TEORI HPLC SIMON BW WEEKS -8
MESIN HPLC
MESIN HPLC
KOMPONEN HPLC
Two Types of HPLC Methods • • • • • •
Normal Phase – polar stationary phase (column) with a nonpolar mobile phase (solvent) Reverse Phase– nonpolar stationary phase (column) with a polar mobile phase (solvent)
MEKANISME PEMISAHAN FRAKSI SOLUTE DLM KOLOM HPLC
FRAKSI HASIL PEMISAHAN SENY. DGN HPLC KOLOM PAK.
CONTOH UTK ANALISA ASAM AMINO DENGAN METODE HPLC: • ADA 2 TAHAP: 1. TAHAP PERSIAPAN SAMPEL 2. TAHAP ANALISA KROMATOGRAFI 3. TAHAP PERSIAPAN SAMPEL: ADA 2 TAHAP: 1. TAHAP ANALISA ASAM AMINO BEBAS YG MEMANG ADA DLM SAMPEL: MISAL, DALAM KECAP ATAU PRODUK FERMENTASI LAINNYA.
• 2. TAHAP ANALISA TOTAL ASAM AMINO YANG MELIPUTI: ASAM AMINO BEBAS + ASAM AMINO YANG TERIKAT SEBAGAI MOLEKUL PROTEIN DLM PRODUK PANGAN. • PERSIAPAN SAMPEL UTK ASAM AMINO BEBAS: • SAMPEL PADAT: DIHALUSKAN DGN MORTAR, KEMUDIAN SAMPEL DIEKSTRAK DGN 0,1 N HCL, CAMPURAN DI SARING DGN ULTRAFILTASI BARU FILTRAT DIINJEKSIKAN KE HPLC
PERSIAPAN SAMPEL PADAT UTK TOTAL ASAM AMINO. • 1. METODE ASAM: SAMPEL HALUS DICAMPUR DGN 6 N HCL dan dimasukkan dalam gelas ampul, dialiri gas nitrogen, ampul gelas di sealed dgn api bunsen. Ampul gelas dimasukkan oven 110 oC selama 20 jam. • Atau sampel diektrak dgn 6 N HCL selama 24, 48 atau bahkan 72 jam. Tgt manual atau kuat tidaknya ikatan asam amino dlm polipetida.
KERUGIAN METODE 6 N HCL • ASAM AMINO TRYPTOPHAN, RUSAK. SEBAGIAN CYSTEIN DAN METHIONINE JUGA RUSAK OLEH HIDROLISA ASAM HCL 6 N.
METOD LAIN: HIDROLISIS BASA • SAMPEL HALUS DIEKSTRAK DGN 4,2 N NaOH DIMASUKKAN DALAM AMPUL GELAS, DI SEALED, DIBEKUKAN DALAM ES KERINGALKOHOL. KEMUDIAN DIPINDAHKAN KE TABUNG GELAS KHUSUS (Oehlhlegel glass), agar hidrolisat bisa divakuumkan (0,18 mm Hg). SESUDAH GELAS INI DIPINDAHKAN KE SUHU KAMAR, DIMASUKKAN OVEN 110 OC SELAMA 16 JAM.
METODE BASA KHUSUS DILAKUKAN UTK: • RECOVERY: TRYPTOPHAN, DIMANA DGN METODE 6 N HCL SELAMA 22/48 JAM, 100% ASAM AMINO TRYPTOPHAN RUSAK ALIAS 0%.
TEORI KUANTITATIF HPLC PROF. SIMON BW Ph.D. Dept. food technology UB
RESPON DETEKTOR • RD = AGAR HUB ANTARA BANYAKNYA SAMPEL YG DIINJEKSIKAN DGN RD DAPAT DIKETAHUI • RD DIPENGARUHI OLEH: • TIPE DETEKTOR, JENIS KOLOM, MERK KROMATOGRAFI DAN JENIS SENYA YG DISELIDIKI • UNTUK MENENTUKAN RD BERAT SENY. STANDARD MISALNYA: CAMP. GLUKOSA, FRUKTOSA, SUKROSA DAN LAKTOSA HARUS DIKETAHUI
• DENGAN PENGENCERAN YG DIKETAHUI • SEJUMLAH VOLUME EKSTERNAL STANDARD DIINJEKSIKAN KE MESIN HPLC. • INJEKSI HARUS DILAKUKAN BEBERAPA KALI AGAR DIPEROLEH HASIL YG TELITI. • TEHNIK INJEKSI VOLUME SAMPLE/STD JUGA HARUS BENAR BENAR TELITI, AGAR DIPEROLEH RD YG BENAR DAN VALID.
• SETELAH DIPEROLEH KROMATOGRAM, LUAS MASING MASING PUNCAK PER SATUAN BERAT DITENTUKAN • RD = LUAS PUNCAK SAMPEL/BERAT SAMPEL • RD = LUAS PUNCAK STD/BERAT STD • UTK MENDAPATKAN FAKTOR KOREKSI: MISAL RD STD GLUKOSA = 352 UNIT LUAS/ug, maka • F = RD SENY/RD SENY STD ATAU • F= RD SENY/352 • UNTUK MENGHITUNG BERAT SENY SCR QUANTITATIVE: LUAS PUNCAK KROMATOGRAM SENY- F.
• NORMALISASI INTERNAL: • KOMPOSISI SUATU CAMPURAN DINYATAKAN DLM % LUAS THD JUMLAH LUAS PUNCAK SELURUH KOMPONEN. MISAL KOMPONEN/SENY A (GLUKOSA) MEMILIKI LUAS PUNCAK 10 UNIT, SEDANG JUMLAH LUAS PUNCAK SELURUH KOMPONEN DLM SAMPEL 100, MAKA DALAM CAMPURAN SAMPEL TSB TERDAPAT : 10/100 x 100% = 10%.
• CARA INI/NORMALISASI INTERNAL INI MEMILIKI KELEMAHAN: YAITU SEMUA LUAS PUNCAK KOMPONEN HARUS DIUKUR, AGAR PENGUKURAN AKURAT. DAN SEMUA PUNCAK HARUS DIKETAHUI RESPONNYA / RD. • NAMUN DALAM PRAKTEK KELEMAHAN ITU BISA DIABAIKAN.
JENIS STANDARD • Senya. Std eksternal: • Cara ini dpt memberikan hasil baik bila: senya. STD dan sampel diinjeksikan beberapa kali 2-3 kali lalu dihitung RATA-2 NYA. • JUMLAH STD dan SAMPEL yg diinjeksikan harus mendekati (misal: ± 2 uL) • Kelemahan tehnik ini: lebih cocok utk analisis satu seny. (mono sakarida saja/ atau lainnya) • Namun dalam praktek STD EKSTERNAL INI yg paling banyak dipakai.
• STD INTERNAL, CONTOH: 5-metiltryptophan, alphametil tryp. • Cara ini paling baik untuk mendapatkan hasil yg akurat dan dianjurkan, ASAL MEMENUHI SYARAT-2 TERTENTU: • 1. SENY. STD HARUS TERELUSI TERPISAH DARI MASINGMASING KOMPONEN PENYUSUN SAMPEL, TAPI TIDAK JAUH DARI PUNCAK KOMPONEN YG DICARI/ SEBAIKNYA DIANTARA KOMPONEN YG DICARI. • 2. SENY STD HARUS MEMILIKI GUGUS FUNGSIONAL YG SERUPA/SENY YG SERUPA DGN KOMPONEN YG DICARI. • 3. SENY STD HARUS STABIL DLM KONDISI ANALISIS DAN TIDAK BEREAKSI DGN SAMPEL YG DIANALISIS
• SENY. STD INTERNAL DITAMBAHKAN DLM SAMPEL DAN DIKETAHUI BERATNYA/VOLUMENYA. • BERAT STD YG DI+KAN DLM SAMPEL HARUS SEBANDING DGN BERAT SAMPEL. • UNTUK MENGHITUNG BERAT MASING MASING FRAKSI KOMPONEN SAMPEL, LUAS PUNCAK DARI SENY. STD DIPAKAI SBG PEMBANDING.
• • • • • •
LANGKAH : 1. MENYIAPKAN LAR STD 2. MENYIAPKAN LAR SAMPEL 3. INJEKSIKAN LAR STD 4. INJEKSIKAN LAR SAMPEL 5. MENGHITUNG MASING- 2 PUNCAK STD & KOMPONEN SAMPEL • 6. MENENTUKAN BESARNYA FAKTOR KOREKSI (F) UTK MASING-2 KOMPONEN • 7. F komponen= RD SENY/RD SENY. STD.
• 8. MENCAMPURKAN LAR STD + LAR SAMPEL, INJEKSIKAN KE MESIN HPLC • 9. HITUNG MASING-2 BERAT KOMPONEN: • KADAR KOMPONEN (% berat) = • Luas puncak komponen X berat STD X 100% • F X Luas puncak STD X berat sampel
