Tabel 12 Definisi operasional

Tabel 12 Definisi operasional Variabel Usia

Definisi Operasional Usia dihitung sejak lahir

Alat Ukur Kuesioner

Cara Ukur Wawancara

hingga ulang tahun terakhir

Hasil Ukur < 50 thn 51 – 55 thn >55 thn

Pendidikan

Lama sekolah yang berhasil

Kuesioner

Wawancara

diselesaikan responden

Lulus SD Lulus SMP Lulus SMA Lulus Akd/S-1

Pekerjaan

Aktivitas di dalam atau

Kuesioner

Wawancara

diluar rumah yang

Bekerja Tidak bekerja

menghasilkan uang Pengeluaran

Besarnya rupiah yang

Kuesioner

Wawancara

dikeluarkan perkapita per

< rata-rata > rata-rata

bulan Suku

Asal daerah orang tua

Kuesioner

Wawancara

Sunda Jawa Minang, dll

Lama menopause

Pengetahuan gizi

Dihitung sejak terakhir kali

Kuesioner

Wawancara

Lama nya

menstruasi hingga saat

menopause

penelitian dimulai

dalam tahun

Nilai yang diperoleh setelah

Kuesioner

Wawancara

Kurang

menjawab pertanyaan

<60% benar

tentang gizi

Sedang 60%-80% benar Baik >80% benar

Konsumsi

Jumlah dan jenis makanan

Form food

yang dikonsumsi dalam satu

record

Pengisian

< AKG > AKG

hari yang disajikan dalam persentase total dari Angka Kecukupan Gizi Status Gizi (IMT)

Rasio antara berat badan

Timbangan

Menimbang BB

Kurus: <18.5

dalam kg dengan tinggi badan

BB SECA

responden dengan

Normal: 18.5 –

dalam meter kuadrat. Rumus

dan pengukur

timbangan SECA

25

: BB (kg)/TB2 (m)

tinggi

dan TB dengan

Gizi lebih: 25 –

microtoise

microtoise

27 Obesitas: >27

17

Variabel

Definisi Operasional

Alat Ukur

Cara Ukur

Hasil Ukur

Tekanan darah

Hasil pengukuran sistolik dan

Tensi meter

Mengukur

Hipertensi: sistolik

diastolic yang dilakukan pada

tekanan darah

>140 mmHg dan atau

posisi duduk setelah

pada lengan

diastolik <90 mmHg

beristirahat minimal 10 menit

bagian atas

Non hipertensi: sistolik <140 mmHg dan diastolik < 90 mmHg

Genetik

Penyakit yang diturunkan dari

Kuesioner

Wawancara

Ada: jika salah satu

salah satu orang tua atau

keluarga yang lebih

saudara yang lebih tua

tua mengalami salah satu jenis pyk degeneratif Tidak ada: jika tidak ada anggota keluarga yang terkena pyk degeneratif

Merokok

Kebiasaan merokok yang

Kuesioner

Wawancara

dilakukan sehari-hari

Ya: jika saat penelitian sampel terbiasa merokok Tidak: jika saat penelitian sampel tidak merokok

Aktivitas fisik

Kegiatan olah raga yang

kuesioner

Wawancara

dilakukan secara rutin dalam

Jarang (<3x/mg) Sering (>3x/mg)

satu minggu K-Total

Kadar kolesterol dalam serum

Analisis

Pengambilan

darah

laboratorium

darah lewat

Rasio

vena dan dianalisis di Lab K-LDL

Kadar LDL dalam

Analisis

Pengambilan

serum darah

laboratorium

darah lewat

Rasio

vena dan dianalisis di Lab K-HDL

Kadar HDL dalam

Analisis

Pengambilan

serum darah

laboratorium

darah lewat

Rasio

vena dan dianalisis di Lab

18

Variabel

Definisi Operasional

Alat Ukur

Cara Ukur

Trigliserida

Kadar trigliserida dalam

Analisis

Pengambilan

serum darah

laboratorium

darah lewat vena

Hasil Ukur Rasio

dan dianalisis di Lab SOD

Kadar enzim superoksida

Analisis

Pengambilan darah

dismutase dalam serum darah

laboratorium

lewat vena dan

Rasio

dianalisis di Lab Zinc

Kadar Zn dalam serum darah

Analisis

Pengambilan darah

laboratorium

lewat vena dan

Rasio

dianalisis di Lab MDA

Kadar MDA dalam

Analisis

Pengambilan darah

serum darah

laboratorium

lewat vena dan

Rasio

dianalisis di Lab Oksidasi LDL

Kadar oksidasi LDL dalam

Analisis

Pengambilan darah

serum darah

laboratorium

lewat vena dan

Rasio

dianalisis di Lab

19

SUPEROXIDE DISMUTASE Kit by Northwest, Vancouver Prinsip Metoda ini di dasarkan pada monitoring laju auto-oksidasi dari hematoxilin, dengan modifikasi untuk meningkatkan robustness dan reliability. Adanya enzim SOD pada pH spesifik, laju auto-oksidasi dihambat dan persentase dari hambatan adalah linier pada jumlah SOD yang ada pada kisaran spesifik. Prinsip dasar dari pengukuran dirumuskan sebagai berikut. O2 + HTH2

SOD XX

H2O2 + HT (Abs 560 ↑)

Alat yang dibutuhkan - Cuvet semi-midro (1.0 mL) - Tabung mikrosentrifugas - Botol - Pipet (0.0 – 1.0 mL) - Tips pipet

Prosedur 1. Tambahkan 230 µL assay buffer dalam well sampel 2. Tambahkan 10 µL assay buffer (untuk blanko) atau 10 µL sampel. Mix dan inkubasi 2 menit 3. Tambahkan 10 µL hematoxylin reagent untuk memulai reaksi. 4. Mix dengan cepat menggunakan shaker dan segera mulai pembacaan dengan panjang gelombang 560 nm setiap 10 detik atau interval waktu yang pendek, setidaknya 5 menit. Catatan : Laju reaksi seharusnya akan linier sekitar 10 menit. Penghitungan aktivitas SOD menggunakan rumus sebagai berikut : 1. Y = aX + b 2. Rate (Abs 560nm /min) = (Y2 – Y1)/(X2 – X1) 3. Ratio s/b = Rates/Rateb 4. % Inhibition = (1 – Ratios/b) *100% 5. (SOD U/mL) s = 1.25 * (% inhibition) 6. (SOD U/mL) os = (SOD U/mL)s * (Sample dilution factor)

Kolesterol Kolesterol total diperiksa dengan menggunakan monotest Cholesterol CHOD-PAP, dengan metoda enzimatik kolorimetrik dengan batas normal < 200 mg/dl. Kolesterol ditentukan secara enzimatik menggunakan kolesterol esterase dan kolesterol oksidase. Sampel di tuang dalam kuvet kecil ditambah reagent kolesterol, diletakkan dalam alat dan pembacaan dimulai, nilai akan keluar secara digital.

Trigliserida Trigliserida diperiksa dengan menggunakan pemeriksaan enzimatik kolorimetrik “trigliserida GPO-PAP” dengan batas normal < 150 mg/dl. Sampel di tuang dalam cuvet, dan ditambahkan buffer/4-chlorophenol/enzymes

dan

pembacaan dimulai serta nilai akan keluar secara digital.

K-HDL Pemeriksaan K-HDL dilakukan dengan menggunakan metoda HDL Cholesterol, no pretreatment, secara homogeneous enzymatic colorimetric dengan batas normal 40 mg/dl. Sampel dituang dalam cuvet dan ditambahkan R1 dan R2 (PEG-modified enzymes/4-amino-antipyrine/buffer) dan pembacaan dimulai, nilai akan keluar secara digital.

K-LDL Pemeriksaan K-LDL dilakukan dengan menggunakan metoda LDL cholesterol CHOD-PAP dengan atas normal 130 mg/dl. Sampel dituang dalam cuvet dan ditambahkan reagent K-LDL dan pembacaan dimulai, nilai akan keluar secara digital.

ANALISIS ISOFLAVON (INA Method 118.000) Prinsip Contoh diekstrak pada suhu 65oC selama 2 jam dengan alcohol/methanol 80% dan dilakukan penyabunan pada temperature ruang dengan NaOH 2N selama 10 menit kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan asam acetat glacial, kemudian hasil ekstrak disaring, diencerkan dan di sentrifus. Dianalisis dengan HPLC kolom C18, dengan fase gerak methanol air dan asam asetat. Contoh dibaca pada panjang gelombang 260 nm.

Persiapan contoh: Untuk sampel yang konsentrasi proteinnya tinggi, diusahakan penimbangan 1 gram protein.

Timbang 300 mg contoh ke dalam tabung centrifuge, tambahkan 40 ml methanol 80% , tutup, kocok pada suhu 65oC selama 2 jam. Dinginkan pada temperatur ruang, tambahkan 3 ml NaOH 2N, tutup dan kocok selama 10 menint pada orbital sheaker, tambahkan 1 ml asam asetat glacial, putar agar tersuspensi. Encerkan menjadi 20 ml dengan methanol. Pusingkan selama 10 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Dengan standar > 40% isoflavon, ambil 1 ml encerkan ke dalam 10 ml methanol 80%.

Kondisi alat HPLC detector UV 260 nm Flow rate 0.8 ml/menit Coloum temperature 30 oC Coloum C18, gradiant, injection volume 10 µL

OXIDIZED LDL ELISA (Kit by Mercodia, Swedia) PRINSIP PENGUKURAN Mercodia Oxidized LDL ELISA merupakan pengukuran imunologi dari 2 sisi enzim dalam fase padatan. Pengukuran ini didasarkan pada tehnik direct sandwich, dimana 2 antibodi monoclonal digunakan untuk memisahkan titik antigenic pada molekul oxidized apolipoprotein B. Selama inkubasi oxidized LDL dalam sampel bereaksi dengan antibody anti-oxidized LDL microtitration well. Setelah pencucian, yang mana menghilangkan komponen-komponen plasma nonreaktif, antibody peroxidaxe conjugated anti-human apolipoprotein B mengenali fase padatan dari oxidized LDL. Setelah inkubasi kedua dan tahapan pencucian berikutnya yang menghilangkan antibody enzim terlabel yang tidak terikat, ikatan konjugat dideteksi oleh reaksi dengan TMB. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam untuk memberikan titik akhir kolorimetrik, selanjutnya dibaca dengan spektrofotometer.

ALAT DAN BAHAN  Mikropipet 25 μL dengan disposable tips  Pipet 50, 100, 200, 1000 μL  Gelas kimia dan silinder untuk preparasi sampel  H2O steril  Test tubes dengan tutup 3.5 mL  Microplate reader filter 450 nm  Shaker  Microplate washing device  Vortex

REAGENT Setiap Mercodia Oxidized LDL ELISA kit mengandung reagent untuk 96 wells, tersedia untuk 40 sampel, 2 kontrol, dan 1 kurva calibrator (duplo). a. Coated Plate – 1 plate, 96 wells, ready to use (mouse monoclonal anti-oxidized LDL) – 8-well

Untuk mikcroplate wells yang tidak digunakan, tutup kembali dengan isolasi dan dapat digunakan dalam jangka waktu 2 bulan. b. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 – 5 vials, 1000 L, Lyophilized Konsentrasi terdapat pada label. Warna kode kuning. Ditambahkan 1000 μL H2O steril per vial. c. Calibrator 0 – 1 vial, 1000 μL, ready to use Warna kode kuning. d. Control (L), (H) – 2 vials, 1000 L, Lyophilized Konsentrasi tercantum pada label. Ditambahkan 1000 L H2O steril per vial. e. Enzyme Conjugate 11x – 1 vial, 1.2 mL, Preparation (Peroksidase conjugated mouse monoclonal anti-apoB) f. Enzyme Conjugate Buffer – 1 vial, 12 mL, ready to use Kode warna biru. g. Assay Buffer – 1 vial, 12 mL, ready to use Kode warna merah. h. Sampel Buffer 4x – 1 botol, 50 mL Kode warna kuning. Dilarutkan dengan 150 mL H2O steril untuk membuat sampel buffer. Catatan! Endapan mungkin terbentuk ketika disimpan pada suhu 2 – 8 0C. Biarkan Sampel Buffer 4x hingga mencapai suhu ruang. Shake atau vortex hingga endapan terlarut kembali. i. Wash Buffer 21X – 1 botol, 40 mL Dilarutkan dengan 800 mL H2O steril untuk membuat wash buffer j. Substrate TMB – 1 vial, 22 mL, ready to use Tidak berwarna. Catatan! Sensitif terhadap cahaya! k. Stop Solution – 1 vial, 7 mL, ready to use 0.5 M H2SO 4

PERSIAPAN ENZYME CONJUGATE SOLUTION Siapkan sejumlah volume enzyme conjugate solution yang dibutuhkan dengan melarutkan enzyme conjugate 11x (1+10) dalam enzyme conjugate buffer seperti pada table. Jika ingin menyiapkan enzyme conjugate solution untuk seluruh plate,

tuangkan seluruh enzyme conjugate buffer kedalam vial enzyme conjugate 11x. Campurkan hingga merata.

KOLEKSI SPESIMEN DAN PERLAKUAN Spesimen ynag direkomendasikan untuk digunakan adalah fresh EDTA-plasma, heparin-plasma, dan serum. Plasma Koleksi darah kemudian masukkan dllam tabung yang mengandung EDTA atau heparin sebagai anti-koagulasi, dan pisahkan fraksi plasma. Sampel dapat dismpan pada suhu -80 0C selama-lamanya 6 bulan. Hindari pembekuan dan pencairan yang berulang-ulang. Serum Koleksi darah, biarkan menggumpal, dan pisahkan serum dengan sentrifugasi. Sampel dapat disimpan pada suhu -80

0

C paling lama 6 bulan . Hindari

pembekuan dan pencairan yang berulang-ulang.

PREPARASI SAMPEL Sampel harus dilarutkan pada hari yang sama saat pengukuran dilakukan. Siapkan 2 tabung untuk setiap sampel pasien. Setiap sampel harus dilarutkan dalam 2 tahapan hingga mencapai larutan akhir 1/6561, sebagai berikut : 1. Pembuatan larutan 1/81. 25 μL sampel pasien dimasukkan dalam tabung, ditambahkan 2000 μL sampel buffer kemudian ditutup dan dicampurkan sempurna (invert 3x, vortex). 2. Pembuatan larutan 1/6561. 25 μL larutan 1/81 dimasukkan dalam tabung, ditambahkan 2000 μL sampel buffer, kemudian ditutup dan dicampurkan sempurna (invert 3x, vortex).

PROSEDUR Semua reagent dan sampel harus berada di suhu ruang sebelum penggunaan. Siapkan kurva standar setiap kali pengukuran. 1. Siapkan enzyme conjugate solution, sampel buffer, wash buffer dan sampel.

2. Siapkan Coated Plate wells yang tersedia untuk calibrators, controls, dan sampel (duplo). 3. Pipet calibratos, controls, dan diluted sampel masing-masing 25 μL kedalam wells. 4. Tambahkan 100 μL assay buffer pada setiap wells. 5. Inkubasi plate pada shaker (700-900 rpm) selama 2 jam pada temperatur ruang (18-25 0C). 6. Cuci sebanyak 6 kali dengan pencuci otomatis atau masukkan setiap sumuran dengan 350 μL wash buffer. Hilangkan cairannya dan ulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, balik dan tepukkan palte pada tisu. 7. Tambahkan 100 μL enzyme conjugate solution pada setiap wells. 8. Inkubasi plate pada shaker selama 1 jam pada temperatur ruang (18-25 0

C).

9. Cuci kembali sebanyak 6 kali dengan pencuci otomatis atau masukkan setiap sumuran dengan 350 μL wash buffer. Hilangkan cairannya dan ulangi sebanyak 5 kali. 10. Tambahkan 200 μL substrate TMB. 11. Inkubasi selama 15 menit pada temperatur ruang (tanpa shaker). 12. Tambahkan 50 μL stop solution, shaker selama 5 detik untuk memastikan pencampuran. 13. Baca absorbansinya pada 450 nm dan analisa. Pembacaan harus dilakukan + 30 menit.

Catatan! Untuk menghindari kontaminasi antara conjugate dan substrate, gunakan pipet yang berbeda.

SKEMA KERJA PENGUKURAN OXIDIZED LDL ELISA (Mercodia Kit)

Calibrators, Controls, Diluted Sample -

Diambil dengan pipet masing-masing sebanyak 25 μL dan dimasukkan kedalam wells yang telah tersedia

-

Ditambahkan masing-masing wells dengan 100 μL assay buffer

-

Diinkubasi dengan dishaker (700-900 rpm) selama 2 jam pada T ruang (18-25 0C)

-

Ditambahkan masing-masing wells dengan 350 μL wash buffer, dihilangkan cairannya dan diulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, microplate dibalik dan ditepukkan pada tisu.

-

Ditambahkan masing-masing wells dengan 100 μL enzyme conjugate solution.

-

Diinkubasi dengan dishaker selama 1 jam pada T ruang (18-25 0C)

-

Ditambahkan masing-masing wells dengan 350 μL wash buffer, dihilangkan cairannya dan diulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, microplate dibalik dan ditepukkan pada tisu.

-

Ditambahkan masing-masing well dengan 200 μL substrat TMB

-

Diinkubasi selama 15 menit pada T ruang (tanpa dishaker)

-

Ditambahkan masing-masing well dengan 50 μL stop solution, shaker selama 5 detik untuk memastikan pencampuran.

-

Dibaca absorbansinya pada 450 nm (pembacaan harus dilakukan dalam + 30 menit)

-

Dianalisa

Calibrators, Controls, Diluted Sample