1 Alkalmazásra került FONTOSABB IPARI MIKROBIOLÓGIAI ELJÁRÁSOK Il n y a pas des sciences appliquées. Mais il y a des applications de la science Louis...
Alkalmazásra került FONTOSABB IPARI MIKROBIOLÓGIAI ELJÁRÁSOK
“Il n y a pas des sciences appliquées. Mais il y a des applications de la science” Louis Pasteur
SZENTIRMAI ATTILA Prof. Emeritus DE-TTK Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék
2000 Biomérnök Tsz.
2011
Ipari mikrobiológia Piacképes gyógyászati és élelmiszeripari termékek előállítása a mikrovilág választott képviselőinek élettani viszonyait befolyásolva. Frissitve: {12.09.10} 235 oldal 1
The laws of applied microbiology The microorganism is always right The microorganism is your friend The microorganism is a sensitiv partner There are no stupid microorganisms Microorganisms can do anything Microorganisms are smarter, wiser and more energetic than chemists, engineers and biologists If you take care of your microbial friends, they will take care of your future
David Perlman 1960
Ki volt Pasteur? Luis Pasteur (1822-95)Strasbourgban kémia tanár. PhD kutató munkája a dl borkősav vizsgálata 1842. Ekkor találkozott az optikai aktivitás biológiai vonatkozásaival. Az ipari gyakorlat biológiai problémáival foglalkozott. 1857 tejsav fermentáció 1864 pasztörözés 1865 selyemhernyóvész 1866 bortermelés 1868 ecetsavgyártás 1876 sörgyártás 1877 a lépfene leküzdhető más mikroorganizmussal Joubert, Pasteur 1880 immunológiai védelem lépfene, baromfi-kolera ellen
2
KÜZDELEM A MIKROBIÁLIS KÓROKOZÓK ELLEN 4. A KEMOTERÁPIA TUDATOS ALKALMAZÁSA 9. A PENICILLIN FELFEDEZÉSE 10. AZ ANTIBIOTIKUMOK (SZEKUNDER METABOLITOK) A TERÁPIÁBAN 11. ß-LAKTÁM SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK BIOLÓGIAI-KÉMIÁJA 15. AZETIDINON SZERKEZETŰ VEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA, TÖRZSFEJLESZTÉS 18. ÚJABB β-LAKTÁM SZERKEZETÜ BIOLÓGIAILAG AKTÍV METABOLITOK FELFEDEZÉSE 21. PENICILLIN GYÁRTÁS 28. A PENICILLINÁZ 31. P4NICILLIN ALLERGIA 33. A β-LAKTÁM SZERKEZETŰ VEGYÜLETEK, A PENICILLIN BIOSZINTÉZISE 42. GYŰRŰ TÁGÍTÁS RING EXPANDÁZ (REX) CEPHEM VÁZ KÉPZŐDÉSE 48. A PENICILLIN KÉMIAI SZINTÉZISE. 48. PENICILLIN ANALÓGOK ELŐÁLLÍTÁSA FÉLSZINTÉZISSEL 57. GLYCOPEPTID ANTIBIOTIKUMOK: VANCOMYCIN, TEICOPLANIN 62. D-CIKLOSZERIN 66. FOSZFONOMYCIN 67. PEPTID JELLEGŰ ANTIBIOTIKUMOK (DEPSZIPEPTIDEK) 68. GRAMICIDIN-S 70. BACITRACIN 72. VIRGINIAMYCIN 75. NISIN 76. BLEOMYCIN 78. ACTINOMYCIN-D 81 CYCLOSPORIN-A; IMMUNSZUPRESSZÍV ANYAG HATÁSMÓDJA 90. NOVOBIOCIN 90. ANSA-LÁNCÚ ANTIBIOTIKUMOK CSOPORTJA 94. RIBOSZÓMÁLIS FEHÉRJESZINTÉZIST GÁTLÓ METABOLITOK 95. CHLORAMPHENICOL 97. AMINOGLIKOZID ANTIBIOTIKUMOK 109. MAKROLID ANTIBIOTIKUMOK 112. THIOSTREPTON 115. POLIKETID KÖZTESTERMÉKBŐL KÉPZŐDŐ METABOLITOK CSOPORTJA 117. TETRACIKLIN TIPUSÚ ANTIBIOTIKUMOK 124. KOLESZTERINSZINT CSÖKKENTŐ FARMAKONOK; SZTATINOK 126. GRIZEOFULVIN 128. POLIÉTERKARBONSAV SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK 1 129. FUNGISZTATIKUMOK POLIÉNEK, ACTIDION FUMAGILLIN 135. TERPÉNEK - FUSIDINSAV 134. GIBERELLINSAV 140.RÁKOS MEGBETEGEDÉSEK ELLEN HATÁSOS ANTIBIOTIKUMOK CSOPORTJA 143. AZ ANTIBIOTIKUM KÉPZŐDÉS LEHETŐSÉGE ÉS FELTÉTELEI 146. FARMAKOLÓGIAILAG HATÁSOS ANYAGOK 148. MIÉRT ÉPPEN A STREPTOMYCESEK 151. ÚJ ANTIBIOTIKUM ELŐÁLLÍTÁS (KUTATÁS) MŰVELETEI 154. ELJÁRÁS PRIMER METABOLITOK ELŐÁLLÍTÁSÁRA CITROMSAV ELŐÁLLÍTÁSA 165. GLUTAMIN SAV ELŐÁLLÍTÁSA 171. ESSZENCIÁLIS AMINOSAVAK ELŐÁLLÍTÁSA 182. ARÓMÁS AMINOSAVAK ELŐÁLLÍTÁSA 193. ASPARTAM ELŐÁLLÍTÁSA 194. LAKTOBACILLUSOK ENZIMRENDSZEREINEK HASZNOSÍTÁSA 196. CLOSTRIDIUMOK 198. ALKOHOLOS ERJESZTÉS 213. ECETSAVGYÁRTÁS 218. CIANOCOBALAMIN B12 228. GLÜKONSAV ELŐÁLLÍTÁS 230. KÖRNYEZETET SZENNYEZŐ ANYAGOK BIOLÓGIAI HASZNOSÍTÁSA
3
A KEMOTERÁPIA TUDATOS ALKALMAZÁSA A kemoterápiai kutatások elméletének kialakítása és az első gyakorlati eredmények elérése Paul Ehrlich nevéhez kötődik (1854-1915). Munkatársaival fáradhatatlanul és tudatosan kereste azokat a vegyületeket, amelyek a mikroszervezetek szaporodását olyan koncentrációban gátolják, amelyet még a gazdaszervezet károsodás nélkül elvisel. Felismerte a hatóanyag és a hatáshely közötti fizikai, illetve kémiai kapcsolat szükségességét. Corpora non agunt nisi fixata - A testek nem hatnak, hacsak nem kötődnek. Iskolát teremtve kialakította a gyakorlati gyógyszerkutatás módszertanát, technikáját. A sikereken felbuzdulva a gyógyszerészeti kutatás művelői úgy vélték, hogy kellő ötletgazdagsággal végzett kísérleti munkával megtalálhatók azok a kémiai szintézissel előállítható vegyületek, amelyekkel az élő szervezetet fertőző kórokozók leküzdhetőkké válnak. Kísérleti módszerük szerint a kórokozóval fertőzött állatokba juttatták a hatásosnak vélt vegyület különböző mennyiségét, meghatározva a túlélés százalékát. Egészséges állatokba juttatott hatóanyaggal pedig vizsgálták a vegyület toxicitását. Az eredmények mérhetősége, számszerűsítése a biológiában bevezetett 50%-os hatás meghatározását jelenti. Ez a technika reprodukálható módszerként lehetőséget ad a hatásos (effektív) dózis (ED50) és a gyilkos (letális) dózis (LD50) meghatározására, amely adott időn belül a fertőzött állatok 50%-ának túlélését, illetve az egészséges állatok 50%-ának pusztulását okozza.
A kísérleti eredményeket mutató ábra a testsúly kilogrammra vonatkozó hatóanyag mennyiségének az állatok pusztulási görbéjére kifejtett hatását mutatja. A statisztikailag értékelhető számban felhasznált kísérleti állatot olyan mértékben fertőzték, hogy belátható időn belül közel azonos időpontban elpusztuljanak. Ennek érdekében azonos érzékenységű, azonos korú, azonos tömegű állatok kerülnek felhasználásra. Gyógyászati alkalmazásra az a vegyület számíthat, amelynek az ED50 és az LD50 értéke közötti érték (távolság) jelentős. A hatásos anyag bevitele történhet a tápcsatornán keresztül (per os) a gyomorban és a vékonybélben, illetve a véráramba juttatva vénába, (i.v.) vagy izomba (i.m.), illetve bőr alá (sub cutan) adva. Felszívódhat az anyag a nyálkahártyán keresztül. Ez esetben elkerüli a máj méregtelenítő hatását.
A szervezetbe juttatott anyag a bevitel sebessége és a kiürülés , illetve bomlás függvényében kialakít egy vérszintet amitől a hatás várható. A vese áteresztőképessége és a máj méregtelenítő hatása egyedi illetve faji variációt mutat. Ezért az aktuális vérszint meghatározása feltétlenül indokolt
4
Az antibiotikum kezelés esetén a terápiás vérszint elérésére törekedve a meghatározó paraméterek figyelembe vételével a terápiás hatáshoz szükséges küszöbérték felett kell tartani a hatóanyag koncentrációját. Naponta többször adagolva, vagy pedig olyan származékot használva amelynek kémiai stabilitása akár egy napon keresztül is képes a terápiás szintet biztosítani (lásd például az oxitetraciklin és vibramicin használatát)
Nemcsak tudománytörténeti, de szakmai szempontból is tanulságos röviden megismerkedni a kemoterápiai kutatás jelentősebb eredményeivel. Az Ehrlich által vezetett kutatócsoportnak (1909-ben Nobeldíj) az akkor népbetegségnek tekinthető igen súlyos következményekkel járó, Treponema pallidum okozta vérbaj (syphilis, lues) gyógyítására sikerült gyógyszert találni. Az Ehrlich-O. Hata 606 jelzésű, később Salvarsan néven forgalomba került vegyületük aromás arzénszármazék. A kevéssé toxikus készítmény csak in vivo mutat biológiai aktivitást. A gazdaszervezetben végbemenő oxidációval felszabaduló biológiailag aktív aromás arzén származék, a piroszőlősavból induló acetil-CoA szintézishez szükséges liponsavval reagál. A liponsav hiánya az egész ciklust blokkolva akadályozza a Treponema életműködését-
Liponsav felesleggel egyébként a gátló hatás felfüggeszthető.
5
A kemoterápiás kutatás jelentős eredménye volt a harmincas években a szulfonamidok felfedezése. A Mietzsch és Klarer által szintetizált prontosil biológiai hatását Domagk 1935-ben írta le. Ez a vegyület in vitro ugyancsak inaktív. A gazdaszervezetben alakul olyan hatásos vegyületté (p-aminobenzol-szulfonamid), amely a Streptococcus okozta fertőzések gyors leküzdésére sikerrel használható. A szulfonamidok vérszintjének alakulását, a vérminták hatóanyagtartalmát analitikai méréssel vizsgálják. Kiürülésük a vesén keresztül egyrészt változatlan alakban, másrészt acilezett formában vagy glükuronidként történhet. A metabolitok természetesen a kiürülés szempontjából előnyösebb helyzetben vannak. A képződő p-amino-benzolszulfonamid, mint p-amino-benzoesav (PAB) analóg, a fólsav szintézis gátlásán keresztül zavart okoz a kórokozó anyagcseréjében, reagál a dihidrofólsav egyik alkotórészével, a dihidropteridinnel. A képződő származék dihidropteridin-hiányt okozva végül is fólsav hiányt eredményez. Az emlős szervezetben ez az enzimreakció nem fordul elő. A szulfonamid csak a baktériumok anyagcseréjében okoz zavart, az emlős sejtet nem károsítja. A hazai gyógyszerpiacon a vegyület metiltiazol származéka ultraseptyl néven terjedt el. Az antibiotikumok elterjedése előtt a bakteriális fertőzés elleni küzdelem egyetlen, de igen hatásos fegyvereként tartották számon. A klinikai gyakorlatban 20-25 szulfonamid készítményt használnak. Ezek két csoportba sorolhatók. Az egyik csoportot alkotják a bélből nehezen felszívódó származékok, amelyeket bélfertőtlenítésre használnak. Ílyen a hazai piacon elterjedt sulfaguanidin. A másik csoportot alkotják a vízben jól oldódó, bélből felszívódó, nyújtott hatású készítmények. Ezek lassú kiürülésük miatt viszonylag tartósan hatásos vérszintet biztosítanak még napi egyszeri per os adagolás esetén is. Ilyen a több hazai szulfonamid készítményben alkalmazásra került 3-szulfa-5metil-izoxazol származék. A szulfonamidok bakterium spektruma meglehetősen széles. Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokon kívül az Actinomyces, Toxoplasma és Coccidium fajok, valamint a Plasmodium malariae ellen is felhasználhatók, sőt néhány Rickettsia szaporodását is gátolja (Trachoma, Lymphogranuloma psittacosis, Lymphocyticus choriomeningitis). Gyenge hatású viszont az Escherichia, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Brucella, Aerobacter fajokkal szemben. A szulfonamidokkal szemben is kialakulhat rezisztencia egyrészt a p-amino-benzoesav szintézis fokozódása útján, de gyakoribb oka a rezisztenciának a permeabilitási körülmények változása. Ezért nem előnyös alacsony dózisban adagolni a szulfonamid készítményeket. A forgalomba kerülő gyógyszerek hatásmechanizmusának részletes biokémiai vizsgálata, és a céltudatos kemoterápiai kutatás szép eredményeket hozott. prontosil
Jó példa erre a trimetoprim, a 2,4-diamino-5(3,4,5-trimetoxi-benzil)-pirimidin előállítása és biológiai hatásának a felismerése. Hasonló hatású rokon vegyület a pyrimetamin, a 2,4-diamino-5(p-klórfenil)-6-etilpirimidin. Mindkét pirimidin származék a szulfonamidokkal együtt adva azok hatását jelentősen fokozza (potencirozza). Általában szulfonamidokkal kombinálva alkalmazzák. Ilyen készítmény a sumetrolim.
6
Szerkezete bizonyos mértékig hasonlít a pteridin szerkezetéhez, így nem meglepő, hogy a szulfonamid fólsav szintézist zavaró hatását fokozni tudja a szintézist végző enzimek működésének gátlásával. A dihidrofólsav reduktázt gátolva megakadályozza a tetrahidrofólsav képződését. Ez az enzim nem csak a baktériumokban, de az emlős szervezetben is fontos szerepet tölt be. A trimetoprim tehát a gazdaszervezetet is károsítja.
Századunk közepén két kemoterápiás szer vált népszerűvé hazánkban. Mindkettő a tuberkulózis elleni küzdelemben került felhasználásra. Az egyik az 1946-ban felfedezett p-amino-szalicilsav (PAS) mint PAB analóg. A másik pedig az 1951-ben felfedezett baktericid tulajdonságú izonikotinsav-hidrazid (INH), amelynek szerkezete hasonlít a piridoxaminhoz, illetve a nikotinsavamidhoz. Feltételezhetően mindkét vitaminjellegű vegyület élettani hatását zavarja.
Széles spektrumú kinolon származékok közül emlitésre érdemes a vízben jól oldódó pefloxacin (1-etil-6-fluoro7-/4-metil-1-piperazinil/4-oxo-1,4-dihidro-3-kinolinkarbonsav moltömege: 465.5), amely tabletta és injekciós formában adagolható. Jellemző rá a posztantibiotikus hatás.Az antibiotikum /400 mg hatóanyagot tartalmazó tabletta/ 8-10 óra alatt bekövetkező kiürülése után még néhány órán keresztül a kezelést esetleg túlélt baktériumok sem képesek növekedni. A hatóanyag az RNS magra feltekeredett DNS fellazítását végző giráz működését gátolva fejti ki baktericid hatását. Szepszis, szívbelhártya és agyhártya gyulladás esetén is hatásos. A hatóanyagnak a szervekben illetve a szövetekben kialakuló koncentrációját a következő oldalon található ábra szemlélteti.
Pefloxacin Nem felejtendő el, hogy a kemoterápia eredményei nem függetleníthetők a gazdaszervezet védekező mechanizmusának állapotától. A gyógyszerként felhasznált hatóanyagok csak csökkentik a korokozók életképességét. A végső eredményt az ellenanyagképző mechanizmus, az immunológiai védelem teljesítménye határozza meg. A gondolkodó ember a mikroszkóppal sem látható természeti Nalidix sav képződmények élettani hatásával, kórokozó tulajdonságaival jóval azelőtt találkozott, mintsem ezen lények vizsgálatára alkalmas eszközöket megalkotta volna a műszaki tudomány. A gyógyítani akaró orvosi hivatástudat több-kevesebb sikerrel felvette ezekkel az ismeretlen lényekkel a küzdelmet. A szervezet védekező mechanizmusát kihasználva, Edward Jenner az aktív immunizálást alkalmazta az orvoslás gyakorlatába, amikor 1796-ban elsőként a tehénhimlővel vakcinálva (vacca~tehén) védelmet tudott biztosítani az akkor még ismeretlen himlő (Pox) vírus ellen. — Luis Pasteur pedig 1880-ban az immunológiai védelem hatásos alkalmazását demonstrálta a lépfene korokozója, az Anthrax bacillus okozta fertőzés leküzdésére.
7
A piperazinil-kinolin-karbonsav hatóanyagnak a szervekben illetve a szövetekben kialakuló koncentrációja
8
AZ ANTIBIOTIKUMOK BIOLÓGIAI-KÉMIÁJA A PENICILLIN FELFEDEZÉSE A penicillint felfedező orvos - Alexander Fleming (1881-1955) - doktori disszertációját a magasabb rendűek által védekező anyagként termelt lizozim tulajdonságait vizsgálva készítette. Ez az enzim folytonosan termelődve az élőlény felületére került baktériumok sejtfalát feloldja, a sejtfal szénhidrát építőelemei közötti βglikozidos kötést hidrolizálja. A baktériumtenyészet penész hatására bekövetkező feloldódását látva, valamint a hatásos anyag hő és pH érzékenységét tapasztalva, Fleming valami lizozimhoz hasonló anyagra gondolt. A munkába kapcsolódó Dr. C. Thom mikológus rendszertanilag Penicillium notatum-mal, egy ritkán előforduló fajjal azonosítja az antibakteriális hatást mutató anyagot termelő fonalas gombát. Az antibakteriális tulajdonságú hatásos anyag kinyerése céljából végzett eredménytelen kísérleti munka után, 1932-ben Clutterbuck csak annyit közölhetett, hogy a penicillinnek elnevezett hatásos anyag labilis, pH és hő érzékeny gyenge sav. Az anyag hatásossága és elhanyagolhatóan csekély toxicitása azonban nem hagyta feledésbe merülni Fleming felfedezését, bár a nehézségeket látva maga sem bízott a sikerben. Az 1930-as évek végén csupán a tenyészet szűrletét javasolhatta külsődleges alkalmazásra. Az Oxfordban összekovácsolódott munkacsoport kitartó munkája, Chain és Florey erőfeszítései végül eredményre vezettek. Felületi tenyészetből elkülönített tenyészléből fagyasztva szárítva sikerült kielégítő stabilitású barna port nyerni, amellyel Abraham és munkatársai már bizonyíthatták az anyagnak a szeptikus folyamatok leküzdésében elért fantasztikusnak tűnő gyógyító hatását. Tiszta anyaggal nem rendelkezve, biológiai egységet használtak összehasonlítási alapként. Oxford-egységnek (NE) tekintették azt a legkisebb penicillin mennyiséget, amely egy bizonyos Staphylococcus törzs növekedését 50 ml táptalajban képes gátolni. Ez ma o.6 mg kristályos benzilpenicillin Na-sónak felel meg. Fleming 1940 november 14.-én a Gyógyszerészeti Társaság tudományos űlésén számolt be az eredményekről. Ezekkel az eredményekkel indult 1941 júliusában Florey és Heatley az Egyesült Államokba a kormány anyagi támogatását kérni az eredmények továbbfejlesztéséhez. A kormányszervek felismerték a téma katonai jelentőségét.(Az első világháborúban megsebesült katonák több mint 50%-a szepszisben halt meg!) A Pentagon a Northern Regional Research Laboratory (Peoria Illinois) fermentációs osztályán R. D. Coghill és A. N. Richards mikrobiológusokat bízta meg a téma vitelével. A termelő törzsek kiválasztásában az USA lakosságának a segítségét is igénybe vették. Közhasznú hazafias tevékenységgé vált a különböző helyekről származó gombatenyészetek eljuttatása a Mezőgazdasági Minisztérium által fenntartott NRRL törzsgyűjteményébe, ahol szorgalmas munkával minden tenyészet biológiai aktivitását megvizsgálták. Az összegyűjtött törzsek közül egy háziasszony által beküldött grép fruitról származó Penicillium notatum chrysogenum néven leírt tenyészet - a Fleming által izoláltnál 10-szer nagyobb biológiai aktivitást mutatott. Később (feltehetőleg szabadalmi okokból) a notatum előnév lemaradt. Ebből az izolátumból fejlesztették ki a gyógyszeripar fermentációs üzemeiben felhasználásra kerülő törzseket. Kezdetben négy gyógyszergyártó vállalat (Pfizer, Lederle, Merck, Squibb) és több kutató laboratórium, (Carnegie Institute, University of Minnesota, University of Wisconsin) kapcsolódott a munkába. A katonai titoktartás szabályait betartó együttműködés a különböző kutatóhelyek között tökéletes volt, A hadügyminisztérium szakemberei ezt az életmentőnek tűnő anyagot minél előbb a szövetséges hatalmak katonakórházaiba kívánták juttatni. Az anyagi és a szellemi erőfeszítés hamarosan eredményt hozott. 1943 májusában az új gyógyszert már 300 sebesült esetében alkalmazhatták teljes sikerrel a szepszis kialakulásának akadályozására, illetve gyógyítására. A katonai költségvetés a háború utolsó éveiben 30 millió dollárral támogatta a program sikerét. A munkában résztvevő kutatóhelyek száma közben 20-ra növekedett. A heti penicillin termelés 1943 végére elérte a 100 grammot (100 ezer NE penicillin akkor 20 dollárba került, ez ma 1 milliárd NE ára). A fejlődés ütemét jól mutatja, hogy 1944 végére a havi termelés meghaladta a 200 kg-ot, amely 1946-ban évi 32 tonnára emelkedett. 1944-ben már indokolt esetben a polgári kórházak számára is engedélyezték a hatásos anyag, a G-penicillin alkalmazását. 1944 júliusában a király a V-bombák rendszertelen érkezése miatt a királyi palota alagsorában rendezett ceremonia keretében tudományos érdemeit elismerve a neves tudóst lovaggá ütötte (Sir Alexander Fleming). Az első felhasználásra került termék mindössze 1% hatóanyagot tartalmazott. A tisztításban való előrehaladás a kémiai szerkezet felderítésének lehetőségét jelentette. Abban reménykedtek, hogy a kémiai szerkezet ismeretében a hatóanyag kémiai szintézisére lehetőséget találnak. A szerkezetkutatásban l944-ben már 59 kutatóhely vett részt teljes katonai titoktartás mellett. Ma már köztudott, hogy kutató munkát az zavarta, hogy a különböző laboratóriumokban előállított gombatenyészetek szűrletei több mint 20 különféle penicillin keverékét tartalmazták, amelyeket az angol alphabet betüivel jelöltek.. Az USA laboratóriumaiban előállított penicillin készítményeknek a fizikai-kémiai adatai jelentős mértékben eltértek az Angliában, szeszgyártási maradékon előállított készítmények vizsgálatakor nyert adatoktól. Az egyik esetben G-penicillin (benzilpenicillin), a másik esetben F-penicillin (pentenil-penicillin) volt a főtermék. Angliában a szeszgyártás maradékát (distillers solubl) használták táptalajként, az US kutatói viszont a fenilecetsavat is tartalmazó kukorica áztató lé tejsavas erjesztéssel dúsított koncentrátumát alkalmazták a táptalaj nitrogén forrásaként. A tenyésztő táptalaj kémiai összetételének meghatározó jelentőségét felismerve javasolták a prekurzorok alkalmazását. A tápközeghez adott fenilecetsav jelenlétében a kutató laboratóriumokban főleg benzil-penicillin képződött a tenyésztési ciklus második fázisában. 9
A második világháború után a penicillin előállításával a gyógyítás történetében új korszak kezdődött. Az orvosi gyakorlatban, a fertőző betegségek elleni küzdelemben addig nem tapasztalt forradalmi fejlődést jelentett az antibiotikumok megjelenése. Széleskörű gyógyászati alkalmazásuk az átlagéletkor meghosszabbodását jelentette. A genetikailag megalapozott egyéni különbségek, az öröklött ellenálló képesség szintjében jelentkező eltérés szelekciós hatása csökkent. Addig ritkábban előforduló halált okozó megbetegedések ennek következtében előtérbe kerültek (rák, keringési problémák). A gyermekhalandóság csökkenése, a szeptikus folyamatok kialakulásának megakadályozása, a fertőző betegségek leküzdése a lakosság életkori összetételét jelentősen megváltoztatta. Nem csekély mértékben az antibiotikumok használatának terjedése is hozzájárul a Föld népességének ugrásszerű növekedéséhez. Áttételesen a társadalmi átalakulásokra is hatással van. Hagyománytiszteletből antibiotikumnak nevezzük azokat a mikro-organizmusok életműködését gátló vegyületeket, amelyeket mikroorganizmusok termelnek. E vegyületek utáni kutatás és a kiválasztott vegyületek nagyipari előállítása a gyógyszeripar legdinamikusabban fejlődő ágát teremtette meg. Az antibiózis fogalma a biológiában régóta ismert, mint a szimbiózis ellentéte. A kifejezést először Vuillemin használta 1889-ben megjelent dolgozatában. Évezredes hagyomány és gyakorlati tapasztalat a tejsavas erjedés tartósító szerepének használata. A tejsav azonban nem tekinthető antibiotikumnak, mert elsősorban a közeg hidrogén ion koncentrációjának megváltozása — a kialakított savanyú élettér — akadályozza más mikroorganizmusok elszaporodását. Időszámításunk előtt 5-600 évvel készült kínai feljegyzések említik, hogy szójababon nőtt gombák nedvével furunkulusok, gennyes fertőzések leküzdhetők. A tudománytörténet Roberts 1870-ben közzétett dolgozatát tekinti az első antibiózisra utaló híradásnak, melyben leírja, hogy Penicillium glaucum tenyészetében nem növekednek a baktériumok. Később Tyndall közli, hogy bizonyos zöld színanyagot termelő baktériumok más idegen mikroorganizmusok szaporodását gátolva, képesek leküzdeni azokat. Joubert és Pasteur 1877-ben bejelenti, hogy apatogén mikroorganizmusokkal le tudják küzdeni a lépfene fertőzést. Pasteur dolgozatában a jövőt sejtve megállapítja, hogy ez a jelenség nagy reményekre jogosítja a gyógyászat művelőit. A szorgalmas kutatómunka ellenére több mint 50 év telik el Alexander Fleming (18811955) a St. Mary kórház bakterológusának 1929-ben megjelent dolgozatáig, amelyben leírja, hogy a Staphylococcus növekedését gátolva a tenyészet lízisét okozza egy levegőből származó penész által kiválasztott ismeretlen vegyület. Ilyen jelenséget valószínűleg több klinikai laboratóriumban észleltek már ezt megelőzőleg is, sőt közlésre is került több esetben mint figyelemreméltó tapasztalat, mégsem lett belőle piacképes termék. AZ ANTIBIOTIKUMOK MEGJELENÉSE A TERÁPIÁBAN Közel tíz év telik el a penész által termelt vegyület — a penicillin — első parenterális gyógyászati alkalmazásáig. Ettől az időponttól ugrásszerű a fejlődés. Mi volt vajon a kezdeti sikertelenség oka? Nem más, mint az, hogy a kémiai tevékenység modern módszerei, a kis mennyiségű anyagok ma már megoldott tisztítási eljárásai az időben ismeretlenek voltak, illetve még gyermekcipőben jártak. Nem utolsó sorban éppen a biológiailag aktív anyagok tisztítására való törekvés volt a serkentője e mikrokémiai módszerek fejlesztésének. Ezen időszakban a kutató kapacitás jelentős részét világszerte a szép eredményekkel dicsekvő (salvarzán, prontozil stb.) kemoterápia gyógyszeripar által támogatott fejlesztése vonta el. Ezek az évtizedek az antibiotikum kutatás szempontjából is haszonnal jártak, amennyiben ebben az időszakban a kemoterápiai módszerek tökéletesedésével egy új gondolkodásmód terjedt el a fertőzéses megbetegedések leküzdése területén. Tüneti kezelés helyett a kórokozó elpusztítására törekedtek a gazdaszervezet károsítása nélkül. Az elmúlt félszázadban felfedezett hatásos vegyületek száma meghaladja a tízezret, a gyógyászati alkalmazásra került antibiotikumok száma azonban alig éri el a százat. Biológiai szempontból a rendszertani csoportokra kifejtett hatásuk szerint oszthatjuk be őket baktérium ellenes, gomba ellenes, antivirális és citosztatikus hatású anyagokra. Hatásmód szerint megkülönböztethetünk: baktérium sejtfalszintézist gátló, membránkárosító, fehérjeszintézist gátló, DNS képződést gátló, RNS szintézist akadályozó vegyületeket. Kémiai szerkezet szerint megkülönböztethetők az azetidinon ( β-laktám) szerkezetű antibiotikumok, aminoglikozidok, tetraciklinek, makrolidok, ansa-láncúak, oligopeptidek, antraciklinek, poliéterek, spirolaktonok, ciklopentano-perhidrofenantrén vázúak, poliének, poliketid vázból épülők, antimetabolitok (anyagcsere köztestermékek, nukleotidok és aminosavak analógjai), poliének, stb. A kémiailag jelentős mértékben különböző vegyületek hatásmechanizmusa, de felhasználási módjuk is eltérő. Az antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok rendszertani helye sem segít a csoportosításban. Képződésüket nem tekinthetjük faji jellegzetességnek, inkább anyagcseretípustól függő lehetőségnek. Így például ß-laktám csoportot tartalmazó antibiotikumokat termelnek a prokariota törzsek és az eukariota tömlős gombák. A kemoterápia eredményei nem függetleníthetők a gazdaszervezet védekező mechanizmusának állapotától. A gyógyszerként felhasznált hatóanyagok csak csökkentik a korokozók életképességét. A végső eredményt az ellenanyagképző mechanizmus, az immunológiai védelem teljesítménye határozza meg.
10
A ß-LAKTÁM SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK BIOLÓGIAI-KÉMIÁJA A penicillin molekula krisztallográfiás analízissel igazolt szerkezete 1945-ben vált ismertté Crowfoot és Low munkáiból. A benzil-penicillin, - más néven G-penicillin - D-valinból és L-ciszteinből álló penám alapvázát fenilecetsav acilezi. A tiazolidin gyűrűvel anellált négytagú, igen labilis β-laktám szerkezet sav, lúg és oxigén érzékenysége jelentette a szerkezet felderítés fő nehézségét. .A három királis szénatom (vastagítva) pedig a gazdaságos totálszintézis reménytelenségét. A PENICILLIN KÉMIAI SZERKEZETE ÉS BOMLÁSI FOLYAMATAI VIZES KÖZEGBEN =R
H H CH3 : : | R-CH2-CO-NH-C----C—S—C-CH3 | | | O=C----N--------C-H : COOH
CH3 | HOOC—CH—CH—S—C--CH3 | | | penill-sav N N———C-H \\ / : C COOH | R—CH2
Savanyú kémiai kezeléssel a penaldsav mellett az úgynevezett penicillamin (dimetil-cisztein) különíthető el mint hidrolízis termék. Lúgos körülmények között penicillosav képződik. A penicillosav dekarboxilezésével penillosavhoz, a penaldsav dekarboxilezésével pedig penilloaldehidhez jutunk. Savanyú körülmények között egy intramolekuláris átrendeződéssel penillsav képződik. A laktám gyűrű felnyílása a biológiai hatás elvesztésével jár. A molekulában található három királis (vastagítva) szénatom azidőtájt reménytelenné tette a gazdaságos kémiai szintézist. A fejlesztési igény kielégítése elsősorban a mikológusok eredményes genetikai tevékenységétől volt várható A penicillin szerkezetének felderítése után a biológusok az acilező sav (prekurzor) változtatásával igyekeztek a G-penicillinnél előnyösebb tulajdonságú származékot nyerni. Itt azonban a bioszintézist végző Penicillium törzs enzimrendszerének specifitása behatárolta lehetőségeiket. A kipróbálásra került több mint ezer acilező sav közül alig száz esetben igazolták a prekurzor beépülését. Az előállított új származékok baktériumspektruma és penicillinázzal szembeni érzékenysége nem különbözött a gyógyszerként ma is forgalomban levő fenilecetsav származéktól, a G-penicillintől. Kiemelkedő savstabilitására való tekintettel csupán egyetlen új termék aratott sikert, a fenoxiecetsav származék, amely szabad savként a gyomorsav hatásának ellenállva tabletta formájában tartósan adagolható gyógyszerként növelte a penicillin népszerűségét.
11
A fermentlében talált, addig betüvel jelölt Gram-pozitív mikroszervezetek ellen eltérő mértékben hatásos fontosabb penicillinek kémiai szerkezete is közlésre került. Penicillin BT Penicillin O Penicillin F Flavicidin Penicillin K Dihidro-penicillin F Penicillin N Penicillin G
Penicillin X
Penicillin V
penám-CO-CH2-S-CH2-CH2-CH2-CH3 penám-CO-CH2-S-CH2-CH=CH2 penám-CO-CH2-CH=CH-CH2-CH3 penám-CO-CH2-CH2-CH=CH-CH3 penám-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 penám-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 penám-CO-CH2-CH2-CH2-CHNH2-COOH H penám-CO-C--H H penám-CO-C-----OH H H penám-CO-C—O— H
penám = 6-aminopenicillansav
CH3 H H | : : H3C-C—S—C—C—NH2 | | | H-C —— N—C=O : COOH
A penicillin kémiai analitikai meghatározása is a laktám gyűrű labilitását hasznosítja. A jodometriás módszer alapja az, hogy az ép penicillin molekula nem köt jódot, a lúgos hidrolízis termék, a penicillosav viszont 7-8 atom jódot köt. Ez lehetőséget adott a penicillin jodometriás meghatározására. A hidrolízis nélkül mért aspecifikus jód kötés és a lúgos kezeléssel hidrolizált minta jódkötése közötti érték arányos a β-laktám szerkezetű vegyület mennyiségével. A másik eljárás azt a tényt hasznosítja, hogy a penám váz jól reagál hidroxilaminnal. A képződő hidroxamát vaskomplexe kolorimetriás meghatározásra ad lehetőséget. H H CH3 : : | R—CO—HN--- C-------C----S-----C---CH3 Penicillin + HO-NH2. HCl | | | HO---HN----C=O HN----------C---H : COOH ÚJABB β-LAKTÁM SZERKEZETŰ BIOLÓGIAILAG AKTÍV METABOLITOK FELFEDEZÉSE Hamarosan új vegyületcsoportot a carbapenemeket fedezték fel egymástól függetlenül a Merck és a Beecham kutatói, a Streptomyces fajok által termelt thienamycineket. Ez esetben a kén atom nem az anellált gyűrűben, hanem tioetanolamin származékként tioéter kötésben található. (Streptomyces clavuligerus, S olivaceus, Erwinia carotovora, Serratia sp.) . CH3 Tienamicinek szerkezeti képlete | HO-C-H H O CH3 H H : : || | : : H—C—— C ———CH2 HO—S—O—C—– C——C———CH2 H H | | | | | | | | || | O=C--------N---C== C—S—CH2--CH2--NH2 O H O=C —–N —C==C––S—C=C---N---C---CH3 | | | || COOH COOH H O
12
Ugyancsak Streptomyces törzsek termelik a. Merck és az Eli Lilly kutatói által felfedezett cefamicineket. A Streptomyces clavuligerus, törzsek által termelt cefamicin származékok különlegessége a 7-α-metoxi csoport megjelenése és az oximetil csoport hiánya, illetve karbamoilezettsége. CH3 | NH2 H H H O H O H | | | | || | : : HOOC----C----C----C----C----C----N-----C------C-----S-----CH2 O | | | | | | | || H H H H O= C------N-----C===C---CH2--O--C---NH2 | Cephamycin szerkezete O=C−OH A Beecham Laboratórium kutatói által vizsgált Streptomyces clavuligerus tenyészlevében egy clavulansavnak elnevezett vegyületet izoláltak. Ez a vegyület a tiazolidin gyűrű helyett oxazolidin gyűrűt
tartalmaz. A kén helyett oxigént tartalmazó alapváz acilező aktivitása fokozott mértékű. A C6 szubsztituens hiánya miatt antibakteriális hatást ugyan nem mutat, de a penicillináz enzimet képes inaktíválni. A β-laktam bontásáért felelős -SH csoportot a felnyíló laktám gyürű acilezi. Ezt követőleg az oxazol gyürű felnyílása után a reaktív oldallánc stabil tioéter kötésbe lép az enzim másik SH csoportjával. Széles spektrumú félszintetikus penicillin származékokkal együtt adagolva penicillin rezisztens fertőzések leküzdésére használják. .A β-laktám szerkezetű vegyületek sikere fokozta a kutató csoportok új hatásos anyagokat kereső tevékenységét. Azetidinon gyűrűt tartalmaznak a monolactamok. Első képviselőjüket a nocardicint Fujisava laboratóriumának a kutatói izolálták Nocardia uniformis tsuyamanensis tenyészlevéből. A molekula p-hidroxi-fenilglicinből, annak oximino származékából, ciszteinből és homo-szerinből ill. cisztathioninból épül fel.
A hetvenes évek végén végzett kutatómunka N-szulfonil azetidinon gyürűt tartalmazó Gram-negatív törzsekre ható β-laktám vegyületek felfedezéséhez vezetett. Az irodalom monobaktám gyűjtőnéven tárgyalja őket, mert baktériumok (Pseudomonas acidophila, Gluconobacter, Acetobacter, Agrobacterium radiobacter) tenyészlevéből izolálták őket. A 3-amino-baktámsav alapváz savanyú természetét az N-szulfonsav csoport okozza. A β-helyzetű amino-csoportot különféle savak, illetve savszármazékok acilezik. Több esetben a 3-αhelyzetű hidrogént metoxi csoport helyettesíti. CH3
Az Agrobacterium radiobacter törzs termékében az acilező sav aromás gyűrűt tartalmaz. Ezek az utóbbi azetidinon szerkezetű antibiotikumok gyógyászati felhasználásra nem kerültek, de a megszerzett biokémiai ismeretek termékenyítőleg hatottak az új hatóanyagok előállítását célzó kutató munkában.
14
AZETIDINON SZERKEZETÚ VEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA — TÖRZSFEJLESZTÉS A penicillin kémiai szerkezetének felderítése után a tématerületen dolgozó kutató csoportok számára nyilvánvalóvá vált, hogy a totálszintézis gazdaságos megoldására nem számíthatnak. Minden erejüket a biológiai eljárás technológiájának fejlesztésére fordították. Minden mikrobiális eljárás alapja a kitűzött feladat megoldására (sejt-tömeg termelés, enzim termelés, primer vagy szekunder metabolit termelés) kiválasztott illetve genetikai munkával fejlesztett olyan baktérium vagy gomba törzs amely biokémiai tulajdonságát hosszabb időn át képes megőrizni. Az eljárás kivitelezéséhez szükséges a környezettől elválasztott olyan aszeptikus körülményeket biztosító reakciótér, amely hatékony hűtő és fűtő rendszerrel rendelkezve a sterilezés és a hőmérséklet tartás feladatát biztonsággal megoldja. Változtatható hatékonysággal működő keverő elemei az anyagátadást elősegítik. Műszerezettség szempontjából a belső nyomás a pH, az oldott oxigén és széndioxid koncentráció beállított értéken való tartására alkalmas. A reakció elegy összetételében bekövetkező változások mérése és az adatok rögzítése alapvető jelentőségű. A magas színvonalú technológia kialakítása igényli a mikroszervezet anyagcsere rendszerének ismeretét, a mikrobiális feladat megoldásában szerepet játszó enzimek közötti élettani, funkcionális kapcsolat felderítését. A természeti környezetünk kialakulásának evolúciós szemlélete szerint a rendszer fennmaradásában a természetes kiválogatódás érvényesül. A gazdaságosabb anyagcseréjű egyed győzedelmeskedik. Ennek szellemében nem várható, hogy természetes élőhelyén bármely organizmus fölös mennyiségben állítson elő valamilyen számunkra hasznos terméket. Nyilvánvaló, hogy a létért folytatott küzdelemben ez az improduktív tevékenység hátrányos helyzetbe juttatná a kiválasztott törzset. Természetes élőhelyén az anyagcsere szabályozott volta biztosítja a leggazdaságosabb életvitelt a mikroszervezet számára. Az ipari alkalmazáskor kialakított technológia valójában az évmilliók alatt kialakult szabályozási mechanizmus félrevezetésével, adott esetben kikapcsolásával éri el a gazdaságos termelés körülményeit. A negyvenes évek elején a fonalas gombák által termelt anyagok nagyipari előállítása közismert volt a biomérnökök előtt. Az Aspergillus niger tenyészlevéből elkülöníthető citromsav nagyipari méretben folyó előállítása évtizedek óta évi több ezer tonnás tételt jelentett. Formalinnal és gőzzel sterilizálható helységekben elhelyezett 2x5 méteres saválló acélból készített tálcákban töltött 10-15 cm-es folyékony táptalaj felszínén növekedett a gomba micélium tömege. Aszeptikus körülmények között a tápközeg felületén fejlődő micélium tömeg a táptalaj glükóz tartalmát 25-30%-os hatásfokkal alakította át citromsavvá. Ez a primer metabolit a micéliumtömeg (réteg) alól elválasztott tenyészléből könnyen kinyerhető volt. Kezdetben a penicillin termelésre is ezt a technológiát alkalmazták. Különbség volt a hasznos termék koncentrációjában. A citromsav 100 g/l koncentrációban képződött savanyú körülmények között, a penicillin viszont alig haladta meg a 0,1 g/l értéket semleges körüli környezetben. Ez lényeges különbséget jelentett. A citromsavat termelő felületi tenyészetet bakteriális fertőzés ellen jól védte a savanyú kémhatás. A semleges körüli pH tartományban termelődő penicillin viszont nem volt képes megvédeni a gombatenyészetet a gyakran jelentkező bakteriális eredetű fertőzésektől. A megjelenő baktériumok a penicillint általában elbontották. Nyilvánvaló volt mindenki számára, hogy a technológiai folyamatban alkalmazható döntő áttörés nélkül a termék nem számíthat piaci sikerre. A fejlesztési munkákat a technológia jellegéből adódóan genetikai és technológiai tevékenységre csoportosíthatjuk. A két irány egymással állandó kapcsolatban levő kutató-fejlesztő munkát jelentett és jelent ma is. Egy-egy új jobban termelő mutáns fermentációs körülményeinek optimalizálása az előállítási technológia módosítását igényelte. A felületi tenyésztést hamarosan felváltotta a sűlyesztett körülmények között végzett eljárás. A keverővel ellátott sterilizálható edényekben elhelyezett tenyészet oxigénellátását sterilre szűrt levegő befúvásával oldották meg. Ez nem csekély feladatot jelentett a habzás miatt, amit habgátló anyagok adagolásával lehetett mérsékelni. Az oxigénellátást javító keverést a fonalas szerkezetű micélium tömeg növekedésével járó viszkozitásváltozás nehezítette. A genetikai munkákban a szelekciós tevékenység mellett a mutagén kezelés is korán alkalmazásra került. A törzsfejlesztéshez felhasznált mutagének (diepoxibután, etilmetánszulfonát, etilénimin, metil-bis-(β-kloretil)amin, N-metil-N’-nitro-N-nitroso-guanidin, UV-, X-, γ-sugárzás.) hatására a törzs termelőképessége több százszorosra növekedett. A felületi kultúrában 200 E penicillint termelő törzs röntgen sugárral kezelt túlélői, amilyen például a Carnegie Intézetben előállított X1612 jelű mutáns már 450E penicillin termelésére volt képes. A Wisconsin egyetemen előállított Q 176 jelű mutáns termelése elérte a 780 E értéket. 1946-ban a Wis-51-20 mutáns 1520 E termeléssel került az élre. Egyébként ez a törzs került ipari felhasználásra hazánkban is az ötvenes évek elején. A táblázat néhány fejlesztéssel foglalkozó laboratóriumban végzett tevékenység vázlatát mutatja megjelölve az alkalmazott klasszikusnak tekinthető genetikai eljárást. A legjobb mutánsok termelési értéke ma meghaladja az 50000 E/ml értéket. Ez a mennyiség a tenyészet száraz micélium tömegének többszöröse. Nyilvánvaló, hogy ez a gomba számára haszontalan többlettermelés csak szigorúan meghatározott körülmények között valósul meg és ahhoz sem férhet kétség, hogy ezzel a túltermeléssel terhelt mutáns a létért való küzdelemben alul marad a környezet energiaforrásait gazdaságosabban hasznosító, penicillint alig termelő vad törzzsel szemben. Ezért nem kis feladat a jól termelő törzs termelőképességét meghatározó biokémiai tulajdonságok megőrzése. Nagyipari termelésre csak olyan mutáns alkalmas, amelyik változatlan körülmények között hosszú ideig képes termelőképességét megőrizni. Az üzemek mikrobiológusainak fő feladata a magas termelőképességű oltóanyag előállítása.
15
A legjobban termelő törzs kiválasztása egyspóra tenyészet (klon) termelőképességének meghatározásával kezdődik. A vizsgálandó, mutagén kezelést túlélő higitott spóra-szuszpenziót szélesztik agar táptalajra, hogy a kifejlődő telepek egymástól elkülönülve növekedjenek. A kifejlett telepekről nyert spóra szuszpenzióval rázó lombikban elkészített termelő táptalajt oltanak, illetve törzsfenntartásra szolgáló szaporító felületet, például köles szemeket. Rázott tenyészetben vizsgálják az izolátumokra jellemző antibiotikum képződés sebességét. A legjobban termelő változat biokémiai tulajdonságának stabilitását ismételt szélesztéssel és termelőképesség vizsgálattal igazolják. A kísérleti eredmények a törzs specifikus termelőképességére jellemző adatokat szolgáltatnajk a sejttömeg és az idő függvényében. Négy fejlesztő laboratórium törzsnemesítő tevékenysége a törzsjelzés feltüntetésével. Penicillium chrysogenum NRRL 1951 S NRRL 1951-B-25 Carnegie Institute Univ.Minnesota X X 1612 U Wis Q 176 UV-1 Wis BL 3DIO | S Peoria Illinois
47-636 S 47-1327
47-650
47-638 S
47-1380
47-762 S
47-911 S
47-1564
47-1040 S
S 47-749
48-1655
NM
49-482
NM
49-2695
NM
50-529
NM
50-1247
51-20 E-1
52-318 NG E-3 E-4
U M-73
E-5
M-88
53-399
E-6 E-8 NG E-9 NG E-10 NG
NG E-12 E-11 SA 1639 E-13 NG 16534 E-14 NG 15259 E-15
Wyeth Lab. Eli Lilly Indianapolis West Chester Alkalmazott módszerek: S= szelekció, M= metil-bis(β-kloretil)amin,
X = röntgenbesugárzás, NG = nitrozo-guanidin,
UV-1 53-844 UV-1 54-912
Univ.Wisconsin Madison UV= ultraibolya kezelés, NM = nitrogénmustár
Az egymást követő mutagén kezelés természetesen nem csak a termelőképesség megváltozásával jár. A kezdetben fonalasan növekedő micélium tömegből célszerűségi okokból azokat a jól termelő variánsokat választották ki, amelyek rövid lekerekedő formában - pelletet képezve - növekedtek. Ezek az alakok sűlyesztett körülmények között 1-2 mm átmérőjű kompakt gömbszerű telepecskéket alkotnak. Ez a növekedési forma a 16
specifikus termelőképesség szempontjából is előnyös, mert a térfogategységben megjelenő micélium tömeg mennyisége nagyobb. A golyócskákból álló tenyészet jól keverhető és levegőztethető. (A fonalas sűrű micéliumtömeg oxigén-ellátása technikai okok miatt nem oldható meg.) Az ipari szempontból kinemesített variánsok csak a növekedés kezdetén, a spórából csírázva jelennek meg laza, fonalas formában, de ez a növekedési szakasz sem emlékeztet a vad törzs hosszú sima, enyhén elágazó micéliumára, hanem hajlott göcsörtös, artrospóraszerű, néha elágazó formát mutat. Fleming felfedezését követően hosszabb ideig úgy vélték, hogy a penám váz szintézisére csak a Penicillium nemzetség néhány faja jöhet számításba. A század második felében végzett kiterjedt vizsgálatok megerősítették, hogy a bioszintetizáló rendszer számos nemzetségben előfordul, sőt a molekuláris biológiai vizsgálatok a gén prokariota eredetére utalnak Közel húsz év telik el Fleming emlékezetes bejelentése után a második β-laktám típusú antibiotikum felfedezéséig. Brotzu 1948-ban közli, hogy egy Cephalosporium acremonium törzs tenyészlevében igen erős széles spektrumú antibakteriális hatás észlelhető (J. Gen. Microbiol. 47:1952). A fermentlé több biológiailag aktív terméket tartalmaz. A Cepalosporin-C hatóanyagon és a 6aminopenicillansav D-α-aminoadipinsavval acilezett Gram-pozitív és Gram-negatív kórokozók ellen hatásos származékán, a penicillin-N antibiotikumon kívül egy savanyú természetű szteroid vázat tartalmazó kefalosporin-P-nek nevezett helvolinsav származék jelenlétét is bizonyították. A főtermékként megjelenő Cephalosporin-C-nek elnevezett azetidinon származékot Abraham és Newton izolálta 1961-ben. Később a törzs rendszertani hovatartozását végző mikológusok az antibiotikumot termelő törzset helyesen Acremonium chrysogenum névvel különítették el a Cephalosporium fajoktól A termelő törzs nevének változása nem befolyásolta az antibiotikum elnevezését. NH2 H H H O H H H | | | | || | : : HOOC----C----C----C----C----C---N----C-------C-----S-----CH2 O H H H H | | | || O=C-------N----C===C---CH2---O---C---CH3 | Cephalosporin-C szerkezeti képlete O=C−OH A kefém váz 7-amino csoportját D-α-aminoadipinsav acilezi. A hattagú tiazin gyűrűvel anellált βlaktám gyűrű kémiai stabilitását a kvázi-delokalizált elektroneloszlás mezomer rendszere okozza. Ez a rendszer a penicillináz rezisztencia magyarázata. A kémia szerkezet D-alaninhoz való hasonlósága miatt hatásmódja a penicillinéhez hasonlóan a peptidoglükán sejtfal felépülését gátolja. A szélesebb baktérium spektrumát az acilező sav aminocsoportja hozza. Kémiai stabilitása alkalmassá teszi különböző O-acil és 7 amino-acil származékainak előállítására. Félszintetikus származékainak gyógyászati jelentősége az antibiotikum illetve kemoterápia sikeres korszakát indította el.
A penicillin képződéséhez szükséges három enzim; az ACV tripeptid szintetáz (ACVS), az izopenicillin N szintetáz (IPNS) és az izopenicillin aciltranszferáz, (IAT) jelenlétét igazolták a felsorolt gombanemzetségekben: ASCOMYCETES (perfekt alak) DEUTEROMYCETES (imperfekt alak) Emericella nidulans Aspergillus nidulans Eurotium Penicillium notatum chrysogenum Sartorya Epidermophyton Eupenicillium Trichophyton Talaromyces Microsporum Carpenteles Malbranchea Thermoascus Polypaecilum Gymnoascus Arthroderma Nanizza Az N penicillin képződéséhez szűkséges enzimek; ACV tripeptid szintetáz (ACVS), az izopenicillin N szintetáz (IPNS), az izopenicillin epimeráz továbbá a gyűrűtágító rendszer, az expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz valamint a befejező lépéseket katalizáló hidroxiláz, aciláz karbamoil transzferáz, és a metiltranszferáz Jelenlétét a következő gomba törzsekben sikerült igazolni:
17
ASCOMYCETES Emericellopsis
DEUTEROMYCETES Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum) Byssochlamys Paecilomyces persicinus Arachnomyces Scopulariopsis Anixiopsis Diheterospora Spiroidium További vizsgálatokban több azetidinon származékot termelő pokariotát sikerült izolálni: Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans, Lysobacter lochenigenus, Flavobacterium A ß-laktám antibiotikumot termelő Penicillium chrysogenum törzs rendszertanilag az Ascomycota tagozat Euascomycia ágazat Eurotiales rend Eurotiaceae család Talaromyces nemzetség Asymetrica csoport Velutina alcsoport Chrysogenum sorozatba illeszthető faj olyan nemesített variánsa, melynek szexuális folyamata ismeretlen. Penicillium notatum Penicillium chrysogenum (Önmegtermékenyítő is lehet). Ugyanez vonatkozik a Penicillium csoportokra. 1950-óta több mint 150 új Penicillium faj került leírásra, amelyek valójában valószinűleg az Eupenicillium és a Talaromyces fajok imperfekt alakjaiként tárgyalhatók. A taxonómiai szempontok változását szemlélteti az Acremonium strictum esete amely a Cephalosporium nemzetségből 1971-ben került át Gams W munkája eredményeként az Acremonium nemzetségbe. A konidiumok (c) csoportosan a vékony fialidok csúcsán helyezkednek el. Az egyesével álló fialidok harántfallal különülnek el a.konidiofórumokon (b). A konidiumok általában egy a gomba által kiválasztott nyálkás anyag hatásaként összetapadva maradnak. A fialidok átmérője a konídiumnál 0,5 µm-re szűkül. Talajban, növények maradványain gyakran előfordul. A penám és cephem szerkezetű antibiotikumot termelő fajuk Acremonium chrysogenum-ként ismert, holott a Botzu által cephalosporin-C termelésre alkalmas szervezetként izolált gombát a XX. század közepén Cephalosporium acremonium-ként azonosították. Innen ered az antibiotikum elnevezése. Acremonium strictum A PENÁM ÉS KEFÉM SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK FELDÚSULÁSA A TENYÉSZETBEN Az azetidinon szerkezetű antibiotikumok képződésének előfeltétele egyrészt, hogy a bioszintézisben résztvevő enzimek aktív formában kellő mennyiségben jelen legyenek, másrészt, hogy az építőelemek, az L-αAminoadipinsav, L-Cisztein és L-Valin az ACV-tripeptid szintetáz működéséhez szükséges koncentrációban jelen legyenek. Ez nem elhanyagolható igény, mert egyetlen ml fermentlében felhalmozódó 100 mmol antibiotikum (6x1017molekula) tömege meghaladja az őt termelő mikroszervezet száraz tömegét. A sejtben normál esetben előforduló aminosavak mennyiségének 100-szorosa található a termelt antibiotikumban. Ezért van jelentősége az eljárás szempontjából olyan optimális technológia kimunkálásának, amely a termelő törzs
18
igényeit szelektíven kielégítve, a genetikailag meghatározott potenciális lehetőséget maximális mértékben kihasználja. (Lásd a három aminosav (A,C,V) képződését bemutató vázlatot a következő oldalon
A három aminosav közül az L-cisztein központi szerepet ellátva közvetlenül nem jelenthet limitáló faktort az azetidinon képzésben. A glikolitikus út köztes termékéből (3-foszfoglicerát) NAD-függő redukcióval képződő 2-keto-3-foszfoglicerát transzamináz segítségével alakul szerin foszfáttá. Ebből acetil-CoA felhasználásával képződik az acetil-szerin, amely kénhidrogénnel reagálva alakul ciszteinné a szükséges mennyiségben. Hiánya áttételesen jelentkezhet, ha a szulfát redukcióhoz szükséges NADPH formában megjelenő redukáló aktivitás nem áll rendelkezésre. Az L-valin képződése ugyan feedback kontrol alatt áll, de képződése ugyancsak központi szerepet betöltő piroszőlősavból kielégítő aktivitással folyik. Különlegességként említhető a bioszintézis NADPH-t igénylő reduktoizomeráz reakciója. A vízkilépést követően glutaminsavból származó amino csoportot hasznosít a transzamináz a ketovalin valinná alakításához. A harmadik építőelem az L-α α-aminoadipinsav, a lizin szintézis köztes terméke. A Krebs-ciklusban képződő α-ketoglutársav acetil-CoA-val reagálva alakul homocitráttá. Nem véletlen, hogy a reakciót a végtermék, a lizin szabályozza. Ezt a lizinhez vezető reakció utat csapolja meg az izo-penicillin-N szintézis. A homocitrátból képződő homoakonitin-sav dehidrogénezésével és egy transzamináz reakcióval jutunk az L-αaminoadipinsavhoz, amelynek δ-karboxil csoportja ATP-vel reagálva adenilsav vegyes anhidridként hasznosul a tiotempláton folyó ACV-tripeptid képződéséhez. Ez a vegyes anhidrid a lizin szintézis irányában lehetővé teszi a karboxil csoport redukcióját, amely feltétele az ε-aminocsoport kialakulásának. Mindent összevetve végeredményben négy acetil-CoA felhasználásával képződik egy-egy aminoadipinsav, amely nélkülözhetetlen építőeleme a cephalosporin-C antibiotikum képződésének is. (A prokariotákban a szacharopinen és aaminoadipinsav félaldehiden keresztül vezető lizin lebontási út szolgáltatja a kefém váz szintéziséhez szűkséges köztes terméket.) A bioszintézis egyes lépésének közvetlen energia és kofaktor igényét szemlélve, nyílvánvaló, hogy a sejten belüli redukáló környezet szempontjából optimális NADPH szint fenntartása meghatározó jelentőségű. A felhasználásra kerülő aminosavak előállítása a vázlaton bemutatott anyagcsere rendszert terheli. Az ammonia felvételt katalizáló glutaminsav dehidrogenáz NADPH-t igényel. A valin szintézis redukciós lépése ugyancsak NADPH-t igényel. Négy NADPH segíti a szulfátból származó kén redukcióját. Végül a NADPH poolt terheli a tripeptidet redukált formában tartó specifikus tioredoxin rendszerhez hasonló széles spektrumú diszulfid-reduktáz, amely felszámolja az átmenetileg esetleg megjelenő biszulfid alakot, amely nem azonos a glutationt redukált formában tartó, NADPH igényes reduktázzal. A bioszintézis szempontjából tehát meghatározó jelentőséget nyer a G-6-P dehidrogenáz és a 6-PG dehidrogenáz működésétől függő NADPH ellátottság.. Hexóz szénforrásból a G-6-P szint természetesen kielégítené a szénváz felépítés igényét, ha a hexóz monofoszfát (HMP) úton hasznosul. Ezt az irányítást hatásosan a fruktóz-2,6-biszfoszfát szint végzi.
Fruktóz-2,6-biszfoszfát szabályozó szerepének a vázlata
20
Glükóz-limit estén kialakuló cAMP szint a szénforrás hasznosulást a hexózmonofoszfát útra tereli. A tenyészethez adott fölös glükóz ugyanis a szénhidrát lebontást a fruktóz-1,6-biszfoszfát útra tereli, amely NADPH hiányt eredményez. Ez esetben a lecsökkenő cAMP szint miatt inaktíválódik az a protein foszforiláz, amelyik a F-2,6-foszfokinázt foszforilezve F-2,6-biszfoszfatázzá alakítja. Ez utóbbi enzim elbontja a képződő F2,6-P2-ot, amely egyrészt gátolva a 6-foszfoglükonát dehidrogenáz működését NADPH hiányt idézne elő, másrészt a fruktóz-1,6-foszfokinázt aktiválva serkenti a fruktóz-1,6-P2 képződést, amely végül az EMP útra tereli a szénhidrát lebontást. Nem véletlen tehát, hogy a penicillint termelő tenyészethez adott glükóz leállítja a penám váz képződését. A bonyolult szabályozó mechanizmust látva érthetővé válik, hogy az ipari termelésre kinemesített törzsek miért vesztik el olyan könnyen kiemelkedő termelőképességüket. Az antibiotikum termelés szintjét befolyásoló spontán mutáció ugyanis csökkenti az anyagcserére nehezedő szelekciós nyomást. A populáció könnyebben, gyorsabban növekedő spontán megjelenő mutánsai, vagy a környezetből a tenyészetbe kerülő vad törzsek a fermentációs ciklus végére elszaporodva sok esetben elnyomják a kinemesített variánst. Az ismertetett okokból az antibiotikum termelésre kidolgozott eljárások szénforrásként lassan bontható oligoszacharidot, a 60-as évekig előnyösen laktózt, esetleg növényi zsiradékot használnak. A Penicillium chrysogenum a laktózt — nem lévén galaktózzal indukálható ß-galaktozidáza — különösen lassan képes felhasználni. A növekedési fázist követő antibiotikumot termelő szakaszban (idio fázis) a mérsékelt glükóz ellátottság a cAMP szint növekedését eredményezi, ami a foszfatáz hatást növeli. A F-2,6-P2 szint csökkenése megszünteti a biszfoszfát 6PG dehidrogenázt gátló hatását. A PENICILLIN GYÁRTÁS IPARI GYAKORLATA; Ahogy 1945 UTÁN VILÁGSZERTE MEGVALÓSULT A fehérje oldatban szuszpendált spórák fagyasztva szárított körülmények között (liofilizálás) hosszabb ideig biztonságosan tárolhatók. Ma divatos a cseppfolyós nitrogénben, illetve -80 fokon való tárolás. Ezek a törzskonzervek természetesen nem közvetlenül kerülnek felhasználásra, hanem megfelelő előkezelés, felélesztés után előállított spóra tömeggel történik a termelő fermentáció oltása. Virulens oltóanyagként felhastználható spóratömeg nyerhető a nemsített törzs szuszuszpenziójával oltott sterilezett rizs, vagy köles szemek felületén A spóratermelő fázis befejeztével a rizskultúrát vákuum szárítószekrényben vízmentesíthető. Az aszeptikusan lezárt spóratömeg –20 °C on 1-2 éven keresztül tárolható biológiai aktivitásának csökkenése nélkül. A technológiai előírások pontosan meghatározzák az oltófermentorba juttatandó élőcsiraszámot. Az optimális spóraszám túllépése a mikrotelepek összefonódását eredményezi. Alacsonyabb spóraszám esetében viszont a pelletek mérete lesz nagyobb. Mindkét esetben az oxigénellátás kielégítetlensége miatt a termék képződése károsodik. Az oltóanyagot előállító laboratórium minőségileg ellenőrzött spóratömegével oltják az előinokulumot. A törzsfenntartó laboratórium rutin feladata az oltóanyagok termelőképességének és az élőcsiraszámnak az ellenőrzése. A spóraszám a termelő táptalajban kialakítandó gömb alakú telepecskék (pellet) kívánatos számával egyezik meg. A pellet kialakulása és mérete több szempontból fontos. A apró, 0.5-1 mm átmérőjű gömböcskék nagyobb mennyiségű gomba tömeg jelenlétét és a gömb felületen elhelyezkedő nagy számú csúcsi sejt működését teszi lehetővé a nagy viszkozitása miatt nehezen keverhető fonalas szerkezetű tenyészetnél előnyösebb levegőztetési körülmények között. A penicillin képződés ugyanis a bioszintézis szempontjából legaktívabb csúcssejtekben folyik. Az inokulum gazdasági megfontolásból több lépcsőben készül szerves nitrogénforrást és könnyen metabolizálható szénforrást tartalmazó táptalajon. A vegetatív inokulum táptalaj szerves nitrogénforrásaként a kukorica áztatóléből készült tejsavbacillusokkal erjesztett koncentrátumot használták 2% mennyiségben. Ez az 50% szárazanyagot tartalmazó koncentrátum teljes értékű aminosavak és más növekedési faktorok, vitaminok szempontjából előnyös, de jelentős a tejsav és foszfáttartalma is. Az oltóanyag energiaforrásaként általában a csírázást és a növekedést segítő glükózt használnak ugyancsak 2-3% mennyiségben. Een a szénforráson jelentős micélium tömeg fejlődik. A táptalajba adott 0,5-1% kalciumkarbonát a tenyészközeg savanyodását akadályozza. A habgátló is az előkészített táptalajba kerül sterilizálás előtt. A fejlődő inokulum tenyészetbe való adagolást kerülik a tenyészet — homogénitása, — idegen fertőzéstől való mentessége érdekében. A méretnövelés céljából előnyös az oltóanyag előállítást két lépcsőben végezni, A végtértfogat méretének megfelelő spóratömeggel 1000 L térfogatban előinokulumként indítják az első lépcsőt. A csírázás ellenőrzése után — a primer fonalak megjelenésekor — célszerű átoltani a tenyészetet. Biztonsági okokból általában két oltó reaktort indítanak az esetleg fellépő zavarok (fertőződés) elhárítása céljából. Az átoltások
21
idejét úgy határozzák meg, hogy a növekedés zavartalan legyen. Az elkészült inokulum 40-50 órás olyan vegetatív tenyészet, amelyben a mikrokolónia kezdemények még függetlenek. Ez kerül át a főfermentáció tápközegébe legkevesebb tízszeres higításra törekedve.
A techniki fejlődés. A fermentlé glükóz-tartalmának online mérhetősége, lehetővé tette a tanyészetet hosszabb időn keresztül termelő fázisban tartani akár szőlőcukor vagy nádcukor adagolásával (Az ábra egy ilyen fermentáció adatait mutatja.) A limitált glükóz szinttől függően emelkedő cAMP szint a négy alegységből álló inaktív protein foszokinázt aktív monomerekké alakítja. (Lásd a F-2,6-P2 szabályozó szerepét bemutató vázlatot) Ez a cAMP-t tartalmazó protein foszforiláz a F-2,6-foszfokinázt foszforilezve 2,6-biszfoszfatázzá alakítja. Ez utóbbi enzimaktivitás eltünteti a jelenlevő F-2,6-P2-ot. Ez a beavatkozás nemcsak a HMP út működését teszi szabaddá, de a fruktóz1,6-difoszfatáz működésével megnyitja az utat az acetil-CoA ból táplált glükóz képződés (glükóz neogenezis!) irányába, elősegítve a HMP út működését, azaz a NADPH képződést. Ez a szabályozó elem különösen fontos szerepet nyer a szénforrásként növényi olajat hasznosító cephalosporin képződés szempontjából Az acetil-CoA-ból történő bioszintézis esetében fontos szerepet nyer a Krebs ciklus és a glioxilát ciklus működése, amely az olajsavból szabályozás nélkül képződő acetil-CoA gyors felhasználódását lehetővé teszi. A zsírsav szénforrást hasznosító anyagcsere nagyobb mennyiségű redukált kofaktor (NADH és FADH2) képződéssel jár. A FADH2 képződés növekedését jelenti a cephem szerkezetű termékek képződése, az expandáz és a dioxigenáz jellegű hidroxilezéssel együttjáró szukcinát képződés. Az anyagcsere teljesítőképességét ez esetben a redukált kofaktorok visszaoxidálásának sebessége határozza meg. Nem meglepő, hogy fokozott szerepet kap a szalicil-savval, illetve borostyánkősavval indukálható, de szalicilhidroxamáttal gátolható — CN
22
rezisztens — alternatív légző rendszer, amely ATP képződés nélkül képes az elektront az oxigénre mint elektron-akceptorra juttatni.
NADH NAD+
<
ox. flavin enzim red H+ >
-
cianidddal gátolható) oxidatív foszforiláció
H+ e –
H+ e – (cianid-rezisztens szalicilhidroxamáttal gátolható)
H 2O
alternatív légzés
1
/2 O2
Az elektron útja az oxigénhez
Mivel a redukált kofaktor visszaoxidálása ATP képződés nélkül történik, az oxidáció közben felszabaduló energia a tenyészet hőmérsékletét emeli. Ez a hőtermelésben megjelenő energia a rendszer fokozott hűtését igényli (24-26 oC-ra). Az alternatív légző rendszer fontos szerepet kap a mikroszervezet energia termelő és bioszintetizáló rendszerének optimálisra szabályozásakor. A redukálódó kofaktorok regenerálása alapvető feltétele a rendszer működőképességének, ezért sebességmeghatározó, tehát adott esetben limitáló faktorként jelenik meg a biotechnikai folyamatokban. Az alternatív légzésnek nevezett elektronátvivő mechanizmus kiegyensúlyozó szerepe a primer metabolitokat túltermelő eljárások esetében is jól megfigyelhető. (A NAD+ hiány, illetve az ATP felszaporodása — a kulcs enzimek működését befolyásolva — egyaránt a szénhidrát anyagcsere sebességét csökkentené, ami a célvegyület képződését zavarná. A termelő fermentáció táptalaja nitrogén- és kén-forrásként főleg ammónium-szulfátot tartalmaz. A szénforrás felhasználásának az útja a penicillin termelés szempontjából meghatározó jelentőségű, ezért szénforrásként kezdettől fogva a 60-as évekig tejcukrot használtak. A táptalajhoz adott glükóz ugyanis akadályozza a penicillin képződést. A penicillin termelésre kiválasztott törzs ß-galaktozidáz aktivitását (laktáz) — a tömlós gombákban (Aspergillus nidulans) tapasztaltakkal ellentétben — nem indukálja a galaktóz. Mégis a glükózaminidáz képes a tejcukor lassú hidrolízisére. Ebből következően a tenyészetben a glükóz limitált mennyiségben van jelen. A mérési és adagolási technológia fejlődésével — ipari méretben — folyamatosan adagolt répacukorral, illetve keményítő hidrolízátummal a glükóz mennyisége a penicillin termelés szempontjából optimális alacsony szinten tartható. Ez a technikai megoldás lehetőséget ad a szakaszos, ráadagolásos technológia alkalmazására, akár tíz szakasz lefejtésére. A penicillin kémia stabilitása megkívánja a tenyészlé közel semleges állapotát. Az első évtizedben a táptalajhoz adott kálcium karbonát akadályozta a tápközeg savanyodását. Később, a mérési technika fejődése, sterilezhető elektród alkalmazás, lehetővé tette a pH állandó ellenőrzését. Ma ammónia adagolásával 6,4-6,6 pH tartására törekednek. Energia forrásként szolgálhat a tápközeghez adott növényi olaj, amely habgátló feladatot is ellát. A tápközeg prerkurzor tartalma határozza meg a képződő penicillin minőségét. Fenilecetsav jelenlétében G penicillin, fenoxiecetsavat adagolva V penicillin képződik főtermékként. Az arómás savak, és bomlástermékeik toxikus volt miatt a prekurzor adagolásaa a termelő fázisban az igényeknek megfelelően folyamatosan történik. A penicillin molekula kémiai érzékenysége miatt a feldolgozása egyes lépéseit hűtve végzik. Gyenge sav lévén a szerves oldószeres extrakció járható útnak látszik, de savanyú körülmények között észlelhető bomlása miatt a rendszer (pH 2) savanyítása célszerűen csak szerves oldószer jelenlétében végezhető. Az egyik elterjedt módszer szerint a közel semleges pH-nál megszűrt (fermentlevet) tenyészlevet lehűtve amilacetáttal extrahálják. A savanyítást közvetlenül a centrifugál-szeparátor beömlőnyílásánál végzik folyamatosan. A megsavanyított vizes fázisból így a penicillin a szeparátorral elkülönített szerves fázisban dúsul fel. Ebből az oldatból kálium acetáttal a penicillin kálium sója könnyen kristályosítható. A fermentáció befejezése után a 2-4 °C-ra hűtött semleges pH-jú tenyészléből a micélium eltávolítását vákuum dobszűrővel végzik. A hűtve tárolt üledékmentes szűrletből a hatóanyagot szerves oldószerrel különítik el. Kezdetben előszeretettel használtak klórozott szénhidrogéneket (széntetrakloridot, kloroformot). Egészségvédelmi okokból ma etilacetát, butilacetát, amilacetát illetve metilizobutilketon kerül felhasználásra. A pH beállítására kénsavat, vagy foszforsavat használnak. A hűtött szűrlethez közvetlenül a szeparátor előtt folyamatosan adják a savat számított mennyiségben. Így a savanyú pH=2-2,5 a rögvest szerves oldószerbe kerülő hatóanyagot nem károsítja. A szerves fázisból a következő szeparátoron a szabad savat újra pufferbe pH=7,5-8,2 viszik vissza. Az így nyert sót egy újabb szerves oldószeres extrakcióval tovább tisztítják és koncentrálják A szerves oldószerből kálium-acetáttal a penicillin kálium sója közvetlenül kristályosítható. Ez azonban még átkristályosításra szorul.
23
A penicillin gyártás folyamatábrája (1) termelőképesség szempontjából "nemesített ipari törzs" (2) agar tenyészet, vagy rizs szemeken spórázó tenyészet (3) termelőképesség szempontjából minősített spóra szuszpenzió (4) oltóanyag tenyésztő bioreaktor, keverővel ellátott, aerob inokulum-fermentor (5) pH szabályozott, kevert aerob termelő fermentor prekurzor [fenilecetsav] adagolással (6) a semleges fermentlé szúrése vákuum dobszűrővel [ lásd a dobszűrőt bemutató ábrát] (7) hűthető tároló tartály (8,9,10) szeparátort igénylő extrakciós lépések [lásd a szeparátor ábrát] (11) penicillin-só kristályosító (12) szűrőcentrifuga (13) vákuum szárítószekrény (14) granuláló (15) átkristályosító (16) szűrő (17) prokain-só képzés (18) penicillin-nátrium-só steril átkristályosítása (19) steril szűrők (20) vákuum szárító (liofilező) (21) steril penicillin tároló (22) kiszerelés .
Igen előnyös a szerves oldószerben történő N-etilpiperidinnel végzett kicsapás. Ezt a piperidin sót köztes termékként használva az igényeknek megfelelő formában lehet felhasználni a hatóanyagot kálium-só képzésre. A piperidin sóból könnyenl előállítható a procain-penicillin, amely aluminium stearáttal stabil szuszpenziót adva tartós vérszint biztosítására adott lehetőséget (Supracillin). Később védőkolloidnak polyvinil24
pirrolidont alkalmaztak (Retardillin). A piperidin só előnyösen használható a félszintézishez szűkséges 6aminopenicillinsav előállítására. A vegyület érzékenysége miatt ioncserélő gyanta oszlopon nem oldható meg gazdaságosan a termék kinyerése. Kiküszöbölhető azonban a bomlás, ha valamilyen folyékony ioncserélő felhasználásával végezzük a kinyerést. Ezek az alifás természetű vegyületek olyan poláros csoportot (gyenge bázis) hordoznak, amely képes a gyengén savanyú penicillinnel sót képezni. A benzilpenicillin extrakciója ílyen módon Amberlit LA-2 (375 moltömegű szekunder amin) n-butilacetát rendszerben 4,5 pH-nál gyakorlatilag bomlás nélkül folyamatosan végezhető. Ez a módszer lehetőséget ad az ellenáramú extrakciós kolonnák használatára, amely a rendszer természetéből következően az elméletileg kinyerhető mennyiség tetszőleges megközelítését jelenti. A cefalosporin fermentációs úton történő előállítása lényegesen eltér a benzil-penicillin előállítására szolgáló eljárástól. Értelemszerűen nincs szükség prekurzor adagolásra. Sőt a kísérleti eredmények szerint a tenyészközeghez adott α-aminoadipinsav sem segíti a cefalosporin C képződését. A tenyészetben a főtermékként képződő Cephalosporin C antibiotikumon kívül ennek dezacetil és dezacetoxi származéka is megjelenik, sőt kis mennyiségben a vegyület 7-metoxi származékának képződését is kimutatták. Szénforrásként használható a keményítő hidrolízátum, de a hatóanyag képződése szempontjából az idio-fázisban előnyösebb növény olajat használni szénforrásként. A Penicillium esetében eklőnyösen alkalmazható tejcukor itt nem használható, mert a galaktóz által indukálódó laktóz bontó aktivitás reakcióterrméke katabolikusan gátolja a kefém váz képződését, de a glükóz szint emelkedése zavarja a NADPH képződést is, Nitrogénforrásként a kukorica-lekvár mellett az ammónia, kénforrásként szulfát jöhet számításba. Előnyös hatású a táptalajhoz adott kis mennyiségű metionin. Feltünően nagy az eljárás oxigén igénye. Elsősorban az alternativ oxidáció működtetése miatt. Nem kielégítő oxigénellátottság esetén először a képződő termékek aránya eltolódik a dezacetil-cefalosporin C irányába. Tartós oxigénhiány esetén leáll az antibiotikum képződés. Az oxigén ellátás visszaállása után csak néhány órányi aktív növekedés szükséges az enzimrendszer kifejlődésdéhez. A cefalosporin-C kémiai szerkezetéből következően a fermentléből való kinyerés módszere is eltér a penicillinnél megismert eljárástól. Szerves oldószeres extrakció csak alkalmas karrier vegyület (szulfonsav típusú folyékony ioncserélő) használatakor jöhet számításba. A szilárd ioncserélő gyanták alkalmazása helyett a környezetbarát, erre a célra kifejlesztett makropórusos adszorbciós gyanták használata terjedt el világszerte.
25
AZETIDINON SZERKEZETŰ VEGYÜLETEK HATÁSMÓDJA. A vegyület-típus gyógyászatban elért félévszázados sikerét a peptidoglükán sejtfal felépítésében szerepet játszó reakció specifikus gátlásával magyarázhatjuk. Már Fleming észlelte, hogy a Penicillium által termelt anyag csak a virulens, növekedő baktérium tenyészet osztódó sejtjeit pusztítja. Abnormális alakok, (protoplaszt, szferoplaszt) átmeneti megjelenése mellett következik be a tenyészet lízise. Ezt a tulajdonságot a genetikusok a populációban megjelenő hiánymutánsok szelektív dúsítására évtizedek óta jó eredménnyel használják. Minimál táptalajra oltott baktériumok auxotróf variánsai nem osztódnak, a vad sejtek viszont jól növekednek. A penicillin csak a növekedő sejteket pusztítja el. Az életben maradó auxotrófok penicillin mentes környezetben teljes értékűvé tett táptalajon felszaporíthatók. Az antibiotikum eltávolítását penicillinázzal végzik. A baktériumsejtfal murein rétegének, a peptidoglukán váznak a felépülését a D-alanin transzpeptidáz inaktiválásával akadályozza a penicillin. A hatásmód ismeretében már nem meglepő az a tapasztalat, hogy a penicillin és a kefalosporin származékai nem mutatnak toxikus hatást az emlős szervezetben. Az emlős sejtben ugyanis nem fordul elő olyan enzim, amelynek működését a penicillin vagy a kefalosporin gátolni tudná. A prokarioták alakját és méretét az N-acetil-glükózaminil-N-acetil-muramil egységekből felépülő szénhidrát polimereknek a peptid láncok által összekötött háromdimenziós hálózatából kialakuló muropeptid határozza meg. Az elnevezés a latin murus (fal) szóból származik. A sejtfal építőelemeit a baktérium citoplazmájában működő enzimrendszerek építik fel. A citoplazma membránon kívül, a periplazmikus térben az aktívált formában megjelenő N-acetil glükózaminil-N-acetil muramil oligopeptid egységek összeépülése folyik minimális energiaveszeteséggel. Az muramil-peptid építőelemeknek a membránon való áthaladását az
izoprenilalkohol foszfát észtere segíti. A muropeptid aminocukor része a membránhoz rögzített foszfolipid hordozóhoz kapcsolódik észterkötéssel. A periplazmikus térbrn működő különleges glikozilező enzim az észterkötésben rejlő energiát hasznosítva kapcsolja a muraminsavat a már meglevő peptidoglükán vázban helyet foglaló aminocukor szabad C4 atomjához. A rekció közben szabadon maradó undekaizoprenil pirofoszfát regenerálását, - egy anorganikus foszfát leválasztását, - membránhoz kötött foszfatáz végzi. A transzglikozidáz az építőelem diszacharid komponensét a glükán polimer terminális hexóz C4 atomjához. A sejtfal peptid vázának továbbépítését a membrán külső felületén működő transzpeptidáz és transzglikozidáz végzi. Ez az enzim a muropeptid terminális D-alanin elemének eltávolításával felszabaduló karboxil csoportot illeszti a már meglevő murein váz szabad aminocsoportjához. Az újabb építőelem két ponton 26
való kapcsolásával nő a térhálós szerkezetű sejtfal. A transzpeptidáz reakció végbemenetele közben a szubsztrátum átmenetileg acilezi az enzimet és az acilezett enzimről kerül az acilező ágens a muropeptid sejtfal N terminális amino csoportjára.
Az azetidinon molekula merevített szerkezete éppen a muropeptid építőelem D-alanin-D-alanin dipeptid szerkezetéhez hasonlít. Nem meglepő tehát, hogy nagyfokú szerkezeti analógia miatt a penicillin a sejtfalépítő
transzpeptidáz aktív centrumába jut és a felnyíló ß-laktám kötés karbonil csoportja in statu nascendi irreverzibilisen acilezi az enzimet. Ezért nevezték kezdetben ezt az enzimet penicillinkötő fehérjének. A sejtfal felépítéséhez szükséges specifikus enzim inaktíválása akadályozza a sejtfal továbbépülését, miközben a baktérium életfolyamatai zavartalanul tovább folynak. Először az egyre vékonyodó sejtfalon és lazuló membránon keresztül a folyamatosan készülő sejtfal építőelemek köztes termékeiként, glükózamint, foszforsavat és aminosavakat tartalmazó uridil-származékok, úgynevezett Park nukleotidok kerülnek a tápközegbe. Végül a sejt tömegének, térfogatának további növekedése a sejtmembrán szétszakadásához, a baktérium pusztulásához vezet.
27
A PEPTIDOGLÜKÁN SEJTFAL ÉPÍTŐELEMEINEK KÉPZŐDÉSE A CITOPLASZMÁBAN
Ez a felismerés a baktérium-sejtfal szintézisét gátló antibiotikumok kutatására irányította a figyelmet. Érdekessé váltak mindazok a vegyületek, amelyek a prokariota sejtfal képződésében zavart okozhatnak. Ilyenek a kefalosporinon kivül a cikloszerin, foszfonomicin, bacitracin, vankomycin, ristocetin antibiotikumok. Ezek a vegyületek a baktériumsejtfal szintézis különböző reakcióit gátolva fejtik ki antibakteriális hatásukat. A Dszerinből készülő cikloszerin mint D-alanin analóg gátolja D-Ala dipeptid képződést. A foszfonomicin foszfoenolpiroszőlősav analógként gátolja a muraminsav képződését. A bacitracin az izoprenilpirofoszfát hidrolízisét gátolva akadályozza a muramilpeptidek transzportját.
A ß-LAKTÁM GYŰRŰ FELNYÍLÁSÁT KATALIZÁLÓ ENZIM A PENICILLINÁZ Abraham korán felhívta a figyelmet a prokariotákban jelenlevő penicillint inaktíváló enzim jelenlétére a penicillináz (β-laktamáz) káros hatására. Erre az enzimre a penicillin széleskörű gyógyászati alkalmazása után megjelenő penicillin rezisztencia hívta fel a figyelmet. A penicillint inaktíváló enzim génje plazmidhoz kötve a rezisztencia gyors terjedését segíti. Ez a penicillin hatására felszaporodó mikrobiális enzim nagy valószínűséggel a sejtmembránhoz kötődő, eredetileg transzpeptidáz, illetve transzaciláz feladatot ellátó, úgynevezett penicillinkötő fehérje biokémiailag módosult formájának tekinthető. Az aktív centrumában található szulfhidril csoport reakciója a labilis laktám gyűrű felhasadását segíti elő. Az átmenetileg megjelenő acilezett enzim-komplex vizes közegben penicillosavra hidrolizál. Több esetben a penicillináz a membránhoz kötő fehérjeláncról lehasadva sejtmentes formában extracellulárisan is megjelenhet. Az enzim képződését általában a természetes penicillinek serkentik, de induktív hatásúak lehetnek a félszintézissel előállított β-laktamáz (penicillináz) rezisztens származékok is. Igen erős induktív hatású a penicillináznak ellenálló dimetoxibenzil-penicillin (penbritin).
28
A β-laktamáz (a reagáló penicillináz fragmentum kivastagítva) működése
Penicillináz, illetve ß-laktamáz Enzimaktivitás nemzetközi egysége {IU} az az enzim-mennyiség, amely percenként 1 µmol termék előállítására képes. A sebesség mértéke 1 molekula tömeg átalakításához szükséges idő Specifikus aktivitás 1 mg -1 3 enzimfehérje nemzetközi egységben megadott teljesítménye. kcat (sec ) 2 x 10 Szubsztrátummal való telítés esetén KM<<<[S] a turnover number Vmax = kcat[E]t Enzim koncentráció [E] = 1 molekulatömeg/liter A Bacillus cereus esetében a kezdetben membránhoz kötődő enzim a periplazmikus térben megjelenő proteáz hatására extracelluláris penicillinázként megjelenik a környezetben
Limitált proteolízis
Proteáz hatás |apoláros szakasz|
| ******extracelluláris penicillináz*******|
H2N–Met–(Xxx)15–Ser–(Xxx)22–Glu–Ser–Lys–Thr–Glu–(Xxx)258–Lys–COOH | O | foszfatídsavval acilezett szerin-OH HO–P=O | HO–CH–CH–CH2 | | | H O O | | O=C C=O | | R R R = páratlan szénatom számú alkil láncok (foszfolipid zsírsav)
A membránhoz kötődő penicillináz extracelluláris enzimmé válása
A penicillin-allergia jelensége a penicillin gyógyászati alkalmazásával egyidejű. A jelenséget kezdetben a termék szennyezettségével magyarázták. A technológia fejlődésével előállítható legtisztább készítmény alkalmazása sem szüntette meg a sokszor halálos kimenetelű reakciót. Kifejlődése egyéni érzékenységtől függ. A jelenség magyarázata szerint az azetidinon gyürű felhasadásakor az élő szervezetben fellelhető szabad aminocsoportok (pl. lizin ε -aminocsoportja) acileződhetnek. Ezek a bomlástermékek potenciális allergének, az emlős szervezetben viszonylag hosszabb ideig jelen vannak a bevitt antibiotikum kiürülése után is. Ezért célszerűnek látszott a penicillin érzékenység vizsgálatakor az antibiotikumon kívül a bomlástermékek allergén hatását is vizsgálni. A kifejlesztett készítmény D-benzilpenicillinen kívül benzilpenicillo savat, e sav propilamidját és egy polilizin származékot tartalmaz. (8 Lizin + 8 Benzilpenicillosav) Benzilpenicillo Na-só hűtött körülmények között nátriumhidroxiddal nyerhető. Penicillo-propilamid könnyen készíthető benzilpenicillin vizes oldatához propilamint csepegtetve (pH=11,5-12). Az oktalizin származékot Merrifield módszerével célszerű előállítani α-amino- tercier-butioloxikarbonil-ε-aminobenziloxikarbonil lizinből. A gyantáról a terméket hidrogémbromiddal telített trifluorecetsavval célszerű leválasztani, mert az így kapott okta-α-L-lizin-nonahidrobromid könnyen reagáltatható benzilpenicillin kálium sójával alkalikus (pH=11,5) körülmények között. A bőrbe juttatott fiziológiás sóoldatban oldott keverék pozitív esetben 20 perc alatt kiváltja a bőr érzékenységi reakcióját. A bevitel helye körül megjelenő pirosodás átmérője az érzékenység mértékéről tájékoztat. Általában a fenti keverék hatását először a bőrre karcolva vizsgálják és csak azután végzik el a kvantitatív eredményt szolgáltató bőrpróbát. Feltételezhető, hogy a vérfehérjékhez kötődő penicillin származékok és ezek bomlástermékei mind szérumfehérjéhez kötődő haptének, érzékeny egyéneknél ellenanyagképzést indukálnak. Ezt a hatást kis mennyiségű penicillin tartós jelenléte is előidézheti. Műhiba esetén szerencsés esetben az anaphylaxiás sokk kialakulását penicillináz injektálásával (8.millió E neutrapen) meg lehet akadályozni. Ez az enzim mennyiség kb. 1 óra alatt képes elbontani a szervezetbe került penicillináz érzékeny azetidinon származékokat HC == CH O H H H CH3 | | || | : : | HC C−−CH2 −− C−−N −−C------C------S-----C-CH3 || || | | | HC — CH O=C H-N------------C-H : | HOOC-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-N-H COOH | N-H Benzilpenicillosav | | ( O=C-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-N-H ) 6 [okta-ε-(D-benzilpenicillo)-okta-α-L-lizin] | N-H Benzilpenicillosav | | O=C-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-N-H | NH2 HC == CH O H H H CH3 | | || | : : | HC C −− CH2 −− C−−N−−C------C------S-----C-CH3 || || | | | benzil-penicillo-propilamid HC — CH O=C H-N-------------C-H | : CH3-CH2-CH2-N-H COOH
31
2013.05.15. du. 2:56 Preliminary condition (presumption) for overproduction of β-lactam antibiotics Copy number of synthase genes are necessary but not satisfy for overproduction of beta-lactam preferable condition: gluconeogenic pathway high level of NADPH high level of cAMP low level of GSH NADH regeneration to NAD+ FADH2 regeneration to FAD
by alternative (CN- resistant) respiration high DO level refrigeration of reactor (fermentation source)
favourable energy (carbon) source lactose, vegetable oil (glucose limitation) catabolite repression of secunder metabolit synthesis glucose or fructose as carbon source metabised by glycolytic pathway It seems the production rate determining factor is NADPH. Not only as essential cofactor for biosynthesis of building element of tripeptide but also needs to save reductive intracellulare milieu and held the ACV tripeptide in reducing form In the case of penicillin production there are any chance to recirculate AAA using ATP to form adipyladenilate for ACV formation, but in the fermentation source concentration of oxopiperidine carboxylate (pyroaminoadipate) rise up during fermentation The fungal cell are not able to uptake this circulare anhydro aminoacids The overproducer strain build up 10 times more aminoacids (Cys, Val, AAA) for ACV peptide formation than wild type for cellprotein. The regeneration of NADH and FADH2 cofactors by oxidative phosphorlation, - the turnover of path influenced by rate of ATP/ADP There are an other key point of carbohydrate metabolizm is the fructose 2,6-bisphosphate production which my be controled by cAMP level In the presence of glucose limitation cAMP level is high and cAMP activate protein kinase which able to transformed fructosephosphate kinase-2 into 2,6 bisphosphatase which is able to eliminate fructose 2,6bisphosphate Lac of this regulator compound fructose 1,6-bisphosphatase direct all of hexose or triose phosphate to hexosemonophosphate pathway helping to formation of NADPH There are an other oveerway to switch out this regulation if we use oleate as carbon source, the microbe bouild up all of amino acids from acetyl-CoA using oleate as carbon source The turnover of this path limited by the level of NAD+ and FAD There are an old (CN resistant, alternative) respiration system which are able to regenerate NADH and FADH2 using air oxygene without ATP formation
32
A β-LAKTÁM SZERKEZETŰ VEGYÜLETEK BIOSZINTÉZISE A fehérje szintézishez felhasználára kerülő L-cisztei és L-valin a nitrogén anyagcsere természetes terméke. A harmadik az α-amino-asdipinsav a lizin szintézis köztes termékeként van jelen mégpedig adenilát formájában vegyes anhidridként. A α-ketoadipinsav a prokariotákban a lizin lebontás köztes termékeként jelenik meg. Az ábra a tömlősgombákban foklyó lizin szintézis vázlatát mutatja
A bioszintézis köztes terméke a δ-adenilil-α-aminoadipát az ACV tripeptid képződéshez felhasználható aktivált amionosav, amely a vezikulumban folyó tripeptid szintézis ideális alapanyaga.
33
A β-laktám antibiotikumot termelő prokariótákban a lizin bomlástermékei között fordul elő a ketoadipinsav, amelyből a bioszintézishez szükséges aktivált aminosav ATP felhasználásával képződik
Az azetidinon gyűrűt tartalmazó penám, illetve kefém (cephem) vázat tartalmazó vegyületek bioszintézise azonos kiindulási anyagokból, hasonló módon folyik a fonalas gombákban és a sugárgombákban.
34
Penicillin képződéséhez
ACV tripeptid szintetáz (ACVS) izopenicillin N szintetáz (IPNS) és izopenicillin aciltranszferáz, (IAT) penicillinaciláz szükséges Penicillint termelő gombákban az izopenicillin aciltranszferáz mikro testecskébe rögzítve működik Ebből a testecskéből kerül a környezetbe a penicillin. A többi enzim a citoplazmában tevékenykedik.
35
Cephalosporin képződést katalizáló enzimek a citoplazmában működnek Az első két enzimkomplexen (ACVS, és IPNS) kívül izopenicillin epimeráz és a gyűrűtágító rendszer expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz szükséges a folyamathoz. A befejező lépéseket négy enzim: a hidroxiláz, aciláz, karbamoil transzferáz, és a metil transzferáz katalizálja A felsorolt enzimek génjeit az elmúlt évtizedben elkülönítették, szekvenálták, majd penicillint nem termelő gombába telepítve azokat penicillin szintézisre késztették. A szekvencia analízis a gének nagyfokú hasonlóságát igazolták. A változások vizsgálata alapján feltételezhető, hogy a bioszintézisben résztvevő gének a prokariotákból kerültek a fonalas gombákba. A prokarioták számára viszont határozott szelekciós előnyt jelentett a β-laktám szerkezetű széles spektrumú antibakteriális hatású anyagok megjelenése. Az izopenicillin N-ből penicillin képződést csak a fonalas gombákban figyelték meg. A prokariotákban működő epimeráz és a gyűrűtágító mechanizmus létrehozza a kefém (cephem) szerkezetet, amely magában hordozva a penicillináz rezisztenciát, Gram+ és Gram− szervezetek növekedését is gátolja. ACV tripeptid szintetáz A primer anyagcserében nem szereplő első vegyület egy tripeptid a δ-L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-D-valin. Képződését L konfigurációjú aminosavakból az acvA/pcbAB struktur-gén által kodolt ACV tripeptid szintetáznak nevezett két fehérjéből épülő komplex katalizálja. A valin izomerizálását is a komplex végzi. A peptid kötések kialakításához szükséges energiát az aminosavak aktíválásakor az ATP
szolgáltatja. Az antibiotikum képződése jelentős mértékben terheli a termelő törzs anyagcseréjét. A nagyobbrészt klasszikus genetikai kezeléssel kifejlesztett - iparban használt - törzsek szárazanyag tartalmukat meghaladó mennyiségben termelik az antibakteriális hatású vegyületeket. A hatásos vegyületek építőelemeit a kinemesített mikroszervezetek saját anyagcseréjük terhére szintetizálják. L-α-aminoadipinsav | ATP
L-cisztein
L-valin ATP
ATP tripeptid (ACVS) szintetáz O H H SH CH3 || | | | | HOOC−−CΗ−CΗ2−CH2−CH2−−C−−N—C—CH2 H H−C−CH3 | | | | NH2 O=C ——— N ——— C−H | L-α-aminoadipilL-ciszteinilD-valin COOH (ACV tripeptid) Figyelemre méltó analógiát találunk a fenti tripeptid képződése és az élő sejtben fontos szerepet játszó hasonló kémiai szerkezetű glutation a γ-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin bioszintézise között. Különbség, hogy az adipinsav egy szénatommal hosszabb a glutaminsavnál. A D-valin pedig a glutationnal összehasonlítva lényegesen növeli a kis peptid apoláros tulajdonságát. H H H H O H H H | | | | || | | | HOOC—C—C—C—C---C—N—C—C—SH | | | | | H CH3 H2N H H H H | | O=C—— N—C—CH—CH3 | | H COOH ACV tripeptid
H H H O H H H | | | || | | | HOOC—C—C—C—C—N—C—C–SH | | | | H H2N H H H | O=C—–N—C—H | | H COOH
glutation tripeptid (G-SH)
A két tripeptid-szintetáz méretbeli eltérésén túl a két enzimkomplex kémiai szerkezete is alapvetően különbözik. Az ACV-szintetáz a glutation-szintetáznál nyolcszor nagyobb. 36
Az idiofázisban képzodoadipilciszteinil-valin tripeptida penám váz kialakulásánaKaz elofeltétele
A gombák exponenciális növekedési fázisában képzodotripeptid,
a (glutamilciszteinil-glicin)
Glutation fontos szerepet tölt be, az aminosavfelvételben
37
A gombákban képződő több mint 11ezer bázispárt tartalmazó acvA gén több mint 3700 aminosavból épülő fehérjét kodol. Az Acremonium chrysogenum-ból izolált ACV-szintetáz (ACVs) és a Penicillium chrysogenumban működő ACVs szekvenciája több mint 50%-os egyezést mutat. A kémiai szerkezetben három helyen mintegy 600 aminosavra kiterjedő teljes homológia figyelhető meg Különböző azetidinon származékot termelő törzsekből nyert ACVs összehasonlítása
Genom DNS bp Aminosav-szám Molekulatömeg
Aspergillus. nidulans P. chrysogenum P.chrysogenum II Acremonium.chrysogeneum Ll310 11376 11328 11136 3770 3792 3776 3712 422486 425971 423996 414791 * (The Mycota II. Genetics and Biotechnology Springer-Verlag Berlin 1995. 263-285)
A homológia nem csak a gombáknál, de a Streptomyces clavuligerus izolált ACVS-re is érvényes. Sőt hasonló doment találtak a Gramicidin S szintézisre képes Bacillus brevis-ből nyert fehérje-komplex mindkét alegységében. Az enzim közös szakasza a kiválasztott aminosav adenilezését végzi. Ez az aktiválás előfeltétele a peptid kötés kialakulásának. A gén eredetére utalhat az, hogy a tömlős gombában előforduló gén intront nem tartalmaz. Átíráskor az RNS polimeráz közvetlenül az ACVS mRNS-t hozza létre. A vakuola membránhoz kötődő ACVS enzimkomplex termékeként megjelenő oligopeptid (ACVtripeptid) ellenáll a sejten belül működő proteolitikus hatású enzimeknek, mivel az egyik kötés egy δ-karboxil csoport és egy L-aminosav amino-csoportja között, a másik pedig az L cisztein és a D-valin között létesült. Ilyen kötéstípus a sejt fehérje frakciójában nem fordul elő. Valójában a glutation szerkezete is stabil a proteázok aktivitásával szemben, mivel az L ciszteinhez γ-karboxil csoport kapcsolódik, a glicinnel alkotott peptid kötést pedig a protázok nehezen bontják. Ez a tripeptid szintetáz (ACVS) in vitro különböző glutation analógok előállítására használható. A szubsztrátum változtatásával a valin helyett aminovajsav, norleucin vagy izoleucin építhető a molekulába. Ezek a glutation analógok in vivo zavarják a kisérleti alany normál anyagcseréjét, különös tekintettel a sejtben kialakuló oxidoredukciós viszonyokra. Az élő sejt működése megkívánja a redukáló körülményeket. Ezt igazolja , a jól mérhető G-SH : G-S-S-G arány alakulása. A képződött oligopeptidet a környezet redoxviszonyaira érzékeny. NADPH-val táplált (tioredoxin reduktázhoz hasonlóan) diszulfid-reduktáz rendszer tartja redukált formában. A diszulfid kötéssel kialakuló tripeptid-dimer ugyanis nem képes további reakciókban részt vállalni. Amint az tudott a glutation is csak redukáló körülmények között, monomer formában láthatja el feladatát, például aminosav-transzport folyamatot.
38
IZOPENICILLIN-N SZINTETÁZ — A CIKLÁZ KOMPLEX MŰKÖDÉSI MECHANIZMUSA A bioszintézis következő lépésében a sejt ATP energiatartalmát használva egy ipnA/pcbC gén által kodolt (nonhemeFeIIfüggő oxidáz) enzimkomplex, az izopenicillin N szintetáz (IPNS) oxigén jelenlétében a citoplazmában alakítja ki a lineáris tripeptidből az azetidinon gyürűt tartalmazó izopenicillin N vegyületet. L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-D-valin (ACV tripeptid) Fe++ O2 Mg++ ATP
ditiotreitol izopenicillin -N-szintetáz
CH3 H H H H O H H H | | | | || | : : | HOOC—C—C—C—C—C— N---C---C—S—C—CH3 | | | | | | | H 2N H H H O=C---N--------C—H : izopenicillin-N COOH Ez a 38 kDa mértű fehérje 4 hidrogén eltávolításával alakítja ki a hasznos terméket. In vivo az IPNS aktív központját a növekedési szakaszban fölöslegben levő glutation foglalja el. Sejtmentes körülmények között a reakció ditiotreitol jelenlétéhez kötött, mivel az ACV tripeptid SH-csoportját az oxidatív hatásokkal szemben védeni kell a tiazol gyürű záródásáig. A képződött reakciótermék L-α-aminoadipinsavval acilezett penám váz, (izopenicillin-N) a kefalosporin és a penicillin bioszintézis közös intermedierje. Az enzimkomplex (izopenicillin-N szintetáz) teljes szekvenciáját összehasonlítva meglepően nagymértékű egyezés található a penicillint termelő Penicillium chrysogenum, a cefalosporint termelő Acremonium chrysogenum, a cefamicint termelő Streptomyces clavuligerus és S. lipmanii, valamint az antibiotikumot alig termelő Aspergillus nidulans-ban képződő fehérjék kémiai szerkezete között. Carr és munkatársai összehasonlították az AS-P-78 jelű P.chrysogenum törzsből nyert IPNS enzim szerkezetét a belőle kapott (23x80-269-37-2) jól termelő mutánsból izolált enzim szerkezetével. Egyetlen aminosavban találtak eltérést. A tirozint kodoló TAC triplet ATC-re változva izoleucint tartalmazó enzim képződését írta elő. In vitro ez a különbség az enzim működésében érzékelhető eltérést nem okozott, ---MASTPKANVPKIDVSPLFGDNMEEKMKVARAIDAASRDTGFFYAVNHGVDV K ALSNKTREFHFS I T MGSVPVPVANVPRIDVSPLFGDDKEK KLE VARAIDAASRDTGFFYAVNHGVDL PWLSRETNKFHNS I T MPVLMPSAHVPTID ISPLFG TDAAAKKRVAEEIHGACRGSGFFYATNHGVDVQQLQDVVNEFHGAMT MGSV----SKANVPKIDVSPLFGDDQAAKMRVAQQIDAASRDTGFFYAVNHG INVQRL SQKTKEFHMS IT DEEKWDLAIRAYNKEHQDQIRAGYYLS I PEKKAVESFCYLNPNFKPDHPL IQSKTPT HEVN2VWPDEKK DEEKWQLAIRAYNKEHE SQIRAGYYLP I PGKKAVESFCYLNPSFSPDHPR IKEPTPMHEVNVWP DEAK DQEKHDLAIHAYNPDN P-HVRNGYYKAVPGRKAVESFCYLNPDFGEDHPMIAAGTPMHEVNLWPDEER PEEKWDLAIRAYNKEHQDQVRAGYYLSI PGKKAVESFCYLNPNFT PDHPR IQAK TPTHEVNVWPDETK HPGFREFAEQYYWDVFGLSSA LLRGYALALGKEEDFFSRHFKKEDALSSVV LIRYPYLNPYPPAAIKTAE HPGFRAFAEKYYWDVFGLSSAVLRGYALALGRDEDFFTRHSRRDTTLSSVV LIRYPYLDPYPEPAIKTAD HPRFRPFC EGYYRQMLKLSTVLMRGLALALGR PEHFFDAALAEQDSLS SVSLIRYPYLEEYP--P-VKTGP HPGFQDFAEQYYWDVFGLSSALLKGYALALGKEENFFARHFKPDDTLASVVLIRYPYLDPYPEAAIKTAA DGTKLSFEWHEDVSLITVLYQSDVANLQVEMPQGYLDIEADDNAYLVNCGSYMAHITNNYYPAPIHRVK DGTKLSFEWHEDVSLITVLYQSDVQNLQVKTPQGWQDIQADDTGFLI NCGSYMAHITDDYYPAPIHRVK DGQLLSFEDHLDVSMITVLFQTQVQNLQVETVDHWRDIPTSENDLVNCGTYMAHVTYDYFPAPNHRVK DGTKLSFEWHEDVSLITVLYQSHVQNLQVETAAGYQDIEADDTGYLINCGSYMAHLTNNYYKAPIHRVK WVNEERQSLPFFVNLG FNDTVQPWDPSKE- DG K -TD- QRP- --ISYGDYLQ NGLVSL NK- NGQT Pen. WVNEERQSLPFFVNLGWEDT IQPWDPATAKDGAKDAAKDKPAI SYGEYLQ GGLRGLNKKNGQT Acr. F VNAE RLSLPFFLNGGHE AV IE PFVP-- -- -- -EGASEEVR—NEAL SYGDYLQHGLRAL I VKNGQT Str. WVNAERQSLPFFVNLGYD SV IDPF DP-REPNG- K - SD----- REPL SYGDYL QNGLVS L INKNGQT Asp.
Az enzim specificitását részletesen vizsgálták a Penicillium chrysogenum és Acremoniun chrysogenum tenyészetekből nyert cikláz készítmények esetében. A kisérletekben nem csak a penicillin, a kefalosporinok és a kefamicinek közös intermedierjeként elfogadott δ-L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-D-valin tripeptidet, hanem a fenilacetil-L-ciszteinil-D-valin peptidet is felhasználták szubsztrátumként. A reakcióelegy 250 ml térfogatban (összetétele 30 mM Tris-puffer /pH 8/ 0,1 mM ferroszulfát, 1 mM aszkorbinsav, 2 mM ditiotreitol, 0,2 mM - 2 mM tripeptid dimer formában) 0,3 mg enzimkivonatot tartalmazott. Mindkét faj genetikailag nemesített, ipari
39
termelésre kiválasztott törzseiből nyert enzimkivonat 25 oC -on képes volt kialakítani az azetidinon szerkezetet. A bioszintézist azonos térfogatú metanol hozzáadásával állították le. A benzilpenicillin képződés nagyságrendi eltérést mutatott. Az Achremonium chrysogenum-ból kinyert szintetáz topológiai felépítettsége is a penám szerkezetű vegyület képződésének kedvez. D-valin tartalmú tripeptidből csak izopenicillin-N képződik. A D-valin helyett D-αaminovajsavat tartalmazó tripeptidből viszont kisebb mennyiségű cefám szerkezetű termék képződése is megfigyelhető. D izoleucint tartalmazó tripeptidből in vitro ugyancsak penám vázú és cefám vázú vegyületek képződnek. A szintetáz topológiai felépítettsége a penám vegyület képződésének kedvez. Achremonium chrysogenum-ból izolált izopenicillin N szintetáz jelenlétében az L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-Dα-aminobutánsav sztereoszelektíven deuterált származékaiból normetil-penám és normetil-cefám szerkezetű vegyületek képződnek. A képződés arányát a nyíl vastagsága jelzi. A cefám szerkezetű termék képződésekor természetesen a C3' deuterium megőrzi térbeli helyzetét.
40
Izopenicillin aciltranszferáz (IAT) Ez az enzim mikroszómában működik.Cephem szerkezetű antibiotikumot termelő törzsekben ez az enzim nem képződik.A penicillint termelő mikroorganizmusokban az aatA/penDE gén által kodolt enzim az izopenicillin-N hidrofil természetét fokozó L-a-aminoadipinsavat valamilyen aktívált formában (acil-S-CoA) jelenlevő hidrofób természetet fokozó karbonsavra cseréli. Ha a tenyésztő közegben fenilecetsav van jelen, akkor benzil-penicillin képződik. Fenoxiecetsav adagolás hatására V penicillin képződik. H H CH3 : : | HOOC-CH-CH2-CH2-CH2-CO-NH-C---C—S—C-CH3 | | | | NH2 O=C---N--------C-H : COOH izopenicillin-N
H H H H–C— C—C–H H + HO-C—N—C-H H | | H COOH
G-penicillin KÉPZŐDÉS
H H CH3 : : | (BENZIL)--CO-NH-C---C—S—C-CH3 | | | + penicillinaciláz O=C---N-------C-H : (BENZIL)-CO-S—CoA COOH
Adenil-C=O | H H H H-C-H NADH H–C—C—C–H | NAD+ H ATP PP H-C-H | dehuidrogenáz O=C —N—C-H (oxoprolináz) H-C-H | | oxopiperidináz | H COOH H-C-NH2 | 6-oxopiperidin-karbonsav COOH
Reakció közben az aminoadipinsav átmenetileg gyürűs formában, 6-oxopiperidin-2-karbonsav formájában szabadul fel. A reakció a glutation által segített glutamil-acil transzferáz reakciókor észlelt oxoprolin képződéssel analóg. A képződő gyűrűs forma ez esetben ATP felhasználásával oxoprolináz segítségével aktiválódva vegyesanhidridként vesz részt a jól ismert glutation szintézisben. A penicillint termelő szervezetben az oxopiperidin-karbonsav regenerálása is megtörténik és az ATP felhasználásával atíválódó L-αaminoadipinsav egy újabb tripeptid képződésében vehet részt. Veszteségként ipari körülmények között az a hányad jelentkezik, amelyik a sejtből a környezetbe kerül. Méréseink szerint a fermetlében megjelenő oxopiperidin karbonsavat már nem veszi fel a tenyészet. Ugyanígy - valószínűleg felvételi nehézségek miatt nem lehet fokozni az azetidinon képződést a táptalajhoz adott L-α-aminoadipinsavval. A Penicillium chrysogenum-ban és az Aspergillus nidulans-ban képződő 357 aminosavat tartalmazó izopenicillinaciltranszferáz (IAT) nagyfokú hasonlóságot mutat. Az 1275 illetve 1237 DNS bp -ból képződő enzim moltömege 39943 illetve 39240. Ezzel szemben. a baktériumokban, például Escherichia coli ATCC 11105 törzsben előforduló —(a 6-aminopenicillansav előállításához is felhasznált)— hasonló funkciót betöltő penicillin aciláz aminosavszekvenciája alig (11 %-ban) hasonlít a gombákban működő enzimekhez. Izopenicillin epimeráz Cephem szerkezetű antibiotikumot termelő törzsekben képződő penicillin az izopenicillinből képződik. A cefD gén által kodolt izopenicillin-epimeráz, az L-α-aminoadipinsav építőelemet irreverzibilisen enantiomerjévé alakítva katalizálja a D-α-aminoadipinsavat tartalmazó penám váz képződését. A gyűrűtágítást végző enzim ugyanis csak N-penicillint fogad el szubsztrátumként. H H CH3 NH2 | H H H : : | H--C--C--C--C--C--N--C----C----S----C---CH3 | H H H || | | | | COOH O H C ----N---------C--H L-α-amino adipinsav || : O COOH
izopenicillin N
izopenicillin epimeráz
COOH H H CH3 | H H H : : | H--C--C--C--C--C--N--C----C----S----C---CH3 | H H H || | | | | NH2 O H C----N----------C--H D-α-amino adipinsav || : COOH O
penicillin N
41
Gyűrű tágítás Ring expandáz (REX) Cephem váz képződés A cefém váz kialakítását gyűrűtágítással az expandáznak nevezett vasat tartalmazó dioxigenáz enzimkomplex, a DAOC-szintetáz végzi. Molekuláris oxigén felhasználásával alakítja ki a telitetlen dezacetoxi cefalosporin C (DAOcefC) vegyületet. Feltételezhető egy hidroxilezett származék átmeneti képződése (az ábrán zárójelben ), amelyből víz távozásával jelenik meg a cephem szerkezet. Az expandáz által előállított vegyület, a dezacetoxi cephalosporin-C még két helyen hidroxilezhető a cephem vázat kialakító törzsek enzimkészletével. A kettős kötés mellett levő metil csoport és az amino csoportot hordozó C7 atom hidroxilezése minden esetben dioxigenáz működését igényli. A légköri oxigén egyik atomja a szénvázhoz; a másik oxigén atom pedig a koreduktánshoz kapcsolódva, az α-ketoglutársav—>szukcinát átalakulást segíti CO2 képződés közben. (Hasonló rekció alakítja posztszintetikusan az élő sejtben működő fehérjékben levő prolint hidroxiprolinná, vagy a lizint hidoxilizinné.) In vitro körülmények között aszkorbinsav is adandó a reakcióelegyhez. Az Acremonium chrysogenum-ban a cefEF gén által kodolt gyürűtágitó és hidroxilező enzimkomplex a metilcsoportot hidroxilezve a dezacetilcephalosporin C képződését segíti. A DAcefC acetilezését a cephalosporin C szintézis befejező lépéseként — a cefG gén terméke — a dezacetilcephalosporin C acetil transzferáz (DACAT) végzi. A Streptomyces clavuligerus-ban a cefE gén terméke a DAOcefC képződését segíti. A metil csoportot a cefF gén terméke hidroxilezi. A dezacetilcephalosporin C hidroxil csoportját a cmcH gén által kodolt DAC karbamoil transzferáz karbamoilezi. Az amino csoportot hordozó C7 atomot a cmcI gén terméke hidroxilezi. A hidroxil származék metilezését pedig a cephamycin C szintetáz végzi. Megjegyzendő, hogy az Acremonium chrysogenum fermentlevében a 7-metoxi cephalosporin C származék alig kimutatható
COOH H H | H H H : : H—C—C—C—C—C—N—C—C—S—CH2 | H H H || | | | | dezacetil-cefalosporin C NH2 O H C—N—C = C—CH2-OH || | CO2 ATP Gln O COOH COOH H H 3-hidroximetilceph-3-em | H H H : : O-carbamoiltranszferáz H—C—C—C—C—C—N— C—C—S— CH2 NH2 | H H H || | | | | | NH2 O H C—N—C = C−CΗ2−O−C=O PP Glu || | O COOH (carbamoil-cefalosporin) 7-demetoxicephamycin COOH CH3-O H | H H H : : 7-α-hidroxiláz H—C—C—C—C—C—N— C—C— S— CH2 NH2 (Fe++ dioxigenáz) | H H H || | | | | | cephamycin szsintetáz NH2 O H C—N—C == C−CΗ2−O−C=O metionin ATP B12 || | O COOH cephamycin-C
42
Penicillin szintézis a csúcs-sejtben A ß-laktám antibiotikumok szintézise a fonalas gombák fiziológiailag legaktívabb részében, a csúcssejtben történik. A pellet képződés ebből a szempontból is hasznos, meert a néhány tized mm átmérőjű göbök felületéről nagy számban rövid fonalak nyúlnak a környezetbe. Kis térfogatra sürítve nagy mennyiségben növekedő fonalak, jól levegőztethető csúcs sejtjeiben történhet a hatóanyag képződése.
43
CEPHEM származékok képződése
Acremonium chrysogenum tenyészetében
COOH H H CH3 | H H H : : | H--C--C--C--C--C--N--C----C----S----C---CH3 | H H H || | | | | NH2 O H C----N--------- C--H || : O COOH
penicillin N
pen N
Fe++ O2 dioxigenáz expandáz
COOH H H HO-CH2 | H H H : : | nemizolált H--C--C--C--C--C--N--C----C----S----C---CH3 feltételezhető | H H H || | | | | köztestermék NH2 O H C ----N---------C--H || : O COOH COOH H H | H H H : : H--C--C--C--C--C--N--C----C----S----CH2 | H H H || | | | | NH2 O H C ----N---C == C--CH3 || | O COOH
dezacetoxicefalosporin C
DAOcefC
Fe++ O2 dioxigenáz DAC-hidroxiláz
COOH H H : | H H H : H--C--C--C--C--C--N--C----C----S----CH2 | H H H || | | | | dezacetilcefalosporin C NH2 O H C ---N----C ==C--CH2-OH || | acetil-CoA O COOH DAcefC cephalosporin acetiltranszferázáz COOH H H | H H H : : CoA-SH H--C--C--C--C--C--N--C----C---- S----CH2 O | H H H || | | | | || cefalosporin C NH2 O H C----N- --C == C--CH2-O-C--CH3 || | O COOH cef C Fe++ O2 COOH HO H (dioxigenáz ) | H H H : : cephalosporin C H--C--C--C--C--C--N--C----C----S ----CH2 O hidroxiláz | H H H || | | | | || 7α α-hidroxi-cefalosporin C NH2 O H C----N- --C == C--CH2-O-C--CH3 || | O COOH
A gombákon kívül azetidinon szerkezetű hatóanyagot termelének a prokaroták. feltüntetett eredményeket
44
Lásd a jegyzet 24.-ik oldalon
Cephem származékok képződése a prokariotákban
45
A részletesen vizsgált Streptomyces clavuligerus a vázlaton bemutatott Cephamycin C termelése mellett erős penicillinázt gátló hatóanyagot termel. Ez a vegyület a ß-laktamáz enzimek aktív centrumába hatolva inaktíválja a penicillin rezisztenciát okozó fehérjét A hatűásos anyag bioszintézise arginin és slicerinaldehid-3-foszfát (GAP)
kondenzációjával indul, amit azetidinon gyürű kialakítása követ. A végterméken lívül a fermentlében néhány köztes termék jelenlétét is igazolni lehet
A géncsoportok szabályozottságát bemutató ábrán az együtt átíródó csoportokat hullámvonal jelöli Az ábrán bemutatott eddigi vizsgálatok szerint a clavulánsav képződést a cephamycin C bioszintézist szabályozó ( CcaR ) fehérje is képes befolyásolni. Ugyanakkor a clavulánsav bioszintézist egy az előzőtől különböző fehérje ( ClaR ) szabályozza (regulálja), mégpedig az ábrán jól látható három helyen. Ez a szabályozó fehérje nem befolyásolja a cephamycin képződést.
46
A clavulansav hatásmódjának vázlata
47
A PENICILLIN KÉMIAI SZINTÉZISE. A kémiai szerkezet ismeretében a korabeli technológiák ismeretét hasznosító peptidkémikusok megkisérelték a penicillin totálszintézisét. A penicillamin szintézisére viszonylag könnyen adódott módszer. Az Erlenmeyer féle azlakoton szintézissel acetonból és hippursavból nyerhető 2-fenil-4-izopropilidén-oxazol-5-on-ból nátriummetilát jelenlétében a benzil-tioéter származék képződik. A lakton gyürű felnyitását a benzoesav eltávolítása követte. A tioéter származékból a DL penicillamint De Vigneaud szerint végzett hidrogenolízissel állították elő. Rezolválásra több lehetőség adódik. Az egyik előnyös módszer szerint a benziléterrel formilezhető penicillamin brucin sójából az L-enantiomer jól kristályosodik. Az anyalúgban maradó D enantiomer hidrogenolízisével nyerhető a D-penicillamin.
A penaldsav-etilésztert reagáltatva a D-penicillaminnal penicillosav etilészter képződik, amelyből dioxánban foszfortriklorid és jégecet jelenlétében kialakítható a penám váz tiazol gyürűje. A termék 1-2%-os hatásfokkal enantiomerek elegyét szolgáltatja. Ez nem tekinthető járható útnak. A szerveskémiai szintézis módszereinek gyors fejlődése, különösen a peptidszintézis fejlesztése közben kialakított új módszerek alkalmazása az ötvenes években már racionálisabb szintézis kidolgozását tette lehetővé.
48
A ftálimid védőcsoport irányító hatása, a tercierbutilészter csoport könnyű eltávolíthatósága és az Ndiciklohexil-karbodiimid alkalmazása jelenti az ugrásszerű fejlődést. Sheehan és munkatársai 1955-ben ismertetik a benzil-penicillinnél lényegesen stabilabb V-penicillin szintézisére vezető eljárásukat. Az első reakciólépésben a penicillamin hidroklorid nátriumacetáttal pufferolt vizes etanolban reagál a tercierbutilftálimido-malonaldehiddel. A ftalil-csoport eltávolítását hidrazinkomplex képzésén keresztül sósavval végezték ecetsavban szuszpendálva. A tercier-butiloxikarbonil-tiazolidin származék aminocsoportját egyenértéksúlynyi fenoxi-ecetsavkloriddal acilezték két ekvivalens trietilamin jelenlétében. A tercier butiloxi csoport eltávolítását metilénkloridban vízmentes sósavval végezték, amit átkristályosítás követett ekvivalens piridint tatalmazó vizes acetonból. A gyürűzárást ekvivalens mennyiségű N-diciklohexil-karbodiimiddel végezték vizes dioxán oldatban. A kapott termék aktivitása megegyezett a fermentációs úton nyert termékkel. A tritil védőcsoport alkalmazása megadta a lehetőséget a penicillin mag, a 6-amino-penicillansav totálszintézisére. A ftalil csoport eltávolítása elött a karboxil csoportot észterezték. A tercier-butiloxi védelem eltávolítása után dietilamin jelenlétében tritilezték az aminocsoportot. Ezt követte a gyürűzárás, amit N,N’-diizopropilkarbodiimiddel hajtottak végre dioxánban D-α-4-karbometoxi-5,5-dimetil-α-tritilamino-2-tiazolidin-ecetsavból. Aluminium-oxidon végzett kromatografálással kristályos formában nyerték a 6-tritilamino penicillansavmetilesztert. Ebből az észter hidrolízisével dietilamin sót nyertek, majd híg sósavval a tritilcsoport eltávolítása következett. A penicillin totálszintézise az enantiomerek előállítására is lehetőséget adott. Ezek a vegyületek azonban érthető okokból biológiai aktivitást alig mutattak (0,7% a természetes származékkal összehasonlítva). A totálszintézis területén elért tudományos eredmények gazdaságos gyártásra nem adtak lehetőséget. A ß-laktám antibiotikumok előállítására ma is a fermentációs eljárást használják. Korszakalkotó jelentőségű viszont, hogy a kutatók figyelmét a félszintézissel előállítható új penicillin származékok irányába mozdította. PENICILLIN ANALÓGOK ELŐÁLLÍTÁSA FÉLSZINTÉZISSEL Nagy áttörést jelentett Chain és munkatársainak az a felismerése az ötvenes évek végén, hogy a penicillin alapváz 6-aminocsoportja tetszőleges reagenssel acilezve új nagyhatású penicillin származékok előállítását teszi lehetővé. A biológusok, már évekkel előbb (Kato 1953) közölték a savkomponens nélküli, úgynevezett penicillin mag képződését. Sőt japán szerzők már 1950-ben leírták a fenilecetsav mikrobiológiai úton történő eltávolítását. Ezek a japán nyelven megjelent közlemények elkerülték a kutatók figyelmét.A mikrobiológiailag előállított alapmolekula kémiai acilezésének gondolatát talán Sheehan és munkatársainak 1955-ben közzétett eredményei hívták elő. Hamarosan mikrobiológiai eljárás született a félszintézishez használható 6-amino-penicillansav előállítására.
Prekurzor nélkül végzett fermentációs eljárásokon kívül sikerrel alkalmaztak biokonverziós módszereket a félszintézishez szükséges alapanyag előállítására. Hamarosan kiderült, hogy a prekurzor nélküli direktfermentációs eljárás közel egy nagyságrenddel alacsonyabb kihozatala miatt nem kerülhet ipari alkalmazásra. A gyógyszeriparban nagymennyiségben gyártott mindkét penicillin féle (G, és V penicillin) felhasználható kiindulási anyagként. A Gram-negatív baktérium törzsekben (Escherichia coli) előfordul egy fenilecetsavval indukálható enzim a penicillin-aciláz (penicillin amidáz), amely képes reverzibilisen a G-penicillint fenilecetsavvá és 6-amino- penicillansavvá bontani. Más baktérium csoport tagjai - az Achromobacter és Streptomyces fajok - a V-penicillint bontják 6aminopenicillansav és fenoxiecetsav képződése közben. Ezek az enzimek eredetileg valamilyen transzacilezési folyamatot katalizálnak. Lúgos pH a hidrolízisnek, a 49
savanyú pH a szintézisnek kedvez. A reverzibilis reakció teljessé tételét a hidrolízis termékek eltávolítása segíti. Példaként említhető a képződő sav semlegesítése trietanolamin adagolásával. A reakció elegyben feldúsuló 6aminopenicillan sav az oldatban levő széndioxiddal reagálva inaktíválódhat. Semleges pufferben, széndioxid jelenlétében 37 fokon három óra alatt akár 50%-a képes alkalmatlan termékké alakulni. Az először képződő karboniloxi származékból a penillin átrendeződéshez hasonlóan imidazolon származék képződik. Ennek enol alakja könnyen dekarboxileződve a 6-aminopenicillansav stabil, de inaktív izomérjét szolgáltatja. A másik inaktiválódási lehetőség a polimerizáció, amit maga a reverzibilisen működő amidáz végez a termékkoncentráció növekedésekor. Ezeket a zavarokat kiküszöbölendő általában rögzített enzimmel működő eljárást használ a gyógyszeripar. Az amfoter tulajdonságú végtermék kinyerésére előnyösen használható az adszorbciós gyanta, vagy az ioncserélő módszer, de kellő nagy koncentráció esetében izoelektromos ponton (4,3 pH) történő kristályosítással is elkülöníthető a reakcióelegyből az értékes termék (6-APS). A félszintézishez használható alapanyag (6-APS) nagyvolumenű előállítására, illetve a fenoxiecetsav tetszőleges csoporttal való kicserélésére kémiai megoldás is ismeretes. Első lépésként a penicillin karboxil csoportjának a védelme alkil-szililészter képzésével oldható meg. A kapott reakcióterméket -30 oC alatt iminohalogenidet képző reagenssel, például foszforpentakloriddal hozzák össze. Az átmeneti termékként képződő N-monoszubsztituált imino-kloridot alkohollal reagáltatva imino-éterré alakítják, amelyből az iminoéter csoport és a védőcsoport hidrolízisével nyerhető 6-aminopenicillan sav.
Ezek az eljárások gazdaságos lehetőséget jelentettek félszintézissel előállítható új penicillin származékok nagyipari előállítására. Általában — így az oxacillin előállításakor is — savkloridokat használnak acilező szerként.
Egyes esetekben az enzimes szintézis is szerepet kap, kihasználva a penicillin- (aciláz) amidáz reakció reverzibilis voltát. Különösen előnyös az enzim, ha ezzel elkerülhető a védőcsoport használata. Igy gazdaságosan nyerhető az ampicillin fenilglicin-tioglikolsav észterből és 6aminopenicillansavból penicillin-aciláz enzimmel savanyú közegben végzett reakcióval. A hatvanas években előállított sok ezer új vegyület között több száz hatásos ter mék akadt. Ezek az új származékok a fermentációs úton előállítható két (G- és V-penicillin) származéknál előnyösebb terápiás Ampicillin előállítása Escherichia coli tenyészetével 50
hatásúak. A savamid kötés közelében elhelyezett nagy térkitöltésű szubsztituens (methicillin, penbritin) védelmet jelentett a penicillináz inaktíváló hatásával szemben. A savállóságot növelte a savamid kötés közelében elhelyezkedő elektronszívó csoport (oxacillin, cloxacillin, flucloxacillin). A baktérium spektrum szélesítése céljából előnyös volt az amino csoportot tartalmazó arómás savvakkal (fenilglicin, p-hidroxi-fenilglicin) történő acilezés (ampicillin, amoxicillin). Szabad karboxil csoport jelenléte (fenilmalonsav) a Pseudomonas fajok leküzdésére is alkalmassá teszi az új származékot (carbenicillin). A penámváz karboxil csoportját érintő kémiai átalakítások (pl.G-penicillin acetoximetilésztere) az alkalmazhatóságot befolyásolhatják (maripen). A félszintézissel előállított új származékok antibakteriális hatása (MIC érték) is kedvezően megváltozhatott. Eltérést találtak a felszívódásban, a kiürülésben, a vérszint alakulásában. A hetvenes években a félszintetikus penicillin származékok mellett egyre nagyobb jelentőséget nyernek a cefalosporin származékok. Cephalosporin-C-ből induló félszintetikus termékekhez vezető út első feladata a Dα-aminoadipinsav oldallánc eltávolítása. A D-α-aminoadipinsav egyetlen fermentációs lépésben való eltávolítása nem könnyű feladat. Egyetlen meg nem erősített japán közlemény állítja a reakció végbemenetelét. Ezzel szemben jó hatásfokkal távolítható el az oldallánc két független fermentációs lépésben. Először Trigonopsis variabilis tenyészlevében az aminocsoport oxidatív eliminációja következik be hidrogénperoxid és ammonia felszabadulásával. A második lépésben a ketosavat egy Pseudomonas törzs távolítja el. Az acetil csoport hidrolízisét Bacillus subtilis tenyészetével végezve, igen jó hozammal lehet nyerni 7-amino-dezacetoxikefém származékot, amely a félszintetikus kefém vázú antibiotikumok előállításához használható alapvegyület. A kefém alapváz nagyobb stabilitása miatt 7-amino-kefalosporánsav (7-ACA) előállítása jó hatásfokkal történhet kémiai úton a 6-APS előállítási eljárás analógiájára. A nitrogén-tercier-butiloxikarbonillal védett kefalosporin-C dibenzil észterét piridinben foszfor-pentakloriddal alacsony hőmérsékleten,(cseppfolyós nitrogén) iminokloriddá alakítják, amiből alkoholizissel imino-éter nyerhető. Az ezt követő hidrolízis, valamint a védőcsoportok eltávolítása ma már a peptid szintézis rutin feladata. A 7-aminocsoport ezután bármely savkloriddal ismert klasszikusnak tűnő módszerekkel acilezhető.
7-amino-kefalosporin C kémiai előállítása
51
A kefém váz, összehasonlítva a penám váz adta lehetőséggel, lényegesen nagyobb variációs lehetőséget biztosít, mert a vázban jelenlevő elektronrendszer kvázi konjugált volta az alapváz β-laktamáz rezisztenciáját hozza. Ez azt jelenti, hogy nem kell a rezisztenciát kikényszerítő szubsztitúcióra törekedni. Tovább bővíti a lehetőséget az O-acil csoport változtatása. Az acetil csoport ugyanis nukleofil szubsztitúcióval könnyen cserélhető bármilyen kéntartalmú vagy nitrogéntartalmú csoportra. Ezen az úton jó hozammal nyerhető a kefalotin és a kefaloridin Több ezernyi félszintetikus kefalosporin származék között néhány igen hatásos készítmény akadt. A származékok előállításakor a szerkezeti analógiára való tekintettel sikerrel használták az úgynevezett félszintetikus penicillinszármazékok vizsgálata közben szerzett tapasztalatokat. Termékenyítőleg hatott az új antibiotikumok utáni kutatás közben gyűjtött új ismeretanyag, a kémiai szerkezetek biológiai hatásmódjának egyre részletesebb megismerése. A nocardicin-A antibiotikumban előforduló oximino szerkezet például előfordul az igen hatásos kefotaxim nevű származékban. A 7-ACA tercier-butilészterét klóracetil védőcsoportot tartalmazó metoximino-tiazol származék savkloridjával acilezik piridin jelenlétében. A klóracetil védőcsoport tiokarbamiddal távolítható el, majd a tercier-butilészterből trifluor-ecetsavval szabadítható fel a kefémsav származék. A biológiai hatás szempontjából döntő jelentőségű, hogy a metoximino csoport a karbonilhoz képest szin helyzetű legyen. A β-laktamáz enzimet ugyanis csak a szin izomer gátolja. A metoximino-tiazol származék szintézisekor ezért a gyűrűzárást vizes közegben, szobahőmérsékleten végzik. Magasabb hőmérséklet és alkoholos közeg ugyanis az antiizomer képződésének kedvez. Széles spektrumú, savstabil és β-laktamáz rezisztens a kefoxitin, amelyik nemcsak az acetoximetilcsoport helyett karbamoil-oximetilcsoportot, de a Streptomyces törzsek tenyészlevéből a Merck és az Eli Lilly kutatói által izolált kefamicinekben felfedezett 7-α-metoxi csoportot is tartalmaz. A szintézis első lépéseként a dezacetil-7-aminocefalosporánsav tercier-butiloxi-karbonillal védett származékát karbamoilezik, majd a védőcsoport eltávolítása után a szililezést követi a tiophen-ecetsav-kloriddal végzendő reakció. A befejező szakaszban bróm-szukcinilimiddel állítják elő a 7-α-bróm származékot, amelyből metanollal reagáltatva ezüstoxid jelenlétében nyerik a kefoxitint. Az Acremonium chrysogenum-ban természetes körülmények között végbemenő gyűrűtágítási reakció kémiai megfelelője iparilag is végrehajtható. A cefém váz a viszonylag olcsó V-penicillinből oxidáló reagensekkel előállítható szulfoxid köztiterméken keresztül könnyen kivitelezhető reakcióval nyerhető.
A tiazolidin gyűrű átrendeződése p-toluolszulfonsav jelenlétében refluxolva következik be. A fenoxiecetsav eltávolítására kémiai illetve enzimológiai módszer használható. Az így nyert 7-amino-dezacetoxi cefalosporánsavból készül a kefalexin, mégpedig tercier-butiloxi-karbonillel védett D-fenil-glicinnel való Nacilezéssel, majd a védőcsoport eltávolításával. Kémiai gyürütágítási reakcióval nyerhető a 6-aminopenicillansavból a moxalaktám. Ebben a vegyületben a clavulánsav analógiájára a kén atom helyett oxigén található. Az anellált oxazol gyürű a β-laktám gyürű biológiai aktivitását jelentős mértékben növeli. A 7-aminocsoportot p-hidroxi-fenilmalonsav acilezi, de megtaláljuk a molekulában a 7-α-etoxi csoportot is. A C3 atomhoz 2-merkapto-1-N-metil-tetrazol kapcsolódik. Itt említhető a gyógyszerként sikeres monobactám, az azthreonam. Kezdetben félszintézissel 6-aminopenicillan savból állították elő, ma több gazdaságosan kivitelezhető totálszintézise ismert. Első lépésként elkészítik a treonin tercier-butiloxi-karbonillal védett származékát. Ehhez kapcsolják a metoxiamint 1-etil-3,3dimetilamino-propil-karbodiimidet használva kapcsoló ágensként. A gyürűzárást megelőzi a metán-szulfonilkloriddal végzett metilezés. A gyűrű kialakítása kálium-karbonátot tartalmazó acetonban refluxolva végezhető. Az N-metoxi csoport eltávolítása reduktív hasítással történik. A szulfonilezést dimetilformamidban végzik, az
52
aminocsoportot hangyasavban melegítve szabadítják fel. Ezt követi a megfelelő oximino-savkloriddal való acilezés. A szin állású oximino csoport biztosítja a β-laktamázzal szebeni védelmet Azthreonam kémiai totálszintézise Boc Boc | | dmf CH3 CH3 N-H H Na H-N H SO3 HO-C-H Boc2O H-C-O-SO2-CH3 H--C-----C---CH3 H—C----C—CH3 H-C-NH2 H-C-NH-Boc K2CO3 | | cseppfolyós NH3 | | O=C-----N—O-CH3 O=C----N-H N(Bu)3 O=C CH3-O-NH2.HCl C=O HO CH3-SO2Cl H-N−O−CH3 reflux acetonban
Boc | N-H H H—C----C---CH3 | | SO3 O=C----N SO3N(Bu)4
+
dmf
HCOOH
H3N H H---C----C---CH3 | | O=C----N SO3-
S ---- C-H O | || || + H3N−C=N−C − C −− C −− N-H H || | | O−N H…C−−−−C…CH3 | | | H3C-C-CH3 O=C-------N COOH SO3 AZTHREONAM
Gyógyászati felhasználásra került azetidinon szerkezetű antibiotikumok G-penicillin kálium (Benzilpenicillin kálium só) Vízben jól oldódó só. Mivel a gyomornedv inaktíválja, parenterá-lisan adagolják. Rövid idő alatt magas vérszintet ad, majd a vesetubulusokon keresztül a vizelettel 3-4 óra alatt távozik. Ezért négy-hat óránként adagolva napi adagja 2000001000000 NE. Kristályos formában porampullá-ban hozzák forgalomba. 1 mg kristály 1989 NE aktivitást képvisel Prokain-penicillin (Retardillin) Benzil penicillin paminobenzo-esav-N-dietilamino-etilészterrel alkotott sója. Vízben nehezen (1 g 250 ml-ben) oldódik. Tartós vérszint biztosítására használható, mert csak oldódás után a disszociált szabad G-penicillin hatásos. Az injekció a prokain só szuszpenzióján kívül valamilyen szuszpendáló anyagot és a kívánt vérszint gyors elérése céljából valamennyi benzil-penicillin kálium sót (promtcillin) is tartalmaz. Adagolása 300000-600000 NE naponta két alkalommal. A készítmény hatásos vérszintet tart 12-16 órán keresztül. BED penicillin (Beacillin) N,N’-difenil-etiléndiamin-dipenicillin-G. Vízben savanyú és semleges körülmények között alig oldódó só.(1g 5 liter vízben oldható fel). Ez a tulajdonság szájon keresztüli adagolását, (gyermekek részére szirupos formában) teszi lehetővé. V-penicillin (Vegacillin) Fenoximetil penicillin. 1948-ban fedezték fel, de csak 1953-tól használják savtűrő penicillinként. Vízben a szabad sav rosszul oldódik (1g 1.2 literben) A tablettákban 200000NE aktivitás mérhető. Adagolása 3-4 tabletta naponta elosztva étkezés előtt fél órával. A maximális vérszint egy órán belül érhető el. Maripen. A benzil penicillin acetoxi-metilésztere. A vízben alig oldódó anyag nagyobb hányada átvészeli a gyomorban töltött időt. A bélbe kerülve az ott működő észterázok felszabadítják belőle az oximetil-penicillint, amely spontán hidrolizál G-penicillinné. Ez felszívódva rövid idő alatt hatásos vérszintet eredményez. A tabletta hatóanyag tartalma 500000 NE. Naponta elosztva négy tablettát célszerű bevenni étkezés előtt fél órával. Methicillin, (2,6-dimetoxi-fenil-penicillin nátrium só) 2,6dimetoxibenzoil-kloriddal acilezett 6-APS. Vízben igen jól oldódó fehér kristály. Parenterálisan izomba vagy vénába adják. A vizelet változatlan formában távolítja el a szervezetből. A feloldott antibiotikum hűtve sem tárolható 24 óránál tovább. Életmentő gyógyszerként a penicillin 53
rezisztens törzsekre is hat annak ellenére, hogy a penicillináz képződését indukálja. Ezért methicillin után nem célszerű G vagy V penicillinnel a kezelést. Penicillináz rezisztenciáját a β-laktám gyűrűt árnyékoló két metoxi csoportnak köszönheti. Oxacillin. (5-metil-3-fenil-4-izoxazolil-penicillin nátrium monohidrát) A 3 fenil és az 5 metil csoport térbeli gátlása akadályozza a molekula kapcsolódását a penicillináz aktív központjához. Az elektron szerkezete savtűrést biztosít. Ezért per os adagolva is alkalmas a penicillin rezisztens fertőzések leküzdésére. A kapszulában forgalmazott adag (250 mg) hatóanyag a bélből felszívódva egy óra múlva hatásos vérszintet ad6. Erősen kötődik a plazmafehérjékhez. A vesén keresztül változatlan formában ürül. Adagolása 4-6 óránként 2 kapszula egy órával az étkezés előtt. A flukloxacillin. 3-(2-klór-6-fluor)fenil-5-metil4-izoxazolil-penicillin nátrium só. Az aromás gyürűn az izoxazol gyürűvel orto helyzetben levő halogén atomok hatására emelkedik a vérplazma antibiotikum szintje. Penicillináz szintézist indukáló, savtűrő vegyület, amely penicillin rezisztens kórokozók ellen hatásos. Kapszulában és injekciós formában alkalmazzák. Per os adagolás után egy órával alakul ki a hatásos vérszint. Az izoxazol szerkezetű penicillinek közül ez kíméli leginkább az érfalat, az endoteliumot. Ampicillin (Penbritin, Semicillin) D-α-amino-benzilpenicillin.trihidrát. Az aminocsoport az antibiotikum baktérium spektrumát kiterjeszti. Eredményesen alkalmazható a Gram negatív kórokzók, így az enterococcus okozta fertőzések esetében is. Különösen hatásos akut hugyuti fertőzések (Escherichia coli, Proteus mirabilis, etc.) leküzdésére. Az ampicillin amino csoportja savanyú körülmények között protonálva van, ami bizonyos mértékű savstabilitást biztosít. Kapszulában adagolva általában két óra alatt érhető el a maximális vérszint. A vesén keresztül változatlan formában ürül. Egy kapszula 250 mg hatóanyagot tartalmaz, amiből hat óránként kell egyet bevenni. Injekciós adagoláshoz nátrium sóját használják (porampullában). Amoxicillin 6-D-α-amino-p-hidroxi-fenilacetamidopenicillansav, az ampicillin p-hidroxi analógja. Baktérium spektruma és kémiai stabilitása hasonló, de jobban szívódik fel a bélcsatornából, ezért magasabb vérszintet ad. A gyorsabb felszívódás miatt kevésbbé hatásos disenteria esetében. A vesén keresztül változatlan formában ürül, ezért hat óránként kell egy egy kapszulát (250 mg hatóanyag) adni. Karbenicillin (Geopen) Dinátrium-a-karboxi-benzilpenicillin. Savérzékeny, a penicillináz is bontja. Oldatában lassan dekarboxileződik. Széles spektrumu, különösen hatásos a Pseudomona, Proteus, Providencia fertőzések esetében. Injekciós formában intravénásan adagolják szisztémás fertőzések, idült hugyúti és epeúti fertőzések leküzdésére. Adagolása négyszer naponta 1-2 g hatóanyag. Kémiailag stabil, penicillináznak ellenálló, széles spektrumú antibiotikum. Aktivitása több mint egy nagyságrenddel felülmúlja a többi kefalosporin származékét. 7-D-2-karboxi-2-(4-hidroxil-fenil)-acetamido-7-α-metoxi-3-(1-metil-1,2,3,4-tetrazolil)tiometil-1-oxa1-detia-3-kefém-4-karbonsav dinátrium só. A klavulánsav analógiájára a kénatomot oxigénre cserélik. Ez a váltás a biológiai aktivitását nagyságrenddel növeli. A 7-amino csoportot p-hidroxi-fenil malonsav acilezi. Megtaláljuk a molekulában a 7-metoxi csoportot is. A C-3 atomhoz 2-merkapto-1-N-metil tetrazol kapcsolódik. A szervezetben nem bomlik, nagyobb részt a vizelettel ürül, de jelentős a széklettel távozó moxalaktám mennyisége. Az irodalmi adatok szerint allergiás tüneteket nem okoz. Hosszabb ideig használva az érfal károsodása figyelhető meg, vérzékenységet okozhat! Azthreonam A kefalosporináznak és a penicillináznak ellenálló totálszintézissel előállítható új monobaktám, amelynek stabilitását a szin állású oximinocsoport biztosítja. Kezdetben 6-amino-penicillansavból állították elő. Ma már több gazdaságos szintézise ismeretes Gram-negatív baktériumok ellen jól használható, de Pseudomonas ellen is sikerrel alkalmazható. 0.5 g dózisban 6 óránként izomba adagolják, mert a szervezetből a vesén keresztül 6-8 óra alatt ürül.
54
Kefém alapvázat tartalmazó származékok
Kefalotin (Keflin, Cephalothin) Az első forgalomba került kefalonsporin származék 7-(2-tienil-acetamido)kefalosporánsav nátrium só. Széles spektrumú, savtűrő, penicillináz rezisztens antibiotikum. Parenterálisan adagolják, mert a bélcsatornából nehezen szívódik fel. Hat óra alatt a bevitt mennyiség 60%-a változatlan formában ürül a vesén keresztül. A máj észteráz aktivitása az acetoxicsoport hidrolízisét katalizálja. Adagolása izomba naponta 4-6-szor 0.5-1 g hatóanyag. Izomba adva az injekció helyén izomfájás, vénába adva tromboflebitisz előfordulhat. Az adagolás után 1 órával 7 mg illetve 17 mg vérszint mérhető. Kefalexin (Keflex) 7-D-α-amino-fenilacetamido-3-kefém-4-karbonsav. Az α-aminocsoport a savtűrést, a 3metil csoport az észterázokkal szembeni érzéketlenséget biztosítja. Fiziológiás körülmények között az aminocsoport egyrészt a penicillinázzal szembeni védelmet, másrészt a spektrum szélesedését biztosítja. Savanyú körülmények között jól oldódik és könnyen felszívódik. Szájon keresztül adagolható naponta négyszer 250 mg hatóanyag. Sikerrel használható felsőlégúti fertőzés esetén. Különösen előnyös a hugyúti fertőzések leküzdésében, mert a hatóanyag nagyobb hányada változatlan formában a vizelettel ürül, illetve bomlás közben reakcióba léphet a glükózzal. Kefaloridin (Cephalomycin) A kefalotin továbbfejlesztett változata. 7-(2-tienil-acetamido)-3-piridil-metil-3kefém-4-karbonsav betain. Vízben enyhén savanyú körülmények között jól oldódik, a bélből rosszul szívódik fel, ezért parenterálisan izomba adagolják naponta négyszer 0.25-1 g mennyiségben. Hugyúti kevert fertőzések és légúti fertőzések esetén is hatásos. Vizelettel változatlan formában ürül. Kefoxitin.7-α-metoxi-7β-(2-tienil)-acetamido-3-karbamoil-oximetil-3-kefém-4-karbonsav Széles spektrumú, penicillináz rezisztens, savtűrő antibiotikum. A bélcsatornából nem szívódik fel. Izomba adva 20 perc alatt elérhető a maximális vérszint, nem okoz olyan fájdalmat, mint a kefalotin. Gyorsan ürül, nagyobbrészt változatlan formában, de néhány százaléka dekarbamoileződik, majd tovább bomlik. Kefotaxim. 7-cisz-2-metoxiamino-2-(2-amino-4-tiazolil)-acetamido-3-acetoximetil-3-kefém-4-karbonsav. Kis koncentrációban is hatásos széles spektrumú antibiotikum. Képes inaktíválni a β-laktamáz enzimeket.Nemcsak a penicillináz, de a kefalosporináz ellen is védett vegyület. Az amino-tiazol gyürű és az amidin gyök együttes jelenléte fokozza a sejtfal transzpeptidázhoz való affinitását. A metoximino csoport térállása a penicillináz rezisztencia szempontjából fontos. A máj észterázaktivitása a dezacetil-kefotaxim lakton képződést segíti elő. Ez tovább bomlik ismeretlen metabolitokká. A parenterálisan adott antibiotikum 90%-a nagyobb részt eredeti formában ürül a vesén keresztül. A különböző mértékben lebomló hányad mennyiségének csökkentése céljából újabban a nehezebben bomló 3-oximetil származékát forgalmazzák. Kefsulodin. Pseudomonas ellen hatásos széles psektrumú szulfokefalosporin származék. 7-(7-szulfonil-2-fenil)acetamido-3-(4-karbamoil)-piridilmetil-3-kefém-4-karbonsav nátrium só. Csak parenterálisan használható. Izomba adva a beadás helyén izomfájdalom léphet fel. 0.5g kefszulodin 30 perc alatt 20-21 mg/ml vérszint alakul ki, amely 100 perc alatt a felére csökken. Bomlástermékeinek megjelenését eddig nem mutatták ki.
55
Kiemelten bélbaktériumok —Enterobacteriaceae — szaporodásának gátlására alkalmas hatóanyagként került forgalomba. Ezen túlmenően Gram-pozitív baktériumok (Staphylococcus, Streptococcus fajok) növekedését is gátolja. Tapasztalati képlete: C25H25N9NaO8S2 Vizes oldata szintelen.
A 7-[D-(–)-a-(4-etil-2,3-dioxo-1-piperazinkarboxamido)-a-(4-hidroxifenil)-acetamidol]-3-[(1-metil-1H-tetrazol5-yl)-tiometil]-3-cefem-4-karbonsav nátriumsója kémiailag grammonként 34 mg nátriumot (1,5 meq) tartalmaz. Fehér , kristályos, vízben jól oldódó por. A 25%-os vizes oldat pH-ja 5-6.5 között van In vitro mért MIC értékek összehasonlítása Staph aureus Staph epidermidis
56
Cefoperazon
2,0
1,0
Ceftriaxon
3,3
7,3
Cefotaxim
1,6
1,1
A BAKTÉRIUMSEJTFAL KÉPZŐDÉSÉT GÁTLÓ ANTIBIOTIKUMOK Ebben a fejezetben kémiailag egymástól különböző vegyületekkel ismerkedünk. Tárgyalásukat a peptidoglükán sejtfalszintézist zavaró ß-laktám antibiotikumokat követően az indokolja, hogy ezek a vegyületek a sejtfalépítésben szerepet játszó enzimek működését gátolva fejtik ki antibakteriális hatásukat. GLYCOPEPTID antibiotikumok: VANCOMYCIN, TEICOPLANIN és társai A Lilly kutató központban McCormick és munkatársai 1956-ban Indiából illetve Indoneziából származó talajmintákból izolált Amycolatopsis orientalis törzs termékeként izolálták az első hét aminósavat — köztük öt arómás aminósavat — tartalmazó glikopeptidet (molekulattömege 1500 kDa) a vancomycint, amely.szénhidrát komponensként glükózt és hozzá kapcsolva vancózamint tartalmaz. Penicillin rezisztens törzsekre való hatása miatt már két év múlva engedélyezték a klinikai kipróbálását. Röntgen diffrakcióval igazolt szerkezetét Sheldrick csak 1978-ban közölte. Hatásmódja a β−laktám szerkezetű antibiotikumokhoz hasonlít, amennyiben ez a glikolipid nagy affinitással kötődve a peptidoglükán sejtfal szintázisét katalizáló rendszerhez, nevezetesen a muramil pentapeptid D-Ala–D-Ala végződéséhez nemcsak a peptid kötés kialakulását, de a glikozidos kötés létrejöttét is lehetetlenné teszi. Közeli rokonszerkezetű hatóanyagot, a teicoplanint Actinoplanes teichomyceticus tenyészlevéből 1978-ban izolálták. Hatásmódja és kémiai szerkezete hasonló a vancomycinhez. Ez utóbbi antibiotikumot termelő törzs azonban a hatóanyag hat változatát állítja elő egyidejűleg, ezért forgalombahozatalát az USA-ban nem engedélyezték. Azóta a szakirodalomból újabb glikopeptidek felfedezéséről értesülhetünk. Jellemző erre az antibiotikum csoportra az oxigénfunkciót hordozó, arómás para-hidroxi-fenilglicint, illetve ß-hidroxi tirozint tartalmazó oligomer és az oxigén funkcióhoz kapcsolódó hexóz illetve aminocukor komponensek jelenléte.
Az aglikon rész többnyire hét arómás aminosavat tartalmaz kivéve a vancomycint, amalyben az első aminosav N-metil(R)-leucin, a harmadik pedig (S)-aszparagin. Az antibiotikum a periplazmikus térben egyedül vagy dimerként hidriogénhidakkal kötődhet a peptidoglükán képződés izoprenil foszfáthoz kapcsolódó építőelemének (N-acetil glükozaminil-muramil pentapeptid) D-Ala-D-Ala végéhez. 57
A peptídóglükán sejtfal felépítése és a képződés gátlása antibiotikumokkal
A peptidoglükán építőelemhez kötődő vancomycin akadályozza a glikozidos kötés kialakulását a periplazmában.
58
Az építőelemhez kapcsolódó antibiotikum teljes mértékben blokkolva a prokarióta sejtfal képződését, elsősorban a Gram pozitív baktériumok pusztulását okozza. Hatásos a Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Streptomyces, Clostridium fajok ellen. (MIC= < 4 µg). A penicillin allergia esetén pedig életmentő hatású lehet. Sőt a penicillin, streptomycin és erythromycin rezisztens Staphylococcus aureus (régebbi nevén Micrococcus pyogenes) törzsek ellen is sikerrel alkalmazható. Az esetleg megjelenő ototoxicitása és vesekárosító (nefrotoxicitása) hatása miatt hosszan tartó használata nem ajánlott. A Lactobacillus és Enterococcus fajok között több rezisztens törzs akadt. Ezek sok esetben olyan enzimet termelnek, amely módosítja a vancomycin kötődését, de az induktív, illetve konstitutív rezisztencia kifejlődésére is találunk példát.
A rezisztencia kialakulásának különleges formája, amikor a glikopentapeptid utolsó tagjaként szerepló D alanin helyett észter kötéssel D tejsav fordul elő.Ez esetben az antibiotikumnak a sejtfal építőelemhez való kötődése meggyengül. A D-Ala-D-Ala csoporthoz lazán kötődő antibiotikum, a gyengülő kölcsönhatás miatt nem képes akadályozni a glikozidos kötés kialakulását, azaz a törzs rezisztensnek tekinthető. Az utolsó aminosav kicserélődése tejsavra a prokarióta sejtfal képződést nem zavarja, mert a transzpeptidáz az észter kötést hasítva reagál a pentapeptidből származó tetrapeptiddel.. A rezisztens törzsekben működő, plazmid hordozta enzimek (vanH, vanA, vanX és a szignál transzdukciót vezérlő vanS és vanR) jól ismertek VanH α-keto-reduktáz Piruvát D Lactát VanA depsipeptid ligáz VanX D-Ala-D-Ala dipeptidáz —DAla-D-Lactát
—D-Ala—D-Ala
— D-Ala
A rezisztens törzsben sokszor a pentapeptid utolsó aminosav összetevője D szerin. A terminális szakasz tehát —D-Ala-D-Ser, ami a sejtfal kiépülését nem zavarja, de akadályozza a vancomycin kötődését
Más esetben a vancomycin rezisztens Staphylococcus aureus elektornmikroszkópos felvételén feltűnően vastag sejtfal megjelenése észlelhető.
59
Vancomycin bioszintézise
A hatásos anyag a növekedési fázisvégén képződik. Az aglikon rész tiotempláton szintetizálódik. A pantetein lánchoz kapcsolódó aminósav építőelemek adenilezése az aktíváló egységen történik. Az adenilsav származék tioészter formában kötődik a megfelelő sorrendben elhelyezkedő kondenzációt, illetve epimerizációt katalizáló egységekhez. Itt készül a heptapeptid, amelynek térbeli szerkezetét az oxidatív gyürűzárás merevíti. Ezt követi két hidroxilezés, továbbá két klórozási reakció. A befejező lépésben a negyedik aminosav (tirozin) p-hidroxi csoportjához glikozidos kötéssel egy vancózamint tartalmazó glükóz kapcsolódik. A merev szerkezetű antibiotikumot a periplazmikus térben megjelenő muramil-pentapeptid D-Ala-D-Ala végződéséhez hidrogén hidak rögzítik. Ez a nagy térkitöltésű komplex megakadűlyozva a peptiodoglükán építőelem kapcsolódását a sejtfal glükán vázához, azaz a baktérium pusztulását okozza.
60
Új glükopeptid antibiotikumok izolálása A peptidoglükán képződést specifikusan akadályozó hatásmód ismeretében világszerte megindult a kutatómunka — amely mind a mai napig folyik — a prokarióta sejtfalszintézist gátló hatóanyagok izolálása érdekében. A mellékelt ábra néhány érdekesebb glikopeptid iípus kémiai szerkezetét mutatja a termelő törzseknek, továbbá a leírásuk időpontjának a feltüntetéséveé.
Vancomycin totálszintézise Nem meglepő, hogy a glükopeptid antibiotikumok gyógyászati sikere a szerveskémiai szintézissel foglalkozó kutató csoportok tevékenységét is aktíválta.
61
Vancomycin aglycon totálszintézise (Nicolson és munkatársai)
62
63
D-CIKLOSZERIN Ezt az egyszerű szerkezetű, (D-4-amino-3-izoxazolidon) Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok növekedését gátló, főleg antituberkulotikumként felhasználásra került antibiotikumot az ötvenes évek derekán, négy egymástól független kutatócsoport, négy különböző Streptomyces törzs fermentlevében találta (Harned: S. orchidaceus. Shull: S.lavendulae. Harris: S. garyphalus. Kuzikava: S. roseochromogenes ). Ez az amfoter tulajdonságú savstabilis vegyület ketoenol tautomériát mutat, vizes oldatban hosszabb idő alatt dimerizálódik.
+
+
NH3 NH3 | | H2C−−−C−H H2C−−−C−H | | | | O C-OH O C-O− \ // \ // N N
4,5 pH
NH2 NH2 | | H2C−−−C−H H2C−−−C−H | | | | O C=O O C-O− \ / \ // N N | H tautomer alakok 7,4 pH
H | N N / \ // \ H2C−−−CH C O | | | | O C HC−−−CH2 \ // \ / N N | H dimer forma
A cikloszerin gyűrűs formában merevített szerkezete a D-alanin térszerkezetéhez hasonlít. Kompetitív gátlással akadályozza azokat a reakciókat, ahol az enzim szubsztrátuma, illetve terméke D-alanin. Gátolja a D-Ala-D-Ala szintetáz működését, de nem akadályozza az aminosav aktíválását.
Gátolja a D-alanin és a D glutaminsav-transzamináz aktivitását és gátolja az alanin permeáz működését. Az alanin racemáz működését az enzim kofaktorával a piridoxál-foszfáttal reagálva gátolja.
A cikloszerin a D-Ala-D-Ala peptid szintézisét gátolva a sejtfal alkotórészeként nélkülözhetetlen muramilpentapeptid képződését akadályozza. Mikroszkoppal vizsgálva - cikloszerin jelenlétében - a baktériumokon a penicillin hatásához hasonló jelenség figyelhető meg. A sejtfalszintézis szelektív gátlása miatt először szferoplaszt képződik, majd a sejtek szétszakadása a baktériumtenyészet feltisztulásához vezet. Antibakteriálás hatását csökkenteni lehet in vivo D-alanin adagolásával. A D-cikloszerin például hatástalan a TBC-vel fertőzött egereken, illetve a tengerimalacon, mivel ezen két állatfaj magas endogén D-alanin szintje hatástalanítja az antibiotikumot. Humán TBC fertőzés leküzdésére izonikotinsav hidraziddal szokták alkalmazni. Egyszerű kémiai szerkezete miatt a szabadalmi bejelentésekben leírt bioreaktorban kivitelezhető módszereket ipari méretben csak átmenetileg használták. Előnyösebb és gazdaságosabb a kémiai szintézis Dszerin metilészterből. A szerin kémiai szintézisével nyert racemátból a D-forma elkülönítendő. A melléktermékként megjelenő L-szerin adott esetben L-triptofán előállítására használható.
64
Kiindulási vegyületként etilimino-benzoátot és D-szerin-metilészter hidrokloridot reagáltatva 2-fenil-4karbometoxi-2-oxazolint nyernek. Az oxamid csoport kialakítása nátrium-etilát jelenlétében történik. A 2-fenil4-karboxami-do-2-oxazolinból a gyűrű felnyitásával (ami dioxánban sósav hatására következik be) αbenzamido-ß-klór-propion hidroxamát nyerhető. Az izoxazolidon gyűrű 1 n nátriumhidroxidban alakul ki. Enyhén visszasavanyitva képződik belőle a 4-benzamido-3-izoxazolidon. A védőcsoport eltávolításával sósavas etanolban képződik a ß-aminoxialanin-etilészter dihid-roklorid. Káliumhidroxiddal D-4-amino-3izoxazolidonná zárható a gyűrű.
65
FOSZFONOMYCIN
Ezt a szélesspektrumú antibiotikumot a Merck kutatói több Streptomyces törzs (S. fradiae, S. viridochromogenes, S. wedmorensis) tenyészlevében is megtalálták.
foszfoenol-piroszőlő sav
Kémiailag (-) (1R,2S)-1,2-epoxipropil-foszfonsav. Szerkezetileg egy foszfoenolpiroszölősav analóg. Gátolja a PEP részvételét a bioszintézisben, mindent összecvetve az UDP-N-acetil-muraminsav képződését. Így fő támadáspontja a sejtfalszintézis gátlása. Mivel szerkezete az α-glicerin-foszfáthoz hasonlít a glicerinfoszfát transzportmechanizmusát megtévesztve
akadálytalanul jut át a sejtmembránon. Ezt az antibiotikumot is egyszerűen kivitelezhető kémiai szintézissel állítják elő. Foszfor-trikloridból, tercier butanolból és trietilaminból benzolban nyerik a klórfoszfit intermediert. Ezt propargilalkohollal reagáltatva alakítják propionil-foszfáttá. A 45 oC-on bekövetkező acetilén-allén átrendeződés eredményeként kapják az alkadienil-foszfonátot, amit palládium-szén katalizátor mellett hidrogéneznek cis-propenil-foszfonáttá. Ezt hidrolízálva nyerik a cis-propenil-foszforsavat.
Reszolválás után - amit + ( α ) -fenetilaminnal végeznek propanolban trietilamin jelenlétében - az epoxidálás nátrium-wolframát jelenlétében, meleg oldatban, hidrogén-peroxiddal végezhető.
66
PEPTID JELLEGŰ ANTIBIOTIKUMOK (DEPSZIPEPTIDEK) Kémiailag olyan viszonylag kis tagszámú gyűrűs depsipeptidek, amelyek a természetes aminosavakon kívül különleges szerkezetű aminosavakat, zsírsavakat, illetve a természetes aminosavak enantiomerjeit tartalmazzák. Főleg spórázó bacillusok termelik, de gombák tenyészlevében is találtak ilyen természetű metabolitokat. A β-laktám antibiotikumok, noha 2 aminosavból álló gyűrüs peptidek, mégis kémiai tulajdonságaikra és különleges hatásmódjukra tekintettel külön tárgyalandók. Peptid töredékek megjelenése a tápközegben nem tekinthető ritka jelenségnek. Több esetben rendszertani elkülönítésre is használták a tenyészlében megjelenő peptidek szerkezetét. Ezek a kisebb-nagyobb peptidek azonban jelentősebb biológiai aktivitással nem rendelkeznek. A biológiailag aktív ciklo-peptidek különleges merev szerkezetét másodlagos kötések, hidrogén hidak biztosítják. Erős baktericid hatásukkal együttjáró toxikus tulajdonságaik miatt a klinikai gyakorlatban csak egyes speciális esetek gyógyítása szempontjából van jelentőségük. Ezek a vegyületek a bélcsatornából nem szívódnak fel, így csak közvetlenül a vérpályába juttatva, parenterálisan alkalmazhatók. A gyomorsav nem károsítja, a különféle emésztő enzimek nem bontják őket, sőt sokesetben a fehérjebontó enmzimekkel komplexet képezve proteázgátlóként alkalmazhatók. A velük kezelt szervezet bélflóráját megváltoztatják, baktériumspektrumuk függvényében módosítják azt. Ebből következik, hogy néhány ide sorolt antibiotikumot eredményesen használnak az állattenyésztők. Kis mennyiségben a tápanyaghoz keverve a tápanyag hasznosítását javítva növelik a súlygyarapodást. Használatuk az élelmiszerek fogyasztói számára veszélyt nem jelent, mivel a bélből nem szívódnak fel a húsban és a tejtermékekben nem jelennek meg. Nem zárható ki a bélfalra, a bélfal áteresztőképességére gyakorolt olyan közvetlen hatásuk sem, amely befolyásolhatja a tápanyagfelvételt. A peptidjellegű antibiotikumok nem riboszómán szintetizálódnak, hanem tiotemplátnak nevezett fehérjén. A tiotemplát felületi viszonyai szabják meg a rajta szintetizálódó oligomer kémiai szerkezetét.
Képződésükhöz, nem szükséges aminoacil-tRNS szintetáz, nincs szükség mRNS-re, sem specifikus tRNS-re. Képződésüket klóramfenikol nem gátolja..Ebből következőleg a biológiailag aktív termék felépítésében a variációs lehetőségek nagyobbak. Hasonló szerkezetű vegyületek, aminosavak egymást könnyen helyettesíthetik. A rendelkezésre álló építőelemek mennyiségi viszonyai befolyásolhatják a képződő depsipeptid szerkezetét. A tiotemplát egy multienzim rendszernek tekinthető. Az enzimkomplexhez tartoznak a nem természetes aminosavak képződésében résztvevő enzimek. Az aminosav aktíváló enzimeken kívül izomerázok, epimerázok, dehidrogenázok és gyűrűzárást végző alegység is a komplex alkotórésze. Természetesen a tiotemplát és a kiszolgáló enzimek mRNS közvetítésével a DNS-ben rögzített információ alapján riboszómán képződnek. Nyilvánvaló, hogy az antibiotikumot termelő törzs mutagén kezelése áttételesen a depsipeptid képződésében is változást okozhat.
67
GRAMICIDIN-S Gauze és Brazsnyikova 1944-ben egy Bacillus brevis törzs tenyészlevében találta ezt a semleges kémhatású gyűrüs szerkezető dekapeptidet. A két azonos szerkezetű pentapeptid gyűrűvé zárásaval képződő antibiotikum szerkezetét Ruttenberg és munkatársainak 1965-ben megjelent munkájából ismerjük. CH3 | CH3 H-C-CH3 H-C==CH—C-H | | | || H O H-C-CH3 H H O H-C-H H H C==CH—C-H | || | | | || | | : | H2C−−−−C −−C−−N−−C−−C −−N−−−−−C−−C−−N−−C−−−C−−−N−−−C−−−CH2 | | | || | | | || | H 2C H H O CH2 H H O C=O | : : NH2CH2 : : | : : CH2 CH2 : : N−−−−CH2 H2C−−−−N | : : CH2 NH2 : : | O=C O H H CH2 O H H CH2 | || | | | || | | | CH2−−−−C−−N−−−C−−−C−−N−−C−−C−−−−N−−−C−−−C−−−N−−C−− C −−−− CH2 | : | | || | | | || | H H H-C-H O H H H-C-CH3 O H | | CH3 H-C-CH3 | CH3 Négyféle természetes aminosavból (L-prolin, L-valin, L-ornitin, L-leucin) és D-fenilalaninból felépülő két pentapeptid záródik gyűrűvé. A molekula szerkezetét a térközelben levő imino- és karbonil-csoportok között kialakuló hidrogénhidak merevítik. Ez a szerkezet a merev gyűrű egyik oldalán két ornitin δ-aminocsoportját, az ellentétes oldalon az aminosavak alifás láncait hordozza. Ez a detergensekre jellemző szerkezet károsítja a prokarióta citoplazma membránját. Az antibiotikum gyógyászati értéke csekély. Viszonylag egyszerű szerkezete azonban lehetőséget teremtett a biotechnológusok számára a nemriboszómális peptidszintézis mechanizmusának a tanulmányozására, sőt ezen vizsgálatok eredményeként az M.I.T. kutatói Wang professzor vezetésével elsőként oldották meg egy antibiotikum szintézisét oszlopreaktorba rögzített enzimekkel. A bioszintézist katalizáló pantetein foszfátot tartalmazó tiotemplát előállítására a gramicidin-S termelésére előnyösen használható Bacillus brevis mutánst használták. Egy gram ép baktériumsejt glicerint és ammóniát tartalmazó táptalajon 250 mg antibiotikum előállítására volt képes óránként. A tenyészléből összegyüjtött baktérumsejtek roncsolásával nyerték a sejtmentes kivonatot, amelyből ammónium szulfáttal kezelve két aktív frakciót különítettek el. A 100 kDa tömegű könnyű frakció a fenilalanin aktíválását és izomerizálását végezte. A 280 kDa méretű nehéz frakció a négy másik aminósav aktíválását és sorrendbehelyezését végzi. Az első feladat az aminosav aktiválása aminosav-adenilát formájában. Az enzim felületén az aminosavból és ATP-ből pirofoszfát képződése mellett képződik a vegyesanhidrid, amely a tiotemplát SH csoportját acilezi. A tioészter képzéssel egyidejüleg AMP szabadul fel. A tioészter átészterezéssel juttatja az aminosavat a mozgékony pantetein lánc SH csoportjára, amely résztvesz a lánchosszabbításban. Utolsó lépésként a két foszfopanteteinlánchoz kötött pentatpeptid gyűrűvé záródva válik le az enzimfelületről. A tiotemplát pontos topográfiája még nem ismert. Nem sikerült felderíteni azokat a szerkezeti elemeket, amelyek az aminosavak helyes sorrendben való lekötésére szolgálnak.
68
A folyamatos szintézis az antibiotikumot felépítő L-konfigurációjú aminosavakon kívül - (D-fenilalanin ugyanis nem használható szubsztrátumnak!) - jelentős mennyiségű ATP állandó jelenlétét igényli. Az élő sejtben az oxidatív-foszforiláció működése kielégíti az ATP igényt. A feladat elvégzése céljából az MIT (Mass. Inst.Techn.) kutatói B.brevis-ből izolálták az adenilát-kinázt, amely az adenilsavat ATP jelenlétében adenozindifoszfáttá alakítja. A következő lépéshez az Escherichia coli tenyészetéből kinyerték az acetil-kinázt, amelyik ADP-ből acetilfoszfát jelenlétében ATP-t szintetizál. A nagy energiatartalmú acetil-foszfát egyszerűen előállítható aceton pirolízisével. A két regeneráló enzimet cianogén-bromiddal Sepharose-hoz kötötték. A rögzített regeneráló rendszert összekeverve a poliakril-amid gélbe rögzített gramicidin-S szintézisre képes könnyű és nehéz frakció 1/1 arányú elegyével -oszlopreaktorba helyezték. Ezzel a módszerrel grammos tételben, 80 %-os kihozatallal nyerték az antibiotikumot a reaktorba adagolt L-valin, L-prolin, L-ornitin, Lleucin, L-fenilalanin keverékéből. A reakció energiaigényét — az ATP ellátottságot — a fölöslegben adagolt acetil foszfát fedezute (foszforsav ecetsav vegyesanhidrid) amit foszforsav jelenlétében aceton hőkezelésével állítottak elő.
69
BACITRACIN Johnson és munkatársai 1945-ben fedezték fel ezt a gyűrűs depsipeptid szerkezetű vegyület csoportot. Az antibiotikus hatást egy 7 éves kislány, Margaret Tracy csontfertőzéséből izolált egyik bacillus tenyészlevében észlelték. Innen adódott az antibiotikum neve. A termelő törzset később Bacillus licheniformis fajjal azonosították. A tenyészlében tíz közelrokon peptid képződik. A kereskedelmi forgalomba kerülő készítmény is tartalmaz kis mennyíségben B, D, E és F komponenst a főterméknek tekinthető legaktívabb “A” komponens mellett. A bacitracin-B például az egyik izoleucin helyett valint tartalmaz A bacitracin-A savanyú és semleges körülmények között stabil, lúgos közegben gyorsan inaktíválódik. Vízben és rövid szénláncú alkoholban jól oldódik, más szerves oldószerben oldhatatlan. Nehézfém sók inaktíválják, de EDTA hatására is elveszti antibakteriális hatását. A baktericid hatás kifejtéséhez ugyanis kétértékű ionok, előnyösen cink ionok jelenléte szükséges. Kémiai szerkezetének felderítése nem volt könnyű feladat. Megjegyzendő, hogy a ma elfogadott szerkezetet eddig nem igazolták kémiai szintézissel. Az L illetve D aminosavakból felépülő undekapeptidből (LAsn, D-Asp, L-His, D-Phe, L-Ile, D-Orn, L-Lys, L-Ile, D-Glu, L-Leu, L-Cys, L-Ile) a gyűrűs szerkezetet nagy valószínűséggel a lizin ε-aminocso-portja és az L-aszparagin között kialakuló kötés biztosítja. Nem zárható ki azonban az sem, hogy a lizin ε-aminocsoportja és a D aszparaginsav ß-karboxil csoportja között kialakuló kötés miatt az L-aszparagin nem tagja a gyűrűnek. H2N-C=O HO-C=O H | | | O CH2 CH2 C || | | // \ H-N----C----C----N----C----C----N----C=O N N-H | | | || : | | | | H-C-H H H O H H H-C--CH2---C==C-H | | CH3 N-H H-C==C-H H-C-H H2N-CH2 | | | | | | H-C-H CH2 CH2 C=O H-C C-H | | | | || || H-C-H CH2 H3C-C-H H. .C---CH2—C—CH | | | | H-N−−CH---C---N---C----C----N---C----C----N H NH2 CH3 | || | : || | | || | | H H C=O O H H O H H O H-C----CH---CH2---CH3 | | | | H3C−C----C---CH H H N == C ---S | | | : | | | H H N-----C------C------N-----C-----C-----N-----C-----C----------CH2 | || | | || | | || | H O CH2 H O CH2 H O H | | CH2 H-C-CH3 | | A- bacitracin szerkezete HO-C=O CH3
A kovalens kötések alkotta peptid gyürűn kívül a biológiai hatásért felelős második érzékeny gyűrűs szerkezet kialakulását a D-fenilalanin és a láncvégi L-izoleucin közötti gyenge kötés stabilizálja. Ennek a szerkezetnek a kialakulásához szükséges a cink ion jelenléte. Az antibiotikum bioszintézise a sejtmembránhoz kötődő bacitracin szintetáz enzimkomplex felületén folyik. Ez az enzimkomplex elektroforézissel vagy gélszűréssel három olyan fehérje alegységre (A, B, C domain) választható szét., amelyen a bacitracin molekula szintézisét katalizáló enzimek (összesen 53 reakció) működnek. Egy antibiotikum képződéséhez 12 aminosav aktíválás, 12 tiolízis, 4 izomerizáció, a thiazol gyűrű kialakítása, lánckezdő reakció, 11 elongációs reakció, 9 transztiolízis, 2 peptidil transzferáz és egy termináló rekció szűkséges. Az alegységeken az aminosav építőelemekre specifikus templátok valamint tízféle enzimreakciót katalizáló aktív központ található. A lépésről-lépésre hosszabodó peptid láncot egy-egy mozgékony foszfopantetein kar kapcsolja az enzimkomplex felületéhez. Aminosav aktíválás indítja a bioszintézist magnézium ion jelenlétében. aminosav + ATP ------------------> aminosav-adenilát + PP Ez az aktívált aminosav közeledik a tiotempláthoz, ahol szűkság szerint az izomerizáció is megtörténik. Tiolizáció kapcsolja az aktívált aminosavakat a komplex SH csoportjaihoz, 70
ahonnan az egyes építőelemekkel a transztiolizációs reakció, illetve az elongációs reakció hosszabítja a növekedő peptidet. A peptid lánc kialakulását követi a templáton megürülő aminosav kötőhelyek folyamatos feltöltődése. Az alegységek közötti átmenetet a peptidil transzferáz katalizálja. A termináló reakció kapcsolja a peptid utolsó tagját a lizin ε-aminocsoport-jához. Ez a lépés a kész antibiotikum leválásával jár. A bioszintézis korai szakaszában eddig felderítetlen mechanizmus szerint alakul ki a tiazol gyűrű az N-terminális izoleucin és a cisztein között játszódó kondenzációval. A forgalomba hozott bacitracin készítmény biológiai aktivitását, (lévén anyagkeverék) nemzetközi egységben adják meg. Az egységnyi aktivitás (IU) 1/1024 higításban gátolja a Streptococcus haemoliticus szaporodását húsleves táptalajon (1 mg bacitracin = 74 IU). Gram-pozitív mikroorganizmusok közül főleg a Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Streptococcus, Corynebacterium, Actinomyces törzsek ellen hatásos. Gram negativ törzsek közül érzékenynek találták a Vibrio, Neisseria, Haemophylus, Bordetella törzseket. A bacitracin peptid jellegéből következően a bélfalon keresztül nem szívódik fel. Hízlaló tápokhoz adva (4200 IU / kg táp) javítja a tápanyag hasznosulását. Kedvező irányba módosítja a bélcsatorna mikroflóráját, de a bélfalra való közvetlen hatása sem zárható ki (King 1976). A bacitracin használatának közöspiaci előírása szigorú feltételeket jelent. Növendék állatfaj pulyka
szárnyasok tojó tyúk borjú, bárány, kecske kismalac sertés
használati időszak 4.-ik hétig 5-26.-ik hétig 4.-ik hétig 5-16.-ik hétig 16.-ik hétig 17-26.-ik hétig 4.-ik hónapig 4-6-ik hónapig
A bacitracint kémiai felépítése miatt a proteázok nem bontják, sőt valójában proteáz gátlóként használható vegyület. Makarova szerint jelenlétében az emésztőcsatornában magasabb proteáz szint mérhető. Ez a depsipeptid a baktérium citoplazma membránját károsítja, specifikusan zavarja a sejtfalszintézist. Annak a lipid jellegű (izoprenil-pirofoszfát) hordozó vegyületnek a defoszforilezését gátolja, amely a sejtfal építőelemeket a citoplazmából a membrán külső felületére segíti. Az N-acetil-glükózaminil-N-acetil muramil nonapeptid amidnak sejtfalba épülésekor a 10 izoprén egységből felépülő lipid jellegű hordozó molekula pirofoszforilezett formában marad vissza. Csak egy foszforsav leválasztásával válik alkalmassá újabb muramil peptid felvételére. Ezt a defoszforilezést akadályozza a bacitracin. Magnézium ion jelenlétében bacitracin hatására izoprenilpirofoszfát felhalmozódás észlelhető. Sejtfal károsodott baktériumok ellen az immunológiai védekező mechanizmus is hatásosabban veszi fel a küzdelmet. A Bacillus licheniformis ATCC 14580 neve a görög lichen és a forma szó összetételéből származik. Weigmann a múlt század végén Clostridium licheniforme néven irta le ezeket a gyakran összetapadva, láncot alkotva növekedő spórát képző pálcákat. Agar táptalaj felületén száraz ráncos felületű telepet alkotnak, amelyből hajra emlékeztető kitüremlések formájában terjed a táptalaj felületén. Az idős tenyészet barnás szinűvé válik. Glükóz szénforráson nyálka szerű viszkozitást fokozó γ-glutamil polipeptidet választanak ki környezetükbe. Szacharóz illetve raffinóz szénforrásból polifruktánt, levánt termelnek. Elegendő vas jelenlétében ezek a törzsek pulcherrimin nevű vörös pigmentet választanak ki.A Johnson által izolált törzsön kívül ma több bacitracint termelő törzsről tudósít az irodalom (ATCC 10716, 9945, 11945, 11946, 14580, 14593). Ezekből klasszikus és modern genetikai módszerek alkalmazásával nagyüzemi alkalmazásba vett törzseket állítottak elő. A termelő törzs húslé táptalajon fenntartva termelőképességét megtartja. A fokozott antibiotikum termelésre nemesített törzs spóratermelő képességében sérült. Az antibiotikum termelő táptalaj állati eredetű fehérje hidrolizátumot vagy szójalisztet tartalmaz nitrogénforrásként. Szénforrásként keményítő vagy glükóz használható. Az eljárás 30 o C felett 30 óra alatt befejeződik. A tenyészlében ez idő alatt 8-10 g bacitracin képződik literenként. Az antibiotikum képződése a tenyészet lúgosodásakor, a növekedési fázis végén észlelhető fokozott mértékben. Ezért nem befolyásolja a termék képződését a termelő törzs növekedését gátló antibiotikum megjelenése. Az elkészült antibiotikum a fermentlé szűrletéből kétértékű fémionokkal (cinkbacitracin ZB) vagy metilén diszaliciláttal (BMD) könnyen leválasztható. Az így nyert nyers termék forrólevegős ciklonrendszerrel (niro) könnyen kezelhető porrá szárítható. Ez a kémialag stabil termék közvetlenül keverhető a tápszerekbe.Gyógyszerként használható terméket butanollal vonják ki a szűrt léből vagy ioncserélő gyantát alkalmaznak a kinyert termék tisztítására.
71
POLYMYXIN-B Polimixineket termelő mikroorganizmusokat egymástól függetlenül több kutatócsoport is izolált 1947-ben (Lanlykke, Stansly, Ainsworth). Az antibiotikumok szerkezetének megismerése után az eredetileg eltérő névvel leírt bacillusokat Bacillus polymyxa névvel (µυξα nyálka) jelölték. Az antibiotikumot termelő törzsek a glükózt élesztőkivonatot és ammónium-szulfátot tartalmazó táptalajon nagy mennyiségű nyálkás anyagot, poliszacharidot választanak ki, amely megnehezíti a termelési szakasz befejeztével az aktív anyag kémiai elkülönítését a tenyészléből. Az alapvegyület változatai közül gyógyszerként csak két termék, az 1947-ben felfedezett polymyxin-B és a Kyoma által 1950-ben leírt polymyxin-E, másnéven colistin van forgalomba. A két antibiotikum egyetlen aminosav alkotórészben különbözik egymástól. A polymyxin-E peptid gyürűje D-leucint tartalmaz D fenilalanin helyett. Kémiai szerkezetüket Vogler és munkatársai igazolták 1964-ben szerkezetbizonyító szintézissel. CH3 HC—CH=CH NH2 CH3 | || | | | HC—C ==CH H-C-H H-C-H H3C—C-H | | | | H-C-H H-C-H H-C-H H-C-CH3 | | | | O=C−−−C−−−N−−−C−−−C−−−N−−−C−−−C-H H-N-H H-N-H H-C-H | | H || | H || | | | | H-N H O H O N-H H-C-H H-C-H H-C-H | | | | | H2N-CH2-CH2-C-H C=O H-C-H H H-C-H H-C-H | | | | | | O=C H-C−−N−−C−−C−−N−−C−−C−−N−−C−−C−−N−−C−−C−H | | H || | H || | H || | H || | H−N H CH2 O H O HC-OH O H O H | | | | H2N-CH2-CH2-C−−−−C−−−−N−−−−C−−−−C−−−N−−−C−H CH3 | || | | || | | O H HO−C−H O H H H | CH3 polymyxin B1 szerkezeti képlete
A gyógyszerként forgalomba hozott termékben két, a zsírsav alkotórészben különböző vegyület fordul elő. A B1 komponens 6-metiloktánsavat (izopelargonsav), B2 komponens viszont 6-metil heptánsavat (izooktánsav) tartalmaz. Az előbbi savakkal acilezett depsipeptid láncban 3 természetes aminosavat (1 leucin és 2 treonin) 1 D-fenilalanint és 6 molekula L-αγ-diamino vajsavat találunk. Az acilezett dekapeptid negyedik tagját alkotó diaminovajsav γ-aminocsoportjával alakítja ki a gyürűs szerkezetet a láncvégi treonin. A természetes fehérjétől eltérő szerkezete miatt a fehérjebontó enzimek a polimixint nem inaktíválják. Ugyanakkor peptid jellege miatt a bélcsatornából nem szívódik fel. Ez azért előnyös mert Pseudomonas vagy Shigella okozta bélfertőzések kezelésekor, bélfertőtlenítőként használva a vegyület vesetoxikus tulajdonsága nem jelentkezik. Számos Gram negatív kórokozó ellen hatásos, de nem használható Gram-negatív kokkuszok és a Mycobacterium törzsek ellen. Gram pozitív fertőzések leküzdésére más peptid jellegű antibiotikumokkal, például bacitracinnal kombinálva használják. Különleges esetekben szisztémás fertőzések leküzdése céljából metánszulfonátját intramuszkuláris injekcióként adják. A polymyxin-B szulfát sója fehér szagtalan kristályos anyag. Vízben jól, alkoholban gyengén oldódik. Vizes oldata enyhén savanyú, 6 pH-nál jól tárolható. alkalikus közegben bomlékony. Fizikai-kémiai szempontból kationos detergensnek tekinthető. Alifás oldallánccal rendelkező bázikus peptid, amely a megtámadott baktériumok membránját károsítja. Hatására purin és pirimidin bázisok, nukleozidok távoznak a sejtből. Ebből következik, hogy a nemnövekedő baktériumokat is elpusztítja. Anionos természetű vegyületek (szappanok, foszfolipid, cefalin) jelentősen csökkentik antibakteriális hatását.
VIRGINIAMYCIN Az állattenyésztésben világszerte használatban levő sikeres antibiotikum készítmény, két szinergista hatású peptid lakton természetes elegye. Poláros oldószerekben jól, vízben gyengén oldódik, hexánban, petroléterben gyakorlatilag oldhatatlan. Permeábilitási különbségek miatt csak Gram pozitív mikroorganizmusok növekedését gátolja, jóllehet sejtmentes körülmények között az M-faktor a Gram-negatív és a Gram pozitív mikroorganizmusok riboszómájához azonos mértékben kötődik. A tenyészlében a két komponens - az M- és az S-faktor - a fermentációs periódus befejeződésekor éppen a szinergista hatás szempontjából optimális arányban fordul elő. Az S-faktor elősegíti a kálium ion felvételét a membránon keresztül, az M faktor kötődése a riboszómához viszont éppen kálium iont igényel.
72
(4,6-metil-5-hidroxi-2-hepten-sav)
CH3 | H H O H H H H-C-CH3 O | | || | | | | || H--C−− N −−C −−−C==C−−−C −−− C −−O−−− C | | | | (nor-valin) H C==CH−−CH2 H--C H 3C Az M faktor || | | szerkezete H--C H H H N−−−−−− CH2 | | | | | C== C −−C−− C−− C−−C−− C==N−−−C−−−C==O | | | | || | | || (szerin) CH3 H OH H O H O−−−−−−C-H (2-keto-4-hidroxi-6-metil-10-amino-6,8-decen-sav) Treonin O Fenilalanin O ( Lizin módosítva) || || O−−−−−C−−−CH −−−NH−−−−−C−−−−−CH−−−CH2−−−C==O | | | | H−C−H N−−−−CH2−−−CH2 H−C−−CH3 | | | O=C−−NH−−CH HC–C==CH C==O HC==CH | | || | | | | N=====C O==C HC–CH=CH H O H−C−−CH2 —C CH | | | | || | || || H−C HO−C H-N−−−CH−−−C−−−−N−−−−C−−−−−C−−−−N − CH3 HC—CH | || | || | | H−C–−−−−C−H CH2 O CH2 CH2 | \ / Az S-faktor szerkezete CH3 H–C–H (Lizin módosítva) Aminovajsav Prolin N-metil-fenilalanin A két aminosavból és két elágazó zsírsavból felépülő, vízben alig oldódó M faktor képződése a glükolízis sebességével arányos. A hét aminosavból felépülő S faktor képződését az aminosav-bioszintézist szabályozó mechanizmusok befolyásolják. A fermentáció paramétereinek változtatása kölcsönhatásban áll az egész fermentációs rendszer anyagcseréjével.A programtól való eltérés ezért jelentős mértékben befolyásolhatja a képződött antibiotikum mennyiségét. A virginiamycint termelő fonalas növekedésű prokarióta a Streptomyces virginiae 1954-ben került de Somer és van Dijck laboratóriumába egy Leuven mellett gyüjtött talajmintából. Mivel az előállított termék a penicillinre rezisztens Staphylococcus törzsek ellen is hatásosnak bizonyult, staphylomycinnek nevezték el. Humán gyógyászetben viszonylag rövid ideig használták, mert az új félszintetikus penicillin származékok hamar kiszorították a gyógyszerpiacról.. Ekkor kezdődött az állattenyésztésben való alkalmazása. Sikerét nem utolsó sorban annak köszönhette, hogy az első tíz esztendőben, amikor gyógyászatban használható igéretes új antibiotikumnak tekintették, jelentős kutató munkát fektettek fejlesztésébe. Több mint 90000 izolált mutáns antibiotikum termelését vizsgálták a törzs nemesítése céljából. A jól termelő törzs ipari gyakorlatba vételét nehezítette a lizogén tulajdonsága, fágérzékenysége. Szelekciós munkával az izolált fágra (S-1) rezisztens variánst állítottak elő. Ez a variáns 108 fág ml-1 estén sem lizált. Hamarosan kiderült, hogy a S-1 fágra rezisztens varáns érzékeny egy másik fágra. Hosszadalmas munkával előállították az S-2 fággal szemben is rezisztens mutánst. A törzs élettani viszonyainak vizsgálata feltárta, hogy a virginiamycinen kívül tremel egy bakteriocin szerű antibiotikumot is, amely zavart okoz a termelő törzs anyagcseréjében, gátolja növekedését. Előállították tehát ezt az ismeretlen szerkezetű anyagot és további genetikai munkával előállították az S-2 fágrezisztens törzsből annak antibiotikum rezisztens variánsát. A következő lépés a virginiamycinnel szembeni rezisztencia kifejlesztése volt. Több mint 8000 mutáns közül lehetett kiválasztani azt a törzset, amely elvesztette S faktor érzékenységét.Többszöri akriflavinnal és ethidium bromiddal végzett kezelés után, limitált protein és széhidrát tartalom mellett kinőtt egyedek között sikerült találni egy olyan törzset, amely virginiamycin rezisztenciában jelentősen felülmúlta az eddigi törzseket. A hetvenes években azután rekombinánsok előállításával tovább javitották a fejlesztett törzs termelőképességét. A törzs nemesítés utolsó szakaszában fenilalanin analógra és metionin analógra rezisztens mutánsok közül választották ki a nagyipari eljárásban eredménnyel ma is használt variánst.
73
Az antibiotikumot termelő fermentációhoz az inokulum két lépésben készül. Az első 100 liter térfogatú oltótenyészetet agar táptalajon kifejlődött légmicéliumon fejlődő spóratömeggel oltják. A táptalaj kukoricalekvárt és csupán annyi glükózt tartalmaz, amennyi két nap alatt éppen elfogy. A jól levegőztetett tenyészet a szénhidráthiány hatására vegetatív ”arthrospóraszerű” tömeggé alakul erős pigment termelés és jellegzetes talajillat képződése közben. A második lépcsőben a 10 m3 térfogatú oltóanyagot az előbbi előinokulumban kifejlődött vegetatív spóratömeggel oltják. A tápközeg literenként 20 g kukoricalekvárt, 15 g mogyorólisztet, 5 g élesztőhidrolizátumot, 10 g szójalisztet, 40 g glükózt és 5 g kalciumkarbonátot tartalmaz. A szén és nitrogénforrásban gazdag táptalajt 25 oC-on két napig levegőztetik. A keverő fordulatszáma és az átáramló levegő mennyisége előre megállapított program szerint változik a pH, a cukorfogyás, valamint a tenyészet növekedésének állandó ellenőrzése mellett. A főfermentációs táptalaj (100-200 m3 ) literenként 20 g kukoricalekvárt, 10 g földimogyorólisztet,5 g élesztő hidrolizátumot, 5 g glükózt, 25 g glicerint, 10 g lenolajat, 5 g kalcium karbonátot tartalmaz. Fél óra alatt 110 Co on végzett sterilezést követően a tápközeg 23 oC-ra visszahűtve kerül oltásra. A 100 m3 hasznos térfogatú fermentor magasság:szélesség aránya 2,4. A keverő maximális fordulatszáma 120/perc. (A keverő teljesítményfelvétele 2.3 kW/m3 ) A levegő mennyísége 0.3-0.6 térfogat/perc. A tenyészet kémhatását pH = 6,8-7 között tartják. A készüléken 0,1 atm. túlnyomás mellett annyi levegőt áramoltatnak át és a keverő fordulatszámát úgy változtatják, hogy az oldott oxigéntartalom 15-20% telítési értéken maradjon. Az első 6-10 órában virginiamycin termelés nem észlelhető. A tizedik és huszadik óra között a logaritmikus növekedési fázisban már mikroszkópon jól látható a vizben nem oldódó M faktor kristályainak megjelenése. Húsz és hatvan óra között az antibiotikum termelés valamivel lassabban, de egyenletesen emelkedik. Az utolsó 10-15 órában a szénhidrát elfogy, az antibiotikum képződés lassan leáll, a tenyészet DNS tartalma csökken (lÍzisre utal!). Három nap elteltével az elmenő gázelegyben az oxigén fogyás és a szén-dioxid képződés csökkenése jelzi a fermentációs folyamat befejeződését. A képződött M-faktor mennyisége Ehrlich reakcióval, koloriméterrel mérhető. Az S faktor mennyisége spektrofluoriméterrel határozható meg. A két komponens szinergista antibakteriális aktivitása Staphylococcus aureus mérőtörzzsel agardiffúziós módszerrel követhető. Ezt a szinergista hatást mutatja a mellékelt ábra. Helyesen vezetett fermentációs ciklus esetében a képződött anyagkeverék aránya 100% körüli antibakteriális hatást mutat. Az antibiotikum elegy a megsavanyított teljes fermentléből metilizobutilketonnal könnyen kivonható. Az elválasztott szerves fázis vákuumban történő töményítése után hexánnal kicsapható a nyers virginiamycin, A hatóanyag megszáritott por alakban száraz hüvős helységben aktivitás vesztés nélkül évekig tárolható. Állattápszerként a nyers por kerül felhasználásra. A tápkeverékhez adva kedvező irányban módosítja a bélflóra összetételét, csökkenti a tejsav és illósav termelést, megőrzi a gazdaszervezet számára a tápanyagok értékes aminosavtartalmát és az energiahordozó szénhidrátok jelentős részét. A bél mozgását lassítva, több idő jut a tápanyagok felszívódására. Dierick (1980) vizsgálatai szerint kedvezően befolyásolja a bélhámsejtek permeabilitási viszonyait. Alkalmazása a fehérje takarmány tized részének megtakarítását teszi lehetővé.
74
NISIN Élelmiszeripari jelentősége miatt évtizedek óta szerepel a Gram-pozitív mikroorganizmusok növekedésére ható ható vegyületek között ez a 34 tagú peptid, amely tejgazdasági termékekben (sajt, tejföl, túró) természetes körülmények között is előfordul. Rogers írta le először 1928-ban, mint a Streptococcus lactis által előállított olyan terméket, amely más baktériumok életműködését gátolja. Whitehead 1933-ban megállapította peptid jellegét, de tisztán először Meanwell izolálta 1943-ban. Ezt követőleg rövid idő alatt kiderült, hogy gyógyszerként nem kerülhet forgalomba, élelmiszeripari jelentősége nem kétséges, mivel vitathatatlanul a humán gyakorlatban folytonosan jelenlevő környezetbarát fertőtlenítőszer. A hatóanyag biológiai aktívitása Streptococcus cremoris mérőtörzset használva turbidimetriásan mérhető. (0,4 IU/ml). Az agardiffúziós módszer Micrococcus flavus mérő törzset használ a fehérje diffúzióját gyorsító Tween-20 detergens jelenlétében. A génen végzett beavatkozással több nisin analógot állítottak elő. Ezek elméleti érdekességük mellett élelmiszeripari felhasználásra nem kerültek. Kémiailag nem teljesen egységes. A főkomponens mellett több rokon szerkezetű vegyület található. A hőstabil, kémiailag ellenálló nisinben előforduló építőelemek egy része (aminovajsav, lantionin, dehidro-vajsav, dehidroalanin, metil-lantionin) nem fordul elő a természetes fehérjékben. Ezért először úgy vélték, hogy a bioszintézise nem riboszómán folyik. Ma már köztudott, hogy a nisin előanyaga a pronisin a természetes fehérjékhez hasonlóan mRNS által irányítva riboszómán szintetizálódik. Ezt a 7000 moltömegű peptidet a membrán közelében működő enzimek alakítják bioaktív termékké. Éppen a poszt-transzlációs átalakítás természetéből következően, egy-egy átalakítási reakció elmaradása okozza a rokonszerkezetű termékek megjelenését. Nagyüzemi termelésekor anaerob körülmények között kukoricalekvárt, kazeinhidrolizátumot, glükózt, kálium-foszfátot és magnézium-szulfátot tartalmazó táptalajt használnak. A növekedő tenyészethez adott nukleinsav-bázisok fokozzák a nisin képződést. A tenyésztés 16-18 órán keresztül 28-30 oC-on enyhén savanyú (pH = 6.5-6.8) körülmények között oxigénmentesen folyik. Keverés csak a pH állítás miatt szükséges. A termék kinyerésére több módszer használható. Az egyik elterjedt eljárás szerint a pH = 2-re savanyított fermentlé sejtmentes szűrletét pH = 4,5 -re állítva 5 % kloroform és 0,1% szekunder-oktilalkohol elegyével extrahálják. Az elkülönített gélszerű szerves fázishoz hűtött körülmények között abszolút etanolt adnak. A kicsapódó nyers nisint 0,05 n sósavval oldják. Az oldatból a kloroform nyomait forró levegő átbuborékoltatásával elűzik, majd nátrium-kloriddal kisózzák az antibiotikumot. Átkristályosításkor fonalas szerkezetű kristályok nyerhetők, ha a forró etanolos oldatot lassan engedjük lehülni. Propanollal is extrahálható a nisin a fermentlé savanyú szűrletéből. Ez esetben konyhasó adagolásával biztosítják a szerves (propanolos) fázis elkülönülését. A propanolos oldatból további nátrium-klorid adagolással, kétfázisú kristályosítással állítható elő az élelmiszergazdaságban széleskörűen használt fertőtlenítőszer.
75
BLEOMYCIN Ezt a glikopeptid antibiotikumot először Maeda írta le 1956-ban phleomycin néven. Ennek ellenére a tudományos közvélemény Umezawa 1966-ban kiadott közleményét ismeri.
A Streptomyces verticillus fermentlevében előforduló citosztatikus hatású glikopeptid keverékben a hexózok és a peptidszerkezetű alapváz, a bleomycin sav minden esetben azonos. Eltérést csak a savamid oldallánc szerkezetében észlelhető. Az A 2 variánsban 3-amino-propil-dimetilszulfonium oldalláncot, a B2 komponensben pedig guani-dino-butilamin oldalláncot találunk.
A peptidlánc felépülése A gyógyszerként forgalmazott készítmény 50-60% A 2 komponenst és 25-32% B 2 komponenst tartalmaz. A cukorrész diszacharid, 2-O-(3-O-karbamoil-α-D-mannozil)-L-glükóz. A peptidlánc felépítésében a természetes aminosavakon kívül (L-szerin, L-aszparaginsav, L-treonin, L-β-alanin, L-cisztein) néhány különleges aminosav is részt vesz, például L-eritro-β-hidroxi-hisztidin, 4-amino-3-hidroxi-2-metil-valeriánsav és a 2-metil-2-karbimino-alanin. A különleges aminosavak jelenléte nehezíti a proteolitikus enzimek hidrolitikus hatását. A láncvégi savamid hidrolízise azonban zavartalanul folyhat. Ez a hidrolízis (bleomicin hidroláz) inaktiválja az antibiotikumot.
76
A rákellenes gyógyszerként forgalmazott antibiotikum rézII-komplexe ellenáll a bleomicinhidroláz inaktíváló hatásának. A kétértékű réz nem csak a molekula nitrogén atomjaival kialakított koordinációs kötésekkel rögzíti a másodlagos szerkezetet, de a diszacharid lánc karbamoil csoportjával is kapcsolatba lép. A szervezetben uralkodó redukáló környezet hatására azonban a fémion redukálódik. Az egyértékű (kupro) réz ion viszont alkalmatlan a molekula szerkezetének stabilizálására. A réz redukciója az előbbi stabil szerkezetet a komplex teljes széteséséig lazítja. A biológiai környezetben jelenlevő kétértékű (ferro) vas a teljes szétesést megakadályozza. A réz ion helyére épülve a nitrogén atomok helyzetét továbbra is koordinálja, a diszacharid lánc karbamoil csoportjához azonban nem kapcsolódik, sőt a jelenlevő oxigénnel kapcsolatba lépve hamarosan oxidálódik (ferri). A megkötött oxigén C-4 helyzetben támadja a DNS lánc dezoxiribóz egységeit. A gyürüs szerkezetet felszakítva elősegíti a DNS szál feldarabolódását.A fellazított DNS könnyen áldozatul esik a lebontó hatású enzimaktivitásnak.A pankreász dezoxiribonukleáz. hatását megnöveli a bleomicin hatására bekövetkező fragmentáció. Gyógyszerként a hatásos vegyület szulfát sója kerül forgalomba. Krém színű, higroszkópos porként vízben jól oldódik. Enyhén savas közegben (4.5-6 pH) tárolt oldata két hét alatt sem veszít aktivitásából. In vitro inaktíválják a szulfhidril származékok, az aszkorbinsav, hidrogénperoxid és a nehézfém ionok. Adagolása kémiai szerkezetéből következően csak injekciós formában lehetséges. A legtöbb daganatellenes hatású antibiotikum immunszupresszív hatást is mutat. A bleomycinnek ilyen hatása nem jelentkezik, mert a lépben és a limfoid szövetekben viszonylag gyorsan lebomlik. A szövetekben előforduló bleomycin hidroláz ammónia felszabadulásával hidrolizálva a karboxamido csoportot inaktíválja a molekulát. A gyógyszer és a szervezet között kialakuló bonyolult kölcsönhatás jól adagolhatóvá teszi ezt a citosztatikumot.
77
ACTINOMYCIN-D Waksman és Woodruff 1940-ben a Streptomyces parvulus fermentlevében egy igen hatásos antibakteriális anyagot találtak. Hasonló kémiai szerkezetű és biológiai tuljasdonságú anyagokat később más sugárgombák fermentlevében is kimutattak. Ezek a sárgásvörös fenoxazint tartalmazó peptidek toxikus voltuk miatt antibiotikumként szóba sem jöhettek. A csoport egyik tagja, a vörös, enyhén higroszkopos, fény és hőérzékeny kristályos actinomycin-D, amelynek kémiai szerkezetét Brockman és Johnson derítette fel, a rák-kemoterápiában kapott fontos szerepet. Ez a vegyület vízben 10 oC-on jobban oldódik mint 37 Co-on. Alkoholban jól oldódik, éterben gyakorlatilag oldhatatlan. Biológiai hatása olyan erős, hogy bőrön keresztül vagy porának belégzése is toxikus tüneteket okozhat. Főleg a vörös csontvelőt károsítja, zavarja a veseműködést, gyomor és bélpanaszokat okoz. Ezek a panaszok a kezelés befejeztével megszűnnek.
A természetben előforduló aktinomicinekben a kromofor azonos: 2-amino-4,6-dimetil-3-oxofenoxazin1,9-dikarbonsav. Mindkét karboxil csoporthoz egy-egy gyürűs peptidlánc kapcsolódik. A fenoxazin gyürű szintézise triptofánból indul. Kinureninen illetve hidroxikinureninen keresztül jutunk a hidroxiantranilsavhoz. Ez utóbbi metilezett származéka kapcsolódik a pentapeptid laktonhoz. A hexapeptid tiotempláton szintetizálódik. A bioszintézist végző enzimkomplexben valin racemáz és N-metiláz működik. A készülő peptidben az aminosav sorrend 4-metil-3-hidroxi-antranilsav, L-treonin, D-valin, L-prolin, szarkozin, L-N-metil-valin. Utolsó lépésként a valin tioészter hidrolízise vezeti be a treonin hidroxil csoportját hasznosító lakton gyürű kialakítását. Befejező lépésként a két antranilsav-pentapeptid-lakton reduktív kondenzációjával jutunk el a kész actinomycin-D molekulához. Az antibiotikum két peptid-laktonjának egymáshoz viszonyított helyzetét a D-valinhoz tartoztó karbonil és amid csoportok között kialakuló hidrogénhidak rögzítik. Egy ilyen kis peptid kémiai szintézise nem jelent sem elméleti sem gyakorlati problémát, szinte rutinszerű feladat. A tercier butiloxi karbonillal védett L-treoninhoz kapcsolják a benziloxi-karbonillal védett LN-metil-valint, majd a védőcsoport eltávolítása után a szarkozint. A következő lépésben újra a treonin reagál. Vegyesanhidrides módszerrel kapcsolják hozzá a D-valin-L-prolin-butilésztert. Az így kialakitott fragmentumhoz kötik az aromás komponenst p-metil-2-nitro-3-benziloxi-benzoesav-kloridot használva. A lakton gyűrű kialakítása az előbbi termék p-nitrofenil-szulfittal pridinben képzett észter-származékából hidrogénbromiddal történik dioxánban trietilamin jelenlétében. A pentatpeptid laktonból katalitikus hidrogénezéssel
78
nyerhető a 3-hidroxi-4-metil-antranil lakton, amelyből matanolos foszfát-pufferben káliumferricianiddal végzett oxidációval készül el az actinomycin-D.
Ezt az utat természetesen nem a fermentációs útnál gazdaságosabb eljárás kidolgozása céljával járták végig, hanem a hatás és szerkezet közötti összefüggéseket kívánták vizsgálni. Ezen az úton nagy variációs lehetőség nyílott az aktinomicin analógok előállítására azon túlmenően, hogy már az alapmolekulán is szinte minden elképzelhető és kémiailag lehetséges módosítást végrehajtottak. Ismertté vált, hogy a lakton gyűrű felnyitása a biológiai hatás elvesztésével jár. A prolin kicserélése oxiprolinra két variációt jelent. Cisz helyzetű hidroxil csoport növeli az aktivitást transz helyzetű hidroxil viszont az antibiotikus hatást jelentős mértékben csökkenti. A hidroxil csoport acilezése ugyancsak csökkenti a biológiai hatást. A kromofor aminocsoportjának az acilezése csökkenti az aktivitást. Az amino-csoport dialkilezése illetve hidroxil csoporttal vagy klórral való helyettesítése inaktiválja a molekulát. A metil csoportok alkil homológjai az aktivitás csökkenését hozzák. Az aromás gyűrű hidrogénjeinek klór, bróm, illetve nitro csoporttal való helyettesítése minden esetben növeli a biológiai aktivitását.
79
Biológiai hatása a transzkripció gátlásában jelentkezik. A bázispárok közé ékelődve a DNS-hez kötődik. A kromofor poláros csoportjai hidrogén híddal képesek a guanin csoporthoz kapcsolódni, miközben a peptid-lakton a DNS cukorfoszfát láncával képez hidrogénhidat. A DNS függő RNSpolimeráz működését ez az antibiotikum jobban gátolja, mint a DNS-replikázét. A riboszomális RNS
A fenoxazin-gyűrű kapcsolódása a guanincsoporthoz
szintézisét olyan alacsony koncentráció gátolja, ami a sejtmagban folyó DNS szintézist nem zavarja..
BIALAPHOS Japán szerzők a hetvenes évek egyik leghatásosabb peptid jellegű herbicidjeként ismertetik a Streptomyces hygroscopicus tenyészlevéből izolált oligopeptidet (J.Antibiot. 37:1505. 1984). Kémiailag foszfonotricil-alanilalanin L-2-amino-4-(hidroximetil-foszfinoil)-butiril-L-alanil-L-alanin. H O H H NH2 O H H O H H | || | | | || | | || | | H----C------P------C------C------C------C------N------C------C------N------C------COOH | | | | | | | H OH H H H CH3 CH3 Jól használható az egy és kétszikű növények kiirtására, a kakaslábfű (Echinochloa crusgalli), a fehér libatop (Chenopodium album), a palkafélék (Cyperus rotundus), a fodros lorum (Rumex crispus) és a vizi jácint (Eichornia crassipes) elterjedésének meggátlására. A növényvilág peptidázai egymásután eltávolítják a C terminálisról az alanin molekulákat és ezzel aktíválják a foszfonotricin metabolitot. Az L-2-amino-4-hidroximetilfoszfinoil-vajsav (L-AMPB) a növényi nitrogénanyagcsere szempontjából kiemelkedő jelentőségű glutamin szintetáznak az aktív gátlószere. Ezzel magyarázható a bialaphos herbicid tulajdonsága. Pruess és munkatársai 1973-ban az előbbi rokonvegyületét, az L-(foszfono)-metionin-S-szulfoxinil-Lalanil-L-alanint izolálták egy Streptomyces törzs tenyészlevéből. O H H H O H H O H H || | | | || | | || | | HO---P===N-----S-----C-----C------C------C-----N-----C-----C-----N-----C-----COOH | | | | | CH3 H NH2 CH3 CH3 A bialaphoshoz hasonlóan az alanin molekulák lehasítása után visszamaradó glutamin-szintetázt gátló L-N-foszfono-metionin-S-szulfoximin ugyancsak hatásos herbicid. Mindkét enzim-gátló a talajban tovább bomlik, végül teljesen inaktiválódik. De amíg az alanin molekulák egy napon belül leszakadnak, az L-AMPB inaktiválódása két hétig is eltarthat. Hővel sterilezett talajban, az üvegházakban intenzív növénytermesztési technológiát alkalmazva az L-AMPB hatásos koncentrációja több mint egy hónapig változatlan aktivitással megmarad.
80
A CYCLOSPORIN mint IMMUNSZUPRESSZÍV HATÓANYAG A XX. század utolsó negyedében a Sandoz biológiailag hatásos új anyagok előállítása céljával 1970ben indított kutató programjának anyagilag is sikeres gyógyászati terméke az immunszupresszív hatású cyclosporin vegyület család, amelynek első képviselőjét két különböző helyről, Wisconsin-ból (Cylindrocarpon lucidum) és Norvégiából származó (Tolypocladium inflatum) törzsek fungisztatikus hatású termékeként fedeztek fel. A két fonalas gombát a taxonomusok Trichoderma polysporum-ként nevezték meg az első vizsgálatok alapján. Dreyfuss M. munkatársai 1976-ban közölték (Eur. J. Appl. Microbiol. 3:1125-133) hogy a Trichoderma polysporum tenyészlevéből in vitro hatásos gombaellenes anyag nyerhető, amelyről később megállapították, hogy a vérparaziták ellen is hatásos. A Trichoderma polysporum 2 % malátakivonatot és 0,4 % élesztőkivonatot tartalmazó agar táptalajon tenyésztve 27 oC-on 10-12 nap alatt 5x108 konidiospórát fejleszt 1 cm2 agarfelületen. Az így nyert konidiospóra 7 % malátakivonatot és 5 % glükózt tartalmazó tápközegbe szuszpendálva -40 oC-on hosszabb ideig tárolható az életképesség csökkenése nélkül. Az elő-inokulumként szolgáló táptalaj 4 g glükózt, 0,5 g peptont, 0,2 g káliumfoszfátot, 0,3 g nátrium-nitrátot, 0,05 g kálium-kloridot, 0,05 g magnézium-szulfátot és 10 mg vas-szulfátot tartalmaz literenként 5,2 pH-ra állítva sterilezve Rázott lombikban 16 óra inkubálás után indul meg a növekedés. A micélium növekedése 72 órás korra éri el a literenkénti 7 g szárazanyag tartalmat, miközben minimális ciklosporin képződése mellett kémhatása csökken. Jól levegőztetett fermentorban a növekedés gyorsabb. Az előinokulumban literenként 8 g száraz micélium képződik 48 óra alatt, miközben a pH 5,2-ről 4,2-re csökken. Az oltóanyag felszaporításához már a termelő táptalajt használják, amely nagyobb mennyiségű szerves nitrogént – 10 g peptont – tartalmaz literenként. Tíz százalék oltóanyaggal oltva, percenként a fermentlé térfogatával azonos mennyiségű levegőt áramoltatnak át a készüléken 0,5 bar túlnyomás mellett, hat napon keresztül. A negyedik naptól kezdve a tenyészet színe erősen sárgul, miközben nagy mennyiségű változatos alakú konidiumot tartalmaz. A fermentáció második szakaszában, 7 napos korban a micélium töredezni kezd és egyre nagyobb számban jelennek meg a sárgásbarna konídiumok, a fermentlé nyálkássá válik. A jólsikerült fermentáció leálláskor 4-500 mg butilacetáttal elkülöníthető hatóanyagot tartalmaz literenként, amiből szilikagélen végzett kromatográfiás tisztítással acetonból átkristályosítva 150-200 mg ciklosporin-A és 50-100 mg ciklosporinC nyerhető prizmás tűkristályok Tizenkétnapos fermentációs ciklus paraméterei, formájában. A biológiailag aktív a termékképzés körülményei hatóanyag mennyisége Aspergillus niger növekedésének gátlásával jól meghatározható (MIC érték : 1-3 mg /ml). A gomba sejtfal képződését gátolja a kitin szintézis akadályozásával. Ebből következően a Neurospora crassa sejtfalképzésben sérült mutánsának növekedését nem gátolja. Hatás spektruma a polioxinénál lényegesen szűkebbnek tűnik. A hetvenes években a vezető kutató helyeken jelentős farmakológiai kutató kapacitást építettek ki az antibiotikus hatás miatt kiválasztott vegyületek közül valamilyen farmakológiailag hatásos új anyag kiszűrése céljából. Ez a rendszer a szívkoszorúér, a központi idegrendszer, a sejtosztódás, a tumor növekedés és az immun rendszer területén jelentkező biológiai hatás felismerésére volt kifejlesztve A fungisztatikus hatás alapján megtisztított hatóanyagot ezért ebben a rendszerben is megvizsgálták. Az in vivo gyenge fungisztatikus hatást mutató anyag jelentősége erősen növekedett, amikor egereken végzett kísérletekben gyulladásgátló és immunszupresszív hatását észlelték. A készítmény hamarosan a századvég fontos terápiás szereként került a szervátültetéssel foglalkozó klinikákra. A tiszta termék szelektíven hat a limfocitákra, mégpedig sokkal inkább a T-sejtek induktív fázisában mint a sejtszaporodási ciklusban. Gátolja a T-segítő (helper) sejtek aktiválását. Akadályozza a limfokinek, igy az interleukin-2 képződését. Nem zavarja viszont a leukocita α-interferon és a (fibroblast) β-interferon képződését. A legnagyobb mennyiségben, főtermékként képződő cyclosporin-A mellett közel 25 minor komponensként képződő rokon vegyületet ismerünk, amelyeket a nyers extraktumból metanollal Sephadex LH20 oszlopon, illetve szilikagélen lehet elválasztani. Ezek a gyűrűs peptidek 11 aminosavból épülnek fel. A főtermékként gyógyászati alkalmazásra került acetonból kristályosítható, vízben gyengén oldódó, lipofil anyag UV spektruma végabszorpciót mutat. Apoláros természete - az aminosav építőelemek nagyfokban érvényesülő N-metilezettségét ismerve - nem meglepő. Megjegyzendő, hogy a hatásos termékben a 9, és 10-ik helyen levő leucin N-metilezettsége cisz helyzetű, a többi aminosav N-metilezettsége viszont transz.
81
A harminchárom tagú peptidgyűrű szerkezetét merevíti – a 2-ik és 5-ik aminosav – az aminovajsav és a valin között kialakuló két hidrogénhíd, valamint a 7-ik helyen levő L-alanin és a 11-ik helyen levő metil-valin között létrejövő hidrogénhíd. Vizes közegben a metil-butenil-treonin és a 6-ik helyen levő metil-leucin apoláris lánca egymásfelé fordulva elősegíti egy újabb hidrogénhíd kialakulását a D-alanin és az előbbi metil-leucin karbonil csoportja között. Ezt szemlélteti az ábra és a krisztállográfiai térszerkezeti model rajza Sósavas hidrolízissel nyert építőelemei közül az egyetlen D-alaninon kívül a többi komponens L konfigurációjú természetes aminosav. Egy α-aminovajsav, egy szarkozin, négy N-metil-leucin, egy alanin, egy valin, egy N-metil-valin és egy kilenc szénatomot tartalmazó telítetlen aminosav (3-hidroxi-4-metil-2metilamino-6-okténsav, másnéven N-metil-γ-butenil-γ-metil-L-treonin) alkotja a hatásos molekulát. A C62H111N11O12 összegképletű anyag dihidrociklosporinná redukálható. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A B C D E F G H I K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
A tenyészközeghez adott aminosavakkal a képződő ciklosporin kémiai szerkezetét befolyásolni lehet. A táblázat a termelő törzsben kialakuló, illetve mesterségesen kialakított aminosav készlettől függő ciklosporin változatokat mutatja be. Tolypocladium inflatum-mal végzett kisérletek szerint 8 g/liter mennyiségben adott DL-α-aminovajsav jelenlétében kizárólag ciklosporin-A képződik. Treonin jelenlétében a ciklosporin termelés megkétszereződik ugyan, de 59 % ciklosporin-A mellett 41 % ciklosporin-C képződik. A C komponens immunszupresszív hatása gyengébb mint a gyógyszerként fogalmazott ciklosporin-A (C62H111N11O12). L-norvalint adagolva a teremék 91 %-a ciklosporin-G ( C63H113N11O12) mindössze 9 % ciklosporin-A mellett. Immunszupresszív hatás szempontjából az A illetve G komponens nem különböztethető meg.
82
83
Bioszintézise a gramicidin-S képződéséhez hasonlóan, tiotemplát enzim-komplexen folyik ATP-vel aktívált természetes konfigurációjú aminosavak felhasználásával. Az izotóppal végzett kísérletek alapján feltételezhető, hogy az okténsav a zsírsav szintézis analógiájára malonil-CoA felhasználásával képződik. A jelzett (metil13 C)metioninnal végzett kísérletek alapján feltételezhető, hogy a metil csoportok a bioszintézis második szakaszában kerülnek a tizenegy tagú gyűrűs peptidre.
(a) szilárd kristály konformációja röntgenkrisztállografikus vizsgálat alapján.
(b) apoláros oldószerben felvett NMR vizsgálat eredményeiből komputerrel nyert szerkezet rajza. Az ábrán látható, hogy az apoláros oldallánc a molekulából kemelkedik az apoláros oldószerben való kristálíyképződés körülményei között.
Wenger R. és munkatársai a ciklosporin-A totálszintézisét is megvalósították. Előállították a metilokténsav származékot, majd tercier-butiloxi-karbonil védelmet alkalmazva létrehozták a tizenegytagú lineáris peptidet, végül zárták a peptid láncot. Nem kevés problémát jelentett az N-metilált építőelemekből felépíteni a lineáris peptid láncot. A totálszintézis gazdaságosság szempontjából nem vetekedhet a bioszintézissel, viszont lehetőséget adott bizonyos - a természetben elő nem forduló - ciklosporin analógok előállítására. Ezek a kémiai változatok azonban kivétel nélkül inaktív módosulatok voltak.
13
C eloszlása.
*: [13C1 ] acetátból,
: [13C2] acetátból,
: [metil-13C] metioninb
Az élő szervezetbe etanol-polioxietilált castor olaj elegyeként intravénásan adagolható. Szájon át zselatinkapszulában adva felszívódása bizonytalan (20-50 %), 3-4 óra alatt éri el a hatásos vérszintet. Lipofil természete miatt egyenletesen oszlik el a szervezetben, a vér-agy gáton azonban nem hatol át. A felvett anyag fele a vörös vértestekhez, 10-20 %-a a fehérvérsejtekhez, 30-40 % a vérplazma lipoprotein frakciójához kötődik. A májba kerülve lassan lebomlik. Közel 30 ismert bomlásterméke, demetilezett, illetve hidroxilezett származéka ürül elsősorban az epével. A bomlástermékek jelentős hányada még immunszupresszív hatást mutat. A bevitt hatóanyag felezési ideje 15 óra. A vizelettel 96 óra alatt mindössze 4-6 %-a távozik.
84
A makrolid antibiotikumok között is akad néhány immunszupresszív aktivitású anyag. A felfedezésekor FK506 ként kiemelt, később tacrolimusnak elnevezett intravénásan illetve szájon keresztül is adható vegyületet Streptomyces tsukubaensis tenyészlevéből izolálták. A tacrolimus is gátolja a T-sejtek aktíválását. A citoszolban kialakuló tacrolimus-fehérje komplex gátolja a calcineurin aktívitását, a kalcium-függő szerin/treonin foszfatáz hatásos működését. A tacrolimus intracelluláris receptora azonban nem azonos a ciklosporint kötő fehérje szakasszal, jóllehet mindegyik végeredményben a calcineurin hatását befolyásolva a defoszforilezést gátolva akadályozza a lymphokin gének expresszióját és ezzel késlelteti az immunválasz megjelenését
Immunszupresszív hatású újabb bioaktív makrolidok
85
Az immunválaszt befolyásoló anyagok hatásmódja A téma vizsgálata szempontjából célszerű végigtekinteni az immunválaszban résztvevő sejtek kapcsolatrendszerét.
86
A vörös csontvelőben képződő pluripotens őssejtből képződik a prekurzor sejt, amiből egyrészt a vér alakos elemei (vörös vértestek, a fehérvérsejtek és a vérlemezkék) másrészt az antigént bemutató sejtek (APC antigen presenting cells) és a makrofágok jönnek létre. Vörös csontvelõ
Az immunválaszban résztvevõ sejttípusokat bemutató vázlat A pluripotens őssejtből képződik a prekurzor lymphocita, amiből a thymusban fejlődik ki a T sejt. A T sejtből az antigén bemutató sejt közreműködésével jön létre az antigénre specifikus CD8 sejt, amiből a CD-4 segítő sejtből származó IL-2 fehérje által serkentett antigénre specifikus sejt lízist okozó CD-8 ölő sejt és CD-8 szuppresszor sejt képződik. Ugyancsak a pluripotens sejtből képződik a prekurzor nyirok sejt, amiből a thymusban képződik a T sejt, valamint az elő-B sejt, amely végül B-sejtté alakul. A T sejtből képződik a CD-4 sejt, amiből az általa termelt IL-1 fehérje (lymphokin) közreműködésével képződik CD-4 segítő sejt. Ebből képződik az antigén specifikus antitestet hordozó CD-4 immunsejt és az emlékező sejt. A segítő sejt különböző fehérjéket (lymphokineket) termel. Ezek közül az IL-2 a CD-8 sejt továbbalakulását, az IL-1, IL-4, IL-5, és IL-6 fehérjék pedig a B-sejt differenciálódását, extracelluláris antitestet termelő plazma sejtté, illetve antigén specifikus emlékező sejtté fejlődését segítik. Az APC sejthez kapcsolódó MHC (major histokompatibility complex) faktor exogén eredetű antigént befogadva MHC-I komplexként indítja a CD8 sejt kialakulását serkentő folyamatot. Az immunválasz elsősorban a T és B sejtekből származó emlékező sejtek képződési sebességétől függően általában 8-14 nap elteltével várhat. A T-sejt képződési sebességétől függően azonban 1-3 napon belül is megjelenhet az antitest. — Az endogén eredetű fehérjével kialakuló MHC-II komplex bekötődésének a hatására indul a lymphokinek elválasztása, ami viszont a B sejtek fejlődését serkenti. A T és B sejtek szaporodási ciklusát egy Ca++ iont igénylő calcineurinnak nevezett szerin/treonin foszfatáz a foszfát csoport eltávolításával a foszforilezett szabályozó fehérje (NFATc–P) aktiválását végzi. A citoszolban képződő foszfátmentes NFATc fehérje (nuclear factor of activated T cells) a sejtmagi NFATn fehérjével kapcsolódva nélkülözhetetlen átírást szabályozó faktor. Transzkripciós faktorként serkenti az interleukin (lymphokin) IL1–IL12 gének átírását. Hiánya nem csak az interleukin géne átírásűát akadályozza, de 87
a megfelelő citokin receptorok képződést is gátolja. Az IL2 hiány miatt menő a TGF-β képződés (transforming growth factor-β), ami hatásosan gátolja a T sejt osztódását, az antigén specifikus CD8 ölősejt képződést. Végül is a TGF-β tevékenysége váltja ki a immunszuppressziót. Ez az NFATc/NFATn komplex inditja el más fehérje gének (TNF-α tumor nrkrózis faktor, IFN-γ interfgeron γ, GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor) átírását is. A calcineurin foszfatáz gátlása tehát nagy számú fehérje képződésének az akadályozását okozza. A lipofil tulajdonságú ciklosporin a sejtbe jutva az ott levő ciklofilin receptor fehérjével heterodimer komplexet alkotva gátolja a calcineurin (szerin/treonin peptid foszfatáz) működését. A citoszolban levő szabályzó fehérje defoszforilációját akadályozva nem jöhet létre az NFATc/NFATn komplex, ennek hiányában pedig nem képződnek a B sejt differenciálódását segítő lymphokinek. MHC-II endogén antigén
ciklosporin
T sejt receptor T sejt SEJTPLAZMA Ciklofilin
Calcineurin (foszfatáz) Ca++/CaM
Ciklosporin ciklofilin Inaktíváló komplex
PI NFATc—P
NFATc
NFATn
NFATc | NFATn SEJTMAG génátírás indukálása Interleukin IL2 Interleukin képzõdés CaM = calmodulin (kalcium iont kötõ fehérje) calcineuri = szerin/treonin peptid foszfatáz ciklofilin =aktiváló fehérje ciklosporin = immunszuppressziót okozó depsipeptid (Ciklofilinhez kapcsolódva inaktíválja a calcineurint) Az NFATc/NFATn komplex hiány miatt nem képződik IL2. Ennek következtében fokozódik a TGF-β (transforming growth factor) képződése, ami hatásosan gátolja a T sejt szaporodását, azaz az antigén specifikus CD8 ölősejt képződést. Végül is a TGF-β tevékenységének a fokozódása váltja ki az immunszuppressziót. A ciklofilin fehérjével a tacrolimus (eredetileg FK506) is calcineurint inaktíváló stabil komplexet képez A foszforilezett szabályozó fehérje (NFATc–P) nem indítja el a lymphociták továbbalakulását segítő fehérjék génjeinek átírását, azaz specifikusan gátolja az immunválasz kiteljesedését. A sejtosztódás és a differenciáció hatásosan gátolható kortikiszteroidokkal, a de novo purinszintézist gátló mycophenol savval, rapamycinnel, cyclophosphamiddal, methotrexáttal, azathioprinnel. Az immunszuppresszív anyagok hatása függ az antigén minőségétől. Általában könnyebben akadályozható az immunválasz megjelenése, ha a terápia megelőzi az antigén bemutatását. A primer immunválasz megjelenése sokkal hatásosabban akadályozható, mint a mérsékelten szuppresszálható szekunder válasz. Mellékhatásként ezek a hatóanyagok gátolják a vörös csontvelő sejtjeinek az osztódását, továbbá a gyomor-béltraktus sejtjeinek a szaporodását.
Serkenti a vörös csontvelő sejtek és prekurzor lymphocyták képződését T sejt képződést és a citolízist okozó ölősejt képződését segíti A vörös csontvelőben a B és T sejtek képződését serkenti A B és T sejtek valamint a makrofágok aktiválódását segíti Az eozinofil sejtek képződését segíti A csontvelő képződést és a plazmasejtek osztódását segíti Az IL-2-vel együttműködve serkenti a B és T sejtek képződését A neutrofil sejtek, valamint a B és T sejtek képződését segíti Az ős sejtek osztódását segíti Gátolja a T sejtek működését Az IL-3 hatását erősíti Az IL-2 hatását erősíti Növeli a makrofágok, a T sejtek és a természetes ölő sejtek aktivitását Aktiválja a makrofágok és a T sejteket, fokozza az MHC képződését Serkenti a csontvelő sejtek osztódását, aktiválja az ACP sejteket A tumor sejteket öli, fokozza a gyulladásos folyamatot VIOMYCIN
Vörös kristályos, vízben jól oldódó erős bázis, amelyet 1951-54 között több kutatócsoport is izolált kölönböző Streptomyces törzsek tenyészlevéből. Összegképlete C25H43N13O10. Legvalószinűbb kémiai szerkezetét eddig szerkezetbizonyító szintézissel nem igazolták.
Gyógyszerként a szulfátsóját használják. Gyógyászati jelentősége a Mycobacterium tubercolosis elleni alkalmazhatóságában rejlik. Mellékhatása nyolcadik agyi ideg károsításában és vesekárosító hatásában jelentkezik. A riboszomához kötődve gátolja a fehérjeszintézist, de nem okoz hibás kódleolvasást. A vegyület kémiai módosításával nem sikerült a biológiai tulajdonságát javítani. A hidroxilcsoportok kémiai acilezése nem befolyásolja a biológiai aktivitását, viszont a terminális aminocsoportokat érintő kémiai reakciók teljesen inaktíválják a molekulát.
89
NOVOBIOCIN Gyógyászati használhatósága és az eddig megismert antibiotikumoktól eltérő különleges szerkezete indokolja a bioaktív termék tárgyalását. Az ötvenes évek derekán egymástól függetlenül három kutatócsoport is megtalálta a Streptomyces spheroides, illetve a S. niveus metabolitjaként, majd ezt követően egy S. griseoflavus és egy S. griseus, valamint több nem azonosított Streptomyces törzs termékeként is leírták. Kémiai szerkezetének tisztázása Shunk, Haecksema, valamint Spencer nevéhez fűződik. Kémiai szintézisét Vaterlaus dolgozta ki munkatársaival.
A molekula egy benzoesav származékkal szubsztituált kumarin származék, amihez egy L-lyxóz szerkezetéhez hasonló novióz kapcsolódik. A vegyület mindkét aromás komponense shikiminsavból a cukor komponens pedig UTP-glükózból képződik. A kristályos antibiotikum sárgás fényérzékeny anyag. Erős sav lévén vízben való oldhatósága pH függő. A kumarin enolos hidroxilja sokkal erősebben savas karakterű, mint a fenolos hidroxil. Streptomyces niveus-ból kinyertek egy enzimet, amely ATP jelenlétében a 3-amino-4,7-dihidroxi-8metil-kumarin és a 4-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-benzoesav kapcsolódását katalizálja. In vivo valószínűleg a cukor komponenssel szubsztituált kumarinhoz kapcsolódik a benzoesav származék. A cukor komponens metilezése, továbbá karbamoilezése az antibiotikum képződés befejező lépése. A karbamoil csoport jelenléte esszenciális a biológiai hatás szempontjából. A tenyészethez adott prekurzorokkal a novobiocin különböző analógjait lehet előállítani. A beépülés feltétele, hogy a benzoesav para helyzetben oxigén, vagy nitrogén atomot tartalmazzon. Ezek a novobiocin analógok azonban antibakteriális hatás szempontjából nem jelentettek előnyt. Az injekcióként, vagy kapszulában forgalomba került novobiocin nátrium sója könnyen előállítható. Vízben nehezen oldódó kalcium-sóját szuszpenzióként is adagolják. Erősen gátolja a Proteus vulgáris és a Klebsiella törzsek növekedét. Fontos szerepet nyer a penicillin rezisztens Staphylococcus törzsek által okozott fertőzések leküzdésében. Szokásos adagja 0.5-1 g 12 óránként. Antibakteriális hatását erős magnéziumkötő képességével magyarázzák. A híg (0,01 M) novobiocin oldat enyhén sárgás színe 0,01 M MgCl2 jelenlétében mély sárgává sötétedik. Más kétérétékű ion – például kalcium – nem mutat hasonló hatást. A novobiocin mind azokat a reakciókat (közel 60) zavarja, ahol a Mg++ ionoknak különleges szerepük van. Így a DNS-girázhoz kötődve gátolja a DNS polimeráz és az RNS polimeráz működését. Nagyobb koncentrációban gátolja az oxidatív foszforilezést és a transzport rendszerek működését. Közismert, hogy a magnézium a biológiai membránok és a riboszómák szerkezetének a stabilizálásában is fontos szerepet játszik. Ismeretes, hogy a Gram-pozitív mikroorganizmusok magnézium igénye közel tízszer nagyobb a Gram-negatív mikroorganizmusokénál. Nem meglepő tehát, hogy a novobiocin erősen gátolja a Gram-pozitív mkroorganizmusok növekedését, de alig hatásos a Gram negatív szervezetek által okozott fertőzések leküzdésében.. Gátolja viszont a magnézium igényes gombák és protozoák növekedését, sőt gátolja a. növények gyökércsúcsának növekedését. Az antibiotikum hatását potencirozza a magnézium hiányt okozó Zn++ ion jelenléte. A giráz működáse nem csak a sejt osztódása, azaz a DNS állomány megkettőződése szempontjából életfontosságú, de a sejt életműködése mRNS képződése szempontjából is nélkülözhetetlen, nem helyettesíthető tevékenység. A kettős szálú DNS a helykihasználás céljából nyugvó állapotban szuperhélix formában, kettősen feltekeredve alkotja a maganyagot. Ebből következően a szuperhelix a DNS replikáció illetve az mRNS képződés előtt az információ kezdőpontjánál fellazítandó, majd átmenetilag felhasítandó, végül újra összekapcsolandó az információt hordozó kettős szálú nukleinsav. Ezt a bonyolult folyamatot katalizálja a négy alegységből szerveződött DNS-giráz enzimkomplex, amely az igénynek megfelelően, a szuperfeltekeredett DNS-re kapcsolódva indítja a folyamatot. Mivel az összekapcsoláshoz szükséges 90
energiát a magnézium jelenlétét igénylő ATP hidrolízis szolgáltatja, nem kétséges, hogy a Mg++ hiánya a folyamatot markánsan gátolja. 1962-ben észlelték a nalidixsav giráz-enzim működését gátló hatását. Az alapvegyület sokoldalúan fejlesztett változatai közül a ciprofloxacinnak nevezett széles spektrumú magnéziumot kötő kinolonkarbonsav származék bizonyult a leghatásosabbnak.
Az emlős sejt lassú növekedési sebessége miatt a ciprofloxacin a magsabb rendű szervezet számára nem toxikua A giráz enzimkomplex működásének gátlása mint látjuk a mikroszervezetek szaporodását akadályozza. Bonyolitja a helyzetet, ha a kórokzó letális toxint is termel. Jó példa erre a Bacillus anthracis okozta kóreset.
A lépfene kórokozója egy letális (LF) faktort és egy edema (EF) faktort választ ki, amelyek a protektiv antigén (PA) alkotta heptamer póruson át jutnak a gazdasejtbe.— Újszerű védekezés lehetősége nyílik meg a bakteriális toxinok ellen, mivel egy kémiailag pontosan hangolt (heptakis per-6-[3-aminopropilthio]-β-CD) ciklodextrin származék (0.2 nM koncentrációban) az Anthrax porusba illeszkedve a letális faktor sejtbe jutását gátolja. (Karginov et al. PNAS 2005 102.42 15075) A CD származék tehát, a giráz működését Mg++elvonással (Mg++ kötéssel) gátló ciprofloxacin hatását potencírozva, a gazdaszervezet túlélési lehetőségét javítja.
A protektív antoigén heptamerje alkotta porustg zárja a kémiailag módosított (heptakis per-6-[3-aminopropilthio]-β-CD) ciklodextrin származék, amely akadályozza a letális hatású toxin sejtbe jutását.
91
ANSA-LÁNCÚ ANTIBIOTIKUMOK CSOPORTJA A Prelog által ansamycinnek elnevezett antibiotikum csoport közös jellemzője az aromás, koplanáris helyzetű alapsíkot alkotó magot kancsófülszerűen áthidaló makrociklus.
A csoportba sorolt hatásos vegyületek legismertebb tagját a rifamycin csoport vegyületeit Sensi és munkatársai 1958-ban izolálták egy Streptomyces mediterranea törzs fermentlevéből. A taxonomusok szerint a törzs a Nocardia nemzetsséghez tartozik. Más szerzők sok rokon vegyületet írtak le, ilyenek például a streptovarycin, tolypomycin, geldenamycin, de gyógyászati alkalmazásra csak a rifamycin származékok kerültek. A Nocardia mediterranea tenyészlevében ugyanis nemcsak az eredetileg képződő vegyület, a rifamycin-B található, hanem ennek oxidált alakja a rifamycin-O illetve a glikol-származék hidrolízisével képződő rifamycin-S is. A rifamicin Bből oxigén felvétellel képződő Y módosulat teljesen inaktív. A csoport tagjai egymásba könnyen átalakulhatnak, illetve viszonylag egyszerű kémiai reakcióval átalakíthatók. A kromofort érintő kémiai átalakulások az egyes vegyületek spektrumában jól követhető változást okoznak. A rifamycin-B biológiai aktivitása csekély, de a belőle nyerhető rifamycin-S már parenterálisan alkalmazható antibiotikum. Ez utóbbiból enyhe redukcióval előállítható az orálisan alkalmazható rifamycin-SV. A vegyület stabilitását kémiai átalakítással, a C-3 hidrogén helyettesítésével fokozni lehet.. A rifamycin-SV 3-metil-piperazinil-iminometil származéka a gyógyszerként forgalmazott rifampicin.
A rifamycinek biológiai aktivitásának összehasonlítása MIC érték in vitro Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus fertőzés kivédése mérőtörzs használatakor egérben in vivo végzett méréssel mg.ml-1 mg/kg i.m. adva mg/kg per os adagolva 0,026 305 500 0,01 500 500 0,005 65 172 0,005 18 74 0,002 0,12 0,11
92
A rifampicin félszintézis első lépése a fermentációs úton előállított rifamycin-B salétromos savval végzett
oxidációja vizes metanolban. A második lépésben metanolos tetrahidrofuránban végzett sósavas hidrolízissel nyerhető a rifamycin-S származék. Ezt tetrahidrofuránban formalinnal és tercier-butilaminnal reagáltatják mangándioxid jelenlétében. A kapott t-butil-iminometil-rifamycin-S vegyületből tetrahidrofuránban végigvitt savanyú hidrolízissel formil-rifamycin-S nyerhető. A befejező lépésben, ugyancsak tetrahidro-furánban 1-amino4-metil-piperazinnal reagáltatva jutunk a 3-(4-metil-1-piperazinil)-iminometil-rifamycin-SV-hez, a rifamp(ic)inhez. A félszintézissel előállított rifamycin S-szerkezetű rifabutin előnyösen alkalmazható az utóbbi időben különösen a HIV-fertőzött személyek esetében gyakrabban előforduló Mycobacterium avium fertőzések leküzdésében. Annak ellenére, hogy a két rifamicin származék a Mycobacterium törzseknél keresztrezisztenciát okozhat, mégis nagyszámú (225) rifampin rezisztens (10 µg/ml) törzs 80 %-ának növekedését 1 µg/ml rifabutin gátolja. A vegyület lipofilitása miatt a szövetekben jelentős mértékben dúsul fel. A biológiai aktivitás az ansa láncban található C21 hidroxil csoport és környezetének érintetlenségéhez kötődik. A rifamycin-SV 20-hidroxi-21-keto származéka biológiailag teljesen inaktív. Ugyanakkor a 25 dezacetilszármazék, valamint a 27 demetil-származék biológiai aktivitása jól észlelhető.
93
A rifamycin váz szintézise tiotempláton folyik a zsírsavszintézishez hasonlóan, metilmalonil-CoA elemekből. A bioszintézis az aromás mag képződésével indul.
A 2,5-dihidroxi-3-amino-benzoesav egy metilmalonil-CoA-ból származó propionsav β-szénatomjához kapcsolódik. Ezt követi a malonil-CoA-ból származó ecetsav beépítése. A továbbiakban hat metilmalonil-CoA felhasználásával épül tovább a szénlánc..Ezután ismét egy malonil-CoA-ból származó ecetsav hosszabítja a molekulát A lánc utolsó építőeleme metilmalonil-CoA felhasználásával kerül a helyére. Az utolsó lépésben az aromás mag aminocsoportját acilezi a tiotemplátról leváló metabolit és ezzel záródik a gyűrű. A bioszintézis során hat esetben a dekarboxileződést követő kondenzáció után NADPH függő redukciós lépés következik, sőt két esetben a zsísav szintézishez hasonlóan a vízkilépés is bekövetkezik. Az antibiotikum speciális szer8kezetének a kialakítása még néhány oxidációs lépést igényel. A C28-on levő metilcsoport széndioxiddá oxidálódik. A C29, C30 közötti kötés oxidálását követi a FAD-enzim által katalizált gyűrűzárás - a naftalin váz kialakulása - majd az ezzel anellált dihidrofurán gyűrű képződése. Az alapváz elkészültét követi a C25 hidroxil acilezése acetil-CoA felhasználásával és a C27 hidroxil metilezése. A C4 hidroxilon glikolsavval kialakított fenoléter tartósan nem képes sabilizálni a molekulát. Könnyen oxidálódik rifamycin-O átmeneti terméken keresztül rifamycin-S naftokinonná. Az ansa-láncú antibiotikumok hatásos származékai specifikusan gátolják a bakteriális DNS függő RNSpolimeráz működését, mégpedig azáltal, hogy az RNS-polimeráz β-alegységéhez egy antibiotikum molekula kötődik. Ebből a kedvező tényből - egy enzimhez egy antibiotikum molekula kapcsolódik - adódik, hogy viszonylag nagyon csekély, mindössze 0.0025 µg.ml−1 antibiotikum már gátolja a Gram-pozitív baktériumok növekedését. Ugyanakkor az eukariota sejtben a DNS függő RNS szintézis gátlása csak 1000 illetve 10000-szeres koncentrációban észlelhető. A piperazin enyhe májkárosító mellékhatása miatt csak állandó orvosi ellenőrzés javasolt. Sőt a májfunkció zavarása miatt krónikus alkoholistáknál használata ellenjavallt. Nem tanácsos együtt alkalmazni kifejezetten májkárosító gyógyszerekkel, például izonikotinsavhidraziddal sem. A hatásos anyag fő kiürülési útja ugyan az epén keresztül vezet, de jelentős része távozik a vizelettel is. Étkezés előtt adva nyolc órán keresztül hatásos vérszintet eredményez. A központi idegrendszer kivételével a testszövetekbe jól eloszlik. Az RNS szintézist gátló hatása miatt kezdetben virusellenes hatását is feltételezték. A hatvanas években végzett igen részletes kisérletek bizonyították, hogy virusellenes hatása nincs, az onkogén virus ellen hatástalan, a reverztranszkriptáz működését nem befolyásolja, félszintézissel készült lipofil származékai pedig már az emlős sejteket is károsítják. Az említett kedvező adatokon kívül különleges tulajdonsága ennek az antibiotikum csoportnak, hogy eredménnyel használható a tuberkulózis kórokozója ellen. Csekély májkárosító hatása ellenére sikerrel alkalmazzák a Mycobacterium tuberculosis okozta fertőzés leküzdésére, de hatásos a Mycobacterium leprae ellen is. A ferementációs eljárás fontos elemeként említendő a széndioxid koncentráció meghatározó jelentősége. A bioszintézishez szükséges malonil, illetve metilmalonil-CoA képződés az átlagosnál nagyobb parciális széndioxid koncentrációt igényel. Ezért a rifamicin képződését a reaktoron átfúvott levegő mennyisége befolyásolja. A rendszerből távozó gázelegy nyomását, oxigén és szén-dioxid tartalmát - folyamatosan mérve optimális értéken kell tartani.
94
RIBOSZÓMÁLIS FEHÉRJESZINTÉZIST GÁTLÓ METABOLITOK CHLORAMPHENICOL Klóramfenikol, Chloromycetin, Chlorocid Az első szélesspektrumu antibiotikumot 1947-ben a Waksman vezette munkacsoport izolálta Streptomyces venezuelae tenyészlevéből. A fonalas mikroorganizmust egy Venezuelából származó talajmintából izolálták. Az első felfedezés után többször megtalálták ezt az anyagot különboző helyről származó Streptomyces törzsek metabolitjaként. Ez az antibiotikum a természetes anyagokban ritkán előforduló csoportokat (nitrocsoport és dikóracetil-csoport ) tartalmaz. Egyszerű kémiai szerkezetének [ (D-threo-N-)1,1'-dihidroxi-3-pnitrofenil-izopropil-diklóracetamid ] felderítése után hamarosan kidolgozták totálszintézisét. Ez a fermentációs eljárásnál lényegesen olcsóbb utat jelentett. Ez volt az az antibiotikum, melyik kezdettől fogva kémiai szintézissel előállítva került forgalomba. Kiindulási anyagként általában p-nitroacetofenont használnak, amit brómozás után hexametiléntetraminnal p-nitro-acetamidoacetofenonná alakítanak. A lánchosszabbítást formaldehiddel végzik. A ketocsoportot Al-izopropilát jelenlétében Meerwin-Pandorf szerint redukálják. Ezen az úton a DLthreo származékhoz jutunk, amit Dborkősavval lehet reszolválni. A nyert D nitrofenil-szerinolt diklórecetsavkloriddal acilezik.A kémiai előállítás lehetőséget adott az antibiotikum kémiai analógjainak a szintézisére. Ezek azonban egy kivételével gyengébb hatásúak, illetve hatástalanok. Az antibakteriális hatás megkétszereződött, ha diklórecetsavklorid helyett trifluorecetsav-kloriddal acilezték a p-nitrofenil-szerinolt.
A klóramfenikol bioszintézise az aromás bioszintézis-úthoz kapcsolódik. Az arilamin-szintetáz közreműködésével képződik a pamino-fenil-piroszőlősav, amiből egy transzamináz alakítja a p-amino-Lfenilalanint. Ez a vegyület alloszterikusan képes sza-bályozni az arilamin-szintetáz működését, de az enzim képződését is, represszálja. Ezen enzim képződését a szerkezeti hasonlóságból következően a klóramfenikol is represszálja. Az L-pamino-fenilalanin hidroxilezése közben az aminosav konfigurációja is megváltozik, D-threo-p-aminofenilszerin képződik. Ennek a vegyületnek a diklór-acetilezését követi a karboxil csoport redukciója, majd az aminocsoport oxidációja. A bioszintézist bemutató ábrán jól követhető, hogy p-aminofenil-szerinol természetes intermedierként nem fordul elő. Sőt a tenyészethez adva sem acileződik, viszont in vitro és in vivo gátolja a p-aminofenilalanin hidroxilezését. Fölös bromid jelenlétében fermentációs eljárással előállítható a dibrómacetil származék. Halogenid hiányos táptalajon viszont rövidláncú zsírsavakkal acilezett származék képződik.
95
A szintelen tűkristályt képző antibiotikum alkoholban és szerves oldószerekben jól, vízben rosszul (2,5 mg ml-1 ) oldódik. A hőstabil vegyület sterilezhető. Mivel a bélcsatornából jól felszívódik szájon át adva is hatásos vérszintet biztosít. Keserű ize miatt kapszulában, vagy palmitinsav észterét szirupban szuszpendálva adagolják. Ez utóbbi származék vízben nem oldódik. Felszívódása csak a bélcsatornában bekövetkező hidrolízis után várható. Parenterális adagoláshoz általában a klóramfenikol borostyánkősav-észterének nátrium sóját javasolják. Napi adagolása: 4 x 12,5 mg testsúly kg-ra számolva. Helyi felhasználásra kenőcs és hintőpor formájában is forgalomba hozzák. A huszadik század közepétől több mint 20 éven keresztül a Gramnegatív kórokozók leküzdésére az egyik legnépszerűbb hatóanyagként alkalmazták alacsony ára és széles spektuma miatt. Az utóbbi időben a vérképző szervekben okozott zavarok miatt (10 napnál hosszabb kezelés a vérképet megváltoztatja) alkalmazása visszaszorulóban van. Először az USA egészségügyi szervezete (FDA) tiltotta meg használatát. Alacsony piaci ára miatt azonban a szegényebb országok ma is jelentős mennyiségű klorocidot használnak. A felszívódott anyagot a gazdaszervezet észteráz aktivitása lassan inaktíválja. Rossz vizoldékonysága miatt a szervezetből a májban képződő glükuronid alakjában a vesén keresztül távozik. Májbetegek számára a klóramfenikol használata különösen veszélyes, mert az aktív vegyület felhalmozódik. Az aktuális vérszint meghatározására immunologiai módszert használnak. Vizes oldatban egy hidrogénhíddal stabilizált formája némileg hasonlít a tRNS aminoacilezett végéhez. A biokémiai vizsgálatok szerint a hatóanyag a riboszóma 50 S alegységén az akceptor helyhez kötődik. Riboszómánként 0,7-0,8 kloramfenikol kapcsolódását lehet mérni. Makrolidok, puromycin, linkomycin befolyásolják, az amino-glikozidok és tetraciklin nem zavarja a riboszómához való kötődését. Az aminoacilezett tRNS kapcsolódását a riboszómához nem gátolja, de a peptidil-transzferáz számára lehetetlenné teszi az aminoacil-terminál felismerését, így végső soron gátolja a peptidiltranszferáz reakciót. A tiotempláton folyó peptid szintézist nem befolyásolja. A klóramfenikolt a biokémikusok az induktív de novo enzimszintézis gátlószereként használják. Nagy koncentrációban a NADH oxidációját mind a négy izomer (treo és eritro valamint a D- és L-) közel azonos mértékben gátolja. Ez a hatás azonban fiziológiai körülmények között nem érvényesül. A riboszómán csak a D-threo származék kötődik. A klóranfenikollal szembeni rtezisztencia viszonylag kevés gondot okozott a gyógyászatban. Az irodalomban nem található rezisztens riboszómáról szóló közlés. A permeabilitási viszonyok megváltozása viszont az érzékenység csökkenésével járhat. A klóramfenikol rezisztenciát a mikroorganizmus specifikus aciláz aktivitása okozza. A klóramfenikol-acetil-transzferáz az antibiotikum mindkét hidroxilcsoportját acetilezve inaktíválja azt. Ez az enzim a klóramfenikolt termelő Streptomyces törzsekből kerülhetett át plazmid hordozta információként más mikroorganizmusokba.
96
AMINOGLIKOZID ANTIBIOTIKUMOK A Waksmann által 1939-ben szervezett kutatócsoport első sikeréről, a streptomycin felfedezéséről 1944-ben értesülhetett a tudományos közvélemény. Waksmann eredményein fellelkesülve világszerte tökéletesítették az új antibiotikumok utáni kutató munka technikáját. A kezdeti eredményeken felbuzdulva azidőtájt sugárgombának nevezett, elsősorban Streptomyces törzsek biológiai aktivitását vizsgálták. A kiterjedt kutatómunka eredményeként a különböző antibiotikum csoportok felfedezése közben nagy számban találtak a fentihez hasonló - aminocukrokat tartalmazó - antibakteriális hatású termékeket. Megbizható szerkezetük csak a hatvanas évekre tisztázódott. Kémiai stabilitásuk, széles spektrumú alkalmazhatóságuk, vizoldékonyságuk és biológiai hatásuk és elviselhető toxicitásuk indokolta kemoterápiai hasznosításukat. A kémiailag különböző származékok egyetlen fejezetbe való ismertetését indokolja, hogy az aminocukor építőelemeik glikozidos kötéssel kapcsolódnak egy diamino-hexithez (sztreptaminhoz). Kémia szerkezetük alapján két fő csoportban oligoszacharidokként és pszeudo-oligoszacharidokként tárgyalhatók. Az oligoszacharidok csoportjában megkülönböztetjük a 4-O-monoglikozidok csoportját - ide tartoznak a sztreptomicinek és a bluenzomicinek - a 4,5-O-biszglikozidok csoportjától, ahová a neomycin, paramomycin, lividomycin és hibrimycin komplexek vegyületei sorolhatók. A pszeudo oligoszacharidok közé tartoznak a monoglikozidok, vagy másnéven pszeudo-diszacharidok, amelyeknek legismertebb képviselője a kasugamycinés a pszeudo triszacharidok, amelyeknek legfontosabb képviselői a 4,6-O-biszglikozidok, amelyek között találjuk a kanamycint, tobramycint, gentamicint, sisomicint. Az antibiotikumok angol nevében szereplő y illetve i betű a termelő mikróba rendszertani besorolására utal (például Streptomyces, illetve Micromonospora). Valamennyien vízben jól oldódó, bázikus, kémiailag stabil vegyületek. Gram-pozitív és Gram-negatív törzsek ellen hatásos széles baktérium spektrumú gyógyszerek. A penicillinre és tetraciklinre rezisztens törzsek leküzdésében közülük nem egy életmentő jelentőségű. A bélből nem szívódnak fel, ezért csak parenterálisan adhatók. Idegrendszeri zavarokat okozó krónikus toxicitásuk, ototoxicitásuk, vesekárosító hatásuk miatt tartós kezelésre nem használhatók. A halláskárosodás magyarázata lehet, hogy az endolim-phában feldúsulva nehezen ürülnek ki. Tartós hatásuk a cochlearis és vestibularis receptor sejtek elfajzását, degenerálódását okozza. Az aminoglikozid antibiotikumok előállításához jól levegőztethető saválló fermentorokat használnak. A táptalaj nitrogénforrásaként általában hőkezelt (proteázgátlótól mentesített) szójalisztet, szénforrásként glükózt illetve keményítőt, a fermentációs pH tartása céljából kalciumkarbonátot használnak adalékként. A jóltermelő törzsek szárazanyagtartalmuk többszörösét képesek szekunder anyagcseretermékként a tápközegbe juttatni 5-7 nap fermentációs idő alatt. Az antibiotikumot termelő törzsek sűlyesztett tenyésztési körülmények között spórát nem termelnek, de a letöredező fonaldarabokból új kolóniákat fejlesztenek. Ebből következően az egész fermentációs folyamat alatt egyidejűleg különböző élettani állapotban levő öreg és fiatal koloniák vannak jelen a tenyészetben. Ha a tenyészet egy részének szakaszos eltávolításával annak friss táptalajjal való kiegészítéséről is gondoskodunk, akkor tartósan akár két hétre is megnyújthatjuk az antibiotikumot termelő szakaszt. Az aminoglikozid antibiotikumokat termelő törzsek tenyészlevében a főtermék mellett - minor komponensként a bioszintézis köztes termékei illetve ezek kémiai módosulatai mindig megtalálhatók. A képződő termékek arányát a tenyésztési körülmények befolyásolják. A mutagén kezelés és gondosan ellenőrzött szelekcióval egyegy minor komponens főtermékké válhat. Az aminoglikozid-antibiotikumot termelő törzsek fejlesztése nem könnyű feladat, mert a cél minden esetben a gyógyszerként eladható legértékesebb komponens termelésének a fokozását jelenti, miközben a tenyészlében fellelhető egyéb rokon vegyületek képződésének a visszaszorítására kell törekedni. Ebből következik, hogy általában nem elegendő a fermentlé összaktivitásának a mérése, hanem az elegy összetevőinek a vizsgálata, sőt mennyiségi értékelése szükséges. Az aminoglikozidok antibakteriális hatása elsősorban a riboszómális fehérjeszintézis zavarásában jelentkezik. A 30S alegységhez kötődve gátolják az iniciáció folyamatát. Zavarják a kód helyes leolvasását, ami a téves aminosav beépítés miatt abnormális fehérjék képződéséhez vezet. Nem lehetetlen, hogy ezen felderített hatásmódon kívül még más módon is beavatkoznak a baktérium anyagcseréjébe. Ez abból következtethető, hogy a fehérjeszintézis gátlása elvileg csak bakteriosztatikus hatást eredményezne, márpedig a streptomycin baktericid hatása kétségtelen. SZTREPTOMICIN Waksman által 1944-ben felfedezett sztreptomicin volt az első neves képviselője a humán terápiában alkalmazott széles spektrumú, a tuberkulózis elleni küzdelemben is hatásos - kémiailag stabil - antibiotikum csoportnak. Az antibiotikumot egy Streptomyces griseus törzs tenyészlevéből izolálták. Az első években alkalmazott felületi tenyésztési technikáról viszonylag hamar áttértek a penicillin előállítás céljára kidolgozott sűlyesztett aerob technológia alkalmazására. A szójalisztet és glükózt tartalmazó táptalajon növekedő, klasszikusnak tekintett genetikai módszerek alkalmazásával nemesített törzs micélium tömege ml-ként 10-20 mg sztreptomicin termelésére képes. A vízben jól oldódó antibiotikum kinyerésére ioncserélő módszert alkalmaznak.
97
A tisztított terméket szulfát-só formában kristályosítják és parenterálisan adható formában, steril porampullában hozzák forgalomba. Hatásos adagja napi 1 g injekciós formában. A kristályos termékként korlátlan iderig tárolható készítményt használat előtt oldják fel steril vízben. A feloldott sztreptomicin néhány napon keresztül hűtőszekrényben károsodás nélkül tartható. Szerkezetének felderítése nem volt könnyű feladat. Sztereokémiailag is megbízható szerkezetét csak 1963-65 években ismertette Dyer. Totálszintéziséről pedig csak 1974-ben Umezawa és munkatársai közöltek adatokat. Az antibiotikum N-metil-L-glükózamint, Lsztreptózt és sztreptidint tartalmaz. A glükózamint és sztreptózt tartalmazó rész neve sztreptobiózamin, amely több aminoglikozid antibiotikum alkotórésze. A fermentlében előforduló mannozido-sztreptomicinben a glükózamin 4” szénatomjához Dmannopiranozil csoport kapcsolódik. Törzsnemesítéskor a mannozido-sztreptomicin képződés visszaszorítására törekednek. A sztreptomicin bioszintézise glükóz-6-foszfátból indul. A glükózamin szintézise jól ismert módon fruktóz-6-foszfáton keresztül glutamin terhére folyik. Az amino csoport metilezése megelőzi a foszfomutáz reakciót, amely katalizálja az N-metil-L-glükózamin-1-foszfát képződését. Ez a foszfátészter reagál a streptózzal, kialakul a streptobiózaminban levő glikozidos kötés. A streptóz szintézis egyes lépései még nem tisztázottak. Legérdekesebb a streptidin képződés reakciósorrendje. A bioszintézis a glükuronsavhoz vezető szintézisútból ágazik el, mégpedig az inozitolból epimerizációval scilloinozitol képződik, amelyből a NADfüggő dehidrogenáz állítja elő a scilloinozózt. Ezt egy glutaminnal működő transzamináz inózaminná, majd egy foszforiláz inózamin-foszfáttá alakítja. A következő lépésben egy amidináz az inózamin-foszfátot amidininózamin-foszfáttá alakítja, amiből egy foszfatáz hatására képződik az amidin-inózamin, amely már alkalmas szubsztrátum a NAD-függő dehidrogenáz számára. Ezt követően megismétlődnek az előző reakció lépések: az amidin-3-keto-inózamin az előbb szereplő transzamináz hatására glutamin terhére amidino-sztreptaminná alakul, amely foszforiláz segítségével amidino-sztreptamin foszfáttá, az aminidáz szubsztrátumaként pedig diamidinsztreptamin-foszfáttá alakul, amely alkalmas a sztreptobiózaminnal glikozidos kötés
kialakítására, és ezzel a sztreptomicin termelésére. Jól követhető a reakciósoron, hogy a primer anyagcsere szempontjából hasznavehetetlen köztestermék a scilloinozitol a mikroszervezet enzimkészletének közreműködésével, két egymást követő folyamatbanban végül is egy addig ismeretlen olyan végtermék (streptomycin) képződéséhez vezet, amely a termelő mikróba számára mai ismereteink szerint elvben némi előnyt jelent a létért folyó küzdelemben. A bioszintézis útjának felderítését követően Demain streptomycint nem termelő mutánsokat állított elő. Ezek közül kiválasztotta a streptidin szintézisben sérült, úgynevezett idiotróf mutánsokat. Ezek a törzsek csak a
98
tenyészethez adott streptidin jelenlétében termeltek streptomycint. A következő kisérletsorozatban prekurzorként különböző aminociklitol származékokat adagoltak. Ezek közül csak a 2-dezoxi-ciklitol volt hatásos. Egy addig ismeretlen új antibiotikum, a streptomutin-A képződött. Az új antibiotikum biológiai hatása a sztreptomicinéval egyezett. A guanidin csoportok között levő hidroxil léte vagy hiánya nem okozott zavart sem a bioszintézisben, sem a biológiai hatásban. Úgy tűnik, hogy a fölösleges, adott esetben káros anyagcseretermék sejtből való eltávolítása csak oligiszacharid formában lehetséges. A monoszacharidok, különösen a foszforilezett köztestermékek számára a membrán gyakorlatilag átjárhatatalan. A sztreptomicin hatásmódja Az elmúlt évtizedek bőséges idevágó irodalma sem ad minden részletre vonatkozó ismeretet. A biokémikusok régóta használják a streptomycin szulfát sóját a baktériumokból kinyert enzimek tisztításánál a nukleoproteinek eltávolítására. Azt is korán megállapították, hogy a baktériumfehérje szintézisét riboszómához kötődve gátolja. Sztreptomicin jelenlétében megváltozik a riboszóma frakció hidrogén cserélődésí sebessége, ami önmagában konformáció változásra utal. Egyidejűleg bizonyos konformációs változások bekövetkezését viszont késlelteti a sztreptomicin. Megakadályozza például az alacsony Mg++ koncentráció esetén bekövetező disszociációt, inaktíválódást. Sőt megakadályozza az inaktíválódott riboszóma reaktíválását. Ez a regenerálódási folyamat enyhe melegítés hatására megfelelő pH mellett streptomycin távollétében reprodukálhatóan bekövetkezik. A hatásmód vizsgálat egyik gyümölcsöző módja a vizsgálandó érzékeny törzsből antibiotikum rezisztens variáns előállítása és a két eltérő biokémiai tulajdonsággal rendelkező törzs részletes összehasonlító vizsgálata. A rezisztens mutáns előállítása közben érdekes megfigyelésre jutottak a mikrobiológusok. A streptomycin érzékeny Escherichia coli törzsből nemcsak rezisztens variánst, hanem olyan stabil mutánst is izoláltak, amelyik csak streptomycin jelenlétében képes szaporodni, streptomycin dependessé vált. A modern biokémiai módszerek a hatásmód molekuláris szintű vizsgálatára is lehetőséget adnak. Ezekhez a vizsgálatokhoz fel lehetett használni a dihidrostreptomycint, amelyik nem csak a tenyészetben képződik meléktermékkként, de kémiai redukcióval is előállítató. A molekulában levő streptóz aldehid csoportját triciummal redukálva jelzett dihidrostreptomycinhez jutottak, amely biológiai hatás tekintetében nem tért el a streptomycintől. Ezt a jelzett vegyületet használva megállapítható volt, hogy az antibiotikum direkt kölcsönhatásba lép a riboszómával, a riboszóma 30S alegységében az S-12 fehérjéhez kötődik. Az 50S alegység nem köti, de a nemdisszociált 70S riboszóma megint erősen köti a sztreptomicint. A sztreptomicin-rezisztens törzsből nyert riboszóma nem köti és érdekes módon a szterptomicindependens törzsből izolált riboszóma is igen gyengén köti a streptomycint. Ez azt valószínűsíti, hogy a függőség nem kapcsolható ribosuómán bekövetkező változáshoz. Tovább vizsgálva a rezisztencia kialakulását elkülönítették a 30S riboszóma alegység sztreptomicint kötő fehérje frakcióját, amely a ribonukleinsav frakcióval való újraegyesítés után változatlan aktivitással kötötte a jelzett dihidro-sztreptomicint. Ha ez a fehérjefrakció rezisztens baktérium riboszómájából származott, akkor akár érzékeny akár rezisztens törzs riboszómájából származó ribonukleinsav frakcióval egyesítették, sztreptomicin kötést nem lehetett észlelni. Az érzékeny baktériumból származó fehérje frakció viszont érzékeny illetve rezisztens törzsből származó ribonukleinsav frakcióval egyesítve kötőképességét változatlanul megtartotta. Ez a genetikailag meghatározott eltérés a fehérje molekula kis részét érinti csak, mert a fehérjefrakció fizikai és kémiai tulajdonságában változás nem észlelhető. A rezisztens törzs riboszóma frakciójának fehérjeszintézisben mért aktivitása az érzékeny törzsből származó készítmény aktivitásával megegyezett. A streptomycin kötődése a riboszómához a fehérjeszintézist több szinten (több fázisban) zavarja. Az egyes fázisok gátlásához más-más streptomycin koncentráció szükséges, sőt az aktuális koncentráció az egyes baktérium törzsek esetében is eltérhet. Igen kis mennyiségű streptomycin hatására a fehérjeszintézis nem áll le, csak lassúl. Kodleolvasási hibák jelentkeznek nem csak szintetikus mRNS, de természetes eredetű mRNS alkalmazása esetében is. A leolvasási hibák anomális fehérjék képződését okozzák. Növelve az antibiotikum koncentrációt a 70S riboszóma mennyiségének felszaporodása tapasztalható. Valójában az antibiotikum akadályozza a 70S riboszóma szétesését alegységeire. Gátolja ugyanis a termináló kod által kiválasztott faktor (relais factor) riboszómára kötődését, azaz megakadályozza a mRNS elválását a riboszómától. Tovább emelve a reakció elegyhez adott sztreptomicin mennyiségét az iniciáció kifejezett gátlása tapasztalható. A riboszómális fehérjeszintézist zavaró antibiotikumok hatásmódjának tárgyalásával kapcsolatban célszerű röviden összefoglalni az eddig végzett kutató munka eredményeiből felépített elképzeléseket. Indokolja ezt az is, hogy a fehérjeszintézist gátló antibiotikumok felfedezése és hartásmódjuk vizsgálata segítette a ribosszómális fehérjeszintézis biokémiai mechanizmusának feltárását. Legtöbb ismeretanyag az Escherichia coli-val végzett kiséleti munkákból származik, ezért célszerűen ezt a területet választjuk ismertetésünk modeljeként.
99
A mRNS-ba átírt információ a riboszómán folyó mechanokémiai reakciók eredményeként jelenik meg fehérje formájában. A 70S riboszóma egy nagyobb 50S (1,8x106 dalton tömegű, 5300 nm3 kiterjedésű) és egy kisebb 30S (1x106 dalton tömegű, 2600 nm3 kiterjedésű) méretű alegységből tevődik össze. Az 50S alegység egy nagyobb 1904 nukleotidot tartalmazó és egy kisebb 120 nukleotidot tartalmazó ribonukleinsav molekulából, valamint 34 fehérje molekulából áll. A 30S alegység egy 1542 nuleotidból álló (16S rRNS) ribonukleinsavat és 21 fehérje molekulát tartalmaz. A két alegység (30S + 50S) érett mRNS jelenlétében csak a fehérje szintézis idejére kapcsolódik funkcionális egységbe, az úgynevezett 70S riboszómát alkotva. Az ép riboszóma kötő szakasszal rendelkező mRNS kapcsolódását a 30S alegységhez egy 20.000 móltömegű IF-3 (iniciációs faktor) fehérje segíti. Ezt követi a 8000 móltömegű IF-1 fehérje kapcsoódása és a 115000 móltömegű formil-metionil-tRNS-GTP-IF-2 komplex bekötődése a mRNS-en levő antikodon irányítása szerint. Az így kialakuló komplex az 50S alegységhez közeledve alakítja ki a működőképes 70S riboszómát, miközben az iniciációs faktorok szabaddá válva egy újabb iniciációs komplex kialakításában vehetnek részt. A formilmetionil-tRNS ekkor a riboszóma úgynevezett ferhérje kötő helyén található. A streptomycin ennek az aktív riboszóma komplexnek a képződését akadályozza. A következő lépés az elongációs szakasz, a peptid lánc hosszabbítása. Elsőként a riboszóma aminosav kötőhelyéhez kapcsolódik a mRNS következő antikodonja által igényelt aminosavval acilezett tRNS. A kapcsolódáshoz szükséges energiát az elongációs faktornak nevezett EF-Tu-GTP fehérje komplex szolgáltatja. Ezt a folyamatot a riboszómához kötődő tetraciklinek gátolják! A tRNS 3’ végén levő ribóz 3’-OH-hoz észterkötésben levő aminosav aminocsopor6tja nukleofilen a peptid kötőhelyen levő aminosavészter karbonil csoportját támadja. A visszamaradó, most már üres tRNS egyidejűleg elhagyja a peptidkötő helyet. A peptid kötés kialakítását az 50S alegység egyik fehérjéje, a transzferáz végzi. A kémiai reakciót egy mechanikus (mechanokémiai) lépés követi. A transzlokáz enzim a másik elongációs faktor, az EF-G-GTP komplexben levő energia felhasználásával a peptid láncot a mRNS-val együtt átemeli a riboszóma peptid kötő helyére. Ezzel lehetővé válik egy újabb, mRNS által kodolt aminoacil-tRNS kapcsolódása. A peptid lánc hosszabítását jelentő ciklusok program szerint ismétlődnek. Amikor a mRNS termináló kodonja kerül a riboszóma aminosav kötő helyéhez, akkor a kodnak megfelelő valamelyik RF (release factor) 100
fehérje kapcsolódik a riboszómához. Az aminoglikozid antibiotikumok éppen ennek a faktornak a kapcsolódását akadályozzák. Ha a reakcióelegy nem tartalmaz aminoglikozid antibiotikumot akkor az RF fehérje hatására a peptidil transzferáz hidrolizálja az utolsó tRNS és a peptid lánc közötti észterkötést. Szabaddá válik az új fehérje, ezzel egyidejűleg leválik az üres tRNS, majd szétesik a mRNS-ből, valamint a 30S és 50S riboszómából álló komplex. Ezek az alkatrészek ezután egy újabb iniciációs komplex képzésében vehetnek részt. Escherichia coli-ban egy 4-500 aminosavat tartalmazó peptidlánc 15-20 másodperc alatt készül el. Egy mRNS egyidőben 4-5 riboszómához kapcsolódhat egymástól 97 nukleotídnyi távolságra. A mRNS életidejét működésben létének köszönheti. Általában átlagban 50 ciklust ér meg, ha folyamatosan szolgálatban van, azaz működő riboszómákkal van kapcsolatban. A riboszómához kapcsolt mRNS-t a ribonukleáz nem képes bontani. A sztreptomicin inaktíválása Az antibiotikum rezisztencia kialakulása, a streptomycin tűrés több biológiai okra vezethető vissza. Streptomycin rezisztencia oka lehet riboszómális, például a streptomycint kötő fehérje szerkezetében bekövetkező változás, a kémia szerkezet kismértékű, de a kötődést akadályozó módosulása. Akadályozhatja az antibiotikum felvételét a sejthártya áteresztőképességének módosulása. Az aminoglikozid antibiotikumok esetében a rezisztencia oka sok esetben az enzimes inaktíválás. Ezek az antibiotikumok sok, kémiailag, illetve biológiai reakcióval könnyen támadható hidroxil illetve amino csoportot tartalmaznak. Az enzim katalizálta átalakítások a riboszómához való kötődést akadályozva végeredményben rezisztenciát okoznak. Ezek az inaktíváló enzimek sok esetben extrakromoszómális eredetűek, plazmidhoz kötött formában könnyen terjednek a mikrovilágban. A sztreptomicin glükózamin alkotórészének C-3 hidroxil csoportját a sztreptomicin-adenil-transzferáz ATP és Mg++ jelenlétében adenilezi és ezzel inaktíválja az antibiotikumot. Ugyanezt a hidroxil csoportot a sztreptomicin-foszfo-transzferáz képes foszforilezni. Az így képződött sztreptomicin-foszfát ugyancsak inaktív. A Pseudomonas aeruginosa TI-13 jelű törzsének enzimrendszere a sztreptomicin-3’6-biszfoszfát képződését segítve inaktiválja az antibiotikumot. Streptomyces griseus-ból izoláltak és tisztítottak egy enzimet, amelyik a sztreptomicin-6-foszfát képződését katalizálva okoz rezisztenciát. A sztreptomicint termelő mikroorganizmusban az antibiotikum foszforilezett, tehát biológiailag inaktív formában képződik és csak a kiválasztás folyamata közben távolítja el az inaktíváló csoportot egy alkalikus foszfatáz. Az antibiotikumnak a környezetbe történő kiválasztása segíti az antibiotikumot termelő mikroszervezet túlélését, hiszen elvben saját magát is mérgezhetné a képződő antibiotikum. A törzsfejlődés buktatói között csak az az egyed maradhat túlélő, amelyik az általa termelt anyag káros hatását ki tudja védeni, akár úgy, hogy a sejtfalon való áthaladást csak egy irányban, a külvilág felé biztosítja, vagy a hatáshely módosítása jelent rezisztenciát a termelő egyed számára. Az antibiotikum termelés fokozását célzó genetikai munkát végzők, már kezdettől fogva elsőrendű feladatuknak tekintették a termelt anyagra rezisztens mutánsok izolálását. Nyivánvaló, hogy a termelt metabolitra valő érzékenység az elérhető termelési szintet limitálja. Nem véletlen, hogy éppen Streptomyces griseus törzs fejlesztésekor jobban termelő mutánsok nyerése céljából először a sztreptomicin rezisztenciát igyekeztek fokozni. Ezek az enzimek nemcsak a streptomycint, de keresztrezisztenciát okozva minden streptobiózamint tartalmazó antibiotikumot képesek inaktíválni. Az enzimek működését a glükózamin alkotórészen történő szubsztitúció akadályozhatja. A mannozido-sztreptomicin pédául nem inaktiválható a 3”-hidroxil csoportot támadó reakcióval, mert a 4”-helyhez kötődő mannóz térbelileg elnyomja a 3”-hidroxil csoport reakcióképességét.
101
NEOMYCIN A széles spektrumú neomycint ugyancsak a Waksmann által vezetett kutatócsoport izolálta 1949-ben Streptomyces fradiae tenyészlevéből Azóta különböző törzsek tenyészlevében is megtalálták ezt az anyagot. A Streptomyces fradiae fermentlevéből valójában az úgynevezett neomicin komplex, a neamin, a neomycin-B és a neomycin-C vegyületek keveréke nyerhető jó hozammal. Abszolut konfiguráció szempontjából is megbízható szerkezeti képletét Hickens és Rinehart közölte 1963-ban. A D-ribóz 1-es szénatomjához kapcsolódik a Cneózamint és 2-dezoxi-sztreptamint tartalmazó neamin. A 3-as szénatomhoz egy másik C-neózamin kapcsolódik. Az antibiotikum ribózból és C-neózaminból felépülő részét neobiózamin-C néven ismeri az irodalom. A neomycin metanolízissel könnyen bontható neaminná és neobiózaminná. A neomycin-B antibiotikumban a D-ribóz 3-as szénatomjához kapcsolódó cukor komponens 2,6-diamino2,6-didezoxi-idóz (neózamin-B), amelyben a 6-amino-metil csoport orientációja a D-glükózhoz viszonyítva ellentétes szerkezetre utal. A törzsfejlesztéssel foglalkozó mikrobiológusoknak fáradságos munkával sikerült olyan mutánst előállítani és kiválasztani amelyik az értékesebb neomycin-C-t termeli főtermékként. Az allergiás tüneteket nem okozó neomycin-C széles spektrumú aminoglikozid antibiotikum gyakorlatilag nem szívódik fel. A bélflóra tartalmát fertőtlenítő tabletták formájában alkalmazva idegkárosító toxikus tünetek nem jelentkeznek. Kémiailag stabil, autoklávban aktivitás veszteség nélkül sterilezhető A termelési szint ma 15-20 mg bázis ml-1. Gyógyszerként a fermentlé szűrletéből ioncserélő oszlopon végzett tisztítással könnyen előállítható C komponens szulfát sóját hozzák forgalomba. Felfedezése óta a gyomor-bél traktus fertőzéseinek leküzdésére használják. Kiváló eredménnyel alkalmazzák akut hashártya gyulladás esetében és műtétek előtt a bél baktériumflórájának csökkentésére. Ugyancsak elterjedt külsőleges alkalmazása szemcseppben, kenőcsben, hintőporban, szaruhártya és bőrfertőzések leküzdésében. A főleg plazmid hordozta inaktíváló enzimek számára a neomycin kiváló terepet szolgáltat, sok megtámadható hidroxil és amino csoportja van. Így a 2-dezoxi-streptamin 3-as aminocsoportjának acetilezése, vagy a neózamin C-6’ helyzetű amino-csoportjának acetilezése, vagy a C-3’ helyzetű hidroxil foszforilezése inaktíválja a molekulát. Ismeretes egy adenilező enzim, amelyik a 4’-hidroxil csoport átalakításával inaktíválja a molekulát. De inaktíválja a molekulát a ribóz 5’-hidroxiljának foszforilezése vagy a neózamin 2’-aminocsoport acetilezése.
A neomycin hatását ugyancsak a 30S riboszóma alegységen fejti ki, de a kötődés helye különbözik a sztreptomicinétől. Amig a sztreptomicinből riboszómánként specifikusan csak egy molekula kötődik, addig neomycinből több molekula is kötődhet. A két antibiotikum egymás kötődését nem befolyásolja. Amig a sztreptomicin az iniciáció gátlásával a riboszóma komplex kialakulását akadályozza, addig a neomycin csoportba tartozó aminoglikozidok poliszóma felszaporodását eredményezik. Megjegyzendő, hogy a termináló hatású RF fehérjék kötődését akadályozó neomycin jelenlétében, a 70S riboszóma szétesése nem következik be.
102
KANAMYCIN A pszeudo-oligoszacharid aminoglikozid antibiotikumok első tagját a kanamycint Umezawa kutató csoportja izolálta 1957-ben egy Streptomyces kanamyceticus tenyészlevéből. Az antibiotikum két szénhidrátmolekulát tartalmaz a központi dezoxi-streptaminhoz kötve (ezért pszeudooligoszacha-rid). A fermentlében több biológiailag aktív oligoszacharid képződik. Különbséget a streptamin C-4 atomjához glikozidos kötéssel kapcsolódó hexóz szerkezetében mutatkozik. Tadsuoka 1964-ben. Gyógyszerként a legkevésbé toxikusa 6-amino-6-dezoxi-Dglükózt tartalmazó Kanamycin A került forgalomba. Umezawa az N-metánszulfonát sóját javasolja gyógyszerként, amely kevésbé toxikus mint a szulfát sója. Nem csak az emésztőcsatorna fertőtlenítésére használják, de injekciós formában szisztémás fertőzések leküzdésére is alkalmazzák. Toxicitása miatt napi 1 g-os adagja nem léphető túl. Izomba injektálás után egy órával 28 mg/ml szérum szint mérhető, ugyanekkor a tüdőszövetben 7 mg/g antibiotikum szint alakul ki. Streptomycinnel keresztrezisztenciát ad. A TBC kórokozói hamarabb rezisztenssé válnak mint azt streptomycin kezelés esetében tapasztalták. Az aminoglikozid antibiotikumok inaktíválódását okozó enzimek a kanamycin inaktíválására is alkalmasak. Hat enzim által támadható ponton eddig 7 enzim hatását igazolták. A 2-dezoxi-sztreptamin C3 aminocsoportját két különböző aciláz támadhatja. A kanózamin C2” hidroxilját egy nukleotidil transzferáz adenilezi. A 6'-amino-6'-dezoxiD-glükóz részén pedig az amino csoport acilezését végzi egy-egy acetil-transzferáz, mig a C3’-hidroxilt két különböző foszfor-transzferáz képes foszforilezni. Ismeretes egy nukleotidil transzferáz, amelyik a 4’-adenil származékot állítja elő. A tenyészlé kanamycin-B komponense amely 2',6'-diamino-2',6'-didezoxi-D-glükózt tartalmaz kémiai eljárással alakítható tobramicinné, amely az eddig ismert aminoglikozid antibiotikumok egyik leghatásosabb képviselője. Ezt az antibiotikumot csak azután találták meg a Streptomyces tenebrarius fermentlevében a nebramycin komplex tagjaként, miután kémiai módszerekkel már előállították a kanamycin-B 3’-dezoxi származékaként. A gyógyászatban 1976 óta használják sok esetben életmentő antibiotikumként. Az eredeti nebramycin komplexet termelő törzsből fáradságos genetikai munkával olyan mutánst sikerült izolálni, amelyik főtermékként termeli a tobramycint illetve a karbamoilezett származékát. Terápiai értékét fokozza az, hogy a 2dezoxi-streptamin C4 hidroxiljához kötődő nebrózamin nem tartalmazza a könnyen foszforilezhető a C3’hidroxil csoportot. Az amino csoport acilezésével, illetve a C4’-hidroxil csoport adenilezésével természetesen ez az antibiotikum is inaktíválható. Ezek az enzimek azonban ritkábban fordulnak elő a patogén mikroorganizmusokban GENTAMICIN Weinstein 1958-ban izolálta először egy Micromonospora purpurea törzs tenyészlevéből, de csak 1963-ban ismertette eredményeit. Azóta más törzsek szekunder metabolitjaként is megtalálták ezt a széles spektrumú igen hatásos antibiotikum keveréket. Kémiai szerkezetét Cooper 1969-ben, illetve 1971-ben ismertette végleges formában. Az antibiotikum nevét a nemzetközi szakirodalom i-vel írja érzékeltetni akarva, hogy a termelő mikroszervezet nem Streptomyces törzs. A gentamicint termelő törzsek tenyészlevében a főterméknek tekintett 2-3 közelrokon szerkezetű antibiotikum mellett úgynevezett minor komponensként nagyszámú, 15-20, vagy ennél is több biológiai hatásában is különböző aminoglikozid antibiotikum képződik. Számuk az analitikai módszerek felbontóképességének fejlődésével és az egyre tökéletesedő preparatív munka eredményeként még tovább növekedhet. A főterméknek tekintett és terápiás használatra került gentamicin komplex három rokon vegyület a gentamicin-C1, -C1a, -C2 meghatározott arányú keveréke, amelyek a purpurózamin C-6 szubsztituáltságában, azaz metilezettségükben és ezzel összefüggésben toxicitási adataikban különböznek. A metioninból származó metil-csoport beépüléséhez szűkséges cobal-amin (B12 vitamin) koncentráció, a tápközegbe juttatott kobalt ion
103
mennyisége kedvezően befolyásolja. A 2-dezoxi-sztreptamin C4 hidroxiljához kapcsolódik glikozid kötéssel a pupurózamin (2',6'-diamino-2',3',4',6'-tetradez-oxi-hexóz), a C6 hidroxilhoz pedig a garózamin.
A gemtamicin komplex különleges jelentőséget nyert a Pseudomonas fajok okozta másodlagos fertőzések leküzdésében. Injekciós formában a gentamicin szulfátot életmentő antibiotikumként alkalmazzák különböző szisztémás megbetegedések leküzdésére. Különösen hatásos az urogenitális rendszer fertőzési gócainak felszámolására. Sikerrel használják a makacs légúti fertőzések leküzdésére, mert a tüdő szövetből igen lassan ürül. Szokásos adagja 3mg/kg naponta izomba adva. Különböző kórházi, úgynevezett jatrogén fertőzések elleni küzdelemben is sikerrel alkalmazható, mivel a legtöbb rezisztens kórokozó ellen hatásos vegyület. Szerkezeti képlete mutatja, hogy nincs olyan szubsztituense, amelyet a mikroorganizmusokban leginkább előforduló nagy aktivitású foszfotranszferáz képes lenne megtámadni. Gentamicinre rezisztens baktériumokban természetesen sikerült plazmidhoz kötött inaktíváló enzimeket kimutatni, mert az élő világban semmi sem lehetetlen (Nil mortalibus ardui est). A dezoxi streptamin C3 aminocsoportja acetilezhető, a purpurózamin C2’-amino éa a C6’ amino csoport acetilezése ugyancsak inaktíválja a molekulát. A garózamin C2” hidroxilját pedig az adenil transzferáz adenilezi. Ezek a ritkábban előfordul enzimek csekélyebb aktivitásuk miatt késve tudják inaktíválni a terápiás célból adott hatóanyagot. Részletesen vizsgálták az antibiotikum komplex képződéséért felelős aminociklitol minőségének a hatását a képződött antibiotikumra. Rosi és munkatársai gentamicint termelő törzsből a nagy elődök gondolatmenetét követve ugynevezett idiotróf mutánsokat állítottak elő. Ezek a mutánsok csak kívülről adagolt 2-dezoxi-streptamin jelenlétében termeltek gentamicint. A mutáns mikroszervezet tenyészetéhez adott különféle szerkezetű ciklitolok beépültek. Ez azt jelenti, hogy a Micromonospora bioszintetizáló rendszere nem annyira specifikus mint azt a streptomycint termelő Streptomyces griseus esetében tapasztalták. Sztreptamin adagolására pédául új hatásos antibiotikumként 2-hidroxi-gentamicin-C1 antibiotikum képződött. SISOMICIN Ugyancsak Micromonospora fajok termelik az 1964ben japán szerzők által leírt antibiotikumot. Szerkezete, kémiai és biológiai tulajdonságai a gentamicin-C-hez hasonló. Eltérés csak annyi, hogy a purpurózamin csoport helyett egy 2,6-diamino-2,3,4,5-tetradezoxi-Dglicero-4-hexenóz, a dehidropur-purózamin kapcsolódik glikozidos kötéssel a 2-dezoxi-streptamin C4 hidroxil csoportjához. A vizsgálatok szerint a sisomicin a gentamicin bioszintézis egyik köztes anyaga. A gentamicint termelő törzs a tenyészethez adott sisomicint gentamicinné telíti. Ezt igazolja az, hogy a gentamicin termelő törzs tenyészlevében a minor komponensek között a sisomicin mindíg fellehető. Az enzimes inaktíválhatósága a gentamicinC1a -hoz hasonló. A telítetlenség alig befolyásolja az Nacetilezést. Aminoglikozid antibiotikumok inaktíválása és az inaktíválhatóság akadályozása Az inaktíválásért felelős általában plazmid hordozta enzimek eredeti funkcióit nem ismerjük. A patogén mikroorganizmusok anyagcsere rendszerében valamilyen eddig ismeretelen biokémiai feladatot látnak el, és szubsztrátspecifitásuk teszi lehetővé a gyógyászati céllal adott antibiotikumok hatástalanítását. Nem meglepő, hogy az ilyen aktivitást hordozó baktérium törzsek feldúsulnak a tenyészetben az inaktíválható antibiotikum jelenlétében. Davis feltételezése szerint ezek az enzimek Streptomyces törzsekből származnak és plazmidként kerültek mai gazdaszervezeteikbe. A plazmid hordozta rezisztencia faktor végeredményben plazmid átvitellel az antibiotikum távollétében is lehetővé teszi újabb rezisztens törzsek megjelenését, sőt ez az információ könnyen integrálódhat a baktérium kromoszóma-állományába.
104
Az eddig ismert különböző mikroorganizmusokban (Pseudomonas, Escherichia, Staphylococcus, Streptomyces, Micromonospora) előforduló sok esetben izomer formában izolálható enzimek különböző specifikus aktivitással támadnak az antibiotikum megtámadható csoportjaira. A sztreptomicin N-acetil-glükózamin részének C3 helyzetű ekvatoriális hidroxil csoportjával két enzim képes reagálni. az adenil transzferáz adenilezi, a foszfor-transzferáz foszforsavval észterezi ezt a csoportot és ezzel az antibiotikum riboszómához kötődését lehetetlenné teszi. A neomycin tíz olyan funkciós csoportot tartalmaz, amelyek az eddig ismert inaktíváló enzimekkel acilezhető. Az enzimek specifitására mutat, hogy általában a funkciós csoportokat más-más enzim acilezi. Sok esetben viszont egy-egy funkciós csoportot több enzim (esetleg izoenzim) képes acilezni. A 4,6-Obiszglikozidok enzimes inaktíválásával kapcsolatban eddig nyolc enzim működését vizsgálták részletesen. A táblázat a leggyakrabban előforduló amino csoportot acilező, hidroxil csoportot foszforilező illetve adenilező enzimek legismertebbjeit foglalja össze, megjelölve néhány gyógyászatban alkalmazott aminoglikozid antibiotikumon kimutatott hatáshelyeket. (A Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptomyces, Micromonospora nemzetség törzseiből izolált aminoglikozid antibiotikumokat inaktíváló enzimek speciftása) A táblázat a funkciós csoport helyzetét mutatja az egyes antibiotikumokban Izoenzimek Streptomycin Neomycin Kanamycin Tobramycin Gentamicin 3 Amino-acetil-transzferáz (I) 3 3 3 Amino-acetil-transzfer (II) 3 3 3 Amino-acetil-transzferáz (III) 2’ 2’ 2’ Amino-acetil-transzferáz (I) 2’ Amino-acetil-transzferáz (II) 6’ 6’ 6’ 6’ Amino-acetil-transzferáz (I) 6’ 6’ 6’ 6’ Amino-acetil-transzferáz (II) 2’’ Hidroxifoszfor-transzferáz..... Hidroxifoszfor-transzferáz 3’’ Foszfor-transzferáz 3’ 3’5’’ Hidroxifoszfor-transzferáz(I). 3’ 3’ Hidroxifoszfor-transzferáz(II) 3’ 3’ Hidroxifoszfor-transzferáz(III) 6 Nukleotidil-transzferáz 4’ 4’ Nukleotidil-transzferáz 4’ 2’’ 2’’ 2’’ Nukleotidil-transzferáz Nukleotidil-transzferáz 3’’
Sisomicin 3 3
2’ 6 6’ 2’’
2’’
A mikroszervezetekben mérhető enzim szintek jelentős eltérést mutatnak, de az egyes antibiotikumon mérhető aktivtásuk is különbözhet a kémiai szekezetből adódó hatások miatt. Nem meglepő az eredmény, hogy közülük öt enzim azonosan viselkedik a különböző antibiotikumok esetében, mert a dezoxi-sztereptaminhoz kapcsolódó cukor komponens szerkezete azonos. Az a tény, hogy egyetlen enzim többféle aminoglikozid antibiotikum inaktíválására képes, azzal jár, hogy az egyik antibiotikummal szemben kialakuló rezisztencia (keresztrezisztenciát okozva) más a táblázatban fel nem sorolt rokon antibiotikumokkal szemben is védelmet biztosít. A 2-dezoxi-streptamin C3 aminocsoportjának acilezésére több enzim alkalmas. Ezeknek a működését a funkciós csoporttól távolabb levő molekularészek is befolyásolhatják. A 2-dezoxi streptamin C6 hidroxiljához kapcsolódó aminocukor C2 ekvatoriális helyzetű hidroxilját egy nukleotidil transzferáz adenilezi. A Staphylococcus aureus-ban olyan foszfor transzferáz található, amelyik primer aminok és szekunder hidroxilok acilezésére is képes, attól függően,hogy kofaktorként ATP vagy pedig acetil-S-CoA helyezkedik el az enzim aktív központjában.
A bemutatott aminoglikozid-antibiotikumok szerkezetét figyelmesen tanulmányozva megállapítható, hogy bizonyos funkciós csoportok eliminálásával, vagy kémiai védelmével megakadályozható az inaktíválódásuk. Ezt a lehetőséget a természet változatossága és az antibiotikumok kémiai módosításával foglalkozó kutatócsoportok tevékenysége hasznosítja.
105
AMINOGLIKOZID ANTIBIOTIKUMOK KÉMIAI MÓDOSÍTÁSA Az antibiotikumok kémiai átalakításakor nem csak az inaktíválódás megakadályozása, hanem a toxicitás csökkentése, esetleg a baktérium spektrum szélesítése is célként tűzhető. Ezek a feladatok, sokáig megoldhatatlannak tüntek. Nem rendelkeztek a gazdaságosság elvét is kielégítő specifikus reakciók elvégzésére aalkalmas szelektív kémiai módszerekkel. Sok esetben a kezdetben csak elméleti jelentőségű eredmények a gazdaságosság követelményeit is kielégítve végül gyakorlati hasznot hoztak. Ilyen eredmény volt a 3’,4’-didezoxi-kanamycin-B (dibekacin) előállítása. Első lépés az aminocsoportok védelme etoxi-karbonil-kloriddal vizes acetonban. A második feladat a 3’- és 4’- hidroxil csoportokból, valamint a 4”- és 6” hidroxil csoportokból acetonid képzés dimetil-formamidban p-toluolszulfonsav jelenlétében. Ezt követi a 2” hidroxil csoport karbobenzoxilezése karbobenzil-oxi-kloriddal, majd a
vicinális 3’,4’ hidroxilok mezilezése pyridinben az acetonid bontása közben. A 3’4’-hidroxilok eltávolítására a Tipson-Cohen módszer jól használható, amikor is a dimezilátot nátrium-jodiddal Zn jelenlétében raegáltatják N,N-dimetilformamidban. A telítés után a védőcsoportok reduktív eltávolítása következik. Az ábrán jól látható, hogy a C5-hidroxil térszerkezeti gátoltsága miatt nem vehet részt a reakcióban.
Japán szerzők,- Okutami és munkatársai - különböző aminoglikozid antibiotikumok könnyen foszforilezhető 3’hidroxilcsoportjának racionális eltávolítását oldották meg. Szellemesen felhasználták a mikrobiológiai inaktí-válás specifikusságát. A kanamycin-B 3’-hidroxil csoportját egy Pseudo-monas törzsben előforduló transz-foszforiláz segítségével foszforilez-ték, majd ezt a foszforsavésztert trimetilszililklorid-dal halogénre cserélték, a halogént pedig hidrogénezéssel távolították el. Ez a kombinált módszer jó kihozatallal ipari méretben az egyik leghatásosabb aminoglikozid antibiotikum előállítására ad lehetőséget. Ez az eljárás más antibiotikumok esetében is sikerrel alkalmazható. Igy előállították többek között a 3’-dezoxi neomicin-B származékot is.
106
A másik elgondolás a guanidino csoport védelmére a természettől ellesett ötlet alapján ugyancsak japán szerzőktől származik. A dezoxi-streptamin csoport C-1 aminocsoportjának acilezése megakadályozza az inaktíváló enzimek működését. Acilező ágensként a butirozin antibiotikumban előforduló L-(−)-4-amino-2hidroxi-vajsavat használták. Ezzel a savval való acilezés ugyanis nem változtat lényegesen a hatás szempontjából alapvető jelentőségű vízoldhatóságon, a molekula bázikus voltán. Ugyanakkor az acilezett termék toxicitása lényegesen csökkent.
Kavaguchi és munkatársai gazdaságos eljárást kidolgozva a kanamycin-A acilezésével egy szélesebb spektrumú, rezisztens törzsekre is ható, kevésbé toxikus antibiotikumhoz az amicamycinhez jutottak. Mivel a kanamycin A négy aminocsoportjának reakcióképessége különböző (C6>C1>C3>C3”) A C6 atomhoz kapcsolódó legreakcióképesebb aminocsoportot védeni kellett karboxibenzoxilezéssel. Az így előállított 6’N-benziloxikarbonil-kanamycin-A-t acilezték a karbobenziloxi-L-(−)-hidroxi-4-amino vajsav szukcinil 2-iminészterével. A védőcsoportok eltávolítása után egy új fészintetikus antibiotikumhoz, az 1-N-(S)-4-amino-2-hidroxi-butirilkanamycin-A-hoz, az amikamycinhez jutottak. Ezt az antibiotikumot már csak egyetlen enzim, a viszonylag ritkábban előforduló 6’-acetil-transzferáz képes inaktíválni. Az l-N-szubsztituens jelenléte nem csak a dezoxi streptamin C3 aminocsoportjának az acilezését akadályozza, de a C3’ hidroxil csoport foszforilezését és a C2” hidroxil adenilezését is zavarja. később az acilcsoport útólag végzett redukciójával előállították az alkil analógot, az L-N-(S)-4-amino-2-hidroxibutil-kanamycin-A-t is, amelynek biológiai hatása megegyezett az amikamycinével. A streptamin C1 aminocsoportjának szelektív acilezésével, majd az acil csoport redukciójával több antibiotikum N-alkil analógját is elkészítették. Igy a gentamycin és a sisomycin toxicitását csökkenteni lehetett, miközben a rezisztens baktériumokra való hatását a dezoxi-streptamin C1 csoportjának acilezésével növelték.
Előállítása egyszerűen,gazdaságosan megoldható, mivel nátrium-cián-bórhidrid és feleslegben adott acetaldehid jelenlétében pH 5-nél a sisomycin szulfátból C1-N-etil-sisomicin állítható elő. A pH változtatásával más aminocsoport alkileződik.
107
Aminoglikozid vérszint mérése immunológiai módszerrel Az aminoglikozid antibiotikumot erős halláskárosító és vese károsító hatása miatt csak súlyosabb fertőzések leküzdése céljából alkalmazzák, amikor már más, kevésbé toxikus antibiotikum hatástalannak bizonyult Megjegyzendő, hogy az emberi szervezetnek a szakirodalomból ismert szűk aminoglikozid tűréshatára ép, egészséges szervezeten kimért adatokra vonatkozik. Leromlott állapotban, szepszisben, sokkos állapotban, vizelethajtók egyidejű adagolása mellett könnyen bekövetkezhet a túladagolás, amely veszélyes károsodást okozhat. Ez indokolja kezelés közben a szérumban az antibiotikumszint állandó ellenőrzését. Ez a mérés a szérum viszonylag alacsony antibiotikum szintje, valamint a biológiai mérés időigénye miatt agardiffúziós módszerrel nem végezhető el. Erre a célra gyors, nagy pontosságú, specifikus immunológiai mérőmódszereket dolgoztak ki. Az aminoglikozid antibiotikumok jól kötődnek a szérum fehérjékhez. Így hapténként szerepelve a saját fehérjét az immúnrendszer idegen testnek érzékeli. E tény hasznosítása céljából a mérendő antibiotikumot valamilyen homogén, ismert fehérje frakcióhoz (például szérumglobulin) rögzítik kémiailag. Optimális mennyiségnek tekinthető 50 antibiotikum molekula egy-egy fehérje molekulán. Ezt adagolják az antiszérum termelésre kiválasztott állatba. Az ellenanyag kifejlődése után a szérumot elkülönítik a vértestektől és ezt használják mérőoldatként. Az antitest ugyanis a reakcióelegyben levő mérő fehérjéhez csak az esetben kapcsolódik, ha időlegesen kellő számú haptén molekula (antibiotikum) kötődött a mérő fehérjéhez, esetünkben a szérum globulinhoz. A szerológiai módszer gyorsan és nagy pontossággal adja meg a szérum antibiotikum tartalmát. A módszer specifikus volta miatt minden antibiotikumra külön-külön kell előállítani az arra specifikus antitestet.
108
MAKROLID ANTIBIOTIKUMOK A makrolid tipusú antibiotikumok első képviselőjét, a pikromycint 1950-ben izolálták. Azóta a csoportnak több mint 40 képviselőjét írták le. Gyógyszerként azonban csak két rokon vegyületet, az eritromycint és az oleandomycint, az állathízlalásban pedig a tylozint használják. A makrolid antibiotikumokra jellemző a nagy lakton gyűrű (12, 14, 16, 18 atom alkothatja), amely lehet részben telítetlen is egy-egy csoportra jellemző szubsztituenssel, az oxo csoporttal konjugálva. Minden makrolid antibiotikum tartalmaz egy aminocukrot is, amely glikozidos kötéssel kötődik a laktongyűrűhöz. Sok esetben egy semleges karakterű cukorkomponens is kapcsolódik glikozidos kötéssel a laktongyűrűhöz. Az antibiotikum erős bázikus tulajdonságát az aminocukor sóképzésre lehetőséget adó dimetilamino csoportja okozza. A szabad bázis vízben kevéssé oldódik, jól oldódik viszont poláros szerves oldószerekben, alkoholban. Közel semleges vízes oldata hűtve stabil, savanyítva, lugosítva, vagy melegítve könnyen inaktíválódik. A makrolidok főleg Grampozitív mikroorganizmusok okozta fertőzések leküzdésére használhatók. Többször alkalmazzák más antibiotikumokkal, kombinálva. ERITROMYCIN McGuire és munkatársai 1952-ben közölték a Streptomyces erythreus fermentlevéből izolált Streptococcus, Staphylococcus és Pneumococcus fertőzések ellen hatásos új antibiotikum tulajdonságait. Jól használható amöbiázis kezelésére és hatásos számos penicillin, streptomycin és tetraciklin rezisztens baktérium ellen. Kémiai szerkezetét Wiley 1957-ben közölt munkáiból ismerjük ugyan, pontos sztereokémiailag helyes szerkezetének felderítése azonban Celmer érdeme, aki 1965-ben közölte munkájának eredményeit. A lakton gyűrű bioszintézise a zsísavszinté-zishez hasonló módon egy savhordozó fehérje komplex felületén folyik. Első megközelítésben enzimhiányos, enzimhibás zsírsavszintetizáló komplexnek tűnik. Cerulamin a zsírsavszintézis ismert gátlószere gátolja a makrolid képződést. Az indítás propionil-CoA-val, a lánc hosszabbítás metilmalonil-CoA egységekkel történik. A hordozó fehérje komplexhez átmenetileg tioészterként rögzített ketozsírsavlánc kapcsolódik, amely a lánchosszabításban következő és dekarboxileződő matilmalonil fragmentum αszénatomját acilezi.. A tápközeghez adott jelzett propionsav jó hatásfokkal jelenik meg az eritrolid gyűrűben. A makrolidszintézis szempontjából esszenciális metilmalonil-CoA szint a propionsav karboxilezésével is feltölthető, a mikrobiális-élettani vizsgálatok szerint azonban a metilmalonil-CoA elsősorban szukcinil-CoA epimerizációjával képződik, amely átrendezési folyamat cobalamin (B12) igényes. A táptalajhoz adott propanol ez utóbbi folyamatot elősegítve jelentősen serkenti az eritromycin képződést A hetedik propionil egység beépülését követi a gyűrűzárás a proeritrolid gyűrű kialakulása. A bioszintézis során a zsírsav szintézisben szerepet játszó NADPH-függő dehidrogenáz működését ez esetben nem követi minden esetben a dehidratálási és telítési reakció, bár lehetséges, hogy az oxigén funkció vándorlása C-7-ről C-6-ra egy dehidratált átmeneti termék képződésén keresztül történik.
109
Az eritrolidnek nevezett 14 tagú laktongyűrű 5-ös szénatomjához kapcsolódik a makrolidokra jellemző aminocukor, a 3,4,6-tridezoxi-3-dimetil-amino-D-xilohexóz. A dezózamin tercier aminocsoportja adja az eritromycin erős bázikus tulajdonságát, amely lehetőséget ad a gyógyszerként forgalmazott sztearát, laktobionát, stb sóinak képzésére. A másik cukorkomponens, az L-cladinóz, a 2,3,6-tridezoxi-3-metoxi-3-metil-L-ribohexóz ugyancsak glikozidos kötéssel kapcsolódik a lakton gyűrűhöz, annak 3-as szénatomjához. A szénhidrátkomponensek bioszintézise glükóz-6-foszfátból indul. A dehidratálást követő izomerizáció termékeként kapott D-6-dezoxi-hexóz valójában két különböző 4-oxo-6-dezoxi-hexóz enol formája. Azt a köztes terméket, amelyikben a 6-metil csoport megtartotta eredeti sztereokémiai helyzetét, egy NAD-függő dehidrogenáz sztereospecifikusan redukálja. A redukált termék dehidratálás után egy átmeneti enolizációval 3oxo-4,6-dezoxi glükózzá alakul. A ketocsoport glutamin segítségével történő iminálásával, majd ismételt metilezésével eljutnk az eritromycin egyik cukorkomponenséhez a dezózaminhoz, amelynek foszfát észtere alkalmas köztes termék az eritrolid gyűrű C-5 helyzetben történő glikozilezésére. A szénhidrát alkotórész képződésének elágazásánál a másik cukorkomponensben a 6-metil csoport sztereokémiai helyzete az eredeti konfigurációval ellentétes. Az előző reakciósorban szereplő dehidrogenáz számára alkalmatlan szubsztrátum, viszont fölöttébb alkalmas a dehidratáz számára. A telítetlen cukor kémiai stabilitását a ketonnal való konjugáció fokozza. A C-3 metilezését és a kettős kötés telítését követi az oxo csoport redukciója,mivel ez már alkalmas szubsztrátum a dehidrogenáz számára. Ezzel a reakcióval eljutottunk az eritromycin-C semleges szénhidrát komponenséhez a mikarózhoz. A C-3 hidroxilcsoport metilezésével készül az eritromycin-A és az eritromycin-B szénhidrát alkotórésze az L-kladinóz. Amint látható az enol-keto tautomeria a kétféle oxo származék képződését közel azonos mértékben teszi lehetővé. Nem meglepő tehát, hogy az eritrolid gyűrűn mindíg ezt a két cukorkomponenst találjuk. A fermentációhoz adott más cukrok adagolásával nem lehet befolyásolni a képződő antibiotikum szerkezetét. A S. erythreus fermentlevében az alapmolekula több változata található. Az A komponens a 12-es szénatomon α-helyzetű hidroxil csoportot tartalmaz, a B komponens ugyanitt csak hidrogént. A B-komponens savstabilitása nagyobb, biológiai aktivitása azonban 20%-kal kisebb. A C komponens a cukorkomponens szerkezetében különbözik a másik két variánstól, mert a mikarózban a kladinóz molekula metoxicsoportja helyett hidroxilt találunk. Ez a kis kémiai különbség a biológiai aktivitásban nem okoz eltérést. A mikrobiális genetikai technológia (géntechnológia) fejlődése az antibiotikum kutatásban is éreztette hatását. Ilyen jellegű kutatásra különösen előnyös terület a makrolid antibiotikumok bioszintézise, mivel egyrészt sok olyan elemet tartalmaz amelyen módosításokat lehet végrehajtani, másrészt az antibiotikum csoport termelésére alkalmas törzsek enzimrendszerei általában működőképesek maradnak a rokon törzsekbe jutatva. A megfelelően megválasztott partnerek protoplasztfúziójával létrehozott hibrid által termelt antibiotikum szerkezete sok estben többé-kevésbbé előre sejthető. Az eritromcin bioszintézisében résztvevő 27 enzim génjét a Genentech és az Eli Lilly géntechnológusai sikerrel klónozták. A 35 kilobázis méretű DNS darabot pKC462 vektorba építve először Streptomyces lividansba juttatták. Ez a sugárgomba nyomokban sem termel makrolid típusú antibiotikumot. A plazmid felvétele után viszont mérhető mennyiségű eritromycin képződött. Ugyanezt a plazmidot ezután tylozint termelő Streptomyces fradiae-ba vitték. Ez esetben ugyan eritromycin nem képződött, viszont megjelent egy eddig ismeretlen új makrolid antibiotikum. Hatásmechnizmusuk kevéssé tisztázódott. A de novo fehérjeszintézist gátolják. Az eritromycin az 50S riboszómához, valószinüleg a 8-P fehérjéhez kötődve gátolja a fehérje szintézist. Elsősorban a transzlokációt gátolja, annak is az utolsó fázisát. A peptidil-tRNS elhelyezkedését akadályozza a peptidkötő helyen. Kisebb mértékben zavarja a transzferáz reakciót is. Eritromycin rezisztens törzsben ez a 8-P fehérje megváltozott formában fordul elő. Az eritromycin viszonylag kevéssé toxikus, mert az eukarióta sejtek citoszolban folyó fehérjeszintézisét nem zavarja, de gátolja a mitokondriumokban folyó riboszómális peptidszintézist. Érdekes módon a tetraciklin típusú antibiotikumok megakadályozzák az eritromycin kötődését a riboszómához, az eritromycin kötődése viszont gátolja a klóramfenikol (klorocid) kapcsolódását. Az eritromycin nem tekinthető széles spektrumú antibiotikumnak. Eőszeretettel használják Grampozitív penicillin rezisztens kórokozók ellen, illetve penicillin allergia kifejlődésekor. Vízben rosszul oldódik, a bélből könnyen felszívódik. Mivel a gyomorsav elbontja enteroszolvens tablettában forgalmazzák, vagy saválló származékát javallják szirup formában szájon át. Kiürülése nem túl gyors. Hatóránként adagolva a megfelelő vérszint könnyen biztosítható.
110
OLEANDOMYCIN A másik világszerte használt makrolid típusú antibiotikumot 1955-ben izolálta Sabin a Streptomyces antibioticus fermentlevéből. Szerkezetét 1960-ban Hochstein ismertette. Sztereokémiáját pedig 1965-ben az eritromycinével együtt ismertette Celmer. Később egy Streptomyces ambofaciens törzs tenyészlevében is megtalálták. A 14 tagú oleandolidnak nevezett lakton gyűrű szerkezete hasomlít az eritromycin szerkezetéhez. Különbség a C6, C8 helyen található. Nevezetesen a C6 hidroxil helyett az oxigénfunkció a C8 helyen oxirán gyűrűben található. A C5 atomhoz glikozidos kötéssel az eritromycinhez hasonlóan kapcsolódik a dezózamin. A C3 atomhoz L-oleandróz kapcsolódik glikozidos kötéssel. Gyógyászati felhasználáskor vízben oldódó foszfátsóját adagolják. A molekulában levő három hidroxil csoport acilezésével kapott triacetil származék előnyösen kapszulában vagy szuszpenzióban adagolva rövid idő alatt magas vérszinet ad. hatásmódja megegyezik az eritromycinével, sőt legtöbb esetben keresztrezisztenciát okoz. TYLOSIN McGuir és munkatársai 1961-ben izolálták ezt a makrolid antibiotikumot a Streptomyces hygroscopicus tenyészlevéből. Később S. fradiae és S.rimosus törzsek fermentlevében is 8megtalálták. Kémiai szerkezetét Morin és Gorman 1964-ben írták le. A 16 tagú tilakton alapváz oxidált származékához kapcsolódik a Dmikaminóz és ezen keresztül mikaróz, valamint a tilakton hidroxil-csoportjához kapcsolódó Dmicinóz. A makrolid bioszintézis a zsírsav szintézis tiotemplátjához hasonló enzimkomplex felületen folyik. Az enzimkomplex egyes enzimei azonban kölönböző mértékben vesznek részt a bioszintézisben. Nem ismeretes az a mechanizmus, amely a programot adja, a bioszintézist irányítja. A szénlánc 2-2 szénatommal való meghosszabítása esetén ugyanis nem működik minden esetben a zsírsavszintézisnél megismert négy enzim. A nyolc acil-CoA-ból felépülő 16 tagú makrolid gyűrű kialakításában a β-ketoacil szintetáz hétszer, a NADPH függő β-ketoacil reduktáz hatszor, a hidroxi-dehidráz háromszor, a NADPH igényes enoil-reduktáz pedig csak egyszer jut szerephez. A bioszintézis propionil-CoA-val indul, négy metilmalonil-CoA, egy etilmalonilCoA, és két malonil-CoA vesz részt a reakcióban. Minden malonil-CoA származék képződéséhez (széndioxid felvételéhez) egy-egy ATP szükséges. A tilanolid gyűrűn végrehajtandó oxidációs reakciók és a cukorkomponenseknek a laktongyűrűhöz való kapcsolása is energiát igényel. A tilakton bioszintézis végül is a templátról való leválással, illetve a lakton gyűrű kialakulásával fejeződik be.
111
Az ezt követő első reakció a mikaminóz kapcsolódása a C-5 hidroxilon keresztül. Ezt követi a C-20 metil oxidációja, majd a hidroximetil tovább alakulása formil származékká. A cukorkomponensek beépülése timidildifoszfát származékaikon keresztül történik. A C-23 oxidációját követi a 6-dezoxi-Dallóz megjelenése. A következő lépésben vagy egy újabb cukor, a mikaróz kapcsolódik a mikaminóz 4’hidroxilcsoportjához és ezt követi a Dallóz 2’’’ és 3’’’ helyzetben levő hidroxilcsoportjainak a metilezése. Lehetőség van arra, hogy előbb következzen be a hidroxilcsoportok metilezése és csak azután a mikaróz belépése. Ezekkel a lépésekkel eljutottunk a főkomponensként megjelenő tylosin-hoz, amely a fermentációs periódus utolsó szakaszában a formil csoport redukciójával továbbalakulhat (relomycin). A tenyészlé a fent említett főkomponenseken kívül a bioszintézis többkevesebb köztes termékét (lactenocin, desmycosin, macrocin) is tartalmazhatja változó mennyiségben. A fermentlében található tilakton származékok közül antibakteriális hatásával a tylosin kiemelkedik. Húsleves agaron a Bacillus subtilis növekedését 0,4 mg tylosin, 0,8 mg macrocin, 1,5 mg relomycin, 6,25 mg lactenocin illetve desmycosin képes megakadályozni. Megjegyzendő, hogy Corcoran és munkatársai szerint sejtmentes körülmények között a riboszóma 50S alegységéhez a desmycosin kötődik legerősebben. Teljes mértékben megakadályozza az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához. A gátló hatásnak az érvényesülése a stacioner fázisban levő tenyészetben a fehérje szintézis csökkent volta miatt már jelentéktelen. A képződő tylosin a termelő törzs saját riboszómájának a működését is zavarja. A saját fehérjeszintézis zavarásával így végeredményben az antibiotikum képződés csökkenése észlelhető. Első megközelítésben fenotipusosan ez végtermék gátlásnak (feed-back) tűnik. Jó példa ez arra, hogy az in vivo nyert kisérleti eredményekből nem tanácsos meggondolatlan következtetéseket tenni (A feed-back gátlás alatt a végterméknek a bioszintézisben közvetlenül szerepet vállaló enzimre való gátló hatását értjük!). A törzsfejlesztés szempontjából ezért tylosin rezisztens mutáns kiválasztása előnyös volt. Géntechnológiai munkával a bioszintézis egyes enzimeinek klonozását, kópiaszámának növelését meg lehetett oldani. Ilyen módszerekkel az O-metil transzferáz termékképződést limitáló hatását fel lehetett függeszteni. A tylosin előállítására kialakított eljárások megegyeznek abban, hogy nitrogén forrásként állati eredetű, vagy növényi fehérje azonosan jó eredménnyel használható. Szénforrásként a szénhidrát mellett jelentős szerepet kap sőt a nagytermelőképességű törzsek esetében előnyösebb a növényolaj szénforrás használata. A fermentáció első szakasza, az úgynevezett növekedési szakasz oxigénigénye jelentős (1.5 mmol O2 . g sejt-1 óra-1), mintegy háromszorosa a termelő szakaszban fogyasztott oxigén mennyiségének. Egyes szerzők kérdőjelezik az eljárás növekedő és termelő szakaszra osztásának létjogosultságát. Egyre több adatra hivatkozva - éppen a tylosin esetében - állítják, hogy az antibiotikum a növekedési szakaszban is képződhet, ha az ugynevezett ”katabolikus represszió” azt nem akadályozza. Glükóz adagolása, illetve a foszfátkoncentráció emelése egyaránt csökkenti az antibiotikum termelést. Az újabban alkalmazott növényolaj rátáplálással kivitelezett (feed-batch) technológia kialakítása ebből a szempontból különös figyelmet érdemel, mert a represszív hatás kizárásával a hasznos termék képződés jelentősen növelhető.. Ammónia a növekedést serkentve az idiofázis elérését későbbre tólja, csökkenti az antibiotikum képződését. A táptalajhoz adott zeolit pozitív hatása az ammónia megkötésében jelentkezik.
112
A szűrt fermentléből vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel (dikóretán, butilacetát, metil-etil-keton) jó hatásfokkal különíthető el a tylosin rokon vegyületeivel együtt, de sikerrel alkalmazhatók a környezetkímélő ioncserélő vagy abszorpciós eljárások is. Kémiailag a pH 5-nél nyert kloroformos extraktum 283 nm-nél mért fényelnyeléséből következtethetünk a tenyészlé tylosin tartalmára. A nyers szűrlet biológiai értékének meghatározására turbidimetriás, vagy agardiffúziós módszerek használhatók. Mérő törzsként a Staphylococcus aureus (ATCC 9114) vagy a Sarcina lutea (ATCC 9341) hasznlhatók. A kinyert tylosin kevéssé toxikus, Grampozitív baktériumok és Mycoplasma törzsek ellen hatásos makrolid antibiotikum. Humán gyógyszerként nem kerül forgalomba éppen a köztestermékek jelenléte miatt. Állattápszerben (szárnyasok, választási malacok, borjak esetében) és az állatgyógyászatban azonban használata terjedőben van. Tápkeverékben való alkalmazása különös gondosságot igényel, mivel a bélcsatornából felszívódik és a kiürülése sem túl gyors. A tylosin készítményt tartalmazó tápot fogyasztó állat csak meglehetősen hosszú várakozási idő után kerülhet vágóhídra, mert az FDA szigorú szabályait egyre inkább követő nemzetközi előírások szerint a forgalomba került élelmiszer antibiotikumot nem tartalmazhat.
113
THIOSTREPTON Az antibiotikum elnevezése is utal jelentős kéntartalmára. A peptidjellegű antibiotikumok külön csoportját képviselő bioaktív vegyület a tiazol gyűrűkben tartalmazza a kénatomokat. A csoportra jellemző, hogy az emésztőenzimek inaktíválják. Ez a kutatólaboratoriumok számára előnyös, mert a biológia hatás kiváltása után egyszerűen eltávolítható a reakcióelegyből. Az állatgyógyászatban kerül felhasználásra.
A csoport első képviselőjét az 1600 molekulatömegű thiostreptont Pagano és munkatársai 1956-ban izolálták Streptomyces azureus fermentlevéből. Kémiai szerkezetét Anderson és munkatársai 1970-ben ismertették. Kémiailag egy kvinaldinsav származék. Izoleucin, treonin, alanin és cisztein aminosavakon kívül tiostrepton-savat és tiostreptint tartalmaz. A vízben rosszul oldódó kémiailag stabil vegyület a kiszűrt sejttömegről kloroformmal oldható le. Biológiailag különösen a Gram-pozitív baktériumok ellen hatásos. A Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium diphteriae, és a Streptococcus haemolyticus szaporodását már 0.01 mg ml-1 koncentrációban is akadályozza. A Gram-negatív baktériumok külső membránján nem képes áthatolni. Sejtmentes körülmények között mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív baktériumokban az 50 S riboszóma alegységhez kötődve a GTP hidrolízisének akadályozásával a lánchosszabítást gátolja. A tiostrepton-rezisztens Bacillus megaterium riboszómájából hiányzik az L-11 fehérje. Az antibiotikum a gazdaszervezet számára nem toxikus, mert az eukariota riboszómához nem kötődik. Az antibiotikumot termelő S. azureus riboszómáját felépítő rRNS jelentős mértékben metilezett. Vélhetően ezért zavartalan a sajátfehérje bioszintézise.
114
POLIKETID KÖZTESTERMÉKBŐL KÉPZŐDŐ METABOLITOK CSOPORTJA A poliketid bioszintézis építőeleme a malonil-CoA. Ugyanez a köztes terméket használja fel a zsírsav szintézis. A zsírsav bioszintézishez felhasználásra kerülő malonil-CoA acetil-CoA karboxilezésével képződik. A poliketid szintézis építőeleme viszont oxálecetsav oxidativ dekarboxilezésével képződik. A két bioszintézist végző enzimkomplexhez lazán kapcsolódik a malonil-CoA képződésért felelős fehérje A zsírsavszintézist végző enzimkomplexhez a transzkarboxiláz kapcsolódik, aminek a működését a végtermék, a hosszabb szénláncú zsírsav gátolja. A karboxi-biotin képződést az átmenetileg megjelenő szénsav-foszforsav vegyesanhidrid segíti. [HO–CO–O–PO3H2] Biotin + CO2 + ATP
ADP +
Pi + karboxibiotin
Az Escherichia coli-ban működő enzimkomplex mérete 277 kd, amely két alegységből álló 45 kd méretű hordozó fehérjét (BCCP biotin carboxil carrier protein), két alegységből álló 102 kd méretű biotin karboxilázt és négy alegységet tartalmazó 130 kd méretű transzkarboxilázt tartalmaz. (dalton = 1 hidrogénatom tömege 1,67x10–24g) A poliketid szintézis működését az oxidatív dekarboxilezésért felelős fehérjét (oxálecetsav
115
dekarboxiláz) és piroszőlősav karboxilázt tartalmazó együttes segíti. A gyürüs szerkezet kialakulása víz kilépésével következik be. (Lásd a tetraciklin szerkezetű antibiotikumok kialakulását mutató ábrát
116
TETRACIKLIN TIPUSÚ ANTIBIOTIKUMOK Közel félszáz éves múltra tekintve emlékezhetünk meg a széles spektrumú antibiotikumok minőségileg jól elkülönülő négy anellált gyűrűt tartalmazó oktahidronaftacén (4-dimetilamino-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-oktahidro3,6,10,12,12a,-pentahidroxi-1,11-dioxo-2-naftacén karboxamid) származékairól, amelyek fehérjeszintézist gátló vegyületként, szájon át adható formában őrzik népszerűségüket. Gyógyszerként a Streptomyces törzsek által előállított valamelyik természetes képviselőjük (aureomycin, terramycin, tetracyclin, demeclocyclin), illetve az utóbbi évtizedben a terramycin kémiai átalakításával nyert stabil hatásos származék a doxycyclin kerül felhasználásra. A hatásos anyag sztereokémiai szerkezetének felderítése röntgendiffrakciós analízis segítségével igen nagy munkát jelentett. Szerkezetükben közös az amfoter tulajdonság. Valamennyien savakkal illetve bázisokkal sót képeznek. Semleges oldatban zwitterionként léteznek. Stabil komplexet alkotnak a kettő és több értékű fémionokkal (Ca, Mg, Fe). Mivel ezek a komplexek vízben alig oldódnak, az antibiotikummal együtt fogyasztott tej iontartalma rontja a tetraciklinek felszívódását. Nátrium-hidrokarbonát ugyancsak gátolja a felszívódást. Antibakteriális hatásukat kezdetben a teraciklinek erős fémion megkötőképességével, a baktériumok számára esszenciális fémionok elvonásával magyarázták. A hatásmód részletes vizsgálata azonban igazolta, hogy ez a hatás nem jelentős. A tetraciklin ugyanis a 30 S ribószóma egység akceptor részéhez kötődve akadályozza az aminoacil tRNS kötődését a mRNS-riboszóma komplexhez. Az is feltételezhető, hogy a riboszóma szerkezeti alkotórészeként szereplő Mg++ ionhoz kötődve kapcsolódik az antibiotikum a riboszómához.
X klórtetraciklin aureomycin Cl tetraciklin tetracyclin H oxitetraciklin terramycin H demetilklórtetraciklin demeclocyclin Cl
Y CH3 CH3 CH3 H
Z H H OH H
moltömege 479,9 445,4 461,4 465,9
Semlegeshez közeli pH-nál a C4 atomon bekövetkező epimerizáció (a dimetilamino csoport térhelyzetében bekövetkező változás) a biológiai aktivitás csökkenését okozza. Ugyancsak csökkenti a biológiai hatást a dimetilamino csoport kvaternerizációja. Savval képzett sóik képződését a C2 enolcsoport protonálódása segíti elő (mezomer átrenedeződés lehetősége). Sóik vízben jól oldódó kristályos vegyületek. Szájon át adagolva hidrokloridjaikat használják. Hidrokloridjaik három disszociációs állandója a három protonálódó molekularész következménye. A disszociációs állandók értékét a kémiai szerkezetük határozza meg Hidrokloridjaik pKa értékei vízben 25 Co hőmérsékleten pKa1 pKa2 pKa3 Tetracyclin 3.3 7.7 9.5 Aureomycin 3.3 7.4 9.3 Oxytetracyclin 3.3 7.2 9.3 Vízoldható kálium és nátrium sóik bomlékonyak. A tetraciklin kálcium-ortofoszfát komplexe olyan stabil, hogy a fejlődő csontokba, fogakba kerülve és olyan sárga elszineződést okoz, amely később fotokémiai reakció eredményeként megsötétül. Különösen fontos ez a szoptató anyák illetve a terhes nők szempontjából, mivel az antibiotikum egyrészt megtalálható az anyatejben, másrészt akadálytalanul hatol át a méhlepény gátján és így feldúsulhat a magzat csontrendszerében. Ugyanezen okok miatt 8 éves kor alatt tetraciklinek használata csak feltétlenül indokolt esetben javasolható. 117
Erős sav, vagy bázis hatására a C6 atom hidroxilcsoportja inaktíválódási folyamatot indít. A gyomorsav hatására dehidra-tálódás indul a C6 hidroxil és az C5a hidrogén kilépésével. Az így kialakuló kettőskötés indukálja a C11a-C12 kettőskötés vándorlását C11-C11a helyzetbe. A termodinamikailag stabilabb naftalin vázat tartalmazó anhidro-TC biológiailag inaktív. Lúgos körülmények között a bélcsatornában a C6 hidroxil csoport és a C11 ketocsoport reakciója inaktíválja a molekulát. A C11 és C11a közötti kötés felszakadásával egy lakton gyűrűt tartalmazó inaktív izotetraciklin alakul ki. Ezzel a két reakcióval per os adva feltétlenül számolni kell. A hatás szempontjából kivánatos vérszint elérése érdekében a hatóanyagot gyakran (6 óránként), viszonylag nagy mennyiségben kell adni. Kezdettől fogva ez a szempont indokolta a kémiai módosítását. Kiderült azonban, hogy minden kémiai átalakítás, amely a molekula gyürűrendszeréhez közvetlenül kapcsolt szubsztituensek térszerkezetét érintette az aktivitás jelentős csökkenésével járt. Ez nem meglepő, ha megfigyeljük, hogy a négy gyürű sikjának felső oldala apoláros, az ellenkező felszin pedig poláros tulajdonságú. A C2 kvázi ekvatoriális helyzetű karboxamid csoport kivétel ez alól. Az amid-csoport hidrogénjének szubsztituálása nem változtatja a biológiai hatást. Ezt ki is használják a gyakorlatban. Az 1958-tól forgalmazott N-pirrolidino metil származék (Rolitetracyclin) vizes oldatban szobahőmérsékleten is stabil. Molekula tömege 527.3. Alkoholban is jól oldódik. Vízben való oldhatósága több mint 2000-szeresére növekszik a bázishoz viszonyítva. 28 Co-on 1250 µg oldható 1 ml 1.5-8.5 pH tartományban. Ez előnyös az injekciós adagolhatóság szempontjából. 275 mg RTC intravénás bevitelét követően 10 perc mulva 16-20 µg szérumszint mérhető, amely 20 perc mulva 7Fiziológiás sóoldatban oldható rolitetracyclin 13 µg értékre csökken. Az első óra Rolitetraciklin (N-pirrolidino-metil tetraciklin) végén 5-8, a harmadik órában 3-4.5, a hatodik órában 2.5-3.5, a nyolcadik órában 1.8-2.6, de tizenkét óra mlva is 1.-1.7 µg.ml-1 vérszint mérhető. 12 óránként ismételten adott i.v adagolással 2.5-5.5 µg.ml-1 átlag vérszint érhető el. Folytonos infúzióval (0.5 mg/6 óra) 4-10 µg.ml-1 vérszint tartható. A tetraciklinek széles baktériumspektruma miatt használata erősen megváltoztatja a bél természetes flóráját. Ez lehetővé teszi a gombás fertőzések megjelenését, például a patogén Candida albicans elszaporodását. Parenterális adagolás esetén előtérbe kerül a májkárosító hatása, különösen akkor, ha a vesefunkció zavara miatt a kiürülés természetes útja gátolt. A tetraciklin antibiotikumok bioszintézisének felderítése McCormic, az egyes antibiotikumszármazékok egymással összefüggő szintézisútjainak ismertetése Vanek és munkatársainak érdeme. A bioszintézis SH csoportokat tartalmazó hordozó fehérje felületén történik malonil-CoA egységekből. Az indító vegyület (malonamid) karboxamido-acetil-CoA, majd ezt követi nyolc malonil-CoA mlekula részvétele a lánchosszabbítási reakcióban. A reakció hasonlít a zsírsav bioszintézis lánchosszabító első lépéséhez. Az indító karbamoil építőelem végeredményben a malonát amidálásával is képződhet, mégis a vizsgálatok más képződési mechanizmust sugallnak. Két lehetőség adódik vagy az acetil-CoA lép reakcióba a karbamoil foszfáttal, vagy pedig az aszparagin keto analógja lép reakcióba a CoA-SH-val NAD kofaktort igénylő oxidatív dekarboxilezés közben. A vizsgálati eredmények szerint az oligoketid váz felépítéséhez szükséges malonil-CoA építőelemek nem az acetil-CoA karboxilezésével, hanem az oxálecetsav oxidatív dekarboxilezésével képződnek. Behál vizsgálatai szerint a jól termelő törzsekben az általában jelentéktelen szerepet játszó foszfenolpiruvát karboxiláz kiemelkedő szerepet kap az oxálecetsav pool feltöltésében. Ez az út kikerüli a vad törzsekben jól működő alloszterikus szabályozó mechanizmust, nem igényel ATP-t, hanem a PEP nagyenergiájú foszfátkötésének a terhére anorganikus foszfát képződése közben jut el az oxálecetsavig. A tiotempláthoz kapcsolódó ketosavtioészter kötésének esetenkénti átészterezését a malonil-CoA szénatomjának reakciókészsége, a dekarboxilezési folyamat könnyíti..
118
A régebbi elképzelést, amely a poliketidszintézisben az acetil-CoA karboxiláznak tulajdonított kulcs szerepet, szabályozási és élettani szempontból elvi ellentmondások terhelték. A biotint tartalmazó és működéséhez ATP-t igénylő acetil-CoA karboxiláz enzimkomplex az élővilágban a zsírsav szintézis első reakcióját katalizálja. Nem meglepő tehát működésének szigorú szabályozottsága. Az alloszterikus 410 kd molekulatömegű inaktív monomer csak citrát jelenlétében alakul aktív dimerré. Szabályozás hiányában ugyanis képes lenne elszívni a szénhidrátlebontás termékeként megjelenő acetil-CoA jelentős részét. Nem csekély élettani problémát jelentene, ha az oligoketid szintézis is ide csatlakozna, versengve a sejtmembrán foszfolipid építőelemének (zsírsav) szintézisével. A kerülő út érvényesülése két ugyancsak jól szabályozott mechanizmust is kikapcsol a poliketid szintézis ellenőrzéséből. Nevezetesen az ATP, citrát és acetil-CoA által szabályozott piruvát kinázt, valamint a liponsavat és tiamint tartalmazó NAD kofaktorrral működő piruvát dehidrogenáz enzimkomplexet, amelynek működését ATP és GTP gátolja, ADP viszont aktíválja. A tetraciklin antibiotikumok képződését glükózból íly módon a primer metabolizmus szintjén csak a fruktóz-1,6-biszfoszfát szintézis sebessége befolyásolja. A fruktózfoszfát kináz a glikolízis szabályozása szempontjából kulcshelyzetben van, működését a sejt aktuális energiaellátottsága befolyásolja. Az ATP és a citrát gátolja, az ADP és az AMP koncentrációnövekedése viszont serkenti a működését. Ez a multivalens szabályozás a mindenkori körülményeknek megfelelő gazdaságos anyagcsere sebességet állít be a mikroba számára. . A tetraciklin bioszintézis reakciólépéseit elemezve jól észlelhető, hogy a hexóz bontás netto ATP termelése nulla, mivel a PEP energia-gazdag foszfátja a kerülő úton anorganikus foszfátként távozik. A bioszintézishez szükséges trióz-foszfátot és redukáló aktivitást NADPH formájában a TC termelő törzsek a HMP úton nyerik. A fruktóz-1,6-biszfoszfát képződés fokozódása lényegesen csökkenti a tetraciklin bioszintézist. Egy-egy tetramid molekula szintéziséhez szükséges három ATP és négy NADPH nem terheli különösebben az anyagcserét, mivel a hexózok átalakítása közben képződő redukált kofaktorok (NADH) visszaoxidálása az ATP igényt bőven fedezi, sőt túltermelése is bekövetkezik. Vanek és Hostalek már 1972-ben kimutatták, hogy az ipari szempontból értékes jól termelő Streptomyces törzsekben mérhető ATP szint több mint egy nagyságrenddel meghaladja a gyengén termelő vad törzsekben mért értékeket. A kiemelkedő termelés előfeltétele többek között a fokozott adenilsav szintézis. A NADPH igény szempontjából nem hagyható figyelmen kívül a bioszintézis szempontjából utolsó reakció, amely az addig képződött biológiailag hatástalan köztes terméket antibiotikummá alakítja. Az ábra a zsírsav szintézishez szükséges malonil-CoA képződését mutatja acetil CoA-ból. Ezt a reakciót telített zsirsav alloszterikusan szabályozza. A poliketid szintézishez szűkséges malonil CoA viszont oxálsavból oxidativ dekarboxilezéssel képződik. Az oxálsav piroszőlősav karboxilezésével elégíti ki a poliketid szintézis épírtőelem igényét. Az ábra a két reakció lefolyását szemlélteti. A jól termelő mutánsokban a citrát szintetáz működését is magasabb ATP szint szabályozza. A túlzottan magas ATP szint kialakulását a fokozott mértékű polifoszfát képződés akadályozza a jól termelő variánsokban. Ezekben a törzsekben sok esetben nemcsak az ATP, de már a glicerinsav-1,3-biszfoszfát is szubsztrátuma a polifoszfát szintetáznak. A szabályozó mechanizmus teljes kikapcsolását jelenti, ha szénforrásként zsírokat vagy növényi olajat használunk. Ez esetben a zsírsav β lebontása szolgáltatja a szükséges építőelemet. Két acetil-CoA-ból a glioxalát cikluson keresztül képződik az oxálecetsav. Amikor a képződő poliketid lánc hossza eléri a templát szempontjából optimális méretet, akkor kezdődik három víz kilépésével a gyürűs szerkezet kialakulása, a három lineárisan anellált gyürűt tartalmazó pretetramid közti termék képződése. Ezt követi a C6 metilcsoport beépítése metioninból egy ATP felhasználásával. Metiláz hiányában demetilklórtetraciklin képződik. Metiláz hiányos mutáns viszonylag könnyen nyerhető. a klasszikus genetika módszereivel mutagén kezeléssel. A bioszintézis következő lépésében kialakul a negyedik gyürű, amit közvetlenül megelőz a köztes terméket a templát felületéhez rögzítő tioészter kötés felhasítása. A reakció előrehaladását elősegíti az energetikailag előnyösebb anellált aromás rendszer kialakulása. A gyürűzárást követi a C8-ketocsoport NADPH-t igénylő reduktív eltávolítása. A C4 oxigénfunkciót az így képződőtt pretetramidba egy NADPH-t igénylő oxigenáz vezeti be, amit az oxitetraciklint termelő törzsekben a C5 oxigénfunkció hasonló módon történő kiépítése követ. Az aromás rendszer felszámolását egy FAD dehidrogenáz indítja. Ezt követi egy víz felvételével a C12a hidroxil csoport megjelenése. A következő lépésben a C4 oxo csoportot egy transzamináz glutaminsavból származó amino csoportra cseréli. A nitrogén metilezését metioninnal működő ATP-t és B12 vitamint igénylő N-metiláz végzi. Az eddig kialakult anhiderotetraciklin biológiailag hatástalan. A biológiai aktivitás megjelenéséhez az aromás rendszer kiterjedésének a csökkentése szükséges. Ennek bevezető lépése egy újabb NADPH-t igénylő oxigenáz reakció, amely bevezeti a C6 hidroxil csoportot. Ezt követőleg NADPH-ról származó hidrogén felvételével fejeződik be a tetraciklin molekula szintézise. A bioszintézis NADPH igénye egyértelműen meghatározza a nagytermelőképességű törzsek szabályozó mechanizmusát befolyásoló élettani beavatkozások irányát.
119
A tetramid szintézis utolsó két reakciólépését katalizáló enzimek képződéséről tudjuk, hogy katabolikusan represszáltak, különösen a gyengébben termelő törzsekben. Az anyagcsere sebességének fokozódásakor csökken az oxigenáz képződése, de gátolja az enzim képződését a táptalajhoz adott nagyobb mennyiségű foszfát ion is. Ha menet közben a foszfátot eltávolítjuk a rendszerből, akkor egy órányi látens fázis után újra megindul az enzim szintézise. A kiemelkedően jól termelő variánsokban ez a katabolikus represszálhatóság alig kimutatható. Régóta ismeretes, hogy a tetracklint termelő törzsek bioszintetizáló aktivitását jelentősen fokozni lehet benzil-tio-cianáttal. A termelés fokozódásakor a pentóz-foszfát ciklus aktivitása megnő és fokozódik az anhidro-tetraciklin oxigenáz szint. Általában megállapítható, hogy minden beavatkozás a növekedés kezdeti szakaszában, ami a szénhidrát felhasználás sebességét csökkenti (fruktóz,
120
répacukor szénforrás, oxigén limit) előnyös a tetramid váz képződése szempontjából, tehát a tetraciklin tipusú antibiotikumok képződését fokozza. Kérdés, hogy a biológiailag aktív fehérjeszintézist gátló tetraciklin feldúsulása a tenyészlében milyen hatással van magára a termelő törzsre? Mikulik megállapította hogy az antibiotikumot termelő törzsből izolált 70 S riboszóma 320 tetraciklin tipusú antibiotikumot képes megkötni, irreverzibilisen azonban mindössze egyetlen kötődik. Ludvik és munkatársai tetraciklin hatására a citoplazmában a riboszómák aggregálódását figyelték meg. A vizsgálatokból később kiderült, hogy a jól termelő törzs adott idő alatt lényegesen kevesebb tetraciklint vesz fel mint a gyengén termelő vad törzs. A jól termelő törzs antibiotikum érzékenysége a tenyészet korától függ, különösen érzékeny a növekedő fázisban levő fiatal vegetatív sejt. A négy órás tenyészethez adott 500 ng/ml tetraciklin a fehérjeszintézist harmadára csökkenti és teljes mértékben megakadályozza az antibiotikum termelését. A 16 órás tenyészethez adott tetraciklin már nem befolyásolja az antibiotikum képződését, sőt jól megfigyelhető egy alapszintű fehérjeszintézis. A kétnapos tenyészetben a fehérjeszintézis a fiatal tenyészet ötödére csökken. Az antibiotikum szintézis fokozódásakor a fehérje szintézis csökken, ezt megelőzően a guanozin-pentafoszfát (ppp-G-pp) megjelenése mellett az RNS szintézis csökkenése tapasztalható. Kívülről adott ppp-G-pp az RNS polimeráz működését gátolja, a kívülről adott tetraciklin viszont a ppp-G-pp szintézist akadályozza. Ezt az igen érzékeny bonyolult szabályozási mechanizmust zavarja meg a korai fázisban adott tetraciklin. A TC-t termelő törzsekben csak a növekedési fázis végén indul meg az antibiotikum képződése. Az aminocsoport bevezetése előtt a bioszintézis útból két elágazás lehetőségét használja ki a természet. Az egyik változatként a C6 oxigénfunkció kiépítése után az oxigenáz a C-5 hidroxil csoport kiépítésével elindítja az oxitetraciklin képződését. A másik lehetőséget kihasználó fajokban működő klórozó enzimrendszer kiépíti a C7 klór származékot. Klórozó enzim nélküli mutánsokat könnyen lehet nyerni. Eddig nem találtak olyan variánst, amely a C5 hidroxil csoport kiépítésre és a klór bevitelére egyaránt képes lett volna. Kémiai szintézisére több módszert dolgoztak ki. A sok (5-6) királis szénatom miatt ez a munka nem a fermentációs eljárás kiváltását, hanem olyan új tetraciklinek előállítását célozta, amelyek fermentációs úton nem állíthatók elő. Az egyik eljárás szerint a dimetoxi-benzoesav metilészter redukciójával nyert alkoholt foszfortribromiddal bromozzák. A brómszármazékot karbetoxiszukcinát dietilészterrel reagáltatják. Az észter hidrolízisével nyert trikarbonsav dekarboxilezése után polifoszforsav hatására bekövetkezik a gyürűzárás A nyert karbonsavat észteresítik, majd az oxocsoportot etiléntioketállá alakítják. Ezt követi a LiAlH4-es redukció. Az alkoholt meziláton keresztül cianidra cserélik, amit Raney-Ni katalizátor mellett aldehiddé redukálnak. Ez lehetőséget ad a feniltiazolonnal való reakcióra. Az alapváz még hiányzó szénatomjait tartalmazó 3-oxoglutaramát metiészterét Michael addicióval kapcsolják a molekulához, végül észterkondenzációval zárják a gyürűrendszert. A tioamid csoport aminocsoporttá alakítása a kénatom alkilezésén keresztül végezhető trietiloxonium tetrafluoroboráttal. Az így kapott iminoéter híg savval könnyen hidrolizálható. Az aminocsoport metilezése metiljodiddal is végezhető, de a képződött mono-, di és trimetilszármazékokat nehéz szétválasztani. Sokkal előnyösebb a reduktív alkilezési módszer alkalmazása, amikor is a metanolos oldathoz vizes formaldehidet és nátriuncián-bórhidridet adnak pH=7.5-8-nál. A metoxi csoport eltávolítására bórtribromidot előnyös használni. A védőcsoportok eltávolíthatók koncentrált jód-hidrogénnel 100 oC-on. .
121
Aureomycin-t az antibiotikum csoport első forgalomba kerülő hatásos képviselőjét a 7-klór-4(dimetilamino)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-oktahidro-3,6,12,12a-pentahidroxi-6-metil-1,11-dioxo-2-naftacénkarbonsavamidot Streptomyces aureofaciens fermentlevéből 1948-ban izolálta Duggar. Hidrokloridjának fénylő sárga kristályos formáját látva aureomycinnek nevezték el. Ez a kissé fotoszenzitív, de levegőn stabil, szagtalan, keserű anyag vízben jól, alkoholban gyengén oldódik. Hidrokloridjának 1%-os vizes oldata savas (pH 3). Kapszulában hozzák forgalomba A táptalaj klorid tartalmát csökkentve, fölös mennyiségű bromid jelenlétében fermentációs eljárással előállítható a brómtetraciklin. A klór brómra cserélése a kémiai és biológiai tulajdonságában változást nem okoz. Az új antibiotikumok kutatása céljából végzett törzsizolálási program keretében több kutatóhelyen találtak aureomycint termelő törzseket (S.alboflavus, S.flavus, S lusitanus, S.sayamaensis). Közöttük olyan törzseket is izoláltak amely demetilklórtetraciklint és tetraciklint is termeltek. Tertraciklint először 1955-ben az aureomycin kémiai módosításával állították elő. Katalitikus hidrogénezéssel ugyanis könnyen eltávolítható a C-7 klórszubsztituens. A dioxán-metanol elegyben oldott aureomycint 10% palládium tartalmú szénkatalizátor és 1 mol trietilamin jelenlétében hidrogénezik. A redukció befejezése után a katalizátort kiszűrik, a szűrlethez vizet adva a terméket kristályosítják, szükség esetén vizes metanolból átkristályosítják. Aureomycint termelő törzs alkalmazásával is előállítható tetraciklin olyan kloridban szegény táptalajon amely a klórbeépítést szelektíven gátló vegyületet, például rodanidot (KSCN) tartalmaz. Ezzel egyidőben izoláltak olyan enzimhiányos mutánsokat, amelyek a klórozó mechanizmus hibája miatt csak tetraciklin szintézisére voltak képesek. Később más törzsek (S.alboflavus, S.antibioticus, S.aureus, S.californicus, S feofaciens, S.flareolus, S.flarus, S.lusitanus, S.parvus, S.rimosus, S.sayamaensis) fermentlevében is találtak tetraciklint, önállóan illetve oxyteracyclin, vagy chlortetracyclin mellett. A tetraciklin stabilabb és magasabb vérszintet ad mint a klórtetracyclin vagy az oxytetracyclin. A liquorban is jól mérhető antibiotikum szintet érhetünk el használatával. Hosszú ideig a humán terápiában a csoport legnépszerűbb tagja volt. Félszintetikus termékként ismert a minociklin (7dimethylamino-6-deoxy-6-demethyltetracyclin C23H27O7N3.HCl 457.5 Moltömeg) származék, amelyben a klór szubsztituenst dimetilamino csoport helyettesíti. Terramycin-t Finlay izolálta Streptomyces rimosus fermentlevéből 1950-ben. Hamarosan igazolódott, hogy szerkezete és hatásmódja hasonló az aureomycinéhez. Kémiai különbség, hogy a C-7 klórszubsztituens helyett a C-5 pozicióban egy hidroxil található. Később több törzs fermentlevéből is sikerült előállítani (S. alboflavus, S. antibioticus, S. cellulosal, S. platensis, S. flarus, S. flareolus S. fuscofaciens, S. parvus, S. vandergensis) . Pontos szerkezetét Hochstein igazolta 1953-ban. Az antibiotikum sűlyesztett fermentációs oxitetraciklin spontán inaktiválódása technológiával szójalisztet és keményítőt tartalmazó táptalajon előállítható. A kinőtt tenyészet antibiotikum termelésfokozása érdekében glükóz helyett előnyösebb pálma olajat adni szénforráskéntagolásával. A zsírsav jelenléte a glükóz neogenezis által táplált HMP út fokozott működésén keresztül a tetraciklinképződés szempontjából optimális NADPH szint kialakulását segíti. Az ellenőrzés nélkül képződő acetil-CoA pedig a bioszintézis szempontjából meghatározó jrelentőségű malonil-CoA ellátottságot biztosítja. Az oxytetracyclin (OTC) fermentléből való kinyerésére gazdaságos csapadékos eljárást használnak. Az oxálsavval savanyított fermentlé (kalcium mentes!) szűrletéből az antibiotikumot cetil-piridinium-bromiddal (sterogenol) kvaterner só formájában csapják ki. A kiszűrt csapadékot újra oldva sósavas metanolból klórhidrátként kristályosítják. Hidrokloridja vízben jól oldódik (500 mg.ml−1). pH=2 alatt és pH=8 felett azonban gyorsan bomlik. Vizes közegben való bomlása a tetraciklinhez hasonló inaktív termékek képződéséhez vezet. Kémiai szerkezetéből következően a sav hatására kialakuló anhidro származéka folyamatosan tovább alakul apovegyületté. Az oxytetracyclin szolgál kiinduló anyagként a Stephens 1958-ban megjelent közleményében leírt félszintetikus származék, a doxycyclin, mésnéven vibramycin (α-6-desoxy-5-hydroxytetracyclin, C22H24O8N2, 513 Moltömeg) előállítására. A kémiai félszintézis az oxitetraciklin 4N-klór-szukcinimiddel végzett klórozásával indul. A kapott klórhemiketálból vizelvonással hidrogén-fluoridban (H2F2) nyerjük az ugynevezett klórmetaciklint.
122
Nátrium-ditionittal végzett dehalogénezés vezet a kiindulási vegyületnél stabilabb metaciklinhez (6-methylen-5hydroxytetracyclin C22H22O8N2.HCl 478,5 moltömeg), amit gyógyszerként is forgalomba hoztak. A C6 hidroxilcsoport hiánya ugyanis stabilizálja a molekulát. A metaciklint ezután mérgezett palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezik. A reakcióelegyből sósavas etanollal az α-doxycyclin hemihidrát-hemialkoholát (hiklát) izolálható csekély víz jelenlétében. Ez a termék savanyú pH-nál stabil. A termék biológiai aktivitása a C6 metilcsoport helyzetétől függ. Az α helyzetben szubsztituált származék háromszor aktívabb az epimerjénél. Rhodium katalizátorral végzett hidrogénezés a hasznos termék képződése szempontjából előnyösebb. Ez a viszonylag savstabil vegyület szobahőmérsékleten hetekig megőrzi biológiai aktivitását a vérszérum körülményei között. Egy százalékos kalciumfoszfát oldatban 24 óra alatt mindössze 20-25 %-a inaktíválódik. Gram pozitív és negatív baktériumok, Spirochaeta, Rickettsia, Leptospira, Chlamydia, Actinomycetes fajok ellen kiemelten hatásos bakteriosztatikum. Nehezebben küzdhetők le a Proteus, Pseudomonas, Klebsiella, Aerobacter, Providencia fajok által okozott fertőzések. Keresztrezisztencia megjelenését tapasztalták az Escherichia coli, Staphylococcus, Pneumococcus fajoknál. A béltraktusból való felszívódása gyors, a szövetekben magas antibiotikum szint érhető el, sőt a szérumszint 20%-a mérhető a gerincvízben (liquor cerebrospinalis). Adagolásánál figyelembe veendő, hogy a placentában és az anyatejben is megjelenik. Igen hatásos a vizeletkiválasztó rendszer fertőzéseinek leküzdésére. Kémia stabilitása miatt lényegesen kisebb mennyiséggel lehet a bakteriosztatikus hatást elérni. A kapszulában forgalmazott termékből napi adagként 100-200 mg elegendő a hatásos vérszint eléréséhez. Tapasztalat szerint 96 óra alatt a bevitt hatóanyag az egészséges szervezetből kiürül. Az ábra a “vibramycin” (α−doxycyclin) adagolás utáni vérszint alakulását mutatja
123
KOLESZTERINSZINT CSÖKKENTŐ FARMAKONOK LOVASTATIN - Mevinolin- MEVACOR A heterozigótaként hordozott magas koleszterinszint (hiperkoleszterimémia 200-400 mg liter−1 LDL koleszterin) tragikus következményének elhárítására gomdolva évtizedek óta javasolja az orvostudomány a koleszterinszint radikális csökkentését. Homozigótaként magas koleszterin szintet öröklő egyedekben ez a kezelés aligha hozhat eredményt. A problematikus helyzet oldására az utóbbi évtizedek kutató munkája hatásos fiziológiai terápiás eljárást talált. A koleszterin szintézis nélkülözhetetlen építőelemének a mevalonsavnak a képződését gátolva gyakorlatilag a koleszterin képződést lehet akadályozni. A régebben kifejlesztett módszer a képződött szetrin epesav formájában történő eltávolítása csupán tüneti kezelés, mert a szervezetet genetikailag meghatározott szint elérésére - a hiány pótlására - több koleszterin képzésre ingerli. A magasabb rendű szervezetekben a szterin bioszintézist a mevalonsavképződést befolyásolva a koleszterin alloszterikus gátlószerként szabályozza. A XX. század utolsó negyedében Merck Sharp and Dohme gondozásában került a piacra a lovastatin hatásos népszerű koleszterin szint csökkentőként. A kutatócsoport (A. Endo és munkatársai) a hetvenes években elméleti meggondolásból a fungisztatikus hatású mikroorganizmusok között célzottan szterin-szintézist gátló mikrobiális eredetű vegyületet kerestek. Közel 8000 törzs biológiai aktivitását vizsgálták patkány máj enzim rendszerén in vitro. A Penicillium által termelt compactinról - későbbi néven mevastatinról - 1976-ban jelent meg az első közlemény. Később a compactin metilezett származékát az Aspergillus fajok tenyészlevében is megtalálták. Az első összefoglaló dolgozat a hetvenes évek végén jelent meg. (J. Antibiot. 32:852-54 1979) a Monascus ruber tenyészlevéből kinyerhető hatásos vegyületekről. A következő évben l980-ban A.V. Alberts és munkatársai Aspergillus terreus tenyészlevében találtak hasonló hatású hexahidro naftalénhez kapcsolódó heptánsavakat. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3957-61). A pravastatin savként kerül kiszerelésre. A többi "statin" lakton alakja a májban felnyílik és így létrjön a gátlás szempontjából fontos δ-hidroxisav. Jól tudott, hogy a mevalon-sav a szterinszintézis korai köztesanyaga. A lovastatin és rokonvegyületei, mint intracelluláris enzim-gátlók a mevalonsav képződés akadályozásával a magasabb-rendűekben a szterin képződést, a koleszterin szintézist gátolják. Szimultán megnő a sejtmembrán LDL-receptorainak száma ami viszont megköti a vérben keringő LDL-koleszterint. A bonyolult folyamat eredményeként csökken a vérplazma koleszterinszintje. Ezek a vegyületek az izeltlábúakban akadályozzák a juvenilis (fejlődési) hormon képződést, a növényekben és gombákban a szterin képződését. Valójában először ez a vegyületcsoport mint ismeretlen szerkezetű antifungális anyag került izolálásra. Később magyar szerzők Aspergillus obscurus nevű törzset izoláltak, amely tenyészlevében a lovastatint { β,δ-dihidroxi -7- [1,2,6,7,8,8a-hexahidro-2,6-dimetil-8-(2-metilbutiriloxi)-naftalén-1-il] -heptán-sav } δ-lakton formában, illetve szabad-savként tartalmazta. (US. Patent: 5,403,728. 1995).
mevalon-sav NADPH-reduktáz (Szterin szintézis: 144 oldalon) Ez a vegyületcsoport a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redukcióját kompetitíven gátolva akadályozza a mevalon-sav képződését, a mevalon-sav hiány viszont akadál2yozza a szterin szintézist. A kompetitív gátló hatás már 1 nM tartományban jelentkezik. Ez három negyságrenddel alacsonyabb mint a HMG-CoA diasszociációs állandója. Kémiai szintézissel készült a lovastatinnál gyengébb hatású fluvastatin, amely p-fluoro-benzoesavval szubsztituált N-izpropil-indolhoz kapcsolódó β,δ-dihidroxiheptánsav. Koleszterinszintet csökkentő hatása a lovastatinnál gyengébb (kb 50 %). A lovastatin kúra az esti étkezéshez kapcsolva 10-20 mg-os adaggal kezdhető, ami felemelhető 80 mg/nap dózisig. Közismert, hogy a koleszterin szintézis fokozott az éjszakai órákban. Lovastatin hatásaként ilyenkor 25-45 %-os csökkentés várható. Tovább csökkenthető 20-25 %kal az LDL koleszterinszint epesavkötő bázikus gyanták például trimetil benzilammónium csoportot hordozó stirén-divinil-benzol (cholestyramin) kopolimer, vagy dietiléntriamin és klór-2,3-epoxi-propánból készült vizoldékony kopolimer (colestipol) fogyasztásával.
124
De 15-20 % csökkentő hatás remélheő a nikotinsav (niacin) használatától. kedvező esetben mindent összevetve a genetikailag szabályozott LDL koleszterinszint 70 %-os csökkenése érhető el az élettani probléma három irányból történő megközelítéséval A mevalonsav oxidoreduktázt gátló "-vastatin" vegyületek bioszintézise a zsírsavszintézis feladatára kialakult enzimkomplexhez hasonló felületen történik. A savhordozó SH csoportban végződő oldalláncához kötődve malonil-CoA építőelemekből a zsírsav szintézisben résztvevő enzimek építik fel a sztearinsav méretű ∆8,14,16trienil-β,δ−dihidroxi-oktadecén-savat, amelynek telítetlen vége a templát erre szolgáló felületén naftilin származékká záródik. A hatásos biológiailag aktív termék a tioészter kötés hidrolízisével a szabad β,δ−dihidroxi-sav illetve β-hidroxi-lakton alakban hagyja el az enzimkomplexet. A bioszintézis befejező lépései a naftalin gyürűn hidroxil csoport kialakítása, illetve metil csoport felvétele. A légköri oxigén felhasználásával kiépített C8 szénatomra helyezett hidroxil csoportot a 2'-α-metil-butánsav acilezi. Ez a sav ugyancsak a zsírsav-színtézisben megismert reakciólépések felhasználásával készül acetil-CoA- és malonil-CoA építöelemekből.
Acetil-CoA pedig szénhidrátból, nevezetesen glükózból képződhet a glikolízis reakciólépéseit használva. Ez az út azonban katabolikus represszió alatt áll. Ezért a képződés növelése céljából a fermentációs szakasz megnyújtására törekedve további szénforrás adagolása szükséges. A katabolikus represszió kiiktatása céljából a szabályozó pont kikerülése szükséges. Az egyik lehetőség glükóz helyett glicerint illetve növényi olajat használni szénforrásként.
125
GRIZEOFULVIN Széles körben használt, sejtfalalkotórészként kitint tartalmazó fonalas gombák növekedését gátló hatóanyag.. Először Oxford és munkatársai izolálták 1939-ben a Penicillium griseofulvum ferment levéből. Néhány év múlv, 1946-ban Brian és munkatársai újból felfedezték Penicillium janczewskii tenyészetében. Kémiai szerkezetét csak 1952-ben ismerteti Grove. [7-klór-4,6,2’-trimetoxi-6’-metil-2’-grizén-3,4’-dion] Megállapították, hogy a grizeofulvin a gombafonalak rendellenes fodrozódását okozza. Biológiai aktivitásának mérésére gyenge vízoldhatósága miatt agardiffúziós módszer nem használható. A fermentlé griseofulvin tartalmát jellegzetes UV spektruma alapján mérik (UV maximum:324, 291, 252, 236 nm-nél Erősen kötődik a gomba ribonukleinsav frakciójához, de 4 °C-on a riboszómákhoz.. A komplexet melegítve a grizeofulvin felszabadulása észlelhető. Növekedő tenyészethez adott grizeofulvin leállítja a nukleinsav szintézist és a fehérje szintézist. A mitótikus sejtosztódáskor az orsó kialakulását zavarja. A hatás koncentrációtól függő: 10–5mol esetén a mikrotubulusok még normális szerkezetűek, de 5x10–5 mol koncentrációnál már dezorganizálódnak. A grizeofulvin gyógyászati felhasználása Gentles 1958-ban közölt észlelésével kezdődött: nevezetesen a tápcsatornába került hatásos anyag az epidermiszben feldúsul. A felszívódást elősegítendő a hatóanyag különleges eljárással előállított mikrokristályos formában kerül a tablettába. Adagolás után 4-6 órával a stratum corneumban jól mérhető a felszívódása.. A dermatofitonok jelentősebb képviselőinek a növekedését 0.1-0.2 µg/ml koncentrációban gátolja. A terápiás hatás céljából viszonylag hosszú időn keresztül kell a gátló koncentrációt fenntartani. Egy egyszerű bőrgombás fertőzés visszaszorítása céljából legalább három héten keresztül napi 500 mg hatóanyag bevitelét javasolják. A lábujjköröm gombás fertőzésének felszámolása 12 hónapig tartó kezelést igényel. Májkárosító hatása miatt alkalmazása csak az esetben javasolható, ha nincs más mód a fertőzés felszámolására. Az emberi szervezet enzimrendszere a grizeofulvint egy csökkent hatású 6demetil-cszármazékká alakítja, majd vízben jobban oldódó glükuronid származékként választja ki a vesén keresztül.
Penicillium patulum,illetve P. griseofulvum jóllevegőztetett tenyészetében literenként 10-12 g hatásos termék képződik.. Egy molekula acetil-CoA és 6 mol malonil-CoA kondenzációjával képződő poliketid a zsírsav szintézishez hasonló tiotempláthoz kötődik. Itt folyik vizkilépéssel az aromatizáció, a grzeofenon C képződés. Az aromás gyürű klórozását peroxidativ mechanizmus segíti, amihez a hidrogénperoxidot a glükózoxidáz szolgáltatja. Az oxigénfunkciók metilezése S-adenozilmetioninon segítségével történik. Az aromatizáció és a klórozás után különleges átmeneti gyök képződés segíti a két aromás gyürű kapcsolódását, a dehidrogrizeofulvin képződését. Az utolsó redukciós lépés aktíválja a molekulát grizeofulvinná. A tenyészetben melléktermékként megjelenik a 6-metilszalicil sav.
126
127
POLIÉTERKARBONSAV SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK Ezek a Gram-pozitiv mikroorganizmusok ellen hatásos vegyületek kokcidiosztatikus hatásukkal tünnek ki. Toxicitásuk miatt a humán terápiában nem kerültek alkalmazásra, viszont annál inkább jelentős a szerepük az állattenyésztésben. A csoport elsőként leírt képviselőjét, a nigericint Herned és munkatársai izolálták 1951-ben. A csoport másik népszerű tagját monensin néven a Streptomyces cinnamonensis ferment-levéből izolálták Amint az ábra mutatja a hatásos termék kémiailag egy poliketidből redukálódó polihidroxi-monokarbonsav,
amelyben a hidroxilcsoportok belső éterek képzésével vesznek rész a vegyületcsoportot jellemző poliéter gyűrűk kialakításában. A monensin és a rokon szerkezetű salinomycin valójában vízben alig oldódnak. A fermentlé általában több poliéter homológot tartalmaz. A változatok elsősorban a C gyürű melletti alkil-lánc méretében különböznek. Valójában a molekula kristályos formában gyűrűs szerkezetű. A terminális tetrahidropirán gyűrűn levő tercier hidroxil csoport hidrogén kötéssel kapcsolódik a karbonsav csoporthoz. Az így kialakuló gyűrű külső fele hidrofób, a belső rész viszont hidrofil az ott elhelyezkedő oxigén atomok jelenléte miatt. Az antibiotikus hatást viszont éppen ez a szerkezet biztosítja azáltal, hogy a lipofil membránba egy hidrofil alagutat alkotva növeli a membrán átjárhatóságát mindkét irányban. Nem csak a fémionok (Na+, K+), de a proton számára is szabad utat biztosít azáltal, hogy az ionokkal lipidoldékony komplexet alkot. Ez a kétirányú működés nem ad lehetőséget az ionáramlás mértékének elektromos mérési adatokkal való jellemzésére. MUPIROCIN, Pseudomonin sav 9-[(2E)-4-[(2S,3R,4R,5S)]-5-[(2S,3S,4S,5S)-2,3-Epoxy-5-hydroxy-4methylhexyl]tetrahydro-3,4-dihydroxipyran-2-yl-3-methylbut-2-enoyloxy]nonanoic acid. — Fuller és munkatársai egy Pseudomonas fluorescens (NCIB-10586) tenyészlevéből izoláltak egy biológiailag aktív (C26H44O9 = 500.6) összegképletű savanyú kémhatású 77-78 °C-on olvadó, metanolban optikailag aktív ([1α]20 =–19.3°, ) anyagot, amely különösen hatásos Gram pozitív multi-rezisztens Staphylococcus és streptococcus baktérium törzsek (MIC 0.01-0.25 ug/mL) és Haemophilus influensae, Neisseria spp. továbbá mycoplazmák ellen. Listeria monocytogenes ( 8 ug/mL), Erysipelothrix rhusiopathiae. Ezenkívül Candida albicans okozta fertőzés leküzdésére is alkalmas. Hughes és Mellows (1978) szerint az izoleucil tRNS szintézist akadályozva gátolja a riboszomális fehérjeszintézist. Az antibiotikum termelés optimális hőfoka 30 °C; 1% kukorica lekvárt, 0.5% glükózt és 0.5% melaszt tartalmazó táptalajon. A gyulladásos bőrfertőzés, ecsema, follikulus ellen hatásos kenőcs 2%-nyi hatóanyagot tartalmaz.
Hatónyagént mupirocint tartalmazó készítmények:Bactroban, Eismycin, Lismycin, Plasimine, Bactroban Nasal.
128
POLIÉN FUNGISZTATIKUMOK A szakirodalom több mint kilencven hatásos antimikotikumot tart számon ebben a csoportban. Gyógyászati alkalmazásra azonban közülük csak néhány került. Kémiai szerkezetükben megegyeznek. Konjugált kettőskötéseket tartalmazó nagytagszámú (26-38 szénatom) makrolid laktongyűrűhöz egy aminocukor kapcsolódik. Ez a szerkezet a jellemző infravörös spektruma és karakterisztikus UV spektruma (200-400 nm) alapján könnyen felismerhető. A konjugált kötések miatt viszonylag merev molekula poláros oldalát a nagy számban található hidroxilok alkotják. Az aminocukor, a mikozamin (3-amino-3,6-didezoxi-D-mannopiranóz) glikozid kötéssel kapcsolódik az aglükon poláros és apoláros részének határán levő hidroxilhoz. Az antibiotikum kémiai szerkezetéből következik a gyenge vízoldékonysága, a fényérzékenysége és a biológiai membránok szerkezetére kifejtett károsító hatása. A poliénnek a membrán szterin építőelemeivel való kölcsönhatása lazítja fel a plazmalemma szerkezetét. A membrán polién érzékenysége a szterin és a foszfolipid alkotórészek moláris arányától függ. A permeablitás megváltozása a sejt iontartalmának a közeg elektromos vezetőképességmérésével is kimutatható kiáramlását okozza, amit az RNS szintézis és a fehérjeszintézis leállása követ. A permeábilitás változása két irányú. Bizonyos gyógyszerek felvétele elősegíthető egyidejű polién adagolással. Polién antimikotikumok gombaellenes hatása (MIC mg/ml) és toxicitása Saccharomyces cerevisiae
Candida albicans
Aspergillus niger
Fehér egér(LD50)
Amphotericin B 0,09-0,5 mg/ml 0,15-3,7 mg/ml 0,09 mg/ml 8000 mg/kg Nystatin 0,80-3,1 mg/ml 1,20-3,1 mg/ml 2,00 mg/ml 8000 mg/kg Candicidin 0,03 mg/ml 0,04 mg/ml 0,83 mg/ml 400 mg/kg Primaricin(natamycin) 0,9-15,0 mg/ml 3,00-6,0 mg/ml 1,8 mg/ml 1500 mg/kg Flavofungin 3,0-20 mg/ml 4,00-5,0 mg/ml 31,0 mg/ml 250 mg/kg A kedvező toxicitási adatokat az anyagok rossz felszívódása magyarázza. A táblázatban felsorolt gombás fertőzések leküzdése céljából forgalomba hozott vegyületek éppen rossz felszívódásuk miatt a szisztémás gombás fertőzések ellen gyakorlatilag használhatatlanok. Elisabeth L. Hasen és Rachael Braun 1949-ben izolálta a Squibb & Sons, (eorges Road. New Brunswick, New Jersey U.S.A.) által nystatinnak elnevezett fungisztatikus hatású anyagot egy talajmintából származó Streptomyces noursey tenyészlevéből. (Science 1950. 112: 423 ; Proc. Soc. Exptl. Boiol. Med. (1951) 76: 93 ) [NCIB 8593. US Patent 2797183] — A tenyészléből eukariota fehérjeszintézist gátló cikloheximid is izolálhatól. Kémiai szerkezetét Chong és Richards közölte 1970-ben. A nystatin A összegképlete: C56H73O18N. ( J D. Dutcher et al. Antibiotics Annual 1953-54:191) A kromofor egy konjugált tetraén és egy különálló dién rendszert tartalmaz. A 38 tagú makrolídgyűrűn nyolc hidroxil és két oxo csoport, valamint egy karboxil csoport található. A fermentlében található 10%-nyi B komponens egy szénatommal és két hidrogénnel nagyobb molekula. Kémiai szerkezetéből következik gyenge vízoldhatósága, hő, fény és oxigén érzékenysége, valamint a halványsárga-drapp színe. A bioszintézist bemutató vázlat szerint a makrolid (nisztatinolid) gyűrű három propionát és 16 acetát egységből épül fel. A bioszintézis a zsírsavzintézis templátjához hasonló enzimkomplex felültén folyik malonil-CoA építőelemekből (lásd: Bioszintézis ábra) Az itt képződő polién-lánc indító tagja általában valamilyen acil-CoA (acetil-CoA, propionil-CoA, candicidin esetében p-amino-benzoil-CoA). A Zsírsav szintézis és a polién szintézis közötti hasonlóságra mutat az a tapasztalat, hogy mindkét bioszintézist gátolja a cörulamin [ 2(S),3(R)-epoxi-4oxo-7,10-dodekadienoil-amid ], ez a 12 szénatomos szírsavamid azáltal, hogy a β-ketosavhordozó-fehérje szintetáz alegységé-hez kötődve akadályozza a lánchosszabbító lépést katalizáló enzim működését. A 38 tagú nisztatinolid gyűrű bioszintéziséhez egyetlen molekula képződésekor a β-ketoacil-szintetáz 18, a β-ketoacil reduktáz 17, a hidroxiacil dehidráz 7, a NADPH-függő ∆2-reduktáz pedig mindössze egyetlen esetben lép működésbe. A bioszintézis befejező lépése minden esetben a laktonizáció, amely az elkészült gyűrűnek a bioszintézist végző enzimkomplexről való leválását is jelenti. Bioszintéziséhez intenzív szénhidrátanyagcsere és jó oxigénellátottság szükséges, nemcsak a molekula építőelemeiként szereplő acetil-CoA képződése szempontjából, hanem az acetil-CoA karboxilezéséhez
129
szükséges 16 ATP, valamint a makrolid karbonilcsoportjainak redukciójához szükséges 18 NADPH biztosítása céljából is. A kromoforon található karboxil csoport az egyik propionátból származó metilcsoport utólagos oxidációjának az eredménye. A karboxil közelében levő keto csoport nagy valószínűséggel egy belső éterkötésben van elrejtve. Nystatin B esetében az indító építőegység az acetil-CoA helyett propionil-CoA. A kész aglükon valószinüleg egy lipofil hordozó molekula segítségével jut el a plazmalemmához, ahol megtörténik a mikozaminnal való kapcsolódás β-glikozid kötéssel. A mikózamin bioszintézise a már eddig megismert makrolid antibiotikumok szénhidrát komponenseinek képződéséhez hasonló módon folyik. Glükóz-1-foszfátból kiindulva timidintrifoszfáttal reagálva pirofoszfát felszabadulása mellett képződik a timidildifoszfoglükóz, amit egy NADfüggő oxido2reduktáz egy víz kilépése mellett TDP-4-oxo-6dezoxi-D-glükózzá oxidál. Ezt a reakciólépést egy enolizációval összekapcsolt epimerizáció követi. A képződő TDP-3-oxo-6-dezoxi-D-glükózt egy piridoxál foszfátot tartalmazó amináz TDP-3amino-3,6-didezoxi-D-glükózzá alakítja. A befejező lépés egy epimerizáció, ami a C2 hidroxil térállását érinti. A képződött.TDP-3-amino-3,6-didezoxi-D-mannopira-nóz egy membránhoz kötött glikozilező enzim segítségével reagál a makrolid gyűrű polién szakasza után következő első hidroxillal. Ez a reakció segíti a membránon való áthaladást. A hatóanyagot termelő törzs aszparagin-glükóz tartalmú agar táptalajon (0.1 % L-aszparagin, 0.1% káliumdihidrofoszfát, 0.1 % vasszulfát, 1 % glükóz, 2 % agar) növekedve egy hét után szürkés-lila spóratömeget fejleszt. Az agartenyészetről lemosott spóratömeg vizes szuszpenziója lefagyasztva csirázóképességét félévig megtartja. A spóraszuszpenzióval rázott inokulum táptalaj oltandó amely 2 % kukoricalekvárt, 2 % glükózt, 0.2 % nátriumkloridot, 0.2 % káliumdihidriofoszfátot és 0.01 % vasszukfátot tasrtalmaz semleges pH-n Az inokulum tenyészet 28 °C –on 36 óra alatt átoltásra alkalmassá fejlődik. — A főfermentációs táptalaj 1% kukoricalekvárt, 1 % szójalisztet, 0.3% ammoniumnitrátot, 0.6 % kalciumkarbonátot, 0.02% vasszulfátot tartalmazott. Habgátlóként pálma olaj használtatott. —A gazdaságos nystatin fermentációs eljárások jól levegőztetett körülmények között folyamatos glükózadagolással biztosítják az antibiotikum szintézishez szükséges optimális körülményeket. A képződő termék a fermentlében alig oldódva kristályosan kiválik, elsősorban a termelő mikroorganizmus felületére. Mennyisége a mikroorganizmus szárazsúlyának többszörösét teheti ki. A fermentáció befejeztével a fermentlé szűrésével 70-80% hatóanyagot tartalmazó nyers termék különíthető el, amiből szárítás után kalcium-kloridos metanollal oldható ki a nystatin. A tenyészlé nystatin tartalmának meghatározására is a metanolban való oldhatóságát használják. A centrifugált üledék metanolos szuszpenziójából nyert szűrlet hatóanyag tartalmát UV elnyelése alapján spektrofotométerrel, vagy biológiailag - mérőtörzsként Candida albicans oltóanyagot használva - agardiffúziós módszerrel határozzák meg. A nystatin világszerte elterjedt népszerű fungisztatikum. A gyógyszerpiacon elfoglalt előkelő helyét az magyarázza, hogy elsőként került forgalomba és azóta sem sikerült sokkal jobbat találni nála. Több évtizedes alkalmazása ellenére rezisztencia csak szórványosan jelentkezett. A kisérleti eredmények több esetben a membránban a foszfo-lipid:szterin arány megváltozását valoszínüsítik a rezisztencia okaként. Park és munkatársai egy rezisztens élesztő törzs membránjában ergoszterin helyett 8,22-ergosztadién-3β-ol jelenlétét igazolták. Gyógyszerként egyrészt tablettában kerül forgalomba a bélben normál körülmények között is létező gombák fokozott szaporodásának gátlása céljából, másrészt kenőcs formájában a bőrfelületen jelentkező fertőzések leküzdésére használják.
130
131
Amphotericin B Venezuelából származó talajmintából izolált Streptomyces nodosus tenyészlevéből Gold és munkatársai izolálzák 1956-ban ezt a fungisztatikus hatású anyagot. A fermentlében található két rokonvegyület közül a B komponens az aktívabb. Baktériumokra, virusokra, protozoákra hatástalan, gomba spektruma viszonylag széles. Szisztémás gombás fertőzések leküzdésére is alkalmazzák mérsékelt eredménnyel. Az amphotericin B, amint a neve is mutatja amfoter tulajdonságú, 50%-os izopropanolban oldva semleges körülmények között stabil. Lúgos és savanyú körülmények között inaktíválódik. Metanolos oldata 363, 382, és 406 nm-nél nyeli el a fényt. Izoelektromos pontján vízben oldhatatalan. A bélcsatornából gyakorlatilag nem szívódik fel. Szisztémás fertőzések leküzdésére intravénás adagoláskor dezoxikólsavas kolloid szuszpenzió formájában alkalmazzák. Parenterális alkalmazása vesekárosító hatású. Kémiai szerkezetét Mechlinski és Borowski ismertette 1970-ben. Összegképlete : C47H75O17N. A nystatin szerkezetétől való eltérés egy kettős kötésben jelentkezik (heptaén). A C-13 és C-17 között kialakuló belső éterkötés fokozza a molekula merevségét és vízoldhatatlanságát. Poliének hatásmódja A polién fungisztatikumok az eukarióta citoplazma szterin építőelemeihez kötődve a membrán áteresztőképességét növelve akadályozzák a gomba növekedését. A sejt beltartalmának kiáramlása egyszerűen, elektromos vezetőképességmérővel is jól észlelhető. A szterin-polién asszociátum képződése in vitro is észlelhető. Ezért nem meglepő, hogy koleszterint tartalmazó tápközegben a polién hatástalan.
Amphotericin hatásmódjának vázlata A fungisztatikum két funkciós csoportján hajtottak végre kémiai átalakítást. A karboxil csoport észteresítése nem befolyásolta a biológiai aktivitást, a mikózamin aminocsoportjának acilezése viszont inaktíválta a molekulát. A metilészterből képzett hidroklorid vízben jól oldódik, de ez nem befolyásolja a bélből való felszívódását, mert az észter könnyen hidrolizál.
CANDICIDIN Az aromás csoportot tartalmazó poliént Lechavalier találta 1953-ban egy Streptomyces griseus tenyészlevében. Később mások is leírták ezt az aromás heptaen makrolidot (Hosoya 1953, Umezawa 1954) trichomycon, illetve hamycin néven. Antifungális gyógyszerként 1964 óta használják. Különösen hatásos a moniliázis leküzdésére. Toxicitása miatt csak lokálisan alkalmazzák. Az amphotericinhez hasonló szerkezetét megnyugtató módon ezideig még nem igazolták. Összegképlete: C63H85O19N2 . Metanolos oldata 364, 384 és 406 nm-nél nyeli el a fényt. A cukorkomponens itt is mikózamin, az aromás alkotórész pedig p-amino-acetofenon. Bioszintézise p-aminobenzoesavval indul.
132
PRIMARICIN, NATAMYCIN A Streptomyces natalensis által termelt fungisztatikus hatású anyagot Struyk és munkatársai izolálták 1957-ben. Ugyanez évben Arcamone és munkatársai egy homológját nyerték ki Streptomyces lucensis tenyészlevéből. 1960-ban tetrin néven Gottlieb is leírta egy Streptomyces törzs termékeként. Az antibiotikum aglükonja viszonylag kisebb az előbbiekkel összehasonlítva, mindössze 26 tagú, négy konjugált kötést tartalmazó makrolid, amelyben tetraén szakasztól távol még egy telitetlen kötés fordul elő. Összegképlete: C33H47O13N . Különlegessége az oxirán gyűrű.
A fényre és levegőre érzékeny anyagot kálium-nátrium klorofillin stabilizálja. Bioszintézise során 12 acetát és egy propionát egységből épül fel az aglükon a megfelelő malonil- illetve metilmalonil-CoA kiindulási termékekből. A cukor komponens ez esetben is mikózamin. Élesztők, szaprofita gombák és humán patogén gombák ellen hatásos. Különösen a Trichophyton violaceum és Aspergillus fumigatus fertőzés leküzdésére használják. Intraperitoneálisan a hasüregbe juttatva tízszer toxikusabb a nystatinnál, per os adva csak háromszor annyira toxikus. Szisztémás fertőzés esetén nem használják. Dermatomikózisokon kívül, különösen Trichomonas vaginalis fertőzés kúrálására sikerrel alkalmazható. Ennek megfelelően kenőcsökben, plietilénglikolt tartalmazó szuszpenziókban vagy hüvelybe helyezhető készítmény formájában hozzák forgalomba. Sok előnyös kombinációban szerepel fontos alkatrészként kortikoidokkal, vagy más szélesebb spektrumú antibiotikumokkal együtt. A Primafucort vazelinkenőcs grammonként 10 mg natamycint, 10 mg hidrocortizont és 3.5 mg neomycin szulfátot tartalmaz. FLAVOFUNGIN Tárgyalását elsősorban magyar vonatkozása indokolja. Uri és Békési találták a Streptomyces flavofungini tenyészlevében l958-ban. Fényre és a levegő oxigénjére különösen érzékeny vegyület.
Kémiai szerkezetét Bognár és munkatársai deritették fel. A fermentlében található két komponens összetétele egy metilén csoportban tér el. Összegképlete: C66-67H58-60O10 . A hosszabb láncú homológ kb 10%-ban képződik. A 31 tagú makrolid gyűrűben egy konjugált pentaén szakasztól függetlenül még egy telitetlen kötés található. Különlegessége, hogy sok esetben — így az ábrán szereplő aglükon — nem tartalmaz mikarózt. Ez.esetben nem csak a gombák szaporodását, de néhány megvizsgált baktérium, így a Bacillus subtilis és a Micrococcus pyogenes növekedését is gátolja.
CIKLOHEXIMID, ACTIDION, NARAMYCIN {3–[2–(3,5--dimetil–2–oxociklohexil)–2–hidroxi-etil]–glutárimid} A Streptomyces törzsek által termelt, gombák növekedését gátló 281,4 moltömegű C15H23NO4 vegyületet először a sztreptomycint termelő Streptomyces griseus fermentlevéből izolálták. Később több törzs termékeként, eltérő néven izolálták.ezt az alkoholban jól oldódó ciklohexil származékot. Actidiont termel a Squibb kutatói által izolált nystatint termelő Streptomyces noursey Az eukarióták riboszómán folyó fehérjeszintézisét gátló hatása miatt a mikrobiológiai kutatómunka fontos szereplőjeként ismert vegyület..(Obrig,T.G et al. J.Biol.Chem 246:174 (1971) 133
PRIMYCIN. Thermopolyspora galeriensis makrociklusos széles spektrumu antibiotikumot termel, amit Ebrimycin néven gél formájában különböző bőrfertőzések, fekélyes bőrfelületek, égési sérülések kezelésére alkalmazzák gyulladásos folyamatok leküzdése céljából (Szilágyi és munkatársai 1984) A Gram poztív baktériumok ellen baktericid, a Gram negatívokra bakteriosztatikus hatású. Az ATP-áz gátlásán keresztül fejti ki hatását.
A hatásos anyagot Vályi-Nagy Tíbor és Úri József (1954) egy viaszmoly (Galeria melonella) béltraktusából izolált Streptomyces primicini tenyészlevéből mutatták ki. Az antibiotikus hatást mutató készítmény A, B,és C főcsoportba sorolható. Ezek mellett 12-15 biológiailag hatásos anyag keveréke alkotja a hatásos asszociátumot. Guanidino csoportot tartalmazó makrociklus szerkezetére DeMAYO 1974-ben tett javaslatot, amit 1987-ben FRANK a fentiek szerint módosított
134
TERPÉNEK AZ EUKARIOTA SZERVEZETEKBEN Az eukarióta sejtek lipidfrakciójában fontos szerepet töltenek be a terpének, különböző szterin származékok, mint a membrán rendszer nélkülözhetetlen alkatrészei. Nem meglepő, hogy szekunder metabolitként több bilógiailag aktív termék került közülük a gyógyszerpiacra.
Lanoszterol * A szterin szintézis oxigént igényel, ezért az élesztők anaerob körülmények között nem képesek szaporodni
135
FUMAGILLIN
Ezt a vegyületet1951-ben izolálták Eble és Hanson Aspergillus fumigatus fermentlevéből. A savanyú karakterű telitetlen vegyület szerkezetét csak 1960-ban közölték Tarbell és munkatársai. A molekula egy terpenoid mag dekatetraéndikarbonsav észtere. Az etilacetátban jól oldódó, fényérzékeny, mérgező anyag; –18 °C-on bomlás nélkül tárolható. Kémiailag {3R-[3α,4α(2Ro,3Ro)75β,6β(a11-E)]}-mono (-5-metoxi-4-[2-metil-3-(3metil-2-butenil) oxiranil]-1-oxaspiro[2,5]oktán-6-il 2,4,6,8-deka-tetraéndion sav. N,N-diciklohexilamin sója. Móltömege 639.88. A terpén mag három mevalonsavból képződő farnezil-pirifoszfátból – a szterin szintézis köztes termékéből – alakul ki intramolekuláris átrendeződéssel több oxidációs lépésben. Az utolsó lépsben a dikarbonsav kapcsolódik észterkötéssel a terpén szabad hidroxiljához A vegyület erős amöbicid hatásáról ismert. Az Entamoeba hystolytica elpusztítására már 0,01 µg/ml koncdentrációban is hatásos. Kevéssé toxikus. LD50 = 800 mg/kg subcutan (bőr alá) adagolva. Krónikus amőbiázis esetén per os adagolva naponta kétszer 10 mg a hatásos adag. Méhészek a méh-nozéma kezelése céljából a kaptár elé tett cukor sziruphoz keverik.
136
FUSIDINSAV Godfredsen izolálta 1960-ban egy Fusidium coccineum gomba fermentlevéből. Már az első közlemények kiemelték a Gram pozitív rezisztens mikroszervezetek elleni hatásosságát és kedvező toxicitási adatait. A Staphylococcus elleni küzdelem fontos antibiotikumként tartja számon Kémiailag négy gyűrűs triterpénsav. A szteroid váz B gyűrűje kád formáju, a gyűrűk pedig transz-cisz-transz kapcsolódást mutatnak. Az oldallánc telítetlensége a molekula merevségét okozza.l Kémiai szerkezete a 2,3oxidoszkvalénből induló szteroid bioszintézis korai fázisát rögzít, amennyiben a gyűrűzárási reakció után csak egy metil csoport eltávolítása történik meg. A 21 metil oxidációját a 17,20 kettőskötés stabilizáló szerepe miatt nem követi dekarboxilezés. A bioszintézis a 11 és 16 helyzetben hidroxilezéssel, majd ez utóbbi csoport acetilezésével fejeződik be. Szteroid antibiotikumot már ez előtt is találtak. Chain 1943-ban írja le az Aspergillus fumigatus fer,mentlevéből izolálható helvolinsav antibakteriális hatását. Burton és Abraham 1951-ben a Cephalosporium acremonium tenyészetében előforduló szteroid antibiotikumot írja le cephalospori-P1 néven. Ezek a fehérjeszintézist gátló vegyületek az oxigénfunkció helyében, illetve a telitetlenség mértékében különböznek a fusidinsav szerkezetétől. A fusidinsav in vivo és in vitro a riboszóma–EF–G–GDP komplex disszociációját akadályozva zavarja a fehérjeszintézis transzlokációs lépését. A biológiai hatás szempontjából esszenciális az α,β-telitetlen karboxil csoport és a C-16 helyzetben levő β-helyzetű acetoxi csoport. A molekula a vegyészek számára hálás model volt. A szteroid kémiából jól ismert módszereket alkalmazva több száz fusidinsav származékot állítottak elő. Kémiai labilitásuk miatt csak elméleti érdekességűek voltak. A kémiailag előállított β-16 acetiltio fusidinsav a természetes fusidinsav antibiotikus hatását jelentősen meghaladja.
A fusidinsav kémiai szerkezete A fusidinsavval szemben kialakuló rezisztencia egyik módja az elongációs faktor szerkezetének megváltozása. Ez esetben az antibiotikum nem kötődik a fehérje szintetizáló rendszerhez. Több közlés említi. hogy a Staphylococcus plazmid nem inaktíválja a molekulát, hanem hatására az antibiotikum kizáródik a baktériumsejtből.
137
GIBERELLINSAV KÉPZŐDÉS Az egyik hatásos terpén származék a Giberella fujikuroi (imperfekt alakja Fusarium moniliforme) által termelt növényi hormon, a giberellin sav, amely ugyancsak a szterin szintézis fő vonalából ágazik ki de végeredményben terpén származéknak tekinthetők a Claviceps nemzetség által előállított anyarozs alkaloidok
138
Claviceps purpurea alkaloida termelése
139
RÁKOS MEGBETEGEDÉSEK ELLEN HATÁSOS ANTIBIOTIKUMOK CSOPORTJA A rák elleni küzdelemben a kemoterápia meglehetősen későn jelent meg a küzdőtéren.. 1954-ben az amerikai rákterápiával foglalkozó intézet (National Cancer Institute) kezdeményezésére széleskörű, költséget és fáradtságot nem kímélő program indult. Kutató csoportok, egyetemi intézetek, ipari kutatóhelyek kapcsolódtak a munkába. Hamarosan nemzetközivé fejlődött a rák elleni küzdelem. Vegyületek tízezreit próbálták ki először állati tumorok ellen, majd siker esetén szigorú toxicitási vizsgálatok után embergyógyászati alkalmazásukat is megkisérelték. A program keretében nem csak jól ismert, illetve kémiai szintézissel nyert vegyületeket próbáltak ki, de a legkülönfélébb forrásból származó természetes eredetű anyagok tumorgátló hatását is megvizsgálták. Így a növényi kivonatok mellett a mikrobiológiai eredetű anyagok, köztük az antibiotikumok is sorra kerültek. Az aktinomycinek és a bleomycinek részletes tárgyalására a depsi-peptid jellegű termékek között sor került.
A kiválasztott vegyületcsoportok kémiai szerkezete egymástól jelentősen eltér. Közös jellemzőjük a kémiai szerkezetükből következő élénk vörös színük és az erősen citotoxikus tulajdonságuk. Terápiás indexük alacsony. Mindegyikük valami módon a DNS molekulával lép kölcsönhatásba. A rákterápiában felhasznált vegyületek közös hibája, hogy a hormonanalógok kivételével nincs szelektív hatásuk. Emiatt a rákellenes küzdelemben nem kerültek az orvosi praktikum élvonalába. Ma is a felismert tumor sebészi eltávolítása és a sugárterápia amit 140
széleskörűen alkalmaznak.. A kemoteerápia csak ezzel párhuzamosan, utókezelésként, inoperábilis esetben, metasztázis jelentkezésekor jut szerephez. A rákellenes antibiotikumok alkalmazása sok esetben a daganat átmeneti visszafejlődését eredményezve, a tünetek enyhülését, mindenképen az élet megnyújtását jelenti. Citotoxikus hatá suk elsősorban a gyorsan növekedő és osztódó ráksejteket pusztítja, de jelentős mértékben károsítják a szervezet immunrendszerét is. Ezek a vegyületek azokat az egészséges szöveteket is károsítják, amelyekbn a fehérjeszintézis, illetve a sejtosztódás funkcionális okokból fokozott mértékű. Így a vérképző szervek, a nemi szervek, a hajhagyma, a bélnyálkahártya sejtjei károsodnak leginkább ezen vegyületek alkalmazásakor. A chromomycinek csoportjába sorolt mithramycint a Streptomycesargillaceus és a Streptomyces tanashiensis tenyészlevéből mutatták ki Rao és munkatársaio 1962-ben. A klinikumban 1970 óta használják. Ide sorolható a Gause által S olivorecticuli tenyészetéből 1962 ben izolált olivomycin.. Szerkezetüket 1968-ban Bakhaeva közölte. A két antibiotikum az aglükon réstben is különbözik egymástól. Amennyiben az olivin metilezett homológjának tekinthatő a mithramycin aglükonja a chromomycin. A cukorkomponernsben olivomikoz helyett D mikarózt találunk. A mithramycin a DNS-el alakít komplexet. Magnézium jel0enlétében a guanin bázishoz kötődik. A cukor rész is résztvesz a kapcsolat erősítésében. A cukor komponens méretének a csökkentése növeli a disszociáció lehetőségét és ezzel gyengül a biológiai hatása. A DNS vírus irányított RNS szintézist akadályozza. Különösen gátolja az uracil beépülését a kismolekulájú RNS-be (5sRNS). Hatással van a DNS replikációra, azaz gátolja a vírus szaporodásdát, de nem befolyásolja az RNS vírus szaporodását és nem zavarjaa reverz transzkriptáz működését. A poliketid vázból kialakuló rákellenes antibiotikumok közül az antraciklin tipusú kromomicinek gyógyászati alkalmazása világszerte ismert. Az 1974-től klinikai kipróbálásra került daunomycint (daunorubicin) Di Marco 1963-ban izolálta Streptomyces peuceuticus tenyészlevéből. A daunorubicin kémiai szerkezetének felderítését Arcamone és munkatársai 1968-ban közölték. Az antibiotikum savas hidrolízisével a vörös színű vízben oldhatatlan aglikonhoz (daunomycinon) jutottak. amelyhez a vízoldható cukorkomponens, a daunózamin — 2,3,6-tridezoxi-3-amino-L-lixohexóz — kapcsolódik glikozidos kötéssel. Az aglikon illetve a cukorkomponens kémiai módosítása gyengíti a biológiai hatást. Ugyancsak ők izolálták 1969-ben a daunomicin 14C hidroxi származékát, az adriamicint az előbbi törzs caesius nevű variánsának fermentlevéből. A két vegyület közötti különbség mndössze egy hidroxi csoport, mégis a hatás szempiontjábol ez nem elhanyagolható. A daunomycin fő indikációs területe a "fehérvérűség". Különösen a gyermekekben kifejlődő limfoid leukémia esetén,de a Hodkin-kór, a lymphosarcoma és a retikuléris rendszer szarkomás eseteiben is alkalmazzák. A szívre való toxikus hatása miatt más citosztatikumokkal kombinálva használják. A kevésbé toxikus hidroxilezett származék a doxorubicin az acut leukémia gyógyításán kívül az Ewing szarkoma, a neublastoma, a Wilms tumor és osteogén szarkomák esetében is hatásosnak bizonyult, sőt mell- és tüdőrák esetében is eredményesen használják. Gyógyszerként a vörös, kristályos hatóanyag, jól felszívódó vízoldható hidrokloridját általában infúzióban adagolják. Könnyen jut át a sejthártyán és a sejtmagban feldúsulva fejti ki hatását. Terápiás indexe alacsony. Mellékhatásként nem csak a szívizomra hatva, alacsony vérnyomást , digitálisszal nem enyhíthető szívelégtelenséget, aritmiát, tachicardiát okoz, de a csontvelőt is károsítja. Az antraciklinek a DNS bázisok közé ékelődnek, miközben a cukorkomponens aminocsoportja ionosan kapcsolódik a dezoxiribózfoszfátlánchoz. A DNS-hez való kötődése olyan erős, hogy in vitro a DNS bontó enzimek hatását is akadályozza. A 60-100 nukleotidonként kötődő egy-egy daunorubicin molekula in vitro az RNS polimeráz működését is akadályozza. Különösen erősen gátolja in vivo a riboszómális RNS szintézisét. Természetesen nem csak a DNS-függő RNS szintézist, de a DNS replikációt is akadályozza. A mitramicint a Streptomyces argillaceus és a S. tanashiensis tenyészlevéből mutatták ki Rao és munkatársai 1962-ben. A klinikumban 1970 óta használják a malignus hypercalcaemia kezelésére. A gyógyszerként felhasználásra kerülő sárga kristályos hatóanyag mannittal és nátriumfoszfáttal pufferolva infúziós formában kerül felhasználásra. Terápiás indexe igen alacsony. Mellékhatásként a kialakuló hypocalcaemia a véralvadás kalcium igényét érinti, de kárositja a vese, a máj és a vörös csontvelő működését A mitramicin a DNS-val alkot komplexet. Kétértékű kationok, előnyösen magnézium jelenlété-ben a guanin bázishoz kötődik. Általában négy bázispáronként kötődik egy antibiotikum. A kapcsolat stabilizálásában a cukorkomponens is résztvesz. A cukorkomponens méretének csökkenése gyengíti a biológiai hatást. A DNS virus irányította RNS szintézisrt erősen gátolja, de hatással van a DNS szintézisre is, gátolja a DNSvirus
141
szaporodását. Kifejezetten gátolja az uracil beépülését a kismolekulájú RNS-be (5sRNS). Nem befolyásolja viszont az RNS virusok fejlődését, nem zavarja a reverztranszkriptáz működését. A mitramycin fémionokkal (Fe++) oldhatatlan chelátot képez. Savas közegben pH=4 alatt a cukorkomponens könnyen hidrolizál az aglükonról, amely inaktív. Ugyanekkor 1962-ben izolálta Gause a S. olivorecticuli által termelt olivomicint, amelynek aglikonja a mitramicin demetilezett változata. A cukorkomponens is eltérő, mert a mitramicin olivomikóz helyett Dmikarózt tartalmaz. A citosztatikus mitozánok legismertebb képviselőjét a mitomycint Streptomyces caespitosus fermentlevéből Hata és munkatársai izlálták 1956-ban. A kereskedelmi forgalomba került mitomycin-C 1965-óta Japánban 1974-től pedig az USA-ban is engedályezett rákellenes gyógyszer. Alkoholban jól, vízben gyengén oldódó vörös kristályos anyag. Intravénás injekció formájában használják. Különösen a gyomor, bél, végbél és hasnyálmirigy adenokarcinoma kezelésére használják. Toxikus mellékhatása a csontvelő működését és az immunrendszert károsítja, bőrkiütést, gyakran az emésztőrendszer zavarát okozza A hatóanyag az aziridin szerkezetű színes mitozánok csoprtjába tartozik. Gátolja a DNS függő RNS polimeráz működését. Citosztatikus hatása valószinüleg a DNS-val való kovalens kötéssel kialakított kölcsönhatás eredménye.
A hatóanyag kinoidális szerkezetének az átrendeződése a sejt redukáló belső körülményei között egy szemikinon szerkezeten keresztül történik egy metanol felszabadulása közben. A reakciótermékben, (egy szubsztituált indolszármazék) a C10 metilénkarbamát aktivált állapotba kerül, amely lehetőséget ad egy aktív karbonium ion képződésére, azaz a DNS-val való kovalens kötés kialakítására. Ezt az elképzelést megerősíti, hogy a metoxi csoport hidrogénre cserélése inaktiválja a molekulát. Az amino csoport eltávolítása is csökkenti a hatást
142
AZ ANTIBIOTIKUM KÉPZŐDÉS LEHETŐSÉGE ÉS FELTÉTELEI Az antibiotikumokat a szakirodalom az un. szekunder metabolizmus termékeinek tekinti. Bu'Lock, a termékek névadója, a szekunder metabolitokat az öregedő tenyészet által termelt anyagoknak tekintette. Amíg a primer metabolitok az élő sejt működéséhez szükséges kis molekulák, vagy életfontosságú makromolekulák építőkövei, esetleg enzimek faktorai, addig a szekunder metabolitok termelésének célja ismeretlen. Elvileg más szervezetek ellen felhasználható anyagcsereterméknek is tekinthetjük. A természetre jellemző gazdaságosságra törekvés, és a létért való küzdelem körülményei között feltételezhetjük, hogy maga a történés - adott körülmények között - ezen anyagok termelése esszenciális az őket termelő szervezetek számára. Kémiailag különféle vegyületek sorolhatók ide, sok esetben egy-egy primer metabolit karikatúrájának tekinthetők. Éppen az antimetabolitok (az izoszterikus enzimgátlók) képződése mossa el az éles határt a primer és szekunder metabolitok között. Milyen alapon tekintsünk például szekunder metabolitnak egy nukleotid analógot, amely egy-egy anyagcsere zavar eredményeként jelenik meg a normál metabolitok között: Ennek a hibás metabolitnak a biotranszformációjával és a környezetbe való kiválasztásával a termelő mikroorganizmus az esetleg végzetes genetikai hiba következményét fiziológiai úton számolja fel. Ezeknek a vegyületeknek a képződése általában a növekedési fázis (trofo-fázis) végén indul meg és a stacioner fázis (idio-fázis) első szakaszára terjed, amikor a ·sejtosztódás sebességének a csökkenése, sok esetben a spóraképzés megindulása, ill. az erre való előkészület az intermedier anyagcsere addig jól szabályozott rendszerében némi zavart okozhat. Egyes spontán mutánsokban, illetve életképes variánsokban az átprogramozás okozta zavar — bizonyos enzimreakciók leállása — egy egy intermedier felhalmozódását okozhatja, sőt addig nem képződött vegyületek megjelenését is eredményezheti. Az éppen jelenlevő intermedierek a még működni képes enzimek hatására új vegyületekké alakulva kerülhetnek a környezetbe, oldott, vagy kristályos formában. A törzsfejlődés folyamán, a szelekciós nyomás hatására általában azok a variánsok maradnak fenn, amelyek a leggazdaságosabban oldják meg az adott körülmények között fellépő élettani zavar problémáit. A szekunder metabolitok fiziológiai hatásossága nem szükségszerű, de ismerve az élővilág egységes felépítési elveit nem is meglepő. Nem véletlen, hogy ezek a primer metabolitoktól kisebb-nagyobb mértékben különböző vegyületek egy másik szervezet anyagcsere rendszerében zavart okoznak. Csupán módszertani oka van annak, hogy látszólag nagyszámú biológiailag aktív szekunder metabolitot ismerünk. Ezek ugyanis éppen a feltűnő, könnyen mérhető antibiotikus aktivitásukkal irányítják magukra a kutatók figyelmét. Sok vitára adott okot a szekunder metabolitok, ezen belül is az antibiotikumok biológiai jelentősége. Roberts Pratt 1949-ben megjelent könyvében mottóként Pasteurt idézve “life destroys life" az antibiotikumot a létért való küzdelem hatásos fegyvereként említette. Herbert Golberger 10 évvel később már azt kérdezi, vajon okozhat-e az antibiotikum valamilyen biológiai szabályozást a környezetében. Ezzel kapcsolatban megjegyzendő, hogy az antibiotikum termelés általában a növekedés késői szakaszában figyelhető meg, akkor amikor a kedvezőtlen környezeti körülményeket legyőzve már jól fejlett kolóniákat hozott létre a termelő mikroorganizmus. Mások az anyagcsere szabályozásban vélik meglelni az antibiotikumok élettani szerepét. Ez esetben nem érthető, hogy miért választják ki nagy mennyiségben a környezetbe azt a jelentős anyag- és energiabefektetéssel létrehozott vegyületet, amelynek a szabályozásban való szerepét kevés számú molekula is megoldja. Ezt az ellentmondást feloldhatjuk, ha feltételezzük, hogy ilyen és hasonló szabályozó vegyületeket minden mikroorganizmus termel, de mi csak az esetben vesszük észre jelenlétüket, ha valamilyen regulációs hiba folytán nagy mennyiségben képződnek és ezt a környezetbe kiválasztják. Egyesek szerint ezeknek az anyagoknak a törzsfejlődés bizonyos szakaszában szabályozó szerepük volt, és ma csupán valami régmúlt idő élő kövületeként képződnek. Az antibiotikum képződése egy izgalmas élettani kérdést vet fel. Hogyan védi magát az antibiotikumot termelő mikroszervezet a saját metabolitjának toxikus hatása ellen. Nem kielégítő az a magyarázat, hogy az antibiotikum termelés a növekedési fázis befejeződése után, az un. Idio-fázisban, azaz egy csökkent érzékenységű életszakaszban indul meg. Ezek a vegyületek ugyanis a növekedési fázisban is képződhetnek, sőt több esetben sikerült előállítani szekunder metabolitokat folytonosan növekedő tenyészetben (kemosztátban) is. Más esetben szoros kapcsolatot találtak a szekunder metabolit képződése és a tenyészet növekedése között. Ezekben az esetekben az antibiotikumot termelő mikroorganizmusnak szükségképpen rendelkeznie kell olyan mechanizmussal, olyan lehetőséggel, ami megvédi a saját antimetabolitjával szemben. A törzsnemesítő munka tapasztalatai bizonyítják, hogy az antibiotikum termelés szintjének jelentősebb növelése csak az esetben lehetséges, ha a transzkripció és a transzláció az antibiotikum termelés ideje alatt is zavartalanul folyhat. Hosszú idő óta keresik az antibiotikum termelés fokozásában érdekelt kutatók azt a szabályozó mechanizmust, amely a képződő antibiotikum szintet meghatározza. A befektetett. munka és az elért csekély eredmény aránytalansága logikailag érthető. Mi ugyanis csak akkor vesszük észre ezen vegyületek képződését, amikor bioszintézisüket a túltermelés jellemzi. Azaz, ha volt is valami szabályozó mechanizmus, az éppen a túltermelés érdekében nem működik. Nem tekinthetjük szabályozásnak azt az esetet, amikor a képződött anyag mennyisége a termelő mikroorganizmus számára toxikus koncentrációt érve el a metabolizmus leállításával
143
együtt a szekunder metabolitnak tekinthető antibiotikum termelését is leállítja. A törzsnemesítő munka során éppen ezt az érzékenységet csökkentve, azaz a rezisztenciát fokozva igyekeznek több-kevesebb sikerrel magasabb antibiotikum szintet elérő variánsokat előállítani. Az antibiotikum termelés szabályozásáról lehetetlen valami egységes képet adni, mert genetikailag eltérő, rendszertanilag távolálló fajok azonos antibiotikumot szintetizálnak, ugyanakkor azonos fajba tartozó törzsek által termelt antibiotikumok kémiai szerkezete nagymértékben eltérhet egymástól. Különböző antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok rendszertani csoportjai Antibiotikum Gombák Streptomyces Micromonospora Nocardia Baktériumok Aminoglikozidok +++ +++ ++ + Anthraciklink +++ ++ Ansa-láncuak +++ ++ +++ Bleomycinek +++ ++ Chloramphenicol +++ ++ +++ Cycloserin +++ ++ ++ + β-laktám típusúak +++ Makrolidok +++ ++ ++ + Tetraciklinek +++ Poliének +++ ++ ++. Fungisztatikumok +++ A β-laktám típusú antibiotikumokat például Penicillium, Streptomyces, Cephalosporium, Dermatophyta, Aspergillus és Nocardia fajok termelik: Ezek a rendszertanilag távol álló fajok megegyeznek abban, hogy az intermedier-anyagcseréjükben a lizin szintézise vagy lebontása α-aminoadipinsavon keresztül vezet. Az általános megállapítások a törzsnemesítéssel foglalkozók számára kevés támpontot nyújtanak. Minden antibiotikum típus túltermelési körülményeit külön-külön kell kialakítani. Sok esetben az egyes termelő törzsek .között is olyan nagy a variáció, hogy az optimálisnak mutatkozó technológia törzsenként is nagymértékben eltérhet. Sok esetben a gyakorlati adatok alapján kialakított eljárás elméleti alapjait sem sikerül felderíteni. A szekunder metabolit termelés szabályozásával foglalkozó összefoglalók ezért inkább vezérelveket tárgyalnak. Kivételt képeznek azok az esetek, amikor az antibiotikum kémiai szerkezete még erősen hasonlít valamely primer metabolithoz (pL. a chloramphenicol). Ez esetben az antibiotikum mennyisége a természetes analóg klasszikusnak tekinthető szabályozó rendszerén keresztül befolyásolja képződésének sebességét. Egyre inkább elfogadható az a nézet, hogy az antibiotikumok szintézisében a primer anyagcsere enzimei vesznek részt és csak egy-egy kulcsenzim működése, egy kulcs intermedier túltermelése segíti elő az antibiotikum képződését. Ez a kulcsenzim lehet plazmidhoz kötött. A kanamycint termelő S. kanamyceticus-ból a plazmid törlésre használható flavin származék alkalmazásával reprodukálhatóan lehet olyan mutánst nyerni, amely nem termel kanamycint. Ha e mutáns tenyészetéhez dezoxistreptamint (kulcsintermediert) adtak, akkor a kanamycin szintézise megindult. A plazmid törlése a kulcs intermedier szintézisének a felfüggesztésével járt. Plazmidhoz kötöttek az aminoglikozid antibiotikumok inaktiválásában szerepet játszó foszforilező, adenilező és acetilező enzimek génjei, amelyek a termelő mikroorganizmus antibiotikum tűrését is képesek biztosítani.
Az antibiotikumok alkalmazásának egészségügyi következményei
A gyógyászatban vezető helyet foglalnak el a penicillin és származékai, a β-laktám típusú antibiotikumok. Nem vitatható, hogy az ideális antibiotikummal szemben támasztott követelményeknek (legyen széles spektrumú, kémiailag stabil és a gazdaszervezetre ne fejtsen ki káros hatást) az azetidinon csoportba sorolt antibiotikumok és származékaik megfelelnek. Az új félszintetikus antibiotikumok — bár előállításuk költségigényes — sok valamikor nagyjelentőségű antibintikumot szorítottak ki a gyógyszerpiacról. Ilyen a chloramphenicol, foszfonomicin, fusidinsav, sőt egyes országokban az aminoglikozidok forgalma is megérzi jelenlétüket.A tetraciklin csoport alig éri el a penicillin felhasználás 20 %-át. A makrolid és az aminoglikozid típus még ennél is kisebb jelentőségű. A rifamicin csnoport a tuberkolózis elleni alkalmazhatósága miatt nélkülözhetetlen. Mennyiségi szempontból elhanyagolható a rákellenes hatású anyagok termelése. A chloramphenicol évi felhasználása ezer tonnás nagyságrendű. A szegényebb országok gyógyszer ellátásában azonban ezek a viszonylag olcsó antibiotikumok (chloramphenicol, aminoglikozidok) még jelentős szerepet töltenek be. Az antibiotikumok eredményes alkalmazása megváltoztatta a népegészségügy helyzetét. Megváltoztatta a társadalom életkori összetételét. Az elöregedést segíti. A halálozás okát feltüntető statisztikai adatok mutatják, hogy a múlt században 90 év alatt a fertőző kórokozók helyett a szervi megbetegedés, a keringési rendellenesség, a rák, a máj kórformái kerültek előtérbe. A gyermekhalandóság visszaszorulásával a genetikai okok miatt gyengébb ellenálló képességgel rendelkezők is elérik az ivarérettséget. Végeredményben a születés szám csökkenése és az életkörülmények javulása, a környezet szelektáló hatását kikapcsolva a populáció genetikai állományának leromlását idézi elő 144
Az átlag populáció halálopzásának oka (az első tíz ok 100000 lélekre számolva) 1900-ban antibiotikumok nélkül 1990-ben antibiotikumok elterjedése hatására Szívbaj 200 Influenza Rákos daganat 192 Tüdőgyulladás Agyvérzés 150 Tuberkulózis Baleset 142 Hashártyagyulladás Influenza, tüdőgyulladás 102 Szívbaj Diabetes 82 Agyvérzés Máj cirrhozis 70 Veseelégtelenség Öngyilkosság 52 Baleset Érelmeszesedés 50 Rákos daganat Gyermekhalandóság Gyilkosság 30 Diftéria
310 199 80 50 30 28 25 18 16 11
AZ ANTIBIOTIKUMOK GYÓGYÁSZATI ÉS GYÓGYSZERIPARI JELENTŐSÉGE Nehéz feladat ezen kérdésekre minden szempontból kielégítő feleletet adni. Nagyon változatos a kép, ha országonként szemléljük ezeket a kérdéseket, mivel a vizsgált ország anyagi és gazdasági helyzete, ipari potenciálja, a nagy nemzetközi jelentőségű gyógyszeripari vállalatokkal való kapcsolata torzítja a valós képet. Szélsőségesen eltérő adatokat kapunk, ha például az USA antibiotikum felhasználását egy fejlődő ország gyógyszerfelhasználásával hasonlítjuk össze. Ezt nemcsak az illető ország anyagi ereje, de a fóldrajzi fekvése, civilizációs szintje és ezzel összefüggő terápiás problémái is döntő módon befolyásolja. Az USA-ban nem kell a TBC ellen vagy a kolera leküzdése érdekében gyógyszerelni, ugyanakkor Egyiptomban vagy Dél-Amerikában ez népbetegségnek tekinthető. Egészségügyi jelentésekből, közgazdasági értesítőkből, iparpolitikai tájékoztat6kból összeállítható egy táblázat a fontosabb antibiotikum csoportokról amely az ezredforduló táján készült. Gyógyászati felhasználás Antibiotikumok β-laktám csoport Tetraciklin csoport Makrolidok Aminoglikozidok Rifampicin csoport Chloramphenicol Cikloszerin Antifungális humán célra Rákellenes antibiotikum Állattápkiegészítők Bacitracin Monensin Tylosin Virginiamycin Antifungális növényvédőszerek
Termelt mennyiség (tonna/év) 25-30000 4-5000 2-3000 2-4000 1000 1000 200 100-200 néhány kg 20000 1000 1-2000 1000 1-3000 30000
145
Mikroszervezetek által termelt FARMAKOLÓGIAILAG HATÁSOS ANYAGOK Prokariota sejtfal képződését gátló hatóanyagok
ß-laktám antibiotikumok
Prokariota membránt károsító anyagok
(Glüko-peptid) Depsipeptidek
Immunszupressziv Természetes hatóanyag (Pefloxacin) Girázgátló
HOGYAN VALÓSUL MEG A TOXIKUS ANYAG TŰRÉSE AZ ANTIBIOTIKUM KÉPZŐDÉSEKOR? A gombák által termelt β-laktám típusú antibiotikumok, a baktérium sejtfalban előforduló peptidoglükán szintézisben szerepet játszó karboxipeptidáz (transzpeptidáz) működését gátolva, megakadályozzák a baktérium sejtfal továbbépítését. A Streptomyces törzsek által termelt — β-laktám típusba tartozó — cefémsav származékok zavarják ugyan a Streptomyces sejtfalban megtalálható peptidoglükán szintézisét, ez a hatás azonban nem észlelhető, mert a csekély mennyiségű antibiotikus hatású termék megjelenésekor a tenyészet növekedése már befejeződött A polién makrolidok ugyancsak nem károsítják a termelő mikroszervezeteket. Ezek a vegyületek a sejtmembránban helyet foglaló szteroidokkal lépnek kölcsönhatásba, ezáltal lazítják a membrán szerkezetét, megváltoztatják permeábilitását, szétroncsolják azt. Ebből a megfigyelésből következik, hogy elsősorban olyan organizmusok növekedését gátolják, amelyeknek membránja számottevő mennyiségben tartalmaz szteroineket. Az eddig végzett biokémiai vizsgálatokkal a polién fungisztatikumokat termelő mikro-organizmusokban szteroidok jelenlétét nem lehetett bizonyítani. A riboszómán folyó fehérjeszintézist gátló antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok esetében több lehetőség kínálkozik a gátló hatás kivédésére. A peptid jellegű thiostreptont termelő S. azureus riboszómája például nem köti az antibiotikumot. A thiostreptonra érzékeny sejtekben a riboszóma RNS alkotórésze felelős a kötésért. A thiostreptont termelő törzsben sikerült kimutatni egy metilázt, amelyik S-adenozil-metionin jelenlétében metilezi a 23S-rRNS-t, még a riboszóma fehérje alkotórészével való egyesülés előtt. Az így kialakuló fehérjeszintézisre alkalmas riboszóma viszont nem köti a thiostreptont. Hasonló oka van az erythromycint termelő S. erythreus antibiotikum türésének. A metilezett 23S-rRNS-t tartalmazó 50S riboszómához nem kötődik a makrolid csoportba sorolt antibiotikum. Bonyolultabb a helyzet a tetraciklin antibiotikumokat termelő törzsek esetében. Kétségtelen tény, hogy az antibiotikumot termelő törzsek tetraciklin tűrése nagyobb, mint a nem termelő törzseké. Megbízhatóan 146
igazolták, hogy a tetraciklin a prokariota riboszóma 30S alegységéhez kötődve akadályozza meg az aminoaciltRNS kapcsolódását az aminosav kötő helyhez. Fiatal S. aureofaciens fehérjeszintézisét a tetraciklin képződés megindulása előtt adott tetraciklin gátolja, de az idősebb tenyészetből izolált fehérjeszintetizáló rendszer is gátolható tetraciklinnel. A fiatal és öreg tenyészet permeabilitásában fellelhető különbség olyan csekély, hogy fel kell tételeznünk a kötőhely olyan jellegű változását, amit ez ideig in vitro nem sikerült kimutatni. Megjegyzendő, hogy a tetraciklin bioszintézis utolsó lépéseként, a NADPH függő redukció aktíválja a környezetbe kiválasztandó addig inaktív köztea terméket. A chloramphenicol az 50S riboszómára kötődve gátolja a peptidil-transzferáz működését. Gondos vizsgálatokkal sikerült kimutatni, hogy a termelő törzs riboszómája ugyanúgy köti az antibiotikumot, mint a nem termelő variáns, illetve mint a más mikroorganizmusokból kinyert riboszóma. A vizsgálatok egy kiválasztó mechanizmus működését valószínűsítik, ami a képződő antibiotikumot valami módon távol tartja a működő riboszómáktól. Ez a kiválasztó mechanizmus nemcsak az antibiotikumot termelő törzs életben maradását biztosítja, de egyben megvédi a chloramphenicolt az enzimes inaktiválástól. A S. venezuelae-ban ugyanis kimutatható egy enzim, amely képes a chloramphenicolt acilezni (inaktiválni). A streptomycin baktericid hatásának kivédése az őt termelő S.griseus-ban még ma is vizsgálandó probléma, annak ellenére, hogy már több mint harminc évvel ezelőtt úgy igyekeztek jobban termelő törzset nyerni, hogy fokozták a termelő törzs streptomycin türését. A részletes vizsgálatok kimutatták, hogy a növekedő fázisban, az un. trofofázisban levő S.griseus igen érzékeny a tápközeghez adott streptomycinre, ugyanakkor az antibiotikum termelő fázisban, az un. Idio-fázisban levő organizmus rezisztensnek mutatkozik. Kimutatható egy ATP-dependens foszforilező enzim, ami képes inaktiválni a streptomycint. Feltételezhető, hogy a sejten belül a streptomycin foszforilezett formában van és csak a tápközegbe történő kiválasztáskor hidrolizálja egy alkalikus foszfatáz az inaktív vegyületet aktív antibiotikummá. Az actinomycinek a DNS templáton a guanozin-citozin bázispárhoz kapcsolódva fejtik ki hatásukat, megakadályozva az RNS-polimeráz müködését. Ezt a hatást az actinomycint termelő S. antibioticus-bó1 izolált rendszerben in vitro is kimutatták. Találtak viszont ebben a mikroorganizmusban egy olyan fehérjét, amelyik képes specifikusan megkötni az actinomycint, és ezzel a szabad antibiotikum sejten belüli koncentrációját elviselhető szintre csökkenti. Ez a fehérje a trofo-fázisban alig kimutatható, az idio-fázisban viszont mennyisége megnő. Más szerzők kimutatták, hogy az actinomycin képződés megindulásával a sejtfa1 permeabilitása csökken. Antibiotikumot termelő törzsek tehát bármikor képződhetnek, sőt ezek laboratóriumban való felépítésének sincs elvi akadálya. Csupán a kulcs intermedier szintézisét biztosító enzim információját, valamint a képződő antibiotikum tűrését biztosító információt kell egyetlen mikroorganizmusba juttatni. Ez természetes körülmények között is bekövetkezhet plazmid felvételével. Az igaz, hogy két plazmid egyidejű átvitelének a valószínűsége meglehetősen csekély, azonban számításba kell vennünk azt, hogy egy antibiotikum termelésért felelős információ megjelenése még nem jelenti magát az antibiotikum képződését. Ez csak meghatározott környezeti feltételek érvényesülése esetén valósul meg. Ily módon meg van annak a lehetősége, hogy valamikor a kérdéses antibiotikum tűrését biztosító információt is felvegye az antibiotikum szintézisére képes mikroorganizmus. Ezzel az így létrejött variáns életképessége fokozódott, a környezeti feltételekre vonatkozó megkötöttségei pedig az antibiotikum termelés szempontjából előnyösen csökkentek.
147
Miért éppen a Streptomycesek termékei között találtak antibiotikumként hasznosítható metabolitokat? Több mint száz éve ismerik sugárgomba néven ezeket a baktérium- és gombatulajdonságokat magukban egyesítő mikroszkopikus talajlakókat. A csoport neve az ακτινος sugár és µυκος gomba szavak összetétele. A nyári zivatarok után érezhető jellegzetes talajillat tőlük ered. Az Actinomycetales rend Gram-pozitívan festődő, morfológiai alapon megkülönböztethető családjai a Micrococcus nemzetségtől az elágazó fonalas szerkezetű, differenciált telepet képező Streptoverticillium fajokig változatos képet mutatnak. DNS-tartalmukban a G+C mennyisége 55 % felett van. Sejtfalszerkezetük azonossága mellett lipidtartalmuk is hasonló. Filogenetikai kapcsolatukat a nukleinsav-hibridizációs kísérletek és a 16S rRNS azonosságuk igazolja. Spóraképzésük a szaporodást szolgálja. Hőtűrő tartós spórát csak a Thermoactinomyces nemzetség tagjai fejlesztenek. Nagy morfológiai változatosságuk, színes telepeik, valamint a környezetbe kiválasztott színanyagaik változatossága miatt a törzsek elkülönítésére csak azonos körülmények között végzett, párhuzamos kísérletek eredményeit értékelve vállalkozhatunk. Az irodalmi adatok összehasonlítása sok esetben félrevezető.Részletes megismerésüket indokolja változatos morfológiájuk, differenciálódási jelenségeik, a környezetre gyakorolt hatásuk, az ipari alkalmazhatóságuk és ezzel összefüggő bonyolultan szabályozott anyagcsere hálózatuk. A DNS replikációt ritkán követi válaszfal képződés. Ebből következika látszólag “többmagvú” prokariota jellegük, A fonalak elágazása azonban mindig szeptum közelében indul növekedésnek. Az elágazó fonal csúcsi részében intenziv az anyagcsere. A növekedő szakasz mögötti szubapikális szakaszban folyó replikációt nem követi a válaszfal képződés. Lineáris szerkezetű kromoszomájuk feltűnően nagy 8Mb 8x105 bázispár Elkülönítésük céljából elvégzendő morfológiai vizsgálatok: 1.) Adott hőmérsékleten és táptalajon fejődő telepeik változásának egfigy4elése és összehasonlítása rendszertnni besorolásuk szempontjából fontos 2.) A pigmentképzésük vizsgálata a tápközeg, az életkor és a pH függvényében. 3.) A légmicélium-képzés vizsgálata. 4.) A konídiumképzés vizsgálata a légmicéliumon és a szubsztrátmicéliumon. 5.) A spórahordozó hifa alaki jellegzetességeinek vizsgálata. 6.) A spórák száma, elhelyezkedése, mozgó vagy nem mozgó voltuk. 7.) A sporangium alakja (ha van). 8.) A spórák küllemének változása — elektronmikroszkópos összehasonlítása. 9.) A fonalas alak fragmentálódási tendenciája. Taxonómiai szempontból kiemelendő a kémiai és élettani vizsgálatok jelentősége, ezen belül a sejtfal-összetétel vizsgálata, a lipid tartalom vizsgálata, az optimális tenyésztési hőmérséklet meghatározása, a levegőigény mérése és a szénhidrát-hasznosítás vizsgálata (D-glükóz, L-arabinóz, D-xilóz, D-mannit, D-fruktóz, szacharóz, inozit, glicerin, keményítő)
Fonalas szerkezetű prokariota típusok fejlődési ciklusai, a légmicélium és a szubsztrátmicélium elkülönülésének továbbá a spóraképzésének vázlatos rajza. Morfológiai vizsgálatuk — az idesorolt fajok fizikai-kémiai és fiziológiai körülmények által befolyásoltan változó tulajdonságai miatt — különleges gondossággal végzendő. Az agar-táptalajon növekedő kolónia fonalas szerkezetű képletekkel a tápközeg mélyebb rétegébe hatolva veszi fel a növekedéséhez szükséges tápanyagot. A
148
táptalaj felszínén viszont kompakt telepet képez, amelyről némi lízisset követően tautolízis mellwettlegtöbb esetben finom fonalakból álló légmicélium- tömeg emelkedik fel. A fonalak vékonysága miatt felületi mikroszkóppal általában nem vizsgálható a jelenség. Áteső fényben való vizsgálat céljából viszont különleges technikát kell alkalmazni. A fonalas prokarionták különlegessége az elterjedést szolgáló szaporító sejt képzése. Spóra képződése sok esetben nem csak a légmicéliumon figyelhető meg, de a differeciálódási folyamat a tápközegbe hatoló fonalakon is elősegíti a spóraképződést. Gyakorta a fonalak feltöredezése is a szaporítást szolgáló, artrospóraszerű képletek megjelenésével jár. A rendszertani helyükre vonatkozó adatokat szolgáltató biokémiai analitikai technika csak a XX. század közepén erősödött meghatározó jellegűvé. Biokémiai rokonságra hivatkozva sorolják közéjük a spórát nem képző Mycobacterium család tagjait, a Coryneform alcsoport családjait, és a Nocardia-féléket. Az elkövetkezőkben a csoport jelentősebb nemzetségeinek típustörzsei szerepelnek. A név után zárójelben található az ATCC gyűjteményben megadott katalógusszám. A felsorolást néhány patológiai vagy biotechnológiai szempontból kiemelt család részletesebb tárgyalása egészíti ki. Megjegyzendő, hogy ipari jelentőségük és szabadalmaztathatóságuk miatt a rendszertani besorolásuk nem minden esetben állja a tudományos kritikát. (Williams et al. J. Gen. Microbiol. 129:1815-30. 1983) A Streptomyces fajokra jellemző bonyolultan differenciálódó anyagcsererendszer működése a talajbiológia fontos tagjává avatja őket. A szubsztrátmicélium és a légmicélium funkcionálisan eltérő feladatot látnak el. A spóraképzésben kiteljesedő differenciálódási folyamat különleges szabályozási mechanizmusok működését igényli. Természetes élőhelyük változatos fizikai és kémiai körülményei, csak nagy ellenállóképességgel, kellő adaptációs készséggel, azaz gazdag génállománnyal rendelkező törzsek fennmaradását tette lehetővé. Amíg az eubaktériumok magállománya általában 4 Mb körüli értéket mutat, az idesorolt fonalas szerkezetű prokarioták magállománya eléri a 8 Mb méretettartományt. Halofil fajaikról is tudunk. A telepekben egyidejűleg van jelen a spórából kihajtott, még életképes legidősebb primer fonal és az egyre gyarapodó fiatal micéliumtömeg. A kolónia sok maganyagot, kevés válaszfalat tartalmazó óriás sejtnek tekinthető. A telep körkörös elszíneződése és morfológiai elkülönülése élettani különbséget takar. A Bergey's Manual VIII. kiadása 463 Streptomyces faj leírását tartalmazza. Az irodalom ennél jóval több törzsről tud. Sok fajuk antibiotikumot termel. Ezek a szekunder metabolitnak tekintett biológiai aktivitást hordozó vegyületek a létért folytatott küzdelemben hatásos fegyvernek tekinthetők. A felfedezők vizsgálati módszereiket általában addig "finomítják", amíg az iparilag hasznosítható törzs szabadalmaztathatóság szempontjából új fajként szerepelhet. A fajon belül nem minden izolált példány termel kimutatható mennyiségben antibiotikumot. Ezért az ipari gyakorlatban törzsnek nevezik a gyakorlati felhasználásra kiválasztott, adott esetben kinemesített és törzs gyüjteményben deponált mikroszervezetet Ipari szempontból
jelentősebb törzsek neve Streptomyces rimosus Streptomyces griseus Streptomyces aureofaciens Streptomyces venezuelae Streptomyces noursei Streptomyces kanamyceticus Streptomyces fradiae Streptomyces erythreus Streptomyces cinnamonensis Streptomyces niveus. Str spheroides
A hatásos anyag neve Oxitetraciklin Sztreptomicin Aureomicin Klóramfenikol Nisztatin Kanamicin Neomicin Eritromicin Monensin Novobiocin
A családba sorolt különböző fajnévvel rendelkező törzsek nagy számát a rendszertan szakemberei nem kevés kétkedéssel fogadják. Williams 400 független fajnévvel deponált “törzs” 139 karakterét vizsgálva tulajdonságaikat a numerikus taxonómia módszereit használva kritikus taxonomusként értékelte. Ennek alapján közülük 394-et ismert csoportba sorolhatónak itélt (J. Gen. Microbiol. 129:1815-30. 1983). A 400 közül mindössze 6 megkülönböztethető fajt állapított meg. A modern törzsfejlesztési eljárások modellként használt kísérleti alanyai is a nermzetség (genus) képviselői. A Sermonti és Hopwood által részletesen vizsgált Streptomyces coelicolor géntérképének felderítettsége miatt került a kutató laboratóriumok asztalára. Mai típustörzse S. violaceoruber (ATCC 14980). A Streptomyces lividans pedig vektorgazdaként került Hopwood laboratóriumába. A modern genetikai módszerek alkalmazását az Escherichia coli-ban és a Streptomyces lividans-ban is jól működő, bifunkcionális plazmidjaik megalkotása tette lehetővé.
149
Streptomyces lividans légmicélium átalakulása
spóralánccá
A Streptomyces-plazmid restrikciós térképe. Az ábra bemutatja a restrikciós enzimek hasítóhelyeit. Ez a kifejlesztett plazmid a Streptomyces coelicolor A3, a Streptomyces lividans 66 és a Streptomyces parvulus ATCC 12434 törzsekben képes replikálódni.
Az idesorolt mikroszervezetek pótolhatatlan szerepet játszanak a komposztálás folyamatában a növényi poliszacharidok ( cellulóz, hemicellulóz, lignocellulóz) lebontásával. A növényi lignocellulóz felépítettségéből következően nehezen lebontható. A szorosan kötegekbe rendezett cellulóz láncokhoz rövidebb hemicellulóz egységek tapadnak. Ehhez kapcsolódnak extenzinek közvetítésével a savas karakterű pektin láncok. Az egész képződményt a lignin (fenilpropán egységekből álló polimer) szilárdítja az egyes növénycsoportokra jellemző lignocellulózzá. Lignocellulózt bontó mikroszervezetek természetes élőhelyükről különleges dúsító eljárással izolálhatók. Ilyen dúsító táptalaj összetétele lehet 100 ml desztillált vízben oldva 0.1 g NaNO3; 0.1g K2HPO4; 0.03g KCl; 0.05g MgSO4.7H2O; 0.05 g élesztőkivonat; 0.05g pepton; 1g Macherey Nagel 300-as kristályos cellulózpor; 2 g agar-agar A mikroelem igény kiegészítése céljából 0.1 ml baktérium mentesre szűrt nyomelem oldat adagolása (1000 ml desztillált vízben oldva 100mg MnCl2.4H2O; 100mg CoCl2; 10mg CuSO4; 10mg Na2MoO4.2H2O; 20mg ZnCl2; 5mg LiCl; 5mg SnCl2.2H2O; 10mg H3BO3; 20mg KBr; 20 mg EGTA, 8mg NaFe3+-trihidrát) szükséges. Ha a tenyésztést 44–60°C tartományban végezzük, akkor a cellulózt hasznosító törzsek kiemelésére van lehetőség. A 8-10 nap után izolálható telepek közül hatásos törzsek izolálhatók. Ezek tisztasága többszöri hígítás után karboximetil-cellulózt tartalmazó táptalajra szélesztve igazolható. A telep körüli képződő kráter a CMC bontó aktivitásról tudósít.
150
Új antibiotikum előállítás (kutatás) műveletei 1.) Talajminta, illetve egyéb élőhelyekről származó populáció begyüjtése 2.) Ismételt szélesztés szilárd táptalajra, majd az önálló telepeket tartalmazó lemez felülfertőzése tesztorganizmussal. 3.) Homogén tenyészet izolálása (klonozás) a szélesztett lemezről, illetve a tesztorganizmus növekedését gátló telepről 4.) Levegőztethető tenyészet indítása nitrogén- és szénforrást tartalmazó folyékony táptalajon. 5.) A tenyészet biológiai aktivitásának meghatározása (Növekedést gátló hatású aktivitási egység megállapítása). Az aktív anyag sejthez kötött, vagy extracelluláris voltának és időbeni stabilitásának vizsgálata) Az antibiotikumot termelő törzs életben tartása a biokémiai aktivitásának megőrzése mellett. A tárolhatóság időtartamának és körülményeinek meghatározása . (Fagyasztva szárítás, –70 °C alatt való tárolás, Agar tenyészet tárolása 0-4°C-on. Paraffin olaj alatt tartott tenyészet virulenciája Homokon, korpán, illetve szilikagélen történő tárolás lehetőségének vizsgálata) Az inokulum oltáshoz használható életképes tenyészet előállítása (Agar felületen, természetes eredetű hordozó felületén [főtt rizs, korpa], esetleg levegőztetett tenyészetben spórázó szervezet ) Az oltóanyag felhasználhatóságának időbeli korlátozottsága (-tól-ig). A termelő tenyészet oltására szolgáló inokulum készítés fizikai-kémiai (tápközeg) körülményeinek, valamint oltóanyagként való alkalmazhatóságának meghatározása. (Oltóképesség –tól-ig, oltó térfogat 1-10%, tárolhatóság). A termelés szempontjából előnyös (főfermentáció) tenyésztési körülmények megállapítása. (Szén és nitrogénforrás kiválasztása, foszfát koncentráció, fémionok, növekedési faktorok [vitaminok] pH, hőmérséklet, keverés, levegőztetés, széndioxid tenzió, habgátló min őség és mennyiség) A képződő hatásos anyag mennyiségének meghatározása biológiai értékméréssel, kémiai analitikai módszerrel és bioautográfiával (biológiai heterogenitás vizsgálata). A minta tárolhatóságának vizsgálata. Az aktivitás féléletidejének meghatározása A termék kinyerése, a termelő mikroorganizmustól való elkülönítése (szűrés, centrifugálás, ioncserélő oszlop, adszorpciós eljárás, szerves oldószerrel való elkülönítés, kicsapás, stb) A hatásos anyag dúsítása, (bepárlás,fagyastva szárítás, szerves oldószeres extrakció) tisztítása, kristályosítása, stabilitásvizsgálata.
6.)Kromatográfiás módszerrel a biológiai aktivitás homogenitásának vizsgálata 7.) Baktérium spektrum vizsgálata (Grám-pozitíy, Gram-negatív, élesztő) 8.) A hatóanyag kémia természetének vizsgálata, meglevő anyagokkal való összehasonlítás 9.) Toxicitás vizsgálat, állati vagy növényi sejteken 10.)Hatásmód vizsgálata 11.)Metabolizmusának a vizsgálata a gazdaszervezetben és a baktériumban 12.)Rezisztencia kialakulásának vizsgálata 13.)A hatásos anyagot termelő törzs élettani képességeinek javítása 14.)Előnyösebb hatású származékok előállítása
151
A BAKTERIÁLIS FERTŐZÉS ELLENI ÉVSZÁZADOS KÜZDELEM VÁZLATA Kemoterápia Paul Ehrlich “Corpora non agunt nisi fixata” A testek nem hatnak, ha nem kötődnek A biokémiai hatás feltétele az anyag kötődése.[A védekezési mechanizmus működését az idegrendszer befolyásolja, ezért a hit, a személyekből induló sugárzás gyógyító hatása, adott esetben a ráolvasás, a pőlacebo is használhat] Salvarsan P. Ehrlich O.Hata 606 Arzén származék 1909 Nobel díj Prontosil Mietzsch & Klarer Domagk 1935 Ultraseptil Trimethoprim — Pyrimetamin — PAS Para-amino-szalicilsav p-amino-benzoesav INH Izonikotinsav-hidrazid piridoxál foszfát Piridoxamin nikotinsavamid Nalidix sav
Fluorokinolon giráz gátlók szintézise. A vérszint alakulása — Felszívódás (tartós jelenlét), ürülés, lebomlás ED50 Effektív hatásos adag. LD50 Letális toxikus adag Lebomlás: fizikai-kémiai hatás; enzim-hatás Kiválasztás a környezetbe változatlan formában v. bomlástermékként Hatásos vérszint biztosítása ismételt adagolással, ill.tartós jelenlétet biztosító származékkal Az aktuális vérszint mérése, A mérések fehér-egér, tengeri-malac, sertés után önkénteseken MIC érték folyékony tenyésztő táptalajon növekedő tenyészetben Érzékenység mérés mikrobával fertőzött agar lemezen impregnált papírkoronggal Ellenőrzendő az egyes szervekben és szövetekben való felhalmozódás A vér / agy gát A liquorban elhelyezkedő idegrendszer elkülönülését segíti, A méhlepény (placenta) elkülönülést elősegítő hatása Felderítendő a bejuttatott anyag esetleges mellékhatása és sorsa a kezelt szervezetben? Felderítendő a lebontási folyamatok köztes termékeinek élettani hatása, mellékhatásai. Adagolás: Infúzióval A hám felszínére juttatva /kenőcs, gél, szuszpenzió (spray)/ Emésztő csatornán keresztül felszívódó formában “per os” Parenterális adagolás interavénásan infúzióval Izomba juttatva (intramuscularis) Bőr alá juttatva “Sub cutan”
152
ANTIBIOTIKUMOK KORA Mikroszervezetek által létrehozott, mikrobák ellen hatásos anyag P. Vuillemin 1889 Antibiózis fogalma a szimbiózis ellentéteként Évezredes múlt Zsoltárok könyve 51,4 51,9 Tejsavas védelem, növényi hatóanyag (Hyssopus officinalis) 2500 éves kinai feljegyzések:szóján növekedő penész furunkulus ellen hatásos Roberts 1870 Penicillium glaucum tenyészetben nem nő baktérium Tyndall 1876 Zöld színanyagot termelő baktérium gátolja a mikrobák növekedését Joubert és Pasteur 1877 A lépfene leküzdhető más nem kórokozó mikrobával B. Gosio 1896 B anthracis növekedését gátolja a Penicillium termelte mycophenol R. Emmerich & O. Lőw 1899 Anthrax ellen hatásos a pyocyanase (1928-ban sikerrel alkalmazták!) Alexander Fleming 1929-ben nyilvánosságra hozott adatai szerint egy Penicillium notatum törzs termelte anyag gátolja a Staphylococcus növekedését “On the antibacterial action of cultures of a Penicillium with special reference to their use in the isolation of Bacillus Influenzae.” Brit. J. of Exp. Pathol. 10:226-236. A flamand származású Alexander Fleming kitartó kutatómunkája a Pentagon költségvetési támogatásával a mikrobiológiai ipar gyors fejlődését hozta. Clotterbuck 1932 A hatásos termék gyenge sav; labilis, pH és hőérzékeny. 1936-38 A tenyészet szűrlete külsődlegesen alkalmazva hatásos 1939 Chain & Florey Hűtve extrahálva, kisózva, fagyasztva szárítva, nem toxikus, parenterálisan alkalmazható barna port nyert, amelynek Abraham kimutatja a gyógyító hatását, de a kórokozó védelmére szolgáló enzim jelenlétéről is tudósít: “An Enzyme from Bacteria able to destroy penicillin” Nature 146:837 A Fleming előadása a Gyógyszerészeti Társaság tud. ülésén 1940 november 14 Florey és Heatley (1941 július) az US elnökéhez megy a termék fejlesztése érdekében 1943-ban sikerrel alkalmazzák a szepszis megakadályozására az amerikai hadsereg frontkórházaiban. A penicillin termelés felfutása 1943 májusig elkészül 0,5 kg penicillin az év végén heti 100 g a termelés. Ez évben sikerül kristályosítani a penicillint 1 Oxford egység = 0.6 µg G-penicillin Na 1944 végén a havi termelés 200 kg 1945 végén a havi termelés 1800 kg Crowfoot & Low megállapítja kémiai szerkezetét 1946 az évi termelés 32.000 kg P. chrysogenum Wisconsin 1980 az évi termelés 30.000 tonna
153
Ipari mikrobiológia II OKTATÁSI SEGÉDLET
PRIMER METABOLITOK ELŐÁLLÍTÁSA
CITROMSAV TERMELÉS MIKROBIOLÓGIAI ELJÁRÁSSAL Történeti bevezetés. Az élelmiszeripar számára nélkülözhetetlen citromsav üzemi termelése volt az első részletesen vizsgált és nagy méretben bevezetésre került aerob biotechnológiai eljárás. Bár Wehmer alapvető felismerése több mint száz esztendős, mégsem állítható, hogy a citromsav előállítására szolgáló eljárások fejlesztése befejeződött. Wehmer 1893-ban egy kálcium-oxalátot előállító Penicillium glaucum tenyészlevében melléktermékként észlelte a citromsav megjelenését. Felfedezésének gyakorlati jelentőségét felismerve később főtermékként citromsavat termelő gombákat keresett és talált, majd ezeket a mikroszkopos gombákat új genusként, a Citromyces nemzetség tagjaiként írta le 1903-ban. A részletes rendszertani vizsgálatok később kideritették, hogy a törzsek a Penicillium nemzetségbe sorolandók. A század elején a citromsavgyártásban az olasz termelők monopol helyzetben voltak. Termelésük meghaladta az évi 10000 tonnát. Egy tonna citromsavat kálcium-só formájában 40 tonna citrom préslevéből nyertek. (Megjegyzendő, hogy most évenként közel félmillió tonna citromsavat használ fel a az élelmiszer- a mosószer- és szerves vegyipar.) Wehmer érezte felfedezésének ipari jelentőségét, a gyakorlati megvalósításban azonban nem volt eredményes. Az első Aspergillus niger-rel végzett citromsavtermelésre vonatkozó szabadalmat Zahorsky B. jelentette be ( US. Pat. 1065358) 1913-ban. A citromsav termelés ipari megvalósíthatóságát biztosító felfedezés Currie J. M. nevéhez kapcsolódik (1917 J. Biol. Chem. 32:15). Thom C. és Currie J. M. az Aspergillus nemzetség savtermelő képességét vizsgálva (J. Agric. Res. 7:1) megállapították, hogy ezek a gombák savanyú kémhatású táptalajon (pH=2,5-3,5) is növekednek, és ez a savanyú környezet a citromsavképződésnek is kedvez. Ílyen savanyú (pH=1,5-2) körülmények között a baktériumos fertőzés már nem zavarhatja a folyamatot, sőt pH=2 alatt, a növekedés részleges gátlása fokozza a citromsav képződést. A felismert és nagyipari méretben is biztonságosan megvalósítható körülmények viszonylag rövid (1-2 hét) idő alatt a szénhidrát tartalomra számolva 60 % feletti citromsav képződést hoztak. Az első citromsavat termelő üzem 1919-ben készült el Belgiumban. Ezt követte a Chas. Pfizer & Co. üzemének a felépítése az USA-ban. Angliában a Rowntree & Co Ltd. - saját szabadalmát használva (Brit.Pat. 266414, 266415) - 1927-ben indította meg a citromsavtermelést. Csehországban a citromsav teremelés - 1928ban - a Kaznejovban épült üzemben indult meg felületi tenyésztéssel, melaszt hasznosító német szabadalom (Montan und Industriewerke 1924 Ger. Pat. 461356) alapján. Később nagy kapacitású citromsav üzemek épültek Németországban, a Szovjetunióban és más európai országokban. Ezek az üzemek mind felületi tenyésztéssel termelték a citromsavat, mégpedig olyan olcsón, hogy a citromléből folyó citromsav előállítás elsorvadt. Az olcsó ipari termék már nem csak az élelmiszeriparban, de a vegyipar más területén is felhasználásra került. A második világháború után fokozódott az érdeklődés a citromsav iránt. A piac igényeit csak újabb üzemek építésével lehetett kielégíteni. Ezek az üzemek azonban már új technológiát alkalmaztak, a sűllyesztett, levegőztetett, először a penicillin előállításához sikerrel alkalmazott ú.n. mélyfermentációs eljárást. A szakirodalomban a század első felében is számos közlemény foglalkozott a zárt kevert fermentorban megvalósítható citromsavtermelés lehetőségével (Bleyer B. 1924 Ger. Pat. 434729, Kluyver A.J. et al. 1925. Biochem. Z. 161:361). Sőt a Kluyver laboratórium (Perquin. L.H. C. 1938 Dissertation. Techn. Univ. Delft) és a Johnson laboratórium (Shu és Johnson J. J. 1947, J. Bact 54:161, 1948, J. Bact. 56:577) kutatási ertedményei a termelés biztonságát is megalapozták, mégis csak az ötvenes évektől észlelhetjük az ugrásszerű változást. Citromsav termelésre használható mikroszervezetek viszonylag szűk körét jelöli meg a szakirodalom. Nem ismeretes azonban, hogy ez a széleskörű vizsgálatok hiányából, vagy az anyagcsereút néhány nemzetségre jellemző öröklött hibájából következik. A fonalas gombák közül a Penicillium ( P. glaucum, P. janthinellum var. kaensanii, P. restrictum var. kuensanii, P. citrinum.) és Aspergillus ( A. niger, A. avamori, A. clavatus, A. fenecis, A. fonsecaens, A. fumaricus, A. luchensis, A. saitoi, A. usumi, A. ventii) nemzetségen kívül a Botrytis cinerea, a Mucor piriformis, az Ustulina vulgaris és a Trichoderma viride, egy-egy törzse képes számottevő citromsav termelésre. Ez utóbbi törzs érdekessége, hogy cellulózból is képes citromsavat termelni. A törzsek rendszertani vizsgálatát és az irodalomban megadott termelési adatokat szabadalmi érdekek befolyásolják. Tény azonban, hogy nagyipari alkalmazásra világszerte mindezideig csak az Aspergillus niger ATCC-1015 jelű törzsből nyert Wisconsin 72-4 (ATCC 11414) törzs leszármazottai kerültek. Mivel az előállítási eljárás szabadalmilag nem védhető, ezért a törzsszelekciós és törzsnemesítő tevékenység mindmáig az egyes üzemek féltve őrzött titka maradt és csak az árviszonyok alakulásából következtethetünk az elérhető termelési szintekre. A megjelent csekély számú irodalmi adat szerint a nagyüzemi termelés alapját képező oltóanyag előállítása állandó szelekciós tevékenységet igényel.
154
A citromsavtermelés élettani, biokémiai háttere. Az Aspergillus niger fonalas gombában a glükóz metabolizmusa glükóz-6-foszfátból (G-6-P) két úton folyhat: egyrészt a jól ismert Empden-Meyerhof-Parnas (EMP) szekvenciát követve, másrészt a pentóz-foszfát ciklus irányában a hexóz-monofoszfát (HMP) úton. Nem hagyhatjuk figyelmen kívül a glükóz oxidáz működését, amely a glükózból pH=2,5-4 tartományban glükonsavat készítve a szénforrás jelentős hányadát képes elvonni a citrát ciklus működését tápláló glikolízistől. A G-6-P képződést a hexokináz katalizálja PEP vagy ATP energiatartalmának terhére. A G-6-P és F1,6-P2 képződéshez szükséges ATP a foszfoenolpiroszőlősav piruváttá alakulásakor képződik a piruvát-kináz segítségével. A HMP irányba történő reakció teljesítőképessége az elágazásnál működő glükóz-6-foszfát dehidrogenáz aktivitásától és a NADP+ aktuális koncentrációjától függ. Ezért növekedő tenyészetben (trofofázis) a bioszintetikus folyamatok NADPH igénye miatt az EMP/HMP arány akár 2:1-re módosulhat, miközben a citromsavat termelő törzsek idio-fázisában az EMP/HMP út aránya 4:1. Jelentősebb szabályozó szerepe van a fruktózfoszfát-1-kináz-nak, amelyik az ATP energiatartalmát használva a F-6-P—> F-1,6-P2 átalakulást katalizálja.
Fruktóz-2,6-biszfoszfát szabályozó szerepét bemutató vázlat A fruktóz-6-foszfát és a fruktóz-1,6-biszfoszfát aktuális koncentrációját finoman szabályozza a fruktóz-2,6biszfoszfát (F-2,6-P2), amely a hexóz lebontást az EMP útra irányítva segíti elő a citromsav képződést. Az alloszterikus hatás a szétroncsolt gombafonalakból kinyert sejtmentes fehérjekivonatban is jól észlelhető. A szabályozó szerepet betöltő vegyület, a F-2,6-P2 eltünése lecsökkenti a glikolízis működése szempontjából nélkülözhetetelen fruktóz-1,6-biszfoszfát képződést. Ez a bonyolult szabályozó mechanizmus a szénhidrát leggazdaságosabb felhasználását biztosítja. Ezért a vad törzsnél csak annyi energiagazdag hexóz-foszfát kerül felhasználásra amennyi szűkséges a citrát kör táplálására, illetve a bioszintetikus folyamatok NADPH igényének a kielégítésére. — A szabályozó szerepet betöltő F-2,6-P2 szintézisét és lebontását egyetlen fehérje katalizálja, mégpedig foszforilezett szeril-oldalláncot tartalmazó fehérje formájában (F-2,6-biszfoszfatázként) lebontja a szabályozó szerepet betöltő F-2,6-P2-ot; Defoszforilezve viszont F-6-P-2-kináz-ként viselkedve éppen a szabályozó hatású F-2,6-P2 képződését katalizálja. Ezt a kettős rendeltetésű Janus arcú fehérjét egy protein-kináz foszforilezi, a foszfát eltávolítását pedig egy protein-foszfatáz végzi. A protein-kináz működését a metabolikus aktivitástól függő cAMP szint serkenti. A protein-kináz cAMP jelenlétében aktíválódva a F-6-P-2-kinázt F-2,6biszfiszfatázzá alakítja, aminek következményeként visszaszorul a glükolízis, sőt előtérbe kerül a glükóz neogenezis. — Nem véletlen, hogy jelentősebb citromsavképzés csak nagyobb koncentrációban adott glükóz jelenlétében várható, amikor a növekvő metabolikus aktivitás csökkenti a cAMP szintet. — Nyilvánvaló, hogy a glükóz felvételét segítő hexokináz aktivitása határozza meg a citrát képződés sebességét. (A glükóz hasznosítását lassító 2-dezoxiglükóz rezisztencia kifejlesztése csökkenti a citrát képződést.) A glikolitikus út működése és teljesítőképessége szempontjából kulcshelyzetben levő alloszterikus tulajdonságú enzimnek – a fruktóz-6foszfát-1-kináz-nak – a működését a vad törzsek esetében gátolja a citromsav, de gátló hatású az enzim szubsztrátuma, a sejt energia tartalékát képviselő ATP is. Az enzim aktivitását fokozza az AMP, ADP, éa a szervetlen foszfát. A citromsavat termelő mutánsban éppen itt észlelhető döntő különbség, mégpedig azért, mert 155
a magasabb glükóz koncentráció jelenlétében a fruktózfoszfát-2-kináz hatására képződő szabályozó szerepet betöltő F-2,6-P2 által aktívált fruktóz-6-foszfát-1-kináz működését nem, vagy alig befolyásolja a citromsav. Ammónia jelenlétében nyomnyi gátlást sem lehet megfigyelni. Ebből következőleg nem áll le a glikolízis citromsav túltermelés esetében sem. H-C=O H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2C-OH
CITRÁT A környezetet bemutató alloszterikus szabályozó elemek zárójelben szerepelnek;
a serkentő +,
illetve a gátló −
156
hatás jelölésével
A glikolízist katalizáló enzimek termodinamikailag meghatározott irányban működve, szabályozás nélkül – önfenntartó módon – a hexózból két molekula piroszőlősavat hoznak létre. — Közben a glükóz felvételéhez és a F-1,6-biszfoszfát képződéséhez szűkséges ATP szubsztrátszintű foszforilezéssel készülhet a Gs-1,3-biszfoszfát glicerinsav-3 foszfáttá alakulásakor, illetve a foszfoenolpiruvátból való piroszőlősav képződés közben. A folyamat szempotjából kritikus pontot jelent a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz kofaktor ellátottsága. A NAD+ hiány ugyanis áttételesen a citromsavképződést csökkentheti. A citokróm rendszer működése (a terminális oxidáció) az ATP szint emelésével jár, ami viszont a fruktóz-1,6-biszfoszfát képződését alloszterikusan gátolná. Megoldást jelent az alternatív oxidáz működése (lásd később), amely ATP képződés nélkül vezeti át az elektront az oxigénre, miközben az energia hő formájában szabadul fel, ami a rendszer hűtésével távolítandó el. A reakciósor másik jól szabályozott pontja az eukariota sejtekben az acetil-CoA-t szolgáltató tiaminpirofoszfátot igénylő enzimkomplex a piroszőlősav-dehidrogenáz. Az enzim működését a vad törzsekben gátolja az ATP és a citrát, de növeli az aktivitását a F-1,6-P2, valamint néhány egy-, illetve kétértékű ion (K+, NH3, Mg2+, Mn2+). — Az Aspergillus niger törzsekből kinyert piruvát-dehidrogenáz készítményekben a citrát alloszterikus szabályozó szerepét nem csak a citromsavat termelő mutánsból, de néhány citromsavtermelésre alkalmatlan vad törzsből készült enzimkészítményben sem sikerült kimutatni, viszont a F-1,6-P2 aktiváló hatása minden enzimkészítménynél jelentkezett. A fentiek ismeretében nem meglepő, hogy az Aspergillus-ok közül került ki a citromsavtermelésre alkalmas mutáns, mert a képződő citromsav csupán egy ponton, a fruktóz-6-foszfát-1-kináz alloszterikus szabályozásánál fejthet ki gátló hatást. Ennek a szabályozási pontnak a kikapcsolásával, klasszikus genetikai módszerek alkalmazásával létrehozható a citromsavat túltermelő mutáns. A citromsav képződését oxálecetsavból acetil-CoA felhasználásával a mitokondriumban működő citrát szintetáz katalizálja. Ezt az enzimet vad és mutáns Aspergillus törzsekből izolálták, tisztították és igen alaposan megvizsgálták, különös tekintettel a szabályozottságára. Ezek a munkák, csak a CoA-SH szabályozó szerepét igazolták, ami élettanilag várható is volt, hiszen az acetil-CoA elszívása más esszenciális bioszintetikus folyamatok leállásához vezetne. A piroszőlősav-dehidrogenáz komplex zavartalanul biztosítja a citrát szintetáz működése közben felszabaduló CoA-SH feltöltését. Az eddig megbeszélt enzimrendszer a citromsavtermelés szakaszában (idio-fázis) szinte teljes mértékben - a micélium növekedése nélkül - a citrát képződést szolgálja. A citromsavképződéshez nélkülözhetetlen acetil-CoA a mitokondriumban jön létre a tiaminpirofoszfátot igénylő piroszőlősav-dehidrogenáz komplex által. Képződését a sejten belüli ATP szint szabályozza. Piruvát + CoA-SH + NAD+
acetil-CoA + CO2
NADH + H+
+
A reakció a szabadenergia csökkenés (Go=−33,5 kJ) miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Az oxálecetsav képződését az Aspergillus-okban a konstitutív piruvát-karboxiláz katalizálja piroszőlősavból és szén-dioxidból egy ATP energiatartalmát hasznosítva. Piruvát +
CO2 + ATP
oxál-acetát
+
ADP
+
P
A szabadenergia változás csekély volta miatt (2,1 kJ) a reakció reverzibilis. Az enzim működését más mikroorganizmusokban a feldúsuló acetil-CoA kapcsolja be. A foszfoenolpiroszőlősav —> oxálecetsav átalakulást katalizáló foszfoenolpiruvát-karboxi-kináz jelenlétét is sikerült bizonyítani (Bloom S. J., Johnson M. J. 1962 J. Biol. Chem. 237:2718). Az enzim ADP jelenlétében szén-dioxid felvételét segíti elő. foszfoenol-piruvát +
CO2 + ADP
oxál-acetát + ATP
A citoplazmában működő malát dehidrogenáz a NADH jelentős részét visszaoxidálja, a képződő almasav pedig koszubsztrátumként a mátrixban képződő citrát transzportját segíti elő a mitokondriumból a citoplazmába.. oxál-acetát + NADH malát + NAD+
157
Összefoglalva a fentieket megállapítható, hogy citromsav termelésre használható Aspergillus niger törzs genetikailag meghatározott képességei lehetőséget adnak olyan technológia kidolgozására, amelynek előírásait betartva gazdaságos üzemi eljárás keretében nyerhető az élelmiszeripar és a mosószeripar szempontjából is fontos vegyület. 1) aktív citrát-szintetáz működése 2) gátolt izocitrát-dehidrogenáz aktivitás 3) fokozott oxál-acetát képzés a citoplazmában 4) aktív izocitrát-liáz működés 5) fokozott malát képzés a citoplazmában 6) F-1,6-P2 által serkentett piruvát-kináz 7) A fruktóz foszfo-1-kináz citrát érzékenységének F-2,6-P2 általi felfüggeszthetősége 8) a mitokondriumban képződő citromsav az almasavval cserediffundálva kerül a citoplazmába, 9) a citoplazmából az energiaigényes citrát permeáz juttatja a tápközegbe a főterméket a CITROMSAVAT. Kérdés, hogy mennyiben befolyásolják a citrát feldúsulást a ciklus enzimei, amelyek a továbbalakulásáról gondoskodhatnak. Elfogadhatónak látszott az az elmélet, hogy a feldúsulás oka az akonitáz és az izocitrát-dehidrogenáz csökkent működése. A kísérleti adatok ezt megerősíteni látszottak. Később kiderült, hogy ezek az enzimek rendkívül érzékenyek, és a kísérleti módszerek alkalmatlanok voltak a kimutatásukra. Mattey igen gondos munkával bizonyította, hogy a mitokondriumokban található egy akonitáz, amely 90:3:7 citrát : cisz-akonitát : izocitrát egyensúlyt állít be (Mattey M. 1977 FEMS Microbiol. Lett. 2:71). Az Aspergillus niger törzsekben több izocitrát dehidrogenáz működik Ezek az enzimek katalizálják az izocitromsav átalakulását α-ketoglutársavvá egy szén-dioxid felszabadulása mellett. A NAD+ függő izocitrát-dehidrogenáz aktivitása alacsony, alig kimutatható. A NADP+ függő izocitrát-dehidrogenáz-ból viszont kettő található a mitokondriumban a citrát ciklus tagjaként. Mindkét enzim működését azonban gátolja a citromsav. A harmadik NADP+ függő izocitrát-dehidrogenáz a sejtplazmában található, működését azonban nem befolyásolja a citromsav. Az idio-fázisra jellemző NADP+ hiány esetén természetesen ez az enzim sem működik. A citrát ciklus enzimeinek a jelenlétére vonatkozólag meglehetősen eltérő adatok találhatók az irodalomban. Sok szerző szerint a termelő törzsben nem található meg az α-ketoglutársav dehidrogenáz., viszont működik az izocitrát-liáz által elindított glioxilát ciklus. Sőt ez a ciklus nem csak acetát jelenlétében aktív, de különlegessége, hogy a glükóz nem represszálja, sőt glükóz szénforráson is aktív. Ez az izocitrat-liáz talán gyenge volt a Wehmer által izolált Penicillium glaucum törzsben, ahol először figyeltek meg citrát képződést glükózból az oxalát képződés melléktermékeként. Az α-ketoglutársav-dehidrogenáz hiánya egyébként nem jelent problémát, mert a citrát ciklus többi tagja oxálecetsavból reduktív folyamat keretében is képződhet elegendő mennyiségben, sőt a malát-dehidrogenáz esetében ez az út termodinamikailag előnyösebb (Kubicek C. P., Rőhr M. 1977 Eur. J. Appl. Microbiol. 4:167) A fumaráz enzim által katalizált reakcióban a szabadenergia változás olyan csekély, hogy a reakció teljesen reverzibilis. A borostyánkősav-dehidrogenáz működését az oxálecetsav befolyásolja. Az eddig tárgyaltakból látható, hogy az alloszterikus enzimek hibás működése, a konstitutív piroszőlősav karboxiláz nagy aktivitása, valamint a NADP+ függő mitokondriális izocitrát dehidrogenáz-ok citráttal való gátolhatósága lehetőséget ad a citromsav képződésére és a környezetbe való felszaporodására. Kérdés hogyan oldja fel a jóltermelő törzs anyagcsere rendszere az ATP (gátló) szabályozó hatását. A reakciósorban szereplő alloszterikus enzimek (fruktózfoszfát-kináz, a piruvát-kináz, a piroszőlősav dehidrogenáz és a citrát-szintetáz) ATP érzékenysége ugyanis a citromsavat termelő mutánsokban is változatlanul jól mérhető. A citromsav képződés glükózból nem igényel ATP-t, sőt némi felesleg marad (egy ATP) minden citromsav molekula képződésénél. A glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogénezésekor, valamint az actil-CoA képződésekor megjelenő NADH visszaoxidálása viszont az oxidatív foszforilezés eredményeként az ATP szintet a kritikus érték fölé emelné, ami a citromsav képződés drasztikus csökkenésében jelentkezne. NADH NAD+
>H2O (cianid-rezisztens szalicilhidroxamáttal gátolható) Az elektron útja az oxigénhez Röhr és Kubicek vizsgálatai szerint a citromsavat termelő törzsekben a NADH visszaoxidálására szolgáló alternatív légzésnek nevezett út egy flavin enzim segítségével ATP képződés nélkül juttatja az elektront a légköri oxigénre víz képződés közben (Kubicek C. P., Rőhr M. 1978 Eur. J. Appl. Microbiol. 5:263). A NADH hordozta energia ez esetben hőtermelés formájában jelentkezik. Ezért a technológiai folyamatban a hőelvezetés — a rendszer hűtése — fontos szerepet nyer. Ennek a hőmennyiségnek a hasznosítása üzemi szinten a termék árát is kedvezően befolyásolhatja. Ez a cianid rezisztens, de szalicil-hidroxamáttal gátolható elektron transzport
158
mechanizmus magasabb oxigén szintet igényel mint a terminális oxidációban működő citokróm-oxidáz. Ebből következően nem meglepő, hogy az oldott oxigén szint átmeneti csökkenése a citromsav képződés leállásával jár, miközben a növekedésben, szárazanyag tartalom változásában károsító hatás nem jelentkezik. — Batti vizsgálatai szerint a citrát képződés sebessége könnyen visszaállítható, ha a levegőztetés újraindítása előtt a tenyészet pH-ját nátrium-hidroxiddal pH=4 körüli értékre emeljük. Néhány órai növekedés után újra indul a citromsav termelés. — Fokozni lehet a citromsav képződést az oxigén parciális nyomásának a növelésével, a levegő oxigéntartalmának emelésével. Döntő jelentőségű az eljárás eredményessége szempontjából a táptalaj alacsony foszfát tartalma. A foszfát szint emelése ugyanis a növekedést serkenti, ez igényli a NADPH képződés fokozását, és előnyben részesíti a cukorsavak képződését. A foszfátszint csökkentése nem könnyű feladat a gazdasági szempontból előnyös természetes eredetű tápanyagok felhasználásakor. Sok problémát jelentett a nyomelemek szerepének a tisztázása. Jelenlétük általában káros, ezért a technológiai folyamatban gondoskodni kell a természetes eredetű anyagokat tartalmazó táptalaj előzetes ionmentesítéséről. A Clark D.S. és munkatársai által összeállított táblázat (Biotechnol. Bioeng. 8:463 1966) bemutatja az Aspergillus niger számára a citromsavtermelés szempontjából még elviselhető fémion mennyiséget. Fémion
Mennyisége
-mg/L
Aluminium Kalcium Kobalt réz (cupri ) vas (ferro) Magnézium Nikkel Cink Mangán Összes ion Össz. ion kivéve Mn
AlIII CaII CoII CuII FeII MgII NiII ZnII MnII
5 80 0,1 3 100 20 0.1 5 1 adott koncentrációban adott koncentrációban
A fémionok között a mangán szerepének a biokémiai magyarázata nem könnyű feladat, mivel a szénhidrát anyagcsere hálózatában tárgyalt néhány enzim stabilitását, aktiválását éppen a mangán ion segíti elő. Mégis mindent összevetve a citromsav termelés szempontjából előnyös a mangán hiány. Ez esetben a tenyészet mikroszkópi képe megváltozik, abnormális göcsörtös hifák alkotják a mikro-kolóniákat, mikro-pelleteket. Mangán hiány hatására a pentózfoszfát ciklus aktivitása általában emelkedik, a trikarbonsav ciklus enzimeinek a szintje pedig lényegesen alacsonyabb értéket mutat. Ugyanakkor nagyobb mennyiségben találjuk a gombasejtben (pool) az aminosavakat, a piroszőlősavat, oxálecetsavat és az ammónium iont. Alacsony a sejt fehérje és nukleinsav tartalma, csökken a triglicerid és a foszfolipid szint. Szignifikánsan emelkedik viszont a sejtfal kitin tartalma, miközben a sejtfal ß-glukán és galaktomannán tartalma határozottan csökken. Az ionmentesítés egyik előnyös módjaként komplexképző káliumferro-cianidot adnak a táptalajhoz. Ez a komplexképző vegyület a növekedési aktivitás visszafogása, tehát az idiofázis fenntartása szempontjából is előnyös. A mangán citromsav termelést csökkentő hatása cikloheximiddel jelentősen csökkenthető. A környezetbe kiválasztott citromsav mennyiségét 0,001 mM mangán (55µg/L) 45 %-ra 0,01 mM (0,55 mg/L) mangán 28 %-ra csökkenti. 20 µg/ml cikloheximid jelenlétében a gátló hatás alig jelentkezik, 10-15 %-ot sem ér el. Ugyanakkor a mitokondriumban folyó fehérjeszintézist gátló klóramfenikol nem befolyásolja a mangán citromsavképzést befolyásoló hatását. Megjegyzendő, hogy az utóbbi időben előállították a jól termelő törzs mangán rezisztens variánsát. Az ipari alkalmazására a gyártási titok fátyla borul.— Érdekes eredményeket hozott a rövidszénláncú alkoholok hatása. Mayer vizsgálatai szerint, a plazmalemma szerkezetében okozott változás előidézésével a tenyészethez adott metanol (1-3%) jelentősen képes növelni a képződő citromsav mennyiségét. A szénlánc növelésével (etanol, propanol) az előnyös hatás csökken. A citromsav termelés szempontjából meghatározó jelentőségű az oltóanyagot előállító laborat,órium szerepe. A termelő üzemek piaci aktivitása olyan alacsonyra szorította a termék árát, hogy csak a legjobban termelő törzsekre kimunkált technológiát alkalmazó cégek maradhatnak versenyben. A sikeres cégek központi törzsfejlesztő laboratóriumai monopol helyzetük megőrzése céljából nem hozzák nyilvánosságra eredményeiket. A termelő üzemek minden esetben a központi laboratóriumból kapják az oltóanyagot, amelyből a gyártási eljárás végén csak csökkent termelő képességű törzs nyerhető vissza. Az oltóspóra előállítása, az állandó ellenőrző mérések alapján kiválasztott kiváló képességű mutáns felszaporítása (egészségi szempontból a légúti fertőzés megakadályozása érdekében) különleges biztonságot jelentő körülmények között, hermetikusan zárt légkondicionált gumikesztyűs boxokban folyik. Ezekből a zárt termosztátokból az oltásra használható spóratömeg aszeptikusan zárt formában kerül a felhasználó üzembe. Az oltóanyag előállítására szolgáló zárt rendszer kizárja annak a lehetőségét, hogy az oltóanyag a környezetünkben
159
nagy gyakorisággal előforduló vad Aspergillus törzzsel fertőződjön. A gyártás szempontjából ez annál veszélyesebb minél korábbi lépésben kerül a vad törzs az oltóanyagba. A vad törzsek ugyanis rövid idő alatt, könnyen túlnövik a magas termelőképesség miatt hátrányos helyzetben levő nemesített varánst, és ezzel a fő fermentációban a citromsavtermelés jelentősen csökkenhet. Az oltó-spóratermelés utolsó fázisát már az üzem végzi, mivel az itt bekerülő egy-két idegen spóra már nem okoz végzetes tragédiát. A citromsav képződést hátrányosan befolyásolhatja az oxálecetsav hasadásával járó oxálsav képződés, amely reakciót a vas ionok serkentik. Ezért az ionmentesítés a citromsavtermelésre kifejlesztett eljárás szempontjából előnyös. COOH | C=O | H-C-H | COOH
Fe++
COOH | COOH
H 2O
CH3 | COOH
oxálsav képződés CaCO3 jelenlétében A másik glükózt fogyasztó reakció a fonalas gombák glükóz-oxidáz aktivitása. Ez a flavin enzim közvetlenül képes glükonsavvá oxidálni a tápközegbe adott glükózt. A citromsavtermelés szempontjából optimális savanyú körülmények között (pH=3,5 alatt) azonban ez a specifikus glükóz-oxidáz nem működik. — A fonalas gombák glükonsav termelő képességét Currie és munkatársainak gyakorlati eredményeire támaszkodva nagyipari méretben is hasznosítják. A Penicillium luteum és az Aspergillus niger törzsekkel optimális körülmények között 50-60 óra alatt 90 %-nál jobb hatásfokkal folyik a glükóz oxidációja. 1937-ben Moyer és munkatársai olyan aktív Aspergillus niger törzset izolált, amely egy nap alatt literenként 200 g glükózt oxidált 95 % elméleti hatásfokkal, ha a reakcióelegy kalcium-karbonátot is tartalmazott. ΟΗ Ο | || H-C C | | H-C-OH O H-C-OH | glükóz-oxidáz | HO-C-H HO-C-H | | H-C-OH H-C-OH | FAD FADH2 | H-C H-C | | H-C-OH H-C-OH | | H H
H2O O
Ο || C-OH | H-C-OH | HO-C-H | H-C-OH | H-C-OH | H-C-OH | H
A kofaktor visszaoxidálása hidrogénperoxid képződése közben egy oxigén molekulát fogyaszt. Ezt a toxikus terméket a mikroorganizmusban működő kataláz azonnal bontja. O2 +
FADH2 H 2O 2
FAD
+
H2O
+
H 2O 2 1
/2 O2
A glükonsav−δ−lakton ugyan spontán hidrolizálhat glükonáttá, az Aspergiullus-ban azonban egy specifikus laktont hidrolizáló enzim működése észlelhető. A glükóz-oxidázt az Aspergillus niger sejtmentes kivonatából D. Müller izolálta 1928-ban (Biochem Z. 199: 136). Később Franke W. és munkatársai (Zbl Bakt. I. 191-94, 1963), valamint Keilin D. és Hartree E. F. (Biochem. J. 42:221, 1948) megállapították, hogy ez a FAD tartalmú flavoprotein a D-glükóz ß-anomerjét 150-szer gyorsabban képes oxidálni, mint az α -D-glükózt. Lehet, hogy a rendszer egy mutarotáz aktivitással rendelkező fehérjét is tartalmaz. Van Dijken J. P. és Veenhuis M. vizsgálatai szerint a glükóz-oxidáz (Eur. J. Appl. Microbiol. 9:275, 1980) az Aspergillus niger sejtplazma peroxiszómáiban található. Nem ismert azonban sem az enzim, sem az általa előállított glükonsav élettani szerepe. Az enzim 10,5 % szénhidrátot tartalmazó 186000 moltömegű glükoprotein. Prosztetikus csoportként két szorosan kötött FAD-ot tartalmaz. A hőérzékeny (50 oC) enzim pH=5,5.-nél működik optimálisan. A glükóz-oxidáz egyes gombatenyészet szűrt levében is megjelenik. Néhány szerző köztük Kecholaty W. "Penatin" néven (Arch. Biochem 273, 1943), Coulthard és munkatársai "Notatin" néven (Nature 150:634, 160
1942) Roberts és munkatársai "Penicillin-B" néven (J. Biol. Chem. 147:47,1943) a negyvenes évek elején antibiotikumként írták le ezt az enzimet. Megtévesztette a szerzőket a glükózt tartalmazó táptalajon felszabaduló hidrogénperoxid dezinficiáló hatása. Azóta ezt a hatást az élelmiszeripar a tojásfehérjepor előállításánál a készítményben levő 0,5 % glükóz eloxidálására használja. Az enzim specifikus volta miatt a glükóz kvantitatív mérésére is használható. Gyorsasága, megbízhatósága miatt ez a tapasztalat analitikai módszerré fejlesztve bevonult a klinikai gyakorlatba. A glükonsav képződés szempontjából előnyös az 1-1,5 M glükóz koncentráció, a tápközeg csekély foszfát tartalma (80-90 mM) és a nitrogén éhezés (20-30 mM). A fémionok közül a mangán jelenléte (1-10 mM) kritikus. A reakció oxigénigénye igen nagy.A reakcióelegy hidrogén-ion koncentrációja meghatározó jelentőségű (pH=4,5-6,5). Savanyú körülmények között (pH=3) az enzim nem működik. CITROMSAVGYÁRTÁSI FOLYAMATOK KEMÉNYÍTŐ TARTALMÚ IPARI MELLÉKTERMÉKBŐL Igen egyszerű tradicionális japán módszert használnak különféle keményítőt tartalmazó ipari melléktermék hasznosítására. Ez az eljárás az Aspergillus niger poliszacharidbontó képességét is hasznosítja. Kihozatalban ezek az eljárások nem közelítik meg a nagyipari eredményeket. Ismertetését indokolja, hogy élelmiszeripari mellékterméket hasznosít olyan egyszerű módon, amely egy iparilag elmaradott területen is megvalósítható. A keményítőt tartalmazó hulladékot vízben áztatják úgy, hogy a víztartalma elérje a 70 %-ot. A massza pH-ját 5,5-re állítva sterilezik, majd tálcákra szétterítve Aspergillus niger konídiummal lefújják a felületét. 30 oC-on hagyják fejlődni. A gomba amiláz először elcukrosítja a poliszacharidot. A következő fázisban kezdődik a savtermelés. Néhány napos fejlődés után az összemorzsolt tenyészetből a képződött citromsavat ellenáramú módszerrel meleg vízzel extrahálják. A vizes extraktumból kalcium-citrát formában leválasztott hasznos termék azután tovább tisztítható. FELÜLETI TENYÉSZETBEN A század első felében épült üzemek a termelés klasszikus módszerével az Aspergillus niger mutáns felületi tenyészetével nyerik a citromsavat. Az évi citromsav szükséglet 30 %-át még ezzel az elavult, élőmunkaerő igényes, de még működőképes technológiával állítják elő. Nagyméretű termosztálható és csiramentesen levegőztethető helyiségekben állnak egymás fölött a nagytisztaságú aluminiumból, vagy saválló acélból készült tálcák. Az egymás felett elhelyezett tálcákat erős szerkezetű építmény tartja, hiszen egy-egy tálca tartalma meghaladhatja az egy tonnát. Egy-egy tálca 5-10 m2 felületet biztosít, mélysége 15 cm. A 9-10 naponként ismétlődő tisztítási, takarítási folyamat megkívánja, hogy a tálcákat tartó egység körüljárható legyen. Az eljárás nem nélkülözheti az élőmunkaerőt, a takarító személyzetet. A vízszintezett tálcák megfelelő töltő és ürítő csőrendszerrel és 12 cm magasságban túlfolyóval vannak felszerelve. A tálcában oltáskor a táptalaj 10-12 cm mélységű réteget alkot. A csíramentesre szűrt levegő bevezetését úgy oldják meg, hogy minden tálca szigorúan azonos mennyiségű levegőt kapjon. A levegő ugyanis nem csak az oxigénellátást biztosítja, de fontos szerepe van a tenyésztés közben képződő hő elvezetésében is. A folyadék felszínen történő párolgás a táptalaj keveredését, homogén eloszlását is segíti. A munkamenet első feladata a fermentáló helyiség és az eszközök kitisztítása és sterilezése. Az eljárást idegen penészek, tejsavbaktérium és élesztő elszaporodása veszélyezteti. Szódás lemosás után az egész rendszert kéndioxiddal, vagy formalin gázzal fertőtlenítik, majd ammóniával való közömbösítés után steril levegő fúvással kiszellőztetik. A hermetikusan zárt helyiségekbe menet közben nem lehet belépni. Az eljárás legkényesebb része a táptalaj előkészítése. Szénforrásként a szacharóz, glükóz, fruktóz egyformán jól használható. Gyakran használják a cukorgyári mellékterméket (melasz) szénforrásként, de épültek üzemek a lebontott keményítő hasznosítására is. Mindenekelőtt a szénhidráttartalmú koncentrátumot annyira hígítják csapvízzel, hogy a hasznosítható cukor koncentrációja 20 % körül legyen. Annyi ammóniumszulfátot, vagy ammónium-nitrátot kevernek el benne, hogy az ammónium ion tartalma 0,5-1,5 g legyen literenként. A pH-t foszforsavval 6-6,5 értékre állítják, majd 45 percig 120 oC-on sterilezik. A még meleg oldathoz adják a káliumferro-cianidot (10-100 mg/liter), amely egyrészt a nemkívánatos fémionok komplexbe vitelével a citromsav termelés szempontjából kedvező körülményt teremt, másrészt mint egy metabolizmust gátló szer, a gomba növekedését visszafogva elősegíti a citromsav termelést. Az eljárás érzékeny pontja a komplexképző szükséges mennyiségének a megállapítása. Ezt a felhasználásra kerülő nyersanyaggal végzett kísérletekben kell meghatározni. Az így előkészített steril táptalajt 40 oC-ra hűtik, hozzákeverik az oltóanyagot, majd a csővezetéken keresztül a csiramentesített helyiségben levő tálcákra vezetik. Az oltóspóra mennyiségét úgy állítják be, hogy a tálcákra m2-ként legalább 100-150 µg konídium kerüljön. A konídiumok — lévén hidrofóbok — lassan a táptalaj felszínére gyűlve kezdenek csírázni. Egy nap alatt a tápoldat felszínén egy vékony micélium hártya képződik. A 30-ik órától számítható az idiofázis. A teljesen kifejlődött micélium gyűrött fehéres rétegként úszik a tápoldat felületén. Az oltóanyagot általában az üzem területén készítik a központi laboratóriumból kapott spóraszuszpenzióval oltva. Szilárd táptalajként jól használható a sterilezett nedves kukoricaőrlemény, esetleg
161
korpa, amelyen 3-7 napos korára fejeződik be a spóraképződés, amely homogén szuszpenzió formájában használható a termelő szakasz oltására.
Citromsav elõállítása melaszból felületi tenyésztéssel 1:Tisztított melasz tartály;— 2:Melaszmérleg;—3:Táptalajfõzõ-tartály;—4:K4Fe(CN)6 oldat —5:Nitrogénforrás (célszerûen mûtrágya);—6:Sterilezhetõ tenyésztõ kamra;—7:Levegõszûrõ;–8:Páratartalom szabályzó;—9: Levegõelõmelegítõ,—10.Fermentlé gyüjtõ tartály;— 11:Micéliumaprító;— 12:Szûrésre elõkészített tenyészet gyüjtõ-tartálya;—13: vákuum dobszûrõ a micelium elkülönítésére;—14:a szûrt micélium mosó tartálya;— 15:Micélium mentes fermentlé gyüjtõtartûlya;—16:kalcium oxalát kicsapására szolgáló tartály;—17Mésztejet tároló tartály;—18:kalcium-oxalát – elválasztása – kiszûrése a reakció elegybõl,—19: kénsav tartály;— 20:Gipszkiválást segítõ tartály;—21:A csapadék vákuum szûrõvel történõ elkülönítése;—22:Nyers-sav összegyüjtésére szolgûló tartály;—23:ioncserélő a CaSO4 nyomok eltávolítása;—24:bepárló készség;— 25:kristályosító tartály A citromsav termelésre szolgáló tálcák feltöltése után megindítják a levegőztetést. Kezdetben az átfújt levegő mennyisége csekély, szerepe inkább a hőmérséklet tartásban van. A levegőt kezdetben annyira kell előmelegíteni, hogy a táptalaj hőmérsékletének a csökkenése kevesebb legyen mint 1/2 oC óránként. A tálcán levő beoltott táptalaj 30-40 óra alatt érheti el a citromsav termelés szempontjából optimális 30 oC-os hőmérsékletet. A csírázást és a növekedést a magasabb hőmérséklet elősegíti. A micéliumtömeg kifejlődése után a levegő mennyiségét növelni kell. Percenként a táptalaj térfogat négyszeresének megfelelő steril levegőt fújnak át a tenyésztő helyiségeken. A termelő szakaszt az alternatív légzés működése miatt jelentős hőmennyiség felszabadulása jellemzi (óránként 600-1100 kJ/m2; citromsavra számolva 12500 kJ/kg termék), aminek az elvezetéséről az átfújt levegő mennyiségének és hőmérsékletének a változtatásával feltétlenül gondoskodni kell. A táptalaj keveredését az a hőmérséklet különbség biztosítja ami a párolgás miatt a tálcák felszíne és a mélyebb rétegek között kialakul. 6-8 napi levegőztetés alatt a szubsztrátum elfogy. A citromsavképződés megindulásakor a kémhatás pH=2 alá csökken. Átlagban 0,2-0,4 kg m2 óra citromsav képződésre számíthatunk. A citromsav termelés legintenzívebb szakaszában óránként és m2-ként 1 kg citromsav képződik. Az erős levegőztetés miatt a táptalaj víztartalma tíz nap alatt 30-40 %-kal csökken. A termelési ciklus befejeződésekor a leválasztott szűrlet literenként 200-250 g citromsavat tartalmaz. (100 g glükózból 75 g citromsav remélhető) Ez az oldat a leeresztő vezetéken keresztül könnyen elkülöníthető. A visszamaradó szivacsos szerkezetű micélium tömeget ezután vízben homogenizálják majd szűrőprésen szűrik. Ezzel a mosóvízzel a megtermelt citromsav 15 %-át még ki lehet nyerni. A visszamaradt micélium tömeget állattakarmányozási célra megszárítják. Ez a szárított micélium tonnánként 150-200 kg tápanyagként hasznosuló citromsavat tartalmaz. 162
CITROMSAVTERMELÉS LEVEGŐZTETETT, KEVERT REAKTORBAN A század második felében elindított citromsavtermelő üzemek már a modernebb süllyesztett tenyésztési technológiát használják, annak ellenére, hogy ez az eljárás sokkal érzékenyebb és igényesebb a technológiai fegyelem szempontjából. A technikai berendezések fejlesztése a penicillin gyártás üzemi méretben történő megvalósítása céljából elkerülhetetlen volt. A mélyfermentációs folyamat a felületi tenyésztési módnál érzékenyebb a fémionokra és a komplexképző káliumferro-cianid mennyiségére. Nagyobb a beruházási igénye, de előnyösebb az élőmunkaerő igény szempontjából. Lehetőséget ad a technológia dinamikus fejlesztésére, amitől a termelési költségek további csökkenése várható. Az ipari gyakorlatban kétféle bioreaktort használnak: az 50-150 m3 hasznos térfogatú keverős fermentort, illetve a 200-1000 m3 térfogatú csőfermentort, amelyben a keverést a levegőáramlás biztosítja. Ezekből a nagytérfogatú fermentorokból a hő elvezetését csak jól kialakított belső hőcserélőkkel lehet elfogadhatóan megoldani. Az eljárás nagyon kényes az alkalmazott szerkezeti anyagra. A technológia igénye szerinti savas közeg miatt jó minőségű saválló acélból készülnek a bioreaktorok. A szakaszos eljárás (batch process) táptalajában a hasznosítható szénhidrát 20-25 %. A termék önköltségi árának csökkentése céljából természetes anyagokat (melasz, hidrolizált kukoricaliszt, keményítőhidrolizátum) használnak szénforrásként. Ebből következően az ionmentesítés az eljárás fontos elemét jelenti. Erre a feladatra előnyösen használható a kationcserélő gyanta. Az ionmentesítés után nyert szűrt savanyú oldatot ammóniumszulfáttal kiegészítve folyamatosan működő hőcserélőben szűkség esetén az előkisérletekben meghatározott mennyiségű káliumferro-cianiddal kiegészítve sterilezik, az előre majd 50 oC -ra visszahűtve kisterilezett fermentorba vezetik. Kémhatását ammónia gázzal pH=2,5-3 közé állítják, figyelve arra, hogy a táptalaj ammóniaCitromsavtermelés melaszból nitrogéntartalma nem haladhatja meg 1-1,5 ezreléket. A fermentáció oltásához kis térfogatú inokulum készüléket használnak, amelyben csökkentett szénhidrát tartalmú táptalajon tenyésztik az oltóanyagot. A kedvező pellet méret kialakulása miatt fontos, hogy oltáskor a főfermentációban az élőcsíraszám 5-15 x 106 legyen literenként. Ez a pelletesedés meghatározó jelentőségű. A laza szerkezetű, szálas kolóniák nagy nedves térfogatot jelentenek. A keverő nem képes az oxigénellátást megoldani a sűrű micélium szövedékbe. A kompakt kis labdacsokból (1 mm-nél kisebb pellet) álló tenyészet száraz tömege nagyobb. Egységnyi fermentor térfogatban nagyobb mennyiségű gomba jól keverhető és levegőztethető formában termeli a citromsavat. A nagyméretű csőfermentorokban a légbuborékok miatt csekélyebb térfogattömegű tenyészet folytonos felfelé áramlása tartja fenn a termelés szempontjából optimális anyagáramlást. A bevezetett levegő mennyisége kezdetben 0,1 térfogat percenként amit az igény szerint 0,4 tf %-ra emelnek. A citromsav termelés szempontjából ennél nagyobb mennyiségű levegő kedvezőbb lenne, gyakorlati okoból azonban ezt az értéken nem szokták túlhaladni. A probléma gazdaságosan megoldható a szén-dioxid mentesített, oxigénnel dúsított levegő visszaforgatásával. A tenyészet hőmérsékletét 28-32 oC-on a tenyésztési körülményeket pedig pH= 2,22,6 között tartják. A tenyészet növekedéséhez 2-3 nap szükséges. Ezután indul a citromsavtermelés, amelynek sebessége az ötödik napon éri el a csúcsot, majd ellaposodva 10-12 nap alatt fejeződik be. A termelés kinetikáját vizsgálva jól elkülöníthető a növekedési fázistól (trofofázis) a termelő (idiofázis) szakasz. A növekedési fázisban nincs citromsavtermelés, az idiofázisban viszont nincs növekedés. Jó eredmény érhető el a tápanyag folytonos adagolásával (feed batch process). Ez esetben oltáskor a fermentor a hasznos térfogat 60 %-ra van töltve és induláskor a cukortartalom nem éri el a 10 %-ot. Így hamarabb éri el a tenyészet a citromsavtermelés szempontjából előnyös idiofázist Az alacsonyabb szénhidrátartalmú fermentlében jobb a pellet képződés. A savtermelés megindulásakor kezdik adagolni a hiányzó táptalajt, mégpedig úgy, hogy az eredetileg bevitt és az adgolt táptalaj összes szénhidrát-tartalma k.b. 18 %-ot érjen el. 15 nap fermentációs idő alatt 130 kg / m3 citromsav szintet lehet ezzel a módszerrel elérni. A mélyfermentáció leállásakor a micélium elválasztása nem könnyú feladat. A szűrési segédanyag megválasztásakor figyelembe kell venni, hogy a kiszűrt micélium takarmányként kerül hasznosításra. Ezért
163
előszeretettel használnak cellulóz tartalmú növényi vagdalékot a szűrés meggyorsítás céljából, amit a tenyészettel összekeverve juttatnak a vákuum dobszűrőn szűrendő elegy számára szolgáló tárolóedényébe. A sejtmentes szűrletből az oxálsavat még savanyú pH-nál kis fölöslegben adott mésszel kálcium-oxalát formájában lecsapják. A kalcium-oxalát csapadékot újabb szűréssel eltávolítják. Eközben a citromsav monokalcium-citrát alakban oldatban marad. Az oxálsavmentesített fermentléből a sok szennyező anyag jelenléte miatt a citromsav közvetlen kristályosítása nem gazdaságos. Előnyösebb a monokalciumcitrátot trikalciumcitrát.tetrahidrát formájában leválasztani, majd a csapadékból kénsavval nyerni a szabad savat. Ez utóbbi oldatból ioncserélő gyantán való tisztítás és aktív szenes derítés után bepárlással nyerhető a tiszta kristályos termék. Kényes feladat a trikalciumcitrát leválasztása. A hőmérséklet, a pH és a mészadagolás sebességének az optimalizálása vezet eredményre. Legjobb, ha nagy kristályok képződnek, mert az apró kristályok sok szennyezést zárhatnak magukba. Előnyösen 90 oC-on, semleges körülmények között 180200 kg kálciumoxidot adnak m3-ként a monokalcium-citrátot tartalmazó szűrlethez, amelyből a trialcium-só melegen kristályosodik. A kristályosítási anyalúg betöményítve állattápszerbe keverhető Ca tartalmú maradék. A kiszűrt trikalcium-citrát.tetrahidrátból kis feleslegben adott 60 %-os kénsavval 50 oC-on szabadítható fel a citromsav. A kalciumszulfát zömét dobszűrőn elkülönítik, a csekély szerves színező anyagot aktívszenes szűréssel távolítják el. A maradék kalciumszulfát eltávolításához egy erős kation cserélő (Dowex-50) és egy közepes erősségű anion cserélő (Dowex-2) gyantát használnak. Az így nyert oldat 200-250 g citromsavat tartalmaz literenként, amit vákuumban 40oC-on karamellizálódás nélkül töményítenek. A végső kristályosítást monohidrát formában 20-25 oC-on végzik. A kiszűrt kristályokat 36.5 oC alatt szárítják. (40 oC felett a citromsav vízmentes savként kristályosodik). Az anyalúgot az utolsó aktívszenes tisztítási lépésbe töltik. Ismeretes az irodalomba más kinyerési módszer is. Ilyen amikor a nyers terméket dikálcium só alakjában választják le. Mások szerves oldószerrel extrahálják. Ezeknek előnyösebb volta nem ítélhető meg.
L- GLUTAMINSAV ELŐÁLLÍTÁSA Japánban népélelmezési cikként fogyasztott tengeri barna moszat - a Konbu - (Laminaria japonica) ízanyagát keresve az L-glutaminsav nátrium sóját találták meghatározó jelentőségűnek (Ikeda K. 1908 J. Tokyo Chem. Soc. 30:820. ) Ez a vegyület a konzerv-ipar fontos alapanyagaként került használatba. Az acetilénből vagy akrilonitrilből kiinduló kémiai (Strecker) szintézissel nyert DL glutaminsav csak reszolválás után kerülhetne élelmiszeripari felhasználásra, amely művelet a termék piaci helyzetét rontja. Tudvalevő, hogy csak az Lenantiomer stimulálja az izlelőbimbókban elhelyezkedő receptorokat, a D enantiomer teljesen íztelen. Ezért a századunk első felében, főleg konzervipari felhasználásra gabona csírából állították elő ipari méretben a glutaminsavat. A csírázó növényben meginduló fehérjeszintézishez szükséges aminosavak képződésekor ugyanis a glutaminsav amino donorként nagy mennyiségben kerül felhasználásra a transzaminációs folyamatokban. A szétroncsolt csíra vizes szuszpenziójából a glutaminsav - lévén amino dikarbonsav - könnyen kinyerhető. A nyomokban megtalálható természetes eredetű szennyezés nem zavarja az élelmiszeripari felhasználókat. Az antibotikum termelés céljára kifejlesztett bioreaktor az ötvenes években lehetőséget adott viszonylag elfogadható áron élelmiszeripari alapanyagok előállítására. Az antibiotikum termelő törzsek termelőképességét növelő genetikai, törzsnemesítési munkák eredményeként ugyanis szabad fermentációs kapacitás jelentkezett. (Ekkor került a citromsav termelés is kevert, levegőztetett fermentorokba). Japán kutatók eredményei irányították a figyelmet az aminosavak mikrobiológiai előállíthatóságára. Szorgalmas munka eredményeként, mintegy 2000 átvizsgált prokariota és eukariota között több olyan törzs is akadt amelyik glükózt hasznosítva nagy mennyiségben választott ki glutaminsavat a tápközegbe. Az átvizsgált baktériumok 20 %-a, a Streptomyces-ek 30 %-a, az élesztők 30 %-a és a fonalas gombák 10 %-a volt képes jelentősebb mennyiségű glutaminsav kiválasztására. A mikroszervezetekről szerzett élettani ismeretek alapján várható volt, hogy ammónia jelenlétében a képződő glutaminsav felszaporodik a környezetben, ha az α-ketoglutársav dekarboxilezésének a lehetősége csökken. Escherichia coli-ból mutagén kezelésssel előállítottak a glutaminsavat termelő α-ketoglutarátdehidrogenáz hiányos törzset. Az élelmiszeripar azonban az E. coli alkalmazásától tartózkodik Kiemelkedő termelő képességet mutatott egy Gram-pozitívan festhető baktérium csoport néhány variánsa. Kinoshita és munkatársai által izolált baktérium törzset a termelőképességére utalva Micrococcus glutamicus néven írták le (J. Gen. Appl. Microbiol. 3:276) Megjegyzendő, hogy az ipari hasznosíthatóság céljából végzett kutató nem rendszertani szempiontból vizsgálják a számukra elérhető mikroorganizmusokat. Ezért a fajnév általában szoros kapcsolatban van a törzs gyakorlati értékével. A nemzetség név pedig a mikroszkópi látvány alapján adatik. Ebből következik, hogy az első felfedezést követően a txonomus a törzs rendszertani helyét a kornak megfelelő vizsgálatok alapján illeszti a rendszertani helyére. Ezt a 30 g/liter glutaminsav termelésére képes törzset a Kiova & Hakko Kogyo Co. Ltd. hamarosan ipari termelő törzsként hasznosította Corynebacterium glutamicum néven. Mások Brevibacterum, Microbacterium, illetve Arthrobacter néven izoláltak glutaminsav termelésre alkalmas egymástól alig megkülönböztethető törzseket. A vegyipar által előállított mikrobiális eredetű nátrium-glutamát évi mennyisége a század-forduló idején már meghaladja a 350 ezer tonnát. Ezek a Gram-pozitív, nem spórázó, nem mozgó baktériumok a növekedésükhöz biotint igényelnek, amit a természetes élőhelyükön a környezetben kellő mennyiségben megtalálnak. A törzsekre jellemző, hogy az α-ketoglutarát-dehidrogenáz aktivitásuk nem mutatható ki, illetve elhanyagolhatóan csekély, viszont a glutamátdehidrogenáz aktivitásuk feltűnően magas értéket ér el. A törzsek glutamát termelő képességét az izocitrát-liáz aktivitás genetikai módszerrel történő csökkentésével fokozni lehet. A glükózt mint szénforrást a Corynebacterium glutamicum törzs köztes anyagcseréje az EmbdenMeyerhof-Parnas úton, valamint a pentózfoszfát cikluson keresztül, a trikarbonsav ciklusba táplálja, ahol a szénváz citromsavon, izocitráton keresztül oxidatív dekarboxilezéssel α-keto-glutársavvá alakul. Ebből a glutarát dehidrogenáz hiány miatt felszaporodó termékből reduktív aminálással képződik a glutaminsav. Egy önálló kis ciklusként, a NADP-függő glutamát dehidrogenáz működéséhez a NAPH szintet az izocitrát-dehidrogenáz ekvivalens mennyiségben szolgáltatja. Az oxidatív dekarboxilezéskor képződő redukált kofaktort használja fel a szervezet az ammónium ion beépítéséhez. A glutaminsavat termelő szervezetekben az izocitrát dehidrogenáz és a glutaminsav dehidrogenáz aktivitás lényegesen meghaladja az átlagot. Az enzim működését a felgyülemlő glutaminsav ugyan gátolja, de ha ennek a terméknek az eltávolítása megoldódik, akkor a glutaminsav termelés akadálytalanná válik. A ciklus működésének a feltétele a rendszer anaplerotikus feltöltése. Ezt a piruvát karboxiláz és a malát enzim végzi. A karboxiláz szerepét igazolja, hogy jelzett szén-dioxid jelenlétében a glutaminsav karboxil csoportja mindig radioaktív. A piruvát karboxiláz egy nagy moltömegű, négy alegységből álló alloszterikusan szabályozott enzim komplex, amelynek működését az acetil-CoA serkenti. Az enzim lizin oldalláncához biotin kapcsolódik. Az ATP segítségével aktíválódó szén-dioxid (adenilsav-szénsav vegyesanhidrid) kapcsolódik a biotin nitrogénatomjához. A kialakuló karboxibio-citin fölöttébb aktív karboxilező ágensként reagálva a
165
166
Ez az aktiv állapotban levő szénsav származék ideális karboxilező ágens, amely piroszőlősavval reagálva oxálecetsavat képez. Az oxálecetsav feldúsulása nem fenyeget, mert acetil-CoA-val reagálva
citráttá alakul, amelyből az igen aktív NADP függő izocitrát dehidrogenáz működésének eredményeként αketoglutarát képződik. Ammónium ion hiányában azonban a környezetben megjelenik az α−ketoglutarát.
167
GLÜKÓZ ATP hexokináz ADP G-6-P
Corinebacterium glutamicum tenyészetben a GLUTAMINSAV BIOSZINTÉZIS VÁZLATA
CO2 α-ketoGLUTARÁT NADPH (+ADP) glutamát dehidrogenáz NH3 (-ATP) NADP+ (zárojelben) a szabályozó metabolitok L-GLUTAMINSAV
A foszfoenol-piroszőlősav megjelenéséig a reakciósor önfenntartó az energiagazdag foszfátkötések szempontjából, sőt NADH és NADPH felesleg mutatkozik a G6P- és GAP-dehidrogenáz valamint a piruvátdehidrogenáz működésének az eredményeként. A glioxalát ciklus részvétele az oxálecetsav képződésben glükóz szénforrás használatakor jelentéktelen, különösen az izocitrát-liáz aktivitásban sérült nemesített törzs esetében. Elvileg 1 mol glükózból 1 mol glutaminsav nyerhető. C6H12O6 + NH3 + 1,5 O2 =
C5H9O4N + CO2 + 3 H2O
168
Az ipari technológia kialakításakor az elméletileg leggazdaságosabb ideális állapotot kifejező fenti egyenletek megközelítésére kell törekednünk annak ellenére hogy ezt az elméleti értéket az ipari gyakorlatban nem lehet elérni. A 60 %-os átalakítás már elfogadható értéknek tekinthető. A termelés szintjét valójában a szénforrás koncentrációja és a glutaminsav környezetbe való kiválasztásának a sebessége határozza meg. A reakcióterméknek a környezetbe való megjelenése végeredményben természetellenes folyamat, hiszen a köztesanyagcsere értékes termékéről van szó. Ennek ellenére a glutaminsav kiválasztást a membrán áteresztőképességének a megváltozása teszi lehetővé. Tween 60 detergens adagolásával például fokozható az aminosav kiválasztása. A glutaminsavat termelő törzsek csekély szukcinát szükségletét egyrészt a viszonylag gyenge izocitrát-liáz aktivitás, másrészt az oxálecetsavból induló reduktív folyamatok elégítik ki. A glioxilsav pedig acetil-CoA felhasználásával a ciklus feltöltését segíti. A kutatómunka eredményeként kiválasztott természetes biotin igényes mutáns tiszta tenyészete a kialakított üzemi körülmények között csak fellazult membrán szintézisére képes. A biotin-szint ugyanis az acetilCoA karboxiláz aktivitást befolyásolva a membrán minőségét befolyásoló zsírsav bioszintézisben okoz zavart. A foszfolipidszintézis zavara az L- glutaminsav spontán kiáramlását segíti elő. Természetes élőhelyén a mutáns biotin igénye nem jelent élettani problémát, mert ezt a vitamint a környezetből felveheti. Olajsav auxotrófok esetében kis mennyiségben adott telített zsírsavval is gátolni lehet a membránépítőelemként nélkülözhetetlen foszfolipid képződését, mivel a zsírsav fölösleg gátolja az acetil-CoA karboxilezését. A membrán áteresztőképességét a biotin szinttől függetlenül penicillin adagolásával is növelni lehet. A sejtfal szintézis zavara ugyanis a sejt hosszanti növekedését segíti elő. A membránszintézis nem követi a sejt térfogatának növekedését, a fellazult membrán pedig átengedi a képződő glutaminsavat. A penicillin szintet ez esetben úgy kell megválasztani, hogy a tenyészet növekedése a biotinszegény körülményekre jellemző növekedést ne haladja meg. Ez a felismerés lehetővé tette a gazdaságos glutaminsav termelést biotinban gazdag olcsó szénforrás felhasználásával. Ennek felismerése a cukorgyártás melléktermékeként képződő biotinban gazdag melasz is felhasználhatóvá vált az ipar szá,ára. Nakao izolált egy L-glicerin-3-foszfát NADP+-oxidoreduktáz hiányos glicerin igényes mutánst (1970 Agric. Biol. Chem. 34:1875), amely penicillin nélkül képes volt normál paraffinből is glutaminsavat kiválasztani a környezetbe (1972 Agric. Biol. Chem. 36:809). A 0,01 % glicerint tartalmazó táptalajon a membránhoz szükséges foszfolipid szintet ez esetben a glicerin tartalom, az α-glicerinfoszfát képződés limitálta. Egy Corynebacterum glutamicum 541 jelű törzsével vezetett eljárás adatait bemutató ábra szemlélteti, hogy a növekedés kezdeti szakaszában az átmenetileg felszaporodó NADH miatt megjelenik a tejsav, az öregedő tenyészetben viszont az α-ketoglutársav. szénforrás % termék % 5 _ 10
glutaminsav sejttömeg
glükóz 4_ 8
3_ 6
2_ 4 α−ketoglutarát
1_ 2 tejsav |
|
| | | | | | | 24 48 72 96 óra Táptalajösszetétel: 100 g glükóz, 5 g karbamid (ammónia bevezetés esetenként a pH 8 szint tartása céljából), 2,5 µg biotin, 1 g káliumfoszfát, 0,25 g magnéziumszulfát, 0,01 g vasszulfát, 0,01 g mangánszulfát literenként. 28 oC hőmérsékleten Az iparban használt termelő törzs limitált biotin jelenlétében (2,5-3 µg/liter) nagy mennyiségű glutaminsavat választ ki a környezetbe. A baktérium növekedése szempontjából ez nem előnyös. A termelés szempontjából viszont hasznos a visszafogott növekedés. Ipari méretben szénforrásként 10-20 % szacharózt tartalmazó táptalajt, melaszt, vagy keményítő hidrolizátumot használnak. A glutaminsav szintézishez szűkséges
169
ammóniát vagy gázalakban levegővel elegyítve vagy karbamid formájában adagolják. Az eljárást pH=8 körüli értéken tartva vezetik. A széforrás hasznosítás általában meghaladja az 50 %-ot A tápközeg biotin tartalmának növelése − 5 µg felett − a prolinképződést serkenti. A biotin mennyiségét tizszeresre emelve glutaminsav helyett a glükózból képződő tejsav és szukcinát jelenik meg a tenyészlében. Oxigén hiány a redukált kofaktorok feldúsulása miatt a tejsav és borostyánkősav képződésnek kedvez, túllevegőztetés hatására viszont az ammónium ion kiűzése miatt a glutaminsav helyett α-ketoglutarát szaporodik fel a tenyészlében. A termék kinyerése szempontjából ipari körülmények között 10 %-ot meghaladó glutaminsav szint elérésére törekednek. Ezt a termelési szakaszban adott glükózzal érik el. A tenyésztés hőmérsékletének emelése rontja az oxigén beoldódását, azaz a tenyészet oxigénellátását. Általában 28-35 oC-on vezetett 5-6 napos fermentációs lépés végén, a beadott szénforrás felhasználása után nyert sejtmentes szűrletből történik a glutaminsav elkülönítése. A táptalajban maradó cukor zavarja a glutaminsav kristályosodását. A sejtmentes szűrletet hevítve besűrítik, a képződő csapadékot forrón kiszűrik. A nyert éles szűrletet hagyják lehűlni. 90 oCról induló kristályosodáskor apró ß formának nevezett tűkristályokat nyerünk, amely sok esetben az anyalúg szennyezését is magába hordozza. 70 oC-on vezetett kristályosodás körülményei között az α-formát, prizma alakú kristályokat nyerhetünk. Egy 1975-ben bejelentett US szabadalom (3929575) szerint a Brevibacterium divaricatum NRRL B-231 törzs inokulum táptalaja literenként 40 g glükózt, 1 g K2HPO4-ot, 0,5 g MgSO4.7 H2O-t, 1 g élesztőkivonatot és 8 g karbamidot tartalmazott A tenyésztés 16 órán keresztül 35 oC-on folyt. A 6 % oltóanyaggal oltott főfermentáció tápközege literenként 121 g glükózt, 5 g ammónium acetátot, 6 g keményítőhidrolizátumot, 1,2 g káliumfoszfátot, 1,2 g kálium szulfátot, 6 g magnéziumszulfátot kevés vasat és mangánt tartalmazott. A tenyésztés megindításakor 0,65 ml olajsavat adagolnak literenként. A pH-t ammónia adagolással 7,8 értéken tartják. A sejtszaporodási szakasz végén – általában a 14-ik órában – a tenyésztés hőfokát 32 oC-ról 38 oC-ra emelik. A glükóz szint 1 %-ra csökkenésekor kezdik a glükóz adagolást ami általában literenként 160 g glükóz adagolását jelenti. A levegőztetést úgy szabályozzák, hogy az elmenő levegő széndioxid tartalma ne haladja meg a 4.5 térfogat % értéket. A tenyészlé glutaminsav tartalma általában 35 órás korban éri el a 100 g/liter értéket. Glutaminsav teremelés ecetsavból Nagyipari méretben kémiai úton előállítható ecetsavból is gazdaságosan nyerhető glutaminsav. Ecetsav szénforrásból indulva természetesen a feltöltést a glioxilát ciklus végzi. 3 HOOC-CH3
+ NH3 + 1,5 O2
=
HOOC-CH2-CH2-HCNH2-COOH + CO2 + 3 H2O
170
ESSZENCIÁLIS AMINOSAVAK IPARI ELŐÁLLÍTÁSA A növényi fehérje aminosav összetétele lényegesen különbözik az állati szervezetben előforduló fehérje aminosav tartalmától. (kukorica: 0,2%, zab:0,5%, árpa: 0,4%, búza: 0,6%, szója 2,3%, élesztő 3,4%, tejpor:2,5%, húsliszt: 2,6% lizint tartalmaz) Ezért a növényi fehérje jobb hasznosulása takarmányként elősegíthető megfelelő arányban adott esszenciális aminosavakkal. A nem teljes értékű növényi fehérjét az állati szervezet csak saját aminosav igényének megfelelő mértékben, a saját fehérjére jellemző aminosav arányban képes hasznosítani. A tenyészállatok a számukra fölösleges aminosavakat az anyagcsere enzimrendszerének segítségével lebontják, átalakítják, a fölös szénvázat pedig elégetik. A takarmány kukorica 0,11% metionint 0.21% lizint 0,36% treonint tartalmaz a takarmány búza 0,23% metionint 0,61% lizint 0,50% treonint tartalmaz a takarmány árpa 0,17% metionint 0,41% lizint 0,36% treonint tartalmaz a szójaliszt 0,53% metionint 2,31% lizint 1,41% treonint tartalmaz. Az ideális takarmányban a lizin hiány kielégítése után a treonin és a metionin igény kielégítése szükséges. A mikrobiológiai eljárással nyerhető aminosavak közül általában a lizin, a triptofán és a treonin kerül felhasználásra tápanyagkiegészítőként. A világ évi lizintermelése 250 ezer tonna. A treoninból 10 ezer tonna kerül felhasználásra. Az évi triptofán termelés mindössze 200-300 tonna. Az állattápszerben évenként felhasznált 300 ezer tonna DL metionin kémiai szintézissel készül, mert a sertések és a szárnyasok racemáza a DL-metionin 100%-os hasznosulását biztosítja. Cél a fehérjeszintézis szempontjából ideális aminosav készlethez megközelítése. Ha a kukorica lisztet 0.2% lizinnel kiegészítjük, akkor a fehérje hasznosíthatósági hányadosa 0.85-ről 1.05-re emelkedik, de ha 0.2% lizinen kívül még 0.07% triptofánt is adagolunk akkor a hasznosíthatósági hányados 2.55-re emelkedik. A rizs fehérjetartalmának kiegészítése 0.2% lizinnel és ugyanennyi treoninnal a hasznosíthatósági hányadost 0.5-ről 2.61-re növeli. Még a szójaliszt is kiegészítésre szorul. Kémiai szintézissel nyerhető metioninnal válik teljes értékűvé. A létért folyó küzdelemben kialakulult szabályozó mechanizmusok működése az eredeti vad törzsekben a bioszintézis egyes végtermékeinek a túltermelődését eredményesen gátolva biztosítja az élő szervezet számára a gazdaságos létfenntartást. A szabályozási mechanizmus az élő világban azonos elvek szerint működik, de nemek, fajok sőt törzsek esetében, a szabályozás kivitelezésében eltérések lehetnek. A szakember éppen ezeket a kivitelben jelentkező különbségeket hasznosítja. Az esszenciális aminosavak fermentációs úton folyó előállítása nem más, mint a modern mikrobiológiai alapkutatás eredményeinek gyakorlati alkalmazása; nem kevesebb, mint az aminosavbioszintézis szabályozó mechanizmusainak megismerését követő tudatos genetikai munka eredményeinek ipari gyakorlatba való használata. A citoplazmában folyó nitrogén anyagcsere didaktikai szempontból anabolikus és katabolikus folyamatra különíthető. Valójában a két folyamat egymáshoz kötődve, egymást kiegészítve működik szoros kapcsolatban a szénhidrát anyagcserével. A mikrovilág ide sorolt anabolikus folyamatai életfontosságúak az egész élővilág fennmaradása szempontjából, mert az esszenciális aminosavak bioszintézisére, a légköri nitrogén megkötésére, bizonyos vitaminok, cobalamin származékok előállítására csak a mikrovilág, ezen belül a prokariota flóra képes. Az aminosav anyagcsere részletes megismerése, az aminosav képződés szabályozó mechanizmusainak felderítése a mikrobiológiai biokémia művelőinek kiemelkedő teljesítménye volt az ötvenes években. Ezek az eredmények ma tankönyvi adatnak számítanak. Az aminosavakat aktiváló enzimek csekély mérvű szubsztrát-specifitása csak meghatározott összetételű aminosav készlet [pool] esetén tudja biztosítani a tRNS állomány helyes feltöltését. A fölösleges aminosavak eltávolítása tehát létkérdés a mikróba számára. A koncentráció viszonyok, az arányok bármilyen okból bekövetkező eltolódása, hibás tRNS feltöltést és ennek következményeként hibás, működésképtelen fehérjék szintézisét okozhatja. Nem meglepő tehát, hogy a bioszintézis és a lebontás szabályozottságának bonyolultan, de eredményesen működő mechanizmusa alakult ki az evolúció eredményeként. A gazdaságos életvitel érdekében a citoplazmában található peptidázok azokat a fehérjéket, amelyek már nem kerülnek felhasználásra lebontják vagy azért, mert hibásan készülve működésképtelenek, vagy pedig jelenlétük szükségtelen, építőelemeik más irányú felhasználásra kerülhetnek.A fehérjeszintézishez szükséges aminosavak előállítására az úgynevezett vad törzsek általában képesek. Ez a bioszintézis a citoplazmában, -a szénhidrát anyagcsere köztestermékeit hasznosítva,- nem csekély energia befektetéssel illetve anyagfelhasználással szigorúan szabályozott körülmények között folyik. Az aminosav készlet optimális minőségi és mennyiségi összetételét a bioszintézis első reakcióját katalizáló enzimre ható visszacsatoló (feed-back) mechanizmus szabályozza, szükség szerint gátolva vagy serkentve működését. Egy-egy aminosav túlzott feldúsulása a túlélés érdekében a lebontására specifikus enzimrendszerek képződését indukálhatja. A körülményektől függő mértékben a mikroba a bioszintézisben érdekelt enzimek mennyiségét a represszor eltávolításával - azaz a struktúrgének átírásának engedélyezésével - a szükségletnek megfelelő mértékre növelheti (derepresszió). Mivel a fehérjeszintézis anyag és energiaigényes folyamat, a gazdaságos életvitelt szolgálja a szabályozást finomító második rendszer (attenuator) működése, amely végül is a feltöltött tRNS mennyiségének függvényében engedélyezi a bioszintézisben érdekelt gének átírását.
171
LIZIN bioszintézis Vizsgáljuk tehát az Escherichia coli-ban kialakult mechanizmust, amely aszparaginsavból indulva nem csak a lizin finoman szabályozott képződését, de más esszenciális aminosavak treonin, metionin és az elágazó szénláncú valin, izoleucin és leucin bioszintézisét katalizálja. Az összetett rendszer gazdaságos működtetését egyrészt izoenzimek működése biztosítja, másrészt a kritikus elágazási pontokon a végteremék okozta visszacsatolás (feed-back mechanizmus) hatása érvényesül. Megjegyzendő, hogy a diaminosav a peptidoglükán sejtfal felépítés nélkülözhetetlen eleme A sejtfal felépítés bifunkcionális építőelemként szerepel az L-lizin, az L,Ldiaminopimelinsav illetve a mezo-diaminopimelinsav. Esszenciális aminósavak szabályozott szintézise ASZPARTÁT aszparaginsavból (Escherichia coli) [HomTre] [Liz] {strukturgén NEVE} ATP [1] izoenzim képződését [Tre és Ile] gátolja {lysC} aszpartát-kináz [2] izoenzim képződését [Met] gátolja [1] [2] [3] [3] izoenzim képződését [Liz] gátolja ADP [1a] izoenzim képződését [Tre] gátolja ASZPARTIL FOSZFÁT [2a] izoenzim képződését [Met] gátolja NADPH feed-back gátlás jelzése: |Tre] |Liz] |Hom] |Ile] |Val] |Leu] {asd} aszpartátfélaldehid-dehidrogenáz NADP+ ASZPARTÁT-ß-FÉLALDEHID [Tre] [Met] NADH
A felsorolt esszenciális aminosavak finoman szabályozott bioszintézise aszparaginsavból indul. Az igényeknek megfelelő mértékben oxálecetsavból képződő aszparaginsav foszforilezését első lépésként három represszálható izoenzim végzi. Az izoenzimek képződését szelektíven az összekapcsolódó bioszintézis út végtermékei (az egyiket 172
lizin, a másikat metionin, a harmadikat pedig az izoleucin) represszálják. Ez indokolt, mert az aszpartilfoszfátból (aszparaginsav-foszforsav vegyesanhidrid) NADPH igényes reduktív hidrolízissel képződő aszparaginsav-ß-aldehid valójában olyan közös köztes termék, amely kiindulási anyag az említett aminosavak bioszintéziséhez. A szabályozás enzimszinten is érvényesül. A lizinnel represszálható izoenzim működését a lizin - mint végtermék - alloszterikusan is gátolja. Az izoleucinnal és treoninnal represszálható izoenzim működését pedig két végtermék, a treonin és a homoszerin befolyásolja. A metioninnal represszálható izoenzim alloszterikus szabályozottságáról nincs adat. Ez az izoenzim tehát biztosítja a teljes rendszer működéséhez szükséges aszpartát-ßfélaldehid alapszintet. Az aszpartát β-félaldehid piruváttal reagálva dihidrodipikolinát-szintetáz (dapA) jelenlétében 2,3dihidrodipikolináttá kondenzálódik. Az enzimszint a termékképzést befolyásolja. A kondenzációt végző enzimnek a specifikus aktivitása a végtermék képződését meghatározza, működését a lizin felszaporodása alloszterikusan szabályozza. Az aszparaginsav-ß-félaldehidből két NADPH függő homoszerin-dehidrogenáz izoenzim végzi a többi esszenciális aminosav képződéséhez szükséges homoszerin szintézisét. Az egyik képződését metionin represszálja, a másik dehidrogenáz képződését pedig a treonin és az izoleucin felszaporodása befolyásolja. Ez utóbbi működését a treonin, mint végtermék alloszterikusan is gátolja A homoszerinből indul a cisztationon és homociszteinen keresztül vezető metionin szintézis. Az első enzim aktivitását - a homoszerinszukcinil-transzferáz működését - a metionin, mint végtermék alloszterikusan gátolja. A homoszerinből induló treonin szintézis első enzimének, a homoszerin-kináznak a működését természetszerűleg a treonin szabályozza alloszterikusan. Az izoleucin a treoninból induló bioszintézis első enzimének a treonin dezamináznak a működését gátolja alloszterikusan, ugyanakkor represszálni képes a bioszintézisben résztvevő enzimek képződését. Az izoleucin szintézisút második enzimének, az acetohidroxisav szintetáznak a működését a valin gátolja alloszterikusan, mivel a valin szintézis szempontjából ez szerepel első enzimként. Az enzim közös használata miatt az ebből adódó veszélyt úgy oldja fel a rendszer, hogy a treonin dezamináz által szolgáltatott α -ketovajsav előnyt élvez a piruváttal összehasonlítva a kondenzációt katalizáló enzim aktív felületén. A leucin szintézishez a valin szintézis köztesterméke az α -ketoizovaleriánsav szolgál kiindulásul. A négy reakciólépést igénylő bioszintézis első enzimének az acetil-CoA-t igénylő izopropilmalát szintetáznak a működését a leucin gátolja alloszterikusan. Az elágazó szénláncú aminosavak bioszintézisének bonyolult szabályozottsága külön figyelmet érdemel a közösen használt enzimekre való tekintettel. A zavartalan fehérjeszintézishez ugyanis a három aminosav optimális aránya szükséges. Erre való tekintettel bármelyik aminosav feldúsulása, vagy a környezetben való megjelenése esetén indukálódik a lebontást végző enzimrendszer, amely azután kiegyenlíti az eltérést. A lizin ipari előállítását célzó kutató-fejlesztő munka az ismeretek bősége miatt kezdetben a Gramnegatív baktérium törzsekre vonatkozó ismeretekre támaszkodva igyekezett eredményt felmutatni. A lizin előállításának első ipari méretben alkalmazott biotechnológiai módszere ma csak tudománytörténeti érdekessége miatt említendő. Davis már 1952-ben észlelte, hogy az Escherichia coli-ból nyert lizinigényes auxotróf a bioszintézis út utolsó lépését katalizáló enzim {lysA} hiánya, illetve működésképtelensége miatt limitáló mennyiségű lizint tartalmazó táptalajon jelentős mennyiségben halmozza fel a mezo-diamino-pimelinsavat (9g / liter). A lizin hiány egyrészt a bioszintézisben szereplő enzimek derepresszióját okozza, másrészt lizin hiányában a feed-back szabályozó mechanizmus sem működhet. Az akkor kidolgozott eljárással a E. coli (ATCC 13024) mutáns felhasználásával literenként 24 g diamino-pimelinsavat termeltek, amit egy második biokonverziós lépésben az Aerobacter aerogenes (ATCC 12409) diamono-pimelinsav dekarboxiláz aktivitását hasznosítva alakították lizinné. Ez utóbbi enzim - esetleg az enzimet termelő mikroorganizmus - reaktorba rögzítve, hosszabb ideig használható a lizin igényes Escherichia coli tenyészlében felhalmozódó mezo-diamino-pimelát dekarboxilezésére, lizinné alakítására. Gazdaságosabbnak látszott azonban olyan eljárás kifejlesztése, amelyik közvetlenül lizint szolgáltat. Ennek érdekében nagy számban vizsgálták meg a természetes forrásból izolált mikroorganizmusokat abban bízva, hogy sikerül olyan törzseket találni, amelyek az esszenciális aminosavak gazdaságos termelésére lehetőséget adnak.
Lizin képződés az élesztőkben Lizin termelés szempontjából az élesztőket is megvizsgálták, mivel a takarmányélesztő gyártása és felhasználása világszerte a közegészségügyi hatóságok által elfogadott gyakorlat volt. A gombákban a prokariotáktól és a növényektől eltérően nem aszparaginsavból indulva képződik a lizin, hanem glutaminsavból. A bioszintézis útja α-ketoglutársavból aminoadipinsav-félaldehiden keresztül vezet. Az élesztőben folyó lizin bioszintézis genetikai hátterét részletesen vizsgálva a lizin képződés fokozását célzó genetikai beavatkozás eredménytelensége némi magyarázatot lelt, mert Lindegren és Mortimer eredményei szerint a bioszintézisben résztvevő enzimek struktúrgénjei szétszórva más-más kromoszómán találhatók.
173
HOOC-CH-CH2-CH2-COOH | NH2
GLUTAMÁT
L-lizin bioszintézis Saccharomyces cerevisiae ill. Neurospora crassa tömlős gombában
A szacharopin dehidrogenáz IX a δ-adenil-α-aminoadipát-δ-félaldehid hidroláz II és VII. A homocitrát-dehidrogenáz XII, az α-aminoadipát-δ-félaldehidglutamát-reduktáz XII, (II-L), VII a homoizocitrát-dehidrogenáz V kromoszómán található R irányban leolvasható formában Nem véletlenül – az ipar képviselői – minden energiát a lizin termelésre alkalmas prokariota kiválasztására illetve előállítására (nemesítésére) forditották. A természetben előforduló törzseket kereső kutatómunka eredménytelenségét tapasztalva részletesen vizsgálták, hogy milyen előfeltételei vannak egy
174
bioszintetikus termék túltermelésének és a tenyészközegben való feldúsulásának? Elvileg a szintézisút visszacsatoló-szabályozó mechanizmusát (feed-back) hatástalanítva a bioszintézishez szükséges építőelemek és kofaktorok jelenlétében akadálytalanná nemesedik a termékképződés. Fokozható a termékképződés a bioszintézisben résztvevő enzimek mennyiségének összehangolt növelésével, a represszált állapot felfüggesztésével. A represszív hatást kifejtő vegyület analógjával szemben megjelelnő rezisztencia sok esetben az eredeti vegyület bioszintézisét végző enzimek derepressziójával jár. A végtermék analógokra kifejlesztett rezisztencia nemcsak a bioszintézisben résztvevő enzimek képződésének a represszióját függeszti fel, de a feedback szabályozás felfüggesztése a hasznos-termék képződésének a növekedéséhez vezet. A kiválasztott termék feldúsulását biztosítja a továbbalakításért felelős enzim inaktiválása. Amennyiben a továbbalakuló termék valamilyen esszenciális vegyület képződését segíti, akkor előnyös erre az anyagra hiánymutánst keresni a mutagén kezelést túlélő egyedek között. Hatásos módszer lehet a bioszintézisért felelő enzimek mennyiségének a fokozása az enzimek génjeinek a gazdasejtbe juttatásával, illetve a kópia szám többszörözésével. A működőképes enzimek mennyiségének a növelése csak az esetben szolgálja a kiválasztott termék mennyiségének a növelését, ha a szintézishez szüksége építőelemek, valamint a kofaktorok kellő mennyiségben és minőségben rendelkezésre állnak. A genetikailag adott lehetőségek kihasználását segíti a termékképződés szempontjából optimális fermentációs paraméterek meghatározása és a technológiai követelmények szigorú teljesítése. A lizint túltermelő törzs nyerése céljából első feladatként mutagén kezeléssel S-ß-amino-etil-ciszteinre (lizin analóg) rezisztens törzset állítottak elő. A lizin rezisztencia kifejlesztésére az S-amino-etil-ciszteinen kívül sikerrel használják L-lizin analógként az amino-etil-O-szerint, a γ-metil-lizint és az α-klór-ε-amino-kaprolaktámot, valamint az α-amino-δ-hidroxi-lizint, lizin-hidroxamátot . H-N-H H-N-H H-N-H H-N-H H-N —– H-N-H H-N-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H ε H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C–OH H-C-H δ H-C-H S O H-C-CH3 H-C-H H-C-H H-C-H γ H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H H-C-H β H-C-NH2 H-C-NH2 H-C-NH2 H-C-NH2 H-C–Cl H-C-NH2 H-CNH2 α O=C–OH O=C–OH O=C–OH O=C–OH O=C —– O/=C–OH O=C H–N–OH L-lizin SAE-Cys AEO-Cys γ-Me-lizin Kaprolakt. δ-OH-lizin Lizin hidroxamát Ezek a vegyületek versengve a lizinnel nemcsak alloszterikusan gátolják a lizin bioszintézis kulcsenzimeinek a működését, de zavarják a fehérje szintézist, mégpedig olyan mértékben ahogy a lizin-tRNS aciláz működését zavarva az analóg verseng a jelenlevő lizinnel. A tRNS hibás feltöltése ugyanis letális hatásúvá válhat. Az S-ßamino-etil-ciszteinnel töltött lizil-tRNS-t ugyanis a riboszóma felületén folyó fehérjeszintézis akadálytalanul felhasználja. Az analóg jelenlétében csak azok a mutánsok maradnak életben, amelyek olyan mennyiségben termelnek lizint, amely már képes ellensúlyozni az aminosav-analóg káros hatását. A feladatot a biszintézisben résztvevő enzimek derepressziója és a végtermék szabályozó hatásának a felfüggesztése oldhatja meg. Elvben elképzelhető egy nagyobb szubsztrát-specifitású aminoacil-tRNS acilázt működtető törzs megjelenése. Erre azonban példa a szakirodalomban nem ismeretes. Sokkal könnyebb olyan törzset izolálni, amelyben a represszor, illetve a feed-back szabályozás nem működik. A feed-back érzékeny kulcsenzimek szabályozó szerepének a kikapcsolása a hagyományos klasszikus genetikai módszerek alkalmazásával könnyebben megoldható. A kritikus helyen levő egyetlen aminosavat kodoló triplet megváltozása már a feed-back hatás elvesztésével járhat. A lizin analógok felvételét a lizin-permeáz segíti. A mikrobába került analóg az aszpartát-kináz működését a lizinnel azonos nagyságrendben gátolja, sőt az Escherichia coli-ban az aszparaginsavfélaldehiddehidrogenáz és a dihidropimelát-reduktáz aktivitását is befolyásolja. A corineformokban ilyen gátló hatás nem jelentkezik. A lizin termelés serkentése céljából előállított hiánymutánsokat (Leu− Hom− Met−) használva limitált mennyiségben adott homoszerin, izoleucin, leucin, metionin és alanin jelenlétében érték el a legmagasabb termelési szintet. A leucin függőség kifejlesztését indokolja, hogy a leucin fölösleg sok esetben represszálja a dihidro-dipikolinát képződést. Aminosav függő mutánsok előállítása céljából különböző mutagén ágens használható. Kiindulásként a kezelendő sejtszuszpenziót logaritmikusan növekedő tenyésztből célszerű elkülöníteni. Az élősejt mennyiségét kazamint és élesztőkivonatot tartalmazó agar táptalajra szélesztve határozzák meg. A higítást minden esetben úgy választják, hogy egy lemez 25-100 megkülönböztethető koloniát tartalmazzon. Egyszerűsége miatt a 90-99 %-os pusztulást okozó 200-300 nm hullámhosszú besugárzást követően a kezelt baktériumszuszpenziót 10-20 egység G-penicillint tartalmazó minimál táptalajba szuszpendálva inkubálják 30 °C-on egy éjszakán keresztül. Ilyen körülmények között nem csak a túlélők, de a helyreállító mechanizmus gátlástalan működéséből bekövetkező visszarendeződés miatt növekedő baktérium sejtek is elpusztulnak. 175
A fotoreaktíválás hatásának a csökkentése miatt a tenyészetet célszerű fénytől elzárva tartani. Az irodalom több visszarendeződést gátló vegyület – például koffein – használatát javasolja. A G-penicillin hatásáról a penicillin mentes kontrol csőben a besugárzást túlélő, illetve regenerálódó sejtek növekedése számszerűen tudósít, mivel nefelométerrel mérhető a denzitásnövekedés. A penicillint tartalmazó szuszpenzióhoz adott penicillinázzal az eddig növekedésnek nem indult mutánsokat kazamint tartalmazó, valamint minimál táptalajra kell széleszteni. Olyan higítást kell készíteni amelyből lemezenként 100-100 kolónia nem jelenik meg néhány napig tartó inkubálás után sem. A kazaminos táptalajon kinőtt telepeket minimál táptalajra replikázva a kazaminos lemezen meglevő kolóniák közül kiválaszthatjuk azokat, amelyek még auxotrófok maradtak. Ha a minimál táptalajra való átmásolás után olyan minimál lemezre is másolatot készítünk, amely azt az aminosavat tartalmazza, amelyre való függöséget kívánjuk kialakítani. Szerencsés esetben a megjelenő kolóniák közül kiválaszthatók azok a mutánsok, amelyeket célszerű tovább vizsgálni. A kiválasztott kolóniáról minimál táptalajra és a célzott aminosavval kiegászített minimál táptalajra átoltást készítünk. Ez utóbb műveletet többször megismételve a törzs stabil aminosav függősége bizonyítható. Lizin termelő törzs kiválasztása céljából. homoszerin, izoleucin és metionin, esetleg treonin igényes törzs előállítása céljából a kapott mutánssal ismételve a mutagén kezelést lehetőségünk van a megfelelő aminosavaktól függő mutánsok előállítására. Ez esetben a penicillinnel kezelendő minimál táptalaj természetesen tartalmazza azt az aminósavat is, amelyet a besugárzott mutáns igényel. A homoszerin– és leucin– függő törzsekből ezután rezisztens variánsok nyerése a cél. Ilyen törzset aminoetilciszteint és az igényelt aminosavakat tartalmazó táptalajon lehet nyerni többször ismételt kezeléssel. A nyert mutáns stabilitásának ellenőrzése után az előállított mutánsok fenntsrtása olyan táptalajon történik, amely minden esetben tartalmazza a megfelelő lizinanalógot. A rezisztencia kialakításához egymást követően több lizinanalógot célszerű felhasználni és ezzel a rezisztencia mértékét fokozni. Az ábra az aminoetilciszteinnel szemben kialakuló (FA 1-30 és FA 3-115 mutánsok) rezisztencia követekezményeként megjelenő aszpartokináz aktivitás előnyös változását mutatja a táptalajhoz adott lizin és treonin függvényében. Az FA1-30 mutáns aszparto-kináz aktivitása 10 mmol/L lizin és treonin jelenlétében sem csökken. A bioszintézis induló szubsztrátuma, az aszpartát a trikarboxilsav ciklusban szereplő oxálecetsavból transzamináz segitségével a glutaminsav terhére képződik. glutamát α-ketoglutarát ATP ADP+ Pi transzamináz piruvát + CO2 oxálacetát [ biotin ] piruvát karboxiláz
aszpartát
Az alanin függőség kifejlesztése azért előnyös, mert az alanin főleg az aszpartát-ß-dekarboxiláz működésével képződik. Az alanin képzés tehát csökkenti az aszpartát szintet, amelyból a lizin szintézise indul. Az alanin dependens törzsben viszont éppen ennek az enzimnek a működése sérült, tehát több aszparaginsav használható lizin szintézisre.. Oxálecetsav képződhet a piruvát karboxilezésével, ha a piruvát dehidrogenáz nem fogyasztja el a glikolitikus út termékét. A ß-fluoropiruvát szinergizmus révén stimulálja a lizin képződést azáltal, hogy akadályozza a piruvát dehidrogenáz működését. A felhalmozódó piruvát biotin jelenlétében ATP felhasználásával oxálecetsavvá alakul, de. oxálecetsav képződhet foszfoenol-piruvátból is szén-dioxid felvételével. A hatvanas években - a lizin nagyüzemi előállítása érdekében - a rendelkezésre álló ismeretek birtokában genetikailag megőrizhető módon a lizin termelés szabályozásába kellett beavatkozni. Olyan mutánsok előállítása volt a cél, amelyek a bioszintézisben résztvevő enzimeket nagy mennyiségben állítják elő és a feed-back mechanizmus kulcsenzimének a módosításával, a végtermék-gátlás felfüggesztésének következményeként a kiválasztott célvegyületet, a lizint gátlástalanul termelik. El nem hanyagolandó feltétel, hogy az ipari szempontból hasznos termék továbbalakulása ne csökkentse az eljárás kifejlesztésével nyert gazdasági hasznot. Nem elhanyagolható szelekciós szempont szerint olyan mutánst kell nyerni, amelyik a megtermelt metabolitot, ez esetben lizint képes kiválasztani környezetébe. Miért éppen a Corynebacterium glutamicum alkalmazása mellett döntöttek az ipari felhasználók, annak ellenére, hogy a coliformokról szerzett ismeret bőségesebb volt.? Nem csak az vezette őket, hogy ez a faj a glutaminsav termelésben a nagyüzemi gyakorlatban is jól vizsgázott, de az aszparaginsavból induló esszenciális 176
aminosavak bioszintézisének a szabályozási mechanizmusa is egyszerűbb, összehasonlítva az Escherichia coli izoenzimek szelektív szabályozásával működő rendszerével. A C. glutmicum-ban a kulcsenzim, az aszpartokináz amelynek az aktivitását multivalens szabályozással a lizin és a treonin állítja be. Ezzel alapvetően meghatározza a baktérium beltartalmában (pool) az optimális aminosav szintet. Az aszpartilfoszfát képződés 80%-kal csökken 1 mM lizin és 5 mM treonin jelenlétében. Lizin bioszintézise Corynebacterium glutamicum-ban ASZPARAGINSAV ATP
L-lizin megjelenése a környezetben Ezek a nem spórázó, nem mozgó, kezdetben Gram-pozitív rövid pálcaként fejlődő (0,7 x 1-3 µm), a logaritmikus fázis végére kissé ellipszoid alakú, toxint nem termelő, a sejtfal összetétel szempontjából jól jellemezhető mikolsavat (C28-C38) és arabinogalaktánt tartalmazó szervezetek üzemi, valamint biztonsági szempontból és - nem elhanyagolható érvként – közegészségügyi szempontból is megfeleltek a
177
követelményeknek. Glükózt, fruktózt, mannózt, maltózt, szacharózt, trehalózt 28-30 oC-on jól hasznosító, nitrát redukciójára képes szervezetek. (Jellemző G+C Mol% 51-60). Membránjuk C16 és C18 tagú telített és egyszer telítetlen zsírsavat, foszfatidil-inozitot és foszfatidilinozitol-mannozidot tartalmaz. A menaquinon tartalmukat főleg 9 tagú izoprén lánc rögzíti a citoplazmamembránba. Tudvalevő, hogy ezeknek a mikroszervezeteknek a sejtfala nagy mennyiségben tartalmaz mezo-diaminopimelinsavat, növekedésükhöz pedig biotint igényelnek. Az aminosav környezetbe való kiválasztása szempontjából kedvező állapotot teremthet az állandó biotin limitáltság, amely tapasztalat szerint a citoplazma membrán képződésében okoz nehézséget.
Első leírója különleges képességére utalva Micrococcus glutamicus néven vezette be a szakirodalomba ezt a halványsárga, folyékony táptalajon összecsapódva kiűlepedő mikroszervezetet. A típus törzset Corynebacterium glutamicum néven ATCC 13032 számon helyezték el a gyűjteményben. Nagy számban előállított, UV kezeléssel, valamint alkilezőszerek alternált alkalmazásával nyert mutánsok közül előnyösen használható treonin auxotrófot sikerült kiválasztani. A mutánsban működésképtelenné vált a homoszerin dehidrogenáz. Ez azt jelenti, hogy a treonin szint limitáltsága miatt a bioszintézisben szereplő enzimek képződése maximális szintre emelkedik. A tragikusan sérült anyagcsere rendszer a treonin hiányt szeretné felszámolni, de a kulcsenzim működésképtelensége miatt erre képtelen. Ebből következően a természetellenesen feldúsuló aszpartát-ß-félaldehid zömében a lizin szintézis irányában hasznosul. Ezzel a termelő aktivitás 0,1 g/l értékről 16 g/l értékre növekedett. Az bioszintézis enzimeinek képződését represszáló hatást különböző lizinanalogokkal (α-aminoetilcisztein, α-aminoetilszerin) szemben kialakuló rezisztencia fokozásával érték el. Az előállított rezisztens törzsek termelőképessége 79 g/l értékre emelkedett, amely 100 g glükózból 44 g lizin termelést jelentett. Ez az érték meghaladja az ipari gyakorlatban elfogadhatónak tekintett 35%-os konverziót. Az emelt szintű lizinképződés fiziológiai feltétele. A glikolízis, a pentózfoszfát ciklus és a citrát ciklus jól szabályozott működése nem biztosítja az emelt szintű lizintermeléshez szűkséges - szén-dioxid vesztés nélküli - aszpartátellátást. Ezt a feladatot nem csak a Corynebacterium.glutamicum-ban működő - O'Regan és munkatársai által izolált és szekvenált (1989. Gene. 77:237-257) - foszfoenolpiruvát-karboziláz, hanem az izocitrát liáz működésével induló glioxalát ciklus és a piruvát-karboxiláz fokozott összműködése teljesíti, amint azt Peters-Wendisch és munkatársainak eredményei bizonyítják (FEMS Microbiol. Lett. 114:243. Arch. Microbiol. 185:387-396. Microbiology 143:1095-1103) Az 178
AMP, ADP és acetil-CoA által ellenőrzött biotint igénylő piruvát-karboxiláz fokozottan működik tejsav és piroszőlősav fölösleg esetében. A magas termelési szint elérése szempontjából a bioszintézis gazdaságos voltát a szén ellátás (carbon flux) befolyásolja. Marx és munkatársainak 1997-ben közölt adatai szerint (Biotechnol. Bioeng. 56:188-190) amíg a glutaminsav termelés közben a pentózfoszfát út 30 %-ban vesz részt a szénváz szállításban, a lizintermelő mutánsban 70 %-ot ér el a részesedése. Ez a bioszintézis NADPH igényének a kielégítését szolgálja. Az anaplerotikus karboxilezés szerepe is közel kétszeres a lizin termelő Corynebacterium glutamicum esetében összehasonlítva a glutaminsavat termelő törzs aktivitásával. A DAP enzimek által katalizált változat szerint a 2,3-dihidrodipikolinát egy NADPH igényes reduktáz {dapB} hatására ∆1-piperiden-dikarbonsavvá telítődik. Ez spontán vízfelvétellel ε-oxo-α-aminopimeláttá hidrolizál. A ketocsoport aminocsoporttá alakítása szukcinil-CoA felhasználásával az N-szukcinil-transzferáz {dapC} hatására képződő N-szukcinil-származékon keresztül szukcinildiaminopimelát-transzamináz {dapD} segítségével történik. Az N-szukcinil-L,L-α,ε-diaminopimelát specifikus szukciniláz {dapE} hatására alakul LL,-α,ε-diaminopimeláttá., amely a továbbiakban mezo-α,ε−diaminopimeláttá epimerizálódik (dapF). Ez a mezo-alak a diaminopimelátdekarboxiláz {lyzA} segítségével L-lizinné alakul. A felszaporodó lizin az egyik izoenzimmel koordinálva génszinten szabályozza (represszálja) a felsorolt enzimek képződését. Tovább vizsgálva a DAP képződést találtak egy alternatív utat, amelyik szerint szukcinilezés helyett egy acetil-transzferáz az L-2,3-dihidrodipikolinátot használva szubsztrátumként N-acetil-2-amino-6-keto-Lpimelátot képez Ezt egy NADPH igényes aminotranszferáz N-acetil-L,L-diamino-pimeláttá alakítja, amiből egy dezacetiláz távolítja el a védő acil-csoportot. A szintézis után a klasszikusnak nevezhető lépéseket (epimeráz, dekarboxiláz) alkalmazva képződik végtermékként az L-lizin. A DAP enzimek aktivitását több lizint termelő mutánsban vizsgálva kiderült, hogy a termék képződését lényegesen előnyösebb út működése is segítheti. Az L-2,3-dihidrodipikolinát egy specifikus NADPH függő Ddiaminopimelát-dehidrogenáz hatására ammónia felvételével egy lépésben alakul mezo-diaminopimeláttá. Ennek az enzimnek a működése meghatározó jelentőségű a termékképzésben. A bioszintézis gyakorlati ipari hasznosítását befejező lépésként a terméknek a környezetbe való kiválasztása határozza meg. A jól termelő, de a kiválasztásban sérült mutáns baktériumban a lizin koncentráció meghaladhatja a 170 mM szintet. Ez az érték már a legyöngített szabályozó mechanizmusban is zavart okoz. Vrjlic és munkatársainak (Mol. Microbiol. 22:815-826. J. Bacteriol. 177:4021-4027) sikerült izolálni a lysE gén által kódolt 236 aminosavból felépülő transzport fehérjét. Ezért a lizin kiválasztást nem befolyásolja a tápközeg biotin tartalma. Ha viszont a táptalaj ammóniumszulfát tartalmát szerves nitrogénforrásra (glutamin, glutaminsav, aszparagin, protein) cserélik, akkor a lizintermelő képesség 30-40%-ra csökken. A fejlesztő munka melléktermékeként Bethe és munkatársai nyilvánosságra hozták az ATCC 13032 számon letétbe helyezett Corynebacterium glutamicum genetikai térképét (Mol. Gen. Genet. 252:255-265). Ipari körülmények között szénforrásként a répacukor gyártás melléktermékeként megjelenő melaszt hasznosítják. Nitrogénforrásként a kénsavval készült szójahidrolízátumot ammónium-hidroxiddal semlegesítik. Az ebben levő aminosavak az auxotróf törzs homoszerin, treonin, metionin és leucin igényét szuboptimális szinten kielégítik. A lizinképződés szempontjából lényeges, hogy a táptalaj biotin koncentrációja meghaladja a literenkénti 30 µg szintet, amely a piruvát-karboxiláz aktivtás optimális szinten tartásához szükséges. A szénhidrátot menetközben adagolják az optimálisnak tekintett szint fenntartása érdekében. Ez azt jelenti, hogy a tenyésztés a fermentor térfogatának 50%-nál indul és folyamatosan adagolva a szénforrást a teljes hasznos térfogatot 100 órás korban éri el. Az adagolt szénhidrát hasznosítása után a tenyészlé alakos elemeit kiszűrve a szűrlet lizin tartalmát ioncserélő oszlopon megkötik. Átmosás után ammóniával eluálják, kondenzálják majd sósavval semlgesítve a lizint hidroklorid formában kristályosítják. A végtermék általában 97%-os tisztaságú lizin.HCl, amely állattápszerekbe kerül felhasználásra. Az eljárás nem tekinthető környezetbarátnak az ioncserélő oszlopról távozó, illetve az anyalúg szerves anyagban és ammónium sókban gazdag szennyvize miatt. A mikrobiális eljárásban termelt lizin 3-4 %-át tartalmazó szennyvíz szerves anyag tartalmának csökkentése költséges aerob kezelést igényel. Célszerűbbnek látszik a teljes fermentlé koncentrálása és a megtermelt aminosavat, valamint az elpusztított baktérium sejteket tartalmazó biomassza tápanyag kiegészítőként való felhasználása. A Corynebacterium glutamicum tartalmú biomassza felhasználása nem ellenkezik az élelmiszeripari minőségi követelményekkel. A technológia különlegessége a kondenzálás és a porlasztva szárítás közben alkalmazott adalék anyag minősége, amely a végtermék nem higroszkópos, könnyen kezelhető formában való forgalmazását lehetővé teszi. Ilyen végtermék például a Degussa A.G. szabadalmilag védett Biolys®60 tereméke, amely legkevesebb 48.8 % L-lizint 1 % L-arginint, 0,5 % L-treonint és 0,2 % L-metionint tartalmaz. A hetvenes években kialakult szemlélet követői a szénhidrogén élelmiszeripari hasznosítása céljából a széhidrát helyett petrokémiai úton előállított szénforrás alkalmazhatóságát vizsgálták. Előtérbe került a petrokémiai úton gazdaságosan előállítható ecetsav hasznosítása. Erre a célra a Corynebacterium tulajdonságaiban rokon Brevibacterium flavum törzset találták megfelelőnek. A táptalaj induláskor literenként 35 g hidrolízált szőját, 30 g glükózt, 7 g ecetsavat, 50 µg biotint és 40 µg tiamint tartalmazott. Az ecetsavszint
179
fenntartása céljából 4:1 arányban kevert ecetsav ammónium acetát elegyet adagoltak folyamatosan arra ügyelve, hogy az ecetsav szint végig 1 % alatt maradjon. L-lizin előállítására mikrobiális eredetű enzimtechnológiai módszerek is ipari megvalósításra kerültek. Alapanyagul a műszálgyártás céljára viszonylag olcsó kémiai szintézissel előállított kaprolaktám szolgál. Az első nyilvánosságra került eljárásban Aspergillus ustus által termelt enzim aktivitását hasznosítva a DL-αamino-ε-kaprolaktámból L-lizin és D-α-amino-ε-kaprolaktám elegyét nyerték. A valóban gazdaságos nagyipari eljárás kidolgozása Fukumura nevéhez kötődik. A kiindulási anyag teljes átalakítását két enzim által katalizált rerakció kombinálásával oldotta meg. A DL-α-amino-ε-kaprolaktám hidrolízisét Cryptococcus laurentii élesztővel végzik. Az L-lizin mellett visszamaradó D-α-amino-ε-kaprolaktám racemizálását egy baktérium áltat termelt enzim hajtja végre NH2 H H | | | H-C-H H−C—— N —— C = O | | | L − hidroláz L-lizin H-C-H H−C−H H−C−NH2 | | | Criptococcus laurentii H-C-H H − C————— C−H | | | H-C-H H H | racemáz H-C-NH2 DL-α-amino-ε-kaprolaktám D-α-amino-ε-kaprolaktám | Achromobacter obae COOH A biokonverziós technológia literenként 100 g szubsztrátunból egy teljes ciklusban 1 g Criptococcus laurentii és 1 g Achromobacter obae acetonnal szárított sejtjeivel 40 o C-on 1 nap alatt 99,8 % nyeredékkel biztosítja az Llizin képződést. A hidrolízist végző enzim az ε-kaprolaktámot nem hidrolizálja csak az α-amino-ε-kaprolaktám felnyitására képes. Az enzinet mangán és magnézium aktiválja, molekula tömege 185.000. A racemizálást végző 50,000 moltömegű enzim molekulánként egy piridoxálfoszfátot tartalmaz kofaktorként. L-TREONIN előállítása. A glutaminsav termelésre használt Corynebacterium glutamicum törzsből treonin termelésre alkalmas mutáns állítható elő. Ez esetben első lépésként metionin igényes törzset célszerű előállítani, A metionin ugyanis represszálja a homoszerin-dehidrogenáz képződését. Metionin hiány esetében viszont ez a treonin termelés szempontjából nélkülözhetetlen emzim akadálytalanul képződhet. A következő feladat a treoninra érzékeny enzimek szabályozó szerepének a felfüggesztése. Ez különböző treonin analógokkal szembeni rezisztencia, például α -amino-ß-hidroxivaleriánsav tűrés kifejlesztésével érhető el. Tovább fokozható a törzs termelőképessége, ha lizin analógra is rezisztenssé tesszük a fejlesztendő mutánsunkat. Az aszpartát-kináz működését ugyanis a treonin és a lizin közösen képesek alloszterikusan befolyásolni. A két aminosav-analógra rezisztens mutánsban ez az enzim maximális aktivitással működik. Ezért a treonin mellett gyakorta képződik valamennyi lizin is. A treonin-dezamináz működésének akadályozása, azaz a treonin tovább alakulásának gátlása elősegíti a treonin feldúsulását a tápközegben. Ezt a célt szolgálva a törzsnemesítés érdekében izoleucin igényes auxotrófot állítottak elő. A Corynebacterium glutamicum-ból klasszikus genetikai módszerekkel, mutagénekkel való ismételt kezelés és megfelelő szelekció alkalmazásával aminosav termelésre alkalmas mutánsokban az egyes kulcsenzimek aktivitása és érzékenysége változó értéket mutat. Az aszpartokináz teronin és lizin érzékenysége az egyes mutánsokban eltérő mértékben csökkenhet. Az α -amino-β-hidroxivaleriánsavval szemben kialakuló rezisztencia sok esetben a lizin érzékenység fokozódását okozta. Ezek az eltérő adatok nem meglepőek, hiszen sokféle oka lehet egy aminosav igény megjelenésének, vagy a feed-back érzékenység elvesztésének. Az ipari gyakorlat viszont csak a termék mennyiségében és az előállítási költségben érdekelt. Irodalmi adatok szerint a treonin termelésben szerepet játszó enzimek szintjét sikerrel tudták befolyásolni az egyes kulcsenzimek információját tartalmazó génnek a gazdasejtbe juttatásával. A treonint termelő eljárások a felhasználásra kerülő szénforrás szerint két csoportra oszthatók; a glükózt hasznosító és az ecetsavat alkalmazó eljárásokra. Mindkét eljárásban fontos tápanyag a szójahidrolizátum, amely a felhasználásra kerülő auxotróf törzsek tápanyag igényének a kielégítését szolgálja. A maximális termelési szint elérésének a feltétele a genetikailag meghatározott aminosav igényüknek a céltermék szempontjából optimálisan limitált kielégítése. Shioi és Nahamori (1970) adatai szerint a Brevibacterium flavum alkalmasan fejlesztett mutánsával 18 g L-treonint termeltek literenként 100 g glükózt, 30 g ammoniumszulfátot, 50 g kálciumkarbonátot 15 g 180
káliumfoszfátot, 0,4 g magnézium-, vas és mangán ionokat 200 µg biotint és 300 µg tiamint, valamint 2 g szójahidrolizátumot tartalmazó táptalajon. A tenyészetet lúg adagolással semleges pH-n tartották. ATP
Ennél lényegesen jobb eredményekről tudósít Tanaka. (1971) Ugyancsak a Brevibacterium flavum alkalmas mutánsát használva két nap alatt 27 g treonint termelt literenként 4 g ammónium acetátot, 4,1 g nátrium-acetátot, 1 g ammónium-szulfátot, 2 g karbamidot, 3 g káliumdihidrogén-foszfátot, 0,4 g magnéziumszulfátot, vas és mangán ionokat, 5 mg tiamint és 50 mg biotint, 3 g glükózt és 8 g szójahidrolízátumot tartalmazó táptalajon. A fermentáció optimális hőmérséklete 39 oC. Az optimálisnak talált enyhén lúgos kémhatást (7,7 pH) olyan ecetsav-ammoniumacetát elegy adagolásával biztosították, amelyben a két vegyület molaránya 100:17 volt.
181
AZ AROMÁS AMINOSAV BIOSZINTÉZIS SZABÁLYOZOTTSÁGA L-TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSA A triptofán bioszintézisének és a szintézisút szabályozottságának felderítése az ötvenes évek alapkutató tevékenységének az eredménye. A mikrobiális bioszintézis a foszfo-2-keto-3-dezoxi-heptonát-aldoláz által katalizált reakcióval indul. Escherichia coli-ban ezt a feladatot három alloszterikusan szabályozott izoenzim látja el. Az egyik fenilalaninra és prefénsavra, a másik triptofánra és korizminsavra érzékeny, a harmadik működését pedig tirozin és prefénsav gátolja. A második polivalensen szabályozott alloszterikus enzim a shikiminsavdehidrogenáz, amelynek működését fenilalanin, tirozin, prefénsav és korizminsav befolyásolja. Az aromás aminosavak bioszintézise és a szintézis szabályozása Escherichia coli-ban FOSZFO-ENOLPIRUVÁT + ERITRÓZ-4-FOSZFÁT foszfo-2-keto-3-dezoxiheptonát-aldoláz [Phe -] [Tir -] [ Tri -] [prefenát] [korizmát] [prefenát] 3-DEZOXI-D-ARABINO-HEPTULONSAV-7-FOSZFÁT dehidrokvinát szintetáz Pi 5-DEHIDROKVINÁT 5-dehidrokvinát-dehidrastáz | H2O 3-DEHIDROSHIKIMINSAV NADPH shikimát dehidrogenáz (Phe- Tir- prefenát- korizmát-) NADP+ D-SHIKIMINSAV ATP shikimát-kináz ADP SHIKIMINSAV --FOSZFÁT P-E-P | piruvil-shikimát-foszfát szintetá 5-ENOLPIRUVIL--SHIKIMINSAV-3-FOSZFÁT korizmát-szintetáz | Pi KORIZMINSAV
PP N-(RIBOZIL-5'-FOSZFÁT-ANTRANILÁT foszforibozil-antranilát izomeráz NAD+ H2O ENOL-1-o-KARBOXIFENILAMINO-1DEZOXIRIBULÓZ-FOSZFÁT CO2 NADH H2O indol-3-glicerin-foszfát szintetáz CO2 CO2 INDOL-3-GLICERIN-FOSZFÁT FENIL-PIRUVÁT p-HO-FENIL-PIRUVÁT L-SZERIN Glu triptofán szintetáz transzamináz GAP α-ketoglutársav L-FENILALANIN L-TIROZIN L-TRIPTOFÁN
182
Néhány zavartalanul folyó enzimreakció után a bioszintézis a korizminsavnál ágazik el. A triptofán szintézis felé vezető út első enzime a két alegységből álló antranilát szintetáz, amely asszociátumot képez az ugyancsak két alegységből álló antranilát-foszforibozil-transzferáz-zal. A triptofán alloszterikus (feedback) inhibitorként ezen aktív asszociátum szétesését okozza. Az antranilsav szintézishez szükséges glutaminkötőhely csak az ép asszociátumon alakul ki. A működőképes komplexen képződő foszforibozil-antranilátot egy izomeráz alakítja tovább, majd az indolglicerinfoszfát-szintetáz működésének a hatására egy szén-dioxid és egy molekula víz távozásával alakul ki az indolváz. Az utolsó enzimkatalizálta történést a négy alegységből álló triptofánszintetáz katalizálja, amely az indolt a szerin harmadik szénatomjához kapcsolja egy glicerinaldehid-3-foszfát felszabadításával. A másik két arómás aminosav szintézise irányába két korizmát-mutáz izoenzim katalizálja a prefénsav képződést. Az egyik izoenzim fenilalalninra, a másik tirozinra érzékeny. Mindegyik asszociátumot képez a megfelelő aminosav szintézisét katalizáló következő enzimmel: a fenilalaninra érzékeny izoenzim a prefenátdehidratázzal, a tirozinra érzékeny pedig a prefenát-dehidrogenázzal alkot komplexet. Az asszociátumok működését triptofán serkenti. Ez a hatás a két aminosavnak a fehérjeszintézis szempontjából kedvező arányban való képződését elősegíti. A fenilalanin és a tirozin szintézis utolsó lépését azonos enzim, egy transzamináz katalizálja. Az aromás aminosavak szintézisét végző enzimrendszer a három aminosav hiányában nagy mennyiségben képződik. Csak az általuk termelt aminosavak felszaporodása csökkenti ezen enzimek képződését. A fölös mennyiségben jelenlevő aminosav, esetünkben a triptofán a represszor fehérjéhez, az pedig a triptofán operon promoter régiójához kötődve megakadályozza az RNS-polimeráz működését. Ezzel az triptofán operonbsn kodolt enzimek szintézisét represszálja. Yanofsky és munkatársai a triptofán szintézisért felelős enzimek képződésének szabályozási mechanizmusát molekuláris biológiai szinten vizsgálva egy olyan új általános jellegű felismerésre jutottak, amely az aminosavval töltött tRNS addig csak sejtett szabályozó szerepének módjára magyarázatot adott. A triptofán szintetáz mRNS információ előtt egy 160 bázis terjedelmű szabályozási feladatot ellátó attenuátor régiónak elnevezett szakasz található. Ennek a szakasznak az a feladata, hogy a promoter régiónak a represszor fehérje távoztával bekövetkező felszabadulása után meginduló RNS-polimeráz működését megszakítsa az esetben, ha a triptofánnal töltött tRNS a fehérjeszintézis szempontjából még kielégítő koncentrációban jelen van a rendszerben. A mRNS esetében a kódolt fehérjére vonatkozó információ előtt minden esetben a riboszómához kötődést biztosító szakasz található. A fehérje szintézise az eubaktériumoknál AUG kodonnal (formilmetioninnal) indul. A DNS-szálon akár egy génen belül is egyidejűleg több RNS-polimeráz is működhet, sőt az enzimről folyamatosan letekeredve képződő mRNS-fonalakon körülbelül 40 bázisnyi távolságban már megindul a fehérjeszintézis. Ebből az következik, hogy meglehetősen kis területen egyidejűleg.változatos biokémiai reakciók (RNS ill. fehérje-szintézis) tömege folyik. Ezt a lehetőséget használja ki az élő szervezet az aminoacilezett tRNS szabályozó szerepének a megjelenítésére. Ennek keretében a promoter régión kötődő RNS-polimeráz, az operátorhoz kötődő represszor fehérje távoztával elindulhat a struktúrgén irányába. Az RNS-polimeráz működése azonban megszakad akkor, ha a megfelelő aminoacil-tRNS a fehérjeszintézis szempontjából szükséges koncentrációban jelen van a mikrobasejtben. Az első vázlat a triptofán represszáló hatását ábrázolja. A triptofánnal terhelt represszor az operátor régióhoz kötődve akadályozza az RNSpolimeráz működését. ______________________________________________________________________ I promoter I operátor I attenuátor I trpE gén I trpD gén I trpC gén I trpB gén I trpA gén I |----------------represszor --------------|-------------|-------------|------------| ------------|------------|RNS > triptofán polimeráz (korepresszor) A második vázlat a derepresszió jelenségét ábrázolja. Triptofán hiányában a korepresszor (esetünkben triptofán) nélküli represszor fehérje lemozdul az operátorról. Ennek következtében elindulhat a transzlációs folyamat. Az RNS polimeráz elindul a struktúrgének felé. __________________________________________________________________________ I promoter I operátor I attenuátor I trpE gén I trpD gén I trpC gén I trpB gén I trpA gén I -|----------------|------------|--------------|------------ |-------------|------------|------------|-------------|-RNS polimeráz ----> represszor Struktúrgének: E = antranilát-szintetáz D = antranilát-transzferáz C = IGP-transzferáz B = triptofán-szintetáz B A = triptofán-szintetáz A
183
A triptofán operon átírását befolyásoló attenuátor régió szabályozó szerepe Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys pppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAA riboszómakötő szakasz G G G l U y AUAAGAGAUUAAACAAGUUUUUUUU - ACCCAUAGACUAACGAAAUGCGUA - U T A C-G C-G r C G-C C-G p A G-C A-U T A G-C C-G r U C-G U-U G p G G-C A C A C G-C U G r A A U G-C g A U-A-A U-A T A ez a komplementer bázisok által stabilizált termináló G-C h C hurok leszorítja a σ faktor nélküli RNS-polimerázt a templátról A-U r A C U S CAAAAACCGACUCUCUCGAACUGCUG...... G-C e ezért a triptofán-szintetáz struktúrfehérje génjei nem íródnak át G-C r G U C G A-A-A Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly pppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGU riboszómakötő szakasz U ACGAAAUGCGU G A A G UCAGA - UUCACC U U-A G Trp-tRNS hiány miatt a vezérpeptid képződése az UGG kódnál A-U G leáll, a polimeráz a komplementer kötések átrendeződése miatt C-G C zavartalanul tovább haladva megkezdheti a triptofán-szintetáz C U G struktúrgén átírását C-G C A A A G-C C C-G U C-G U C-G C AAUAAGAGAUUAAACAAGUUUUUUUUCGGGCGAGUAAUCCG - C -A-A-A-G-U-C C A Met Gln Thr .... AAUGCAAACACAAAAACCGACUCUCUCGAACUGCUG......
Elkezdődik a struktúrgének információja előtt elhelyezkedő attenuátor szakaszon kódolt rövid vezérfehérje szintézise. A vezérpeptid információja a promoter régiót követő rövid riboszómakötő szakasz után, a szokásos AUG kodonnal kezdődik és UGA kóddal végződik. Az RNS-polimeráz által szintetizált mRNS-láncon, amelynek szekvenciája több komplementer szakaszt is tartalmaz, a polimerázt 40 bázisnyira követve folyik a vezérfehérje képződése. A két szintézis (mRNS-képződés és peptidszintézis) közel azonos sebességgel folyik. A vezérpeptidtől 30 bázisnyi távolságra, jóval a struktúrgéneket iniciáló kodon elött található az a termináló hurok, amely képes lenyomni a σfaktor nélküli, lazán kötődő polimerázt a templátjáról. A termináló hurok azonban, csak az esetben alakulhat ki, ha a vezérpeptid szintézise zavartalanul megtörténik. Az RNS-polimeráz tehát leválik az operonról és σ-faktorral kiegészülve újra kezdi működését a promoter szakasznál. Az anyagveszteség csekély, mert a jelenlevő proteázok a funkció nélküli vezérpeptidet lebontják, és az aminosavak visszakerülnek a bioszintetikus folyamatba. Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de szekvenciájában közvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban különösen nagy gyakoriságot jelent, mivel a prokariotákban általában 100 aminosavra esik egy triptofán. Ha azonban triptofánnal töltött tRNS hiányában megakad a vezérfehérje képződése, akkor a vezérszekvencia bázissorrendjében levő komplementer szakaszok által létrehívott új párkapcsolat kialakulása (73-84 és 108-119 bázisok között) nem engedi kialakulni a termináló hurkot. Ennek következményeként a polimeráz a kritikus szakaszon tovább haladhat a struktúrgének AUG kezdő kodonja felé. Hamarosan megkezdi az illetékes aminosav képződését katalizáló enzimek, ez esetben a triptofán-operonba szerveződött struktúrgének átírását, a 184
mRNS szintézisét. Amikor a végtermék által (feed-back) szabályozott, triptofánt szintetizáló rendszer aktív tevékenysége a vezérpeptid szintéziséhez elegendő triptofanil-tRNS szintet állít be, a struktúrgének további átírása megszűnik. Hasonló szabályozó rendszer irányítja a többi aminosav szintézisét katalizáló enzimek struktúrgénjeinek átírását is. Az egyes vezérpeptidek kémiai szerkezetében az illetékes Met-Lys-Ala- Ile-Phe-Val-Leu--Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser Met-Thr-Arg-Val-Gln-Phe-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Pro-Asp Met-Lys-His-Ile-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe-Phe-Thr-Phe-Pro Met-Lys-Arg-Ile-Ser-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Thr-Ile-Thr-Ile-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly aminosav egymás közelében több példányban szerepel. A hisztidin esetében 7 szomszédos kodon igényel feltöltött hisztidil-tRNS-t. A fenilalanin-szintézis enzimeinek képződését szabályozó vezérfehérje 7 fenilalaniltRNS jelenlétét igényli az RNS-polimeráz leválasztásához. Figyelemre méltó a treonin és az izoleucin struktúrgénjeinek átírását szabályozó vezérpeptid szerkezete, amely alternáltan 8 treonin és 4 izoleucinal feltöltött tRNS-t igényel. Ez azt jelenti, hogy értelemszerűen a két aminosav bioszintézisét végző enzimek struktúrgénjeinek átírása csak akkor akadályoztatik, ha mindkét aminosavval feltöltött tRNS jelen van a rendszerben.
ELJÁRÁSOK TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSÁRA Triptofán szintézis L-szerinből és indolból. L-szertinből és indolból a triptofán szintetáz aktivitást hasznosítva gazdaságosan lehet nyerni ezt az esszenciális aminosavat Triptofán-szintetáz (EC. 4.2.1.20) minden prototróf mikroorganizmusban előfordul a triptofán bioszintézist végző reakciósor utolsó tagjaként. Az Escherichia coli-ban ez az enzim 140.000 móltömegű piridoxálfoszfát kofaktorral működő tetramer. Két α alegységből és egy β2 dimerből épül fel. Az érintetlen tetramer komplex in vivo az indol-3-glicerol-foszfátból és az Lszerinből L-triptofánt és glicerinaldehid3-foszfátot alakít. A tetramerből könnyen kiszakadó α alegység az indol-3glicerol-foszfát szétesését katalizálja indolra és glicerinaldehid-3-foszfátra. A β2dimer az indolból és L szerinből történő triptofán szintézist katalizálja, de elősegíti a szerin bomlását piruvátra és ammóniára. A tetramer enzim előállítására alkalmas törzset a triptofánigényes mutánsok közül célszerű kiválasztani. Triptofán limitált tenyésztés esetén várható a bioszintézisben érdekelt enzimrendszer derepressziója. Miles Escherichia coli -B -ből előállított mutánsában az oldható fehérje 16 %-át tette ki ez a fehérje. A sejtekben képződött enzim nem csak triptofán előállítására, de különböző triptofán analógok szintézisére is sikerrel használható. Az enzimkomplex az elölt coli sejtbe glutárdialdehiddel rögzíthető és bioreaktorba helyezve két hét felezési idővel használható. Az enzimkomplex stabilitása és aktivitása nagyobb mint a tisztított formában kinyert β2dimeré. Ez utóbbi esetben piridoxál-5-foszfát kofaktor jelenléte a reakcióelegyben növeli az enzim aktivitását.
185
A triptofán szintetázt nagy mértékben termelő, de triptofán közvetlen előállítására szolgáló törzs olyan fenilalanin– és tirozin– igényes mutáns, amely 5-metiltriptofán, 6 fluor triptofán, 4-metil-triptofán, p-fluorfenilalanin, p-amino-fenilalanin és triptofán-hidroxamát jelenlétében is képes növekedni, tehát a felsoroltakra rezisztens. A mutáns előállításakor a lizintermelére alkalmas törzs előállításakor ismertetett gyakorlatot alkalmazták. Triptofán szintézisre használható a reverzbilisen működő triptofanáz (EC. 4.1.99.1.) amely természetes körülmények között – egyes baktériumokra jellemzően – a triptofán lebontására szolgál. (E. coliindol+, Klebsiella ndol– , Salmonellaindol–, Edwardsiellaindol+, Providencia indol+ viszont a Proteus és a Shigella lehet indol+, illetve ndol– is) indol + piruvát
+ ammónia
——>
triptofán
+ víz
Ez a reakció végeredményben a baktériumokban előforduló jól ismert katabolikus α,β-eliminációs reakció visszafordítása. Nakazawa (1972) Proteus rettgeri tenyészetét használta enzimforrásként. A katabolikus enzim képződését nem csak a könnyen metabolizálható szénforrás, de a nitrogénforrás is represszálja. A promoter régióhoz kötődő aktív glutamin szintetáz és egy speciális fehérje komplexe serkenti az RNS polimeráz aktivitását az esetben, ha egyidejűleg a cAMP-CAP komplex is jelen van. A glutamin-szintetáz 12 alegységből álló óriás enzimkomplex, amelynek működését glikokoll, alanin, triptofán, hisztidin, karbamoilfoszfát, glükózamin, citidil-trifoszfát, és adenilsav multivalensen gátolja. Teljesen inaktív állapotban minden alegységének tirozil oldallánca adenilsavval van acilezve. A fenti aminonitrogént tartalmazó vegyületek limitált mennyiségben való jelenléte a tápközegben előnyösen hat a nitrogénkatabolikus enzim képződésére. Szénhidrátban és egyéb nitrogénforrásban szegény táptalajon az enzim képződését triptofánnal indukálni lehet. A rekció közben felszabaduló indol azonban gátolja a baktérium növekedését. A gátló hatás polyoxietilén-alkil-fenoléter adagolásával védhető ki. Ez a detergens mikrocseppekbe zárva megköti a felszabaduló indolt. Ílyen körülmények között növekedő baktérium oldható fehérjetartalmának 6 %-a triptofanáz. A kifejlődött tenyészetből elkülönített sejtekhez literenként 80 g nátriumpiruvátot, 80 g ammónium-acetátot, 10 mg piridoxál-5-foszfátot, 1 g nátrium-szulfátot és 100 ml metanolban oldott 60 g indolt adva enyhén alkalikus (8,8 pH) körülmények között, 34 oC-on keverve, két nap alatt 75 g triptofán képződik. Az egyensúlyi reakciót teljessé lehet tenni, ha a reakcióelegyből a triptofánt kivonjuk, például inozinnal, ami a képződő triptofánnal vízoldhatatlan komplexet ad. Az eljárást sikerrel használják triptofán analógok, például 5-hidroxitriptofán előállításra.
L-triptofán nyerése racém hidantoin származékból A teljességre törekedve nem hagyható figyelmen kívül egy bakteriális enzim a hidantoináz ipari alkalmazása L-triptofán előállítására. Ez az 5-hidroximetil-hidantoinnal indukálható enzim (Sano. 1977. Agric. Biol.Chem. 41:819) a racém indolil-metil-hidantoinból első lépésben az L-triptofán N-karbamoil származékát állítja elő, majd második lépésként távolítja el a karbamoil csoportot. Az átalakítandó szubsztrátum gyakorlatilag teljes mértékben eladható termékké alakítható, mert az indolil-metil-hidantoin 8-9 pH tartományban spontán racemizálódik. Az indukált baktériumsejtek membránjának átjárhatóságát a reakcióelegyhez adott toluol fokozza, de az elegy baktériumos fertőződését is megakadályozza. 186
H H O H H | | || | | H–C=C–C——C– CH2− C– C – N-H H–C=C–C——C—CH2—C— COOH | || || | | | || || | H–C=C–C–N–C-H H-N —– C=O H–C=C–C–N– C–H H–N—C=O | | | | | H H Η 2Ο H H NH2 hidantoináz N-karbamoil-L-triptofán rac-indolilmetil-hidantoin formamid pH = 9 D-indolilmetil-hidantoin L-triptofán
Bioszintézis prekurzorok felhasználásával. Az egyik jól ismert módszer antranilsav adagolással valósítható meg. Ez esetben az antranilsav adagolás a triptofánra érzékeny alloszterikusan feed-back szabályozott reakciót kerüli meg, ha a másik szubsztrátum az 5foszforibozil-1-pirofoszfát kellő mennyiségben rendelkezésre áll. Ilyen eljárásokat dolgoztak ki Hansenula anomala, Candida utilis, Bacillus subtilis antranilsav auxotróf törzseit használva. A növekedő szakasz után kezdődik az antranilsavat tartalmazó tápoldat adagolás vigyázva arra, hogy az antranilsav szint 0,5 % alatt maradjon. sejt tömeg L-triptofán +
L-triptofán előállítása indol adagolással Ismeretes olyan módszer is, amelyben indolt adagolnak a baktérium tenyészethez. Ez esetben nem vitás, hogy a triptofán szintézis utolsó enzimét hasznosítja az eljárás, miközben a reakcióhoz szükséges szerint a mikroba állítja elő. A törzs kiválasztásakor fontos szempont a szerin szintézis színvonala. Szénforrásként a megvalósított eljárásokban glükózon kívül glicerin, alkohol, növényi olaj azaz zsírsav is számításba jöhet. A különbség a regenerálandó kofaktorok mennyiségében szembetűnő. A technológiai paraméterek optimálása éppen ezt az élettani feladatot van hivatva megoldani. 1
/2glükóz +NH3 + 2 NAD+ szerin + 2 NADH + 2 H+ + glicerin + NH3 + 2 NAD szerin + 2 NADH + 2 H+ + zsírsav + NH3 + 3 FAD + 3 NAD szerin + 3 FADH + 3 NADH + 3 H+ 2etanol + NH3+ATP+FAD+3NAD++2NADP+ szerin+ADP+FADH2+3NADH+2NADPH A szerin bioszintézis látszólag szabályozatlanul folyik, mivel élettani szempontból ez az aminosav központi szerepet tölt be. Bioszintézise a glikolízis köztes termékéből a glicerinsav-3-foszfátból indul 2-keto-3foszfo-glicerinsavon és foszfo-szerinen keresztül, de képződhet C1 töredék felhasználásával glycinből is. A glicerinsav-3-foszfát vagy hexózból, pentózból, triózból származik, de Krebs-ciklusban fontos szerepet játszó oxálecetsavból a glükoneogenezis lépéseit hasznosítva is képződhet. Prekurzorok alkalmazásával vezetett triptofán szintézis esetében célszerű 5-metiltriptofánra, illetve 5fluor-triptofánra rezisztens derepresszált mutánsokat használni. A derepresszált törzsekben a bioszintézisben szerepet nyerő enzimszint a vad törzsben mért érték 200-szorosát is elérheti. A magasabb enzimszint azután a 187
céltermék túltermelését, főtermékként való megjelenését eredményezheti. A derepresszált mutáns előállítására egyszerű lehetőség adódik, mert a tRNS aciláz szubsztrátspecifitásának függvényében téveszthet és a sejten belül kialakuló koncentrációviszonyok függvényében az aminosav analóggal tölti fel a tRNS-t. Ennek az a következménye, hogy a sejtfehérje olyan arányban tartalmazza az aminosav analógot, amilyen arányban a tRNS aciláz tévedett. Élettani következményként az elkészült hibás fehérjék arányában csökken az egyed életképessége akár a teljes életképtelenségig. Nagyszámú egyed között - mutagénekkel való kezeléssel fokozható mértékben - előfordulhatnak olyan változatok (variánsok), amelyek nagyobb mennyiségben termelve a természetes aminosavat, kompetitiven kiszorítják az analógot az acilezési reakcióból, azaz a növekedést gátló aminosav analóg jelenlétében is képesek növekedni.
Ennek a túltermelésnek különböző oka lehet. Adott esetben a bioszintézisben érdekelt enzimek képződnek nagyobb mennyiségben, tehát konstitutívan derepresszált mutánsokká váltak. Más esetben a szabályozási mechanizmus hibájával, a feed-back érzékenység elvesztésével találkozunk. Mindkét eset a természetes aminosav túltermelésével járhat
188
Triptofán bioszintézis szénhidrátból és ammóniából. Leggazdaságosabb előállítási módja a teljes bioszitézis mutánsok felhasználásával. Az iparilag használható mutáns előállításához az eddigi tapasztalatok alalpján a Corynebacterium glutamicum vad törzsből indultak.. Először fenilalanint és tirozint igénylő, kétszeresen auxotróf korizmát-mutáz hiányos törzset izoláltak. Ez a törzs limitált fenilalanin és tirozin jelenlétében tenyésztve képes volt csekély mértékben triptofánt termelni. A felszaporodó korizminsav továbbalakulását nem tudta megakadályozni a triptofánra érzékeny, alloszterikusan szabályozható antranilát szintetáz. A következő feladat éppen a feed-back mechaniuzmus hatástalanítása volt. Ennek a feladatnak a teljesítése érdekében egymás után végzett műveletekben 5-metil-triptofánnal, 5 fluortriptofánnal, 4-metil-triptofánnal és triptofán-hidroxamáttal szemben rezisztens mutánsokat izoláltak. Ezek közül választották ki mindig a legjobban termelőket és azokkal végezték tovább a klasszikus genetikai tevékenységet, a nagy számban előállított mutáns vizsgálatát. − − Ezek között a triptofán analógra rezisztens Tir Phe mutánsok legjobbjai már 0,5% triptofánt termeltek mélyfermentációs körülmények között. Logikailag várható, hogy fokozódik a triptofán termelés, ha a fenilalanin és tirozin érzékeny alloszterikus enzimek feed-back érzékenységét is sikerül megszüntetni. A további genetikai beavatkozásokban p-fluor-fenilalaninra, majd p-amino-fenilalaninra rezisztens mutánsokat állítottak elő. Végül tirozin-hidroxamátra, illetve fenilalanin-hidroxamátra rezisztens módosulatokat választottak ki. Szisztematikusan mindíg a legjobbnak látszó mutánssal végezték a következő genetikai módosítást. A munka eredményeként olyan genetikailag stabilnak tekinthető törzshöz jutottak, amelyik 12 g triptofán termelésére volt képes literenként. A táptalaj 10 % redukáló cukrot, 2 % ammónium-szulfátot, 1 % kukoricalekvárt és 2 % kalcium-karbonátot tartalmazott. A mutáns triptofán termelőképessége ezen kezelések ellenére sem vesztette el teljesen a fenilalanin és tirozin érzékenységét. A technológia kialakításakor ezen két aminosav aktuális koncentrációját a táptalajban gondosan végzett analitikai mérésekkel limitáló szintre kell beállítani.
Aminosav forrásként előnyösen használható a szójafehérje hidrolízátuma fenilalanin kiegészítéssel. A két aromás aminosav egymáshoz viszonyított arányának meg kell egyezni a mutáns fehérje-összetételében mért aránnyal. A táptalaj szuboptimális aromás aminosav tartalma meghatározó jelentőségű. Ettől való eltérés lefelé elmaradást okoz a növekedésben, felfelé pedig a triptofán termelés csökkenésével jár. A beállított táptalaj összetétel csak a fermentációs paraméterek szigorú állandósága esetében hozhat eredményt. A hőmérsékletben, a levegőzésben és a keverésben, vagy az induló sejtszámban való változtatás az aminosavak felhasználását is változtatja, ami végül a triptofán termelésben való eltérés okozója lehet. Meghatározó jelentősége van a technológiai előírások betartásának és a fermentációs berendezés, műszaki színvonalának. A glükózból folyó triptofán szintézis oxigén igényéről fogalmat alkothatunk a mellékelt vázlat alapján. A szintézis energia és anyagigénye független a törzstől, ezért az Escherichi coli adatai nem különböznek a C. glutamicum -étól. Egyetlen triptofán képződéséhez 3 glükóz és 2 ammónia szükséges, miközben 1 piruvát, 4 szén-dioxid és nyolc redukált kofaktor és öt ADP regenerálása terheli az anyagcserét. A piruvát elégetés is az anyagcsere feladata. Mindent összevetve triptofán molekulánként 11 NAD(P)H visszaoxidálása szükséges.
ASPARTAM Aszpartil-fenilalanin metilészter édesítőszer biotechnikai előállítása Az utóbbi húsz év divatos édesítőszere a természetes alapanyagú L-aszpartil-L-fenilalanil-metilészter. Az "aszpartám" édesítőszerként való alkalmazhatósága egy véletlen hanyagság (a laboratóriumi kézmosás elhagyása) következményeként derült ki.. A felfedezést a fenilalanin előállítására szolgáló eljárások gyors fejlődése követte. Az 1981 évi, főleg gyógyszeripari célt szolgáló évi 50 tonna termelés 1984-re 2000 tonnára emelkedett. A kilencvenes évekre ez elérte a 10000 to/év szintet. H | O = C − OH HC—C==CH | || | H−C−H HC—C== CH | | H − C − NH2 H H−C−H | | | O = C ——— NH ———— C − H | O = C − O − CH3 A szénhidrátból kiinduló fenilalanin szintézisre a Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Candida nemzetségből származó mutánsok előnyösen használhatók. A fenilalanin túltermelés érdekében első feladat a szabályozó mechanizmus felfüggesztése. Lásd a triptofán előállításával kapcsolatos fejezetet. A p-fluorfenilalaninnal és p-amino-fenilalaninnal szemben rezisztens törzsek fenilalanin termelése szignifikáns emelkedést mutat. Tovább emelkedik a termelés ha az előbbi mutánsokból nyert tirozin-auxotrófot használjuk az eljárásban. Ez érthető mert a fenilalanin képződés a korizminsavnál ágazik le a triptofán szintézisnél megismert bioszintézis útból. Ezért előnyös az aromás aminosav képződés szempontjából az 5-fluorotriptofánnal szembeni rezisztencia kifejlesztése. Az ipari eljárásban alkalmazott táptalaj 10 % melaszt, 2 % ammónium-szulfátot, 0,1 % foszfátot, magnéziumsót és enzimesen bontott kazeint tartalmaz. A tápközeghez adott triptofán előnyös hatást mutat. Akashi az oldott oxigénszint csökkentésével fokozta a fenilalanin képződést. Az aszparaginsav ugyancsak előállítható biotechnikai eljárással. Az Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens és más baktériumokban működő aszpartáz aszparaginsavból ammónia felszabadításával fumársavat állít elő. Eredeti szerepe az aszparaginsav hasznosítása szénforrásként. Ebből következik, hogy az enzim képződését a glükóz katabolikusan represszálja, de az enzimszint alakulását a tenyészet oxigénellátottsága is befolyásolja. (oxigénlimit esetén nem érvényesül a represszív hatás). Az enzimmel in vitro körülmények között ammónium-fumarátból magnézium jelenlétében gazdaságosan nyerhető az aszparaginsav. A reakciót az oldhatósági viszonyok kedvezően befolyásolják. A diammónium-fumarát vizes szuszpenziója 20 %-os oldattal tart egyensúlyt, az ammónium aszpartátból viszont 60 %-os oldat készíthető. Ebből a tömény oldatból az izoelektromos ponton (pH = 2,8) az aszparaginsav kristályosítható. Az azpartát enzimet tartalmazó E. coli sejtek bifunkcionális reagensekkel (glutárdialdehid) bioreaktorba rögzítve – folyamatos üzemben – hónapokig használhatók aszparaginsav termelésre.
Hasonló módon működő rektorban a baktérium sejtbe rögzített fenilalanin-ammónia-liáz felhasználásával a petrokémiai úton nyert cinnamonsav ammóniumsójából állítják elő a fenilalanint a GENEX Co által ipari eljárássá fejlesztett technológiával. HC==CH NH3 HC== CH | | | | H–C C−CH=CH−COONH4 H–C C−CH2−CHNH2−COOH || || || || HC— CH fenilalanin ammónia-liáz HC— CH Fenilalanin nyerhető cinnamonsav ammónium sójából A két aminosavból általában kémiai eljárással állítják elő az egyre népszerűbbé váló édesítőszert, de elvégezhető a szintézis enzimtechnikai módszerrel is. Sikerrel használhatók peptidkötések kialakítására a kereskedelmi forgalomban beszerezhető proteázok, például a thermolysin (Daiwa Kasei K. K. Osaka), amely alkalmas enzimhordozóra rögzítve tartósan használható. A poliészter alapanyagú, hidrofób és hidrofil kötőhelyekkel rendelkező, 900 nm pórusméretű Amberlit XAD-7 (Dow Chemical Co.) használata különösen előnyös, mert a hozzákötött enzimmel vízzel nem elegyedő szerves oldószerben (etilacetát, diklóretán, kloroform) is lefolytatható a reakció. Az etilacetátban oldott N-benziloxikarbonil-L-aszparaginsav és az L-fenilalalnin-metilészter elegyéből kalcium-klorid jelenlétében az XAD-7 gyantán glutárdialdehiddel rögzített thermolysin segítségével Nbenziloxikarbonil-L-aszpartil-L-fenilalanin.metilészter, majd a védőcsoport eltávolításával az édesítőszer nyerhető.
A LAKTOBACILLUSOK BIOLÓGIAI AKTIVITÁSÁNAK HASZNOSÍTÁSA A tejsavbaktériumok egészségügyi és élelmiszeripari szempontból igen értékes mikroaerofil fakultatív anaerob szervezetek. Savtűrésüknek köszönhetően kiszorítják az életterükről a környezetükben előforduló, potenciálisan patogén Streptococcus fajokat. A G/C arányuk széles határok között változik, de az értékek bizonyos élettani tulajdonságaikkal összefüggést mutatnak. Az emlős szervezet testüregeiben élve (szájüreg, bélcsatorna, hüvely) és a körülményekhez tökéletesen alkalmazkodva, puszta jelenlétükkel és létszámukkal a gazdaszervezet számára előnyös élettani körülményeket alakítanak ki. Antibiotikus hatású peptidek termelésével is befolyásolják a környezetükben kialakuló flóra összetételét. Egyes fajaik poliszacharidot választanak ki. A laktobacillusok nem képesek a hemin szintézisére. Az oxidációt különleges flavoproteinek végzik. Az oxigén számukra azért nem toxikus, mert egy speciális flavintartalmú peroxidázuk van, ami a képződő peroxidokat azonnal lebontja. A táptalajhoz adott hemin hatására viszont megjelenik bennük a kataláz, ami a hemszintézis utólagos elvesztését igazolja. Az anyagcsererendszer szempontjából a prokarioták két csoportba sorolhatók. HOMOFERMENTÁLÓ törzsek és HETEROFERMENTÁLÓ törzsek aktivitása Glükóz <<<<<<
Glükóz <<<<
ATP
Hexokináz
Hexokináz >>>>>>
ADP
>>>>>ADP
G-6-P
G-6-P <<<<<<<<<<<
Izomeráz
NADP+
G6Pdehidrogená >>>>>>>>>>
F-6-P <<<<<<
ATP
F-6-P-1-kináz
<<<<<<<<<<
5Pgdehidrogená >>>>>>
NADPH
6-P-G ----——> > yyyy>>>>>
ADP
F-1,6-P2
NADP+ CO2 NADPH
Ru-5-P
Aldoláz+izomeráz
Epimeráz Xu-5-P
Pi
PentózP-ketoláz 2 GAP <<<<<<
GAPdehidrogenáz
<<<<<< >>>>>> >>>>>>
GAP 2 NAD+ 2 ADP 2 ATP 2 NADH
NAD+ ADP ATP NADH
2 P-E-P <<<<<<
2 Tejsav
ADP
<<<<<< <<
ATP
P-E-P <<<<>>>>ATP
2-ATP
2 piruvát Tejsavdehidr.---áz
<<< >>>>>>
<<<
Piruvát kináz
<<<<<< >>>>>>
NADH NAD+
>>> <<<
2 ADP
Piruvát kináz >>>>>>
Acetil-P
>>>
Piruvát 2 NADH 2 NAD+
NADH NAD+
>>> <<<
Tejsav
Ac.ald. NADH NAD+
>>>>> <<<<<
Etanol
Ecetsav
A homofermentáló törzsekben a glikolitikus út ép, ezért glükózból az EMP-úton főtermékként (90 %) tejsavat fermentálnak és csak. kis mennyiségben képződik ecetsav, etanol és szén-dioxid. A heterofermentáló törzsekben az aldoláz enzim hiánya miatt tejsav mellett számottevő mennyiségben etanol és ecetsav is képződik. Ez esetben a glükóz a pentózfoszfát-úton hasznosul, és különös jelentőséget nyer a xilulóz-5-foszfát foszforoklasztikus bomlása. A fermentlében a kialakuló etanol / ecetsav arányt a tenyészet fiziológiai igénye határozza meg. A tejsavbaktériumok élőhelye tápanyagban gazdag, ezért nem meglepő, hogy az elmúlt évmilliárdok alatt az anyagcsererendszerük zavara miatt különböző anyagcsere termékekre (metabolitokra) vitaminokra hiánymutánsokká váltak. Az enzimhiányos génállományuk – az aminosav szintetizáló enzimrendszerükben levő hiányosság – .természetesen egyértelműen meghatározza a számukra előnyös életteret, mivel ezeket a számukra esszenciális vegyületeket, néhány vitamint a környezetükből kénytelenek felvenni. A klasszikus biokémiai analitika területén ezek a törzsek aminosavak illetve vitaminok mennyiségének a mérésére használhatók. A tejsavbaktériumok a történelem előtti idők rítusaiban rögzítve széleskörű felhasználásra kerültek. A sütőiparban használt kovászban a Lactobacillus plantarum, a L. bulgaricus, L. brevis, a Leuconostoc mesenteroides fordul elő az élesztő mellett. Starterkultúrák formájában a húsiparban, a tejiparban és a tartósítóiparban nélkülözhetetlenek. Jelentős gazdasági szerepük van évezredek óta a növényi tápanyagok tartósításában (savanyú káposzta, kovászos uborka). Az állattenyésztő gazdaságok a silótakarmányok előállításakor is a tejsavbaktériumok aktivitását hasznosítják.
194
Olyan egyszerű, minden háztartásban végrehajtható folyamat, mint a savanyú káposzta készítés, ha nagy mennyiségben, üzemi méretben valósul meg, a biztonság érdekében részleteiben kidolgozott technológiai előírások betartása mellett végezhető. Ugyanez vonatkozik a többi, a történelem előtti idők óta folytatott “biotechnológiai” tevékenységre Káposzta savanyítás nagyüzemi méretben
(Starter) oltótenyészet Előkészítés sólével Oltóadagolás Egészségügyi ellenőrzés
A savanyítási eljárás folyamán jól megfigyelhető az élettérért folyó küzdelem, jól elkülöníthetők annak egyes állomásai. A nedves növényi részeken először az aerob baktériumok szaporodnak. Elhasználják az oxigént, majd átadják helyüket a fakultatív anaerob Aerogenes és Erwinia fajoknak. Ezeket a homofermentáló Streptococcus-ok és a heterofermentáló Leuconostoc törzsek szorítják ki. A közben megjelenő 0,5-0,8 % tejsav már savtűrőképesség szerint szelektál; megjelennek a Pediococcus fajok. Végül a tenyésztés körülményeinek változásával a savtűrő tejsavbaktériumok válnak uralkodóvá, főleg a Lactobacillus plantarum. A tejsavbaktériumok biokémiai aktivitását összefoglaló táblázat G/C
A tejsavtermelő képességük és a tejiparban betöltött szerepükre való tekintettel ide soroljuk a Streptococcus lactis, S. cremoris, S. thermophilus, S. durens, S. diacetilactis, Leuconostoc citrovorum, Lactobacillus casei és a Pediococcus fajokat A savanyú tej, az iró fermentálója a Lactobacillus acidophilus. A 40 °C-on erjedő joghurt készítésénél a Lactobacillus bulgaricus és a Streptococcus thermophilus aktivitását hasznosítják. Az alkoholt tartalmazó kefír a Streptococcus lactis, a Lactobacillus bulgaricus és az élesztő együttműködésének a fermentációs terméke. A sajtok készítésénél is minden esetben jelen vannak. a jellegzetes íz-anyagot szolgáltató fonalas gombák mellett. A svájci
195
sajtok fermentálásában jelentős szerepet visznek a Propionibacterium shermanii és a P. freudenreichi törzsek. Az ipari tejsav gyártásához a Lactobacillus delbrueckii-t használják.
CLOSTRIDIUM TÖRZSEK IPARI HASZNOSÍTHATÓSÁGA A triviálisan vajsavas baktériumnak nevezett obligát anaerob Clostridium fajok már Pasteur figyelmét is felkeltették. A szénhidrátból képződő redukált termékek iránt később a fejlődő vegyipar is érdeklődést mutatott. A századforduló körül a háborúra készülő nagyhatalmak szerves vegyipari alapanyagigénye (robbanószer gyártás) gyorsította a nagyipari technológia kifejlesztését. Ezek a baktériumok glükózból fruktóz-biszfoszfáton keresztül különböző savakat, alkoholokat, szén-dioxidot és hidrogént termelnek. Fehérje erjesztésekor anaerob körülmények között végbemenő aminosav dehidrogénezési, oxidatív dekarboxilezési és az aminosavak reduktív deaminálási folyamatait összekapcsolva (Stickland-reakció 1934) a megfelelő savakon kívül ammónia és ATP is képződik. Oxidatív Hatás
COOH H-C-NH2 H-C-H H
COOH 2 CH2 NH 2
Stickland reakció
Reduktív hatás
NAD+ NADH
H2O NH3 COOH C=O CH3
NAD+
2 NH3
CO2 CoA-SH
CoA S C=O CH3.
NADH Pi P-O3H2 2 O C=O CH3
P-O3H2 O C=O CH3
2 ADP ADP ATP
HOOC-CH3
Alanin + 2 glicin + 3 ADP +3 Pi + + H2O
2 ATP 2 HOOC-CH3
3 ecetsav + 3 Ammónia + 3 ATP + CO2
A Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) talajban élő, peritrich ostoros (0,8 x 4 µm) pálcika, amely a légköri nitrogén megkötésére is képes. Ipari eljárásban aceton és butanol előállítására használják. A butanol, mint membránkárosító oldószer limitálja az elérhető koncentrációt; 2 % felett már toxikus tünetek jelentkeznek. A fermentációs eljárás közben először a megfelelő sav képződik, ami a fermentáció második szakaszában – a sejtek növekedése nélkül – a trióz-foszfát dehidrogénezése közben képződött NADH hasznosításával redukálódik alkohollá. A reakcióelegyhez adott kálcium-karbonát hatására ez az átalakulás nem következik be, felszaporodik a vajsav és az ecetsav Ca sója. Kétnapos Clostridium fermentáció termékösszetétele (mg / liter ): Kalciumkarbonát nélkül Kálciumkarbonát jelentétében vajsav 32,2 630,0 butanol 411,5 45,7 ecetsav 102,1 230,7 etanol 44,5 22,4 aceton 222,3 13,2
196
Clostridium fajok fermentációs aktivitása
NADH
NAD+ CO2 NADH
NAD+ Acetald.
Etanol
CoA-SH acetecetsav Dekarboxiláz CO2 aceton <<<<<<<
Vajsav Az ipari gyakorlatba vett törzsből céltudatos szelekcióval nyert Clostridium butylicum butanol és izopropanol előállítására használható. Az elkülönített Clostridium butyricum stabil variánsként vajsav- és ecetsavképzésre alkalmas.
Keverővel felszerelt fekvő bioreaktor 1) gázelegy bevezető 2)mintaveveő csonk 3) hűtőköpeny 4) keverő lapátok 5)Gázelegy elvezető 6) Keverő mototr 7) fermentor test 8) Reakcióelegy 9) keverőtengely Táptalajként kukoricalekvárt (a keményítőgyártás melléktermékeként felgyűlő növényi fehérjét tartalmazó oldat tejsavas erjesztésével nyert termék koncentrátuma) és melaszt (a répacukor kristályosításakor visszamaradó anyalúg) sterilizálnak az anerob bioreaktorban. A táptalajt aszeptikus körülmények között a termelőképességre szelektált törzs spóráival oltják. Az Clostridium törzsek obligát anaerob voltára tekintettel órákon keresztül széndioxidot áramoltatnak át a rendszeren a növekedés megindulásának segítése céljából.
197
ALKOHOLOS ERJESZTÉS A történelmi idők előtt kialakult alkoholos erjesztési technológiák fő szereplője az élesztő. Ez a tömlősgomba néhány különleges biokémiai tulajdonsága miatt került a törzsfejlődés kegyetlenül szelektáló körülményei között erre a helyre. Ezek a környezet károsító hatásait is jól tűrő, genetikailag stabil szervezetek a növényi eredetű természetes táptalajokon jól növekednek. Az élesztők a természetben viszonylag nagy koncentrációban előforduló cukrok (glükóz, maltóz, maltotrióz, trehalóz, galaktóz, mannóz, fruktóz, szacharóz, raffinóz) hasznosítására, erjesztésére is képesek. Erjesztő tevékenységük főterméke az etanol. A csoport elnevezése tudománytörténeti. Az alkoholos erjedés enzimeinek hordozóiként megismert élesztőgombákat (zymomycota) a görög erjesztő ζυµωµα (kovász) szóval különböztették meg a szénhidrátot nem erjesztő aerob gombáktól. Rendszertanilag a tömlősgombák közé sorolva Hemiascomycetes-ként különítették el őket az Euascomycetes csoporttól. Az élesztősejtfal külső mannán-fehérje rétegét diszulfid-hidak merevítik. Még több a diszulfidkötés a pszeudohifát képző sejtek falában. Ez a rögzített szerkezet megakadályozza a falban működő enzimek eltávozását, de védi a sejtfalat a közegben előforduló sejtfalbontó enzimek roncsoló hatásától is. Polarizációs mikroszkópi technikával nyert adatok szerint az élesztő külső mannán rétegének elemei radiálisan, a belső rétegek viszont a sejtfelszínnel párhuzamosan, kötegekbe rendeződve helyezkednek el. A Saccharomycetaceae családba egysejtű, sarjadzással szaporodó, de a tenyésztési körülményektől függően álmicéliumot (pseudo) képző gombák tartoznak. Ivaros szaporodásuk a vegetatív sejtek összeolvadása. Az idetartozó nemzetségeket zimospóráik alakja és kialakulásuk módja alapján különíthetjük el. A talajtól a melegvérűek bélcsatornájáig mindenütt találkozhatunk velük. Erjesztő képességüket a borászat, a söripar, a szeszipar és a sütőipar hasznosítja; a vegyipar enzimforrásként alkalmazza; az állattenyésztők pedig takarmányként ismerik. A Saccharomyces carlsbergensis-t — amelyet a rendszertan Saccharomyces uvarum-nak nevez — például a hazai sörgyárainkban a mélyerjesztésnek nevezett technológiában használják. Az idesorolt fajok imperfekt alakjait sok esetben a szabályokat szigorúan követő szerzők műveiben a Deuteromycota tagozat Candida nemzetségébe sorolva találjuk. Saccharomyces cerevisiae (szin.: Candida robusta). Első leíróik (Megen és Hansen) 1883-ban Saccharomyces ellipsoideus néven vezették be az irodalomba. Pszeudomicéliumot képez, alakja és mérete változó. Gyümölcslében, talajban és Drosophilán igazolták jelenlétét. Felsőerjesztésű technológiában alkalmazott sörélesztő. Borélesztő néven sok variánsa ismert. Hidegtűrő, melegtűrő, alkoholtűrő, kénsavtűrő, aroma anyagokat termelő változatait fajélesztőként tartják számon és a borászatban használják. A pékélesztő főtömegét is ez alkotja. Az élesztő-félék közül a Saccharomyces cerevisiae szaporodási folyamatairól rendelkezünk a legtöbb ismerettel. Az élesztőkben a kromoszómák mitózisos osztódása a maghártya felszakadása nélkül a sejtmagban folyik. A görög latin eredetű elnevezése (µυθοσ, mythicus) a sejtosztódás valamikor ismeretlen folyamatáea utal. A sarjadzással egy időben a nukleolusz is kettéosztódik és az egyik az új sarjsejtbe húzódva irányítja a megkettőződő kromoszómák szétválását. A maghártya - eltérően a magasabbrendűektől - a kromoszóma kettőződésekor is fennmarad, megakadályozandó a magtartalom szétáramlását a citoplazmában. Ezért a gombamitózist kariokorízisnek (χοριον magzatburok) nevezzük. Az S288C törzs óvatosan nyert lizátumának pulzáló mezejű gélelektroforetogramja (PFGE) is igazolja kromoszómáinak számát. Sőt, a 16 kromoszóma méretére vonatkozólag is megbízható adattal rendelkezünk. S288C törzs Kromoszómái I. 240 kb IX. 440 kb II. 840 kb X. 755 kb III. 350 kb XI. 680 kb IV. 1640 kb XII. * 1095 kb V. 590 kb XIII. 950 kb VI. 280 kb XIV 810 kb VII. 1120 kb XV. 1130 kb VIII. 590 kb XVI. 980 kb • Megemlítendő, hogy a riboszomális DNS még hozzáadandó a XII. kromoszóma méretéhez.
Élesztőkromoszómák (Sfi –|– és Not –|– enzimekkel nyert) restrikciós térképe A kromoszómák szétválását minden esetben mikrotubulusokból felépülő osztódási orsó kialakulása segíti. Ez a húzófonalként szolgáló fehérje a kromoszóma belső részén található, centromernek nevezett, konzervatív szekvenciát tartalmazó szakaszához kötődik. A csövecskéket felépítő fehérje a tubulin, amelyhez specifikusan kötődnek a fungisztatikus hatású benzimidazol származékok, amilyen például a karbendazim. (A magasabb rendűek mikrotubulusait a kolchicin képes inaktíválni, amelyre a gombák viszont érzéketlenek!). Az eukariota kromoszóma mindkét végén többször ismétlődő konzervatív szekvenciát tartalmazó záró szakasz, a kromoszóma információtartalmát őrző telomer régió helyezkedik el. Természetesen minden kromoszómán megtalálható a megkettőződést irányító (ARS regio, autonom repetitív szekvencia) szakasz. Ezen ismeretlen szerkezetű alkotórészek birtokában olyan, tetszőleges információt tartalmazó mesterséges kromoszóma is előállítható, amely az utódokban változatlan formában megjelenve, adott esetben kifejeződik. Ha ellentétes ivarú törzs nincs jelen, akkor a sarjadzó sejtek génállománya mitózisos osztódással a sejtmagban a maghártya felszakadása nélkül kettőződik. A maghártya csupán az ivaros folyamatban bekövetkező kariogámia folyamatában a két mag összeolvadásakor válik átjárhatóvá. A folyamatot az interfázis G-1 (gap) szakaszában a cdc28-gén (cell division cycle) működése indítja el. Mindenekelőtt a maghártyán levő, centriolum szerű képlet kettőződve az osztódásban irányító szerepet tölt be. Az egyik mukleolusz az új sarjsejtebe húzódva irányítja a megkettőződő kromoszómák szétválását. A következő lépés (S fázis) a DNS-replikáció, amit a mikrotubulusokból szerveződő osztódási orsó kialakulása követ. A kromoszómák szétválását az M fázisban (mitózis) ez a szerkezet segíti elő. A folyamat általában 90-120 percet igényel. Ez a szétválás már sarjadzás közben történik. A szülő sejt és a leánysejt között csupán a szaporodási heg számában van különbség. A sarjadzó gombák szaporodásakor ugyanis nem reped fel a fal külső rétege, hanem a sarjsejt növekedésekor a régihez szervesen 199
kapcsolódva képződik az új teljes sejtfal. A képződő leánysejtmag, valamint egy-két mitokondrium kerül azután a sarjsejtbe, amely kezdetben sokkal kisebb, mint az anyasejt. Az intenzív növekedési szakaszban az új sarj képződése a leánysejten még az anyasejtről való leválás előtt, az összekötő szakasz eltömődése közben már megindulhat. Egy ciklus ilyenkor 70-100 percig tart, később ez a folyamat 6 órára nyúlik. A sarjsejt képződését a fonalas gombák mikrociklusos konídiogeneziséhez hasonlítva, a fialidból kisarjadó vegetatív spórának tekinthetjük. Az élesztősejtek felületén a leváló sejt helyén kitinben gazdag heg képződik, amelyből az utódok számára következtethetünk. Sarjképződés ugyanis csak érintetlen sejtfalon indulhat meg. Specifikus festéssel, illetve elektronmikroszkópos felvételeken a leválás helye jól látható. A valódi élesztők sarjadzó képességének meghatározása céljából a tápanyag folyamatos kiegészítése mellett a sarjsejteket is eltávolították a tenyészetből. Ez esetben 43 sarjsejt képződését igazolták az átlagos 24 leánysejt képződése helyett. Az ipari gyakorlatban optimális körülmények között 6-8 sarjnál nem képződik több, mert a tenyészet sűrűsége (élősejtszám) gátat vet a szaporodásnak. A vizsgálathoz szükséges érintetlen kiindulási sejtet csak Az élesztő mitózisos osztódása a szexuális szaporodással képződő zimospórákból nyerhetünk. A Saccharomyces cerevisiae genetikailag tiszta állományú törzsei vagy a-ivarúak (MATa-gén) vagy α-ivarúak (MATα-gén). Az ivaros szaporodásban szerepet játszó gének közül eddig 32 működését ismerjük. Az idesorolt családok közös ismérve az ellentétes polaritású sejtek összeolvadásával képződő, régebben aszkusznak nevezett zimosporangiumban fejlődő zimospóra. A zimosporangium néhány kivételtől eltekintve négy zimospórát tartalmaz. Amennyiben a tenyészetben kellő számban heterotallikus tulajdonságú ellentétes ivarú — a MATa gén, illetve α alléljét tartalmazó — sejt van, akkor megindulhat a szexuális szaporodási ciklus, amely több mint 5 óra alatt fejeződik be. Első lépésként az általuk kiválasztott feromonszerű (S = substantia) vegyületek kölcsönösen leállítják a cdc28-gén működését. Az α-ivarú sejtek az αI-S, az a ivarú sejtek pedig a feromon aI-S változatát állítják elő. A feromonok dodeka- és tridekapeptidből és ezek oxidált formájából álló fehérjék. α−faktor H2N-Trp-His-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr-COOH α− (αI-S feromon) CH3 CH3 CH3 | | | CH2C CH2 C CH2 C / \ // \ / \ // \ / \ // \ S CH CH2 CH CH2 CH CH3 (aI-S feromon) | a-faktor H2N-Tyr-Ile-Ile-Lys-Gly-Val-Phe-Trp-Asp-Pro-Ala-Cys-COO-CH3 Egyidejűleg mindkét ivari ciklusra készülő sejt feromont kötő fehérjét (Guanin nukleotidot kötő α, β és γ fehérjét tartalmazó hetero-trimer) termel. A feromon hatására az élesztősejtek megkezdik az agglutinációs faktorok (a-AF=hőstabil glükopeptid, illetve az α-AF=hőérzékeny glükopeptid) termelését. Az ellentétes agglutinációs faktort termelő törzsek ezután páronként összetapadva élettani folyamataikat szinkronizálják. Az αI-S hatására az a-ivarú sejtek, az aI-S feromon hatására pedig az α-ivarú sejtek a citoszkeleton átrendeződésével nyúlványt fejlesztenek, gametangiummá alakulnak. (Természetesen a sejtek saját feromonjaikkal szemben érzéketlenek.) A gametangiummá alakuló sejtek összeérő sejtfala feloldódik, majd a két sejt plazmája összefolyik, bekövetkezik a plazmogámia. A két sejtmag a KAR-gén hatására egymás felé úszik, majd összeolvadva (kariogámia) a sejt valódi zigótává (2n gonatokonta) úgynevezett blasztozigótává alakul. Elegendő tápanyag jelenlétében a zigóta sarjadzása diploid sejttenyészet (diplofázis) kialakulását teszi lehetővé. A diploid sarjadzással készülő sejtekben a MAT gén a és α allélja is jelen van, ezért szexuálisan inaktív, ivaros szaporodásra képtelen.
200
A tápközeg széntartalékának kimerülésekor, vagy nitrogén éhezés estében, a belső redukáló erő csökkenésekor (oxidatív sztressz) a diploid sejtek meiospóra anyasejtté alakulnak. Ez az átalakulás egyedüli szénforrásként acetátot tartalmazó táptalajon már 4 órán belül bekövetkezik.. A meiózisos folyamat első lépéseként az I-profázis keretében a DNS-állomány megkettőződik, létrejön a 4n állapot. Ezt követi a II-profázis, amelyben a kromoszóma állomány két leánymagra különül. További szétválással alakul ki a négy haploid prospóra génkészlete. Ezzel egyidejűleg megindul a többrétegű spórafal képződése, valamint a spóraplazma sűrűsödése. A II-telofázis végére mind a négy haploid zimospóra (két a ivarú és két α ivarú) érése befejeződik. A kiszabaduló spórák megkezdhetik vegetatív szaporodásukat (sarjadzás). Sok esetben a szexuális folyamat zavartalan lefolyásának előfeltétele az ölő (MAK killer) tulajdonság jelenléte. Az úgynevezett "killer-gén" egy olyan toxikus fehérje képződését segíti, amely a környezetben levő idegen élesztő törzseket elpusztítja. Az ölő toxin elleni védelmet, a saját toxinnal szembeni rezisztenciát három működőképes kromoszómális gén biztosítja. Az ölő anyagot termelő sejtekben két nem szegmentált kettős szálú RNS vírus
201
— a V-1 és a V-2 — található. Azonban nem csak ez a két virion szükséges az ölő toxin képződéséhez, hanem magi kromoszómális gének aktív tevékenysége is nélkülözhetetlen. A MAK gének többsége a V-2, néhány pedig a V-1 RNS fonal képződését segíti elő. Megjegyzendő továbbá, hogy a V-2 öröklődése a fentieken kívül még néhány kromoszómán kódolt gén jelenlétét igényli. Bármelyikük hiánya a virion-RNS széttörését okozza. AV-1 virion 4,6 kb méretű dsRNS fonala kódolja a kapszid fehérjét és az RNS-függő polimerázt. A V-1 virionból kizáródó +RNS szálról a gazda riboszómáin képződik a tok fehérje és a RNS függő fúziós fehérje, amit a V-2 vírus csomagoló anyagként használ. Az RNS fonalak aszinkron módon a fejlődési folyamat különböző periódusában a virionon belül szintetizálódnak a magi gének által kódolt fehérjék aktív közreműködésével. A V-2 virionban levő kisebb méretű 1,8 kb méretű dsRNS fonal +RNS szála kódolja a preprotoxin fehérjét, amit a gazdasejt magi DNS (KEX gének, killer expression) által kódolt fehérjék által irányított érési folyamat aktivál. A környezetbe való kiválasztást (secession) a SEC gének segítik. Az aktív toxin (killer faktor) az idegen gomba glükán sejtfalán levő receptorhoz kötődve kálium és proton kiáramlást okozó pórust képez. A spórázás folyamatában érdekelt gének sérülése esetén a folyamat megrekedve különleges sejtvonalak kialakulására vezet. A KAR-gén sérülése esetén a folyamat a prozigóta állapotig jut el. Az így létrejövő dikarion sejtvonal vegetatív úton sarjadzással szaporodhat. Az is előfordul, hogy a diploid sejtek (blasztozigóta) tovább alakulásának gátlása a kedvezőtlenné váló környezeti hatás ellenére a diploid élesztő vonal fennmaradását okozza. Más esetben, ha az elindult ivaros folyamat valamilyen okból nem végződik zigótaképzéssel, akkor adaptálódásnak nevezett folyamat keretében visszaalakulhat haploid sarjadzó sejtté. Élesztőfélék diploid sejtciklusának indulása
Néhány élesztőfaj esetében magi kromoszómában rögzített killer tulajdonság is ismeretes. A Kluyveromyces marxianus var. lactis killer fenotipusát két plazmid, a citoplazmában található 8,9 kb méretű pGKL1 és a 13,4 kb méretű pGKL2 plazmid hordozza. Az 1-es plazmid kódolja a toxint és az immunitást jelentő fehérjét; a 2-es plazmid pedig a DNS polimerázt és az DNS függő RNS polimerázt. Maga a toxin – amely idegen törzs esetében a sejtciklust a G1 fázisban állítja meg – heterotrimer glükoprotein. Az α-alegység S-S hidakkal merevített glükoprotein. A β ás a γ alegységet is S-S hidak kapcsolják egymáshoz. Megjegyzendő, hogy a Killer fenotipust eredményező RNS vírusok, illetve plazmidok hatása sok esetben a tömlős és bazídiumos gombáknál is jelentkezik. A Saccharomyces cerevisiae homotallikus törzsei a genom programozott átrendeződése miatt a párosodási típusuk megcserélésére, a III. kromoszómán lokalizált MATa és MATα allélok egymásba alakulására képesek. A homotallikus törzsekből képződő telep — mivel a sarjadzás közben képződő a illetve α sejtek zömmel konjugálnak — a/α sejteket tartalmaz . Az átalakulást a IV. kromoszómán lokalizált endonukleázt kódoló homotallia gén (HO 202
gén) irányítja. Párosodási típus váltásra csak a többször próbált anyasejt képes. A sarjadzást közvetlenül megelőzve játszódik le az allélcserélődés folyamata. A genetikai tulajdonságok megőrzésén és tovább adásán kívül a DNS-ben rögzített tulajdonságok leolvasása is a sejtmagban játszódik le. Itt megy végbe a sejtmagban működő RNS-polimeráz által létrehozott premessenger-RNS érési folyamata. Bonyolult lépésekben a szükségtelen (intron) szakaszok eltávolításával és az exon szakaszok összekapcsolásával készül a citoplazmában folyó riboszómás fehérjeszintézis irányítására alkalmas érett mRNS. Az így készült mRNS a maghártya pórusain keresztül kerül a citoplazmába, ahol a 80S méretű riboszómákon a fehérjeszintézis folyamata végbemegy. Ezeken a pórusokon keresztül jut a sejtmagba az RNSszintézishez és a DNS-replikációhoz szükséges összes építőelem (nukleotid-trifoszfátok), de ezeken a pórusokon jutnak a sejtmagba a citoplazmában képződő enzimek és szabályozó fehérjék (represszorok) is. Az élesztők ammóniából és szénhidrátból a sarjadzó sejt felépítéséhez szükséges vegyületek teljes választékát képesek előállítani. A szénhidrát hasznosításban az Embden, Meyerhof, Parnas nevével jegyzett enzimrendszerük sejtmentes formában is képes a glükózt alkohollá alakítani, amint azt Büchner 1897-ben közreadott dolgozatában leírta. Az EMP út kulcsintermedierjét - a Harden és Young által izolált (1908-ban) fruktóz-1,6-biszfoszfátot - az ATP szint által szabályozott fruktózfoszfát-1-kináz állítja elő fruktóz-6-foszfátból. A növekedés ütemét a NADH regenerálásának mértéke, az alkohol képződés befolyásolja. A növekedéshez szükséges egyéb vegyületek (aromás aminosavak, pentózok) képződése a jól ismert HMP (hexózmonofoszfát) úthoz kapcsolódva folyik. A HMP út teljesítményét, a bevezető reakciókat katalizáló enzimek (glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és glükonát-6-foszfát-dehidrogenáz) működését a kofaktor ellátottságuk, a NADP+ szint alakulása szabályozza. A fakultatív anaerob szervezetek szénhidrát anyagcseréjének szabályozására vonatkozó első tudományos megállapítás Pasteur nevéhez kötődik 1860 óta. Kisérleti eredményei az oxigén szabályozó szerepére hívta fel a figyelmet. Oxigén jelenlétében az élesztők növekedése jelentősen fokozódik. A légzés fokozódása, az oxidatív foszforilációhoz vezető elektronlánc működése, a tápközeg (szénhidrát) energiatartalmának gazdaságosabb hasznosítását teszi lehetővé. Oxigén jelenlétében az anaerob anyagcserét kiszolgáló EMP úttal szemben előtérbe kerül a HMP út működése, amely a növekedéshez szükséges építőelemek képződése szempontjából meghatározó jelentőségű. Az oxigén közvetlen hatását kísérletileg ugyan nem igazolták, bár számos olyan enzim ismert, ilyen például az α-ketoglutarát dehidrogenáz is, amely csak oxigén jelenlétében képződik. Valójában az élesztők nem tekinthetők fakultatív anaerob szervezeteknek, mert a növekedésük szigorúan anaerob körülmények között leáll. Oxigénmentes körülmények között ugyanis nem képesek a sejtmembrán nélkülözhetetlen építőelemeként ismert szterinek (ergoszterin) és bizonyos esszenciális telítetlen zsírsavak szintézisére. Néhány metil csoport eltávolítása ugyanis molekuláris oldott oxigén jelenlétét igényli. Az ipari gyakorlatban ezért csekély levegőt mindig juttatnak a tenyésztő reaktorba. Az élesztők különleges szabályozási mechanizmusa miatt az alkoholos erjedés hatásfokát a jelenlevő oxigén nem rontja. Az élesztőben az oxigén jelenléte, az aerob anyagcsere működése morfológiai változást jelent. Az energia nyerés feladatát a továbbiakban a mitokondriumok látják el. Gyorsul a sejtszaporodás, miközben csökken a szénhidrát felhasználása. Megjelennek a légzést szolgáló mitokondriumok, amelyek anaerob körülmények között, oxigén hiány esetén újra sorvadásnak indulnak. Anaerob viszonyok között az oxidatív foszforilációt kiszolgáló elektronlánc működésképtelen. A mikroba növekedő szénhidrát felhasználással — alkoholos erjedéssel — az EMP úton szubsztrátszintű foszforilációval próbálja kielégíteni a mikroszervezet energiaigényét. Ennek az útnak a rossz hatásfoka az aerob körülményekhez viszonyítva lényegesen lassúbb növekedést képes kielégíteni. Azt, hogy ezt a váltást nem közvetlenül az oxigén okozza jól demonstrálja - a Crabtree által 1929-ben leírt jelenség - a glükóz fogyasztásnak a megnövekedése. A tápközeghez adott glükóz mennyiségétől függően az élesztő aerob körülmények között is képes az alkoholos erjedés irányába terelni az anyagcserét. Glükóz adagolásakor a citokrómok képződése ugyanúgy leáll, mintha oxigén hiányában következne be a gátló hatás. A légzőenzimek kiesése érzékenyen érinti a sejt ATP szintjét. Az ATP szint csökkenése pedig feloldja az alloszterikusan szabályozott fruktózfoszfát-1-kináz gátoltságát és ezzel utat enged az EMP út szubsztrát-szintű foszforilációjának. Ennek az enzimnek a működését az aktuális ATP szint szabályozza. A légzés csökkenése a redukált kofaktorok NADH, NADPH feldúsulásához vezet. A NAD+ hiány gátolja a piruvát-dehidrogenáz működését, amiből következően a Krebs ciklus leáll. Az ATP szint alakulása a permeáz működésére hatva, befolyásolja a glükóz felvételét. Végeredményben a légköri oxigén jelenlétében anaerob anyagcserére jellemző egyensúly alakul ki, amely a fokozott glükóz felvétel mellett csupán a növekedés lassú voltában jelentkezik. A glikolitikus út önfenntartó módon képes a glükózt két etanollá alakítani, miközben két ATP marad további felhasználásra. Az elméleti konverziós értéket (1 g glükóz --> 0,51 g etanol) csak 95%-ra lehet megközelíteni. Melléktermékként a táblázatban feltüntetett glicerin és szerves savak jelennek meg, amelyek a NADH dehidrogénezése közben képződnek. 100 mmol glükózból képződő fermentációs termék Saccharomycas cerevisiae tenyészetben
A glicerin képződés főtermékké tehető, ha az alkohol-dehidrogenáz működését helyettesítve az αglicerinfoszfát-dehidrogenáz regenerálja a redukált kofaktorokat. Az alkohol-dehidrogenáz leállását okozza, ha a reakciótermékét - az acetaldehidet - keletkezése pillanatában nátrium-szulfittal reagáltatjuk. Ezért az EMP úton képződött NADH a dihidroxiaceton-foszfát redukciójára használódik fel. A képződő α-glicerinfoszfátot végül egy foszfatáz alakítja glicerinné. Dihidroxiaceton-foszfát + NADH
———————>
α-glicerinfoszfát-dehidrogenáz
α-glicerin-foszfát
————>
α-glicerin-foszfát + NAD+ glicerin + Pi
foszfatáz
Etanol képzés prokarióta aktivitását hasznosítva
. Az ábra bemutatja az élesztő és az ipari alkohol gyártáshoz előnyösen használható anaerob baktérium erjesztő tevékenységét. A Zymomonas mobilis az élesztőnél lényegesen gyorsabban szaporodik. A képződő etanolt megfelelő technikával folyamatosan eltávoloítva nagyobb teljesítményre képes. Magasabb hőmérsékleten erjeszt. 36 °C-on az elméletileg lehetséges alkohol hozam 97 %-át teljesíti. Mivel a szénhidrát lebontás az Entner-Doudoroff úton folyik, csak 1 ATP képződik, amiből következően a képződő sejttömeg csekélyebb. (A folyamatosan üzemeltethető reaktorban állítják elő a motorhajtóanyagként forgalmazott alkoholt.)
204
Az alkoholos erjedés gyakorlati hasznosítása: BORTERMELÉS Az emberi civilizáció az alkoholos erjedési folyamatot világszerte élvezeti cikkek előállítására hasznosította. Kezdetben természetes eredetű szénhidráttartalmú növényi kivonatok, gyümölcsök présleve szolgált alapanyagul, később gabonamagvak szénhidráttartalmát erjesztették. Az egyik legnagyobb mennyiségben fogyasztott alkohol tartalmú termék a szőlőből préselt mustból anaerob fermentációval nyert bor. A must szénhidrát tartalmának jelentős hányadát a mustba került élesztők biokémiai aktivitása alakítja alkohollá. A világ évi bortermelése 300 millió hektoliter, amelynek 80 %-át Európában termelik. A piaci adatok szerint Dél-Amerika a világ termelésének 10%-át az USA pedig 6 %-át állítja elő, bár az utóbbi évtizedben az amerikai kontinens bortermelése évről évre emelkedik. A kipréselt szőlőlé enyhén savanyú kémhatású (pH=3,3-3,9), 6-10 % glükózt és 8-12 % fruktózt, 0,20,6 % asszimilálható nitrogént valamint kolloid méretű növényi részeket tartalmazó enyhén zavaros tápközeg. Savanyúságát a mustban előforduló 0,5-1 % szerves sav okozza, amely gátolja a baktériumos fertőzést okozó csírák elszaporodását. A must könnyen metabolizálható nitrogén tartalma, amely az élesztők elszaporodása szempontjából létfontosságú, főleg aminosav formájában van jelen. Ha valamilyen okból a must nitrogén tartalma nem éri el a 0,2 %-ot akkor - például a szőlőfürtök Botrytis cinerea fertőzöttsége miatt - célszerű literenként 200-300 mg ammónium-foszfátot, illetve ammónium-szulfátot adni a reakció elegyhez. A természetes körülmények között nyert préselt szőlőlé a környezetből származó, méhek, darazsak és muslicák által közvetített különböző élesztősejteket tartalmazhat (600-6000 sejt/ml). Ezek a sejtek alkotják a három jól elkülöníthető fermentációs szakasz aktív résztvevőit. A bortermelés élettanilag jól elkülönülő elsô szakaszában főleg az alacsonyabb erjesztő aktivitású Klockera apiculata, Metschnokowia pulherrima, Torulopsis stellata, Klockera corticis, Candida crusei, Candida vini, Hansenula anomala, Pichia fermentans tevékenykednek. A főfermentációs szakaszban az egy Kluyveromyces veronae-n kívül, a többi törzs a Saccharomyces nemzetséget képviseli (S. cerevisiae, S. uvarum, S. bayanus, S chevalieri, S. delbruecckii, S. fermentati, S. rosei, S. rouxii). Az utófermentációs szakaszban általában csak Saccharomyces cerevisiae és S. bayanus törzsekkel találkozunk. A borkészítés első lépése a szőlőlé nyerése. Az összetört szőlőszemek gyors kipréselése csökkenti a baktériumos fertőzés lehetőségét. A kipréselés halasztása viszont előnyös a lényerés szepontjából, mert a pektinázok működése növeli a lékihozatalt. Egyes technológiai leírások mikrobiális eredetű pektináz adagolását javasolják. Bonyolult szabályozási szerepet tölt be a borképzôdésben a kéndioxid, amelyet az élesztők jelentős része szulfátból képes előállítani. Az egyes törzsek szulfátredukáló képességétől függően jelentős mennyiségű, 50-150 mg szulfit képződhet literenként. Ezt a vegyületet a borászok a technológiai folyamat különböző szakaszában alkalmazzák. A musthoz adott 100 mg acetaldehiddel reagáló kénessav 3 napra leállítja a fermentációt, 200 mg viszont 20 napig gátolja az erjedési folyamatot. Az élesztő szabályozási mechanizmusában fontos szerepet játszó Pasteur effektust felfüggesztve az etanol képződést oxigén jelenlétében is lehetővé teszi. A folyamatosan változó reakcióelegy kéndioxid, hidroszulfit és szulfit ion mennyiségi viszonyaiban a közeg pH-ja által befolyásolt dinamikus egyensúly alakul ki. A szabad kéndioxid toxikusabb mint a kötött. Fontos szerepet játszanak a borászati folyamatban a tejsavbaktériumok. Ezek részben homofermentálók részben heterofermentáló anaerob, illetve mikroaerofil prokarioták. Tevékenységük a szőlőlé savtartalmának a csökkentésében, különösen az almasav-mentesítésben jelentős. NAD+ >>>>>NADH HOOC−CH2−CHOH−COOH >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> HOOC−CH2−CO−COOH almasav-dehidrogenáz NAD+ oxálecetsav-dekarboxiláz malát enzim CO2 NADH CO2 “önfenntartó ciklus!”
H3C−CO−COOH NADH tejsav-dehidrogenáz NAD+
H3C-HCOH-COO Tejsavbaktériumok szerepe a bor savtartalmának csökkentésében
205
A tejsavbaktériumok közül különösen fontos szerepet vállalnak a Leuconostoc fajok. Ezeknek az elszaporodását a széndioxid tenzió segíti. Az alkoholos erjedés közben a növekvő etanolkoncentráció a tejsavbaktériumok szaporodását, mind az almasav fermentáló aktivitásukat határozottan gátolja. A heterofermentáló Lactobacillus törzsek növekedését 6 % etanol 20 %-kal csökkenti, ugyanakkor az almasav bontó aktivitásuk csak 10 %-os károsodást szenved, 10 % etanol tartalom a növekedést közel felére, az almasav bontást viszont csak 20 %-kal csökkenti. Sőt az almasavbontó képességük a környezet savanyodásával fokozódik.
A baktériumok elszaporodását kénessavas kezeléssel akadályozzák már a szőlőszemek megtörésekor. Különösen indokolt a használata az alacsony savtartalmú szőlőkből induló borkészítéskor. A nemkivánatos mikroszervezetek számának csökkentése szempontjából előnyös a rövid időtartamú 85 oC -ra melegítés és az erjesztés szempontjából optimális 10-15 oC -ra való visszahűtés. Az erjedés befejeztekor az új bor 8-10 % etanolt tartalmaz. Az elszaporodott élesztőt, még az autolízis bekövetkezése előtt el kell távolítani. A vörös bor készítése némileg eltér a fehérbor előállításakor követett módszertől. Ennek oka az, hogy fontos szerepet kap a vörös színanyagok, az anthocyanok optimális kinyerése és a tannin tartalom limitálása. A színanyagot ugyanis a képződő alkohol vonja ki a növénybôl. Ezért célszerű ezt a folyamatot már az ép szőlőszemekben elindítani. Egyes technológiai leírások szerint az érintetlen szőlőszemeket 8-10 napig széndioxid túlnyomás alatt tartják. Az alkoholos erjedés már a szőlőszemekben indul, az etanol tartalom 1,5-2 %-ra emelkedik, sőt bakteriális hatásra az almasav tartalom a felére csökken. Az ekkor kipréselt szőlőlében 20-30 oC -on két nap alatt befejeződik az alkoholos erjedés viszonylag alacsony polifenol tartalom mellett. A másik megoldandó probléma a tannin tartalom beállítása. A tannin a szőlőszemek héjából nyerhető. A szőlőszemekben felszaporodó széndioxid miatt a szőlőszem roncsok az erjedő elegy felszínére emelkednek, ahonnan csak mechanikus módszerrel meríthetők a folyadékszint alá. Kellő mennyiségű tannin kioldódása után viszont az alakos elemeket maradéktalanul el kell távolítani az erjedő léből. Nem véletlen, hogy a boripar a vörös bor elôállítására előszeretettel használ nagy méretű saválló fermentorokat, amelyben a legbonyolultabb technológiai előírásokat is be lehet tartani. Ezekben a készülékekben recirkulációs elven alapuló eljárások kialakítására is lehetőség adódik. A fajélesztővel készült borok érzékszervi vizsgálatát a pincegazdaságok analitikai laboratóriumaiban nyert adatok egészítik ki. Példaként egy Bordeaux-i vörös bor (pH=3,49) ideális esetben 12,5 V/V % alkoholt, 4,8 g/L cukrot, 6 g/L savat, 126 mg/L antocianint, 900 mg/L leukoantocianint, 371 mg/L katechint tartalmaz. Az összes polifenol tartalma 880 mg/L. Ezt kiegészíti a színintenzitás és a színárnyalat mérés. Az aszú bor képződése egy második fermentációs lépés eredménye. A külön gyűjtött — a tőkén megaszalódott — nagy cukortartalmú szőlőszemekből származó koncentrátummal kiegészített bor a második fermentációs ciklusban nyeri el különleges ízét. — Kedvező időjárás esetén a megtelepedő Botrytis fajok különleges izanyagokat juttatnak az aszusodó szőlőszemekbe, amely az aszubor élvezeti értékét gazdagítja. A spanyol eredetű sherry meglehetősen nagy alkohol tartalmú (19-21 %), úgynevezett desszert ital. Erjesztését magas alkohol tartalmat tűrő élesztővel végzik. Ez az élesztő az erjedő reakcióelegy felszínén bevonatot képez. Neve - Mycoderma vini - is erre a képességére utal. Mai rendszertani besorolása szerint 206
Saccharomyces bayanus néven szerepel a szakirodalomban. A magas alkohol tartalom elérése céljából a kipréselt szőlőléhez szacharózt adagolnak a kívánt szint eléréséig. Eredetileg a szőlőszemeket napsugárral aszalták a kívánt cukortartalom eléréséig és akkor került a présbe. Az így nyert erjesztésre szánt koncentrált szőlőléből kalcium-szulfáttal való kezelés hatására borkősav szabadul fel, amely visszaszorítja a Lactobacillus törzsek elszaporodását. A koncentrált cukoroldat erjesztését a fermentlé felületén elszaporodó élesztő végzi. Az egyszerű borpincében történő sherry előállítás technológiája szerint a 14-15 % alkoholt tartalmazó alap borba oldják a répacukrot, majd félig töltött 500 literes hordóban végzik az erjesztést oly módon, hogy az élesztő réteg felett levegő legyen. Az erjedés befejeződése után az élesztőréteg alól leeresztett fermentlevet újabb erjesztendő lével töltik fel. Ezt a cserét az élesztőréteg roncsolása nélkül többször végre lehet hajtani. A pezsgőgyártás ugyancsak egy második fermentációs lépéssel a viszonylag gyengébb minőségű borból piacképes terméket állít elô. Literenklént 25 g szacharóz adagolása után a cukrozott bort jól ülepedő tiszta élesztő tenyészettel oltják, majd ledugaszolva 9-12 oC -os helységben — többszöri felrázással elősegítve a folyamatot — néhány hónapig érlelik. Ezután hosszabb-rövidebb ideig mozdulatlanul hagyják, esetleg óvatos mozgatással elősegítve az élesztő kiülepedését (az üvegnyakban való összetömörödését), végül az üveg nyakát – 25°C hűtött jeges sóoldatba mártják. A képződő jégdugó tartalmazza az élesztőt. A dugó kicserélésével az összegyűlt élesztő hűtött körülmények között könnyen eltávolítható. Az 1882-ben alapított Törley pezsgőgyár tradicionális terméke [Törley Chardonna Brut] az etyeki magas savtartalmú chardonnay-ból (Törley József etyeki ültetvénye) nyert alapborból készül, a kiválasztott cuvée-t tirázs-likőrrel édesítik, majd pezsgőerjesztő élesztőt adnak hozzá. Több éven keresztül 12-14 °C-on érlelik. Az ízanyagok kialakulása után a palackban levő üledéket a peszgőmesterek szakavatott mozdulattal a dugóra rázzák. Sóoldatba merített nyakba képződő jégdugó magába foglalja a seprőt, amit degorzsálásnak nevezett lépésben eltávolítanak. Néhány csepp expedicós likörrel beállítják az ideális 12g/literes cukortartalmat és dugóval zárják. Az igy nyert pezsgő illata és aromája 4-6 °C hőmérsékletre hűtve teljesedik ki igazán. {Törley József a harmincas években évente 2 millió palackot forgalmazott. A pezsgőgyár forgalma 1995-ben 15 millió palckot tett ki.} — Nagyipari méretben a termék cukorszintjének beállítása után a második erjesztési lépés speciális erjesztő tartályokban történik, majd zárt rendszerben széndioxid-atmoszférában végzik a szűrés, palackozás és lezárás műveletét. — A Balatonboglári Spumante Muskotály édes pezsgő egy folyamatban, mustból készül az észak-olaszországi Astiban kifejlesztett technológia szerint. Ugyancsak borból készülnek a különböző borpárlatok (Brandy félék). A világ termelésének közel felét Kelet-Európa állítja elő. A desztillációhoz szükséges hőkezelés gazdagítja a borpárlat aroma tartalmát. Olyan új vegyületek mutathatók ki az íz-anyagok között, amelyek az eredeti borban nem fordultak elő. Az élvezeti cikk szerepét betöltő italok aroma anyagainak egy része a szőlő préslevében is fellelhető, de jelentős mértékben gazdagodik az íz-anyagok változatossága az élesztő enzimeinek hatására. Rapp és munkatársainak 1973-ban közölt adatai (Chem. Ztg. 97:29-36) az analitikai eljárások által kimutatható aroma anyagok gazdag választékát tárja az olvasó elé.
SÖRGYÁRTÁS Gabonafélékből, árpából előállított alkoholos ital készítése az ember ősi tevékenysége, a történelemelőtti idők homályába vész. Hatezer-éves leletek bizonyítják a ma is használt technológia gyakorlati alkalmazását. Ezt igazolják babiloni és sumer írásos emlékek. Csíráztatott árpából készített lisztből kenyérféle tésztát gyúrtak, gyengén megsütötték, apródarabokra törve vízben áztatták, majd erjedni hagyták, amíg egy savanyú, alkoholt tartalmazó italt nyertek. Középkori írásos emlékek a bajor sörfőzdék technológiájáról tartalmaznak adatokat. Az árpacsírából készült őrleményből erjesztették az italt, amit növényekkel, fűszerekkel ízesítettek. A technológia Bajorországból a 17. században kezdett terjedni. 1842-ben Csehországban alapítottak sörgyárat. Néhány évvel később Dániában, Észak-Németországban, Skóciában épültek üzemek. A század második felében a tengerentúlon is meghonosodik a sörfogyasztás, de Európa még tartja vezető szerepét a fogyasztásban és a gyártásban.
207
A nagyüzemi termelés biztonságának fokozása a mikrobiológiai kutatásokat indokolttá tette. A várható haszon reményében a sörgyárak anyagilag is támogatták az alapkutató munkát, amitől a sör ”betegségeinek” elkerülését remélték. Berzelius az élesztősejteket komplex katalizátorok hordozóinak tekinti. Pasteur az élő sejt szerepét tisztázza Liebig kémiai elméletével szemben. Eduard Büchner olyan sejtmentes kivonatot készít az élesztőből, amely képes a glükózt alkohollá erjeszteni, majd a zymáz felfedezésével az enzimelmélet alapjait rakta le. Pasteur 1876-ban könyvet írt a sörgyártásról ”bacilles des bieres tournées”, amelyben a sör betegségeiről, a sörgyártás bacillusairól ír. A század végén 1892-ben van Laer Saccharobacillus pastorianus-ként írja le ezeket a sörgyártást veszélyeztető, jelentős gazdasági kárt okozó heterofermentáló rövid pálcikákat, amelyeket Beijerinck 1930-ban Lactobacillus-ként helyez el a baktériumok rendszerében. A söriparban a mikrobiológiai kutatások eredményeként hamarosan igyekeztek tiszta élesztő kultúrák használatával hatékonyabbá tenni a gyártást. Sörgyári mintából Clausen N.H. izolált egy élesztőt, amit Brettanomyces néven vezetett be a szakirodalomba, utalva a brit sörgyártásban betöltött szerepére. A sörélesztő tápigényének felderítése vezetett el a biosz anyagok, a vitaminok jelentőségének felismerésére. Kruis és Stava 1918-ban fedezi fel az élesztő ivaros ciklusát. Winge 1935-ben írja le az élesztő fejlődési ciklusait. A haploid endospórás és a diploid vegetatív fázis felismerése az élesztő-genetika fejlődését indította el. A század közepén. Gertrud Lindegren alapvető biológiai munkáival indul el az élesztő-genetika fejlődése. A géntechnológiai módszerek gyakorlatba vétele századunk utolsó negyedében a modern genetikai kutatómunka kísérleti alanyává, az eukariota genetika típusélőlényévé emelte a sörélesztőt. Első feladat a főleg sörárpából készülő (Hordeum distichum, H.hexastichum) maláta előállítása. A kiválogatott ép gabonaszemeket 2-3 napig 12-15 fokos vízben áztatják. Az áztató levet naponta legalább kétszer cserélik az esetleg elszaporodó mikróbatömeg eltávolítása céljából. Ezek ugyanis nem csak nem kívánt ízanyagok forrásai lehetnek, de nagyobb kárt okoznak a vízben oldott oxigén elhasználásával, amire a csírázó árpának nagy szűksége van. A csírázó embrió enzimkészlete fellazítja az endospermium falát, így a zöldmalátának nevezett árpaszem könnyen morzsolhatóvá válik. Hét-nyolc nap múlva a csíráztatást szárítással (50 oC alatt) leállítják. A nedvességtartalmat 5%-ra csökkentik. Ha sötét malátát akarnak akkor magasabb hőfokra melegítik. A Berlin környékén elterjedt Weissbier árpa helyett csírázott búzából készül. A Brüsszel környékén ismert Lambic bier 40% búza és 60% csírázó árpa őrleményéből készül.
A száraz malátát felhasználásig úgynevezett malátasilóban tárolják. A technológia következő szakasza a száraz maláta őrlésével kezdődik. Járulékos anyagként nem malátásított gabonafélét, kukoricaőrleményt, esetleg cukorszirupot adnak a malátához. A segédanyag a maláta magas nitrogén tartalmát hígítja az optimális N:C aránynak megfelelő szintre. A sörgyártás fontos alapanyagát képezi a felhasznált víz, amelyet általában a sörgyárak saját kútrendszerükből nyernek. Az egyes sörfélék vízminősége, kémiai összetétele lényeges eltérést mutat. A felhasznált víz Pilseni Dortmundi Müncheni
Keménységi foka 25 745 280
és
Karbonát tartalma 15 mg/L 450 mg/L 275 mg/L
A friss őrleményt vízzel elkeverve péppé gyúrják, majd rézedényben a vizes szuszpenzió hőmérsékletét lassan emelik 50 oC-ra. Ez a maláta proteázok hő-optimuma. A keményítőt tartalmazó segédanyagok bontása céljából a reakcióelegy hőmérsékletét 65 fokra, a maláta amiláz optimális hőmérsékletére emelik. A cukrosodás
208
befejeztével (3-4 óra) a hőmérsékletet 75 fokra emelve leállítják az enzimes folyamatot és a fermentlé takarmányként hasznosítható alakos elemeit szűréssel könnyen elkülönítik.
Oltás előtt álló sterilezett édes-cefre összetétele 1 kg malátakivonatra számított adat Maltóz Maltotrióz Glükóz Szacharóz Fruktóz Nemfermentálható Szénhidrát Aminosavak Peptidek Nukleotidok Polifenolok komló maradék Biotin
430-460 g 100-130 g 40-80 g 20-30 g 10-20 g 150-220 g 10-15 g 10-30 g 5-2 g 1-2 g 1g 5-10 µg
200-600 µg 100-500 µg 200-500 µg 1,5-2,5 mg 200-500 µg 50-150 µg 20-30 µg 160-800 mg 1-2 g 50-400 mg 150-600 mg 1,5-3 g 5-10 g
A szűrletet nevezik édes sörcefrének, amit valamikor vörösrézből készült sörfőző üstben, ma saválló tartályban gyűjtenek majd komlóval együtt sterilezik. A cefre cukortartalma 12%, ami a sterilezés hőfokán némileg karamellizálódik, bekövetkezik a lupulon és a humulon izomerizációja. A hőkezelés általában egy órát vesz igénybe. Barna sör készítésekor nem a főzés idejét nyújtják, hanem külön karamellizált cukoroldatot adagolnak. A növényi maradékot és a főzés hatására kicsapódó anyagot szűréssel eltávolítják. A sörkészítés fontos fűszernövénye a komló (Humulus lupulus). A növény mindössze egy százalékát kitevő esszenciális olaj frakciója a sör aromáját adóértékes terpéneket (1:β-myrcen, 2:β farnesen, 3: humulen, 4: β-caryophyllen) tartalmaz.
A komlóban előforduló gyantasavak okozzák a sör jellegzetes keserű ízét. Hexánban oldhatatlan, úgynevezett kemény gyanták csoportja az aroma alakításában nem vesz részt, csak a hexánban oldható úgynevezett lágy gyanták két csoportja tölt be fontos szerepet. Amint az ábrán jól látható a könnyen izomerizálódó vegyületek savanyú kémhatása az enolos hidroxil csoporttól származik. Az α-savak csoportját alkotják a humulon, cohumulon és az adhumulon származékok. A β-savak csoportjában a lupulon, colupulon és adlupulon származékok fordulnak elő. Ezek a természetes építőelemek tárolás közben változhatnak, különösen a β-savak érzékenyek, oxidálódhatnak. Az α-savak könnyen alakulnak hexánban oldhatatlan kemény gyantává. Ezért a komlót begyűjtés után gyorsan szárítják, összepréselve légmentesen hűtve tárolják. Egyes technológiák az egész növényt felhasználják, mások csak a növény kivonatát alkalmazzák. 209
A steril édes cefrét ezután 10-15 °C-ra hűtik és steril levegővel telítik (8-10 mg O2/L), majd jól kifejlődött élesztőtenyészettel oltják. Oltóanyagot egy-egy jól sikerült sörgyártási folyamat primer fermentációs lépéséből izolált tiszta tenyészetből készítik. A modern technológia fontos eleme az élesztő-oltóanyag. Az ipari üzemek nem hagyatkozhatnak a spontán kialakuló erjesztő populációra. A gyártási technológia két fő típusát különböztetjük meg attól függően, hogy melyik élesztővel végzik az erjesztést. A kádakban folyó fenékerjesztésű sörgyártásban az összecsapódó, kiülepedő Saccharomyces uvarum kerül felhasználásra. Ezen belül egyes városok nevéhez kapcsolódóan ízben, zamatban, színben, alkohol tartalomban különböző sörfélék telítik a piacot (Pilsen, Dortmund, München). A másik technológia, a felsőerjesztésű, egyedi sejteket tartalmazó Saccharomyces cerevisiae biokémiai aktivitását hasznosítja. Ez a törzs világos és barna sörfélék előállítására egyaránt alkalmas. Az oltóanyag több lépésben felszaporított virulens tenyészetet jelent. Két-három naponként 10-szeres térfogatba történő átoltással érik el a kívánt oltóanyag mennyiséget. Felsőerjesztési technológia alkalmazásakor a főfermentációt kis térfogatnyi oltóanyaggal is el lehet indítani, azonban az ilyenkor szükséges hosszabb fermentációs idő a készülék kihasználása szempontjából gazdaságtalanná teszi az üzemet. Az erjesztő kádak illetve fermentorok levegőztetése, ami a növekedéshez feltétlenül szükséges, nem csökkenti lényegesen az alkoholos erjedést. Az úgynevezett Crabtree effektus ugyanis nagyobb szénhidrát koncentráció esetében oxigén jelenlétében is az alkoholos erjedésnek kedvez. A fermentációs folyamat közben gondosan ügyelni kell a baktériumos fertőzés elkerülésére. A folyamatot rendszeresen ellenőrzik. A kivett mintát cikloheximidet tartalmazó táptalajra oltva napokig termosztátba helyezve vizsgálják. Ez az antibiotikum az élesztő növekedését gátolja, a baktériumok növekedésére viszont nem hat. A sterilitás vizsgálata céljából oltott szilárd táptalajra oltott anyagot részben 28 °C-on aerob körülmények között, más részüket széndioxid atmoszférában tartják egy héten keresztül. Ilyen módon a fakultatív anaerob fertőző csírákon kívül a szigorúan (obligát) anaerob fertőzés, például a Zymomonas faj is kimutathatóvá válik. Nehezen észlelhető a vad élesztőtörzsekkel való fertőződés. Ezeknek az elszaporodása az erjesztő képesség leromlásában jelentkezhet. A vad élesztők kimutatásához a legmodernebb rendszertani módszereket kell alkalmazni. Molekuláris biológiai és szerológiai eljárások használata indokolt. Modern genetikai módszerek alkalmazásával a meglevőnél előnyösebb törzseket állítottak elő a kutató laboratóriumok. A tradiciókhoz való merev ragaszkodás miatt azonban ezek a törzsek csak elvétve kerülnek ipari felhasználásra. A törzstenyészetet klasszikus módszer szerint 10%-os szacharóz oldatban, vagy szilárd táptalajon tartják fenn. A folyékony közegben fenntartott tenyészetet két évenként átoltják és közben ellenőrzik az életképességét. Szilárd táptalajra oltott tenyészetet paraffin olajjal fedve 4 oC-on, hűtve tárolják, félévenként ellenőrizve életképességét. Hosszabb időtartamra fagyasztva szárított formában őrzik a törzsanyagot.
Az élesztő oltás után erős növekedésbe kezd, a tenyészet felszínén vastag habréteg alakul ki erős széndioxid fejlődés mellett. Az élesztő a fermentáció közben gyakorlatilag feléli a tápanyagként jelenlevő 210
fehérje és szénhidrát jelentős részét. A közben képződő szén-dioxidot összegyűjtve, az eljárás befejező fázisában felhasználják. A primer fermentációs ciklus befejeződésekor a fermentáció hőmérsékletét 0 fokra csökkentik és a lé alakos elemeit szeparátorral eltávolítják. Az élesre szűrt “sör-lé” sterilre szűrése vagy pasztőrőzése teszi piacképessé, fogyaszthatóvá az élvezeti cikként forgalmazható terméket. Sok esetben az ászokpincében második fermentációs lépést folytatnak le saválló tartályban, széndioxid túlnyomás alatt. A sörgyártás utolsó fázisában az íz kialakítása folyik, mégpedig szűkség esetén cukor, tannin, illetve más íz-anyagok kerülhetnek felhasználásra. Sok esetben előnyös hatású különböző proteolitikus enzimek alkalmazása (papain, ficin, bromelain) a fehérjetermészetű szennyezés oldása szempontjából. Ezek az enzimek az alacsony hőmérséklet miatt meglehetősen lassan dolgoznak, a fogyasztóhoz nem kerülnek mert a pasztőrözés hőmérsékletén aktivitásukat elvesztik. Regionális íz-anyagokat az előállítás helyén elterjedt mikroflóra szolgáltatja. Ennek a felderítése ipari megoldást ugyan nem, de nagy számú tudományos közleményt eredményezett. Oltóanyaggal ugyanis nem lehet megoldani a környezet által kialakított mikroflóra különleges szerepét. Az alkoholos erjesztéshez felhasználható élesztősejteket az utóbbi évtizedekben gyakran rögzítik porózus üveghálózatba. Ilyen például a Schott Glaswerke által gyártott Siran
Pórusos üvegbe rögzitett élesztősejtek Ez az alkalmazás tette lehetővé az alkoholmentes sör előállítását. Ebben az esetben az élesztő nem szaporodik az erjesztő tartályban. Ezért az átalakítandó cefre minimális szénhidrátot tartalmaz. A rögzített sejteket tartalmazó reaktoron addig áramoltatják át az alapanyagot alacsony hőmérsékleten, amíg a megfelelő iz kialakul minimális (0,04-0,35 %) alkohol képződése mellett
Alkoholmentes sör előállítására szolgáló berendezés vázlata
211
SZESZGYÁRTÁS A finomszesz gyártás alapanyaga kezdetben a cukorgyártás melléktermékeként megjelenő melasz volt A piaci igényekhez alkalmazkodva, adott esetben a cukorkihozatal növelése a melasz mennyiségét csökkentette, ellenkező esetben növelte, ami a szeszgyártásban bizonytalanságot okozott. A szesz iránt növekedő kereslet hatására a keményítő gyárak mellé is szeszgyárak települtek. Először a keményítő és glükóz gyártás hulladékát hasznosították. Később az igényeknek megfelelően adott esetben a keményítő jelentős része alkoholként került a piacra. Az alkohol gyártás a mezőgazdasági termelésben jelentkező időjárás okozta hullámzásokat pufferként fel tudta felfogni. Az esetenként bekövetkező túltermelés nem vezetett az eladhatatlan termékek felszaporodására, azaz nem csökkentette a termelési kedvet. A szénhidrát tartalmú termékeket túltermelés esetén (burgonya, kukorica) alkohollá alakítva értékállóan lehetett tárolni. Az alkoholgyártás gazdaságosságát vizsgálva össze kell vetnünk a cukorgyártásban hasznosított mezőgazdasági termékek előállítási költségeit és a belőlük nyerhető hasznos termékek mennyiségét. Egy tonna 73% víztartalmú cukornád átlag 769 kg cukortartalmú nádszár mellett 231 kg levél és szárcsúcsi részt tartalmaz. A nádszárból felaprítás után 174 kg szárazanyagot tartalmazó vizes oldatot lehet kipréselni. A visszamaradt növényi maradék száraz súlya 97,4 kg, amelyből elégetve 3,3 kg hamu marad vissza. A víz-oldható frakcióban 122,5 kg fermentálható szénhidrát és 51,9 kg nem fermentálható anyag (19,5 kg nitrogén tartalmú vegyület, 5-6 kg lipid, 13 kg hamu) található. Egy tonna cukorrépából 515 kg szénhidrátot tartalmazó gyökér és 485 takarmányként hasznosítható répafej és levél különíthető el. A répa több mint 81% vizet tartalmaz. A lefejezett gyökérből 84,8 kg szárazanyag tartalmú víz-oldható anyag és 26,2 kg szárazmaradékot tartalmazó, takarmányként hasznosítható extrahált gyökér maradvány képződik. A víz-oldható anyag 66,4 kg fermentálható szénhidrátot és 18,4 kg nem fermentálható maradékot tartalmaz. Ha ezeket az adatokat az egy hektáron termelhető ipari növény mennyiségével összevetjük, akkor nyilvánvalóvá válik a cukornád termelésére alkalmas klimatikus viszonyokkal rendelkező államok gazdasági előnye. Ez az előny fokozódik, ha a két alapanyagból nyert melléktermék a nádmelasz és a répamelasz fermentálhatóságát összehasonlítjuk. A cukornád melasz nagyobb cukor, biotin és foszfor tartama előnyösen befolyásolja az alkohol termelést. Üzemanyagként való használatát az árviszonyok, a gazdasági meggondolások egyértelműen meghatározzák, A 70-es években bekövetkező olajár-robbanás a gazdasági szakértők figyelmét az etanolra fordította. Ez a környezetvédők igényeit kielégítő energiahordozó vegyipari alapanyagként petrokémiai termékek előállítására is használható. A mezőgazdasági termelésbe fogható területek limitált volta és az előállítási költségek azonban óvatosságra intenek. Nem véletlen, hogy csak azokban az államokban került gyakorlati megvalósításra ez a program, ahol a mezőgazdasági termelés túltermelési válsággal küzd, illetve jelentős mennyiségű nyersolajat importál. Braziliában a “proalcool” program keretében az 1976-ban 700 millió literes etanol termelést négy év alatt 4 milliárd literre emelték. Ez 450 ezer autó átállítását jelentette etanol üzemre. Az olajimport csökkentése miatt növelték az etanol termelést Dél-Afrikában is. Az USA “Gasohol” programja évi 400 millió liter etanol üzemanyagként való hasznosítását teszi lehetővé. Az etanol nagyipari előállításának energia igénye: cukornádból 18 MJ/kg etanol, kukoricából 19,4 MJ/kg etanol. Az etanol energia tartalma (26,6 MJ.kg-1) alacsonyabb a motorbenzinénél (43,8 MJ kg-1), oktánszáma viszont 90-100 között van. Tanulságos megismerni az 1 tonna alapanyagból előállítható etanol mennyiségét. Cukornád 70 liter Nyárfa 160 liter Répagyökér 95 liter Burgonya 100 liter Melasz 280 liter Kukorica 370 liter
Cukornád Cukorrépa Nyárfa Kukorica
Az 1 hektáron termelhető alapanyag és a belőle nyerhető alkohol mennyiségét Átlag Kiemelkedő Átlag Kiemelkedő 60 tonna 12,5 tonna 4200 liter 8750 liter 30 tonna 56 tonna 2850 liter 5320 liter 15 tonna 30 tonna 2700 liter 5400 liter 5 tonna 7 tonna 1850 liter 2590 liter
A teljesség kedvéért az alapanyag előállítás energia igényét is számításba kell venni Cukornád Brazilia 16 GJ/ha 4,0 MJ/kg etanol Cukorrépa Új-Zéland 16 GJ/ha 5,3 MJ/kg etanol Kukorica USA 21,8 GJ/ha 12,3 MJ/kg etanol A cukornádból nyert etanol 20%-kal a kukoricából nyert 50%-kal drágább, mint a cukoripari melléktermékből, a melaszból nyerhető etanol. A melasz mennyiségét viszont a cukorgyárak kapacitása egyértelműen meghatározza.
212
Az ipari szesztermelés jelentős hányada ma a gabonafélék szénhidrát tartalmának a hasznosításával készül. A keményítő savas hidrolízise ugyan könnyen kivitelezhető, azonban toxikus melléktermékek (levulinsav, 5-hidroxmetilfurfurol, hangyasav) képződnek. A sav koncentráció optimálásával és a hőmérséklet megválasztásával javítani lehet a helyzeten, mégis az utóbbi időben az enzimes bontást alkalmazzák világszerte. α−AMILÁZ (α-1,4-glukan-4-glukano hidroláz) random bontja a keményítő α-1,4 kötéseit. A mikroorganizmusokban előforduló 60 kd méretű enzim nem bontja az α−1,6 kötést, de az α−1,6 kötés szomszédságában levő α−1,4 kötést sem. Ezért a reakció termékben jelentős mennyiségben fordulnak elő oligomerek. Az Aspergillus oryzae által termelt enzim például keményítőből 4 % glükózt, 56 % maltózt, 28 % maltotriózt és egyéb oligoszacharidot tartalmazó maltóz szirupot készít: β−AMILÁZ (α-1,4-glukán maltohidroláz) a Bacillus genusban előforduló enzim a keményítő redukáló végén kezdve maltóz egységeket hasít le. Nem bontja az 1,6 kötéseket. GLUKOAMILÁZ. Széles spektrumú, a poliszacharid nem redukáló végétől indulva az 1,3, 1,4, és 1,6 kötéseket bontja. Főleg gombákban Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Rhizopus fajokban fordul elő. Keményítőből 97 % glükózt, 1,5 % maltozt és valamennyi egyéb oligoszacharidot tartalmazó elegyet készít. Az α−amiláz jelenléte gyorsítja a reakciót, fokozza az eljárás teljesítményét. A fenti enzimek keveréke jó hatásfokkal, de az egyes növényfajokból származó keményítőt eltérő sebességgel glükózig bontja. A gabona keményítő például könnyebben bontható mint a burgonya keményítő. Sok helyen a kukorica teljes feldolgozására törekedve az egyes termékek, például csíraolaj, áztató-lé, keményítő, glükóz-szörp, izomeróz stb. árában jelentkező gazdasági haszon javítja az alkohol termelői árának alakulását ECETSAVGYÁRTÁS Az ipari gyakorlatot követve célszerű itt tárgyalni az alkoholból történő ecetgyártást.annak ellenére hogy ez szigorúan aerob folyamat. Gazdasági szempontból az erjesztéssel nyert alkohol, így közvetlenül alakítható esetsavvá. A XVIII század végén jelentek meg az első ecetgyárak. Hazánkban Pozsonyban 1787-ben létesítették az első üzemet a szesz gyár mellett. 1843-ban a honi iparvédegylet iparműkiállítására beküldött ecet minőségét elismerő okiratot Batthyány és Kossuth aláírása fémjelezte. A Leipziger-féle ecetgyár 1898-ben kezdte meg működését az 1867-ben alapított Óbudai Szeszégető és Finomító Rt. Telephelyén. Az 1990-ben a még működő 5 ecetgyár 3100000 hL szeszecetet 2000 hL borecetet 14000 hL almaecetet készített A szeszgyárban 180000 hL finom szesz, 60000 hL abszolút alkohol és 10000 hL denaturált szesz készült évente. A szesztermelés mellett 21000 tonna friss élesztő kerül a piacra. A fennmaradó élesztő takarmányként haszmnosul Az ecetkészítés és annak a táplálkozásban való hasznosítása a történelem előtti időkből származó ismeret gyakorlati hasznosítása. A bor ecetesedésének - a környezetünkben megtalálható ecetsav baktériumok tevékenységének következményeként - naponta tanui lehetünk. Élelmezési célra évente 2-3 millió m3 ecet készül, ami 150-200 ezer tonna ecetsavat jelent. Ez a mennyiség az aerob biotechnológiai eljárással gyártott primer metabolit termelésben az első helyre emeli. Vegyipari alapanyagként jelentős mennyiségű ecetsavat állít elő a petrokémia, mégis élelmiszeripari célra csak az ecetsav baktériumokban jelenlevő enzimek katalitikus hatására alkoholból képződő, tehát biológiai úton nyert, ecetet használják. Az átalakítás gyakorlatilag melléktermék képződése nélkül megy végbe. Az ecetsavtermelésre használt baktériumok a képződő ecetsavat - az adott technológiai körülmények között - sem energiaforrásként, sem szénforrásként nem hasznosítják. Ebből következik, hogy igen jó kihozatallal, 95-98 %os hatásfokkal valósítható meg az alkohol oxidációja. Veszteséget csak az átáramló levegővel eltávozó szubsztrátum és az ugyancsak illékony termék távozása okoz. HO-CH2-CH3 + O2
HOOC-CH3 + H2O
∆ Go = − 455 kJ / mol
A reakció lefolyásával járó nagy szabadenergia változás a folyamatot gyakorlatilag megfordíthatatlanná teszi. Az ecetsav termelésre alkalmas mikroorganizmusok évezredek alatt az emberi tevékenységgel szoros kapcsolatban választódtak ki. Valójában szélsőséges viszonyokhoz alkalmazkodva specializálódtak. Évezredek alatt néhány olyan fajuk választódott ki, amelyek elvesztve a különleges körülmények között fölösleges enzimeiket éppen az ember közelében találják meg életterüket. Az alkoholosan erjesztő élesztők mellett az alkoholból ecetsavat termelő baktériumok az ember korai háziasított élőlényeinek tekinthetők Az átalakításra használt mikrobákat gyűjtőnéven ecetsav baktériumoknak nevezzük, bár rendszertanilag elkülöníthető fajok illetve nemzetségek egyedei alkalmasak ennek a folyamatnak a katalizálására. A múlt század végén Beijerinck az Acetobacter nemzetségbe sorolta őket. Ellipszoid, illetve rövid pálca formájú alak mellett előfordulnak egyenes vagy enyhén hajlott formában is (0,5-0,8 µ vastagok és 1-4 µ hosszúak) . Előfordulhatnak egyedül, párosan vagy láncba rendeződve. Mozgó alakjaik peritrich vagy poláros ostorral rendelkeznek. Obligát aerob fajaik jellegzetes tevékenysége a cellulóz mikrofibrillum képzés. A bor felületén bevonatot képeznek. 213
Rendszertani vizsgálatuk mind a mai napig folyik és tökéletesedik. Ezt a munkát nehezíti a nemzetségre jellemző rendkívül nagy változékonyság. Luis Pasteur (1864) Mycoderma aceti néven szerepelteti a "Mémoire sur la fermentation acétique" című alapvető munkájában (Ann. Sci. Ec. norm. sup. 1:113-158). Ma Acetobacter aceti néven 7 törzset sorol ide a rendszertan. Később Pasteur egyik tanítványa Hansen 1879-ben mesterét tisztelve Mycoderma pasteurianus néven irta le az előbbitől némileg különböző baktériumot, amelynek jellegzetessége volt, hogy az előbbivel szemben glicerinből nem képezett acetont. Az idesorolt törzseket ma Acetobacter pasteurianus néven tárgyalja a szakirodalom. Amikor a baktériumokat biokémiai tulajdonságaik alapján igyekeztek rendszerezni - Asai és munkatársai 1934-ben - az Acetobacter nemzetségből elkülönítették a Gluconobacter genus-t, amelynek tagjai csak glükózból képeznek ecetsavat, alkoholból nem (J. Agr. Chem. Soc. Jap. 10:621-29, 932-41). Frateur 1950ben az Acetobacter fajokat oxidálóképességük alapján négy csoportra; A. peroxidans, A. oxidans, A. mesoxidans, A. suboxidans osztva tárgyalta (Cellule 53: 287-92). Leifson 1954-ben elkülönítette a peritrich ostorral mozgó ecetsavat továbboxidálni képes Acetobacter törzseket a poláros ostorral rendelkező Acetomonas törzsektől, amelyek nem képesek az ecetsav továbboxidálására (Antonie van Leeuwenhoek 20:102-10). Az 1984-ben kiadott Bergey's Manual of Systematic Bacteriology a Gram-negatív aerob pálcák és kokkuszok közé VI. családként (ACETOBACTERACEAE) két nemzetségbe Acetobacter és Gluconobacter nemzetségekbe sorolva tárgyalja őket. Az iparilag alkalmazott törzs olyan ecetsav baktérium, amely 13,5 % ecetsavat tartalmazó tápközegben még életben marad, az alkoholt gyakorlatilag teljes mértékben ecetsavvá alakítja és az ecetsavat tovább nem oxidálja, ugyanakkor a glükózt vagy más hexózt széndioxidra és vízre bontja. Ez a nagy ecetsavképző aktivitást mutató törzs fágrezisztens. E tulajdonság megőrzése a technológia körülményei között alapvető jelentőségű. A törzsek liofilezett formában, illetve cseppfolyós nitrogénben jól tárolhatók. Az ecetsavképződés biológiai alapjai Lavoisier 1793-ban bizonyította, hogy az alkohol ecetsavvá oxidálásához oxigénre van szükség. Person 1822-ben az ecetesedő alkohol tartalmú oldat felületén kialakuló hártyában található baktériumot Mycoderma aceti néven írta le. Liebig 1851-be feltételezte, hogy az etanol ecetsavvá alakulásánál köztes anyaga az acetaldehid. Pasteur, aki 1962-ben kezdte vizsgálni az általa ecetvirágnak nevezett felületi hártya tulajdonságait, feltételezte egy dehiodrogenáz működését (Compt. Rend. 54: 265, 55:28). Brown 1886-ban Bacterium xylinum nevet adta az ecetsavképző mikroorganizmusnak (J. Chem. Soc. 49:172). Neuberg csak 1919-ben azonosította a reakcióelegyből az acetaldehidet (Biochem Z. 96: 158-74). Végül Nakayama 1959-60-ban izolálta az átalakítást katalizáló enzimeket (J. Biochem 46:1217-25, 48:812-30, 49:158-63, 49:240-51) E1 enzim néven az alkohol-citokróm553 reduktázt E2 enzimnek nevezve a koenzim nélkül működő aldehid dehidrogenázt és az E3 enzimet a NADP+ függő aldehid-dehidrogenázt CH3 − CH2 − OH
1
/2O2
-------- E1 enzim >>>>>>>>e−>>>>>> Citokróm oxidáz : CH3 − CHO e− H 2O + NADP : E3 enzim ---------------- -------- E2 enzim NADPH CH3 − COOH Ecetsavképződés alkoholból a baktériumban Az etanol dehidrogénezését végző E1 enzim hemfehérje. UV spektruma a citokrómhoz hasonlít, az abszorpciós maximuma 553 nm-nél van és 3,5 pH-n működik optimálisan. Etanol jelenlétében ez az enzim nem redukálja a NAD+ illetve NADP+ koenzimeket. Kálium ferricianidot használva elektron akceptorként különböző lánchosszúságú telített és telítetlen alkoholok dehidrogénezését végzi. Az acetaldehid dehidrogénezését két enzim végzi az ecetsavbaktériumokban. A kofaktor nélkül működő E2 enzim az acetaldehidről leválasztott elektront az E1 hemfehérje vasatomjának adja át. Az így redukálódó hemproteint azután a citokróm-oxidáz regenerálja. Nem zárható ki az acetaldehid diszproporcionálódása Az E3 enzim fontos szabályozó szerepet tölt be a NADP redukálásával. A NADPH felesleg ugyanis gátolja a trikarbonsav ciklus működését és ezzel megakadályozza az ecetsav oxidációját- Az enzim működését pklórmerkuri benzoát és hidroxilamin gátolja. Az ecetsavbaktériumok csak a hexózok hasznosítására képesek. Megtalálhatók bennük a glikolízis (EMP), a pentóz-foszfát út (HMP) és az úgynevezett Entner-Doudoroff lebontási út enzimei. Ez azonban nem
214
jelenti azt, hogy mindezek az enzimek teljes aktivitással működnek. Kitos és munkatársai szerint az Acetobacter suboxidans-ban a glükózlebontás főleg a HMP úton folyik, de jelentős a ketoglükonsav út aktivitása is. Ez a direktoxidáció 2,5-diketo-glükonáton keresztül egy transzfoszforiláz segítségével kapcsolódik a HMP ciklushoz. Az egyes lebontási folyamatok egymáshoz viszonyított aránya az oldott oxigéntartalommal, azaz a gázfázis parciális oxigén-nyomásával szoros összefüggést mutat. Tiszta oxigénben a glükóz 63 %-a a HMP úton, 28 %-a a ketoglükosav úton oxidálódott. A szén-dioxid fő tömege normál körülmények között is a HMP úton képződik. Ha a reakcióelegyen átáramló gáz oxigéntartalma 4 % alá csökken, akkor a szénhidrátanyagcsere leáll. Egyébként a szén-dioxid jelenléte nélkülözhetetlen az ecetsavbaktériumok életműködéséhez. Razumovszkaya és Belausova 1952-ben észlelték, hogy az Acetobacter schützenbachii növekedése leáll ha az átáramló levegőből eltávolítják a szén-dioxidot (Mikrobiology 21:403-07). Hromatka és Gsur (1962) Acetobacter suboxidans esetében 14CO2-vel igazolta a szén-dioxid beépülését (Enzymologia 25:81-86). Izotóppal jelzett ecetsavval végzett kísérletek igazolják, hogy az A. suboxidans nem hasznosítja az ecetsavat, de aktív glükóz anyagcsere esetén, valamennyi megtalálható a C14 aktivitásból a sejtburok lipid alkotórészeként. Ezért az ecetsav baktérium életben tartása céljából a folyamat elindításakor némi szénhidrátot kell adni a tápközeghez. Az Acatobacter peroxidans képes oxidálni az ecetsavat, hasznosítani a tejsavat a működőképes trikarbonsav ciklus és a glioxilsav ciklus segítségével. Nitrogénforrás tekintetében az ecetsav baktériumok általában igénytelenek, jól hasznosítják az ammóniát. Laboratóriumi kísérleti körülmények között - homogén tiszta tenyészetet használva - több szerző ismertette vitamin igényüket (p-amino-benzoesav, tiamin, pantoténsav), több esetben észlelték egyes aminosavak és purin-bázisok jelenlétének előnyös hatását. Ipari körülmények között ilyen igényt nem észleltek, mivel a természetes szubsztrátum, valamint a keverék tenyészet elfedi ezt az igényt. Különösen érzékeny a tenyészet az oxigénellátottságra. Az érzékenység fokozódik a tápközeg alkohol és ecetsav tartalmának növelésekor. Az oxigén parciális nyomásának gyors növelése általában károsítja a mikroszervezetet, de az alkohol elfogyása is okozhatja a baktérium pusztulását. Két százalék alkohol és két százalék ecetsav jelenlétében 2-3 perc levegő kimaradás csak 30-40 %-os pusztulást okoz. Ennél hosszabb kimaradás viszont elpusztítja a tenyészetet, 3 % ecetsav és 4 % alkohol jelenlétében már egy perces levegőhiány is a tenyészet pusztulását okozza. Mori és Terui vizsgálatai szerint (J. Ferment. Technol. 50: 70-78, 510-17) az eljárás az elméleti értékhez közeli oxigénmennyiséget igényel. Más mikroorganizmussal mért értékekkel összevetve a sejtek saját légzésre fordított oxigénigénye meglehetősen csekély. 1 g baktérium 3-6 liter oxigént fogyaszt óránként. A tenyészeten átvezetett levegő 30-40 %-át képes hasznosítani. Az átvezetett levegő mennyisége nem növelhető minden határ nélkül, mert a távozó levegő jelentős mennyiségű etanolt és ecetsavat vihet magával. Az ecetsavgyártás technológiája A gazdaságos ecetsavgyártás szempontjából a folyamatos, műszaki zavarok nélküli üzemeltetés alapvető jelentőségű, mivel a fermentlé összetételében bekövetkező hirtelen változásokra érzékeny a sejt. A magas ecetsavtartalmú és alacsony etanol tartalmú közeg átcserélése kevés ecetsavat és sok alkoholt tartalmazó reakció elegyre a sejtek közel 90 %-ának pusztulását okozhatja. ezért minden esetben alacsonyabb alkohol koncentrációval indítják az eljárást és menetközben adagolják az átalakítandó szubsztrátumot. Az eljárás eredményességét és gazdaságosságát ronthatja az ecetsav oxidációra alkalmas idegen baktérium megjelenése, illetve túloxidációra hajlamos mutáns elszaporodása. Általában átalakítható szubsztrátum jelenlétében nem következik be túloxidáció. Az ecetsavgyártás alapanyaga az élesztővel erjesztett fermentlé szűrlete vagy annak desztillálással dúsított koncentrátuma. Az erjesztett fermentlé mint kiindulási anyag általában tartalmaz annyi hasznosítható szerves anyagot, amely a baktérium szaporodásához szükséges szén-, nitrogén- és vitaminforrás igényt kielégíti. Desztillációval nyert termékhez viszont.az igénynek megfelelően 100-400 g ammónium-foszfátot adnak az oxidálandó elegyhez m3-ként. Sok esetben előnyös m3-ként 200 g élesztőkivonat adagolása. Borecet készítésekor az ammónium-só hozzáadása feltétlenül szükséges, mert a szőlőlé nitrogéntartalma alacsony. Ecetsav előállítása hagyományos csepegtető eljárással Nemcsak ipartörténeti érdekessége miatt foglalkozunk a régi csepegtető ecetsavgyártó technológia ismertetésével, de azért is mert a világ ecetsavtermelésének közel egyharmada az úgynevezett Frings generátorokban készül. Sőt néhány ilyen üzem még századunk második felében is üzembe helyeztetett. A történelemelőtti idők óta az ecetesedő bort feneketlen hordóba gyömöszölt faforgácson öntögették át mindaddig amíg az elérte a kellő savanyúságot. A levegővel érintkező bükkfaforgácson, nyírfa ágacskákon megtapadó ecetsav baktériumok az átcsepegő erjesztett gyümölcslé alkoholtartalmát ecetsavvá oxidálták, miközben a lé megőrizte a gyümölcsből származó aroma tartalmának jelentős hányadát
215
A Frings generátorok 20-60 m3 hasznos térfogató henger alakú fatartályok, amelyekben nyírfavesszőt, bükkfaforgácsot helyeznek el. A tartály alsó részén gyűlik össze a faforgácson átszivárgó reakcióelegy. A faforgácsra tapadva találjuk az ecetsav baktériumokat. Ma divatos kifejezéssel az egész tartályt rögzített sejteket tartalmazó bioreaktornak nevezhetjük. A laza hálózatot alkotó faforgácstömegen alulról felfelé levegőt fúvatnak. A tartály alsó részén található gyűjtő edényből az alkoholos-ecet elegyét egy vízszivattyú az alkoholoxidáció közben szabaddá váló hőenergia elvezetését szolgáló hűtőrendszeren át a tartály tetején elhelyezett túlfolyóval ellátott gyűjtőtartályba továbbítja. A hűtés mértékét a reaktorban elhelyezett hőmérők adatai által vezérelt automata rendszer szabályozza, mégpedig a hőcserélőkbe juttatott hűtővíz mennyiségének a változtatásával. A gyűjtőtartályból egy folyamatosan működő permetező rendszer juttatja az egyre savanyodó reakcióelegyet a forgácstömeg tetejére. Az eljárás gyenge pontja az egyenletes eloszlás biztosítása. Gyakran előfordul, hogy a reaktor egyikmásik részén az alkohol koncentráció átmenetileg az optimális érték alá csökken. Egy-egy oxidációs periódus a forgács minőségétől, a levegőellátottságtól és a generátor méretétől függően 4-10 napig tart. A végtermék általában 11 % ecetsavat és 0,3 % alkoholt tartalmaz. Ennek egy részét használják az újabb folyamat indításához 4 % alkoholt és 8 % ecetsavat tartalmazó kiindulási elegy készítéséhez. Újrainduláskor az első szakaszban az elpusztult baktériumok pótlása miatt az oxidációs teljesítmény csökken, majd beáll az üzemi teljesítmény, amely 5 liter ecetsav termelését jelenti m3-ként. A nyers ecetet néhány hónapig érlelik az íz anyagok és a különleges aroma kialakulása céljából. Kellő ideig tartó érlelés után a nyers ecetet bentonit jelenlétében perlitből, vagy diatomea földből kialakított szűrőágyon élesre, majd membrán szűrőn baktérium mentesre szűrik. A termék ecetsavtartalmának a növelése egyszerű és kíméletes módon a víz kifagyasztásával oldható meg. Desztillálással az aroma anyagokat elvesztenénk. A kevés ecetsavat tartalmazó vizet fel lehet használni az alkoholt tartalmazó fermentlé higítására az acetátor újraindításakor. Ecetsavgyártás Frings acetátorban Az ecetsavgyártás technológiai fejlődését századunk második felében a keverővel ellátott saválló rektorokban folyó alkoholoxidáció jelentette. Ez a félfolyamatos technológia 12 % ecetsavat tartalmazó végterméket szolgáltat. Egy-egy ciklus literenként 75 g ecetsavat és 5,5 térfogat % alkoholt tartalmaz. Az eljárás az Enkel és Maurer által szabadalmaztatott és Heinrich Frings üzemében kifejlesztett úgynevezett Frings acetátort használja világszerte. Az eszköz lényege a hűtőköpennyel ellátott saválló tartályban elhelyezett 6 lapátos turbina test, amely percenként 1500 fordulattal működtetve a lapátok mögött elhelyezkedő nyílásokon keresztül igen finom eloszlásban juttatja a levegőt a reakcióelegybe. A levegő beszívását az üreges keverőtengelyen keresztül a turbina lapátok mögött kialakuló kavitációs hatás teszi lehetővé. A levegőbuborékok finom elosztásában fontos szerepe van a turbina állórészében elhelyezett terelőlapoknak. A keverő és a reaktor méretét úgy kell megválasztani, hogy a reakcióelegy teljes térfogatában azonos legyen a levegőellátottság 1 mm átmérőjű buborékok mellett. Az intenzív levegőztetés természetesen habképződéssel jár, amit az étkezési célra felhasználandó végtermékre tekintettel nem szabad habgátló anyagok alkalmazásával csökkenteni. Az elmenő gázelegyből a habot egy erre a célra kifejlesztett Ebner által szabadalmaztatott mechanikus habtörővel visszajuttatják a rekció-elegybe. A percenként 1500 fordulattal működő rendszerben a folyadék a centrifugális erő hatására a centrifuga külső álló részébe kerülve visszajut a reaktorba. A habmentesített gázelegy pedig a rotor tengelye mellett távozik a rendszerből. Az acetátor hőmérsékletét megfelelő hűtőrendszer tartja a generációs idő beállása szempontjából optimális értéken. Fontos tartozéka a készüléknek az Ebner és Enenkel által szabadalmaztatott alkográf, amely folyamatosan méri az analizátoron átfolyó reakcióelegy alkohol tartalmát. Az itt nyert adat vezérli a feltöltő és leszívó berendezést.
216
Egy-egy ciklus hossza 36 óra. 1 m3 fermentor térfogat napi termelése 40-50 kg ecetsav. 1 liter alkohol átalakítása ecetsavvá 1260 kJ energiát igényel. Az eddig épített legnagyobb méretű acetátorok naponta 12001800 liter alkohol oxidálására képesek. A világgazdaság ecetsav igényének közel felét ilyen készülékekben termelik. Jégecet előállítása vegyipari felhasználásra. A mindenkori nyersolajár függvényében a biotechnikai úton előállítható ecetsav vegyipari felhasználására is lehetőség adódik a kémiai szintézissel előállított jégecet kiváltására. Az olajárrobbanás időszakában 1962-ben napi 2 tonna jégecetet termelő melaszt hasznosító üzemet építettek először Törökországban. A gyártási folyamat a melasz alkoholos erjesztésével kezdődik. A desztillálással kinyert alkohol oxidációja Frings acetátorban folyik. A képződött ecetsavat a fermentléből etilacetáttal extrahálják, majd az extraktumból desztillálással vízmentes ecetsavat nyernek.
Ecetsavtermelésre vonatkozó szabadalmi bejelentések: Ebner H. (1966) U.S. Pat. 3262252 (1969) U.S.Pat. 3445245. Ebner H., Enenkel A. (1978) U.S.Pat. 4076844. Frings H.(1974) Ger.Pat. 1517898 Austrian.Pat. 6274/80/. A XVIII század végén jelentek meg az első ecetgyárak. Hazánkban Pozsonyban1787-ben létesítették az első üzemet a szesz gyár mellett. 1843-ban a honi iparvédegylet iparműkiállítására beküldött ecet minőségét elismerő okiratot Batthyány és Kossuth aláírása fémjelezte. A Leipziger-féle ecetgyár 1898-ben kezdte meg működését az 1867-ben alapított Óbudai Szeszégető és Finomító Rt. telephelyén 1990-ben a még működő 5 ecetgyár 3100 e hL szeszecetet 2000 hL borecetet 14000 hL almaecetezt készített A szeszgyárban 180000 hL finom szesz, 60000 hL abszolút alkohol és 10000 hL denaturált szesz készül A szesztermelés mellett 21000 tonna friss élesztő kerül a piacra. A fennmaradó élesztő takarmányként haszmnosul
217
CIANOCOBALAMIN (B12 vitamin) és a RIBOFLAVIN (B2 vitamin) előállítása mikrobiológiai eljárással. Századunk első harmadában még rettegett gyógyíthatatlan betegség volt a vészes vérszegénység. A betegséget Addison írta le a XIX. században, Biermertől származik az elnevezés “anaemia perniciosa”, melyről még a XX. század első évtizedében is arról folyt a vita, hogy vajon fertőző betegség, vagy valamilyen toxikus eredetű kórral küszködik az orvostudomány. Georg H. Whipple kaliforniai professzor elvéreztetett kutyákon a vészes vérszegénységhez hasonló tüneteket észlelt, amit máj etetésével sikerült kedvezően befolyásolnia. Minot és Murphy 1926-ban megállapította, hogy máj etetéssel a vészes vérszegénységben szenvedőkön segíteni lehet ( J. Amer. Med. Assoc. 86:470.1926). Az általuk javasolt terápia — nagy mennyiségű máj elfogyasztása — kétségtelenül sok esetben hatásosnak bizonyult. Az igazsághoz hozzátartozik, hogy Hippokratész, később Galenos és Avicenna is alkalmazta a májetetést a vérszegénység tüneteinek az enyhítésére. A terápia bizonytalanságát egy angol klinikus Castle 1929-ben közölt elmélete magyarázta. A csontvelőben folyó vörösvértest képződéshez a táplálékban megtalálható “extrinsic” faktoron kívül egy másik komponens az “intrinsic” tényező is szükséges. Ez a gyomornedvben jelenlevő hipotetikus faktor segíti a májban található vitamin felszívódását és a szérumban az α-globulin frakcióhoz való kötődését. A tragikus következményekkel járó vitaminhiány következménye valójában a gyomorban termelődő és a felszívódást segítő speciális glikoprotein, az “intrinsic faktor” hiányával magyarázható. Normál esetben a “cobalamin-intrinsic” komplexet az ileumban található receptorok kötik meg, majd az itt termelődő disszociáló faktor segítségével a vitamin aktív transzport útján kerül a bélhámsejteken keresztül a véráramba. A bélbaktériumok által termelt vitamin a gazdaszervezet számára általában nem hozzáférhető. Biztos hatás csak az extrinsic faktornak (B12) a véráramba juttatásától remélhető. A cobalamin a magasabb rendű szervezetek életműködése szempontjából nélkülözhetetlen termék. Minden olyan intramolekuláris átrendeződésben nélkülözhetetlen a szerepe, amelyben egy H atom és valamilyen szubsztituens helyet cserél, de a metil-csoport átvitelére szolgáló biokémiai reakciók végbemeneteléhez is szükséges.
a | H − C − b | X − C − c | d
a | X − C − b | H − C − c | d
metilmalonil-CoA: CoA-karbonil mutáz (B.B.R.C- 2:1. 1960) metilmalonil-CoA: szukcinil CoA izomeráz acetohidroxisav-izomeroreduktáz dioldehidráz (J.Biol.Chem. 236: 1199 .1961) homoszerin-metiláz (Nature 195:340 1962) methionint hasznosító metilezési reakciók CDP : dCDP átalakulás (J. Biol. Chem. 236:1199 1961) L-treo-3-metil-aszpartát karboxiaminometil mutáz (Proc Nat. Acad. Sci. 44:1093. 1958) Ez a prokarioták által előállított kémiailag stabil vitamin az alapvető életfolyamatokban betöltött kulcsszerepe miatt a környezetből felvett faktorként az élő világban mindenütt előfordul. A magasabb rendű szervezetek táplálkozás közben szerzik be ezt a számukra esszenciális vegyületet, amely kis mennyiségben minden emlős szövetben µg/kg nagyságrendben megtalálható. A pillangós növények a szimbióta baktériumaiktól veszik fel. Az emberi szervezet napi szükségletét néhány µg vitamin fedezi. Természetes anyagok cianocobalaminként meghatározható vitamin tartalma Tyúk máj Tojás fehérje Marha máj Tehén ürülék Bendő protozoa Élesztő Földimogyoró liszt
A világpiacon évenként 10 tonna B12 vitamin kerül eladásra, amelynek 30 %-át sertés és baromfi tápszer alkotórészeként forgalmazzák. A tématerület élettani jelentőségére utalva Murphy, Minot és Whipple felfedezésükért 1938-ban Nobeldíjat kaptak. Hamarosan világszerte megindult a verseny a májban található hatásos anyag előállítása céljából. Végül is néhány hónap eltéréssel 1948-ban három cég kutatócsoportja jelentette be a keresett, B12-nek nevezett vörös színű kristályos hatóanyagnak az izolálását marhamájból illetve (Streptomyces griseus)-ból. Rickesés munkatársai (Merck Science 107:396) Wijmenga és munkatársai, az Organon kutatói s Lester Smith és munkatársai a Glaxo kutatói (Biochem. J. Proc VIII 43/1948) A korrinoid váz kémiai mérésére a látható fényben és az ultraibolya tartományban észlelhető fényelnyelésük jó lehetőséget ad, a probléma azonban az eredmények biológia értékelésekor jelentkezik. A magasabb rendű élőlények ugyanis csak a dimetilbenzimidazolt, illetve hidroxibenzimidazolt tartalmazó cobinamid származékot képesek hasznosítani. A téma fejlődése szempontjából nagy jelentősége volt Shorb bakteriológus felfedezésének. Megállapította, hogy bizonyos enzimhiányos baktériumok nem képesek a B12 vitamin szintézisére, számukra ez a vitamin növekedési faktornak számított. Ez a felismerés a bonyolult klinikai kipróbálás helyett a vitamin mennyiségének a mérését agardiffúziós módszerré egyszerűsítette, ami felgyorsította a kutató munkát. Az Escherichia coli 113-3-58 jelű mutáns ellenőrzötten tiszta tioglikolsavat és aszparagint tartalmazó táptalajon nem szaporodik, de ha ezzel a mutánssal fertőzött agar lemezbe fúrt lyukakba cobinamid származékot cseppentünk, akkor a baktérium az agarban diffundáló vitamin hatására osztódni kezd. A növekedési gyűrű átmérője a vitamin koncentráció függvénye. Ha a mutánsban csak a cobinamid váz szintézise sérült, akkor a tápközegbe adott hatástalan korrin köztes terméket maradék enzimkészletével hatásos származékká képes alakítani. Ennek a lehetőségével számolnunk kell! A növekedési sebességet az elvégzendő enzimes lépések száma befolyásolja. Az agardiffúziós módszer 5-20 pg/mL B12 koncentráció tartományban használható. Biológiai mérőtörzsnek használták a Lactobacillus leichmannii ATCC 4797 számú és az ATCC 7830 számú mutánsokat is. Fokozható a módszer érzékenysége, ha növekedést serkentő hatás mérését nem agar táptalajon, hanem kémcsőben végezzük. A mutáns maradék enzimkészletének zavaró hatását kiváltandó a törzs növekedésének mérésével nyert számszerű adatokat célszerű kromatográfiás módszerekkel ellenőrizni, illetve olyan megbízható mérőtörzset alkalmazni, amelyik nem képes a köztes terméket aktiválni. A klasszikusnak tekintett papírkromatográfiás eljárással —nátrium cianidot és kálium-perklorátot tartalmazó szekunder butanolos futtatószerrel — jól elkülöníthető a B12 vitamin, a cobinamid, a cobirsav és a cianokobalamin 5hidroxibenzimidazol származéka. A komponensek mennyiségi viszonyairól a kivágott foltokból kioldott anyag spektrofotometriás vizsgálata tájékoztat. Később kiderült, hogy a magasabb rendűekhez hasonlóan a protisták sem képesek a vitamin szintézisére, így a vitamin biológiai mérésére jól használhatók. A Euglena gracilis már ng nagyságrendben érzékeli a vitamin jelenlétét Lényegesen javult a biológiai meghatározás értékelhetősége azzal, hogy mérőtörzsként az Ochromonas malhamensis használata vált általánossá (Analyst 80:132. 1956) Ezek a mikroszervezet csak B12 vitamin jelenlétében képesek növekedni. Hátrányuk, hogy lassan szaporodnak, négy öt nap szükséges a méréshez. A HPLC elterjedésével a korrinvázas komponensek aránya és abszolút mennyisége könnyen meghatározható. A nyers kivonat B12 tartalmának közvetlen meghatározása azonban a szennyező termékek miatt nem végezhető. Ezért a cianid-származékká alakítást követő fenolos extrakcióval nyert vitamin-koncentrátumot elektroforézissel előtisztítják. Ez az előtisztított termék kerül a HPLC oszlopra.
219
A B12 vitamin röntgen-diffrakciós eljárással igazolt kémiai szerkezetét Dorothi Hodgkin csak 1955-ben közölte. A gyógyszerpiacon forgalmazott B12 vitamin, a cianocobalamin összegképlete C63H88O14N14PCo, móltömege:1355,5 Szerves oldószerekben rosszul, vízben jól oldódó, acetonban, éterben, kloroformban oldhatatlan sötétvörös kristályos termék. A lúgos és savas körülményeket jól tűri, de az erős oxidáló és redukáló szerek károsítják. Ez az eddig ismert egyetlen biomolekula ahol kovalens fém-szén kötés kialakul. Különlegessége a kobalt két illetve három értékű alakban való jelenléte. Több mint 70 lépést igénylő totálszintézisét Woodward irányításával 1973-ban fejezték be. Ez a szintézis azonban csak elméleti érdekességű. A B12 vitamint ma is természetes forrásból nyerik. A vitamin korrinoid alapváza a porfirinek jól ismert tetrapirrol szerkezetétől abban különbözik, hogy az A és D pirrol gyürű közvetlenül metin híd nélkül kapcsolódik. Összehasonlíthatóság céljából az ábrán bemutatott hem szerkezetét, amelyekben a pirrol gyűrűkhöz vas atom, vagy a klorofillban magnézium kapcsolódik. A cobalamin pirrolgyűrűin metil, acetamid, propilamid csoportok találhatók, a pirrolgyűrűk N atomjai pedig egy kobalt atomot kötnek. Ehhez a fématomhoz kötődik egy különleges bázis, amelyhez α-glikozidos kötéssel kapcsolódik egy D-ribóz-3-foszfát. Ez utóbbi a D gyűrű propionsav oldalláncát amidáló aminoizopropanolhoz kötődik foszfátészter kötéssel. A különleges heterociklusos bázis általában 5,6-dimetilbenzimidazol. A gyógyszerként forgalmazott B12 vitamin valójában egy műtermék. A korrinoid gyűrűnek a különleges bázissal ellentétes térfelén egy cianid gyök kötődik a kobalt atomhoz. A cianocobalamin a természetes vitamin olyan átmeneti alakja, amely az élő szervezetben könnyen alakulhat aktív vegyületté, például 5-dezoxi-adenozil-cobalaminná, amelyben az ionos kötéssel rögzült cianid gyök helyett a kovalensen kötődő 5-dezoxi-adenozint találjuk. PBGS ALS Szukcinil-CoA || || || || Porfobilinogén δ−aminolevulinsav Glikokoll F430koenzin Ni++ alloszterikus SZABÁLYOZÁS Uroporfirin III. Tetrapirrol-metán Shirohidroklorin Metilezés, Co+++ Koprogén III Cobirinsav 6 Glutamin Cobirsav Aminopropanol Protoporfirin IX
A cobalamin bioszintézise — amint az előző vázlat mutatja — a porfirin szintézisútból ágazik el. Ebből következik, hogy a képződésében a δaminolevulinsav szintetáz (ALS) aktivitása meghatározó jelentőségű. Ennek az enzimnek a működését alloszterikusan szabályozza a protoporfirin-IX. Várható tehát, hogy az ALS enzimszint géntechnológiai módszerrel történő növelése fokozza a cobalamin képződést. Protaminobacter és Rhodopseudomonas törzsekből sikerült egy olyan életképes hibridet előállítani, amelyben nem működik az alloszterikus szabályozási mechanizmus. Az eredeti Protaminobacter ruber IFO 3708 jelü törzsben az amino-levulinsav szintézis szabályozása jól működik, ezért a tenyészet alig éri el a néhány µg/ml cobalamin szintet. A másik mikrobában, a fototróf Rhodopseudomonas spheroides IFO 12203 törzsben viszont az aminolevulinsav-szintetáz szabályozás nélkül működött. Ennek a következményeként ebben a törzsben természetes élőhelyén nagy mennyiségű klorofill képződhet. A Rhodopseudomonas protamicus névre keresztelt életképes hibrid tenyészet B12 tartalma (prekurzor adagolás nélkül) meghaladta a 100 µg/ml értéket. Végeredményben nem meglepő, hogy a két törzsből előállított hibridben a szabályozás nélkül termelődő δ-aminolevulinsav a B12 vitamin képződését jelentős mértékben megnöveli (Eur. Pat. 131456. 1985), hiszen a korrinoid váz szintézise és a klorofill képződése közös köztesanyagot hasznosít. A bioszintézis út következő lépésében — a porfobilinogén szintetáz (PGFS) felületén — két δ-aminolevulinsav kondenzál, porfobilinogén képződik, ami nem más mint egy aminometil csoporttal, ecetsavval és propion savval szubsztituált pirrol származék. A szintézisért felelős enzimkomplex ugyancsak alloszterikusan szabályozott. Az aminolevulinsav szintetázhoz hasonlóan ennek a komplexnek a működését is a sejten belüli hem koncentráció, nevezetesen a protoporfirin-IX szint befolyásolja. A porfobilinogének összekapcsolása bonyolult enzimkomplex felületén következik be. Egy NADP kofaktort igénylő deaminációs reakcióban egy csupán átmenetileg megjelenő, igen reakcióképes hidroximetilbilán képződik. Megjegyzendő, hogy végül a kialakult tetrapirrol származék nem szimmetrikus. A tetrapirrol D gyürűjében az ecetsav- és a propionsav-oldallánc sorrendje ellentétes a többihez viszonyítva. Ez az eltérés a bioszintézis folyamán irányító szerepet tölt be. A négy porfobilinogénből kialakult uroporfirin-III (uroporfirinogén III) az utolsó közös intermedier az alapvetően fontos élettani feladatokat ellátó porfirin származékok képződésében. Ebből a vegyületből képződik a fényhasznosító klorofill, de itt ágazik el a citokromok, a hemoglobin, a kataláz valamint más pirrol származékok között a B12 szintézis útja is. Az uroporfirinből meghatározott sorrendben bekövetkező metilezési reakciókkal alakul ki a korrin váz. A második metilezési reakció terméke a dimetilkorriferin, illetve dihidroizobakterioklorinként ismert shirohidroklorin, egy újabb elágazási pontot jelent. Innen indul ugyanis az F-430 dehidrogenáz nikkelt tartalmazó kofaktorának a szintézise. A metionin segítségével folyó metilezési reakciókat követően a tetrapirrol szerkezetben a B12 szintézis irányába mutató döntő átalakulás következik be. Nevezetesen a trimetil-korriferin C gyűrűjén található ecetsav oldallánc dekarboxilezését követően, az előző reakciósorban metilezett C20 szénatom ecetsav formájában kiválik. Ez az eliminációs reakció az A és D gyűrű közvetlen kapcsolódását teszi lehetővé. A kialakult szerkezeti változás segíti a kobalt atom bekötődését és a cobirinsav képződését.
221
cobirinsav A cobirinsav továbbalakulását — a B12 koenzim bioszintézisének történéseit — szemlélteti a következő vázlat
222
223
A kialakult erősen savas jellegű cobirinsav hét karboxil csoportja közül hat vesz részt a további átalakulásban. A cobirinsav hat glutamin felhasználásával hat amid csoport kialkításával alakul cobirsavvá. A cobirsav csupán egyetlen savas jellegű csoportot, egy propionsav oldalláncot tartalmaz, amely hamarosan egy treoninból származó amino-izopropanollal peptid kötést kialakítva reagál. A szabad hidroxil csoport ezután egy ATP-ből származó foszforsav-maradékkal képez észtert. Ez az észter a továbbiakban egy GTP-bôl származó guanozin-monofoszfáttal reagál pirofoszfát felszabadulása mellett. A GMP-cobirsav származék pirofoszfát kötése lehetőséget ad az α-ribazol-foszfáttal való reakcióra is. A reakcióban a ribóz C3 hidroxil csoportja reagál guanilsav felszabadulása közben. A képződő vegyület a B12 foszfát. Ezt követőleg a ribóz C5 hidroxil csoportját acilező foszforsav maradékot (foszfátészter) az utolsó lépésben egy foszfatáz eltávolítja. A ribazol imidazol csoportja lazán kötődik a korrin vázba rögzített kobalt atomhoz. Ez a komplex képző tulajdonságáról jól ismert atom a hozzá lazán kötött imidazol gyűrű elektronszerkezetét is felhasználja a B12 vitamin által katalizált reakciók bonyolításához. A kobalamin képződés közben figyelemre méltó kémiai reakciók zajlanak a kobalt-szén kötés kialakulása érdekében. A B12 koenzimben 5’-dezoxi-adenozin kapcsolódik közvetlenül az imidazol elektronszerkezetével kapcsolatban levő kobalt atomhoz. A kobalt körül kialakuló reakcióképes elektronrendszer miatt az 5’-dezoxi-adenozin könnyen lecserélhető. Ez történik a B12 vitamin ipari előállításakor, amelyben a műterméknek tekinthető cianid származékot nyerjük. Ezt a vegyületet a gyógyászatban azért alkalmazhatjuk sikerrel, mert az élő szervezetben a felhasználás helyén a cianid csoport ugyanilyen könnyen cserélődik az adott reakcióban szereplő gyökkel, 5’-dezoxi-adenozinnal illetve a metioninból származó metil gyökkel. A vitamin nukleotid jellegű építőelemeiként ismeretes benzimidazol származékok az elektrontranszport folyamatokban szereplő, különböző dehidrogenázok kofaktoraiként ismert izoalloxazin vegyületekből képződnek. Jól szemlélteti ez a folyamat azt, hogy az élő szervezet bonyolult anyagcsere-rendszerében még a bomlástermékek is szerepet kaphatnak. Sőt - amint látható - a szelekciós nyomás hatására biológiai jelentőséget nyerve, végül is esszenciális élettani faktorrá válhatnak.
224
A különböző flavin enzimek kofaktorainak szintézise guanozin-trifoszfátból (GTP) indul, amit a GTPciklohidroláz egy hangyasav eltávolításával 2,5-diamino-6-keto-4-(5'-foszforibozilamino)-pirimidinné alakít. Ebből egy reduktív deaminációs reakcióban 5-amino-2,6-diketo-4-(5’-foszforibozilamino)-pirimidin képződik. A következő reakcióban két molekula vesz részt. Az előbbi diketo-pirimidin származék egy másik molekula ribitil csoportjával reagálva 6-metil-7-(1’, 2’-dihidroxi-etil)-8-foszforibitil lumazinná kondenzál. Ez a lumazin származék a flavin nukleotídok közös köztesterméke. Riboflavin képződéskor egy szénatom eltávolításával 6,7-dimetil-8-foszforibitil lumazin képződik, amiből ugyancsak két molekula vesz részt a riboflavin szintetáz által katalizált reakcióban. Az egyik reakciópartnerrel leszakadó négy szénatomot tartalmazó fragmentum felhasználásával fejeződik be a riboflavin szintézis, miközben az előbbi reakcióban megismert 5-amino-2,6-diketo-4-(5’-foszforibitilamino)-pirimidin képződik. Ez a “mellék-termék” a bioszintézis reakciósorában köztes termékként természetesen újra felhasználásra kerül. Az F-420 dehidrogenáz koenzime ugyancsak a 6-metil-7-dihidroxietil-8-foszforibitil lumazinból képződik, mégpedig célszerűen a riboflavin képződéskor eltávolított C1 töredék felvételével a lumazin 7-hidroxi9-D-5’-foszforibitil-izoalloxazinná alakul. (Az ábrán az utolsó sor első szerkezeti képlete) A cobalamin csoportba tartozó vegyületek benzimidazol építőelemei ezekből az izoalloxazin származékokból képződnek. Az izoalloxazin-gyűrű felnyílása után egy molekula alloxán képződése mellett a megfelelő benzimidazol származék képződik (5,6-dimetil-benzimidazol, 5-hidroxi-benzimidazol, 5-metoxi-benzimidazol, stb.) A NAD+ -ból nukleotidil pirofoszfatáz hatására képződő nikotinsavamid-mononukleotid egy transzglikozidáz katalizálta reakcióban ribazol-5-foszfáttá alakul. Ez utóbbi vegyület az 5'-dezoxiadenozil-cobinamidguanizin difoszfáttal reagál. A ribazol-5-foszfát pedig egy transz-glikozidáz katalizálta reakcióban GMP lehasadása mellett a cobinamid vázhoz kapcsolódik. A képződő vitamin-foszfát azután egy foszfatáz segítségével alakul B12-koenzimmé. Az 5 dezoxiadenozin mobilitását előnyösen befolyásolja a korrinoid vázban elhelyezkedő kobalthoz kapcsolódó imidazol jelenléte. A korrin váz által meghatározott sík egyik oldalán helyezkedik el a dimetilbenzimidazol gyűrű, a másikon a kobalthoz kapcsolódó 5'-dezoxiadenozil, illetve esetenként a metil, vagy hidroxil csoport, valamint az életmentő gyógyszerként forgalmazott cianocobalamin előállításakor ott elhelyezkedő CN csoport. (lásd a cianocobalamin szerkezetzét bemutató ábrát) A B12 vitamin bioszintézisének az utolsó fokozottan energiaigényes lépéseiben a NAD+, az ATP és a GTP energiatartalma használódik fel.
A B12 vitamin nagyüzemi előállítására aerob, illetve anaerob fermentációs eljárásokat dolgoztak ki. Kisebb mennyiségben antibiotikum fermentációs eljárások melléktermékeként felszaporodó megsemmisítésre ítélt biomasszából nyerték ki. A múlt század közepén — a Merck kutatói — Rickes és munkatársai a streptomycint termelő Streptomyces griseus kiszűrt micéliumtömegéből állította elő. Az ötvenes években a kristályos vitamin piaci értéke 1200 $/g volt, ami minden költséget elviselt. Később direktfermentációs eljárásokat dolgoztak ki az előállítására. A termelő mikroorganizmus számára is életfontosságú vitamin a növekedési fázisban képződik. Ez a megállapítás a genetikai beavatkozással saját szükségletén túl termelő törzsekre is érvényes. Miller és Rosenblum 1960-ban Pseudomonas denitrificans törzset izoláltak, amely literenként 600 µg vitamint termelt. A Merck cég kutatói 10 éves törzsnemesítő munkával 60 mg literenkénti termelésre képes mutánst állítottak elő. A vitaminképződés magas szintjét a táptalajba jelenlevő betain (trimetil-glicin) előnyösen befolyásolja. Nem mint metil donor, hanem glicin analógként a δ-aminolevulinsav szintetáz aktivitását fokozva növeli a vitamin képződését. A tápközegben szénforrásként használt répamelasz bőségesen tartalmaz betaint. Prekurzorként 5,6-dimetilbenzimidazolt kell juttatni a tenyészethez, mivel a nemesített törzs anyagcsere rendszere nem képes annyi benzimidazolt előállítani, amennyit a képződő cobinamid aktíválása igényel.
225
Az eljárás oxigén igényének kielégítése céljából a tenyészeten térfogatával egyező levegő átáramoltatása szűkséges. A termelő táptalaj összetétele L–1 pH=7.4 90 óra 29 °C 420 ford.perc–1 100,0 g cukorrépa melasz 0,025 g 5,6-dimetil-benzimidazol 2,0 g élesztőkivonat 0,005 g Na2MoO4.H2o 5,0 g (NH4 )2HPO4 0,188 g Co(NO3)2.6 H2O 0,3 g MgSO4.7 H2O 0,020 g ZnSO4.7 H2O 0,2 g MnSO4.H2O A fermentációs folyamat végén a tenyészetet 30 percig 120 oC-on tartják. Ezzel kiszabadítják a vitamint és rokonvegyületeit a baktérium sejtből. A lehűtött feltárt sejttömeget pH=8,5-re állítva 16 órán keresztül káliumcianiddal keverik. Literenként 60 g cinkkloriddal kiegészítve pH=8-ra állítva szűrik. A szűrletet 1/10-ed térfogatnyi krezol:széntetraklorid 1:2 arányú elegyével háromszor extrahálják. Az összegyűjtött szerves fázishoz fél térfogat butanolt adva vízzel extrahálják (1/10 térfogat). A vizes fázist 1/100-adnyi krezol-széntetraklorid eleggyel extrahálva töményítik. A szerves fázisból a vitamin aceton:éter 2:1 arányú elegyével kicsapható.A csapadék minimális metanolban oldva aktivált alumínium oxidon tisztítható 2 % ecetsavat tartalmazó metanollal. Gazdaságos fermentációs eljárást fejlesztettek ki a fakultatív anaerob Propionibacterium fajokkal. (Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207— P. shermannii ATCC 13673) Az eljárás első szakaszában kukoricalekvárt és 10 % glükózt tartalmazó táptalajon anaerob körülmények között propionsavas erjedés folyik. Ez az anyagcsere korrinoid vitamint igényel a szukcinil-CoA metilmalonil-CoA átalakításhoz. Nem csoda tehát, hogy a fermentációs szakaszban a B12 vitamin 5'-dezoxiadenozil származéka túltermelődik. A glükóz mennyiség négy napi anaerob fermentációja után kezdődik az aerob szakaszra való áttérés. Az aerob szakaszban a baktérium a fermentációs szakaszban képződött propionsavat hasznosítja. Ez az élettani reakciósor fokozottan igényli a cobalamin vitamin jelenlétét. Az aerob anyagcsere elősegíti a dimetilbenzimidazol képződését a feleslegessé váló riboflavinból. Ezért a folyamat nem igényel prekurzor adagolást. A B12 vitamin előállításának ipari megvalósításában a magyar gyógyszeripar is figyelemreméltó eredményeket ért el. A negyvenes évek végén a Kőbányai Gyógyszergyár (Richter Gedeon R.T.) májkivonata "Perhepár" néven került forgalomba. Ezt 1951-ben egy tisztított készítmény a "Neo-perhepár" váltotta fel. A gyár vegyészei heroikus munkával hat tonna májból 2 gramm kristályos vitamint állítottak elő. A teljesítmény egyértelművé tette a gazdasági vezetők számára, hogy kiindulási anyagként valamilyen olcsóbb vitamin-forrást kell keresni. Szabadalmi okokból a direkt-fermentációs eljárás bevezetése nem jöhetett számításba. Az antibiotikum termelés melléktermékeként való előállítását is megvizsgálták. A Chionoinban folytatott sztreptomicin termelés azonban a kiindulási anyag mennyiségét meghatározta, azaz a gyártás felfuttatását az alapanyag mennyisége limitálta. A gyár kutatóinak figyelme a rothasztó baktériumok jelentős B12 vitamintartalmára irányult. 1954-ben a soroksári szennyvíztisztító baktériumflórájából 16,8 g kristályos terméket állítottak elő. 1958-ban a kezdeti mennyiség 100-szorosára emelték az évi termelést. A hetvenes évekre a vitamin termelés meghaladta a fél tonnát. Ezt azonban már nem a csatorna iszap, hanem fermentációs eljárással nyert baktériumtömeg feldolgozása tette lehetővé. Az első 10 m3 térfogatú anaerob fermentor 1956-ban kezdte meg a termelést a szennyvíztisztítóból nyert vegyes baktériumpopulációval A vizsgálatok szerint a csatornaiszapból származó populáció vitamintermelő tagja a Methanobacter omelianskii volt. A Svéd Királyi Akadémia mikrobiológusának, Halina Menjahl dolgozatában talált utalás alapján sikerült az eljárást iparilag hasznosíthatóvá tenni. A hatvanas években az eljárást fél-folytonos technológia bevezetésével fejlesztették. Elhagyták a szennyvíziszapot. A belőle elkülönített, metanol hasznosításra szelektált baktérium tömeg folytonos fenntartásával biztosították a folyamatos termelést A nyolcvanas években a B12 koenzim fermentációs előállításával bővült a készítmények száma. A termelési eredmények javulása és a piaci verseny radikális árcsökkenést okozott. A kinyerési technológia is jelentősen változott. Mivel a hatóanyag az élő sejtben található az első lépés a sejtek feltárása, amit követ a cian származék előállítása. A fermentléhez NaCN-ot adva és acetonnal hígítva 30 percig keverik 50 oC-on, miközben a cianocobalamin oldatba megy, a sejtből kiszabaduló fehérje pedig kicsapódva az alakos elemekkel együtt szűrhetővé válik. A vizes-acetonos oldathoz kloroformot adva a korrinoidok a vizes fázisba szoríthatók. és kromatografálással tisztíthatók. A környezet szennyezését elkerülendő a hőkezeléssel kiszabadított cianocobalamint XAD-2 gyantán kötik. Csapvízzel való mosása után a szelektíven megkötött vitamint vizes alkohollal mossák le, majd töményítés után kristályosítják. Mai élettani ismereteink alapján nem meglepő, hogy a metanolt hasznosító mikroorganizmusok különösen alkalmasak a B12 vitamin nagyipari előállítására. A metil hasznosítás első lépéseként a metiltranszferázhoz kapcsolódó B12-koenzim kobalt atomján indul a reakció. A metilcobalamin képződése segíti a metanolból származó szén hasznosulását. Ebből a szénből építi fel a Methanobacterium a szénhidrátokat,
226
fehérjéket, lipideket, az egész szervezetét. Ugyanakkor a dehidrogénezési folyamatokban eltávolított elektron és felszabaduló proton számára a metil csoport elektronakceptorként is hasznosul. A CoM-SH-hoz kötődő metilcsoport az F430 és az F420 fehérjéket tartalmazó metilreduktáz enzimkomplex működésének eredményeként végül is metánként távozik az enzimfelületről. A szénlánc felépüléséhez szükséges acetil-CoA a COdehidrogenáz felületén képződik. Mint látható az Ősbaktérium csoportba sorolható baktériumtömeg szénforrásként és energiaforrásként (elektronakceptorként) hasznosítja a metanolt
B2 vitamin (laktoflavin) A riboflavint tejből 1933-ban izolálta Kuhn György, szerkezetét 1933-ban határozta meg
6,7-dimetil-9-(D-1’-ribitil)-izoalloxazin Az élő világban a flavoprotein alkotórészeként fordul elő. A kémiai szintézissel vetélkedő mikrobiológiai előállítási eljárást a XX. század közepén fejlesztették ki. Évtizedeken keresztül hazánkban is alkalmazták. Az NNRL Y-1056 jelű Ashbya gossypii tömlős gomba komplett táptalajon fejlődött 7 napos tenyészete literenként 7-10 g riboflavint tartalmaz. A táptalaj 2,25 % kukorica-lekvárt, 3,5 % peptont és 4.5 % szója olajat tartalmazott. Habgátlóként is előnyös a szója olaj.használata.
227
D-GLÜKONSAV ELŐÁLLÍTÁSA A glükóz mikrobiális oxidációját - a "cukorsav" képződését - ecetsav baktériumok jelenlétében L. Boutroux írta le 1880-ban (C.R.Acad.Sci. 91: 236). Pseudomonas glükonsav termelését Alsberg írta le 1911-ben. Gombatenyészettel történő előállítását M. Molliard közölte először 1922-ben (C. R. Acad. Sci. 17:881). 1928ban már működött az első üzem felületi tenyésztéssel Penicillim luteum-pupurogenum aktivitását hasznosítva 80-85 %-os hatásfokkal. Azóta végzett kutatások eredményeként számos mikroszervezet, köztük Aspergillus, Penicillium, Scopulariopsis, Gonatobotrys, Endomycopsis Pullularia, Pseudomons, Gluconobacter fajok glükózoxidáló képességéről tudunk. A glükóz baktériumokban folyó direkt oxidációja általában NAD+ illetve NADP+ kofaktort igényel. Sok esetben ezek a baktériumok a glükonsavat tovább oxidálva 2-keto-glükonsavat illetve 2,5-diketoglükonsavat képeznek. Az oxidált termék végül egy-egy foszfotranszferáz aktivitását hasznosítva kerül az anyagcserébe a pentózfoszfát ciklus köztesanyagaként. ATP ADP GLÜKÓZ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Glükóz-6-foszfát NAD+ glükokináz NADP+ glükóz-dehidrogenáz G-6-P dehidrogenáz NADH NADPH glükonsav-δ-lakton H 2O
glükonát foszotranszferáz glükonsav −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> Glükonsav-6-foszfát NAD+ ATP ADP NADP+ glükonát-2-oxidoreduktáz 6-PG-dehidrogenáz NADH ATP ADP NADPH 2-keto-glükonát −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> 2-keto-6-foszfo-glükonát NAD+ 2-keto-glükonát-foszfotranszferáz 2-oxo-glükonát-5-oxidoreduktáz NADH 2,5-diketo-glükonát ribóz-5-foszfát Az eljárás ipari jelentőségét éppen a megjelenő különböző keto-származékok csökkentik, kivéve a főtermékként felhalmozódó 2,5-diketo-glükonátot, amely a C-vitamin gyártás előnyösen továbbalakítható értékes köztesterméke. A ma is használatos (glükonát) gyártási eljárást Bernhauer K. és Schalhof L. kutatómunkája alapozta meg (1932.U.S.Pat. 1849053). Ettől függetlenül Currie és munkatársainak gyakorlati eredményeire támaszkodva a Chaz. Pfizer & Co. üzemében 1923-ban indult a glükonsav gyártás nagyipari méretben. (1933 U.S.Pat. 1893819). A Penicillium luteum és az Aspergillus niger törzsekkel 50-60 óra alatt 90 %-nál jobb hatásfokkal folyt a glükóz oxidációja. 1937-ben Moyer és munkatársai olyan aktív Aspergillus niger törzset izolált, amely egy nap alatt literenként 200 g glükózt oxidált 95 % elméleti hatásfokkal (Ind. Eng. Chem. 29:777 és 44:435, 1952), ha a reakcióelegy kalcium karbonátot is tartalmazott. Glükonsav előállítására ezt a törzset és eljárást hasznosított hazánkban a Richter Gedeon Rt elsőként hazánkban. A glükóz átalakítását glükonsav-δ-laktonná a gombákban egy FAD enzim a glükózoxidáz katalizálja ΟΗ | H-C | H-C-OH | HO-C-H | H-C-OH | H-C | H-C-OH | H
Ο || C | H-C-OH glükózoxidáz | HO-C-H | H-C-OH FAD FADH2 | H-C | H-C-OH | H
228
H 2O
Ο || C-OH | H-C-OH | HO-C-H | H-C-OH | H-C-OH | H-C-OH | H
A kofaktor visszaoxidálása hidrogén peroxid képződése közben egy oxigén molekulát fogyaszt. Ezt a toxikus terméket a mikroorganizmusban működő kataláz azonnal bontja. O2 +
FADH2 H 2O 2
−−−−−−−−−−−−−−−−−>
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−>
FAD
+
H 2O
+
H 2O 2 1
/2 O2
A glükonsav−δ−lakton ugyan spontán hidrolizálhat glükonáttá, az Aspergiullus-ban azonban egy specifikus laktont hidrolizáló enzim működése észlelhető. A glükóz-oxidázt az Aspergillus niger sejtmentes kivonatából D. Müller izolálta 1928-ban (Biochem Z. 199: 136). Később Franke W. és munkatársai (Zbl Bakt. I. 191-94, 1963), valamint Keilin D. és Hartree E. F. (Biochem. J. 42:221, 1948) megállapították, hogy ez a FAD tartalmú flavoprotein a D-glükóz ß-anomerjét 150-szer gyorsabban képes oxidálni, mint az α -D-glükózt. Lehet, hogy a rendszer egy mutarotáz aktivitással rendelkező fehérjét is tartalmaz. A glükóz-oxidáz egyes gombák szűrt tápközegében is megjelenik. Néhány szerző köztük Kecholaty W. "Penatin" néven (Arch. Biochem 273, 1943), Coulthard és munkatársai "Notatin" néven (Nature 150:634, 1942) Roberts és munkatársai "Penicillin-B" néven (J. Biol. Chem. 147: 47 ,1943) a negyvenes évek elején antibiotikumként írták le ezt az enzimet. Megtévesztette a szerzőket a glükózt tartalmazó táptalajon felszabaduló hidrogénperoxid dezinficiáló hatása. Azóta ezt a hatást az élelmiszeripar hasznosítja. A tojásfehérjepor előállításánál a készítményben levő 0,5 % glükóz eloxidálására használják. Az enzim specifikus működése miatt a glükóz kvantitatív mérésére is használható. Gyorsasága, megbízhatósága miatt ez a tapasztalat analitikai módszerré fejlesztve bevonult a klinikai gyakorlatba. Van Dijken J. P. és Veenhuis M. vizsgálatai szerint a glükóz-oxidáz (Eur. J. Appl. Microbiol. 9:275, 1980) az Aspergillus niger sejtplazma peroxiszómáiban található. Nem ismert azonban sem az enzim, sem az általa előállított glükonsav élettani szerepe. Az enzim 10,5 % szénhidrátot tartalmazó 186000 moltömegű glükoprotein. Prosztetikus csoportként két szorosan kötött FAD-ot tartalmaz. A hőérzékeny (50 oC) enzim optimális reakciókörülménye pH=5,5.-nál található. A glükonsav képződés szempontjából előnyös az 1-1,5 M glükóz koncentráció, a tápközeg csekély foszfát tartalma (80-90 mM) és a nitrogén éhezés (20-30 mM). A fémionok közül a mangán jelenléte (1-10 mM) szükséges. A reakció oxigénigénye igen nagy. A reakcióelegy hidrogén-ion koncentrációja meghatározó jelentőségű (pH=4,5-6,5). Savanyú körülmények között (pH=3) az enzim bomlik. Az átalakítást végző gombatömeg (micélium) többször is felhasználható aktivitásvesztés nélkül. Moyer 1944-ben felfedezte, hogy bórax jelenlétében az átalakítandó glükóz koncentrációja tovább növelhető akár 350 g/liter értékig. A bór ugyanis akadályozza a kalciumglükonát kiválását. A világszerte használt eljárást Moyer és munkatársai fejlesztették ki (US.Pat. 2351500). Az ipari gyakorlatban használt Aspergillus niger törzset agar táptalajon tartják fenn. A tenyészetről lemosott spóra-szuszpenzióval oltják az ammónium-foszfátot és glükózt tartalmazó táptalajt. A tenyésztést 30 oC-on erősen levegőztetve végzik. A logaritmikus növekedési fázisban levő tenyészettel oltják a főfermentációt, amely 15 % glükóz (keményítő hidrolizátum) mellett 0,4 % ammóniumfoszfátot, 0,2 % kálium-foszfátot, 0,16 % magnézium-szsulfátot és 2,5 % kálcium-karbonátot tartalmaz. Ez utóbbi anyagot külön sterilezve adják oltás előtt a táptalajhoz. A keverővel ellátott raktorban levő tenyészeten percemként 1 térfogatnyi levegőt préselnek át 4 bar túlnyomás mellett. Az oxidáció közben felszabaduló hő elvonása hatásos hűtést igényel. 15-20 órás kortól az átalakuló glükózt pótolva steril tömény glükóz oldatot, a kálcium-glükonát kiválását akadályozandó pedig literenként 1,5-2,5 g bóraxot adagoltak. A glükóz összmennyisége nem haladja meg a 35 %-ot. Élelmiszeripari hasznosításra készülő termék esetében azonban a bórsav-észter toxicitása miatt bórax nem használható, ezért általában 15 % glükóz átalakítását végzik 20 óra alatt. 1952-ben a Blom által kifejlesztett automatikus pH szabályozással azután bór alkalmazása nélkül is sikerült növelni a termékkoncentrációt. Az átalakítás befejeződésekor kiszűrt micélium tömeg ismételten felhasználható a folyamat katalizálására. A szűrletet kalcium-hidroxiddal semlegesítik, majd forralva 20 % kálcium-glükonát tartalomig töményítik. A kristályosítást oltókristállyal elősegítve 20 oC -ra hűtve végzik. A kristályos terméket hűtött vízzel mossák. Az anyalúgot és a mosóvizet aktív szénnel tisztítják, majd újra töményítve kristályosítják. A kristályt 80 o C hőmérsékleten szárítják. A kristályok tömény vizes szuszpenziójához adott számított mennyiségű kénsavval a glükonsav felszabadítható. A szabad sav vízben jól oldódik, akár 50 %-os oldat is készíthető belőle. Ebben a vizes oldatban a hőmérséklettől függő arányban egyidejűleg jelen van a szabad sav mellett a δ−illetve a γ−lakton is. A túltelített oldatból 30 oC alatt a szabad sav kristályosodik, 30-70 oC között a δ−lakton kristályosítható, 70 o C felett pedig a γ−lakton válik ki. A termék tisztítása ismételt kálcium-glükonát képzéssel, majd aktív szenes derítést követő kristályosítással történik. Vizes (50 %-os) oldatát a tejipar használja a tároló edények, alumínium eszközök és a rendszer tisztítására. A δ−laktont, mint lassan ható savanyító szert az élelmiszeripar illetve a húsipar használja. Japánban évente 3000 tonna laktont használnak fel csak a szójafehérje kicsapására. Évente 50 ezer tonna 99.5 % tisztaságú nátrium sója kerül forgalomba. Fémsóit (Ca, Fe, Mg) állattápszerbe keverve használják. 229
KÖRNYEZETET SZENNYEZŐ ANYAGOK BIOLÓGIAI HASZNOSÍTÁSA Szerves anyagok anaerob lebontása évmilliárdok óta nélkülözhetetlen részfolyamata a Föld felszín anyagforgalmának. A tudomány ezzel az érdekes és még ma is sok nyitott kérdést tartalmazó problémakörrel a tavak fenekén felszaporodó üledék rothadási folyamatainak vizsgálatakor, a tőzegmocsarak különleges biológiai jelenségeinek vagy a kérődzők bendőjében végbemenő átalakulásoknak a magyarázatakor találkozott. A szemétgödrökben, illetve trágyatárolókban folyó anaerob folyamatok alapjelenségei hosszú ideig senkit sem érdekeltek, annak ellenére, hogy ugyanakkor a jelenség gyakorlati hasznát közösen élvezte az emberiség. Amikor Franciaországban Louis H. Mouras de Vesoul 1860-ban zárt emésztőgödröt épített a birtokán, valószínűleg csak a kellemetlen illatanyagok kiszabadulását akarta megakadályozni. Később az emésztőgödörben végbemenő folyamatot figyelve megállapította, hogy a szilárd növényi hulladékok egy idő után teljesen elfolyósodnak. A képződő gáz (biogáz) hasznosítására azonban nem gondolt. Az irodalmi adatok szerint először 1895-ben Donald Cameron használta a kiáramló gázelegyet fűtőanyagként. Az Exeter-ben épített, nagy emésztőtartályai körül ezzel a gázzal világítottak. A század első felében a szennyvíztisztítást energiaigényes aerob módszerrel próbálták megoldani. Az eljárás valójában a biológiailag eloxidálható szervesanyag-tartalom (AOX) lebontásához szükséges levegő mennyiségének a meghatározására szolgáló analitikai módszer megnövelt méretű változatának tekinthető. A szennyvizet ugyanis a szervesanyag-tartalmának a biológiai lebontásához szükséges oxigén mennyiségével lehet minősíteni. Az aerob bomlást elősegítő levegőztetés azonban nagy felületet és nem kevés energiát igényelt.
A levegőztetett szakasz után elhelyezett ülepítő medencék biológiai folyamatait nem vizsgálták. A felhasznált felület csökkentése és a levegőbuborékok oxigén tartalmának jobb kihasználása érdekében 30 méternél magasabb toronyreaktorokat építve igyekeztek gazdaságosabbá tenni az eljárást. Megfelelő fúvókák alkalmazásával a 8-10%-os oxigén kihasználás 40-60%-ra emelhető A túlfolyó tölcsérben felgyűlő biomassza egy részét szükség esetén visszavezetik a kezelőtérbe.
Az aerob szennyvíz tisztítónak — a beruházási költségen túl — jelentős az energiaigénye, a közösséget terhelő költségigénye. Tovább fokozható a tisztítás hatásfoka tiszta oxigén bevitelével. Ugrásszerű fejlődést hozott a hetvenes években jelentkező energiakrízis, a nyersolaj árának emelkedése. a szakemberek figyelmét az energetikailag kedvezőbb anaerob módszerekre irányította. Az aerob eljárással történő tisztításkor a szennyvíz eloxidálható széntartalmának 45 %-a széndioxid alakjában távozik; a bevitt anyag fele a szennyvíziszapban dúsul fel (ez később elégethető); 5 % pedig az elfolyó tisztított vízben marad oldva. Anaerob módszerrel viszont ugyanebből a szennyvízből a metabolizálható széntartalom 80 %-a metán és
230
széndioxid formájában gázfázisba vihető, miközben a szennyvíziszapban l0 %, az elfolyó tisztított vízben ugyancsak l0 % széntartalom van jelen. Ez utóbbi érték közel felére csökkenthető, ha az anaerob rendszer után egy kisméretű aerob reaktort működtetünk. Az anaerob reaktorból távozó biogáz összetételét a szennyvíz kémiai összetétele jelentős mértékben befolyásolja: Szénhidrátból 50 % metán és ugyanennyi széndioxid képződik. A fehérje tartalmú szennyvízből képződő széndioxid és metán aránya 3:7, de jelentős az ammóniaképződés. Lipidekből 67 % metántartalom mellett 33 % széndioxid képződik. Természetesen különböző technológiai fogásokkal hidrogén bevitellel vagy a széndioxid és az ammónia eltávolításával - a gázelegy (biogáz) metántartalma lényegesen növelhető. A gazdasági haszon számottevő, hiszen a hexóz aerob lebontásakor 2803 kJ/mol energiát szolgáltat, anaerob körülmények között viszont mindössze l32 kJ/mol szabadul fel. A különbség jelentős hányadát a fűtőanyagként használható metán tartalmazza. A szeméttelepeken folyó metánképződésről Jones és Owen már 1934-ben beszámolt. Az energiabőség miatt azonban erre a felfedezésre senki sem figyelt fel. Csupán a 60-as években kezdtek német és amerikai mérnökök e felismerés gyakorlati hasznosításával foglalkozni. Az első gáztermelő üzem a Palos Verdes Landfillnél 1975-ben indult. A szeméttelepről nyert gázt elektromos energia termelésére hasznosították. Ezt követőleg egyre több hasonló üzem épült szerte a világon. Egy1988-ban megjelent statisztikai adat szerint addig 15 országban 146 üzem kezdte meg a működését. Az így nyert gáz általában 55 % metánt tartalmazott. A termelt gáz mennyisége évenként 825.000 tonna szénnel egyenértékű fűtő teljesítményt jelent. A metánképződést mint általános jelenséget a Föld különböző pontjain végzett vizsgálatok igazolják. A mérhető csekély koncentráció ellenére a Föld évi metántermelése meghaladja a gigatonna mértéket. Ez a metánmennyiség különböző mikroorganizmusok egymást segítő és kiegészítő tevékenységének eredményeként kerül a légkörbe. A szerves anyagból folyó biológiai metánképződés négy, biokémiailag jól megkülönböztethető szakaszra osztható, mivel az egyes szakaszok mikroflórája számára az optimális fizikai-kémiai körülmények jelentős mértékben eltérnek.. Az első lépésben nagyméretű szerves molekulák, polimerek, fehérjék, poliszacharidok lebontása folyik. Ezt a feladatot különböző mikroaerofil és fakultatív anaerob szervezetek extracelluláris enzimei végzik nagyon hatásosan.—A második lépésben nagyobb molekulák lebontása folyik, miközben C-1 töredékek, szerves savak, alkoholok, széndioxid és hidrogén képződik. Ezt a szakaszt a reakcióelegy savanyodása miatt acidogén fázisnak nevezik. Az itt működő gyors növekedésű mikrobák ezt a savanyodást jól tűrik.—A harmadik lépésben a fenti vegyületekből a szerves savak és alkoholok továbbalakulása közben főleg ecetsav képződik. Acetogén fázisnek nevezik ezt a szakaszt (Acetil-S-CoA), mert mikrobiális úton ecetsav képződhet közvetlenül széndioxidból és hidrogénből is.— A befejező szakasz a metánképződés, amely molekulánként legalább egy ATP képződésével jár. Ebben a fázisban az ecetsav, valamint a C-1 töredékek: metanol, formaldehid, formiát, metilamin szolgáltatják az alapanyagot a metánképződéshez, de a jelenlevő széndioxid és hidrogén is metánná alakul. Innen származik a metanogén fázis elnevezés. A négy szakasz természetes körülmények között térbelileg nem különül el, ezért a metánképződés sohasem éri el a célüzemekben, illetve laboratóriumokban megvalósítható teljesítményt. Itt ugyanis a négy szakaszt térben elkülönítve, két reaktorban folytatják le, ami az optimális rekciókörülmények biztosítását lehetővé teszi. Az ősbaktériumok és az eubaktériumok biokémiai és élettani különbségeit ismerve nem csodálkozhatunk azon, hogy az anaerob szennyvíztisztítás technológiájának kialakításakor a két szakasz térbeli szétválasztására törekedtek. Ezzel a lebontandó szerves anyag összetételétől többé-kevésbbé függetlenné vált a metánképződés. A rendszert tovább fejlesztve a lassan szaporodó metanogének porózus üveggyűrűre rögzítésével olyan sejttömeget lehet a biogázt termelő reaktorban felhalmozni, amely a térfogategységre vonatkoztatott aktivitást a gazdaságosság szintjére emeli. A képződő metán a rendszer működtetéséhez szükséges energiaigényt bőven fedezi. Az első reaktorban egymás tevékenységét segítő mikroaerofil, fakultatív anaerob és szigorúan anaerob baktériumk konzorciuma működik. Ezek széles pH tartományban képesek osztódni, mégpedig a baktériumokra jellemző 30 perces generációs idővel. Zömmel mezofilek, optimális hőmérsékletük 35 oC. A jelenlevő oxigéntűrő szervezetek rövid idő alatt felhasználják a kezdetben jelenlevő oxigén nyomait is. Az első reaktor konzorciuma a nagy molekulák (polimerek) hidrolízisét, szerves savak, alkoholok akár C-1 töredékekig való lebomlását, széndioxid és hidrogén képződését teszi lehetővé. Ezzel előkészítik a fermentációs körülményeket az acetogén és metanogén fázis számára. A hidrogén az anaerob, illetve fakultatív anaerob szervezetekben folyó fermentáció végtermékeként jelenik meg. Fontos szerepet kap a bélbaktériumokban működő hangyasav dehidrogenáz és a piruvát-formiát liáz H3C-CO-COOH + CoA-SH —> acetil-S-CoA + HCOOH HCOOH —> H2 + CO2 A Clostridium-okban a foszforoklasztikus reakciót segíti a ferredoxin hidrogenáz
piruvát + szervetlen-foszfát
ferredoxin-hidrogenáz ———————————> acetilfoszfát + H2 + CO2 ox red ferredoxin
231
A Clostridiumon kívül hidrogént termelnek még többek között az Eubacterium, a Peptococcus és az Aerobacter fajok. Az itt tevékenykedő mikroorganizmusok gyorsan szaporodva hatásosan képesek alkalmazkodni a szubsztrátum minőségében bekövetkező változáshoz. Ezt az alkalmazkodóképességet a technológiai paraméterek szabályozásával segíteni lehet. Nyilvánvaló, hogy a szennyvíz kémiai összetételének állandó volta nagy mértékben képes fokozni a rendszer működésének biztonságát és gazdaságosságát. Ezért ezeket a szennyező anyagra optimalizált technológia szerint működő reaktorokat közvetlenül a szennyvizet termelő üzem mellé telepítik, és ezzel a kommunális szennyvíztisztító berendezéseket tehermentesítik.
A vázlatrajzon követhetően az Uhde/Schwarting anaerob szennyvíztisztító eljárás egy fakultatív anaerob mikroorganizmusok hatásos savanyító tevékenységét biztosító BO1 jelű fermentorban bontja le a szennyvíz szervesanyagtartalmát. A fermentlé hőmérsékletét 35 °C-on tartja a beépített WTO1 hőcserélő, amelynek hatásfokát a TIC szabályzó ellenőrzése alatt működő VO2 szelep befolyásolja. Az optimális pH (4,5-5,5) beállítását az LI szabályzó végzi. A szennyvíz betáplálása a PO1 szivattyú feladata. A fermentlé a VO1 szelep állásától függő ütembe kerül át az obligát anaerob ősbaktériumokat foglalkoztató BO2 fermentorba, amelynek optimális hőmérsékletét (55 °C) a VO3 szelep által ellenőrzött WTO3 hőcserélő állítja. A második reaktorban az ősbaktériumok az előbbiből származó elegyet ecetsavvá, végül pedig metánná és széndioxiddá alakítják. Az acetogén és a metanogén funkciót végző szigorúan anaerob, termofil baktériumok közössége különleges tulajdonságú, lassú növekedésű fajokból áll össze. A generációs idő harminc órától harminc napig változhat, amit az itt működő (Archaeobacteria) baktériumfajok biológiai tulajdonságai határoznak meg. Legismertebb rendszertani csoportként a Methanobacteriales rend említhető. A rendszer optimalizálásával és egy kisméretű aerob utóreaktor működtetésével, a tisztított szennyvíz az üzemen belül újra felhasználhatóvá válik. A tisztítás hatásfokának látványos bizonyítékaként Japánban aranyhalakat tenyésztenek a tisztított szennyvízben. A két fermentor között szűkség esetén a PO2 szivattyú teremt kapcsolatot, amely a perforált lemezzel szétválasztott BO3 fermentorból nyert sejtmentes lével képes higítani a BO1 fermentor tartalmát. A BO2 fermentorban képződő tisztított szennyvíz a WTO2 hőcserélőn keresztül hagyja el a rendszert, amely a BO1-ből a BO2 fermentorba átfolyó fermentlevet előmelegíti. Mindkét fermentorból a komposztálásra kerülő leülepedő mikroorganizmusokat egy-egy csavarszivattyú távolítja el. A fermentorokban képződő biogáz metántartalma gázmotor működtetésével megtermeli a rendszer működtetéséhez szűkséges elektromos energiát. Mindkét fermentorból a kiülepedő, komposztálandó mikroorganizmusokat egyegy csavarszivattyú távolítja el. A tápanyagokként hasznosuló nitrogéntartalmú vegyületek lebontása - a sejt anyagainak felépítéséhez szükséges szerves nitrogénigényen felül - jelentős ammóniaképződéssel jár. Ezért a biogázban a lebontandó szerves anyag összetételétől függően mindig találunk több-kevesebb ammóniát. Ammóniában dús szennyvíz tisztítása erre a célra kialakított nirtrifikációt és denitrifikációt végző sorba kapcsolt egységek működtetését igényli. A nitrifikáció során aerob körülmények között a Nitrosomonas törzsek az ammóniát nitritig, a Nitrobacter nemzetség pedig nitrátig oxidálja. 2 H+ + H2O + NO2– ∆H = –301-től –352 kJ NH4+ + 1,5 O2 NO2 + 0,5 O2 NO3 – ∆H = –65 –től – 88 kJ
232
Anaerob körülmények között a két faj asszociátuma egymást segítve a nitrátlégzés terhére végzi az ammónia oxidációját 5 NH3 + 3 NO3– 4 N2 +9 H2O + 2 H+ ∆G° = –1483 kJ
Ammóniában gazdag szennyvíz denirifikálását végzõ eljárás folyamatábrája A denitrifikáció szigorúan anaerob körülményeket igényeL. Elektronforrásként a szennyvíz dehidrogénezhető szénforrása szolgál. A folyamatábrán metanol szerepel oxidálható szubsztrátumként NO3– + 6H+ + 5 e– NO2– + 0,5 CH3OH
A denitrifikáló egységben Thiobacillus denitrificans, Micrococcus denitrificans, Pseudomonas, Serratia, Achromobacter nemzetség elektron akceptorként nitrátot használó törzsei végzik. 2 NO3 > 4 e- > 2 NO2 > 4 e- > 2 NO > 2 e- > N2O > 2 e- > N2 Az anaerob folyamat közben jelentős energia szabadul fel, amely a műveletet végző szervezetek számára a szénforrás gazdaságos hasznosítását jelenti.
nitrifikáló egységek vázlatrajzai A nitrifikáló egységekben a levegőztetés hatékonyságát toronyreaktorok kifejlesztésével és megfelelő levegőztető fúvókák alkalmazásával lehet fokozni. A levegőztetett reaktor általában 15-20 méteres toronyként magasodik a felszín fölé, de gyakran süllyesztik a felszín alá. A Ilyen berendezésben a finom eloszlásban bejuttatott levegő oxigéntartalmának 70-80 %-a a légbuborék úthosszával arányosan felhasználásra kerül A levegőztetett reaktor után elhelyezett ülepítőből távozik a kezelt szennyvíz. A kiülepedett aktív biomassza egy része a levegőztetett reaktorba visszatáplálva növeli annak a teljesítményét. Az ülepítő hatásfokát mechanikai úton (végtelenített szalaggal) lehet javítani. A tápközeg kéntartalma is redukált formában van jelen a reakciótérben. A sejttömeg kifejlődéséhez szükséges mennyiségen felül a kénhidrogén egyrészt a gázfázisban a biogáztelepek jól ismert illataként jelentkezik, másrészt a jelenlevő fémekkel reagálva fémszulfidok alakjában kicsapódik, ami a szennyvíziszap (zagy) fekete színét okozza. A kénhidrogén toxikus hatása zavarhatja a rendszer működését, amit mésztej adagolásával lehet kivédeni 233
Megoldandó kérdés még, mi történjék a feleslegben képződő sejttömeggel? Az első reaktor eubaktérium sejtjei - inaktiválás után - állattápszerként jól hasznosíthatók. A második reaktor baktériumtömege azonban zömmel az ősbaktériumok csoportját képviseli. A bennük nagy mennyiségben előforduló fitanil-éter származékok miatt inkább talajerő pótlóként célszerű hasznosítani. Ez a vegyületcsoport ugyanis a talaj mikrobaközössége számára jól használható, a magasabb rendűek viszont szerény enzimkészletükkel nem képesek hasznosítani. A városi (kommunális) szennyvíz korszerű tisztítására példaként szerepeltethető a FARE segélyből Debrecenben épített tisztítómű, amely a város teljes szennyvíz mennyiségének (50000 m3 /nap) tisztítását a szigorú EU szabványnak megfelelően végzi. A kialakított rendszer a levegőztetett aerob és fakultatív anaerob tisztítási műveletet, valamint a metanogéneket foglalkoztató szigorúan anaerob reaktorok tevékenységét egységes rendszerben önfenntartó módon működteti.
A Debrecenben megépített szennyvíztisztító vázlatos rajza
A szennyvíztisztító mikroflórája és faunája változatos. Az ősbaktériumok és az eubaktériumok mellett egysejtűek, gombák és algák konzorciumának tekinthetők. Az aerob körülmények között szaporodó szervezetek nagyobb hányada elpusztulva az anaerob szakasz tápanyagforrásaként hasznosul. A képződött metán gázmotorokkal működő áramfejlesztői a centrifugák, a légkompresszorok, a rendszert mozgató átemelő szivattyúk, és szárító berendezések energia igényét bőven fedezi. A vázlatrajzon látható, hogy az anaerob fázis után a tisztított szennyvízzel a városból bejutó szennyet optimális értékre hígítják. A tisztított lé csak a levegőztető medence után található utóülepítőn keresztül hagyhatja el a telepet.A biogázt termelő reaktor térfogatra számított teljesítménye jelentősen növelhető, ha a mikroszervezetek konzorciuma porózus üvegágyra .(Siran; Schott, Mainz) telepedve fejtik ki porozus Siran üvegfelületen fejlõdõ metanogén aktivitásukat. A térfogategységben levő aktív Methanobacterium és Methanosarcina tenyészet baktérium tömeg mennyisége egy nagyságrenddel növelhető. A tisztítóműben képződő mikroorganizmusok az anaerob szakasz után elhelyezett iszapvíztelenítő berendezésen keresztül kerülnek komposztálásra. Az actinomycesek közé sorolt mikroszervezetek pótolhatatlan szerepet játszanak a komposztálás folyamatában a növényi poliszacharidok ( cellulóz, hemicellulóz, lignocellulóz) lebontásával. A növényi
234
lignocellulóz felépítettségéből következően nehezen lebontható. A szorosan kötegekbe rendezett cellulóz láncokhoz rövidebb hemicellulóz egységek tapadnak. Ehhez kapcsolódnak extenzinek közvetítésével a savas karakterű pektin láncok. Az egész képződményt a lignin (fenilpropán egységekből álló polimer) szilárdítja az egyes növénycsoportokra jellemző lignocellulózzá. Lignocellulózt bontó mikroszervezetek természetes élőhelyükről különleges dúsító eljárással izolálhatók. Ilyen dúsító táptalaj összetétele lehet 100 ml desztillált vízben oldva 0.1 g NaNO3; 0.1g K2HPO4; 0.03g KCl; 0.05g MgSO4.7H2O; 0.05 g élesztőkivonat; 0.05g pepton; 1 g Macherey Nagel 300-as kristályos cellulózpor; 2 g agar-agar A mikroelem igény kiegészítése céljából 0.1 ml baktérium mentesre szűrt nyomelem oldat adagolása (1000 ml desztillált vízben oldva 100mg MnCl2.4H2O; 100mg CoCl2; 10mg CuSO4; 10mg Na2MoO4.2H2O; 20mg ZnCl2; 5mg LiCl; 5mg SnCl2.2H2O; 10mg H3BO3; 20mg KBr; 20 mg EGTA, 8mg NaFe3+-trihidrát) szükséges. Ha a tenyésztést 44–60°C tartományban végezzük, akkor a cellulózt hasznosító törzsek kiemelésére van lehetőség. A 8-10 nap után izolálható telepek közül hatásos törzsek izolálhatók. Ezek tisztasága többszöri hígítás után karboximetilcellulózt tartalmazó táptalajra szélesztve igazolható. A telep körül képződő kráter a CMC bontó aktivitásról tudósít. Gyakorlati példaként vizsgáljuk meg a Lehrter Zucker AG (D-3160 Lehrte) szenny-víztisztító rendszerének a működési adatait. Ez az üzem naponta 2000 m3 szennyvizet termel amely átlagban 7000 mg/l (BOI) biológiailag oxidálható szerves anyagot tartalmaz. A nagy szervesanyagtartalmú szennyvízet (1) két hőcserélőn (2) átvezetve a metántermeklő szakasz optimális hőmérsékletére melegítik fel részben az üzemből származó ipari vizzel (3), illetve a bepárlóból származó (4) kondenzátummal. A vasbetonból készült 3 kamrás összesen több mint 5000 m3 hasznos térfogatú anaerob reaktor (5) némi denitrifikáció mellett naponta 7500 m3 gázt termel (80% metán tartalommal), miközben az oxidálható szerves-anyag tartalom 1500 BOI-értékre csökken. A nitrtifikációt is végző aerob szakasz (11) céljára szolgáló, 3500 m3 térfogatú, levegőztetett reaktorban 1000 m3/óra levegő átfúvásával a tisztított szennyvíz oxidálható szervesanyag Folyamatábra a répacukorgyárból származó denitrifikálandó szennyvíz tartalmát 80-100 BOItisztítására egységre csökkentik. Az aerob szakasz után egy végső denitrifikáló térben (10) találkozik az anaerob köztesülepítőből származó előtisztított szennyvíz és az utóülepítőből származó (8) eleveniszap, valamint a nyerscukor sűrítőből származó, a hőcserélőn átvezetett még meleg kondenzátum (4). A metánt fermentáló reaktorban a biomassza leülepedését a gáztartályból visszavezetett biogázzal (16) akadályozzák meg. A metánreaktorból egy köztes gázmentesítő kamrán (6) átvezetve kerül a részben tisztított szennyvíz a köztes ülepítőbe (7). Az itt felgyűlő eleven iszap nagy része (8) visszakerül a metántermelő (5) reaktorba. A fölösleg (9) szárításra kerül. Az anaerob fázisban képződő biogáz egy részét a gáztartály (15) gyűjti, a gáz nagyobbik hányada (18) teljes mértékben fedezi a 850 m3 térfogatú utótisztítóban (13) felhalmozódó, illetve a köztes ülepítőből származó mikroszervezetek (9) szárításához szükséges energiát. A biogáz rendszert az elmaradhatatlan biztonsági fáklya (17) zárja. A tisztított szennyvíz, mely a kiindulási szerves anyag tartalom alig két százalékát tartalmazza az utóülepítőből kerül (14) a környezetbe. (D betü jelzi a rendszer azon szakaszait ahol denitrifikációt igénylő szennyezés még előfordul.)
235
Az elhangzott előadások szakmai anyagára vonatkozó kérdések Mit nevezünk antibiotikumnak? Mi az antibiotikumok szerepe? Miért képződnek? Az azetidinon antibiotikum miért képződik az idio fázisban, miért nem a növekedési fázisban? Mi a hasonlóság, ill. a különbség az ACV tripeptid és a glutation között? Milyen penicillin építőelemek képződéséhez szükséges a NADPH ? A cephalosporin-C bioszintézist katalizáló enzimek felsorolása Milyen módszert ismer a 6-aminopenicillansav előállítására? Milyen Gram– baktérium növekedését gátló penicillin származékot ismer? Mit tud a penicillin hatásmódjáról? A penicillin rezisztencia megjelenése, hogyan sikerült a rezisztencia leküzdése? Mit tud a vancomycin hatásmódjáról? Mit tud a vancomycin rezisztencia megjelenéséről? A peptidoglükán sejtfal képződést a periplazmikus térben katalizáló enzimek működését hatásosan befolyásoló hatóanyagok: UDP-glükózamint hasznosító glükozidáz működését gátló ramoplanin transzglikozidázt gátló moenomycin transzpeptidázt gátló azetidinon származékok izoprenil-PP foszfatázt gátló bacitracin Milyen kötést hidrolizál a lizozim? Milyen kötést hidrolizál a penicillináz, (ß-laktamáz)? Milyen kötést hidrolizál a penicillin-amidáz, (penicillin-aciláz)? Hogyan befolyásolja a baktérium szaporodást a ciklo-szerinamid (cikloszerin)? Hogyan befolyásolja a baktériumszaporodást a foszfonomycin? Milyen perorálisan alkalmazható penicillin származékot ismer? 7-amino-dezacetoxi-cephemsav származék előállításának lehetősége? A penicillin előállítás szolgáló eljárás vázlata:[fermentációs lépés és kinyerés] Miért előnyös szénforrás a Penicillium chrysogenum esetében a tejcukor? Miért előnyös szénforrás az Acremonium chrysogenum esetében a növényolaj? Miért előnyös nitrogénforrás a kukoricalekvár (cornsteepliquor)? Miért előnyös a termelő (idio) fázisban az ammoniumszulfát A penicillin előállítás szolgáló eljárás vázlata:[fermentációs lépés és kinyerés] Miért előnyös szénforrás a Penicillium chrysogenum esetében a tejcukor? Miért előnyös szénforrás az Acremonium chrysogenum esetében a növényolaj? Miért előnyös nitrogénforrás a kukoricalekvár (cornsteepliquor)? Miért előnyös a termelő (idio) fázisban az ammoniumszulfát A prekurzor használatának jelentősége? Fred Griffith tevékenysége: 1929 Streptococcus pneumoniae
Kórokozó, fertőző csírák elleni küzdelem Marcus Terentius Varro Ad 116—30 Titus Laurentius Carus Ad 96—55 Középkor: Ellenőrizhetetlen ősnemződés, titokzatos miazmák feltételezése, Füstölés, elkülönítés, varázslás, csodatévők, csodavárók Istencsapás ellen; közös ima, fogadalmi építmény, hála szobor, Athanasius Kircher 1602—1680 mikróbák járványokat okozhatnak Carolus Linnaeus 1707—1778 „Chaos”-ba sorolt hat faj Christian Gottfried Ehrenberg 1785—1876 (Az 1838-as Atlas-ban 600 typus) Robert Koch 1843—1910 B. anthracis patogenitásának igazolása 1876 Paul Ehrlich 1854—1915 haematologia; immunitás; chemotherapia „Corpora non agunt, nisi fixata” Hatásos vérszint kialakulása: Felszívódás >>>>>>>>>>> Kiválasztás, Bomlás Hatásos dózis: ED50 — Toxikus dózis LD50 MIC érték
236
Antibiotikumok kora Zsoltárok könyve 51,4—51,9 Kinai feljegyzések; Szóján növekedő penész furunkulus ellen hatásos. 1870—Roberts: Penicillium glaucum tenyészlevében nem nő a baktérium 1896— B.Gosio: Penicillium által termelt Mycophenol gátolja a B. anthracis növekedését 1899—R.Emmerich, O. Low: Pyocyanase gátolja az Anthrax bacillus növekedését 1929—Alexander Fleming: Penicillium notatum gátolja a Staphylococcus növekedését 1932—Clotterbuck: labilis pH és hőérzékeny anyag 1939—Chain, Florey: savanyú extrakció Sóképzés, liofilezés, Oxford egység 0.6 µg Na-só gátolja 50 mL Staphylococcus növekedését Abraham: a gyógyító hatás igazolása, enzimes inaktiválás (penicillináz?) A. E. Oxford: Penicillium griseofulvum fungistatikumot termel R. J. Dubos: Tyrocidin (gramicidin) Bacillus brevis tenyészlevében 1940—S. A. Waksman Actinomycin Streptomyces antibioticus 1944—S. A. Waksman Streptomycin Streptomyces griseus 1943—Wisconsin Univ. (David Perlman) kristályos termék 1945—Crowfoot & Low: kémiai szerkezet ismertetése
