PCR DAN RT-PCR GENOM JATI (Tectona grandis L.f.) MENGGUNAKAN PRIMER YANG DIRANCANG DARI GEN FLO Antirrhinum, ALF-Petunia, NFL 2-Nicotiana DAN GEN HOMOLOG LEAFYIFLORICA ULA JATI
TESIS MAGISTER
Oleh: TJEUW JULIANA 20699034
BIDANG KHUSUS GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER PROGRAM STUDI BIOLOGI PROGRAM PASCA SARJANA INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2001
ABSTRAK Gen LEAFY (LFY) Arabidopsis maupun gen homolog LFY pads tumbuhan lain merupakan salah satu gen yang berperan pada inisiasi pembungaan. Penelitian sebelumnya telah berhasil mengisolasi dan mengkarakterisasi bagian hilir cDNA gen homolog LFY/FLO Jati. Hal ini mendorong dilakukannya penelitian ini yang bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bagian hulu gen homolog LFY/FLO pada Jati (Tectona grandis L.f.) dengan pendekatan PCR dan RT-PCR. Metoda yang digunakan adalah isolasi DNA din RNA kuncup bunga Jati, perancangan primer yang terdiri dari sepasang primer yang tidak didegenerasi dengan primer (FLY-1)"forward" dari bagian hulu gen FLO-Antirrhinum dan primer (FLY-1) "reverse" dari bagian hilir gen homolog LFY/FLO pada Jati serta perancangan sepasang primer FLY-2 "forward" dan FLY-2"reverse" yang didegenerasi dari sikuen asam amino gen FLO (Antirrhinum), ALF (Petunia), NFL 2 (Nicotiana). Primer-primer tersebut kemudian digunakan untuk amplifikasi PCRDNA dan cDNA model-I dan II . Rantai pertama cDNA model-I terdiri dari cDNA-1 yang disintesis dari RNA dengan menggunakan "reverse trancriptase" dan primer FLY-1R serta cDNA-2 yang disintesis dari RNA dengan menggunakan "reverse transcriptase" dan FLY-2R, sedangkan rantai pertama cDNA-II disintesis dari RNA yang menggunakan "reverse transcriptase" dan adapter primer (oligo T). Amplifikasi DNA dan cDNA model I berhasil dilakukan dengan kombinasi primer FLY-1F, FLY-1R dan FLY-2F, dan diperoleh sikuen dengan panjang sekitar 800 pb dan 1200 pb. Amplifikasi cDNA modelII yang dilakukan dengan UAP (primer amplifikasi universal) dan FLY2F dan berhasil diperoleh sikuen dengan ukuran sekitar 900 pb. Seluruh amplikon tersebut kemudian dikloning dan disikuensing. Hasil sikuen tersebut bila dibandingkan dengan "database" pada "GenBank" menunjukkan kesamaan dengan gen-gen lain pada tumbuhan dan bukan dengan bagian hulu dari gen LFY - Arabidopsis maupun gen homolog LFY pada tanaman lainnya. Analisis lebih lanjut "open reading frame" sikuen DNA dan cDNA model I ukuran 800 pb dan sikuen spesifik pada perbatasan ekson dan intron menunjukkan adanya satu ekson dengan 2 "open reading frame" yang diapit oleh 2 intron dan pada sikuen cDNA model II ditemukan potongan sikuen ekson dan segmen 3' mRNA yang tidak ditranslasi.
vi
DAFTAR ISI Halaman PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS
iii
UCAPAN TERIMA KASIH
iv
ABSTRAK
vi
ABSTRACT
vii
DAFTAR ISI
viii
DAFTAR TABEL
xi
DAFTAR GAMBAR
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
xv
BAB L PENDAHULUAN Latar Belakang 1.1. 1.2.
1
Tujuan Penelitian
5
BAB IL KAJIAN PUSTAKA 2.1.
Transisi ke Pembungaan
2.2.
Gen-Gen Pembungaan
6
dan Interaksinya
10
2.3.
Gen-Gen homolog LEAFY
17
2.4.
Disain Primer
22
2.4.1.
Disain primer spesifik
23
2.4.2.
Disain primer terdegenerasi
24
BAB IIL BAHAN DAN CARA KERJA 3.1.
Bahan
27
3.2.
Cara Kerja
27
viii
'
3.2.1.
Pengambilan bahan
27
3.2.2.
Penghilangan aktivitas RNAse
27
3.2.3.
Diagram alir cara kerja
28
3.2.4.
Disain primer
29
3.2.5.
Isolasi RNA
31
3.2.6.
Elektroforesis RNA
33
3.2.7.
Sintesis untai cDNA pertama
34
3.2.8.
Isolasi DNA
35
3.2.9.
Arnplif kasi cDNA model I dan DNA
37
3.2.10. Amplifikasi cDNA model II
39
3.2.11. Elektroforesis hasil PCR
41
3.2.12. Kloning produk PCR
42
3.2.12.1. Ligasi produk PCR 3.2.13. Transformasi produk ligasi
42
3.2.13.1. Pembuatan sel kompeten
43
3.2.14. Transformasi inang bakteri
44
3.2.15. Isolasi plasmid
45
3.2.16. Pemotongan plasmid
47
3.2.17. Sikuensing
47
43
BAB IV. HASIL DAN PEM 3AHASAN 4.1.
Hasil Isolasi DNA dan RNA Total
48
4.2.
Amphfikasi DNA dengan Cetakan
50
dari DNA dan cDNA Model I 4.3.
Isolasi Plasmid dan Restriksi DNA Sisipan Plasmid
ix
52
DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1
Halaman Kemungkinan-kemungkinan perubahan pada
7
kompetensi dan determinasi yang dibutuhkan untuk pembungaan serta tahapan dimana signal dapat bereaksi 2.2
Primordia bunga dan zonasi meristem
8
tunas apikal 2.3
Meristem tunas apikal dari potongan logitudinal
9
2.4
Pembentukan primordium organ-organ
10
bunga pada meristem bunga 2.5
Interaksi antara gen-gen inisiasi proses
14
pembungaan atau identitas meristem bunga dengan gen-gen waktu pembungaan 2.6
Hubungan fimgsional antara LEAFY (LFY),
16
APETALA 1 (API ), CAULIFLOWER (CAL),
danAGAMOUS (AG) 3.1
Pendekatan untuk karakterisai ujung 5' gen
28
homolog LFYIPW Jati 3.2
Disain primer tanpa degenerasi dan dengan
29
dengan degenerasi 4.1
Elektroferogram hasil isolasi DNA dari
48
kuncup bungs jati 4.2
Elektroferogram hasil isolasi RNA dari kuncup bungs jati
xiii
49
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Selama pertumbuhan vegetatif merstem apikal tumbuh menstabilkan arsitektumya dengan membentuk serangkaian pengulangan primordia yang berkembang menjadi daun dan atau cabang yang mempunyai menstem apikalnya sendin. Bersamaan dengan adanya transisi ke pertumbuhan reproduktif, kebanyakan atau hampir seluruh menstem apikal berkembang menjadi bungs (Colasanti & Sundaresan, 2000). Pads Angiospermae terdapat 2 pola yang berbeda dari perkembangan reproduktif . Pertama, seluruh menstem vegetatif yang tidak terbatas ditransformam langsung menjadi meristem bunga yang terbatas. Kedua, meristem vegetatif ditransformasi dahulu menjadi merstem perbungaan yang kemudian menghasilkan merstem bunga. Menstem perbungaan dapat bersifat tak terbatas misalnya pada bunga Arabidopsis ataupun dapat bersifat terbatas seperti pads bunga matahari. Meristem bunga selanjutnya melalui serangkaian perkembangan yang terdiferensiasi menjadi 4 struktur dasar dari organ bunga yaitu sepals petals, stamen dan karpela (Fosket, 1994; Colasanti & Sundaresan, 2000). Sebelum meristem bunga terdiferensiasi menjadi organ - organ bunga, tumbuhan mengalami transisi dari perkembangan vegetatif ke reproduktif yang disebut sebagai evokasi pembungaan. EvOkasi pembungaan merupakan hasil ekspresi dan interaksi serarrgkaian gen
1
2 yang mengkode faktor-faktor transkripsi yang kemudian mengkontrol gen-gen spesifik lain untuk pembentukan meristem bunga dan organorgan bunga. Evokasi pembungaan dipicu oleh sinyal - sinyal dari lingkungan seperti panjang han, temperatur, juga dipenganihi oleh sinyal internal seperti usia tumbuhan (Fosket, 1994; Blazquez et al., 1997; Liljegren et al., 1999). Transisi dari pertumbuhan vegetatif ke reproduktif telah banyak dipelajari sebelumnya antara lain melalui pendekatan fisiologi yang mendeduksi bahwa ads substansi seperti hormon yang membantu transisi ini, namun biokimia dari senyawa yang dikenal sebagai florigen ini masih belum jelas. Pada mass ini studi genetika dan molekuler menawarkan suatu pendekatan baru mengenai mekanisme yang terjadi pads transisi pertumbuhan vegetatif ke reproduktif (Wagner, 1996; Colasanti & Sundaresan, 2000). Penemuan mutan - mutan yang kehilangan fimgsmya dimana bungs digantikan oleh struktur intermediet antara bungs dan tunas vegetatif menunjukkan keberadaan gen-gen regulator pengendali yang mengontrol keseluruhan proses insiasi pembungaan atau identitas meristem bunga. Ada 5 gen regulator pada inisiasi proses pembungaan yang telah diidentifikasi dengan mutasi dan diklon pada Arabidopsis yaitu LEAFY (LFY), APETALA 1 (API), CAULIFLOWER (CAL), APETALA 2 (AP2), dan UNUSUAL FLOWER ORGANS (UFO). Dua dari gen yang menginisiasi proses pembungaan yaitu LFY dan API merupakan gen-gen kunci yang berperan penting untuk inisiasi program pembungaan. Ekspresi konstitutif pada LFY atau API menyebabkan pembungaan lebih awal, tunas lateral diubah menj adi bungs tunggal dan
3 tunas apikal yang bersifat tidak terbatas digantikan oleh bunga (Hempel et al., 1997; Sunchan et al., 1998; Pidkowich et al., 1999). LFY dan API menstabilkan identitas meristem bungs. Aktivitas gen LFY dan API dapat menekan aktivitas gen pads meristem apikal yaitu TERMINAL FLOWER 1 (TFLI), yang mengakibatkan transformasi daun dan tunas menjadi bunga. Hal sebaliknya terjadi bila gen TFL 1 menekan aktivitas gen LFY dan API maka terjadi transformasi bunga menjadi daun dan tunas vegetatif (Alvarez et al., 1992). LFY dan API pada Arabidopsis diekspresikan pada primordia bunga yang sangat muda, namun hanya LFY yang diekspresikan selama fase vegetatif di primordia daun (Nillson et al., 1998), hanya level ekspresi yang terjadi sangat rendah, namun mengalami peningkatan selama pembungaan (Blazquez et al., 1997). Ekspresi langsung gen identitas meristem bunga secara dramatis dapat mengurangi waktu yang diperlukan untuk berbunga, misalnya pada kasus yang ekstrim dimana terjadi peningkatan kebutuhan bunga yang mendesak. Pada kasus tanaman aspen, yang merupakan basil persilangan Populus tremula dan Populus tremuloides, diperlukan waktu 8 sampai 10 tahun untuk dapat berbunga. Adanya tanaman transgenik aspen dengan ekspresi konstitutif dari gen LFY menyebabkan bunga dapat dihasilkan pada usia 6 sampai 7 bulan. Sebaliknya, inaktivasi gen yang menentukan nasib meristem bunga dapat menghambat atau mengeliminasi waktu pembungaan. Konsekuensi regulasi aktivitas gen identitas meristem pembungaan adalah pengaturan produktivitas tanaman melalui rekayasa genetika (Gocal, 1998; Weidong et al., 2000).
4
Gen LFYmerupakan pengatur utama untuk perkembangan bungs. Gen LFY dapat mengaktivasi geri-gen ABC yang maupakan gen-gen penentu diferensiast shuktur bunga yaitu sepala, petals, stamen dan karpela (Busch, 1999} Gen LFY pada Arabidopsis dan gen yang homolog dengan LFY pads tanaman Petunia (ALF), Nicotiana (NFL), Antirrihinum (FZ.O), Pisum (UNI), Brassica (BOFH) mempunyai daerah tertentu yang dikonservasi. Daerah ini sangat membantu untuk mengkarakterisasi gen yang homolog dengan LFY pads tanaman lain (Souer et al., 1998). Jati (Tectona grandis Lf) jugs memiliki gen yang homolog dengan LFY seperti padaArabidopsis dan tanaman lainnya. Dugaan ini diperkuat oleh peneliian sebelumnya (Etikawad, 2001) yang telah berhasil mengisolasi dan mengkaraktexisasi 577 nukleotida cDNA gen yang homolog dengan LFY/ FLO pads jati. Gen yang di peroleh masih merupakan potongan ujung 3' atau berada di daerah hilir. Penjajaran 577 nukleotida cDNA gen homolog LFY/FLO jati dengan gen homolog LFYpada tanaman lain menunjukkan bahwa kemungkinan gen homolog LFYIFLO jati mempunyai cDNA yang berkisar antara 1400 - 1500 nukleotida. Hal ini mendorong ddakukan penelitian benkutnya untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi gen homolog LFY/FLO jati yang berada di daerah hulu atau ujung 5' sehingga dapat diperoleh gen homolog LFY/FLO jati yang lebih lengkap.
5
1.2. Tujuan Penelitian Penelitian nu bertujuan untuk mengisolasi dan mengkaraktensasi bagian hulu (ujung 5') gen homolog LFY/FLO jati (Tectona grandis L.f.) dengan mengamplifikasi daerah cDNA dan DNA jati yang MPn_ menggunakan primer yang dirancang dari gen homolog LFY/FLO jati dan gen-gen homolog LFYpads FLO (Antirrhinum), ALF (Petunia) don NLF 2 (Nicotiana).
