan faktor-faktor lingkungan lain seperti ion-ion, pH dan osmolaritas. Sedangkan kecepatan bergeraknya bergantung spesies. Penurunan
7
yang cepat dalam motilitas setelah aktivasi berhubungan dengan pengurangan yang teratur dari kandungan Adenosin Triposfat (ATP) intraseluler. Motilitas spermatozoa ikan akan mengalami penurunan secara cepat, hal ini berhubungan dengan kandungan ATP yang ada di dalam sel. Menjelang akhir motilitas, sebanyak 50 – 80% ATP akan dihidrolisis. Motilitas spermatozoa yang mengalami penurunan dapat dipulihkan dengan cara menginkubasi semen dalam larutan KCl 150 atau 200 mM (Billard et al. 1995). Spermatozoa yang tidak bergerak secara progresif tetap menunjukkan penurunan konsentrasi ATP (Billard et al. 1995). Adenosin Triposfat dihasilkan dari glikolisis dan dari respirasi mitokondria. Penyimpanan Semen di Luar Tubuh Penyimpanan gamet di luar tubuh ikan terutama ikan jantan telah lama dilakukan. Penyimpanan gamet di luar tubuh akan diperoleh beberapa keuntungan diantaranya adalah : (1) dapat mengurangi jumlah ikan jantan yang dipelihara, sehingga biaya pemeliharaan untuk induk ikan jantan dapat diperkecil, (2) dapat dilakukan pembuahan buatan, meskipun waktu kematangan gonad antara induk jantan dan betina tidak bersamaan, (3) memudahkan untuk melakukan persilangan antara jenis-jenis ikan yang waktu matang gonadnya berbeda, (4) memudahkan penerapan teknologi ginogenesis, androgenesis, poliploidisasi dan sebagainya, (5) dapat mengatasi keterbatasan induk ikan jantan disuatu daerah yaitu melalui transportasi semen dari suatu daerah ke daerah yang memerlukan. Penyimpanan sebaiknya dilakukan pada suhu dingin misalnya dalam refrigerator dengan suhu 4oC atau pada es kering dengan suhu -76 oC, namun untuk penyimpanan dalam waktu yang lama paling baik dilakukan pembekuan semen dalam nitrogen cair bersuhu -196oC (Horvath & Urbanyi 2000). Dua metode telah digunakan untuk penyimpanan semen beku ikan: diencerkan atau tanpa diencerkan. Selanjutnya dikemukakan bahwa penggunaan bahan pengencer untuk penyimpanan semen memberikan kontrol yang lebih baik dari kondisi pisikokimia selama penyimpanan. Penyimpanan semen dengan formulasi bahan pengencer yang tepat dapat memperlama kehidupan semen dibandingkan dengan penyimpanan yang tidak diencerkan (Mansour et al. 2005).
8
Fisiologi Semen Semen adalah campuran seminal plasma dan spermatozoa. Sel spermatozoa secara umum terdiri atas dua bagian besar yaitu kepala dan ekor. Kepala spermatozoa mengandung DNA yang berperan dalam penyimpanan dan penerjemahan informasi genetik yang dibawa oleh spermatozoa. Plouidy dan Billard (1982) menyatakan cairan plasma semen ikan mas terdiri dari 98.5 % air, sedangkan 1.5 % bahan kering, dimana 58 % bahan kering adalah bahan kering organik dan 42 % bahan kering abu. Secara fisiologik, proses pembentukan spermatozoa di dalam tubuli seminiferi disebut spermatogenesis. Proses kematangan gamet terdiri atas spermatogenesis dan spermiogenesis. Waktu yang dibutuhkan mulai dari aktivasi “stem-cell” sampai pelepasan spermatozoa ke dalam tubuli seminiferi dikontrol oleh mekanisme hormonal (Cek & Yilmaz 2005). Parameter yang digunakan untuk menilai karakteristik semen untuk berbagai ternak pada umumnya sama, yaitu : warna, volume, kekentalan, pH, gerakan massa, konsentrasi, motilitas, morfologi (hidup/mati), abnormalitas, keutuhan membran plasma dan tudung akrosom. Standar minimal spermatozoa segar yang layak untuk dibekukan adalah persentase motilitas 70%, konsentrasi 1 x 109 spermatozoa/mL dan abnormalitas kurang dari 15% (Mansour et al. 2005). Bahan Pengencer Larutan yang digunakan sebagai bahan pengencer harus memenuhi beberapa syarat, yaitu (1) tidak bersifat racun; (2) mempertahankan dan tidak membatasi daya fertilisasi spermatozoa; (3) murah, sederhana dan praktis dibuat, tetapi spermatozoa yang diencerkan mempunyai daya fertilisasi yang tinggi; (4) menjamin kehidupan spermatozoa setelah pengenceran; dan (5) dapat memelihara kehidupan spermatozoa, tetapi tidak menyebabkan spermatozoa aktif selama penyimpanan (Urbanyi et al. 1999). Berbagai jenis bahan pengencer telah digunakan pada pengenceran spermatozoa ikan, seperti larutan Cortland, larutan Alsever dan sitrat kuning telur. Berbagai penelitian telah dilakukan dengan menggunakan natrium sitrat, larutan penyangga fosfat sitrat kuning telur dan larutan ringer (Ernawati 1999).
9
Sumber protein yang sering ditambahkan ke dalam pengencer sebagai krioprotektan adalah kuning telur. Ernawati (1999) menyatakan penambahan protein kuning telur ke dalam pengencer dapat meningkatkan daya tahan hidup spermatozoa pasca pencairan pada ikan patin. Selanjutnya ditambahkan bahwa kuning telur mengandung lipoprotein dan lesitin yang dapat melapisi membran plasma sel, sehingga mampu mempertahankan dan melindungi integritas selubung lipoprotein sel spermatozoa dan melindunginya dari cekaman dingin selama proses pembekuan. Kuning telur juga mengandung glukosa sebagai sumber energi bagi spermatozoa, disamping protein dan vitamin-vitamin yang larut dalam air maupun minyak, serta memiliki viskositas yang mungkin menguntungkan spermatozoa. Motilitas dan fertilitas spermatozoa sangat tergantung atau dipengaruhi oleh perbandingan antara pengencer dengan spermatozoa dan waktu penyimpanan. Menurut Urbanyi et al. (1999) menyatakan bahwa spermatozoa ikan lele dumbo yang diencerkan dengan glukosa dan fruktosa dengan perbandingan 1:15 menunjukkan tingkat fertilitas ≥54 %. Krioprotektan Krioprotektan adalah zat kimia non elektrolit yang berfungsi mereduksi pengaruh letal proses pemaparan kriopreservasi sel diantaranya yang berupa efek larutan maupun pembentukan kristal es ekstraseluler atau intraseluler, sehingga dapat menjaga viabilitas sel setelah kriopreservasi. Penambahan krioprotektan bertujuan untuk melindungi sperma dari kerusakan selama proses pembekuan. Menurut Horvath dan Urbanyi (2000) ada dua macam krioprotektan ; yaitu krioprotektan yang dapat menembus dinding sel dan yang tidak dapat menembus dinding sel. Krioprotektan yang dapat menembus dinding sel berfungsi memberikan perlindungan yang lebih baik pada laju pembekuan yang lambat misalnya gliserol, metanol, etilen glikol dan dimetilsulfoksida (DMSO). Sedangkan krioprotektan yang tidak dapat menembus dinding sel lebih sesuai untuk laju pembekuan cepat; misalnya monosakarida, polisakarida, polivinilpirolidon (PVP), dekstran dan protein.
10
Penelitian menggunakan berbagai krioprotektan seperti DMSO, DMA, methanol, ethylene glycol, propylene glycol dan gliserol telah dilaporkan oleh Horvath dan Urbanyi (2000). Hasilnya ternyata DMSO merupakan bahan krioprotektan terbaik pada pembekuan spermatozoa lele dumbo. Keunggulan DMSO juga telah dilaporkan oleh Kurokura et al. (1984) pada ikan mas. Jenis krioprotektan yang paling banyak digunakan adalah yang memiliki daya penetrasi yang tinggi pada membran sel yaitu DMSO dan gliserol. DMSO [(CH3)2SO4] mempunyai berat molekul 78.13 dan berat jenis 1.10. Sedangkan gliserol [C3H5(OH)3], mempunyai berat molekul 92.10 dan berat jenis 1.25. DMSO dan gliserol sama-sama mempunyai sifat yang larut dalam lemak, sehingga dapat berdifusi melalui membran dan masuk ke dalam sel. Namun, karena koefisien permeabilitas DMSO lebih tinggi dari gliserol maka difusi DMSO melalui membran selnya lebih cepat daripada gliserol (Supriatna & Pasaribu 1992). DMSO dan gliserol yang masuk ke dalam sel dan menembus membran sel akan menggantikan air yang keluar dari dalam sel pada saat proses pembekuan, sehingga keseimbangan elektrolit intraseluler dan ekstraseluler tetap terjaga. Selain itu dapat menurunkan titik beku larutan yang dapat memberikan kesempatan kepada sel mengeluarkan air dan memperpanjang aklimatisasi sel terhadap perubahan suhu yang drastis, sehingga memperkecil jumlah air yang membeku intraseluler. Secara fisik kristal-kristal es yang terbentuk diubah menjadi lebih lembut dan juga ikut melindungi membran plasma sel (Supriatna & Pasaribu 1992). Pengolahan Semen Lele Dumbo Persiapan Pengencer Bahan pengencer yang digunakan pada proses kriopreservasi terlebih dahulu harus dipersiapkan. Hal ini perlu diperhatikan dikarenakan spermatozoa yang akan dikriopreservasi tidak dapat hidup dalam waktu yang lama. Kesiapan dari bahan pengencer yang akan digunakan sangat menentukan keberhasilan kegiatan kriopreservasi semen. Menurut Iromo (2006) bahwa kesiapan dari bahanbahan yang akan digunakan sebagai pengencer dapat menentukan keberhasilan
11
kegiatan kriopreservasi semen ikan baung yang dikarenakan daya tahan spermatozoa ikan tersebut terbatas. Koleksi dan Evaluasi Semen Semen dikoleksi dari induk jantan yang matang gonad dengan melakukan pembedahan pada bagian abdominal ke arah anus. Gonad lele dumbo diangkat dari abdominal cavity untuk kemudian ditimbang beratnya. Selanjutnya gonad digunting pada bagian selaput gonad sehingga cairan semen bisa dikoleksi pada cawan petri untuk segera dievaluasi lebih lanjut. Hal ini sesuai pernyataan Urbanyi et al. (1999) bahwa semen dikoleksi dari induk jantan yang terlebih dahulu dibedah untuk evaluasi lebih lanjut. Selanjutnya ditambahkan bahwa semen yang akan diolah untuk pembekuan harus memiliki motilitas semen segar lebih dari 60%, bila dibawah nilai tersebut semen tidak diolah lebih lanjut atau dikeluarkan dari penelitian. Pengenceran Semen Pengenceran semen dilakukan dengan menambahkan bahan-bahan pengencer dan krioprotektan ke dalam semen yang akan akan dibekukan. Semen yang telah diencerkan sesuai perlakuan dengan konsentrasi 100 x 106 spermatozoa/mL. Menurut Urbanyi et al. (1999) bahwa perbandingan konsentrasi spermatozoa dengan bahan pengencer yaitu 1 : 15. Sedangkan Ernawati (1999) menambahkan bahwa semen dicampur dengan larutan pengencer (ringer) dan krioprotektan sesuai perlakuan dalam gelas piala dengan perbandingan 1 : 3. Pengemasan Semen Semen yang telah dicampur siap untuk dikemas dalam kemasan straw yang kedua ujungnya ditutup rapat untuk mencegah keluarnya semen pada saat proses pembekuan berlangsung. Kemasan semen yang digunakan untuk pemebekuan semen ikan berbeda-beda. Ernawati (1999) dan Akcay et al. (2002) menggunakan straw 0.5 mL dengan sumbat laboratorium berupa polyvinil alkohol (PVA). Sedangkan Horvath dan Urbanyi (2000) menggunakan straw 0.25 mL.
12
Equilibrasi Semen Equilibrasi merupakan suatu tahap penyesuaian semen dan larutan pengencer dari kondisi suhu ruang menjadi suhu pembekuan. Waktu dan suhu equilibrasi semen yang digunakan berbeda-beda bergantung pada jenis semen. Menurut Akcay et al. (2002) sampel sperma ikan mas kaca yang disimpan pada kemasan straw membutuhkan waktu equilibrasi selama 45 menit pada suhu 4 oC. Setelah equilibrasi straw diletakkan pada sterofoam yang diberi rak dengan ketinggian rak dari permukaan nitrogen cair kurang lebih 3 cm selama kurang lebih 10 menit. Urbanyi et al. (1999) menyatakan semen disimpan pada lemari pendingin dengan suhu 4 oC sekitar 25–30 menit sebelum dibekukan. Mengacu pada Kwantong dan Bart (2003), bahwa sperma sebelum dibekukan terlebih dahulu diequilibrasi pada lemari pendingin bersuhu 4 oC selama 10–30 menit. Selanjutnya langsung disimpan dalam nitrogen cair selama beberapa hari. Pembekuan Semen Proses pembekuan bisa dilakukan dengan menggunakan metode konvensional dan menggunakan programer machine. Urbanyi et al. (1999) menggunakan CRYOCELL-15 (Biokemia Labor Szerviz, 31. Zselyi A.U., Budapest, H-1165, Hungary) dengan penurunan suhu yang diprogram dengan kecepatan 4 oC/menit dari suhu 3 oC ke -4 oC selanjutnya kecepatan 11 oC/menit dari -4oC ke -80 oC. Setelah suhu pembekuan akhir diperoleh, straw diangkat dari freezing chamber. Kemudian dimasukkan ke dalam kontainer nitrogen cair bersuhu -196 oC selama 2 minggu sampai dengan satu bulan. Silveira et al. (2002) menyatakan straw ukuran 0.5 mL dengan ketinggian 6.5 cm dari permukaan nitrogen cair memperlihatkan persentase fertilitas terbaik pada ikan rainbow trout. Selanjutnya ditambahkan menggunakan sistem pembekuan terbuka menggunakan kotak styrofoam (33.9 cm x 26 cm x 41 cm) dengan nitrogen cair sebanyak 8.73 liter. Thawing Semen Thawing merupakan suatu proses rehidrasi atau pencairan kembali semen beku ke bentuk cair seperti semula dengan menggunakan air hangat dengan suhu dan waktu tertentu. Silveira et al. (2002) menyatakan straw di-thawing pada air
13
hangat bersuhu 70–80 oC selama 3–5 detik. Menurut Urbanyi et al. (1999) bahwa straw disimpan pada nitrogen cair selama kurang lebih 2–3 hari yang selanjutnya akan di-thawing pada air hangat bersuhu 40 oC selama 5 detik. Mengacu pada Horvath dan Urbanyi (2000) bahwa straw di-thawing pada air hangat bersuhu 40 oC selama 5 detik, sedangkan Kwantong dan Bart (2003) menyatakan sampel straw yang telah dibekukan di-thawing pada air hangat bersuhu 25 oC selama 40 detik. Selanjutnya ditambahkan oleh Akcay et al. (2002) bahwa straw yang dibekukan sebelum digunakan untuk fertilisasi terlebih dahulu di-thawing dalam air yang bersuhu 30 oC selama kurang lebih 30 detik. Uji Fertilisasi Uji fertilitas merupakan teknik untuk menguji kemampuan fertilisasi dari spermatozoa yang telah dibekukan. Akcay et al. (2002) menyatakan bahwa uji fertilisasi pada ikan mas kaca dilakukan pada wadah aquarium berbentuk segitiga yang airnya telah diatur suhunya 22 oC. Larutan pembuahan yang digunakan berupa campuran 3 g urea, 4 g NaCl yang dilarutkan dalam 1 liter aquades. Teknik fertilisasi yang digunakan secara fertilisasi kering, dimana telur dikumpulkan dari beberapa ekor betina yang diletakkan pada cawan plastik kering. 100 g telur (asumsi 100000 telur) diambil untuk setiap cawan yang akan dilakukan proses ferlilisasi. Akcay et al. (2002) menyatakan rasio sperma dan telur kurang lebih 250000 spermatozoa/egg. Spermatozoa yang telah di-thawing dimasukkan ke dalam telur yang diberi 20 mL larutan pembuahan dan diaduk menggunakan bulu ayam. Selanjutnya telur dilakukan stirer selama 1 jam yang ditambahkan tannin acid (0.5 g/l) selama 30 detik untuk memisahkan antar telur. Selanjutnya telur dicuci menggunakan air media penetasan dan baru akan menetas kurang lebih tiga hari setelah proses fertilisasi. Untuk mengetahui jumlah telur yang digunakan dilakukan sampling jumlah telur dengan mengambil 1 gram telur yang kemudian dihitung jumlahnya. Horvath dan Urbanyi (2000) yang melakukan uji fertilitas pada lele dumbo menggunakan telur yang diperoleh dari beberapa induk betina yang terlebih dahulu diinjeksi dengan Ovopel GnRh, 12 jam setelah pemberian hormon tersebut induk di-stripping. Selanjutnya ditambahkan bahwa 400 telur lele
14
dumbo yang berkualitas baik diletakkan pada cawan petri steril untuk difertilisasi dengan semen beku yang telah di-thawing dengen menggunakan teknik fertilisasi kering. Persentase fertilitas diamati melalui perubahan stadia sel telur yang berubah dari dua menjadi empat sel dengan perkembangan telur secara normal tampak bening. Suhu media inkubasi telur diset 26 oC, dimana larva menetas setelah diinkubasi selama kurang lebih 24 jam setelah fertilisasi.
15
