1
(terbatas di Asia) (Travers, 1984a, b). Famili Mastacembelidae mencakup tiga genus yaitu Mastacembelus (61 spesies), Macrognathus (16 spesies), dan Sinobdella (1 spesies) (Cakmak & Alp, 2010). Famili Mastacembelidae yang dikenal sebagai spiny eel atau belut berduri, bentuk tubuhnya panjang berduri menyerupai belut (Cakmak & Alp, 2010). Masyarakat lokal sering menyebut spiny eel dengan sebutan ikan Sili. Ikan Sili memiliki morfologi yang unik yaitu tubuh sangat pipih dan panjang, terdapat duri di sepanjang punggung (dorsal), 2-3 duri di depan sirip anal, dan tidak memiliki sirip ventral. Ciri lainnya yang dominan adalah adanya belalai yang memanjang ke bawah pada bagian moncongnya. Pinggiran lubang hidung depan, memiliki 6 tonjolan halus seperti jari kecil (Ario, 2010; Eroglu & Sen, 2007). Sirip anal dan dorsal memanjang mulai sekitar 1/3 bagian posterior tubuh ke belakang menuju pangkal ekor dan terpisah dengan sirip ekor (Plamoottil & Abraham, 2013). Lebih dari 70 spesies ikan Sili digunakan sebagai ikan konsumsi (Britz, 2007), karena mengandung nutrisi dan mineral yang cukup tinggi yaitu Cu, Zn, Fe, vitamin A dan E yang dibutuhkan oleh manusia (Olgunoglu, 2011). Ikan Sili juga dapat dikembangkan sebagai ikan hias, karena memiliki bentuk badan dan warna yang menarik (Ario, 2010). Ikan Sili memiliki sebaran yang cukup luas, ditemukan di wilayah tropis dan subtropis Afrika, Asia Tenggara, dan Cina Utara (Frose & Pauly, 2008). Di Indonesia penyebarannya meliputi: Pulau Jawa (Lebak, Bogor, Cipanas, Jasinga, Pelabuhan Ratu), Sumatera (Deli, Langkat, Solok, Payakumbuh, Wai Lima, Palembang), Belitung, dan Kalimantan (Ario, 2010). Di Jawa Timur ikan Sili juga ditemukan di sungai Ngrowo Kabupaten Tulungagung. Sungai Ngrowo merupakan salah satu anak sungai Brantas yang mengalir di Tulungagung dengan panjang 6 km (Dinas Perairan Kabupaten Tulungagung), yang melewati lima desa yaitu Kutoanyar, Kalituri, Kendalbulur, Gesikan, dan Wates. Keadaan sungai Ngrowo berlumpur, terdapat banyak tumbuhan air. Pada musim kemarau sungai ini memiliki kedalaman ± 2 m, sedangkan musim hujan memiliki kedalaman ± 8 m, dengan lebar sungai ± 50 m. Sebagian besar masyarakat setempat melakukan aktivitas penangkapan ikan di sungai untuk dikonsumsi maupun diperdagangkan. Penangkapan ikan Sili yang berlangsung sepanjang tahun merupakan potensi ancaman bagi kelestarian ikan tersebut. Selama ini belum ada penelitian mengenai ikan Sili khususnya di Jawa Timur, dan masyarakat belum mengenal ikan tersebut, sehingga penting dilakukan penelitian. Berdasarkan informasi dari IUCN Red List banyak dari spesies Macrognathus yang masih belum diketahui baik data morfologi maupun genetik secara jelas diantaranya yaitu M. aral, M. circumcinctus, M. maculatus, M. pancalus, M. siamensis, M. tapirus, M. zebrinus. Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi secara berkelanjutan untuk mengetahui keanekaragamannya. Salah satu cara identifikasi suatu spesies dengan pengamatan karakter morfometrik dan meristik serta diperkuat dengan data genetik. DNA barcode adalah sekuen pendek DNA mitokondria yang sudah terstandarisasi dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu organisme sampai tingkat spesies (Hebert, 2003). Keuntungan menggunakan DNA barcode dalam identifikasi adalah sampel yang digunakan dapat berupa potongan kecil dari jaringan tubuh atau darah sehingga tidak menyakiti objek yang akan diidentifikasi (Janzen et al., 2005). DNA barcode terbukti dapat digunakan dengan cepat, akurat, dan relatif murah untuk mengidentifikasi suatu spesies yang sulit dilakukan secara morfologi. Perkembangan literatur tentang DNA barcode menunjukkan bahwa sebuah fragmen pendek COI dapat digunakan sebagai penanda variasi yang secara akurat dapat
2
mengidentifikasi berbagai macam hewan sampai tingkat spesies (Waugh, 2007). Gen Cytochrom-C Oxidase Sub Unit 1 yang dikenal sebagai COI, merupakan salah satu gen dalam genom mitokondria (mtDNA) yang sekuennya biasa digunakan sebagai barcode. DNA barcode memainkan peranan penting sebagai alat bantu taksonomi untuk mengungkap spesies yang berbeda dan terpisah dengan cepat dan akurat secara genetik. Kajian tentang ikan freshwater dengan DNA barcode Cytochrom-C Oxidase Sub Unit 1 (COI) akan menjadi data penguat identifikasi ikan Sili yang telah dilakukan berdasarkan karakter morfologi. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menentukan spesies ikan Sili yang ditemukan dari sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung berdasarkan karakter morfologi dan sekuen barcode gen COI yang diperoleh, serta untuk mengetahui hubungan kekerabatan ikan famili Mastacembelidae yang ditemukan berdasarkan sekuen barcode gen COI. METODE Penelitian ini termasuk penelitian deskriptif eksploratif. Pengambilan sampel ikan dilakukan di Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung dengan metode Purposive Sampling (Fachrul, 2012). Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus hingga Desember 2014. Sampel diperoleh dari hasil tangkapan nelayan menggunakan alat tangkap jaring jala tebar (meshsize 1 inci) dan fish trap (bubu). Identifikasi secara morfologi dilakukan pada 30 ekor ikan melalui pengukuran morfometrik dan meristik ikan Sili dengan menggunakan digital caliper (ketelitian 0,10 mm). Pengambilan data sekuen gen COI dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu pengambilan sampel untuk isolasi DNA, isolasi DNA murni, amplifikasi gen COI, dan sekuensing gen COI. Isolasi DNA murni ikan Sili dilakukan secara duplo. Isolasi DNA total, dari sampel sirip dilakukan dengan menggunakan Roche DNA Isolation Kit dengan beberapa modifikasi. Amplifikasi gen target dilakukan dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan sepasang primer universal yaitu, primer Forward FishF2_tl:(5’TCGAC TAATCATAAAGATATCGGCAC-3’) dan Reverse FishR2_tl:(5’-ACTTCAGGGTGA CCGAAGATCAGAA-3’) (Zhang, 2011). Prosedur amplifikasi gen COI dilakukan sesuai dengan protokol dari iNtRON BIOTECHNOLOGY. Hasil PCR diperiksa melalui elektroforesis dengan gel agarose 1,5%. Sekuensing gen target dilakukan di First BASE Laboratories, Malaysia. Analisis data morfologi berupa data morfometrik dan meristik dilakukan secara deskriptif yaitu mencocokkan sampel ikan dengan buku kunci identifikasi dari Saanin, 1968; Roberts, 1985; dan Kottelat et al., 1993. Analisis sekuen barcode COI dilakukan dengan beberapa software yaitu: FinchTV, DNA Baser, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), BioEdit, dan MEGA 6. Selain itu juga dilakukan analisis jarak genetik (pairwise distance) yang bertujuan untuk mengetahui jarak genetik antar satu individu dengan individu lainnya. HASIL Identifikasi Spesies Berdasarkan Karakter Morfologi Ikan Sili yang ditemukan di Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung memiliki duri didepan sirip dorsal berjumlah 21 (Gb.1.E), duri di depan sirip anal berjumlah 2 (Gb.1.F), tidak memiliki sirip ventral, jari-jari sirip dorsal berjumlah 43-52 (D.43-52) (Gb.1.I), jari-jari sirip anal berjumlah 46-54 (A. 46-54), jari-jari sirip pectoral berjumlah 16-21 (P.16-21) (Gb.1.H), jari-jari sirip caudal berjumlah 12-15 (C.15-15). Bentuk tubuh taeniform, posisi mulut ke bawah (inferior), pada bagian moncongnya memiliki bentukan memanjang seperti belalai dengan lubang hidung tubuler pada ujungnya
3
(Gb.1.D), bentuk sirip caudal membulat (rounded) (Gb.1.G), tipe sisik sikloid (Gb.1.B). Sirip anal dan dorsal memanjang mulai sekitar 1/3 bagian posterior tubuh ke belakang menuju pangkal ekor dan terpisah dengan sirip ekor (Gb.1.A). Pola warna tubuh coklat tua dengan daerah di bagian abdomen memiliki warna yang lebih terang, selain itu ada pola warna lebih terang pada bagian belakang mata sampai ke pangkal ekor. Bentuk linea lateralis lurus. Pada dasar sirip dorsal dan sirip caudal terdapat ocelli (bercak bulat memiliki dua lingkaran, lingkaran dalam berwarna lebih gelap, sedangkan lingkaran luar berwarna lebih terang dengan bentuk tidak beraturan) (Gb.1.A,C).
Gambar 1. Karakter Morfologi Ikan Sili yang Ditemukan di Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung, A) Ikan Sili (panah kuning menunjukkan ocelli); B) Sisik ikan tipe sikloid, perbesaran 200 kali; C) Ocelli pada dasar sirip dorsal, perbesaran 5 kali; D) Moncong ikan yang memiliki bentukan memanjang seperti belalai; E) Duri pada bagian dorsal, perbesaran 5 kali; F) Duri di depan sirip anal, perbesaran 5 kali; G) Sirip caudal, perbesaran 5 kali; H) Sirip pectoral, perbesaran 5 kali; I) Sirip dorsal, perbesaran 5 kali
Berdasarkan hasil pengamatan karakter morfologi, dapat dibuat kunci identifikasi sebagai berikut: Kunci identifikasi ikan Sili sebagai berikut: 1. Tubuh pipih dan panjang seperti ular, tidak memiliki sirip ventral (Ordo Synbranchiformes)........................................................................................................2 2a.Tidak memiliki bentukan seperti duri didepan sirip dorsal, moncong membulat (Famili Chaudhuriidae) b.Memiliki bentukan seperti duri didepan sirip dorsal, moncong memanjang seperti belalai (Famili Mastacembelidae).................................................................................3 3a.Bentukan duri di depan sirip dorsal berjumlah 33-40, jumlah jari-jari sirip dorsal dan sirip anal 68-85 (Mastacembelus) b.Bentukan duri di depan sirip dorsal berjumlah 14-31, jumlah jari-jari sirip dorsal dan sirip anal 48-70 (Macrognathus)..................................................................................4 4a.Memiliki ocelli pada sirip caudal, rostrum kecil..........................................................5 b.Tidak memiliki ocelli pada sirip caudal, rostrum besar (Gb.2.A)..........(M. aculeatus) 5a.Ocelli terdapat pada dasar sirip caudal (Gb.2.B).....................................(M. siamensis)
4
b.Ocelli terdapat pada dasar sirip caudal dan dasar sirip dorsal (Gb.2.C)………………. (Macrognathus)
Gambar 2 Letak ocelli, A) Letak ocelli pada M. aculeatus;B) Letak ocelli pada M. siamensis; C) Letak ocelli pada Macrognathus
Identifikasi Spesies Berdasarkan DNA Barcode Gen COI Panjang gen COI yang berhasil diamplifikasi sebesar ± 700 bp. Setelah mendapatkan pita DNA yang sesuai dengan ukuran gen target, langkah selanjutnya yaitu sekuensing untuk melihat susunan basa nukelotida DNA. Data hasil sekuensing berupa kromatogram kemudian dilakukan analisis sehingga didapatkan consensus sequence untuk sampel A 685 bp dan untuk sampel B 703 bp. Hasil analisis consensus sequence menggunakan BLAST menunjukkan bahwa sekuen yang diperoleh adalah benar sekuen gen COI. Hal ini dibuktikan dari tingkat homologi sekuen sampel dengan sekuen gen COI Macrognathus siamensis voucher BW-2056 yang diperoleh dari Gene Bank sebesar 90%. Hasil multiple alignment antara sekuen gen COI sampel dengan sekuen gen COI anggota dari genus Macrognathus yang meliputi Macrognathus aculeatus GF721, M. aculeatus OM49, M. aral SR-GU, M. aral NBFGR, M. circumcinctus MCBL03, M. circumcinctus MCSY01, M. maculatus MMKO06, M. maculatus MMUBOI, M. pancalus WL-F26, M. pancalus WL-F24, M. siamensis BW-2056, M. siamensis MSPP03, dan M. zebrinus LR2099, menunjukkan bahwa sekuen gen COI sampel ikan yang diteliti memiliki sekuen yang relatif conserved pada basa 61 sampai dengan 664. Hasil analisis ini menunjukkan adanya tingkat mutasi yang cukup tinggi dengan ditemukannya basa-basa yang mengalami transisi atau transversi. Hasil alignment tersebut kemudian digunakan untuk membuat rekonstruksi topologi pohon filogenetik dengan menggunakan program komputer MEGA 6. Topologi pohon filogenetik dibuat dengan menggunakan metode ME (Minimum Evolution), NJ (Neighbor Joining), ML (Maximum Likelihood), dan MP (Maximum Parsimony). Hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik dengan menggunakan metode ME (Gb.3.A), NJ (Gb.3.B), dan MP (Gb.3.C) menunjukkan bahwa sampel A dan B membentuk satu clade monofiletik yang didukung dengan nilai boostrap 100%. Sampel A dan B berada dalam satu cluster dengan M. siamensis BW-2056 dan MSPO03. Analisis lebih lanjut dengan metode ME, NJ, dan MP menunjukkan bahwa kedua takson tersebut berada dalam clade yang berbeda didukung dengan nilai boostrap secara berurutan 44%, 41%, dan 38%. Hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik dengan menggunakan metode ML(Gb.3.D), menunjukkan bahwa sampel A dan B berada dalam satu cluster dengan M. aculeatus GF721 dan OM49, serta M. aral NBFGR dan SRGU. Pengelompokkan tersebut didukung dengan nilai boostrap 21%.
5
Gambar 3 Topologi Pohon Filogenetik, A) Metode ME; B) Metode NJ; C) Metode MP; dan D) Metode ML
Hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik berdasarkan BOLD system menunjukkan bahwa ikan Sili sampel A dan B berada dalam clade yang sama dengan M. tapirus MT07-21 dari Kalimantan Tengah. Berdasarkan indeks similaritas BOLD system ikan Sili sampel A dan B diduga spesies M. tapirus MT07-21 ditunjukkan dengan nilai similaritas 99,69%, sedangkan kedekatan dengan M. aculeatus dan M. siamensis ditunjukkan dengan 99,23% dan 90,32%. Jarak genetik antara ikan Sili sampel A yang diteliti dengan M. siamensis BW-2056 dan MSPO03 sebesar 11,4% ±0,015 dan 11% ± 0,015, untuk sampel B 11,6% ± 0,015 dan 11,2% ± 0,015.
PEMBAHASAN Ikan Sili yang ditemukan di Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung berdasarkan karakter morfologi merupakan genus Macrognathus. Hasil identifikasi morfologi juga dibandingkan dengan beberapa spesies ikan Sili pada kunci identifikasi yaitu M. aculeatus dan M. siamensis. Ikan sili yang diteliti memiliki perbedaan dengan kedua spesies pembanding tersebut berdasarkan letak ocelli yaitu terletak pada dasar sirip dorsal dan dasar sirip caudal, sedangkan M. siamensis ocelli terletak pada dasar sirip caudal, serta M. aculeatus ocelli terletak pada dasar sirip dorsal (Roberts, 1985; Saanin, 1968; Kottelat et al., 1993). Kurangnya referensi mengenai genus Macrognathus mengakibatkan identifikasi morfologi sampai tingkat spesies mengalami kesulitan, oleh karena itu dilakukan analisis genetik dengan menggunakan sekuen barcode gen COI. Hasil analisis genetik menunjukkan bahwa gen COI ikan Sili memiliki sekuen yang relatif conserved pada
6
basa 61 sampai dengan 664. Sekuen barcode gen COI yang diperoleh juga menunjukkan adanya tingkat mutasi yang cukup tinggi dengan ditemukannya basa-basa yang mengalami transisi atau transversi pada site tertentu. Identifikasi spesies menggunakan sekuen barcode gen COI berdasarkan BOLD system menunjukkan hasil rekonstruksi topologi pohon filogenetik yang berbeda dengan hasil rekonstruksi topologi filogenetik berdasarkan Gene Bank. Hasil analisis berdasarkan BOLD system menunjukkan ikan Sili sampel A dan B berada satu clade dengan M. tapirus MT07-21 dari Kalimantan Tengah, satu cluster dengan M. aculeatus dari Lampung, dan berbeda cluster dengan M. siamensis dari Vietnam. Hal ini didukung dengan indeks similaritas antara ikan Sili sampel A dan B dengan M. tapirus MT07-21 sebesar 99,69%, sedangkan pada M. aculeatus dan M. siamensis sebesar 99,23% dan 90,32%. Indeks similaritas yang tinggi menunjukkan tingkat kekerabatan yang dekat. Berdasarkan tingginya indeks similaritas pada BOLD system ikan Sili sampel A dan B diduga merupakan spesies Macrognathus tapirus. Data mengenai M. tapirus belum dipublikasikan pada Gene Bank, sehingga hasil analisis menunjukkan bahwa ikan Sili sampel A dan B berada satu cluster dengan M. siamensis BW-2056 dan MSPO03, serta M. aculeatus GF721 dan OM49, tetapi nilai boostrap dibawah 50% belum bisa dinyatakan bahwa hasil topologi tersebut benar untuk menentukan spesies (Gregory, 2008). Hal ini juga didukung dari hasil analisis jarak genetik (pairwise distance) antara ikan Sili sampel A dan B dengan spesies Macrognathus yang dilaporkan di Gene Bank menunjukkan angka yang cukup tinggi antara lain 11,4%; 11,6%; 11%; dan 11,2%. Dari hasil tersebut diketahui jarak genetik lebih dari 3%. Spesies yang memiliki jarak genetik >3% tergolong beda spesies (interspesies) (Hebert et al., 2003). Kedekatan antara ikan Sili sampel A dan B dengan M. tapirus dari Kalimantan Tengah dapat dihubungkan dengan sejarah Pulau Jawa, Sumatera, dan Kalimantan yang merupakan satu wilayah dalam daerah Paparan Sunda Besar. Saat es di kutub mencair, permukaan laut turun, dan permukaan air naik, menyebabkan kawasan luas Paparan Sunda terbuka dalam bentuk dataran rawa yang amat luas, pulau yang menyatu berpisah diperkirakan terjadi sekitar zaman pertengahan Miosen (Voris, 2000). Ikan yang ada di Pulau Jawa dimungkinkan menuju ke Kalimantan, atau sebaliknya. Sehingga ikan Sili sampel A dan B dengan M. tapirus yang berasal dari Kalimantan Tengah diduga merupakan satu spesies. Penelitian ini belum bisa membandingkan karakter morfologi antara ikan Sili yang ditemukan di Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung dengan M. tapirus. Hal ini karena data mengenai M. tapirus belum dipublikasikan pada BOLD system maupun Gene Bank. IUCN Red List (2014), menyebutkan bahwa M. tapirus termasuk kedalam status LC (Least Concern), sehingga data mengenai spesies tersebut masih belum diketahui secara jelas. Hasil penelitian ini berpeluang untuk memberikan informasi mengenai spesies yang diduga M. tapirus di Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung dengan melakukan kajian lebih lanjut mengenai anatomi misalnya sistem kerangka dan sistem reproduksi. Selain itu untuk memperkuat data genetik perlu dilakukan analisis sekuen dengan menggunakan gen mitokondria lainnya. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa ikan Sili yang ditemukan dari Sungai Ngrowo, Kabupaten Tulungagung secara morfologi merupakan genus Macrognathus, sedangkan berdasarkan sekuen barcode gen COI diduga merupakan spesies Macrognathus tapirus. Hubungan kekerabatan ikan Sili berdasarkan
7
BOLD system berkerabat dekat dengan M. aculeatus, sedangkan berdasarkan Gene Bank berkerabat dekat dengan M. aculeatus dan M. siamensis. SARAN Kajian mengenai anatomi sistem kerangka dan sistem reproduksi ikan Sili perlu dilakukan untuk mendukung hasil penelitian ini. Selain itu, perlu adanya analisis sekuen gen ikan Sili menggunakan gen mitokondria lainnya. DAFTAR RUJUKAN Adisoemarto, S. & Rifai, M. 1992. Keanekaragaman Hayati di Indonesia. Jakarta: Konphalindo. Ario, A. 2010. Mengenal Satwa Taman Nasional Gunung Gede Pangrango. Jakarta: Conservation International (IC). Britz, R. 2007. Two new species of Mastacembelus from Myanmar (Teleostei: Synbranchiformes: Mastacembelidae). Ichthyol. Explor. Freshwater, 18: 257268. Cakmak, E. & Alp, E. 2009. Morphological differences among the Mesopotamian spiny eel, Mastacembelus mastacembelus (Bank & Solander 1794) populations. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 10: 87-92. Eroglu, M. & D. Sen. 2007. Reproduction biology of Mastacembelus simack (Walbaum, 1972) inhabiting Karakaya Dam Lake (Malatya, Turkey). International Journal of Natural and Engineering Sciences I, 2: 69-73. Fachrul, M. F. 2012. Metode Sampling Bioteknologi. Jakarta: Bumi Aksara. Frose, R. & Pauly, D. (Eds). 2008. FishBase. World Wide Web electronic publication.www.fishbase.org, version (10/2008). Gregory, T. R. 2008. Understanding Evolutionary Trees. Evo Edu Outreach (1): 121137. Hebert, P. D. N., Cywinska, A., Ball, S. L. & deWaard, J. R. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. The Royal. 270: 313-321. Janzen, D. H., Hajibabaei, M., Burns, J. M., Hallwachs, W., Remigio, E. & Hebert, P. D. N. 2005. Wedding Biodiversity Inventory of A Large and Complex Lepidoptera Fauna with DNA Barcoding. Proceedings of the Royal Society of London, Series B: Biological Sciences, 360: 1835-1845. Kottelat, M., Whitten, A. J., Kartikasari, S. N., & Wirjoatmodjo, S. 1993. Freshwater Fishes of Western Indonesia and Sulawesi. Jakarta: Periplus Editions (HK) Ltd. Olgunoglu, I. A. 2011. Determination of the fundamental nutritional components in fresh and hot smoked spiny eel (Mastacembelus mastacembelus, Bank and Solander, 1794).Scientific Research and Essays, 6(31): 6448-6453. Plamoottil, M. & Abraham, N. P. 2013. Rediscovery of Mastacembelus malabaricus after one and half century. Research Journal of Animal, Veterinary, and Fishery Sciences, 1(8): 6-11. Roberts, T. R. 1985. Systematic Review of the Mastacembelidae or Spiny Eels of Burma and Thailand, with Description of Two New Species of Macrognathus. Japanese Journal of Ichtyologi, 33: 2. Saanin, H. 1984. Taksonomi dan kunci identifikasi ikan. Bogor: Binacipta. Travers, R. A. 1984a. A review of the Mastacembelidae, a suborder of synbranchiform teleost fishes. Part I: Anatomical descriptions. Bull. Brit. Mus. (Nat. Hist.) Zool., 46 (1): 1-133.
8
Travers, R. A. 1984b. A review of the Mastacembelidae, a suborder of synbranchiform teleost fishes. Part II: Phylogenetic analysis. Bull. Brit. Mus. (Nat. Hist.) Zool., 46 (2): 83-150. Voris, H. K. Maps of Pleistocene Sea Levels in Southeast Asia: Shorelines, River Systems and Time Durations. Journal of Biogeography, 27 (1157-1167). Waugh J. 2007. DNA barcoding in animal species: progress, potential and pitfalls. BioEssays, 29: 188-197 Zhang, J. 2011. Species Identification of Marine Fishes in China with DNA barcoding. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.
9
