Synthese van specifiek isotoop gelabelde carotenoïden

Synthese van specifiek isotoop gelabelde carotenoïden. O OH

HO O

Onderzoek uitgevoerd tijdens de stage bij de groep Bio Organische Fotochemie van Prof. Dr. J. Lugtenburg & Dr. J. Raap Universiteit Leiden Poerya Partovi Augustus 1999

Inhoudsopgave Pag.

Afkortingen

3

1

Inleiding

4

2

Synthese

2.1 2.2 2.3

Inleiding Experimenteel Proefsynthese

7 8 9

2.4

Synthese route van C13-Wittigzout

10

2.5

C13-Wittigzout

11

2.6

Synthese route van C14-dialdehyde

17

2.7

C14-dialdehyde

18

2.8

Synthese van Canthaxanthine

20

3

Karakterisatie

21

4

Discussie & Resultaten

22

5

Conclusies

23

6

Toekomstplan

24

Referenties

25

Nawoord

26

Bijlagen

27

2

Bio Organische Fotochemie, Universiteit Leiden

Poerya Partovi

Afkortingen:

n-BuLi CDCl3 DCM Dibal-H DIPA Et EtoAc Ether HMPA LDA M m MCPBA Me NMR PCC PE Ph ppm s t THF TLC TMS TBDC

3

n-Butyllithium Deuterochloroform Dichloormethaan Di iso butyl aluminium hydride Di-isopropylamine Ethyl Ethylacetaat Diethylether Hexamethyl phosphor triamide Lithium di-isopropylamine Molair Multiplet 3-chloorperbenzoëzuur Methyl Nuclear Magnetic Resonance Pyridinium chloorchromaat Petroleumether Phenyl Parts per million Singlet Triplet Tetrahydrofuraan Thin Layer Chromatography Tetramethylsilaan Thexylbroom boraan dimethyl sulfide complex


Poerya Partovi

1

Inleiding:

Carotenoïden Carotenoïden zijn natuurlijke pigmenten, die bij vele processen in de natuur een belangrijke rol spelen. Deze moleculen hebben een basiskelet van onverzadigde koolstofatomen. Hun intense kleur wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van een lange geconjugeerde polyeenketen. Er zijn in totaal circa 600 verschillende carotenoïden bekend. Veel van de heldere gele, oranje en rode kleuren van planten, insecten, vogels en andere dieren zijn afkomstig van carotenoïden. Enkele bekende voorbeelden van carotenoïden zijn: lycopeen (de rode kleur van tomaat), astaxanthine(de rode en de roze kleur van gekookte kreeft, zalm en flamingo's) en vitamine-A. 1,2,3,4,5

O OH

HO O

CH2OH

Figuur1 : De carotenoïden lycopeen, astaxanthine en vitamine A. In de natuur komen eiwitten voor met een carotenoïde als prosthetische groep: de carotenoproteïnen. Een voorbeeld van zo'n complex is α-crustacyanine. Dit eiwitcomplex bevat het carotenoïde astaxanthine. α-crustacyanine is een octameer van dimeren. In totaal bevat 1 mol α-crustacyanine 16 mol astaxanthine. De dimeer waaruit α-crustacyanine is opgebouwd; ß-crustacyanine is weergegeven in Figuur 2.

4


Poerya Partovi

Figuur 2: Astaxanthine in het ß-crustacyanine (eiwit). De zeekreeft heeft een blauwe kleur, die wordt veroorzaakt door het in het schild aanwezige carotenoproteïnencomplex α-crustacyanine. Als de kreeft gekookt wordt, wordt het schild rood. Deze kleurverandering wordt veroorzaakt doordat bij koken het α-crustacyanine denatureert, waardoor het in het carotenoproteïnencomplex aanwezige astaxanthine vrijkomt. Astaxanthine is blauw (λ max = 628 nm) als het aan het α-crustacyanine gebonden is rood (λ max = 481 nm) in vrije vorm. Bij binding van het astaxanthine aan het α-crustacyanine treedt dus een bathochrome verschuiving in het absorptiespectrum van 147 nm op. 6

Figuur 3: UV- absorptie spectroscopie van astaxanthine in α-crustacyanine en in vrije vorm (oplossing in n-hexaan). Om het mechanisme van deze verschuiving te kunnen ophelderen is informatie op atomair niveau nodig over de structuur van het astaxanthine in het eiwit. 5


Poerya Partovi

Om deze informatie te verkrijgen wordt α-crustacyanine, waarvan het astaxanthine specifiek isotoop gelabeld is, onderzocht met niet-destructieve, niet-invasieve, isotoopgevoelige technieken zoals NMR- en Resonantie Ramanspectroscopie. De hier benodigde specifiek gelabelde eiwitcomplexen worden verkregen door specifiek gelabelde carotenoïde te synthetiseren en deze te incorporeren in de eiwitcomplexen. 7,8,9

Figuur 4: Kreeft na (rood) en voor (blauw) het koken.

Vooruitblik: In het hoofdstuk 2 geef ik een inleiding over het synthese en synthese routes en experimentele beschrijving van iedeer stap en koppeling van C13 en C14. In het hoofdstuk 3 bespreek ik in het kort NMR-techniek en geef ik een korte karakterisatie van 1H NMR-spectra van α-chloorethylacetoacetaat. In het hoofdstuk 4 komt de discussie en resultaten aan orde. Vervolgens in het hoofdstuk 5 komt de conclusie. In het hoofdstuk 6 vertel ik iets over het een nieuw route (toekomstplan) om C14-dialdehyde te maken. 6


Poerya Partovi

2

Synthese

2.1 Inleiding: Het is de bedoeling om een route te maken om astaxanthine 32 te maken en op alle plaatsen te kunnen labelen. Vrijwel alle in de natuur voorkomende carotenoïden hebben een zelfde centraal C10-gedeelte. Vaak maakt men gebruik van de C15+C10+C15 strategie, om carotenoïden te maken. Ik ben van een langer centraal gedeelte uitgegaan, namelijk het C14-aldehyde 22. Bij de synthese van carotenoïden heb ik van de C13+C14+C13 strategie gebruik gemaakt, met C14-dialdehyde 22 voor het centraal gedeelte. Dit synthon werd in specifiek gelabelde vorm gesynthetiseerd. Er is gekozen voor de C13+C14+C13 strategie omdat de C15-ring en C10-ring problemen gaven in de synthese. Met de nieuwe route (C13+C14+C13 strategie), kan een hogere label opbrengst gehaald worden, wanneer het label in de ring komt, eventueel via een kortere en efficiëntere route.

O

O

22

C14 dialdehyde

Vervolgens word een C13-Wittigzout 16 gemaakt, dat ook op alle posities gelabeld kan worden.

+

C13 Wittigzout

-

PPh3 Br

16 O

Men kan nu met 2.2 eq. van het Wittigzout en 1 eq. van het C14-dialdehyde canthaxanthine 31 maken. O 19 16 2 3

17 1 4

O 7

7

6 5 18

11

9 8

18'

20

10

15

13 12

14

14' 15'

12' 13' 20'

Canthaxanthine


10' 11'

5' 6'

8' 9' 19'

7'

31

4' 1'

17'

Poerya Partovi

3' 2' 16

O 19 16 2 3

HO

17 1 4

7

6 5

11

9 8

18'

20

10

15

13 12

14

14' 15'

18

12' 13' 20'

10' 11'

5' 6'

8' 9'

7'

19'

4' 1'

OH 3' 2'

17'

16'

O

Astaxanthine

32

Er werd namelijk een route opgesteld om canthaxanthine 31 te maken. Het verschil tussen astaxanthine 32 en cantaxanthine 31 zijn de hydroxy-groepen op posities 3 en 3' in de ring.

De gelabelde verbindingen moeten aan de volgende voorwaarden voldoen: 1. Bij de synthese moet worden uitgegaan van zeer eenvoudige uitgangstoffen zoals aceton, acetonitril, azijnzuur, methyljodide en paraformaldehyde, die op elke gewenste positie of combinatie van posities in 99% 13C verrijkte vorm commercieel verkrijgbaar zijn. 2. De syntheseschema's moeten voor de kostbare gelabelde verbindingen een zo hoog mogelijke opbrengst hebben. 3. Er mag geen 'scrambling' optreden; dit wil zeggen dat er tijdens de reactie geen uitwisseling van het label met een andere positie in het molecuul mag optreden. 4. Er mag geen isotoopverduning optreden, het produkt moet hetzelfde percentage isotoopverrijking hebben als de gebruikte gelabelde uitgangstof (-fen).11

2.2 Experimenteel: Algemeen: Alle oplosmiddelen zijn voor gebruik gedestilleerd. Bijna alle reacties werden uitgevoerd onder droge omstandigheden en onder stikstof. Chemicaliën werden verkregen bij Aldrich, Janssen en Acros. Voor dunne laag chromotografie (TLC) werd gebruik gemaakt van Merck kiesel 60 F254, voor kolomchromotografie van Merck silicagel 60 (230-400 Mesh). De 200 MHz 1H-NMR spectra zijn opgenomen met een JEOL NM 200 spectrometer, waarbij tetramethylsilaan (TMS) als interne standaard is gebruikt. 8


Poerya Partovi

2.3

Proefsynthese:

Om met het praktisch werk te beginnen heb ik twee proef syntheses gedaan. Allereerst werd van ethylacetoacetaat heb ik chlooraceton gemaakt.

O

O

O

O

SO2Cl2

O

1

O

99,6 %

Cl

2

15,8 ml (26,5 g, 196,7 mmol) sulfurylchloride werd bij 0 ºC langzaam toegedruppeld aan 25 ml (25,5 g, 196,1 mmol) ethylacetoacetaat. De reactie werd overnacht geroerd. Vervolgens werd de reactie op TLC (20% ether/petroleumether) gevolgd. Daarna werd de reactie gestopt met een verzadigde NaCl-oplossing en dan 3x geëxtraheerd met ether/dichloormethaan, gewassen met NaCl, gedroogd op K2CO3, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Er werd 32,2 g (195,3 mmol, 99,6 %) α-chloor-ethylacetoacetaat verkregen.

O

O

H+

O Cl

2

O Cl

3

5 g (30,4 mmol) α-chloor-ethylacetoacetaat werd opgelost in 100 ml THF. Vervolgens werd 5 ml water en 6,5 ml gec. zwavelzuur toegevoegd. De reactie werd overnacht geroerd. Daarna werd de reactie op TLC (20% ether/petroleumether) gevolgd. Vervolgens werd de reactie gestopt met een verzadigde NaCl-oplossing en dan 3x geëxtraheerd met ether, gewassen met NaCl (aq) gedroogd op K2CO3, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper werd ether afgedampt. Daarna werd het produkt in THF bewaard.

9


Poerya Partovi

2.4

Synthese route van C13-Wittigzout: O

O

5 CN

(EtO)2P

4

LDA

CN

6

87%

98%

CH3NO2 / gec. H2SO4

CN

CN

LDA 91%

9

OH

CN

MCPBA

8

72%

O

7

51%

PCC

CN CN

Dibal-H

HOCH2CH2OH HC(OMe)3 99% pTsOH

O

O

10

O

O

67%

O

O

12

11

74%

Aceton / NaOH

OH

O

Dibal-H

14

O 78%

O 48%

O

O

13

H+

+

OH

PPh3.HBr

15 10

O


-

PPh3 Br

O

16 Poerya Partovi

2.5

Synthese van Wittigzout:

O

O

(EtO)2P LDA

4

5 CN 87%

CN

6

1,35 ml (0,91 g, 9 mmol) diisopropylamine (DIPA) werd in 25 ml tetrahydrofuran (THF) opgelost en gekoeld tot -20 ºC en 5,3 ml (1,6 M oplossing in hexaan) n-BuLi (8,5 mmol) werd toegevoegd. Na 10 min. roeren werd met vloeibare stikstof en een ethanolbad tot -80 ºC gekoeld. Vervolgens werd 0,29 ml acetonitril in 3 ml THF toegevoegd. Na 15 min. roeren bij -80 ºC werd 0,79 ml (5,5 mmol, 0,95 g) diethylchlorofosfaat 5 toegevoegd. De reactie werd in 1 uur tot 0 ºC opgewarmd. 0,74 ml (0,63 g, 5 mmol) 6-methyl-5-hepteen-2-on 4 werd in 5ml THF opgelost en toegevoegd. Na lange tijd roeren bij kamertemperatuur, werd de reactie op TLC (25% ether / petroleumether) gevolgd. Vervolgens werd de reactie gestopt met een verzadigde NH4Cl-oplossing en dan 3x geëxtraheerd met ether en gewassen met een verzadigde NaCl-oplossing, gedroogd op MgSO4, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (25% ether / petroleumether) gezuiverd. Er werd 0,65 g (4,36 mmol; 87 %) 3,7-dimethyl-2,6octadieennitril 6 gewonnen.

CN

6

CH3NO2 / gec. H2SO4

98%

CN

7

20 ml gec. H2SO4 werd in CH3NO2 bij 0 ºC toegevoegd. 23,4 ml (20,0 g, 134 mmol) 3,7dimethyl-2,6 octadieennitril 6 werd bij 0 ºC in 80 ml CH3NO2 toegevoegd. Er ontstond een oranje troebele oplossing. Er werd 30 min. geroerd. Nadat de reactie volgens TLC-analyse (10% ether / petroleumether) compleet was, werd er 200 ml H2O toegevoegd en vervolgens 3x geëxtraheerd met ether. De organische laag werd met een verzadigde NaCl-oplossing 2x gewassen, 1x met weinig NaOAc (aq), en vervolgens gedroogd op MgSO4 en ingedampt. Er werd 20,0 g (134 mmol, 98 %) α-cyclonitril 7 verkregen.

11


Poerya Partovi

CN

7

CN

MCPBA

72%

8

O Een oplossing van 4,17 g (28,0 mmol) α-cyclonitril 7 in 40 ml ethylacetaat werd toegevoegd aan 8,4 m-chloorperbenzöezuur in 40 ml ethylacetaat bij 0 ºC. Het reactiemengsel werd het hele weekend bij kamertemperatuur geroerd. De oplossing werd ingedampt en daarna werd 100 ml petroleumether (40-60 ºC) toegevoegd. Vervolgens werd langzaam bij 0 ºC, 2,7 g triethylamine toegevoegd. Na 10 min. roeren werd het mengsel over silicagel afgefiltreerd en de silicagel gewassen met 25 % ether / 3% triethylamine / petroleumether en ingedampt. Er werd 3,32 g (20,1 mmol, 72 %) 2,3-epoxy-2,6,6-trimethylcyclohexaancarbonitril 8 verkregen.

CN

8

CN

LDA

9

91%

O

OH

30 mmol lithiumdiisopropylamide (LDA) (2,4 g, 32 mmol, diisoproylamine en 14,1 ml, 30 mmol 1,6 M, n-BuLi) werd in 50 ml droge THF gemaakt bij -80 ºC. Vervolgens werd 3,2 g (26,6 mmol) 2,3-epoxy-2,6,6-trimethylcyclohexaancarbonitril 8 opgelost in 10 ml droge THF en werd langzaam toegedruppeld bij -40 ºC. Het reactiemengsel werd opgewarmd tot kamertemperatuur. De reactie werd afgebroken met een verzadigde NH4Cl-oplossing en dan 3x geëxtraheerd met ether en 3x gewassen met een verzadigde NaCl-oplossing, gedroogd op MgSO4, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Er werd 2,96 g (18,2 mmol, 91 %) 3-hydroxy-2,6,6-trimethy-1-cyclohexeencarbonitril 9 verkregen.

12


Poerya Partovi

CN

CN

9

10

PCC

51%

OH

O

2,62 g (16,1 mmol) 3-hydroxy-2,6,6-trimethy-1-cyclohexeencarbonitril 9 werd opgelost in 20 ml droge dichloormethaan (DCM) en werd bij 0 ºC langzaam toegedruppeld aan een suspensie van 1,72 g (4,74 mmol) pyridinium chlorochromaat (PCC) in 80 ml droge dichloormethaan. Het reactiemengsel werd opgewarmd tot kamertemperatuur. De reactie werd gevolgd op TLC (80% ether/petroleumether). Daarna werd gekoelde ether aan het mengsel toegevoegd en voor 15 min. geroerd totdat een suspensie van PCC in de kolf overgebleven was. De org. Laag werd afgefilteerd en de prosedure werd 3x herhaald. De organische laag werd gedecanteerd en 2x gefiltreerd over silicagel en de silicagel werd gewassen met ether. Er werd 1,36 g (8,3 mmol, 51 %) 3-oxo-2,6,6-trimethyl-1cyclohexeencarbonitril 10 gemaakt.

CN

CN

10

11

HOCH2CH2OH HC(OMe)3 99% pTsOH

O

O

O

Aan een mengsel van 1,36 g (8,30 mmol) 3-oxo-2,6,6-trimethyl-1-cyclohexeencarbonitril 10 werd 2,53 ml (16,6 mmol) trimethylorthoformate en 1,36 ml (25 mmol) ethyleenglycol en een spatelpunt p-tolueensulfonzuur toegevoegd. Na 15 min. werd TLC (25% ether/petroleumether) genomen en vervolgens is de reactie met verzadigde NaHCO3oplossing stopgezet. Vervolgens werd 3x geëxtraheerd met ether en gewassen met een verzadigde NaCl-oplossing, gedroogd op MgSO4, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (25% ether/petroleumether) gezuiverd. Er werd 1,69 g (8,1 mmol, 99 %) 2,10,10-trimethyl-4,7dioxaspiro[4,5] dec-1-enecarbonitrile 11 verkregen.

13


Poerya Partovi

CN

11 O

O

Dibal-H 67%

O

O

12

O

1,69 g (8,15 mmol) 2,10,10-trimethyl-4,7-dioxaspiro[4,5] dec-1-enecarbonitrile 11 werd in 60 ml droge petroleumether (40-60 ºC) opgelost en m.b.v. vloeibare stikstof en een ethanolbad afgekoeld tot -60 ºC. 10,56 ml (7,4 mmol) 1M Dibal-H werd met een spuit langzaam toegedruppeld. De reactie werd in 1 uur tot 0 ºC opgewarmd. De oplossing werd afgekoeld tot -20 ºC en er werd een homogeen mengsel van 18,5 g silicagel en 6 ml H2O toegevoegd en 1 uur bij 0 ºC geroerd. Daarna werd K2CO3 en MgSO4 toegevoegd, vervolgens afgefiltreerd, gewassen met ether en ingedampt. Het produkt werd via flashkolomchromatografie (gradiënt elutie 20-50 % ether in petroleumether) gezuiverd. Er werd 1,14 g (5,5 mmol, 67 %) 2,10,10-trimethyl-4,7-dioxaspiro[4,5]dec-1-enecarbaldehyde 12 verkregen.

O O

O

12

O

Aceton / NaOH 74%

O

O

13

0,40 g (1,91 mmol) 2,10,10-trimethyl-4,7-dioxaspiro[4,5]dec-1-enecarbaldehyde 12 werd opgelost in 50 ml aceton (p.a.). Daarna werd 2 ml NaOH (2M) toegedruppeld en 3 uur lang bij kamertemperatuur geroerd. Om ieder 1/2 uur werd TLC (25% ether/ petroleumether) genomen en vervolgens werd de reactie gestopt door toevoeging van een verzadigde NH4Cloplossing. Om de rest van de aceton weg te krijgen, werd aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Vervolgens werd 3x geëxtraheerd met ether/water en gewassen met verzadigde NaCl-oplossing, gedroogd op MgSO4, afgefiltreerd en aan rotatiefilmverdamper ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (gradiënt elutie 20-40 % ether in petroleumether) gezuiverd. Er werd 0,29 g (1,00 mmol, 74 %) 4-(2,10,10-trimethyl-4,7-dioxaspiro[4,5]dec-1-en-1-yl)-3-buteen-2-on 13 verkregen.

14


Poerya Partovi

O

O

O

13

OH

Dibal-H

48%

O

O

14

0,25 g (1 mmol) 4-(2,10,10-trimethyl-4,7-diox-aspiro[4,5]dec-1-en-1-yl)-3-buteen-2-on 13 werd in 50 ml droge petroleumether (40-60 ºC) afgekoeld tot -60 ºC, en vervolgens werd langzaam 1,1 ml (0,8 mmol) Dibal-H (1M) toegevoegd. Het reactiemengsel mag in 1 uur opwarmen tot kamertemperatuur. Vervolgens werd het reactiemengsel tot -20ºC gekoeld. Er werd 1,93 g silicagel/water toegevoegd. Het reactiemengsel werd 1 uur lang bij 0 ºC geroerd. Daarna werd K2CO3 en MgSO4 toegevoegd, afgefiltreerd en de oplossing werd aan rotatiefilmverdamper ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (gradiënt elutie 20-50 % ether in petroleumether) gezuiverd. Er werd 0,125 g (0,6 mmol, 78 %) 4(2,10,10-trimethyl-4,7-diox-aspiro[4,5]dec-1-en-1-yl)-3buteen-2-ol 14 verkregen.

OH

O

O

14

OH

H+

15

78%

O

1,95 g (77 mmol) 4-(2,10,10-trimethyl-4,7-diox-aspiro[4,5]dec-1-en-1-yl)-3-buteen-2-ol 14 werd opgelost in 25 ml aceton. Vervolgens werden 3 druppels HCl (1M) toegevoegd. Na 10 min. roeren werd de reactie op TLC (25% ether / petroleumether) gevolgd. Daarna werd K2CO3 en MgSO4 toegevoegd, afgefiltreerd en aan rotatiefilmverdamper ingedampt. Er werd 1,25 (60 mmol, 78 %) 4-(3-oxo-2,10,10-trimethyl-1-en-1-yl)-3-buteen-2-ol 15 verkregen.

15


Poerya Partovi

+

15 O

-

PPh3 Br

OH

16 PPh3.HBr

O

1,25 g (0,6 mmol) 4-(2,10,10-trimethyl-4,7-diox-aspiro[4,5]dec-1-en-1-yl)-3-buteen-2-on (5,3 mmol) 15 werd met 1,71 g (6,32 mmol) trifenyl-phosphoniumbromide opgelost in dichloormethaan (DCM) en overnacht geroerd. Het produkt werd ingedampt. Er werd ether toegevoegd zodat PPh3Br oplost en het produkt als vaste stof overblijft. Vervolgens afgefilteerd. Het produkt werd in DCM opgelost, vervolgens ingedampt en er ontstond een mooie kristallijne rood vaste stof. Er werd 0,320 g (0,6 mmol, 99 %) 4-(2,6,6-dimethyl-3-oxo1-cyclohexeen-1-yl)-3-buteen-2-yl)-trifenyl- phosphoniumbromide (Wittigzout) 16 verkregen.

16


Poerya Partovi

2.6

Synthese route voor C14-dialdehyde: O (EtO)2 P

17

P(OEt)2 O

LDA O O

O

2 eq.

18

60%

O

19

O O O

H+

81%

O

20

O

O (EtO)2P

CN

5

77%

2 eq.

CN

21

O

22

NC

Dibal-H

65%

O

17


Poerya Partovi

2.7

Synthese van C14-dialdehyde:

18

O

O

(EtO)2 P

17

P(OEt)2 O

LDA

O O

2 eq.

O O O

60%

O

19

9,5 ml (6,9 g, 68 mmol) diisopropylamine (DIPA) werd in 40 ml tetrahydrofuraan (THF) opgelost en met vloeibare stikstof en een ethanolbad gekoeld tot -80 ºC. Daarna werd 40 ml (0,42 mmol) n-BuLi toegevoegd. Na 10 min. roeren werd 10 g (30,5 mmol) difosfonaat 17 opgelost in THF en toegedruppeld. Vervolgens werd 10 ml (10,3 g, 57,5 mmol) hexamethyl fosfortriamide (HMPA) bij -70 ºC toegevoegd. Na een tijdje roeren werd 9,5 ml (9,3 g, 78,5 mmol) pyruvaat aldehyde dimethyl acetaal 18 in THF opgelost en langzaam bij -80 ºC toegevoegd. De reactie werd op TLC (20% ether/petroleumether) gevolgd. Na lange tijd roeren bij kamertemperatuur werd de reactie gestopt met een verzadigde NH4Cl-oplossing en dan 3x geëxtraheerd met ether en 3x met water en daarna gewassen met een verzadigde NaCloplossing, gedroogd op MgSO4, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (20% ether/petroleumether/ 1% triethylamine) gezuiverd. Er werd 4,65 g (18,2 mmol, 60 %) diacetaal 19 verkregen.

O

H+

O O

19

O

O

81%

O

20

2,85 g (11,1 mmol) diacetaal 19 werd in aceton (p.a.) opgelost en vervolgens werd 15 druppels HCl (1M) toegevoegd. Na 30 min. roeren werd de reactie op TLC (20% ether / 80% petroleumether) gevolgd. Daarna werden een paar scheppen K2CO3 en MgSO4 toegevoegd, filtraat afgefiltreerd en met dichloormethaan (DCM) gewassen en ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (20% ether / petroleumether) gezuiverd. Er werd 1,6 g (9,1 mmol, 81 %) 2,7-dimethyl octa-(2,4,6)tri-en-dial 20 verkregen.

18


Poerya Partovi

O (EtO)2P

O

20

O

5 CN

2 eq. 77%

CN NC

21

1,7 ml (1,23 g, 12 mmol) diisopropylamine werd in 25 ml THF gekoeld tot -80 ºC. Vervolgens werd langzaam 7,5 ml (12 mmol) n-BuLi (1,6 M oplossing in hexaan) toegedruppeld. 2,12 g (12 mmol) C2-fosfonaat 5 werd opgelost in THF en toegedruppeld. Daarna werd 0,82 g (5,0 mmol) 2,7-dimethyl, octa(2,4,6)tri-en-dial 20 opgelost in THF en langzaam toegedruppeld. Vervolgens werd de reactie op TLC (DCM) gevolgd. Daarna werd de temperatuur langzaam omhoog gebracht. Vervolgens werd de reactie gestopt met een verzadigde NH4Cl-oplossing en dan 3x geëxtraheerd met ether en daarna 3x gewassen met verzadigde NaCl-oplossing, gedroogd op MgSO4, afgefiltreerd en aan de rotatiefilmverdamper ingedampt. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (80% dichloormethaan / 20% petroleumether) gezuiverd. Er werd 0,81 g (3,85 mmol, 77 %) 4,9dimethyl, dodeca(2,4,6,8,10) penta-en-dinitril 21 verkregen.

NC

CN

21

Dibal-H

O

65%

O

22

0,22 g (1,1 mmol) 4,9-dimethyl dodeca(2,4,6,8,10) penta-en-dinitril 21 werd in tolueen opgelost en gekoeld tot -70ºC. Vervolgens werd 8 ml Dibal-H (1M, 8 mmol) langzaam toegevoegd. De reactie werd in 1 uur opgewarmd tot kamertemperatuur. Vervolgens werd TLC (dichloormethaan) genomen. Daarna werd afgekoeld tot –20 ºC en 7 g SiO2/H2O werd toegevoegd. Vervolgens werd 1 uur geroerd bij 0 ºC, afgefiltreerd en gewassen met veel ether. Er ontstond een diep rode suspensie met zwart/grijs/bruine vaste stof. Het produkt werd via flash-kolomchromatografie (80% dichloormethaan / 20% petroleumether) gezuiverd. Er werd 0,148 g (0,68 mmol, 65 %) 4,9-dimethyl, dodeca(2,4,6,8,10) penta-en-dial 22 gewonen.

19


Poerya Partovi

2.8

Synthese van canthaxanthine (koppeling):

+

-

PPh3 Br

O

16

O

22

O

1,2-epoxybutaan

O

31 O

Deze reactie werd in het donker en onder N2 uitgevoerd. 0,25 ml (54 mg, 0,25 mmol) 4,9-dimethyl dodeca(2,4,6,8,10) penta-en-dial 22 en 32 mg (0,6 mmol) 4-(2,6,6-dimethyl-3-oxo-1-cyclohexeen-1-yl)-3-buteen-2-yl)-trifenylphosphoniumbromide (Wittigzout) 16 werden opgelost in 1,2-epoxybutaan. Vervolgens werd het hele weekend bij 63 ºC gerefluxed. De reactie werd op TLC (50% ether / petroleumether) gevolgd. Daarna werd de reactie afgekoeld tot kamertemperatuur. Vervolgens werd droge ethanol toegevoegd. Daarna werd gedestilleerd om 1,2-epoxybutaan te verwijderen. Het ontstane produkt had een mooie diep rode kleur. Vervolgens werd afgekoeld en blijven mooie canthaxanthine kristallen over. De stof werd opgelost in DCM en dit werd via destillatie uitgewisseld met n-heptaan. Vervolgens werd bij 98 ºC 20 uur gerefluxed. Daarna werd afgekoeld tot 0 ºC. Er ontstonden mooie canthaxanthine kristallen. Helaas kon het produkt niet in zuivere vorm geïsoleerd worden.

20


Poerya Partovi

3

Karakterisatie:

Inleiding Om de produkten te kunnen karakteriseren werd van de techniek NMR-spectroscopie gebruikt gemaakt. Ik ga in het kort de techniek beschrijven en vervolgens de 1H NMR-spectra van α-chloorethylacetoacetaat bespreken.

NMR: De afkorting van NMR (Nuclear Magnetic Resonance) wordt Kernspin Resonantie of wel Kernmagnetische Resonantie genoemd. NMR-spectroscopie is toepasbaar op een beperkt aantal atoomkernen, waaronder 1H, 13C en 31 P. Het waterstofatoom 1H is juist zo geschikt, omdat het in vrijwel alle organische verbindingen voorkomt. NMR kunnen we begrijpen als we beseffen dat een aantal atoomkernen magnetische eigenschappen hebben. Zo ook de kern van het waterstofatoom. Normaal merken we hier niets van. Pas als zo'n kernmagneetje in een uitwending magneetveld plaatsen zal het streven naar een zo laag mogelijke potentiële energie.

O

O O Cl

δ 1,32 (t, 3H, OCH2CH3), δ 2,39 (s, 3H, 4-CH3), δ 4,32 (q, 2H, OCH2CH3), δ 4,81 (s, 1H, 2-CH)

Figuur 5: 200 MHz 1H-NMR spectrum van α-chloor-ethylacetoacetaat 2 (zie ook bijlage).

Bij δ 4,81 zit een singlet met een integraal van 1, deze piek is afkomstig van een CH2 die op positie 2 zit. Deze zit naast een chloor atoom en twee carbonyl groepen, vandaar de hoge chemical shift waarde. Bij δ 4,32 zit er een quartet met een integraal van 2 (betekent 2 H-atomen) dat afkomstig is van OCH2CH3. Het signaal wordt opgesplitst door drie H-atomen als naaste buren. Bij δ 2,39 zit een singlet met een integraal van 3. Dit signaal komt van de CH3-groep op positie 4. De carbonylgroep in de buurt verklaart een hogere chimical shift ten opzichte van OCH2CH3. Dit laatste signaal is een triplet en heeft ook een integraal van 3. Dit signaal wordt opgesplitst door twee H-atomen als buren.

21


Poerya Partovi

4

Discussie/Resultaten:

C13-Wittigzout: Om het C13-Wittigzout 16 maken, werd acetonitril gekoppeld aan 6-methyl-5-hepteen-2-on 4 zodat 3,7-dimethyl-2,6-octadieennitril 6 verkregen werd in 87 % ruwe opbrengst. De ring werd gesloten met gec. zwavelzuur in nitromethaan en op α-plaats komt een dubbele band te zitten, 98 % opbrengst. De dubbele band van α-cyclonitril 7 werd met m-chloorperbenzoëzuur (MCPBA) omgezet in het epoxide 8. Met behulp van LDA werd het epoxide geopend en alcohol 9 werd gevormd. Het gemaakte alcohol 9 werd m.b.v. PCC in dichloormethaan, omgezet tot keton 10. Vanwege PCC-troep en een moeilijke zuivering ging deze stap moeizaam en werd 51% produkt verkregen. Vervolgens werd de carbonyl-groep met ethyleenglycol, trimethylorthoformate en p-tolueensulfonzuur als katalysator omgezet in het beschermende acetaal 11 met 99 % opbrengst, zodat men verder de staart van de ring verlengt. Daarna werd door een Dibal reductie de nitril-groep omgezet in aldehyde 12, het produkt werd via flash-kolomchromatografie gezuiverd. Een opbrengst van 67 % werd verkregen.Vervolgens werd overmaat aceton en 2 ml natriumhydroxide (2M) 4-(2,10,10trimethyl-4,7-diox-aspiro[4,5]dec-1-en-1-yl)-3-buteen-2-on 13 74% verkregen. Deze adolcondensatie kan men beter met 1 eq. aceton, base en een andere oplosmiddel doen. Zo kan men goedkoper en met een hogere label opbrengst uitkomen. Met een Dibal reactie werd de carbonylgroep omgezet in een hydroxylgroep 14. Vanwege gedeeltelijke verlies van de beschermende groep werd er 48 % van het gewenste produkt verkregen. Nu is het tijd om de beschermende groep weg te halen. Dat doet men door toevoegen van 3 druppels zoutzuur (1M) zodat 4-(3-oxo-2,10,10-trimethyl-1-en-1-yl)-3-buteen-2-ol 15 gevormd wordt. Daarna werd met trifenyl-phosphoniumbromide een Wittigzout 16 in 99 % opbrengst gemaakt. Zo kan ik met de ontwikkelde route nu op alle postities met 13C labelen. In deze route plan zijn de stoffen 13, 14, 15 en 16 door mezelf ontwikkeld en de rest van de route heb ik uit het proefschrift van Dr. F.J.H.M. Janssen gehaald en nagewerkt.

C14-dialdehyde: Om C14-dialdehyde 22 maken, werd pyruvaat aldehyde dimethyl acetaal 18 met LDA gekoppeld aan difosfonaat 17 zodat diacetaal 19 verkregen werd in 60 % opbrengst. Door toevoeging van 15 druppels HCl (1M) werd met 81 % opbrengst 2,7-dimethyl, octa(2,4,6)tri-en-dial 20 verkregen. Met een BuLi-reactie werd 2 eq. C2-fosfonaat 5 gekoppeld aan 20 zodat men met 77 % opbrengst 4,9-dimethyl, dodeca(2,4,6,8,10) penta-en-dinitril 21 verkregen. Vervolgens werd met een Dibal-H reactie 4,9-dimethyl, dodeca(2,4,6,8,10) pentaen-dial 22 gemaakt.

22


Poerya Partovi

5

Conclusie:

Het is gelukt om C13-Wittigzout 16 en de C14-dialdehyde maken. Met de ontwikkelde route kan men nu op alle postities met 13C labelen. Ik heb 2 eq. van C13-Wittigzout 16 met de C14-dialdehyde 22 gekoppeld om zo canthaxanthine te krijgen, maar omdat dit op zo kleine schaal was gemaakt, kon ik niet met NMR het produkt aantonen. Ik moet erbij zeggen dat de uitgangstoffen ook niet geheel zuiver waren. Er is een nieuw route beschreven om C14-dialdehyde te maken, zodat men op hogere opbrengst uit zou kunnen komen (synthese route is in het volgende hoofdstuk schematisch weergegeven). Er was helaas niet voldoende tijd om deze route helemaal in de praktijk uit te voeren. Ik heb de eerste twee reactie geprobeerd te doen. Broomazijnzuur 24 is gelukt, maar de volgende stap ging niet echt goed. Hopelijk gaat nog iemand hiermee verder. De totale synthese is maar een keer uitgeprobeerd, dat houdt in dat men zeker op hogere opbrengsten kan komen.

23


Poerya Partovi

6

Toekomst plan(C14-dialdehyde):

O

O Br 2

23

OH

Br

24

TFAA

OH

TBDC

O

Br

25 CH3I

Br

CN

CS2

5

O

CN

(EtO)2 P

Br

LDA

26

LDA

CN

PO3

O3 P

28

+

CN

29

27

O (EtO)3P

O

30

O O

O

31 CH3CN

Dibal-H

O 24

H

O Bio Organische Fotochemie, Universiteit Leiden

32

Poerya Partovi

Referenties:

O. Straub in " Key to the carotenoids", (H.P. Pfander, red.), Brikhauser Verlag, Basel, 2e ed. 1987. 2 B.C.L. Weedon in: "Carotenoids", (O. Isler, red.), blz. 29-53, Brikhauser Verlag, Basel, 1971. 3 R.C. Mordi, Chemistry & Industry, 79-83. 4 M. Mimuro & T. Katoh, Pure Appl. Chem. 63, 123-130 (1991). 5 T.O. Yeates, H. Komiya, A. Chirino, D.C. Rees, J.P. Allen & G. Feher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7993-7997 (1988). 6 G. Britton, G.M. Armitt, S.Y.M. Lau, A.K. Patel and C.C. Shone, in 'Carotenoid Chemistry and Biochemistry' (G. Briiton and T.W. Goodwin, eds.), p. 237, Pergamon Press, Oxford, 1982. 7 J.N. Keen, I. Caceres, E.E. Eliopoulos, P.F. Zagalsky and J.B.C. Findlay, Eur. J. Biochem. 197,407(1991). 8 J.N. Keen, I. Caceres, E.E. Eliopoulos, P.F. Zagalsky and J.B.C. Findlay, Eur. J. Biochem. 202,31 (1991). 9 J.B. Clarke, E.E. Eliopoulos, J.B.C. Findlay and P.F. Zagalsky, Biochem. J. Biochem. J. 265, 919(1990). 10 Stageverslag van M. Kwestro 1993. 1

Overige referenties: 1 2

25

Proefschrift van F.J.H.M. Jansen 1996. Stageverslag van M. Kwestro 1993.


Poerya Partovi

Nawoord: Tot slot wil ik nog enkele mensen bedanken. Als eerste mijn mentoren en studiebegleiders Prof. Dr. Johan Lugtenburg en Dr. Jan Raap. Natuurlijk wil ik mijn directe begeleider Drs. Arjan van Wijk, bij wie ik met veel plezier stage heb gelopen, bedanken. Hij was erg geduldig en hij heeft mij erg goede ondersteuning gegeven tijdens mijn stage. Behalve chemische onderzoek heb ik nog veel andere dingen van hem geleerd. Alle mensen van Bio. Organische Fotochemie (BOF) voor de goede sfeer in de groep. Verder wil ik mijn zaalgenoten Drs. Ineke van der Hoef en natuurlijk Drs. Arjan Siebum bedanken voor een kei plezierige sfeer op zaal.

26


Poerya Partovi

Bijlagen:

1

27

NMR spectrum van componenten 2, 13, 14, 15 en 16 .


Poerya Partovi

28


Poerya Partovi

29


Poerya Partovi

30


Poerya Partovi

31


Poerya Partovi

32


Poerya Partovi

33


Poerya Partovi

34


Poerya Partovi

35


Poerya Partovi

Synthese van specifiek isotoop gelabelde carotenoïden

Recommend Documents