KLONING DAERAH PENGKODE INTERFERON ALFA-2B (IFNα2b) SINTETIK PADA Escherichia coli, OVERPRODUKSI, PURIFIKASI, DAN KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN IFNα2b
TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung
RATIH ASMANA NINGRUM 20706011
Program Studi Farmasi
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
KLONING DAERAH PENGKODE INTERFERON ALFA-2B (IFNα2b) SINTETIK PADA Escherichia coli, OVERPRODUKSI, PURIFIKASI, DAN KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN IFNα2b
Ratih Asmana Ningrum 20706011
Program Studi Farmasi Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung
September 2008
Debbie Sofie Retnoningrum, Ph.D ------------------------------------------------------------------
Pembimbing I
Dr. Heni Rachmawati -----------------------------------------------------------
Pembimbing II
ABSTRAK
KLONING DAERAH PENGKODE INTERFERON ALFA-2B (IFNα2b) SINTETIK PADA Escherichia coli, OVERPRODUKSI, PURIFIKASI, DAN KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN IFNα2b Ratih Asmana Ningrum - 20706011
Interferon (IFN) merupakan suatu sitokin yang dihasilkan dan disekresikan oleh hampir semua sel eukariot sebagai respon terhadap stimulasi virus, bakteri, antigen, atau mitogen tertentu. Berdasarkan tipe reseptor yang dapat dikenali pada permukaan membran sel, IFN dikelompokkan menjadi tipe I dan II. Tipe I meliputi IFNα, IFNβ, IFN τ, dan IFN ω. Tipe II terdiri atas IFN γ. Hepatitis B dan C merupakan penyakit berbahaya karena jika tidak ditangani secara tepat dapat berkembang menjadi kanker hati. Data WHO 2002 menunjukkan angka kematian di seluruh dunia adalah 1 juta orang per tahun untuk hepatitis B dan 1,4 juta orang untuk hepatitis C. Sampai saat ini IFNα2b merupakan satu-satunya standar terapi untuk penyakit hepatitis B dan hepatitis C baik dalam monoterapi atau terapi kombinasi dengan analog nukleosida. Terapi hepatitis B menggunakan IFNα dilakukan selama 48 minggu, dan untuk hepatitis C 24 sampai 48 minggu. Harga IFNα2b sangat mahal yaitu sekitar 2,5-2,8 juta untuk dosis sekali pakai sehingga tidak semua penderita hepatitis B atau C memperoleh terapi IFNα2b. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan protein rekombinan IFNα2b melalui kloning daerah pengkode IFNα2b sintetik pada Escherichia coli (E. coli). Urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b telah diketahui dan kodonnya telah dioptimasi untuk E. coli. Kerangka baca terbuka IFNα2b disintesis menggunakan 10 oligonukleotida dengan metode Thermodynamically Balanced Inside-Out (TBIO). Selanjutnya dilakukan amplifikasi kerangka baca terbuka sekaligus menambahkan situs pemotongan enzim yaitu EcoRI dan HindIII dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Kerangka baca terbuka kemudian diligasi dengan vektor kloning pGEM-T dan hasil ligasi ditransformasikan ke dalam E. coli JM109. Penentuan urutan nukleotida dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan.Plasmid pGEM-T membawa kerangka baca terbuka IFNα2b diperoleh, namun mengandung satu mutasi delesi nukleotida deoksiguanosin monofosfat pada kodon kedua. Selanjutnya kerangka baca terbuka tersebut berhasil dipindahkan ke dalam vektor ekspresi pET32b dan hasil ligasi ditransformasikan ke dalam E. coli DH5α menghasilkan plasmid rekombinan pET32b IFNα2b G del. Perbaikan urutan nukleotida kerangka baca terbuka pET32b IFNα2b G del dilakukan dengan mutagenesis terarah. Produk mutagenesis kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli TOP10. Plasmid pET32b IFNα2b yang telah memiliki urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b yang benar ditransformasi ke dalam E. coli BL21. Transforman dikultur dan diinduksi dengan penambahan isopropil β-D-1tiogalaktopiranosid (IPTG) sehingga menghasilkan protein rekombinan IFNα2b. Protein yang dihasilkan merupakan protein fusi dengan poli histidin untuk mempermudah proses purifikasi. Protein kemudian dikarakterisasi melalui metode Sodium Deodesyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE), menunjukkan pita IFNα2b rekombinan berukuran 37 kDa. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom nikel dan protein murni dikarakterisasi dengan metode SDS PAGE dan spektrometri massa Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI TOF). Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa protein yang dihasilkan mempunyai kemiripan yang tinggi dengan IFNα2 dimana IFNα2b adalah salah satu anggotanya. Kata kunci : sintesis gen, TBIO, IFNα2b, E. coli, SDS PAGE, MALDI TOF.
i
ABSTRACT
CLONING OF SYNTHETIC INTERFERON ALFA-2B (IFNα2b) CODING REGION IN Escherichia coli, OVERPRODUCTION, PURIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT IFNα2b PROTEIN Ratih Asmana Ningrum - 20706011
Interferon (IFN) is a cytokine produced and secreted by almost all eucaryotic cells as a response to viral, bacterial, antigen, or mitogen stimuli. Based on their receptor type on the cell membrane surface, IFN is classified to type I and type II. Type I consists of IFNα, IFNβ, IFN τ, and IFN ω. Tipe II consists of IFN γ. Hepatitis B and C are serious diseases because if not managed properly can develop hepatocellular carcinoma. WHO data in 2002 showed that the mortality worldwide is 1 million people per year for hepatitis B and 1.4 million people for hepatitis C. Up to now IFNα2b is a standard therapy for hepatitis B and hepatitis C both as a single therapy or in combination with other nucleosides analog. IFNα therapy for hepatitis B needs 48 weeks and 24 to 48 weeks for hepatitis C. The cost therapy with IFNα2b is quite high, 2.5 to 2.8 million per single dose and can not be achieved by all Hepatitis B or hepatitis C patients. This research was intended to obtain recombinant IFNα2b protein by cloning of synthetic IFNα2b coding region in Escherichia coli (E. coli). The nucleotide sequence of IFNα2b Open Reading Frame (ORF) has been known and its codons have been optimized for E. coli. The IFNα2b ORF was synthesized using 10 oligonucleotides by Thermodynamically Balanced Inside-Out (TBIO) method. Polymerase Chain Reaction (PCR) was used to amplify IFNα2b ORF and introduce the HindIII and EcoRI restriction sites. The ORF was then ligated to pGEM-T cloning vector and the ligation product was transformed into E. coli JM109. The nucleotide sequencing was conducted to obtain the nucleotides sequence of IFNα2b ORF in recombinant plasmids. Recombinant pGEM-T carrying IFNα2b ORF was obtained, however it contained a deletion mutation of deoxyguanocine monophosphate in second codon. The ORF was successfully inserted into pET32b expression vector and the ligation product was transformed into E. coli DH5α resulting pET32b IFNα2b G del recombinant plasmid. The site directed mutagenesis was done to repair the nucleotide sequence of IFNα2b ORF. The mutagenesis product was transformed into E. coli TOP10. pET32b IFNα2b containing the correct sequence was transformed into E. coli BL21. One transformant was induced by isopropyl β-D-1tiogalactopiranoside (IPTG) to obtain IFNα2b recombinant protein. The protein product was a fusion protein with polihistidin to simplify the purification. The protein was characterized by Sodium Deodesyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) method, showed the recombinant IFNα2b band as a 37 kDa protein. The purification was conducted by nickel column and the purified protein was characterized by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI TOF) mass spectrometry. The result showed that the recombinant protein have high homology to IFNα, which IFNα2b is one of its member. Key words: gene synthesis, TBIO, IFNα2b, E. coli, SDS PAGE, MALDI TOF.
ii
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS
Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.
iii
UCAPAN TERIMA KASIH
Segala puji dan keagungan hanyalah milik Allah Swt, atas karunia Nya yang begitu besar maka penelitian dan tesis yang berjudul kloning daerah pengkode interferon alfa-2b sintetik pada Escherichia coli, overproduksi, purifikasi, dan karakterisasi protein rekombinan IFNα2b ini dapat terselesaikan dengan baik. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya disampaikan pada Debbie Sofie Retnoningrum, Ph.D selaku dosen pembimbing utama atas bimbingan, saran, dan motivasi yang diberikan, Dr. Heni Rachmawati selaku dosen pembimbing serta atas masukan dan arahan, Hansky, Ati, Ana, Valen, Dina, rekan-rekan laboratorium bioteknologi, rekan-rekan pasca sarjana sekolah farmasi atas bantuan selama ini, suami dan buah hati tercinta atas pengertian dan dukungan yang tidak pernah putus, serta ibunda dan keluarga terkasih atas semua kasih sayang yang begitu berarti. Tesis ini hanyalah setitik debu dalam semesta ilmu-Nya, namun semoga dapat bermanfaat bagi kepentingan akademik.
iv
DAFTAR ISI Halaman ABSTRAK.....................................................................................................................
i
ABSTRACT...................................................................................................................
ii
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS...........................................................................
iii
UCAPAN TERIMA KASIH..........................................................................................
iv
DAFTAR ISI..................................................................................................................
v
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR.....................................................................................................
viii
DAFTAR TABEL..........................................................................................................
ix
BAB I
PENDAHULUAN
1
II
TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................
3
II.1 Karakteristik Interferon...........................................................................
3
II.2 Mekanisme Kerja Interferon....................................................................
4
II.3 Jalur Jak Stat............................................................................................
4
II.4 Interferon α2b Sebagai Protein Terapetik................................................
5
II.5 Resistensi Virus Terhadap Interferon α2b...............................................
8
II.6 Produksi Interferon α 2b dengan Teknologi DNA Rekombinan.............
9
II.6.1 Metode Recursive PCR………………………………………….
10
II.6.2 Metode Thermodynamically Balanced Inside-Out………………
10
III
METODE PENELITIAN..................................................................................
12
IV
PERCOBAAN..................................................................................................
13
IV.1 Bahan........................................................................................................
13
IV.2 Alat...........................................................................................................
13
IV.3 Plasmid dan Mikroba Uji..........................................................................
14
IV.4 Sintesis, Amplifikasi, dan Purifikasi Kerangka Baca Terbuka IFNα2b Sintetik.......................................................................................................
14
IV.5 Kloning Kerangka Baca Terbuka IFNα2b................................................
15
IV.6 Seleksi dan Karakterisasi Transforman.....................................................
16
IV.7 Mutagenesis Terarah Terhadap Plasmid Rekombinan pET32b IFNα2b..
18
IV.8 Isolasi, Purifikasi, Karakterisasi, dan Protein Rekombinan IFNα2b .......
19
v
V
HASIL DAN PEMBAHASAN..........................................................................
20
VI
SIMPULAN DAN SARAN...............................................................................
40
DAFTAR PUSTAKA.....................................................................................................
41
LAMPIRAN....................................................................................................................
43
vi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
A
Gambar 2.1 Urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b....................
43
B
Tabel 3.1 Urutan nukleotida oligonukleotida dan primer..............................
44
C
Gambar 3.1 Peta plasmid pGEM-T dan pET32b..........................................
45
D
Gambar 5.4 Hasil pensejajaran urutan basa kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan G20 dengan kerangka baca terbuka IFNα2b sintetik pada GenBank.................................................................................
46
vii
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
II. 1
Mekanisme Kerja IFN.......................................................………………...
4
II. 2
Jalur Jak Stat.............................................………………............................
5
II. 3
Mekanisme kerja IFNα terhadap VHC ……………………..…..................
7
II. 4
Prinsip metode Recursive PCR.....................................................................
10
II. 5
Prinsip Metode TBIO ………....……..….....................................................
11
V. 1
Produk TBIO ………………………………………....................................
22
V. 2
Hasil analisis laju migrasi plasmid rekombinan pGEM-T IFNα2b ........….
23
V .3
Hasil pemotongan plasmid rekombinan pGEM-T IFNα2b…………..........
24
V .5
Hasil pensejajaran urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid rekombinan G22..............................................................................
27
V. 6
Hasil isolasi plasmid rekombinan pGEM-T IFNα2b G del dan pET32b…
28
V. 7
Hasil pemotongan pGEM-T IFNα2b G del dan pET32b
dengan
HindIII.......................................................................................................... V. 8
28
Hasil pemotongan plasmid pGEM-T IFNα2b G del dan pET32b dengan EcoRI............................................................................................................
29
V. 9
Hasil isolasi pET32b IFNα2b G del.............................................................
30
V.10
Hasil pemotongan pET32b IFNα2b G del PI 2............................................
31
V.11
Hasil penentuan urutan nukleotida DNA sisipan pET32b IFNα2b G del....
33
V.12
Hasil isolasi pET32b IFN α2b dari transforman...........................................
35
V.13
Hasil pemotongan pET32b IFNα2b..............................................................
35
V.14
Hasil penyisipan deoksiguanosin monofosfat hasil mutagenesis terarah pada pET32b IFNα2b G del menghasilkan pET32b IFNα2b.......................
V.15
36
Hasil analisis SDS PAGE protein intrasel total transforman E. coli pET32b IFNα2b............................................................................................
37
V.16
Analisis SDS PAGE hasil pemurnian IFNα2b rekombinan.........................
38
V. 17
Hasil analisis protein rekombinan IFNα2b dengan metode Spektrometri massa MALDI TOF....................................................................................
viii
39
DAFTAR TABEL
Tabel V.1
Halaman Hasil analisis penentuan urutan nukleotida menggunakan primer T7 promotor terhadap kerangka baca terbuka IFNα2b pada plasmid G4, G5,G6, G7, G8, G15, G16, G17, G18, G20, G21, G22, G36, dan L6......
ix
26
