Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group
Synthese en evaluatie van poly-L-glutamine derivaten als niet-virale gen-afgiftesystemen
Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door
Arne Goes
Academiejaar 2009-2010
Promotor: Prof. Dr. Peter Dubruel Begeleider: drs. Vincent Vermeersch
Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group
Synthese en evaluatie van poly-L-glutamine derivaten als niet-virale gen-afgiftesystemen
Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door
Arne Goes
Academiejaar 2009-2010
Promotor: Prof. Dr. Peter Dubruel Begeleider: drs. Vincent Vermeersch
Dankwoord Eerst en vooral zou ik graag mijn promotor prof. Dr. P. Dubruel willen bedanken om mij de mogelijkheid te geven mijn thesis af te leggen in zijn onderzoeksgroep. Ik zou ook graag mijn begeleider, Vincent Vermeersch willen bedanken. Niet alleen voor al zijn chemische kennis die hij mij heeft doorgegeven, maar ook voor de supermomenten die we zowel binnen als buiten de universiteitsomgeving samen hebben meegemaakt. Ik heb een gans jaar in een lab gestaan waar iedereen het goed met elkaar kon vinden. Bedankt Inki voor alle schaterlachmomentjes, Valérie voor alle al dan niet legale digitale bestanden en Maria voor de massages. Zonder jullie zou het niet zo gemakkelijk zijn geweest om elke dag zwaar door te gaan in “the party lab”. De andere mensen van de polymer and biomaterials research group wil ik bij deze ook bedanken voor de aangename werkomgeving. Met het afwerken van deze thesis zit mijn studententijd er dan ook bijna op. Ik wil al mijn vrienden en vriendinnen bedanken voor de machtige practica, gesprekken, barbecue’s en feestjes gedurende deze 5 jaar. Tot slot wil ik ook mijn ouders bedanken voor de financiële steun en het vertrouwen dat ik gedurende de voorbije jaren van hen heb gekregen. Ook al wisten ze niet echt goed waar ik mee bezig was, ze waren altijd bereid om te luisteren naar mijn (on)begrijpbare uitleg.
I
Inhoudsopgave Dankwoord ........................................................................................................................ I Inhoudsopgave ................................................................................................................. II Lijst gebruikte afkortingen ............................................................................................... VI Hoofdstuk 1: Inleiding ....................................................................................................... 1 A. Wat is gentherapie ......................................................................................................... 1 B. Toepassingsgebieden ..................................................................................................... 3 B.1 Erfelijke genetische ziektes ...................................................................................... 3 B.2 Gentherapie voor kanker ......................................................................................... 3 B.3 Gentherapie voor AIDS ............................................................................................. 5 C. Gen-afgiftesystemen ...................................................................................................... 5 C.1 Inleiding .................................................................................................................... 5 C.2 Virale gen-afgiftesystemen ...................................................................................... 6 C. 2.1 Retrovirussen ............................................................................................ 6 C. 2.2 Adenovirussen .......................................................................................... 7 C. 2.3 Adeno-geassocieerd virus......................................................................... 9 C.2.4 Herpes simplex virus.................................................................................. 9 C.3 Niet-virale gen-afgiftesystemen ............................................................................... 9 C. 3.1 Directe injectie van naakt DNA ............................................................... 10 C. 3.2 Naaldvrije injectie van naakt DNA .......................................................... 10 C. 3.3 Elektroporatie ......................................................................................... 11 C. 3.4 Calciumfosfaat-DNA coprecipitatie ........................................................ 11 C. 3.5 liposomale gen-afgiftesystemen ............................................................ 12 C. 3.6 Cel penetrerende peptiden .................................................................... 13 C. 3.7 Kationische peptiden .............................................................................. 15 Poly(ethyleen imine) ............................................................................... 15 Poly(L-lysine) ........................................................................................... 17 Dendrimeren ........................................................................................... 18 Methacrylaat gebaseerde systemen ....................................................... 19 D. Te overwinnen barrières .............................................................................................. 20 D.1 DNA condensatie ................................................................................................... 21 D.2 Celopname van het complex: ‘internalisatie’ ........................................................ 21 II
D.3 Endosomale vrijstelling van het complex .............................................................. 23 D.4 Polyplex dissociatie ................................................................................................ 24 D.5 Translocatie naar de celkern .................................................................................. 25 E. Doel van de masterscriptie ........................................................................................... 26 F. Referenties .................................................................................................................... 27 Hoofdstuk 2: Synthese van biodegradeerbare poly-L-glutamine derivaten ........................ 30 A. Overzicht van het syntheseproces ............................................................................... 30 B. Synthese van γ-benzyl-L-glutamaat.............................................................................. 31 C. Synthese van het N-carboxyanhydride van γ-benzyl-L-glutamaat............................... 32 D. Synthese van poly-γ-benzyl-L-glutamaat ..................................................................... 35 D.1 Initiatie met primaire amines ................................................................................ 36 D. 1.1 Reactiemechanisme ............................................................................... 36 D. 1.2 Gesynthetiseerde polymeren ................................................................. 38 D.2 Initiatie met tertiaire amines ................................................................................. 41 D. 2.1 Reactiemechanisme ............................................................................... 41 D. 2.2 Gesynthetiseerde polymeren ................................................................. 42 D. 2.3 Viscosimetrie .......................................................................................... 44 D. 2.4 Mastercurve voor pBG ........................................................................... 45 E. Synthese van poly-L-glutamine afgeleiden als niet-virale vectoren ............................ 47 E.1 Aminolyse van poly-γ-benzyl-L-glutamaat ............................................................. 47 E.2 Conversie van primaire amines in guanidines........................................................ 50 E.3 Gel permeatie chromatografie ............................................................................... 51 E.4 Synthese van poly(hydroxyethyl-L-glutamine-co-dimethylaminoethyl-L-glutamine) (p(HEG-co-DMAEG)) ..................................................................................................... 54 E.5 Synthese van poly(hydroxyethyl-L-glutamine-co-guanidyl-ethyl-Lglutamine)-coimidazolethyl-L-glutamine) (p(HEG-co-GuAEG-co-ImEG)) derivaten........................... 55 E.6 Synthese en bespreking van poly(hydroxyethyl-L-glutamine-co-guanidyl-ethyl-Lglutamine) (p(HEG-co-GuAEG)) derivaten ................................................................... 57 F. Referenties ................................................................................................................... 63 Hoofdstuk 3: Fysicochemische evaluatie van poly-L-glutamine derivaten.......................... 65 A. Polyplexformatie .......................................................................................................... 65 B. Ethidium Bromide fluorescentie .................................................................................. 67 B.1 Techniek ................................................................................................................. 67 B.2 Resultaten .............................................................................................................. 68 III
C. Agarose gel-elektroforese ............................................................................................ 72 C.1 Techniek ................................................................................................................. 72 C.2 Resultaten .............................................................................................................. 72 D. Dynamische licht verstrooiing ...................................................................................... 75 D.1 Techniek ................................................................................................................. 75 D.2 Resultaten .............................................................................................................. 76 E. Zeta-potentiaal ............................................................................................................. 79 E.1 Techniek ................................................................................................................. 79 E.2 Resultaten............................................................................................................... 80 F. Referenties ................................................................................................................... 82 Hoofdstuk 4: Biologische evaluatie van poly-L-glutamine derivaten .................................. 83 A. Biodegradatie door peptidasen.................................................................................... 84 A.1 Inleiding .................................................................................................................. 84 A.2 Resultaten .............................................................................................................. 85 B. Interactie met rode bloedcellen................................................................................... 86 B.1 Hemolyse studie ..................................................................................................... 86 B. 1.1 Inleiding .................................................................................................. 86 B. 1.2 Resultaten ............................................................................................... 88 B.2 Hemagglutinatie studie .......................................................................................... 89 B. 2.1 Inleiding .................................................................................................. 89 B. 2.2 Resultaten ............................................................................................... 89 C. Stabiliteit van DNA ten opzichte van nucleasen .......................................................... 92 C.1 Inleiding .................................................................................................................. 92 C.2 Resultaten .............................................................................................................. 92 D. Referenties ................................................................................................................... 94 Hoofdstuk 5: Besluit......................................................................................................... 95 Hoofdstuk 6: Experimenteel Deel ..................................................................................... 98 A. Hoofdstuk 2: Synthese van biodegradeerbare poly-L-glutamine derivaten ................ 98 A.1 Synthese van γ-benzyl-L-glutamaat ....................................................................... 98 A.2 Synthese van poly-γ-benzyl-L-glutamaat met n-butylamine ................................. 99 A.3 Synthese van poly-γ-benzyl-L-glutamaat met tributylamine ................................. 99 A.4 Aminolyse van poly-γ-benzyl-L-glutamaat ........................................................... 100 A.5 Conversie van primaire amines in guanidines ..................................................... 100 B. Hoofdstuk 3: Fysicochemische evaluatie van poly-L-glutamine derivaten................ 101 IV
B.1 Bepaling van de M/C ............................................................................................ 101 B.2 Ethidium bromide fluorescentiemetingen ........................................................... 101 B.3 Agarose gel-elektroforese .................................................................................... 102 B.4 Dynamische licht vertstrooiingsexperimenten .................................................... 102 B.5 Zeta-potentiaalmetingen ..................................................................................... 102 C. Hoofdstuk 4: Biologische evaluatie van poly-L-glutamine derivaten ........................ 103 C.1 Biodegradatie door proteasen ............................................................................. 103 C.2 Hemolyse studie ................................................................................................... 103 C.3 Hemagglutinatie studie ........................................................................................ 103 C.4 stabiliteit van DNA ten opzichte van nucleasen................................................... 103 Bijlage A: English Report ................................................................................................ 105 A. Poly-L-Glutamine Derivatives as Non-viral Gene Delivery Systems ................................ i
V
Lijst gebruikte afkortingen 2-HP: AE: AIDS: BG-NCA:
2-hydroxypyridine Amino-ethanol verworven immunodeficiëntie syndroom γ-Benzyl-L-glutamaat N-carboxyanhydride
CF3COOH: CFTR-gen:
Trifluoroazijnzuur Cystische Fibrose Transmembraan geleiding Regulator gen
CH2Cl2COOH: Chol: CIP: CPP: DLS: DMAEA: DMAEG: DMF: DMGP: DNA: DOPC: DOPE: DOTAP: EtBr: EtOAc: GPC: GuAEG: HEG: HIV: ImEG: IPEC: KI: LV: M/C: M/I: MAP: mRNA:
Dichloorazijnzuur Cholesterol Cel interactief peptide Cel penetrerend peptide Dynamische licht verstrooiing 2-dimethylaminoethyl amine Dimethylaminoethyl-L-glutamine Dimethylformamide 3,5 dimethyl-1-guanylpyrazool formidiumnitraat Deoxyribonucleïnezuur dioleoylfosfatidylcholine dioleoylfosfatidylethanolamine N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfaat Ethidium Bromide Ethylacetaat Gel permeatie chromatografie Guanidyl-ethyl-L-glutamine Hydroxyethyl-L-glutamine menselijk immunodeficiëntie virus Imidazolethyl-L-glutamine interpolyelektrolietcomplex Kaliumiodide Ladingsverhouding "Mass per charge" monomeer/initiator verhouding Model amfifiel peptide boodschapper-RNA
Mv:
viscositeitsgemiddeld moleculair gewicht
Mw:
Moleculair gewicht
Mwa:
Moleculair gewicht na aminolyse
MwG: NCA: NLS: NPC: PAMAM: pBG:
Moleculair gewicht na guanidilering N-carboxyanhydride Nucleair lokalisatiesignaal Nucleair porie complex polyamidoamine poly-γ-benzyl-L-glutamaat VI
PDMAEMA: PEG: PEI: PLL: PTD: RBC: RNA: Rnase H: SEC: TEA: TFA: TrAEA::
poly(2-(dimethylamino) ethyl methacrylaat) poly(ethyleen glycol) poly(ethyleen imine) poly(L-lysine) Proteïne transductie domein Rode bloedcellen Ribonucleïnezuur enzym Ribonuclease H Size exclusion chromatografie Triethylamine Trifluoroazijnzuur Tritylamino-ethylamine
ηrel:
Relatieve viscositeit
ηsp:
Specifieke viscositeit
VII
Hoofdstuk 1: Inleiding A. Wat is gentherapie? Gentherapie is een techniek die steeds meer de aandacht trekt als efficiënte en specifieke behandelingsmethode voor veel voorkomende of overgeërfde ziektes zoals AIDS, kanker en mucovicidose. De huidige aanpak voor dit type aandoeningen bestaat erin geneesmiddelen toe te dienen die slechts de symptomen, die het gevolg zijn van een genetische mutatie, behandelen. Gentherapie wordt gezien als de ultieme oplossing voor genezing van deze, vaak levensbedreigende ziektes, veroorzaakt door een niet of slecht functionerend gen. De techniek is gebaseerd op de inbreng van therapeutisch DNA in doelcellen of weefsel dat codeert voor een specifiek proteïne [1]. Dit proteïne compenseert het ontbreken of slecht functioneren van een gemuteerd gen of kan een nieuwe functie aan de cel geven [2]. De toediening van naakt DNA aan een cel is zeer inefficiënt. Transport doorheen het celmembraan is onmogelijk wegens de hoge negatieve ladingsdichtheid en de relatieve grootte (enkele honderden nanometer). Bovendien zijn nucleasen aanwezig in de bloedstroom die het DNA kunnen degraderen vooraleer het na injectie zijn doelweefsel bereikt. Om deze nadelen te omzeilen wordt het genetisch materiaal gecombineerd met specifieke dragers of vectoren. Deze vectoren beschermen het DNA tegen degradatie en staan bij in het transport naar de celkern, door celopname mogelijk te maken en intra-cellulaire vrijstelling te promoten. Het gen-afgiftesysteem wordt niet alleen gebruikt als 1
transportmiddel doorheen het plasmamembraan. Na celopname kan de vector nog verschillende functies vervullen om eventueel geninsertie en expressie te verhogen. Er bestaan drie verschillende manieren die kunnen aangewend worden om een vector met erfelijk materiaal naar doelcellen of weefsel te transporteren: Ex vivo: Hierbij worden de cellen verwijderd uit het lichaam en in vitro gecultiveerd in aanwezigheid van een gen-afgiftesysteem. Na expansie worden alle gemodificeerde cellen terug in het weefsel geïmplanteerd. Voor deze techniek worden het vaakst rode bloedcellen en beenmergcellen gebruikt omdat deze gemakkelijk uit het lichaam te verwijderen en nadien terug in te brengen zijn. In situ: Bij de in situ-benadering wordt de specifieke drager met erfelijk materiaal onmiddellijk ingebracht in het doelweefsel. Deze methode wordt onder meer toegepast voor de behandeling van de erfelijke longziekte mucoviscidose waarbij de vector rechtstreeks in de bronchi van de longen wordt aangebracht [3]. In vivo: Door zijn gemakkelijke toepasbaarheid is dit de meest aantrekkelijke manier om aan gentherapie te doen. Bij deze techniek wordt het DNA-vectorsysteem geïnjecteerd in de bloedbaan van de patiënt. Vooraleer het echter gebruikt kan worden in klinische applicaties moet de specificiteit van de gebruikte vectoren wel nog geverifieerd en indien nodig verhoogd worden. Het spreekt vanzelf dat er verschillende soorten vectoren bestaan voor erfelijk materiaal. De virale vectoren zijn natuurlijk van oorsprong, terwijl de niet-virale vectoren synthetisch aangemaakt worden. De virale vectoren zijn afgeleiden van virussen en hun gebruik (adenovirus, retrovirus, adeno-geassocieerd virus) als gen-afgiftesyteem ligt voor de hand door hun natuurlijk invasieve eigenschappen en de mogelijkheid om het transcriptiemechanisme van de gastheercel te gebruiken om eigen virale proteïnen te synthetiseren. Virussen veroorzaken echter toxische neveneffecten en zijn moeilijk aan te maken op grote schaal. Deze nadelen hebben geleid tot de ontwikkeling van synthetische vectoren die gemakkelijker te produceren zijn en een grotere hoeveelheid DNA kunnen introduceren in het doelweefsel. Er is reeds onderzoek verricht naar diverse niet-virale afgiftesystemen met potentiële toepassingen. Het zijn kationische polymeren die complexeren met DNA tot interpolyelektrolytcomplexen (IPEC’s). Een gereduceerde oppervlakte lading, deeltjesgrootte en betere bescherming tegen nucleasen zijn de belangrijkste oplossingen voor de barrières die het lichaam oplegt aan DNA-gentherapie. Het positief geladen complex zou via endocytose opgenomen worden in de cel. Een mogelijks nadeel van sommige van deze polymeren is dat ze niet biologisch afbreekbaar zijn met als gevolg dat de in vivo toepassingen gelimiteerd zijn. Deze masterthesis handelt dan ook over de synthese van biodegradeerbare poly-L-glutamine zuur derivaten als niet-virale vectoren voor gen-afgifte.
2
B. Toepassingsgebieden B.1) Erfelijke genetische ziektes Een van de meest voor de hand liggende toepassingen van gentherapie is de behandeling van genetische ziektes. Bij deze aandoeningen ontbreken één of meerdere genen of zijn ze gemuteerd waardoor een bepaalde ziekte zich voordoet. Gentherapie tracht de ziekte te remediëren door een correcte versie van de genen in te voeren in het genoom van geïnfecteerde cellen. Het grootste nadeel aan gentherapie is dat niet alle cellen en weefsels toegankelijk zijn om te behandelen. Vlot toegankelijke weefsels voor behandeling zijn bv. de longen, de spieren en het bloed. Genetische ziektes die veroorzaakt worden door mutatie in één gen zijn gemakkelijker te behandelen dan ziektes verzoorzaakt door mutaties in verschillende genen. Mucoviscidose is een genetische ziekte die een geschikte kandidaat is voor behandeling via gentherapie. Ze wordt veroorzaakt door één specifieke genmutatie en manifesteert zich in de longen. Mucoviscidose is de meest voorkomende erfelijke ziekte in de Indo-Europese samenleving. Het zorgt jaarlijks voor meer dan 70’000 doden. Mucoviscidose wordt veroorzaakt door een mutatie in het Cystisch Fibrose Transmembraan geleiding Regulator gen (CFTR). De mutatie van dit gen leidt tot een onevenwicht in het transport van water en ionen doorheen het celmembraan ter hoogte van de epitheelcellen. Dit resulteert op zich in een ophoping van slijm, een chronische bacteriële infectie en een ontsteking in de longen [4]. Daar er nog steeds geen medicijn op de markt is tegen mucoviscidose, werd gentherapie als mogelijke oplossing naar voor geschoven. In verschillende klinische testen werden patiënten behandeld tegen mucoviscidose. Het CFTR-gen werd via virale of niet-virale vectoren in de epitheelcellen van de patiënt tot expressie gebracht. De expressie van het CFTR-gen dat in het lichaam gebracht werd via virale vectoren duurde drie maanden, niet-virale vectoren konden het ionentransport voor vijftien dagen herstellen [4].
B.2) Gentherapie voor kanker Kanker is de belangrijkste niet-natuurlijke doodsoorzaak in de westerse wereld. Een kanker ontdekt in een vroeg stadium is te genezen via chirurgie, radiotherapie en/of chemotherapie. Wanneer de kanker verder ontwikkeld en verspreid is over het lichaam, is tot op heden chemotherapie als enige behandeling voorhanden. Chemotherapie bezit vele nadelen zoals een lage specificiteit, de potentiële ontwikkeling van secundaire kankers en het induceren van resistente fenotypes. Deze fenotypes ondervinden geen last van de chemo, waardoor de behandeling inefficiënt wordt. Gentherapie zou een alternatief kunnen zijn voor de klassieke therapieën tegen kanker. Het is een efficiënte en specifieke therapie die rechtstreeks in kan werken op de genen verantwoordelijk voor
3
de kanker. In 2005 was 67% van alle uitgevoerde klinische testen die gebruik maakten van gentherapie gericht op kanker [5]. Er bestaan verschillende therapeutische technieken waarmee kanker op genetisch niveau kan behandeld worden: Antisense oligonucleotiden: Antisense oligonucleotiden zijn synthetische oligonucleotiden die zeer specifiek de expressie van verschillende genen kunnen inperken. De doelsequentie wordt geïnactiveerd door binding van een oligonucleotide, meestal een DNA sequentie, met zijn complementaire sequentie op het doel mRNA. Na hybridisatie tussen het oligonucleotide en het mRNA treedt er RNA-opsplitsing (cleavage) op [4]. De productie van proteïnen die de tumor veroorzaken, wordt verhinderd door inhibitie van de translatie. Deze reactie wordt gekatalyseerd door het in het cytoplasma aanwezige enzym Ribonuclease H (RNase H). Door toedoen van RNase H blijft de antisense nucleotide behouden en dient slechts een katalytische hoeveelheid van het oligonucleotide in het lichaam gebracht te worden. De antisense strategie wordt nu zowel in vitro als in vivo toegepast om kankercellen vatbaarder te maken voor chemotherapie. “Knockout” gentherapie: “Knockout” gentherapie probeert om de expressie van oncogenen te inactiveren of vertragen. Hierdoor wordt ongecontroleerde cel-vermeerdering, angiogenese of drug resistentie verhinderd. Een gen, coderend voor een antisense RNA, kan in de cel gebracht worden en zal hybridiseren met het target mRNA waardoor translatie onmogelijk wordt. Het complex zal degraderen waardoor de expressie van het gewenste oncogen specifiek geïnhibeerd wordt. Om volledig verlost te geraken van een tumor moeten alle cellen getransfecteerd worden. Indien niet alle cellen getransfecteerd worden, blijft de kanker bestaan. Een geïntroduceerd gen kan in naburige cellen diffunderen waarin het gen niet geëxpresseerd wordt (bijstaander effect). Hierdoor moet niet in alle cellen nieuw celmateriaal binnen gebracht worden. Genvervanging of genreplicatie: Deze therapie probeert een defect of ontbrekend gen te vervangen door cel-apoptose inducerende of tumor-onderdrukkende genen in te voeren. Slechts één gen wordt vervangen, waardoor de behandeling tegen kankers, ontstaan door fouten op meerdere plaatsen in het genoom, minder efficiënt is. Ziektes zoals hemofilie IX, veroorzaakt door een monogenetisch defect kunnen met deze techniek accuraat behandeld worden. Kanker wordt in de meeste gevallen veroorzaakt door defecten in verschillende genen. Om efficiënt te zijn zou deze techniek moeten gebruikt worden in combinatie met een andere vorm van therapie of zouden er meerdere genen moeten vervangen worden. Wanneer genvervanging in combinatie met chemotherapie toegepast wordt, treedt er een synergetisch effect op waardoor de behandeling vlotter verloopt [6]. Een speciale vorm van genreplicatie is zelfmoordgen therapie. Een zelfmoord gen codeert voor een enzym dat ongevaarlijke prodrugs kan omzetten in een actief toxine. Het voorkomen van dit
4
cytotoxische geneesmiddel in de cel veroorzaakt dan apoptose of celdood. Door dit zelfmoordgen in het zieke weefsel in te brengen, zal het enzym daar tot expressie gebracht worden. Na apoptose wordt het cytotoxische geneesmiddel vrijgesteld aan de omgeving en kan het omliggende cellen binnendringen via diffusie en doden. Als de expressie van dit gen gebeurt in kankercellen sterft de tumor af en is genezing mogelijk. Het nadeel aan deze techniek is dat gezonde getransfecteerde cellen ook kunnen afsterven.
B.3) Gentherapie voor AIDS AIDS wordt veroorzaakt door het menselijke immunodeficiëntie virus (HIV) en zorgt jaarlijks voor miljoenen doden. Een geneesmiddel tegen het virus bestaat nog niet. Ook hier kan gentherapie een oplossing bieden. De therapie tegen AIDS kan op twee verschillende vlakken toegepast worden: door te vermijden dat het HIV virus de cel binnendringt of vermijden dat het HIV virus zich repliceert in de cel. Bij de eerste techniek brengt men genen in de cel die HIV opname verhinderen. Deze genen stimuleren de aanmaak van bepaalde transmembranaire glycoproteïnen die interfereren met de proteïnen aanwezig in het celmembraan waarvan het HIV virus gebruik maakt om de cel binnen te dringen [7]. Inhibitie van celopname maakt HIV replicatie onmogelijk met sterfte tot gevolg. Bij de tweede strategie wordt de replicatie van het virus binnen de cel op alle mogelijke niveau’s tegen gewerkt, om zodoende het virus te inactiveren en zelfs te vernietigen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van zelfmoord genen, siRNA-moleculen, intracellulaire antilichamen en peptiden. Aangezien gentherapie slechts beperkt doelspecifiek is, wordt er extra informatie toegevoegd aan deze genen, zodat enkel de genen binnenin de geïnfecteerde cel geactiveerd worden.
C. Gen-afgiftesystemen C.1) Inleiding Het doel van gentherapie is extern genetisch materiaal onder de vorm van DNA het lichaam binnen brengen. Spontane opname van DNA in de cel is echter onmogelijk, omdat zowel DNA als het biologische celoppervlak negatief geladen zijn en elkaar afstoten. Daarnaast spelen ook de grootte en de natuurlijke afweer van het lichaam tegen externe stoffen een belangrijke rol. In gentherapie worden daarom vectoren gebruikt om deze nadelen te omzeilen. Deze vectoren kunnen het genetisch materiaal beschermen en assisteren in het transport naar en in de cel. De twee types vectoren die in gentherapie gebruikt worden zijn gebaseerd op virale en niet-virale genafgiftesystemen, elk met hun eigen voor- en nadelen. Tot op heden is nog geen enkele vector in staat gebleken om doelcellen die op een bepaalde plaats liggen in het lichaam vanop afstand te transfecteren. Het blijft voorlopig een utopie om vectoren systemisch in het lichaam te brengen en er vanuit te gaan dat ze zich specifiek op ziektecellen zullen richten zonder op gezonde cellen in te 5
werken. Samen met de lage transfectie snelheid die vooral bij niet-virale vectoren uitgesproken is, zijn dit twee substantiële barrières in gentherapie.
C.2) Virale gen-afgiftesystemen Virale gen-afgiftesystemen zijn afgeleid van virussen. Het gebruik van virussen als vector ligt voor de hand. Ze bezitten van nature uit de mogelijkheid om cellen binnen te dringen en hun transcriptie mechanisme te gebruiken om hun eigen virale proteïnen te synthetiseren. Eer de virussen kunnen gebruikt worden als vector in gentherapie moeten ze eerst genetisch gemodificeerd worden. De virale proteïnen noodzakelijk voor replicatie worden vervangen door een therapeutisch gen. Virale vectoren worden nog steeds onderzocht en gebruikt in klinische gentherapie vanwege hun hoge transfectiesnelheid en de snelle transcriptie van het ingevoegde genetisch materiaal [8]. Deze hoge transfectie efficiëntie is het grote voordeel t.o.v. niet-virale vectoren als gen-afgiftesysteem. Het gebruik van virussen als vectoren heeft echter therapeutische nadelen. Het genoom van virussen is vaak beperkt waardoor slechts korte DNA sequenties in het genoom kunnen geïnsereerd worden. Ze zijn tevens moeilijk modificeerbaar, opschaalbaar en veroorzaken van nature uit ziektes. Hoewel ze onschadelijk gemaakt zijn voor therapeutische toepassingen kan via recombinatie met een wild type van het virus een replicatie competent virus ontstaan dat een ziekte kan veroorzaken. Wanneer er op een foute plaats nieuwe genen worden ingevoerd vergroot dan weer de kans op een tumor. Virussen hebben een zeker cytotoxiciteit, waardoor er na toediening afweerreacties ontstaan. Bij herhaaldelijke toediening kan het lichaam een zekere resistentie opbouwen waardoor het virus op termijn afgestoten kan worden. Bepaalde virale vectoren kunnen hierdoor slechts enkele malen gebruikt worden voor dezelfde cellen. Er zijn verschillende soorten virussen die worden gebruikt om genen af te leveren in de cel. Adenovirussen zorgen voor een transiënte transgenexpressie terwijl adeno-geassocieerde virussen, retrovirussen en herpes simplex virussen, zorgen voor een permanente expressie. C. 2.1 RETROVIRUSSEN Een eerst groep virale vectoren zijn de retrovirussen. Retrovirussen werden in 1981 voor het eerst beschreven als virale vector en zijn meestal afgeleid van het Molony murine leukemie virus [9]. Het erfelijk materiaal is aanwezig onder de vorm van een enkelstrengige RNA keten. Retrovirussen worden in de cel opgenomen door een interactie tussen specifieke receptoren op de celwand en virale mantelproteïnen in het eiwitkapsel dat zich rond het virus bevindt (figuur 1.1) [10]. De aanwezige proteïnen in de eiwitmantel bepalen ook welke soort cellen het retrovirus kan infecteren [11]. Retrovirussen bevatten naast hun genoom onder de vorm van RNA ook het enzym “reverse transcriptase”. De aanwezigheid van dit enzym stelt hen in staat om na opname in de cel hun eigen enkelstrengige RNA keten om te zetten in dubbelstrengig DNA via “reverse transcription”. Dit 6
dubbelstrengig DNA wordt dan geïncorporeerd in het genoom van de gastheer. Daar deze permanente insertie op een willekeurige plaats in het genoom kan gebeuren, bestaat de kans dat een bepaald gen van de gastheercel geactiveerd of geïnactiveerd wordt. De kans is echter klein dat de mutatie in één gen tot een bepaalde ziekte leidt aangezien de meeste ziektes veroorzaakt worden door mutaties in verschillende genen. Een ander nadeel van retrovirussen is dat ze selectief delende cellen infecteren. Deze virussen zijn te groot in omvang, ongeveer 120 nm, om door de poriën van het nucleaire membraan getransporteerd te worden [12]. Opname in de celkern gebeurt enkel tijdens de mitose omdat dan de celkern niet omgeven is door een kernmembraan. Ondanks deze nadelen worden retrovirussen het meest gebruikt van alle virale vectoren. Ze zorgen voor een goede integratie in het chromosoom van de gastheercel, met stabiele transformatie en een aanzienlijke genexpressie nadien. Doordat ze snel worden afgebroken in menselijk serum worden ze bijna niet gebruikt voor in vivo-toepassingen.
Figuur 1.1: Retrovirus (HIV)
Wanneer virussen gebruikt worden als vector in gentherapie wordt een deel van hun virale genen vervangen door het therapeutisch gen dat ingebouwd moet worden in het genoom van de gastheercel. Het genoom van retrovirussen bestaat uit ongeveer 10’000 baseparen en bevat minstens drie genen nl. het Gag-, pol- en env-gen [13]. Het gag-gen staat in voor de productie van drie virale structurele proteïnen die geen deel uitmaken van de eiwitmantel. De pol sequentie codeert voor het enzym reverse transcriptase en het env-gen codeert voor de virale mantelproteïnen. Er kunnen slecht DNA-sequenties ingevoerd worden tot 8,5 kb, wat vaak te klein is om op een afdoende manier een therapeutisch gen te inserteren. C. 2.2 ADENOVIRUSSEN In 2005 werden een kwart van alle gentherapeutische klinische testen uitgevoerd met adenovirussen. Adenovirale vectoren hebben een natuurlijke affiniteit voor epitheelcellen in het ademhalingstelsel. Hierdoor worden ze hoofdzakelijk gebruikt voor long gerelateerde genetische 7
ziekten zoals mucoviscidose [14]. Het erfelijk materiaal is in tegenstelling tot retrovirussen vervat in lineair dubbelstrengig DNA (figuur 1.2). Adenovirussen worden veel gebruikt omdat ze zorgen voor een sterke genexpressie in zowel delende als niet-delende cellen. Deze expressie is echter van voorbijgaande aard. Na celopname door receptor-gemedieerde-endocytose wordt het erfelijk materiaal niet ingebouwd in het genoom van de gastheercel. Het virale genoom bevindt zich als episoom in de nucleus, waar het blijft bestaan tot het gedegradeerd wordt [15]. Bij mitose wordt het genetisch materiaal van de gastheercel verdubbeld. Het episoom wordt niet verdubbeld waardoor er verdunning optreedt van het therapeutisch gen na celdeling. Dit heeft als nadeel dat in een ziektebehandeling adenovirale vectoren op regelmatige basis moeten toegevoegd worden om de nodige therapeutische effecten te verkrijgen. Adenovirussen kunnen transgenen afleveren tot 30 kb, dit is beduidend hoger dan de insertiecapaciteit van retrovirussen [12].
Figuur 1.2: Adenovirus
Vooraleer adenovirussen gebruikt kunnen worden als vectoren, worden de genen, die essentieel zijn voor virusreplicatie, verwijderd en vervangen door een therapeutisch gen. De kans blijft echter reëel dat de replicatie-deficiënte adenovirale vector opnieuw replicatie kan ondergaan door recombinatie met een wild type adenovirus. Dit kan leiden tot o.a. ademhalingsproblemen bij in vivo toepassingen [13]. Adenovirussen kunnen onderverdeeld worden in 40 verschillende serotypes, waarvan de meeste behoren tot serotype Ad 5. De helft van alle volwassen mensen bezitten echter anti-Ad antilichamen. Na inbreng, wordt in het lichaam een immuunreactie in gang gezet waarbij de adenovirale vectoren geneutraliseerd worden voordat ze het therapeutisch gen afgeleverd hebben. Deze immuunreactie limiteert de efficiëntie van adenovirale vectoren in vivo. De transductieefficiëntie kan op twee manieren verbeterd worden. Er kunnen immuunonderdrukkende middelen toegevoegd worden tijdens de behandeling of adenovirussen kunnen gecombineerd worden met niet-virale vectoren. Uit testen blijkt dat toevoeging van kationische lipiden of kationische polymeren aan adenovirussen de transgenexpressie kan verhogen met een factor 6 [16].
8
C. 2.3 ADENO-GEASSOCIEERD VIRUS Adeno-geassocieerde virussen zijn onvolmaakte niet-pathogene parvovirussen die co-infectie vereisen van een helper-virus om cellen effectief te infecteren [14]. De meest gebruikte helper virussen zijn het adenovirus en het herpes simplex virus. Het genoom is opgebouwd uit enkelstrengig DNA dat codeert voor twee virale proteïnen, Rep en Cap [13]. Deze enkelstrengige DNA virussen combineren eigenschappen van retrovirussen en adenovirussen. Ze zijn tevens in staat om DNAsequenties tot 4,7 kb het genoom van de gastheercel binnen te brengen en delende en niet-delende cellen te infecteren. Deze virussen veroorzaken geen pathologische effecten bij mensen. Retrovirussen inserteren efficiënter maar de plaats van insertie door adeno-geassocieerde virussen op chromosoom 19 codeert niet voor een belangrijk gen bij de mens waardoor het risico op insertionele mutagenese heel wat lager ligt [14]. C. 2.4 HERPES SIMPLEX VIRUS Herpes simplex virussen hebben een groot genoom bestaande uit dubbelstrengig, lineair DNA. Hierdoor kunnen er grote sequenties, 30 tot 50 kb, therapeutisch DNA ingevoerd worden in het genoom van de gastheercel. Het infecteert mitotische en post-mitotische cellen. Het virus repliceert in epitheelcellen en maakt dat de cellen levenslang latent geïnfecteerd worden in de neurale cellichamen ter hoogte van de ganglia, waar het latente virale genoom bewaard wordt in een episomale staat [17]. Deze virussen worden gebruikt om transgenen af te leveren aan cellen die andere virussen moeilijk kunnen bereiken. Het Herpes simplex virus kan genetisch materiaal afgeven aan neuronen, het hart, skeletspieren, de blaas,… Een nadeel is wel dat het virus moeilijk te manipuleren is wegens zijn complexe levenscyclus.
C.3) Niet-virale gen-afgiftesystemen Niet-virale gen-afgiftesystemen maken geen gebruik van virussen om erfelijk materiaal in de cel te brengen. Hierdoor ondervinden ze geen last van al de bijkomende veiligheidsaspecten die virale vectoren met zich meebrengen. Deze vectoren zijn relatief gemakkelijk synthetiseerbaar, chemisch modificeerbaar, goedkoop en hebben een lagere toxiciteit en immunogeniciteit dan virale vectoren. De transfectie efficiëntie ligt meestal wel lager bij niet-virale dan bij virale gen-afgiftesystemen. Dit komt
omdat
niet-virale
gen-afgiftesystemen
afhankelijk
zijn
van
traditionele
cellulaire
transportsystemen voor de opname en expressie van het genetisch materiaal in de gastheercel terwijl bij virussen de invasieve eigenschappen door natuurlijke evolutie zelf geoptimaliseerd zijn. Bij virale vectoren wordt de term infectie en transductie gebruikt voor het binnenbrengen van transgenen. Er wordt gesproken van transfectie als niet-virale vectoren drager zijn van het extern genetisch materiaal. Het genetisch materiaal kan via directe injectie van naakt DNA, naaldvrije
9
injectie van naakt DNA, elektroporatie, calciumfosfaat-DNA coprecipitatie, liposomale en polymere gen-afgiftesystemen in de gastheercel gebracht worden. C. 3.1 DIRECTE INJECTIE VAN NAAKT DNA Naakt DNA kan in vitro of ex vivo niet spontaan cellen transfecteren. De omvang en negatieve lading zorgen ervoor dat doorheen het celmembraan verhinderd wordt, waardoor transfectie onmogelijk wordt. Wel kan via een microscopische naald het DNA in de celkern geïnjecteerd worden. Op deze manier wordt de integriteit van het DNA bewaard want buiten de celkern wordt DNA snel gedegradeerd door nucleasen [18]. De methode is zeer arbeidsintensief, omdat slechts één cel tegelijk kan getransfecteerd worden. Vroeger was het gebruik dan ook beperkt tot ex vivo applicaties waarbij individuele celmanipulaties gewenst en mogelijk waren [14]. Tegenwoordig wordt de techniek ook in vivo toegepast. Naakt DNA wordt hierbij rechtsreeks geïnjecteerd in spieren en huidweefsel om virale antigenen in vivo tot expressie te brengen met als doel antivirale immuunresponsen te verkrijgen van het lichaam [14]. De hoogste transfectieefficientie van alle niet-virale gen-afgiftesytemen kan op deze manier worden bekomen. Ondanks deze hoge genexpressie is het gebruik van deze methode gering omdat slechts een beperkt aantal type cellen nl. spier-en huidcellen vlot kunnen getransfecteerd worden. C. 3.2 NAALDVRIJE INJECTIE VAN NAAKT DNA Er bestaan 2 manieren om naakt DNA naaldvrij te injecteren. De ene techniek maakt gebruik van het genpistool, de andere van de IntrajectTM of de JetgunTM. Het genpistool werd eind jaren tachtig ontwikkeld om genetische transformatie te verkrijgen in verschillende plantensoorten. Bij het genpistool of deeltjes bombardement worden gouden micropartikels van ongeveer drie µm gecoat met DNA. Deze deeltjes worden door een elektrische ontlading of gas onder hoge druk versneld naar het oppervlak van een weefsel [18]. Door de verkregen kinetische energie kunnen de deeltjes het celmembraan doordringen. In vitro heeft deze methode een zeer goede transfectie-efficiëntie, in vivo iets minder. Eens in de cel koppelt het DNA langzaam los van de partikels en kan het vrijgesteld en geëxpresseerd worden. De expressie is van voorbijgaande aard omdat de genen zich meestal als episomen bevinden in de nucleus [14]. Een ander nadeel is dat de lichaamsvreemde gouddeeltjes in het lichaam achterblijven [17]. Uit onderzoek blijkt dat grote DNA fragmenten effectief in moeilijk transfecteerbare cellen kunnen gebracht worden. Bij de Jet-gun wordt het DNA via een vloeistof onder hoge druk in de interstitiële holtes gebracht [19]. De transiënte expressie die bij beide technieken optreedt, kan verholpen worden door de injecties een paar maal te herhalen.
10
C. 3.3 ELEKTROPORATIE Wong en Neumann slaagden er in 1982 in om niet-permeabele moleculen in vitro via elektroporatie in levende cellen binnen te brengen [20]. Na zijn ontdekking werd het één van de standaardmethoden om DNA te introduceren in bacteriën, gisten, dierlijke en plantaardige cellen. Elektroporatie of elektrotransfectie wordt tegenwoordig vooral gebruikt bij biochemische of farmacologische studies [21]. Het doel van elektroporatie is om RNA, DNA, geneesmiddelen en proteïnen die normaal niet door het celmembraan getransporteerd worden, te introduceren in de cel [14]. De cellen worden blootgesteld aan één of meerdere elektrische ontladingen in de aanwezigheid van de in te brengen (bio)molecule. De aanwezigheid van een extern elektrisch veld genereert een verandering in het transmembraanpotentiaal [22]. Vanaf een bepaalde drempelwaarde ontstaan er hydrofiele poriën waardoor diffusie in de cel kan plaatsvinden. Zowel transiënte als stabiele poriën worden gevormd. De meeste poriën die gevormd worden zijn transiënt. Door hun korte levensduur (t1/2 = 1 µs) is het niet mogelijk om de cel via deze poriën binnen te dringen. Opname in de cel gebeurt via diffusie door stabiele poriën, zij hebben een aanzienlijk grotere halfwaardetijd [21]. Deze techniek heeft veel voordelen. Zo combineert deze gemakkelijke toepasbare techniek zeer hoge transfectiesnelheden met een hoge reproduceerbaarheid. Transfectie is mogelijk van delende en niet-delende cellen en elektroporatie kan meerdere keren op dezelfde doelcellen toegepast worden. In de meeste gevallen is dit noodzakelijk omdat er meestal transiënte expressie optreedt, want slechts een klein deel van de gediffundeerde moleculen komt in de celkern terecht. Deze techniek wordt gebruikt voor in vitro en in vivo toepassingen. Het grote nadeel aan deze techniek is de hoge celmortaliteit, die kan oplopen tot 70%. C. 3.4 CALCIUMFOSFAAT-DNA COPRECIPITATIE Ca3(PO4)2-DNA coprecipitatie werd voor het eerst beschreven door Graham en Van der Eb in 1973 [23]. Deze methode rust op het feit dat divalente metaalionen zoals Ca2+ ionische complexen gaat vormen met de fosfaten aanwezig in de backbone van DNA [24]. De neerslag, gevormd door een oplossing van plasmide DNA en CaCl2 aan een gebufferde fosfaatoplossing toe te voegen, wordt rechtsreeks in contact gebracht met de te transfecteren cellen gebracht. Het complex wordt dan door kanaal gemediëerde endocytose opgenomen in de cel. De lage transfectie-efficiëntie is het gevolg van snelle DNA afbraak en cytosol verplaatsing. Ondanks de snelle, simpele en goedkope werkwijze is de toepasbaarheid in vivo beperkt omdat het Ca3(PO4)2 in bulk neerslaat in het lichaam. Bijkomend nadeel is dat de reproduceerbaarheid laag is vanwege variatie in vorm en grootte van de complexen. Deze techniek wordt vooral toegepast voor in vitro transfectie tijdens routine lab onderzoeken.
11
C. 3.5 LIPOSOMALE GEN-AFGIFTESYSTEMEN Felgner et al. introduceren in 1987 met een nieuw soort vectoren als gen-afgiftesystemen, meer bepaald kationische lipiden [25]. Een kationische lipide is een amfifiele molecule en bevat drie componenten. Een hydrofobe lipide anker groep, die bestaat uit dubbele alifatische ketens of afgeleiden van cholesterol. Ten tweede bevat het lipide een linker groep die zorgt voor de chemische stabiliteit en eventueel biodegradeerbaarheid. Een derde, bij fysiologische pH positief geladen kop, zorgt voor de interactie met nucleïne zuren (figuur 1.3).
Figuur 1.3: N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfaat (DOTAP).
Vanaf een bepaalde concentratie assembleren de kationische lipiden zich tot een deeltje met een lipide dubbellaag, een liposoom. Het DNA wordt mee gecondenseerd door middel van elektrostatische interacties via de positief geladen kop. Het DNA kan ingekapseld worden in de sferische lipide dubbellaag of het kan gesandwiched worden tussen verschillende liposmale deeltjes met de vorming van zogenaamde lipoplexen (figuur 1.4) [13]. Liposoom dubbellaag
DNA
Geïncapsuleerd DNA
Figuur 1.4: Liposoom/DNA complex
De kationische lipoplexen worden in de cel opgenomen door een combinatie van membraanfusie en endocytose. De lipoplexen aggregeren continu met DNA om hun positieve lading te stabiliseren. Door hun lage stabiliteit moeten ze direct na vorming aan de doelcellen worden toegevoegd want de transfectie verlaagt met toenemende aggregatiegrootte. De transfectie-efficiëntie kan verhoogd worden door de lengte van de ketens te vergroten, de saturatiegraad ervan te verlagen of door neutrale lipiden toe te voegen [5]. Het neutrale co-lipide zorgt voor een conformatieverandering van de dubbellaag naar een hexagonale structuur op het endosomale niveau. Deze structuurverandering 12
zorgt ervoor dat het DNA beter vrijgesteld wordt in het cytoplasma, want een groot deel van de opgenomen complexen slaagt er niet in om uit de endosomen te ontsnappen [26]. De drie neutrale lipiden die het meest gebruikt worden om een hogere transfectie te verkrijgen zijn dioleoylfosfatidylethanolamine (DOPE), dioleoylfosfatidylcholine (DOPC) en cholesterol (Chol) (figuur 1.5). DOPE is een beter co-lipide in vitro terwijl cholesterol betere resultaten kan voorleggen in vivo [5]. De transfectie-efficiëntie van lipoplexen is nog altijd laag in vergelijking met virale vectoren. Ondanks hun lage transfectie-efficiëntie worden kationische liposomen gebruikt om grote hoeveelheden DNA af te leveren in veel verschillende celtypes. Liposomale vectoren worden gebruikt in behandelingen tegen mucoviscidose, artrose, kanker en cardiovasculaire ziektes. Door een lage immunogeniteit kan het herhaaldelijk gebruikt worden om in vivo genen af te leveren. De aggregatie van lipiden, afkomstig van afgebroken lipoplexen kunnen wel enige celtoxiciteit veroorzaken. Aggregatie kan vermeden worden door geëxtrudeerde, bilamellaire geïnvagineerde structuren op basis van DOTAP en Cholesterol te gebruiken [27]. De transfectie-efficiëntie kan gevoelig verhoogd worden door liposomale gen-afgiftesystemen te combineren met kationische polymeren. OO
CH2
P
O
CH
O
O
CH2
O
CH2
CH2
NH 3
O DOPE
Figuur 1.5: dioleoylfosfatidylethanolamine DOPE
C. 3.6 CEL PENETRERENDE PEPTIDEN Cel penetrerende peptiden (CPP) zijn amfifiele en/of kationische peptiden van relatief korte lengte (10-30 aminozuren). Ze bevatten zowel hydrofobe als hydrofiele delen en faciliteren celinternalisatie. Op die manier kunnen actieve moleculen zoals DNA doorheen het plasmamembraan van verschillende soorten cellen getransporteerd worden [28]. Hierdoor worden ze ook proteïne transductie domeinen (PTD’s) genoemd. De cell penetrerende peptides zijn gesynthetiseerd op basis van aminozuur sequenties van bepaalde proteïnen die zich doorheen celmembranen kunnen transloceren. Het werd voor het eerst geobserveerd door Green en Loewenstein. Een levende cel interneerde een 86 aminozuur lang fragment van het HIV-1 Tat proteïne, Tat 86 [29]. Enkele jaren nadien werd ontdekt dat het 60 aminozuur tellende homeodomein van het Anetennapedia proteïne van Drosophila ook zichzelf kon transloceren doorheen het celmembraan [30]. Uit onderzoek bleek dat de derde helix van dit domein verantwoordelijk en voldoende was voor de internalisatie. Dit resulteerde in het ontwikkelen van een 16 aminozuur lange cel penetrerend peptide, pAntp of Penetratine [29]. Al snel volgden verschillende andere proteïne afgeleide CPP’s, zoals de basis sequentie van het HIV-1 Tat proteïne [31] en het 13
model amfifiel peptide, MAP [32]. Het aantal gekende cel penetrerende peptiden blijft tot nu toe beperkt en verschillen in oorsprong, primaire sequentie en secundaire structuur [33]. Celopname bestaat uit twee stappen. Eerst treedt er een interactie op met het celoppervlak waarna het complex wordt opgenomen in de cel via directe translocatie of endocytose [34]. Het preciese mechanisme van celopname is tot op heden nog steeds een punt van discussie [35]. Er wordt aangenomen dat het grootste deel van de peptiden opgenomen wordt via verschillende vormen van endocytose. De aanwezigheid van guanidine groepen op de zijketens van kationische CPP bevordert celopname. De guanidine groep vormt bidentaat waterstofbruggen met proteoglycanen aanwezig op het celmembraan. Het meest gekende proteoglycaan is heparaan sulfaat, het kan het Tat-proteïne over zijn volledige lengte binden en helpen om door het membraan te transporteren. Bij CPP’s die ook substantiële hoeveelheden hydrofiele delen bevatten, is de hoeveelheid guanidine minder van belang. De aanwezigheid van hydrofobe en hydrofiele regio’s in de α-helix conformatie zorgen voor membraan destabilisatie en daaropvolgende internalisatie [36]. De grootste limitatie van CPP’s is dat het grootste deel van de geïnternaliseerde peptide cargo zich in een endosoom bevindt na celopname via endocytose. Ontsnappen uit het endosoom is vrijwel onmogelijk waardoor het peptide in een later stadium door het lysosoom zal gedegradeerd worden. Hierbij zullen de actieve moleculen die mee geïnternaliseerd werden ook onbeschikbaar worden [34]. In principe zijn er twee mogelijkheden om DNA in de cel te brengen via cel penetrerende peptiden. Het DNA kan op verschillende manieren covalent gebonden worden aan het CPP of het kan via coincubatie met DNA een complex vormen door toedoen van elektrostatische of hydrofobe interacties. Bij de covalente methode is er meer DNA nodig om een biologisch effect te verkrijgen. De moeilijk te vormen binding tussen het DNA en het CPP en de verschillende purificatiestappen die moeten uitgevoerd worden, maken deze techniek zeer arbeidsintensief. Het grote voordeel van de covalente methode is dat het complex een gedefinieerd moleculair gewicht heeft, wat veel voordelen biedt op klinisch vlak. Bij de co-incubatie methode kan er neutralisatie optreden tussen het kationisch CPP en het negatief geladen DNA. Om dit tegen te gaan kan het CPP gekoppeld worden aan een polymeer of fuseren met een bindings domein voor DNA of RNA [34]. Hoewel cel penetrerende peptides in vitro heel goed macromoleculen kunnen transporteren doorheen het celmembraan blijft het in vivo gebruik beperkt door de lage celspecificiteit. Nadat door injectie, Tat-β-galactosidase ingebracht werd in muizen, werd het gevormde proteïne teruggevonden over gans het lichaam inclusief de hersenen [37]. Door deze totale lichaamsverspreiding is een verhoogde dosis nodig om een bepaald medisch effect te verkijgen. Dit kan secundaire effecten met zich meebrengen, DNA kan bijvoorbeeld op willekeurige, niet te transfecteren plaatsen ingebouwd worden. Er wordt tegenwoordig allerlei onderzoek vericht naar CPP’s die celspecifiek zijn zodat de efficiëntie verhoogd en de blootstelling aan niet te transfecteren cellen geminimaliseerd wordt. Cel
14
interactieve peptides (CIP’s) worden ondermeer bekomen door enkele aminozuren toe te voegen aan de sequentie van CPP’s waardoor cel-specifieke opname mogelijk wordt. CIP’s vertonen een hoge specificiteit en sterke affiniteit voor een bepaald aantal cellen door een specifieke interactie met een receptor die exclusief aanwezig is op het oppervlak van deze cellen. Het meest bestudeerde is het RGD-peptide [35]. De affiniteit van een CIP voor receptoren kan nog verbeterd worden door cyclisatie of multimerisatie. Een gedraaide conformatie vertoont een hogere affiniteit voor een receptor dan het overeenkomstig lineair peptide [38]. Door multimerisatie wordt de affiniteit ook verhoogd omdat er lokaal een hogere concentratie optreedt aan ligand door de covalente link tussen twee of meer entiteiten. Als één ligand-receptor binding verbroken wordt is de kans statistisch groter dat er direct terug een binding zal optreden tussen receptor en het vrijgestelde ligand. De sterkte van de affiniteit wordt ook vergroot doordat een dimeer kan binden aan twee naast elkaar gelegen receptoren [35]. Verschillende polymeren werden reeds gekoppeld met cel interactieve peptides om de specificiteit te verhogen. C. 3.7 KATIONISCHE POLYMEREN De laatste groep niet-virale gen-afgiftesystemen die recentelijk meer en meer aan belang wint zijn kationische polymeren. Deze polymeren zijn bij fysiologische pH positief geladen waardoor er complexvorming kan optreden met DNA. Dit gebeurt door elektrostatische interacties tussen positieve groepen van het polymeer en de negatieve fosfaatgroep van DNA. Dit polyplex wordt via endocytose opgenomen in de cel waar het DNA vrijgesteld wordt waarna het kan migreren naar de celkern. Een aantal belangrijke polymeren die als gen-afgiftesystemen worden gebruikt zijn o.a. poly(ethyleen imine), poly(L-lysine), dendrimeren en pDMAEMA. Poly(ethyleen imine) Poly(ethyleen imine) of PEI is het meest bestudeerde polymeer in gentherapie sinds zijn ontdekking als gen-afgiftesysteem in 1995 (figuur 1.6) [39]. PEI polymeren worden als de ‘gouden standaard’ beschouwd van de niet-virale gen-afgiftesystemen door de relatief hoge transfectie-efficiëntie, die wordt bekomen. Polymeren met verschillend moleculair gewicht en vertakkingsgraden werden reeds gesynthetiseerd en zowel in vitro als in vivo geëvalueerd. Sterk vertakte derivaten van 25 kDa en 800 kDa worden het meest gebruikt samen met polymeren met een lagere vertakkingsgraad [40]. Door het hoge aantal aminogroepen is het mogelijk om DNA moleculen stevig te complexeren tot homogene sferische deeltjes van enkele tientallen nanometer die via endocytose kunnen opgenomen worden in de cel.
15
(CH2CH2N)
(CH2 CH2NH)
y
x
(CH2CH2 NH2 )
z
Figuur 1.6: Chemische structuur van poly(ethyleen imine)
Vertakt PEI wordt het meest gebruikt omdat het ook bijdraagt tot een destabilisatie van het lysosomale membraan. Het polyplex kan makkelijker ontsnappen uit het endosoom waardoor de kans op genexpressie vergroot [41]. PEI is in staat het DNA efficiënt te beschermen tegen degradatie door DNAsen door de hoge ladingsdensiteit. De vele positieve ladingen zorgen wel voor een verhoogde toxiciteit. Dit beperkt daarom het gebruik in vivo [42]. Verschillende factoren zoals vertakkingsgraad, zeta-potentiaal, ionensterkte van de oplossing, deeltjesgrootte en het moleculair gewicht beïnvloeden de efficiëntie en de cytotoxiciteit [43]. PEI met een moleculair gewicht van 25 kDa heeft de beste efficiëntie, maar gaat gepaard met een hoge cytotoxiciteit. Lagere moleculaire gewichten vertonen een lagere toxiciteit, maar de efficiëntie ligt ook lager. Het crosslinken van kleinere PEI wordt gebruikt om dit probleem te omzeilen [44]. Na crosslinking steeg de efficiëntie met 17 tot 80 maal in vivo t.o.v. de niet gemodificeerde polymeren [45]. Niet alleen door crosslinking maar ook door chemische modificatie van de stikstofatomen kan de toxiciteit verlaagd worden. PEI wordt vaak geconjugeerd met suikers en poly(ethyleen glycol) of PEG. De koppeling van PEG maskeert de oppervlaktelading van de nanopartikels, verlaagt de toxiciteit en reduceert niet specifieke interacties waardoor het langer in de bloedstroom blijft [46]. De aanwezigheid van guanidine groepen op de zijketens van cel penetrerende peptiden verhoogt de transfectie-efficiëntie via een bevorderde celopname door waterstofbrugbinding met de op de celwand aanwezige proteoglycanen. Uit testen blijkt dat de omzetting van de in PEI aanwezige primaire amines in guanidine groepen een gunstig effect heeft op de transfectie-efficiëntie. PEI van twee kDa met guanidine groepen vertoonde een 20 maal hogere transfectie-efficiëntie dan ongemodificeerd PEI met hetzelfde moleculair gewicht en twee maal hogere efficiëntie dan PEI van 25kDa [47]. Ondanks de verhoogde transfectie-efficiëntie is de cytotoxiciteit van PEI met guanidine groepen ongeveer hetzelfde als niet gemodificeerd PEI. De laatste jaren wordt ook vaak een disulfide linker in het polymeer geïntroduceerd. De aanwezigheid van deze linker verbetert op verschillende vlakken de gen-afgifte eigenschappen van het polymeer. Het vergroot de mogelijkheid om DNA te binden, het verbetert de endosomale vrijstelling van het polyplex en het verlaagt de toxiciteit [48]. Na vrijstelling van het DNA in de cel wordt het PEI gedissocieerd. Vrij PEI interageert met de negatief geladen membraan van de mitochondriën. Dit leidt tot cel-apoptose. Celtoxiciteit kan verlaagd worden door de kationische polymeren af te breken in kleine stukjes. Omdat disulfide bindingen intracellulair afbreekbaar zijn, 16
kan incorporatie van een disulfide binding tussen relatief korte stukken polymeer de celtoxiciteit verminderen. Uit observaties blijkt dat disulfide bevattende PEI’s een veel lagere toxiciteit bezitten dan het 25 kDa lineaire PEI. De toxiciteit t.o.v. Caco-2 cellen werd verlaagd met een factor 2 [48]. Poly(L-lysine) Poly(L-lysine) is een lineair polypeptide opgebouwd uit een herhaling van het aminozuur lysine (figuur 1.7A). Poly(L-lysine) of PLL was een van de eerste polymeren die gebruikt werd als niet-viraal gen-afgiftesysteem. PLL kan DNA condenseren tot deeltjes van 100 nm. De opname is even efficiënt als bij PEI complexen, doch ligt de transfectie-efficiëntie verschillende grote ordes lager dan PEI [42]. Een reden hiervoor kan zijn dat er weinig aminogroepen met pKa tussen 5 en 7 aanwezig zijn in PLL waardoor de bufferende eigenschappen beter zijn bij PEI. Hierdoor kan het complex moeilijk uit het endosoom ontsnappen met een lage transgenexpressie als gevolg [49]. De peptide ruggegraat kan door peptidasen afgebroken worden in de cel. Ondanks deze nuttige eigenschap is het gebruik van ongemodificeerd PLL in vivo relatief beperkt. De gevormde polyplexen zijn slecht oplosbaar in waterig midden en ze interageren met serum proteïnen. Dit zorgt voor een destabilisatie en snelle verwijdering uit de bloedstroom [50]. O C
O CH
C
NH
(CH2) 4
A
NH2
CH
NH
(CH2) 4
B
NH2
CH2 CH2 O x
y
NH
C
N
Figuur 1.7: A. poly(L-lysine) B. poly(L-lysine)-co-poly(ethyleen glycol) C. Imidazol functionele groep
De biocompatibiliteit kan verhoogd worden door imidazol groepen te gebruiken in plaats van primaire amines [2]. De heterocyclische imidazol groepen (pka ≈ 6) zorgen voor een betere endosomale vrijstelling doordat ze het bufferend gebied verbreden (figuur 1.7C). Na modificatie wordt een zelfde transfectie-efficiëntie bekomen als PEI maar met een lagere toxiciteit [51]. Dit komt door de verlaagde concentratie aan geladen groepen. Een andere modificatie die veelal toegepast wordt en ook bij PLL gunstige effecten heeft bekomen, is het gebruik van PEG (figuur 1.7B). Het wordt vaak door blok- of graft copolymerisatie geïntroduceerd. PEG bezit veel gunstige eigenschappen. Zo is het oplosbaar in zowel water als organische solventen en het is niet toxisch en niet immunogeen [52]. Een hogere transfectie efficiëntie, lagere toxiciteit en een langere verblijftijd werd bekomen na grafting van PLL met PEG [50]. Door PEG te linken met poly(L-lysine) via een disulfide binding worden dan weer stabielere complexen bekomen. De disulfide crosslinking beperkt dissociatie door uitwisseling van tegenionen [53]. 17
Dendrimeren Dendrimeren zijn synthetische, hypervertakte polymeren die oplosbaar zijn in waterige solventen doordat ze positief geladen eindgroepen bevatten. Slechts een beperkt aantal dendrimeren kunnen DNA efficiënt transfecteren met een beperkte toxiciteit. Hun transfectie en toxiciteit is afhankelijk van de grootte, de vorm en het aantal functionele groepen aan de buitenkant van het dendrimeer. De meest gebruikte dendrimeren voor gen-afgifte worden gesynthetiseerd via de divergente strategie en representeren de zesde generatie starburstTM polyamidoamine (PAMAM) dendrimeren (figuur 1.8). PAMAM dendrimeren kunnen naargelang hun structuur opgedeeld worden in twee klassen nl. de intacte (Polyfect®) of gebroken (Superfect®) vorm. PAMAM dendrimeren kunnen door hun multifunctioneel oppervlak bedekt met primaire amines DNA efficiënt binden, encapsuleren en transporteren [42]. Ze worden vaak gebruikt voor hun goede oplosbaarheid en mogelijkheid om hun cargo traag vrij te stellen. De hoge densiteit aan amines aan het oppervlak van PAMAM-dendrimeren zorgen voor een efficiënte condensatie van het DNA. De interne amine-functies verbeteren de bufferende eigenschappen van de denrimeren waardoor na celopname het complex makkelijker kan vrijgesteld worden uit het endosoom. Het DNA in de gevormde dendriplexen is volledig beschermd tegen aanvallen van nucleasen en peptidasen aanwezig in de bloedstroom.
A Verschillende generaties
Figuur 1.8: Chemische structuur van PAMAM dendrimeer
Zoals alle niet-virale vectoren vertonen ook dendrimeren neveneffecten. Ze bezitten een inherente cytotoxiciteit, worden opgenomen in het reticloëndotheliale syteem en veroorzaken hemolyse [54]. Verschillende groepen proberen door modificatie de transfectie-efficiëntie te verbeteren en de toxiciteit te verlagen. Zo werden reeds dendrimeren gecomplexeerd met plasmiden die coderen voor een reportergen, covalent gekoppeld met het amfifiele petide GALA en chemisch gemodificeerd met PEG [45]. PAMAM-dendrimeren die gebaseerd zijn op disulfide bindingen vertoonden een lagere cytotoxiciteit dan hun analogen zonder disulfidebinding [48]. Nam et al. modificeerden PAMAM
18
dendrimeren met arginine. De invoer van guanidine functies, aanwezig in arginine, verhoogde de in vitro transfectie-efficiëntie van PAMAM tot boven de efficiëntie van PEI [55]. Daareenboven bezitten de argininerijke PAMAM dendrimeren een lagere cytotoxiciteit dan PEI. Methacrylaat gebaseerde systemen Polymeren op basis van methacrylaten werden reeds uitvoerig bestudeerd als kationische drager van therapeutisch materiaal. Kationische polymeren met alifatische hoofdketens zijn niet biodegradeerbaar. Ze kunnen evenwel makkelijker gesynthetiseerd (vaak in 1 pot synthese) en vertonen soms ook hoge transfectie-efficiënties. Door selectie van de juiste monomeren kunnen zijgroepen met gewenste functionele eigenschappen bekomen worden (bufferen, koppelen, interactie). Homoen copolymeren met tertiaire amines (Poly[2-(dimethylamino) ethyl methacrylaat] of PDMAEMA) worden frequent onderzocht. De aanwezige tertiaire amines kunnen elektrostatische interacties aangaan met nucleïne zuren (figuur 1.9). Dit stelt PDMAEMA in staat om DNA effectief te condenseren in kleine, positief geladen deeltjes die verschillende cellen kunnen transfecteren. Studies met poly(ethyleen imine) brachten naar voor dat de aanwezigheid van tertiaire amines de vrijstelling vanuit het endosoom zou moeten vergemakkelijken [56]. Uit in vivo studies van Zuidam et al. blijkt dat na 24u incubatie de polyplexen nog steeds aanwezig zijn in de endosomen. De genaflevering na in vivo injectie van PDMAEMA is wel effectiever dan vertakt PEI en PLL [57]. Om een hoge transfectie te vertonen moet naast de endosomale verblijftijd ook de cytotoxiciteit en de niet specifieke interacties verlaagd worden. De synthese van copolymeren kan een oplossing bieden voor deze problemen. Zo werden er reeds blok- en graftcopolymeren van PEG en PDMAEMA gesynthetiseerd. Het graft copolymeer vertoont een lagere stabiliteit dan PDMAEMA maar interageert minder met serum albumines, die zorgen voor snelle verwijdering uit de bloedstroom. Dit effect steeg met stijgend aantal gegrafte PEG eenheden [58]. Uit een andere test blijkt dat random copolymeren van PDMAEMA en ethoxytriethyleen glycol of N-vinylpyrrolidon een verlaagde cytotoxiciteit vertoonden. De copolymeren met een moleculair gewicht tot 170 kDa hadden dezelfde transfectie-efficiëntie als het homopolymeer met een analoog moleculair gewicht. De transfectie daalde echter bij copolymeren met een moleculair gewicht groter dan 170 kDa. Tot op vandaag zijn researchers op zoek naar copolymeren op basis van PDMAEMA met een betere transfectie. Het homopolymeer van poly[2-(dimethylamino) ethyl methacrylaat] blijft op enkele uitzonderingen na de hoogste transfectie vertonen [45].
19
CH3 CH2 C C
O
O CH2 CH2 N H3 C
CH3
Figuur 1.9: Chemische structuur van Poly[2-(dimethylamino) ethyl methacrylaat] of PDMAEMA
D. Te overwinnen barrières Dat plasmide DNA door een passief proces de celkern kan binnendringen is zeer onwaarschijnlijk. De verschillende membranen en het visceuse cytoplasma zijn gemaakt om niet gewenste moleculen buiten de cel of uit bepaalde compartimenten binnen de cel te houden. Een goede vector assisteert op verschillende vlakken de transfectie van een cel door polyplexen. In een ideaal scenario kan het polyplex zich tot de juiste doelcel richten, geïnternaliseerd worden, ontsnappen uit het endosoom en uiteindelijk aflevering van het plasmide DNA aan de nucleus mogelijk maken. Het transfectie proces kan onderverdeeld worden in verschillende deelprocessen (figuur 1.10). I)
DNA condensatie
II)
Celopname van het complex: ‘internalisatie’
III)
Endosomale vrijstelling van het complex
IV)
Polyplex dissociatie
V)
Translocatie naar de celkern
VI)
Genexpressie met proteïne vorming
20
Figuur 1.10: Schematisch overzicht van het transfectieproces [59]
D.1) DNA condensatie De condensatie van het DNA is de eerste stap in het transfectieproces. Polymeren dienen groepen te bevatten die positief geladen zijn bij fysiologische pH (vaak amines). Door het mengen van het synthetische polykation met DNA worden er spontaan interpolyelektrolietcomplexen (IPEC’s) gevormd. De positieve geladen groepen van het polymeer neutraliseren de negatief geladen fosfaatgroepen van het DNA via elektrostatische interacties, waardoor er condensatie van het DNA optreedt. De vorming van deze polyplexen is cruciaal voor de bescherming van het DNA tegen extraen intracellulaire nucleasen en voor celopname. De omvangrijke structuur van het DNA (100’en nm tot enkele µm) moet ook gecondenseerd worden tot een klein partikel om celopname mogelijk te maken.
D.2) Celopname van het complex: ‘internalisatie’ De eerste barrière die het polyplex dient te overwinnen is het plasma- of celmembraan. Toegang tot de cel kan niet verkregen worden door passieve diffusie omdat de transmembraanporiën en kanalen dit niet toelaten [59]. Internalisatie van polyplexen gebeurt op dezelfde natuurlijke manier waarmee cellen nutriënten en bacteriën uit de extracellulaire ruimte opnemen, via endocytose. Algemeen wordt aangenomen dat kleinere polyplexen beter opgenomen worden door endocytose dan grotere [60]. De condensatie is dus van cruciaal belang omdat de afmeting van het complex bepaalt of ze al dan niet in de cel worden opgenomen. De deeltjesgrootte bepaalt welk soort endocytose zal tussen komen om de molecule in de cel op te nemen. Aangezien de meeste polymeer-DNA complexen allemaal van dezelfde grootteorde zijn 21
(ca 30-150 nm), worden ze meestal geïnternaliseerd door pinocytose. Om celopname via pinocytose te laten gebeuren, mag het partikel maximum 150 tot 200 nm groot zijn. Bij dit opnameproces wordt er in eerste instantie een clathrine mantel gevormd aan de basolaterale zijde van de celmembraan. Dit netwerk zorgt ervoor dat het membraan begint in te stulpen, waardoor er een vesikel gevormd wordt. Vervolgens wordt de gevormde instulping, na binding met het proteïne dynamine, afgesnoerd in het cytoplasma van de cel. Hierna wordt de clathrine mantel afgesplitst en versmelten een aantal vesikels tot een endosoom [3]. Een opname in de cel kan doelgericht of niet-specifiek zijn. Niet-specifieke opname gebeurt doordat sommige polyplexen cellulaire opname induceren door een interactie met anionische ladingen aanwezig in het dubbele lipidemembraan, de proteoglycanen (figuur 1.11.III). Het graften van lipofiele ketens op het polymeer kan celopname in de hand werken door interactie tussen de fosfolipide dubbellaag waaruit het celmembraan opgebouwd is met deze lipofiele residuën (figuur 1.11.IV). Koppeling van het polymeer met een CPP versnelt ook celopname door verschillende soorten interacties (figuur 1.11.V). Het mechanisme waarmee cel penetrerende peptiden worden opgenomen is nog niet exact gekend. Het grote probleem bij polymeer-DNA complexen, is dat ze met een lage specificiteit worden opgenomen in de cel omdat pinocytose een niet-selectief opnameproces is. Indien het zou mogelijk zijn om een interactie aan te gaan met receptoren aanwezig op het plasmamembraan van één soort cellen, kan doelgerichte celopname mogelijk worden. Dit kan door het polyplex te koppelen met bepaalde stuurgroepen zoals antilichamen, peptiden of galactose-eenheden die interageren met specifieke receptoren. Na binding vindt een selectiever opnameproces plaats namelijk receptor-gemediëerde endocytose (figuur 1.11.I). De incorporatie van de RGD-sequentie in PLL-DNA complexen verhoogde de transfectie van cellen in vitro, dit door internalisatie te promoten na interactie met integrine receptoren, zoals het geval is voor adenovirussen [18]. Sommige cellen kunnen door fagocytose grotere deeltjes opnemen (>250 nm). Deze methode is beperkt tot een aantal celtypes waardoor ze doelgericht is, maar voor opname van polyplexen minder belangrijk is (figuur 1.11.II).
22
Figuur 1.11: Specifieke en niet specifieke celopname, I. receptor gemedieerde endocytose, II. Fagocytose, III. Interactie met proteoglycanen, IV. Lipofiele interactie met fosfolipiden V. koppeling met cel penetrerende peptiden [59]
D.3) Endosomale vrijstelling van het complex Na cellulaire opname kunnen er verschillende intracellulaire routes gevolgd worden door de endosomen. Het vesikel kan gerecycleerd worden naar het cel-oppervlak, het kan afgeleverd worden aan intracellulaire organellen zoals het Golgi-apparaat of het kan versmelten met zure vesikels, de lysosomen [59]. Dit celorganel die zich in een omgeving met verlaagde pH bevindt, bevat hydrolytische enzymen zoals nucleasen, sulfatasen en fosfatasen die o.a. het DNA kunnen afbreken. Het polyplex moet dus uit het endosoom kunnen ontsnappen voordat er samensmelting met de lysososmen optreedt om enzymatische degradatie te vermijden. Er bestaan verschillende hypothesen over de manier waarop het polyplex vrijgesteld wordt uit het endosoom, de meest gebruikte is de protonspons theorie van Behr [61]. In onderstaande figuur is het protonsspons effect schematisch weergegeven (figuur 1.12).
Figuur 1.12: Schematische voorstelling van het protonspons effect
23
Wanneer een polymeer-DNA complex geïnternaliseerd wordt, daalt de zuurtegraad van fysiologische pH (7,3) tot endosomale pH (5-5,5). De meeste kationische polymeren bevatten protoneerbare aminogroepen zoals secundaire en tertiaire amines en imidazol groepen. In het endosoom vindt er door de pH daling verdere protonatie plaats van de aminefuncties omdat deze over bufferende capaciteiten beschikken als gevolg van het nabuur effect. Bij pH = 7 zijn bijna alle amines volledig geprotoneerd, in een polymeer is dit echter anders door dit nabuur effect. In een polymeer heeft slechts een beperkt aantal amines een pKa van 9,5. De pKa van naburige amines daalt. De bufferende capaciteit wordt dus veroorzaakt door de aanwezigheid van amines met een pKa tussen 9,5 en 5. De protonatie van het kationisch polymeer verstoort de endosomale pH waardoor het vesiculaire ATPase zorgt voor een toevoer van protonen en zijn chloride tegenionen om de pH constant te houden. De verhoogde ionensterkte induceert een osmotisch effect. De endosomen zwellen door een verhoogde waterinflux tot ze uiteindelijk openbarsten met vrijstelling van het polyplex [61]. De lysering van de endosomen zou mede in de hand gewerkt worden doordat de afmeting van het polymeer-DNA complex toeneemt bij verdere protonatie. Tot op heden is er nog altijd discussie over de juistheid van deze hypothese. De aanwezigheid van hoge concentraties aan protoneerbare groepen is van vitaal belang om de dalende pH te bufferen. Dit verlengt de levensduur van het vesikel vooraleer het feitelijke lysosomale stadium bereikt wordt en dus verhoogt de kans dat spontane translocatie in het cytoplasma optreedt [18].
D.4) Polyplex dissociatie De dissociatie van DNA en zijn vector is noodzakelijk om efficiënte genexpressie te verkrijgen. De efficiëntie wordt verhoogd indien dissociatie pas plaatsgrijpt in de celkern tijdens het transport van de polyplexen naar de celkern. Als dissociatie in de kern plaatsvindt, wordt de residentietijd van naakt DNA in het nuclease rijke-cytosol geminimaliseerd maar wordt de vector mee geïncorporeerd in de kern terwijl zijn functie dan reeds vervuld is [62]. Daarom wordt het DNA idealiter vlak voor celkernopname gedissocieerd. Om dit te bereiken kunnen thermoresponsieve polymeren zoals poly(N-isopropylacrylamide) gebruikt worden als vectoren. De inbouw van hydrolytisch degradeerbare (esters) of reduceerbare (disulfide) linkers in het kationisch polymeer worden ook vaak toegepast [42]. Het cytosol bevat een aanzienlijke hoeveelheid reducerend glutathion dat efficiënt disulfidebindingen kan breken en zodoende DNA laat dissociëren.
24
Het vrijgestelde polymeer moet ook biocompatibel zijn. Om een goed gen-afgiftesysteem te zijn moet een vector een zekere systemische stabiliteit hebben in de bloedstroom alsook weinig toxische effecten induceren op cellulair niveau zoals hemagglutinatie en hemolyse. Het polymeer kan zodanig gemodificeerd (PEG modificatie of het invoeren van biodegradeerbare eigenschappen) worden dat de kationische lading van het polymeer deels geneutraliseerd wordt na vrijstelling. Hierdoor kan het polymeer minder elektrostatische interacties aangaan met anionische delen in de cel zodat de celfuncties minder verstoord worden.
D.5) Translocatie naar de celkern De laatste stap van het transfectieproces waarbij het kationisch polymeer het DNA van dienst kan zijn, is de verplaatsing doorheen het cytoplasma naar de celkern. Polyplexen die in het cytosol terecht komen worden onmiddellijk geconfronteerd met een metabolische, vijandige omgeving. In het cytosol bevinden zich nucleolitische enzymen, verspreid tussen de microtubuli, intermediaire filamenten en microfilamenten, die in staat zijn niet-beschermde nucleïnezuren te degraderen. Deze filamenten verstevigen het cytoskelet en helpen de cel in het transport van vesikels, chromosomen en macromoleculen [59]. Het cytoskelet verhindert de vrije diffusie van naakt DNA groter dan 250 bp. Het vrij diffunderen van polyplexen richting de kern is onmogelijk. Het ver van de kern vrijgestelde polyplex moet gebruik maken van de aanwezige cytoplasmatische transportsystemen om de afstand tot de kern te overbruggen. Het dyneïne systeem begeleidt partikels van het endosoom richting de perinucleaire regio. Als het gen-afgiftesyteem te vroeg uit het endosoom ontsnapt, kan het nooit de binnenste regionen van de cel bereiken, omdat er geen interactie met het dyneïne proteïne kan plaatsvinden. Door een ligand dat bindt met het dyneïne proteïne te incorporeren in het polyplex wordt de transporttijd verkort en kan verbeterd celtransport bekomen worden [18]. Een andere mogelijkheid om de residentietijd in het cytosol te verkleinen, transport richting de kern te promoten en nucleaire import mogelijk te maken, kan door het DNA of polymeer te koppelen met zogenaamde nucleaire lokalisatiesignalen (NLS). Proteïnen kleiner dan 40 kDa kunnen passief diffunderen doorheen het kernmembraan via de nucleaire porie complexen (NPC). Deze poriën bevatten één of meerdere kanalen en zijn samengesteld uit een honderdtal proteïnen. Macromoleculen zoals proteïnen en DNA hebben in tegenstelling tot kleine moleculen assistentie nodig om hen actief door deze poriën te loodsen. Cytosolische proteïnen die bestemd zijn voor de nucleus bevatten een bepaalde peptidesequentie, het nucleair localisatiesignaal. Deze 4 tot 8 aminozuur lange sequentie wordt herkend door de importproteïnen die ze daarop direct de nucleus binnenbrengen [59]. Het meest bekende NLS is de het Simian Virus 40 groot-T-antigen. Ligatie van het polyplex met dit soort peptidesequenties zorgt voor een verhoging van de transfectie-efficiëntie [42].
25
E. Doel van de masterscriptie Tot nu toe vertoont geen enkel polymeer gen-afgiftesysteem zowel een goede biocompatibiliteit alsook een hoge transfectie-efficiëntie. Een grote hoeveelheid therapeutisch DNA kan wel afgeleverd worden in de cel, maar dit gaat vaak gepaard met een lage transfectie-efficiëntie en een hoge cytotoxiciteit waardoor de toepassingen van polymeer gen-afgiftesystemen in vivo tot nu toe beperkt bleven. In deze scriptie zullen meerdere polymeer vectoren op basis van een biodegradeerbaar polypeptide afgeleid van L-glutaminezuur gesynthetiseerd en getest worden. Op de zijketens zullen primaire en tertiaire amines, histidine, guanidine en hydroxylgroepen ingebouwd worden om de genafgifte eigenschappen te verbeteren en de biocompatibiliteit te verhogen. De polymeren zullen chemisch gekarakteriseerd worden, waarna ze ook op fysicochemisch en biologisch vlak geëvalueerd zullen worden. De chemische eigenschappen van het polymeer worden bepaald adhv NMR- en IRspectrometrie, gel permeatie chromatografie en viscosimetrie. De fysicochemische evaluatie gebeurt door middel van agarose gel-elektroforese, ethidiumbromide fluorescentie, dynamische licht verstrooiing en bepaling van de zeta-potentiaal. Verder zal ook de degradatiecapaciteit, de afscherming t.o.v. nucleasen en de interactie met bloed via hemolyse en hemagglutinatie nagegaan worden zodat de biologische implicaties kunnen ingeschat worden.
26
F. Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.
Dekie, L., et al., Poly-L-glutamic acid derivatives as vectors for gene therapy. Journal of Controlled Release, 2000. 65(1-2): p. 187-202. Dekie, L., Synthese en evaluatie van poly-L-glutaminezuurderivaten als vectoren voor gentherapie. 2001, Ugent: Gent. Dubruel, P., Studie van synthetische polymeren als vectoren voor gentherapie. 2003, Universiteit Gent: Gent. Griesenbach, U., D.M. Geddes, and E. Alton, Gene therapy for cystic fibrosis: an example for lung gene therapy. Gene Therapy, 2004. 11: p. S43-S50. Giordano, C., F. Causa, and G. Candiani, Gene therapy: The state of the art and future directions. Journal of applied Biomaterials & Biomechanics, 2006. 4(2): p. 73-79. Xu, L., K.F. Pirollo, and E.H. Chang, Tumor-targeted p53-gene therapy enhances the efficacy of conventional chemo/radiotherapy. Journal of Controlled Release, 2001. 74(1-3): p. 115-128. Wolkowicz, R. and G.P. Nolan, Gene therapy progress and prospects: Novel gene therapy approaches for AIDS. Gene Therapy, 2005. 12(6): p. 467-476. Lin, C. and J.F.J. Engbersen, Effect of chemical functionalities in poly(amido amine)s for nonviral gene transfection. Journal of Controlled Release, 2008. 132(3): p. 267-272. Anderson, W.F., Human gene therapy. Nature, 1998. 392(6679): p. 25-30. Palu, G., et al., Progress with retroviral gene vectors. Reviews in Medical Virology, 2000. 10(3): p. 185-202. Wang, C. and P.T. Pham, Polymers for viral gene delivery. Expert Opinion on Drug Delivery, 2008. 5(4): p. 385-401. Hermens, W. and J. Verhaagen, Viral vectors, tools for gene transfer in the nervous system. Progress in Neurobiology, 1998. 55(4): p. 399-432. El-Aneed, A., An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. Journal of Controlled Release, 2004. 94(1): p. 1-14. Van Tendeloo, V.F.I., C. Van Broeckhoven, and Z.N. Berneman, Gene therapy: principles and applications to hematopoietic cells. Leukemia, 2001. 15(4): p. 523-544. Chaum, E. and M.P. Hatton, Gene therapy for genetic and acquired retinal diseases. Survey of Ophthalmology, 2002. 47(5): p. 449-469. Toyoda, K., et al., Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke, 1998. 29(10): p. 2181-2187. Bleiziffer, O., et al., Gene transfer strategies in tissue engineering. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2007. 11(2): p. 206-223. Pouton, C.W. and L.W. Seymour, Key issues in non-viral gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2001. 46(1-3): p. 187-203. Mathei, C., P. VanDamme, and A. Meheus, Hepatitis B vaccine administration: Comparison between jet-gun and syringe and needle. Vaccine, 1997. 15(4): p. 402-404. Wong, T.K. and E. Neumann, ELECTRIC-FIELD MEDIATED GENE-TRANSFER. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1982. 107(2): p. 584-587. Mir, L.M., Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry, 2001. 53(1): p. 1-10. Neumann, E., S. Kakorin, and K. Toensing, Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1999. 48(1): p. 3-16. Graham, F.L. and A.J. Vandereb, NEW TECHNIQUE FOR ASSAY OF INFECTIVITY OF HUMAN ADENOVIRUS 5 DNA. Virology, 1973. 52(2): p. 456-467. Roy, I., et al., Calcium phosphate nanoparticles as novel non-viral vectors for targeted gene delivery. International Journal of Pharmaceutics, 2003. 250(1): p. 25-33.
27
25.
26. 27. 28. 29. 30.
31.
32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.
39.
40.
41. 42.
43.
44.
45.
Felgner, P.L., et al., LIPOFECTION - A HIGHLY EFFICIENT, LIPID-MEDIATED DNA-TRANSFECTION PROCEDURE. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1987. 84(21): p. 7413-7417. Hafez, I.M., N. Maurer, and P.R. Cullis, On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy, 2001. 8(15): p. 1188-1196. Templeton, N., Nonviral Delivery for Genomic Therapy of Cancer. World Journal of Surgery, 2009. 33(4): p. 685-697. Schwarze, S.R., K.A. Hruska, and S.F. Dowdy, Protein transduction: unrestricted delivery into all cells? Trends in Cell Biology, 2000. 10(7): p. 290-295. Lundberg, P. and U. Langel, A brief introduction to cell-penetrating peptides. Journal of Molecular Recognition, 2003. 16(5): p. 227-233. Joliot, A., et al., ANTENNAPEDIA HOMEOBOX PEPTIDE REGULATES NEURAL MORPHOGENESIS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1991. 88(5): p. 1864-1868. Vives, E., P. Brodin, and B. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. Journal of Biological Chemistry, 1997. 272(25): p. 16010-16017. Oehlke, J., et al., Extensive cellular-uptake into endothelial cells of an amphipathic beta-sheet forming peptide. Febs Letters, 1997. 415(2): p. 196-199. Kerkis, A., et al., Properties of cell penetrating peptides (CPPs). Iubmb Life, 2006. 58(1): p. 713. Mae, M., et al., Chemically modified cell-penetrating peptides for the delivery of nucleic acids. Expert Opinion on Drug Delivery, 2009. 6(11): p. 1195-1205. Vives, E., J. Schmidt, and A. Pelegrin, Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery. Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews on Cancer, 2008. 1786(2): p. 126-138. Scheller, A., et al., Structural requirements for cellular uptake of alpha-helical amphipathic peptides. Journal of Peptide Science, 1999. 5(4): p. 185-194. Patel, L.N., J.L. Zaro, and W.C. Shen, Cell penetrating peptides: Intracellular pathways and pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical Research, 2007. 24(11): p. 1977-1992. Haubner, R., D. Finsinger, and H. Kessler, Stereoisomeric peptide libraries and peptidomimetics for designing selective inhibitors of the alpha(V)beta(3) integrin for a new cancer therapy. Angewandte Chemie-International Edition, 1997. 36(13-14): p. 1375-1389. Boussif, O., et al., A VERSATILE VECTOR FOR GENE AND OLIGONUCLEOTIDE TRANSFER INTO CELLS IN CULTURE AND IN-VIVO - POLYETHYLENIMINE. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995. 92(16): p. 7297-7301. Fischer, D., et al., A novel non-viral vector for DNA delivery based on low molecular weight, branched polyethylenimine: Effect of molecular weight on transfection efficiency and cytotoxicity. Pharmaceutical Research, 1999. 16(8): p. 1273-1279. Kichler, A., et al., Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. Journal of Gene Medicine, 2001. 3(2): p. 135-144. Merdan, T., J. Kopecek, and T. Kissel, Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002. 54(5): p. 715758. Kunath, K., et al., Low-molecular-weight polyethylenimine as a non-viral vector for DNA delivery: comparison of physicochemical properties, transfection efficiency and in vivo distribution with high-molecular-weight polyethylenimine. Journal of Controlled Release, 2003. 89(1): p. 113-125. Thomas, M., et al., Cross-linked small polyethylenimines: While still nontoxic, deliver DNA efficiently to mammalian cells in vitro and in vivo. Pharmaceutical Research, 2005. 22(3): p. 373-380. Tiera, M.J., F.M. Winnik, and J.C. Fernandes, Synthetic and natural polycations for gene therapy: State of the art and new perspectives. Current Gene Therapy, 2006. 6(1): p. 59-71. 28
46.
47. 48. 49.
50.
51.
52. 53. 54.
55. 56.
57.
58.
59. 60. 61. 62.
Koyama, Y., et al., Novel poly(ethylene glycol) derivatives with carboxylic acid pendant groups: synthesis and their protection and enhancing effect on non-viral gene transfection systems. Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition, 2003. 14(6): p. 515-531. Lee, Y., et al., Enhancement of the transfection efficiency of poly(ethylenimine) by guanidylation. Bulletin of the Korean Chemical Society, 2008. 29(3): p. 666-668. Lin, C. and J.F.J. Engbersen, The role of the disulfide group in disulfide-based polymeric gene carriers. Expert Opinion on Drug Delivery, 2009. 6(4): p. 421-439. Merdan, T., et al., Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research, 2002. 19(2): p. 140-146. Toncheva, V., et al., Novel Vectors for gene delivery formed by self-assembly of DNA with poly(L-lysine) grafted with hydrophilic polymers. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 1998. 1380(3): p. 354-368. Putnam, D., et al., Polymer-based gene delivery with low cytotoxicity by a unique balance of side-chain termini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001. 98(3): p. 1200-+. Hoste, K., studie van poly(ethyleenglycol)-geënte polyglutamines als dragermolecule voor de bereiding van macromoleculaire geneesmiddelderivaten. 1999, Universiteit Gent: Gent. Bauhuber, S., et al., Delivery of Nucleic Acids via Disulfide-Based Carrier Systems. Advanced Materials, 2009. 21(32-33): p. 3286-3306. Yellepeddi, V.K., A. Kumar, and S. Palakurthi, Surface modified poly(amido)amine dendrimers as diverse nanomolecules for biomedical applications. Expert Opinion on Drug Delivery, 2009. 6(8): p. 835-850. Nam, H.Y., et al., Evaluation of generations 2, 3 and 4 arginine modified PAMAM dendrimers for gene delivery. International Journal of Pharmaceutics, 2008. 363(1-2): p. 199-205. Reschel, T., et al., Physical properties and in vitro transfection efficiency of gene delivery vectors based on complexes of DNA with synthetic polycations. Journal of Controlled Release, 2002. 81(1-2): p. 201-217. Verbaan, F.J., et al., A comparative study of different cationic transfection agents for in vivo gene delivery after intravenous administration. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 2004. 14(2): p. 105-111. Dubruel, P. and E.H. Schacht, Effect of polyethylene oxide blocks or grafts on the physicochemical properties of poly(2-N-(dimethylaminoethyl) methacrylate) DNA complexes. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2000. 15(4): p. 279-296. Wong, S.Y., J.M. Pelet, and D. Putnam, Polymer systems for gene delivery-past, present, and future. Progress in Polymer Science, 2007. 32(8-9): p. 799-837. Gebhart, C.L. and A.V. Kabanov, Evaluation of polyplexes as gene transfer agents. Journal of Controlled Release, 2001. 73(2-3): p. 401-416. Belguise-Valladier, P. and J.P. Behr, Nonviral gene delivery: Towards artificial viruses. Cytotechnology, 2001. 35(3): p. 197-201. Pollard, H., et al., Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry, 1998. 273(13): p. 7507-7511.
29
Hoofdstuk 2: Synthese van biodegradeerbare polyL-glutamine derivaten A. Overzicht van het syntheseproces Polymeren moeten zoals eerder vermeld aan een aantal voorwaarden voldoen om als genafgiftesysteem gebruikt te kunnen worden. Zo moet het polymeer in staat zijn het DNA te condenseren tot een klein partikel om celopname mogelijk te maken en bescherming te bieden tegen de verschillende afweersystemen van het menselijk lichaam. Door modificatie van de vector kan de celspecificiteit verhoogd worden, een betere endosomale vrijstelling verwezenlijkt worden en een betere opname in de celkern mogelijk gemaakt worden. Tot op heden zijn de meest bestudeerde vectoren PEI, PLL, dendrimeren en afgeleiden van pDMAEMA. Het nadeel van veel vectoren is dat een groot aantal een aanzienlijke cyto- en hemotoxiciteit bezitten [1] en niet biodegradeerbaar zijn waardoor ze zich na herhaaldelijke toediening in het lichaam kunnen opstapelen. In het kader van deze thesis zullen daarom polymeren op basis van L-glutamine gesynthetiseerd worden. Er wordt verwacht dat de polymeren een lage cytotoxiciteit bezitten, biodegradeerbaar zijn en substantiële transfectie uitlokken. De bekomen polymeren zijn biodegradeerbaar door de amidefuncties in de hoofdketen en bezitten een lage toxiciteit door de aanwezigheid van o.a. neutrale functionele groepen. In een eerste stap wordt het beginproduct, L-glutaminezuur, selectief veresterd met de vorming van γ-benzyl-L-glutamaat. Polymerisatie van γ-benzyl-L-glutamaat is 30
mogelijk na vorming van een cyclisch product, een N-carboxyanhydride (NCA) dat verkregen wordt na reactie met difosgeen. Dit NCA kan via een ringopeningspolymerisatie leiden tot poly-γ-benzyl-Lglutamaat (pBG). Vervolgens kunnen door aminolyse verschillende functionele groepen ingebouwd worden met vorming van een statistisch copolymeer (figuur 2.1). In de volgende paragrafen wordt elke stap van de synthese in detail besproken. O O H2N H2N
CH
CH
COOH
HN O
CH2
COOH
CH2
bescherming verestering
CH2 COOH
CH2 C
CH2
cyclisatie O
CH2
O
C
CH2
O
O
CH2
polymerisatie
O
O HN
CH
HN
C
C
CH2
CH2 CH2 C
CH
aminolyse O
CH2 C
NH
O
CH2
CH2
O
CH2 R
Figuur 2.1: algemeen overzicht van het syntheseproces van functionele polymeren voor gentherapeutische toepassingen
B. Synthese van γ-benzyl-L-glutamaat De rechtstreekse en selectieve verestering van L-glutaminezuur werd reeds beschreven in 1956 [2]. Aangezien deze procedure omslachtig is en gepaard gaat met lage rendementen werd de synthese uitgevoerd zoals beschreven in het doctoraatswerk van R. Vercauteren [3]. De reactie van L31
glutaminezuur en benzylalcohol gebeurt bij kamertemperatuur in diethylether en wordt gekatalyseerd door zwavelzuur (figuur 2.2). Na overnacht roeren wordt water toegevoegd en wordt het mengsel gekoeld (0°) en tot pH = 6 gebracht met LiOH. Hierbij precipiteert het γ-benzyl-Lglutamaat. Na filtratie en wassen met water, ethanol en ether wordt het product nogmaals omgekristalliseerd uit water/ethanol (9/1). Deze procedure, onder milde omstandigheden, kan doorgaan met een rendement van ongeveer 50%.
H2 N
CH
CH2 OH
COOH
H2N
CH2 CH2
CH
COOH
CH2
H2SO4
CH2 C
COOH
O
O CH2
Figuur 2.2: synthese van γ-benzyl-L-glutamaat
C. Synthese van het N-carboxyanhydride van γ-benzyl-Lglutamaat Om een polymeer, bestaande uit een herhaling van hetzelfde aminozuur te bekomen, dient een monomeer beschikbaar te zijn die kan gepolymeriseerd worden. Dit kan verwezenlijkt worden door de vorming van het overeenkomstig N-carboxyanhydride (“Leuch’s anhydride”) [4]. De eenvoudigste en meest gebruikte methode voor de omzetting van γ-benzyl-L-glutamaat in zijn overeenkomstig Ncarboxy-α-aminozuuranhydride (NCA) bestaat uit de reactie van het aminozuur met fosgeen. Deze methode, waarbij fosgeengas direct aan het reactiemengsel wordt toegevoegd, werd ontwikkeld door Fuchs-Farthing [5]. Tijdens de reactie met fosgeen wordt een N-chloroformylaminozuur gevormd dat verder reageert tot het overeenkomstig NCA. Het gebruik van fosgeen is gevaarlijk. Het fosgeen is niet alleen een zeer toxisch gas maar er zijn ook grote hoeveelheden nodig om de reactie te laten doorgaan. Het ongecontroleerd toevoegen van grote hoeveelheden fosgeen kan aanleiding geven tot nevenreacties zoals HCl productie die verdere cyclisatie verhinderen. Er zijn ook verschillende omkristallisaties nodig om zuiver NCA te bekomen [6]. Deze belemmeringen hebben geleid tot het gebruik van difosgeen en trifosgeen bij de synthese van NCA.
32
O O O H2N
CH
COOH
O
Cl3CO
C
CH2 Cl
CH2 C
OCCl3
HN HN
CH
COOH CH2 HCl (g)
CH2 O
EtOAc, Ar
O
O
CH2
C
Ar O
O
CH2
CH2
HOCCl3 (g)
CH2 C
O
O CH2
Figuur 2.3: synthese van γ-benzyl-L-glutamaat NCA (BG-NCA)
Trifosgeen of di-(trichloromethyl)carbonaat is bij kamertemperatuur een stabiel, kristallijn product en kan gemakkelijk bewaard worden. De kristalliniteit zorgt er echter voor dat trifosgeen moeilijk te verwijderen is uit het reactiemengsel. De verdere synthese van pBG wordt daardoor belemmerd omdat resten trifosgeen in het reactiemengsel kunnen ontbinden met vrijstelling van HCl en dit kan op zijn beurt initiatie verhinderen waardoor geen polymerisatie optreedt. Daarom werd voor de synthese van γ-benzyl-L-glutamaat NCA (BG-NCA) tijdens deze thesis gebruik gemaakt van trichloromethylchlorofomiaat of difosgeen (figuur 2.3). Difosgeen is vloeibaar bij kamertemperatuur waardoor het gemakkelijker en veiliger is in gebruik dan fosgeen. Aangezien het gemakkelijk uit het mengsel kan verwijderd worden is de kans kleiner dat er nevenreacties voorkomen in vergelijking met trifosgeen. Het gebruik van difosgeen voor de productie van NCA werd reeds beschreven door Katakai [7]. De synthese wordt gestart door een suspensie van γ-benzyl-L-glutamaat in droge ethylacetaat op te warmen tot 60 °C. Een oplossing van disfosgeen in Ethylacetaat (EtOAc) (10% w/v) wordt in porties (10 ml) toegedruppeld aan het reactiemengsel. Na 20 minuten reactie van het difosgeen met vorming van BG-NCA, wordt het gevormde HCl uit de oplossing verwijderd door argon gedurende 10 minuten doorheen de oplossing te borrelen. Eliminatie van HCl is nodig om de kans op nevenreacties te minimaliseren. Deze procedure wordt herhaald tot alle γ-benzyl-L-glutamaat is omgezet. Dit kan visueel gevolgd worden doordat de suspensie overgaat in een transparante oplossing. De oplossing wordt na afkoelen tot kamertemperatuur anderhalf uur ontgast met argon. De suspensie wordt nadien afgefiltreerd en ingedampt. Hierna wordt het product geïsoleerd door precipitatie in koude pentaan. Het product wordt gezuiverd door het twee maal om te kristalleren. Hiervoor wordt het product opgelost in een minimale hoeveelheid EtOAc, gerefluxt en daarna neergeslaan in een overmaat koude pentaan. Op deze manier wordt BG-NCA bekomen met een chloridegehalte lager dan 0,02%. Deze lage chlorideconcentratie is noodzakelijk omdat een kleine hoeveelheid HClcontaminatie tijdens de polymerisatie kan zorgen voor een inactivatie van de initiator door 33
zoutvorming. Een chloridetest wordt uitgevoerd om de zuiverheid van het bekomen BG-NCA te bepalen. Hiervoor wordt een kleine hoeveelheid BG-NCA opgelost in HNO3 (2 M) en verwarmd. Nadien wordt AgNO3 (0,05 M) toegevoegd. Als de troebelheid van de oplossing niet hoger is dan deze van leidingswater na een analoog experiment, is het BG-NCA voldoende Cl—vrij. Het gezuiverde BGNCA kon met een rendement van 80% bekomen worden en is voldoende zuiver voor de bereiding van hoogmoleculair pBG. Het bekomen BG-NCA werd gekarakteriseerd via IR spectroscopie en 1H-NMR. In het Infrarood spectrum vertoont een NCA twee karakteristieke pieken die afkomstig zijn van de stretchvibratie van de twee carbonylgroepen aanwezig in de ring (figuur 2.4). De vibratie van de carbonyl naast het stikstofatoom veroorzaakt een piek rond 1780 cm-1. De piek rond 1850 cm-1 is afkomstig van de vibratie van de carbonyl naast het α-koolstofatoom [8]. De rekvibratie van de aanwezige ester is terug te vinden rond 1720 cm-1.
Figuur 2.4: IR-spectrum van BG-NCA
BG-NCA werd ook gekarakteriseerd via 1H-NMR (figuur 2.5). De vijf waterstoffen op het aromatisch gedeelte zijn terug te vinden bij 7,3 ppm. Het waterstof dat zich op de stikstof bevindt in het NCA heeft een chemische verschuiving van 6,35 ppm. De benzylische waterstoffen zorgen voor de piek aanwezig in het spectrum bij 5,1 ppm. Aangezien het β-koolstof gebonden is op een stereocentrum, zijn de twee β-waterstoffen onderhevig aan opsplitsing bij 2,08 ppm en 2,22 ppm. Net daarnaast is de piek (2,55 ppm) van de γ-waterstoffen gesitueerd. Het α-waterstof is terug te vinden als een triplet bij 4,6 ppm. 34
1
Figuur 2.5: H-NMR spectrum van BG-NCA
D. Synthese van Poly-γ-benzyl-L-glutamaat Het meest economische proces voor de synthese van lange polypeptideketens is de polymerisatie van het α-aminozuur NCA [9]. Het gebruik van NCA’s brengt inherente problemen met zich mee. Niet alleen wordt de polymerisatie van een α-aminozuur NCA gelimiteerd door het voorkomen van ketentransfer en terminatiereacties, maar ook door de lage controle over de reactiviteit van het groeiende polymeereinde tijdens polymerisatie. Keuze van een geschikt solvent en initiator kan de controle verhogen en de kans op het optreden van nevenreacties minimaliseren [9]. BG-NCA bezit vier reactieve centra, nl. twee carbonylgroepen, een NH-groep en een α-CH (figuur 2.6). O O
2 1
HN 3
4
5
O
(CH2 )2 C
O
O CH2
Figuur 2.6: reactieve centra van BG-NCA
35
Door delokalisatie van het elektronenpaar op stikstof is de carbonyl op positie C(2) minder elektrofiel dan deze op C(5). Nucleofiele aanval op koolstofatoom C(2) wordt in de literatuur niet gerapporteerd. Stikstofatomen in een amide-achtige structuur en het α-koolstof vertonen weinig of geen nucleofiel karakter. Deprotonatie kan deze centra heel wat reactiever maken door vorming van de overeenkomstige anionen. Daar het N-proton zuurder is dan het α-C proton, zal deprotonatie van C(4) enkel optreden indien N(3) gesubstitueerd is. Door het onderlinge reactiviteitsverschil tussen de vier actieve centra gebeurt initiatie voor bijna alle N-ongesubstitueerde NCA’s door een deprotonatie van N(3) of een nucleofiele aanval op C(5) (figuur 2.7). O O
O
R-NH2
C
O NH
CH
C
In
R
O HN O
O R 3N O
R
+ In H
N
(geactiveerd monomeer mechanisme)
O R Figuur 2.7: initiatiestappen voor polymerisatie van BG-NCA
Welke soort initiatie geprefereerd wordt is afhankelijk van de reactieomstandigheden maar wordt hoofdzakelijk bepaald door de nucleofiliciteit/basiciteit verhouding van de initiator. Deze verhouding hangt af van de elektronendensiteit, polariseerbaarheid en sterische hinder. De initiatoren kunnen onderverdeeld worden in protische en aprotische initatoren. In deze thesis werden de polymerisatiereacties geïnitieerd met een primair en een tertiair amine. In de literatuur zijn drie mogelijke propagatiemechanismen voorgesteld: het aminemechanisme, het geactiveerd monomeer mechanisme en het carbamaatmechanisme.
D.1) Initiatie met primaire amines D. 1.1 REACTIEMECHANISME Primaire amines bezitten meer nucleofiel dan basisch karakter waardoor de polymerisatiereactie hoofdzakelijk geïnitieerd wordt door een nucleofiele aanval op de carbonylgroep C(5). Na ringopening wordt een onstabiel carbaminezuurderivaat gevormd die na spontane decarboxylatie opnieuw een primair amine oplevert ( figuur 2.8).
36
O O
O R'
NH2
R'
HN
NH
C
O
O CH
NH
C
O
decarboxylatie
OH
R'
NH
C
CO2
R
CH
NH 2
R
R
Figuur 2.8: initiatiestap met primair amine
Dit nieuw gevormde nucleofiel kan op zijn beurt verder reageren met andere NCA’s met vorming van pBG (figuur 2.9). Dit propagatiemechanisme is ook gekend als het aminemechanisme. O O
O R'
NH
C
CH
O
HN
NH2
R'
O
NH
C
R
O CH
NH
C
R
O CH
C
OH
R
R
O R' CO2
NH
C
O
O CH
NH
R
C
CH
NH 2
R'
NH
C
CH
NH
H
R
R
Figuur 2.9: propagatiemechanisme voor polymerisatie van BG-NCA geïnitieerd door primaire amine
Het polymerisatieverloop wordt bepaald door de balans tussen de nucleofiliciteit van het amine en de monomeer/initiator verhouding. Indien het actieve ketenuiteinde nucleofieler is dan het initiator amine, is de initiatiesnelheid trager dan de propagatiesnelheid. Dit is bijvoorbeeld het geval als het initiërend primaire amine een aromatische restgroep bezit. Het gevolg is dat polymeren bekomen worden met een hogere polymerisatiegraad dan deze verwacht uit de monomeer/initiator verhouding (M/I). Wanneer de initiator het meest nucleofiel is, verloopt de initiatie sneller dan propagatie. Elk initiator amine geeft dan aanleiding tot één polypeptideketen waarvan de polymerisatiegraad (DP) rechtsreeks kan bepaald worden door onderstaande vergelijking.
% 100
De bekomen DP kan slecht correct bepaald worden voor M/I waarden kleiner dan 100. Ondanks de hoge reactiviteit van de primaire amine initiatoren vertoont deze polymerisatie afwijkingen t.o.v. dit levend karakter. De verhoging van de viscositeit met verlaging van de ketenmobiliteit in combinatie met de ontstane secundaire structuur kan leiden tot een “fysische dood” van het actieve ketenuiteinde [10]. Een tweede oorzaak van dit afwijkend gedrag is te wijten aan het optreden van terminatiereacties. Het eindstandig amine kan een nucleofiele aanval uitvoeren op de esterfunctie aanwezig in de zijketen van het eindstandig aminozuur met vorming van een gesubstitueerde 37
pyrrolidonring (figuur 2.10). Terminatie treedt op bij zeer hoge anhydride/initiator concentraties, hierdoor is het moleculair gewicht (Mw) dat kan verkregen worden bij primair amine geïnitieerde polymerisatie van BG-NCA beperkt tot moleculaire gewichten van ± 35’000 Da. O NH2
CH 2
C
HN
CH
CH 2
RO C
O
O
R
C
HN n
HN
R'
CH
ROH O
CH2
O
C
O HN
CH2
CH R
C
HN n
R'
C H2
pyrrolidon getermineerd pBG
Figuur 2.10: intramoleculaire terminatiereactie met vorming van pyrrolidon getermineerd pBG
D. 1.2 GESYNTHETISEERDE POLYMEREN De polymerisatie van BG-NCA gaat door, voor 48 uur bij kamertemperatuur, in een mengsel van dichloormethaan/ethylacetaat (6/1). Een spoor EtOAc verhoogt de oplosbaarheid van NCA in het begin van de reactie. De reactie wordt gestopt door de keteneindes te termineren door triethylamine (TEA) en azijnzuuranhydride aan het reactiemedium toe te voegen. Na drie uur reactie wordt pBG geïsoleerd door neer te slaan in een overmaat gekoelde diëthylether/methanol (4/1) (figuur 2.11). Rendementen tot 95% worden bekomen. O O
O HN
HN
CH
C
O CH2
n-BuNH2
CH2
CH 2Cl2 /EtOAc (6/1)
C O CH2
O
CH2 CH2 C
O
O CH2
Figuur 2.11: synthese van pBG met n-butylamine (n-BuNH2)
De reactie wordt gevolgd met IR spectroscopie. Tijdens de polymerisatie wordt het NCA via ringopening omgezet in een amide binding. De kenmerkende rekvibraties van het NCA moeten dan ook verdwenen zijn uit het spectrum van pBG en vervangen zijn door de specifieke vibraties afkomstig van een amide binding. De twee pieken van NCA (1850 cm-1 en 1780 cm-1) zijn niet meer terug te vinden in het spectrum, terwijl de vibraties van het gevormde amide (1653 cm-1, 1547 cm-1) 38
duidelijk zichtbaar zijn (figuur 2.12). De ester aanwezig in de zijgroepen van het polymeer vertoont een rekvibratie bij 1734 cm-1. Een CO2 piek (niet afkomstig van de polymeren) is terug te vinden bij 2300 cm-1.
CO2 O HN
CH
C
C
B
B
CH2 CH2
A C
O
A
O CH2
C
Figuur 2.12: IR-spectrum pBG
Verdere karakterisatie gebeurt via 1H-NMR met een longitudinale relaxatietijd van drie seconden. Het polymeer wordt hiervoor opgelost in gedeutereerd trifluoroazijnzuur (CF3COOD). Het aromaat, aanwezig in de zijketen, heeft een typische verschuiving van 7,4 ppm, terwijl de verschuiving van de benzylische waterstoffen 5,25 ppm bedraagt (figuur 2.13). De chemische verschuiving van het αwaterstof is 4,83 ppm, terwijl de piek van de twee β-waterstoffen (2,10 ppm en 2,30 ppm) opgesplitst is door het aanwezige stereocenter.
39
1
Figuur 2.13: H-NMR van pBG met een primair amine initiator
Uit het 1H-NMR spectrum wordt ook het Mw bepaald van het gesynthetiseerde pBG. Dit is mogelijk omdat het n-butylamine, de initiator, covalent gebonden is aan het polymeer na initiatie. Via integratie van de piek afkomstig van het proton op het δ-koolstof van n-butylamine bij 1,02 ppm kan het aantal structuureenheden bepaald worden en zodoende ook het Mw van het bekomen polymeer. Als n-butylamine gebruikt wordt als initiator is het mogelijk om polymeren te bereiden met een gewenst moleculair gewicht. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van de volgende formule.
Bij een vooropgesteld Mw kan het aantal structuureenheden bepaald worden. Aan de hand van de hoeveelheid monomeer kan zo de gewenste hoeveelheid initiator berekend worden. In tabel 2.1 wordt een overzicht gegeven van de gesynthetiseerde polymeren met respectievelijk het beoogde Mw en het Mw bepaald aan de hand van het 1H-NMR spectrum. Tabel 2.1: overzicht van de gesynthetiseerde polymeren
beoogd Mw (Da)
Mw via NMR (Da)
30'000 20'000 10'000 6'000
29600 19750 9965 5689
40
D.2) Initiatie met tertiaire amines D. 2.1 REACTIEMECHANISME De meest gebruikte tertiaire amines zijn trialkyl amines of pyridines (pKA ≈ 5). Het in deze thesis gebruikte tributylamine (pKa ≈ 11) vertoont weinig nucleofiel karakter door de sterische hinder van de butylgroepen. De reactie wordt bijgevolg geïnitieerd door deprotonatie van de NH-groep in de NCA-ring door het basische amine. Het gevormde anion is in staat om een ander NCA aan te vallen met vorming van een dimeer, dat aan het ene uiteinde een carbamaatanion bevat en aan het andere eind een N-acyl-NCA-groep (figuur 2.14). O
O
O
O +
Bu 3N:
Bu3 NH
HN
N
+
O
O R
R O
O
O O
HN O
O
O
O OOC
NH
CH
O
O
C
+
N
N
O
O
R
O
R
HN
R
R R N-acyl-NCA
carbamaat
CO2
O
O O NH2 CH
C
O
O +
N
N O
O
R R
R
Figuur 2.14: intiatiestap voor polymerisatie van pBG gebruik makend van een tertiair amine
Na decarboxylatie van het carbamaation wordt opnieuw een NCA-anion gevormd. Daar het N-acylNCA elektrofieler is dan een niet-gesubstitueerd NCA monomeer, zal dit verder polymeriseren door reactie van NCA-anionen met N-acyl ketenuiteinden (figuur 2.15). De veel lagere nucleofiliciteit van het niet geladen primair amine zorgt ervoor dat het negatief geladen monomeer de nucleofiele aanval zal uitvoeren. Dit propagatiemechanisme wordt ook het geactiveerd monomeer mechanisme genoemd [11].
41
O
O O NH 2 CH
C
O O
O +
N
N
NH 2 CH O
O
R
O C
O NH
CH
R
O
C
N O
R
R
R
R O O
Pol
C
O NH
CH
C
O N O
R R
Figuur 2.15: het geactiveerd monomeer mechanisme
De polymerisatie van BG-NCA geïnitieerd door een tertiair amine vertoont een levend karakter, doordat er bijna geen terminatie en ketenoverdracht plaatsvindt en de propagatiesnelheid veel hoger ligt dan de initiatiesnelheid [12]. De hoge polymerisatiesnelheid maakt ook de productie van polymeren met hoog Mw (tot 250’000 Da) mogelijk. D. 2.2 GESYNTHETISEERDE POLYMEREN pBG wordt bereid door polymerisatie van het overeenkomstig NCA met tributylamine (figuur 2.16). De reactie wordt uitgevoerd onder een stikstofatmosfeer in een 6/1 dichloormethaan/ethylacetaat oplossing op kamertemperatuur. pBG werd na 48u roeren bekomen door precipitatie in koude methanol/ether (2/1). De oplossing kan soms heel visceus worden door de vorming van polymeren met hoog Mw. Indien dit het geval was, werd voor precipitatie het reactiemengsel verdund met een kleine hoeveelheid dichloormethaan. O O
O HN
HN
CH
C
O CH2
Bu3N:
CH2
CH2Cl 2/EtOAc (6/1)
C O CH2
O
CH2 CH2 C
O
O CH2
Figuur 2.16: synthese van pBG met behulp van een tertiair amine als initiator
42
De reactie werd gevolgd door middel van Infrarood Infrarood Spectroscopie. Na polymerisatie polymerisat zijn de karakterestieke pieken van BG-NCA NCA bij 1855 cm-1 en 1780 cm-1 verdwenen. De aanwezigheid van een piek bij 1651 cm-1 en 1542 cm-1, beiden veroorzaakt door een vibratie van een amide-binding, amide wijst erop dat de reactie iss doorgegaan en dat het polymeer polym zich in de α-helix helix conformatie bevindt. bevindt Dit werd geverifieerd door de aanwezigheid van de piek rond 1650 cm-1, specifiek voor H-gebonden H amides. De ester-binding binding die aanwezig is in de zijketens zij van het polymeer zorgt voor een rekvibratie bij 1732 cm-1. Het bekomen polymeer wordt verder gekarakteriseerd d.m.v. 1H-NMR in CF3COOD. COOD De piek van het aromaat bevindt zich bij 7,40 ppm, terwijl deze van de twee benzylische waterstoffen op 5,26 5, ppm ligt (figuur 2.17). De integratie gratie wordt bepaald aan de hand van de piek, toegekend aan het waterstofatoom in de hoofdketen, de α-waterstof α (4,85 ppm). De β-waterstoffen waterstoffen (2,32 ppm en 2,14 ppm) komen voor als twee aparte pieken omdat ze gelegen zijn naast een stereocenter. De piek van de γ-waterstoffen waterstoffen (2,63 ppm) vertoont dezelfde integratie als de twee pieken van de β-waterstoffen β samen, omdat ze voor een zelfde aantal protonen integreert. inte Resten siliconen nvet aanwezig op de rand van de kolf en die het polymeer gecontamineerd hebben zijn terug te vinden op 0,6 ppm. ppm
Figuur 2.17: 1H-NMR van pBG met een tertiair amine initiator
Het Mw kan niet bepaald worden aan de hand van het 1H-NMR NMR spectrum, omdat tributylamine t niet aanwezig is op het uiteindelijke polymeer. Tributylamine initieert de reactie reactie door een deprotonatie en wordt bij de zuivering verwijderd. verwijderd Het moleculair gewicht van de gesynthetiseerde polymeren kan wel bepaald worden d.m.v. viscosimetrie. 43
D. 2.3 VISCOSIMETRIE Van alle methoden voor moleculaire gewichtsbepaling van polymeren is de viscosimetrische methode, geïntroduceerd door Staudinger, de meest eenvoudige. Polymeren gedragen zich anders in oplossing dan een stof met een laag moleculair gewicht. Voor laag moleculair gewichtsstoffen is de viscositeit constant en onafhankelijk van de grootte van het materiaal. De viscositeit van polymeren neemt echter toe met toenemend moleculair gewicht (Mw) volgens de Mark-Houwink relatie :
Deze karakteristieke eigenschap wordt aangewend bij de bepaling van het Mw. De viscositeit van pBG wordt bepaald in gedestilleerd dichloorazijnzuur (CHCl2COOH) met behulp van een Ubbelohde viscosimeter (figuur 2.18). De viscositeit van de oplossing wordt beïnvloed door aanwezigheid van het polymeer.
Meetpunt voor optische detectie oogje
doorloopcompartiment oogje voor optische detectie Meetpunt
reservoir
Figuur 2.18: Ubbelohde viscosimeter
De meting gebeurt bij 25°C bij een polymeerconcentratie van ± 0,1 % (g/g). Uit de doorstroomtijd van het solvent (blanco) en de polymeeroplossing kan de specifieke (ηsp) en relatieve viscositeit (ηrel) bepaald worden. Uit de ηsp, ηrel en de concentratie kan de intrinsieke viscositeit bepaald worden via de volgende formule [13].
√2 η ! ln η$%& '
Via de Mark-Houwink relatie kan het moleculair gewicht bepaald worden omdat α (0,87) en K (2,78x103 ml/g), constanten karakteristiek voor elk polymeer, gekend zijn voor pBG in CHCl2COOH. In onderstaande tabel wordt een overzicht gegeven van de polymeren die bereid werden bij verschillende monomeer/initiator (M/I) verhoudingen (tabel 2.2)
44
Tabel 2.2: overzicht van het moleculair gewicht van gesynthetiseerde polymeren in functie van de M/I verhouding
monomeer/initiator moleculair gewicht (Mv) (Da) 250/1 150/1 100/1 69/1 50/1 40/1 30/1 25/1 20/1 15/1 10/1 5/1
251'000 203'000 221'000 172'000 198'000 165'000 189'000 163'000 158'000 169'000 113000 80'000
D. 2.4 MASTERCURVE VOOR PBG Uit de moleculaire gewichten verkregen via viscosimetrie kan een mastercurve opgesteld worden voor de polymerisatie van BG-NCA geïnitieerd met tributylamine (figuur 2.19). Deze mastercurve kan gebruikt worden om het Mw in te schatten dat zal verkregen worden bij een bepaalde M/I verhouding. Op de figuur stellen de blauwe punten de experimenteel verkregen waarden voor en is de trendlijn terug te vinden in zwart.
Mw (Da) 300000 y = 36828ln(x) + 40834 R² = 0,8442
250000 200000 150000 100000 50000 0 0
50
100
150
200
250
300 M/I
Figuur 2.19: Master curve voor pBG geïniteerd door een tributylamine
Het gebruik van tributylamine zorgt voor deprotonatie van het stikstofatoom op NCA met vorming van een anion, die dan een nucleofiele aanval kan uitvoeren op een ander monomeer. Dit is een zeer 45
reactief proces dat al snel zorgt voor hoge Mw maar gaat gepaard met een lage controle over de ketenlengte en een grote polydispersiteit [14]. Hoge Mw kunnen theoretisch gemakkelijk bekomen worden omdat geen terminatiereacties optreden. Toch is er een afname te zien in de moleculaire gewichtstoename met stijgende M/I verhouding waardoor het Mw beperkt wordt tot ± 250 kDa. Indien een initiator gebruikt wordt die snel (in vergelijking met de propagatie) initieert, dan zal van bij het begin van de polymerisatie de concentratie aan actieve centra gelijk zijn aan de initiatorconcentratie en daarna niet meer veranderen. Hierdoor is het aantal polymeerketens precies gelijk aan het aantal initiatormoleculen en groeien alle polymeren simultaan. Het gevolg is dat de polymerisatiegraad (DP) lineair toeneemt met de omzettingsgraad. De polymerisatiegraad kan dus nauwkeurig vastgelegd worden door M/I [15]. ( .
*
Indien de polymerisatie van BG-NCA met tertiaire amines een volledig levende reactie zou zijn, zou een lineair verband bekomen worden tussen het Mw en M/I. Er wordt echter een afwijking van dit lineair verband waargenomen bij hogere DP. Blijkbaar bezit de polymerisatie van pBG slechts een levend karakter bij een lagere DP. Het optreden van meer terminatiereacties, vaak interne cyclisatie, zorgt ervoor dat het moleculair gewicht trager toeneemt dan verwacht bij hoge M/I verhoudingen. Er wordt een logaritmisch verband gevonden tussen M/I en het Mw. + 36828 ln / 0 1 40834 Deze terminatiereacties kunnen het gevolg zijn van een verlaagde monomeerconcentratie of een afname in reactiviteit van de polypeptideketen bij hogere DP. Bij een polymerisatiereactie is het altijd zo dat monomeereenheden aan elkaar gekoppeld worden met vorming van een polymeer. Elke groeiende polymeerketen bezit één actief centrum waaraan telkens een monomeer addeert met ketengroei als gevolg. Dit actief centrum kan slechts met een monomeereenheid reageren indien er zich in de buurt van het actief centrum voldoende monomeer bevindt op het moment dat de vorige additiereactie afgelopen is. In het begin van de reactie is dit monomeer abundant. Naarmate de reactie doorgaat, neemt de hoeveelheid af en treedt er verdunning op. Dit verdunningseffect verhoogt de kans dat het actieve ketenuiteinde zal reageren met de reeds gevormde polymeerketen i.p.v. een monomeereenheid. De kans op terminatie neemt dus toe met stijgende omzetting. De synthese van pBG met een hoog Mw wordt het best uitgevoerd in een geconcentreerde oplossing om het optreden van dit verdunningseffect zolang mogelijk uit te stellen.
46
Het andere effect dat optreedt is een gevolg van de opvouwing van polypeptideketens tot α-helices en β-sheets. Wanneer het groeiende polymeer 8 à 10 structuureenheden bezit, is pBG in staat zich te reorganiseren tot α-helices. Terwijl de reactie vordert, treedt er voortdurend vorming op van deze secundaire structuren. Bij hoog Mw zal door de secundaire structuren ordening tot een groter macromoleculair geheel optreden. Het actieve ketenuiteinde kan door deze opvouwing ingesloten geraken en afschermd worden van monomeer. Hierdoor treedt terminatie op door intramoleculaire reactie. Een levende reactie volgt normaal een eerste orde kinetiek, de monomeerconcentratie neemt langzaam af gedurende de volledige reactietijd. Er bestaat dus een lineair verband tussen de monomeerconcentratie en de tijd. De reactie met tributylamine als initiator met NCA vertraagt bij hoge Mw. Deze vertraging leidt ook tot een minder snelle afname van de monomeerconcentratie. Het gevolg hiervan is dat de reactie niet verloopt volgens een eerste, maar volgens een tweede orde kinetiek. Hierbij is er een logaritmisch verband tussen de monomeerconcentratie en de tijd. Dit toont nogmaals aan dat de reactie met tributylamine geen levende polymerisatiereactie is, maar slechts een levend karakter vertoond (meer uitgesproken bij lage Mw). Het verband tussen het Mw en de M/I is dus niet lineair maar logaritmisch. Omdat de polymerisatie van BG-NCA tot hoog Mw geen echte levende polymerisatie is, maar slechts een levend karakter vertoond. Aan de hand van de verkregen vergelijking kan voor elke M/I-verhouding het resulterend Mw van pBG geschat worden met beperkte afwijking.
E. Synthese van poly-L-glutamine afgeleiden als niet-virale vectoren E.1) aminolyse van poly-γ-benzyl-L-glutamaat Nadat tijdens de polymerisatie tot pBG het Mw van het polymeer bepaald werd, dient het product nu in een volgende stap verder gederivatiseerd te worden. Aangezien dit pBG geen DNA-interagerende eigenschappen bezit, dienen tijdens de aminolyse de juiste functionele groepen ingebouwd te worden (figuur 2.20).
47
O HN
CH
C
O HN
n
CH2
C
n
CH 2 NH2 CH2 CH2 R
CH2 C
CH
O
DMF
CH 2 C
O
NH
CH2
CH 2
O
CH 2 R
Figuur 2.20: aminolyse van pBG
Na aminolyse is het Mw van het polymeer kleiner en de polydispersiteit groter dan deze van het startpolymeer. Er kon onder deze reactieomstandigheden maximaal 70% van de originele polymerisatiegraad behouden worden [16]. De daling van het Mw is te wijten aan transamidering van de amideruggegraat i.p.v. amidevorming in de zijketen. Om de selectiviteit van de aminolysereactie van de zijketens te verhogen ten opzichte van transamidering van de hoofdketen werd het gebruik van bifunctionele katalysatoren voorgesteld. H. Soyez en A. De Marre onderzochten het effect van 2hydroxypyridine (2-HP) en de temperatuur op de aminolyse van pBG. Hieruit bleek dat de ketendoorbraak sterk gereduceerd wordt indien een vijfvoudige overmaat 2-HP t.o.v. de benzylesters aan het reactiemidden wordt toegevoegd en dit zowel bij 25°C als bij 40°C [17]. Een bifunctionele katalysator is een molecule die zowel een nucleofiele als elektrofiele groep bevat en die op een danige manier ingebouwd zijn dat de ruimtelijke oriëntatie een optimale interactie garandeert met het substraat. De bifunctionele katalysator die gedurende deze thesis gebruikt werd is 2-HP. Het bevat een pyridine stikstof (nucleofiel) en een hydroxylfunctie die een waterstof met elkaar kunnen uitwisselen. 2-HP komt voor als 2 tautomeren. Er wordt aangenomen dat vooral de Ngeprotoneerde vorm voorkomt in oplossing, terwijl het lactime vooral voorkomt in de gasfase (figuur 2.21). 2-HP is vooral sterk katalytisch actief in sterk verdunde oplossingen en wanneer tijdens de reactie een proton moet getransfereerd worden van het ene reactiecentum naar het andere. De transitietoestand met het stikstof geprotoneerde 2-HP is het meest waarschijnlijk en wordt hieronder weergegeven (figuur 2.21).
48
O HN R
CH
2
H
2
N
N
CH2
N H
H
O
O
C
CH2
H
CH
CH
O
C
O
O
CH2
H N
Figuur 2.21: De twee tautomere vormen van 2-HP en de transtistietoestand van de aminolysereactie
Het toevoegen van de katalysator vergroot dus de kans op aminolyse en verhindert de ketendoorbraak. Er wordt maximaal een 5-voudige overmaat gebruikt om dimerisatie van 2-HP te minimaliseren. Bij een verhoogde concentratie verschuift het evenwicht van het actief monomeer naar het niet of minder actieve dimeer en wordt ook de katalytische activiteit ervan verlaagd (figuur 2.22). Ondanks de aanwezigheid van 2-HP treedt er bij aminolyse van pBG nog steeds ketendoorbraak op, zij het slechts in mindere mate. Het gewichtsgemiddeld moleculair gewicht na aminolyse kan uit het viscositeitsgemiddeld moleculair gewicht (Mv) geschat worden, door Mv te halveren [17].
H
O H
N
N N
H
O
O Figuur 2.22: Dimeervorming bij 2-HP
De aminolysereactie wordt uitgevoerd in dimethylformamide (DMF) in aanwezigheid van een 5voudige overmaat 2-HP en de verschillende reagentia in overmaat. De verhouding waarbij de verschillende reagentia toegevoegd worden aan het reactiemengsel bepaalt de uiteindelijke samenstelling van het polymeer. De oplossing wordt verwarmd tot 50°C en geroerd. Na 48 uur reageren wordt nogmaals een 5-voudige overmaat van het reactiefste reagens aan de oplossing toegevoegd om een volledige conversie te krijgen van de estergroepen. Na een totaal van 72 uur reageren wordt het eindproduct neergeslaan in diëthylether en gezuiverd door dialyse.
49
E.2) Conversie van primaire amines in guanidines De sterk uitgesproken positieve lading van primaire amines zorgt voor een sterke elektrostatische interactie met plasmamembraan proteïnen, wat kan leiden tot een destabilisatie en openbarsting van het celmembraan. Guanidine groepen worden in vectoren geïntroduceerd omdat ze zorgen voor een delokalisatie van de postieve lading waardoor de cytotoxiciteit daalt [18]. Daarnaast kan deze geladen groep sterk binden met DNA. De invoer van guanidine groepen verlaagt niet alleen de toxiciteit, het kan ook de transfectieefficiëntie verhogen door internalisatie in de cel. De guanidine groepen die bij fysiologische pH altijd positief geladen zijn (pKa = 12,5) kunnen sterke bidentaat waterstofbruggen vormen met fosfaten, sulfaten en carboxylaten aanwezig op het celmembraan [19]. Er onstaan lipofiele ionenparen waarvan de H-bruggen versterkt worden wanneer deze ionenparen de lipide dubbellaag binnendringen. De snelheid en richting van transport doorheen de dubbellaag wordt bepaald door het membraanpotentiaal [20]. Een overmaat aan guanidine functies heeft een negatieve invloed op de transfectie-efficiëntie. Door de sterke interactie met de membraanproteïnen kan een teveel aan guanidine groepen ervoor zorgen dat polyplex niet kan loskomen van het celmembraan, waardoor efficiënte transfectie belemmerd wordt [20]. Door de hoge basiciteit is het over het algemeen onpraktisch om guanidines bij het begin van de reactiesequentie in te voeren. Het is moeilijk een solvent te vinden waarin deze derivaten oplossen. Het door aminolyse bekomen primair amine wordt daarom tot een guanidine omgezet met behulp van 3,5 dimethyl-1-guanylpyrazool formidiumnitraat of DMGP (figuur 2.23). DMGP wordt aan het reactiemengsel toegevoegd in 16-voudige overmaat. De reactie wordt overnacht geroerd in water waarvan de pH op 9,5 gebracht wordt m.b.v. een kaliumhydroxideoplossing (4M). Om volledige conversie te laten optreden dienen alle primaire amines beschikbaar te zijn voor reactie. Deze groepen mogen niet geprotoneerd zijn en daarom moet de pH hoger dan 9 worden. Een te lage pH kan er ook voor zorgen dat ongewenste degradatie optreedt, meer bepaald de hydrolytische deguanlylatie in urea en 3,5 dimethyl pyrazool [21]. Aan de oplossing wordt ook nog kaliumiodide (KI) toegevoegd tot een eindconcentratie van 6 molair. KI zorgt via een macromoleculair effect dat conversie van de primaire amines voor nagenoeg 100% kan doorgaan. In afwezigheid van KI vindt er geen volledige omzetting plaats (< 70%).
50
O
O HN
CH
HN
C
CH2
HN C
CH2 C
O
+
N
C H
CH2
NH2
N
CH
CH2
+
KI (6M), pH = 9,5 C
N
N
O
NH
NH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH2
NH
dimethyl pyrazool (pKa = 4,3)
C HN
NH2
Figuur 2.23: guanidilering van een primaire amine
De oplossing wordt na reactie in zijn geheel onderworpen aan een dialyse t.o.v. ultra zuiver water om het gevormde reactieproduct, dimethyl pyrazool, te verwijderen aangezien dit slecht oplosbaar is in zuur milieu. De reactie stopt ook daar de pH neutraal is en geen primaire amines meer beschikbaar zijn voor reactie. Nadien wordt de oplossing aangezuurd tot pH = 4 om het polymeer te protoneren (verhoogt oplosbaarheid) en onderworpen aan een standaard dialyseproces. Het gezuiverde product wordt bekomen na vriesdrogen. De omzetting van een primaire amine in een guanidine groep kan gevolgd worden via 1H-NMR doordat er een verschuiving optreedt van het triplet van de waterstoffen op de koolstof naast de eindfunctionaliteit van 2,9 ppm naar 3,1 ppm.
E.3) Gel Permeatie Chromatografie Gel permeatie chromatografie (GPC) is een methode die toelaat zowel Mn, Mw als de polydispersiteit van polymeren te bepalen. Deze techniek steunt op het principe dat macromoleculen in opgeloste toestand chromatografisch kunnen gescheiden worden op basis van hun hydrodynamisch volume. Deze methode behoort tot de Size Exclusion Chromatografie (SEC). Hierbij worden molecules gescheiden op basis van hun grootte. Als stationaire fase worden poreus polymethacrylaatgel en gecrosslinkt gehydroxyleerd polymeer gebruikt. De scheiding gebeurt doordat kleine moleculen de poriën van de stationaire fase kunnen binnendringen, terwijl de grote moleculen dit niet kunnen. Daardoor penetreren de kleine deeltjes veel poriën en wordt hun verblijftijd op de kolom verlengd waardoor ze later elueren dan grote moleculen (kolom retentie). Grote moleculen kunnen poriën niet of nauwelijks binnendringen waardoor ze minder afstand afleggen en bijgevolg sneller van de kolom elueren (figuur 2.24).
51
tijd
Figuur 2.24: Verloop van polymeren over een kolom op verschillende tijdstippen
De aanwezigheid van het polymeer bij de kolomuitgang wordt gemeten door een differentiële refactie index detector. Het resultaat is een concentratie-elutievolume chromatogram. Door middel van een vooraf opgestelde kalibratiecurve kan uit het elutievolume van het onbekende monster het Mw bepaald worden. Mw bepaling via de GPC methode steunt op het volume van de moleculen en dit volume hangt niet alleen af van het Mw maar ook van de polymeer-solvent interacties. GPC is verder ook geen absolute methode voor moleculaire gewichtsbepaling aangezien ze gebruik maakt van een kalibratiecurve bekomen d.m.v. standaarden [15]. De Mw’en van gederivatiseerde polymeren die afkomstig zijn van tertiar amine geïnitieerde pBG moeten bepaald worden via GPC. Alle polymeren werden in een 5 mg/ml oplossing op de kolom gebracht. De scheiding gebeurt over twee in serie geschakelde kolommen. De ene kolom scheidt de polymeren met een Mw tussen 1000 Da en 80’000 Da terwijl de andere een Mw bereik heeft van 10’000 Da en 1’000’000 Da. Tijdens de metingen wordt een constante flow aangehouden van 0,75 ml/minuut. Er wordt gebruik gemaakt van een buffer op basis van NaH2PO4 (5%), CH3CN (3%) en ultrazuiver water, aangezuurd tot pH 4. Om te vermijden dat onzuiverheden aanwezig in de buffer of in de polymeeroplossing de meting zouden verstoren, worden de polymeeroplossing en het eluens gefiltreerd door een 0,45 μm filter. Luchtbellen worden verwijderd door ontgassing (Ar, 15 min) omdat deze zowel kolom werking als de detectie verstoren. Na de meting van 32 minuten kan aan de hand van de vooraf opgestelde calibratiecurve met dextraanstandaarden, het Mw van de polymeren bepaald worden. In onderstaande tabel zijn alle GPC-resultaten terug te vinden voor de verschillende copolymeren. Zowel het viscositeitsgemiddeld moleculair gewicht Mv van het startpolymeer, het moleculair gewicht na aminolyse (Mwa) en het moleculair gewicht na guanidilering (MwG). 52
Tabel 2.3: Het effect van aminolyse en guanidilering op het moleculair gewicht van polymeren
Copolymeren
Mv (Da)
Mwa (Da) MwG (Da)
p(HEG62%-co-DMAEG38%)
169311
145786
-
p(HEG57%-co-GuAEG43%)
164561
155803
153507
p(HEG81%-co-GuAEG19%)
190197
116732
102372
p(HEG63%-co-GuAEG37%)
201475
141814
119148
Uit de tabel is duidelijk te zien dat het Mv afneemt na aminolyse en de daarop volgende guanidilering. De afname van het Mw na aminolyse is een gevolg van transamidering. Uit de tabel is te zien dat het Mw soms gevoelig afneemt na aminolyse. De polymeren met respectivelijk 19% en 37% amines verliezen minstens 60 kDa aan gewicht tijdens de aminolysereactie. Deze sterke daling is te wijten aan het optreden van transamidering. Bij transamidering zal niet de estergroep in de zijketen een nucleofiele aanval ondervinden van de reagentia, maar de carbonylfunctie in de peptide ruggegraat. Doordat de hoofdketen doorbroken wordt, daalt het Mw. Het gewichtsverlies wordt beperkt door toevoegen van 2-HP, een bifunctionele katalysator, die de reactie van de reagentia met de zijketen via een macromoleculair effect gunstig beïnvloedt, waardoor transamidering vermindert. Uit de bekomen resultaten blijkt echter dat 2-HP niet in staat is om het gewichtsverlies van twee polymeren, nl. met 19% en 37% primaire amines te beperken. Bij het polymeer met 19% primaire amines is er een verlies van ± 74 kDa tot 60% van zijn oorspronkelijk Mw, terwijl de andere na aminolyse 70% van zijn oorspronkelijk Mw behoudt. Bij de twee andere gesynthethiseerde derivaten is er slechts een afname van het Mw met 5% en 14% respectivelijk. Het DMAEG derivaat en het polymeer met 43% GuAEG kan 2-HP de transamidering beperken tot een minimum waardoor het Mw slechts lichtjes daalt. In de literatuur wordt gesteld dat het Mwa kan geschat worden door Mv te halveren [17]. Bij geen enkel polymeer is de moleculaire gewichtsafname zo sterk dat er een halvering van het Mw wordt waargenomen na aminolyse. Voor alle polymeren treedt er bij de omzetting van primaire amines in guanidinegroepen nog een extra gewichtsdaling op. Het invoeren van guanidinegroepen mag normaal geen invloed hebben op het Mw. Het Mw wordt bepaald aan de hand van de retentietijd op de kolom. Deze retentietijd wordt bepaald door de hydrodynamische radius van het polymeer in het solvent. De invoer van guanidinegroepen zorgt er blijkbaar voor dat er een wijziging optreedt in de interactie met het solvent. De polymeren verkrijgen een kleinere hydrodynamische straal, waardoor ze schijnbaar een lager Mw bezitten.
53
E.4) Synthese van poly(hydroxyethyl-L-glutamine-co-dimethylaminoethyl-Lglutamine) (p(HEG-co-DMAEG)) PEI en PLL werden in de literatuur reeds beschreven als synthetische vectoren maar bezitten een hoge cytotoxiciteit die te wijten is aan de interactie die optreedt tussen de amines van de polymeren met de negatief geladen proteïnen die zich op het celmembraan bevinden. Daarom werden in deze thesis een aantal derivaten gesynthetiseerd die de interactie met membraanproteïnen beperken. Daarom worden naast kationische groepen ook neutrale hydroxylgroepen ingevoerd. DNA condensatie gebeurt hier als positief geladen groepen van tertiaire amines ingevoerd worden. De positieve lading wordt bovendien deels afgeschermd door de sterische hinder van de twee methylgroepen zodat de interactie met de membraaneiwitten wordt verminderd, maar toch nog sterk genoeg is om DNA voldoende te condenseren. De hydroxylfuncties, die niet geladen zijn bij fysiologische pH, zorgen voor ladingseparatie in het polymeer. Daarnaast kunnen ze ook H-bruggen vormen met andere entiteiten zoals het DNA en componenten aanwezig op het celmembraan. Voor de synthese van p(HEG-co-DMAEG) wordt pBG opgelost in DMF en opgewarmd tot 50°C. 2-dimethylamino-ethylamine (DMAEA) en amino-ethanol (AE) worden in respectievelijk 15- en 5voudige overmaat toegevoegd en geroerd. Een 5-voudige overmaat 2-HP wordt eveneens aan de oplossing toegevoegd om ketendoorbraak te minimaliseren. Na 48 uur wordt een kleine overmaat van beide reagentia (2x DMAEA en 2x AE) toegevoegd om een volledige conversie van de estergroepen te bekomen (figuur 2.25). Het reactiemengsel wordt neergeslaan in koude diëthylether, waarbij na affiltreren het product bekomen wordt. Dit product wordt verder gezuiverd door middel van dialyse en geïsoleerd door middel van vriesdrogen. Dit polymeer werd gesynthetiseerd met een rendement van 52%. O
O HN
CH
HN
C H2N
CH2 C O CH2
O
CH 2 CH2 N DMAEA
+
CH3
2-HP DMF
H2N
C
HN
CH
C 62%
38%
CH3
CH2
CH
O
CH2 CH2 OH AE
CH 2
CH2
CH 2
CH2
C
O
C
O
NH
NH
CH 2
CH2
CH 2
CH2
OH
N H3C
CH3
Figuur 2.25: synthese van p(HEGx-co-DMAEGy)
54
Het verkregen polymeer heeft een Mw van 170 kDa en bezit 62% tertiaire amines en 38% hydroxylfuncties. Deze samenstelling kan bepaald worden aan de hand van het 1H-NMR spectrum (figuur 2.26). De piek bij 4,79 ppm is afkomstig van het water waarin het polymeer opgelost werd.
1
Figuur 2.26: H-NMR van p(HEG-DMAEG)
De piek bij 4,15 ppm is afkomstig van het proton gevestigd op het α-koolstof. Als de integratie van deze piek aan 100 gelijk gesteld wordt, kan de hoeveelheid DMAEG bepaald worden aan de hand van de intergratie van de piek bij 2,7 ppm. Deze piek is afkomstig van de twee methylgroepen van DMAEG, aangezien deze piek voor zes protonen integreert kan de hoeveelheid DMAEG aanwezig in het copolymeer bepaald worden door deze te delen door zes. De piek bij 3,1 ppm en 3,4 ppm zijn beiden afkomstig van CH2-eenheden naast het amide en de eindfunctionaliteit. Net zoals bij pBG is de β-piek (1,75 ppm en 1,85 ppm) opgesplist omdat het naast een stereocentrum ligt. De integratie van de γ-piek is gelijk aan deze van het β-koolstof (integratie voor 2H telkens).
E.5) Synthese van poly(hydroxyethyl-L-glutamine-co-guanidyl-ethyl-L-glutamineco-imidazolethyl-L-glutamine) (p(HEG-co-GuAEG-co-ImEG)) derivaten Bij de synthese van dit polymeer worden er guanidine-, hydroxyl- en imidazol groepen ingebouwd in het polymeer. De imidazol functies (pKa = 7) zijn slechts gedeeltelijk geladen bij fysiologische pH. De introductie van deze functionele groep zorgt voor een betere buffering van de dalende pH in het endosoom en kan zorgen voor een verhoogde cytoplasmatische vrijstelling. Het aantal aanwezige positieve ladingen wordt hier opnieuw gespreid door de invoer van de hydroxylfuncties. De
55
ingevoerde primaire amines worden in een volgende reactie omgezet in guanidinegroepen, die zorgen voor een betere condensatie van het DNA. De aminolyse van pBG gebeurd op 50°C in DMF. Aan de oplossing wordt een 5-voudige overmaat 2HP toegevoegd om ketendoorbraak te vermijden. Niet alle reagentia die gebruikt worden voor aminolyse vertonen een zelfde reactiviteit. Hierdoor worden amino-ethanol en histamine slechts toegevoegd wanneer tritylamino-ethylamine (TrAEA) overnacht gereageerd heeft met pBG. De reactie wordt dan verder geroerd voor 72 uur om volledige conversie te verkrijgen. Het vooraf apart toevoegen van het minst reactieve reagens (TrAEA) laat toe om toch een zekere substantiële hoeveelheid primaire amines in te bouwen. Indien voor dit mengsel de drie reagentia samen zouden worden toegevoegd, zou door de lage reactiviteit slechts een kleine hoeveelheid primaire amines ingebouwd worden. De lage reactiviteit is vooral te wijten aan de grote, sterisch hinderende, trityl groep. Een analoog principe geldt bij andere reagentia met volumineuse groepen. De tritylgroep wordt nadien verwijderd door acidolyse in trifluoroazijnzuur (TFA). Het gezuiverd product wordt verkregen door precipitatie in diëthylether en daaropvolgende dialyse. Het primair amine wordt in een volgende reactiestap omgezet tot een guanidinegroep met behulp van DMGP en KI zoals beschreven in sectie E.2. Na dialyse en vriesdrogen wordt p(HEG-co-GuAEG-co-ImEG) bekomen (figuur 2.27). O
O HN
CH
HN
C H2N
CH2
TrAEA
C
O
+
H2N
1) 2-HP/DMF 2) CF3COOH
CH2 CH2 OH AE
CH2
H2N
CH2 CH2
Histamine
HN
CH
NH
HN
C
CH
C o
n
CH 2
CH2
CH2
CH 2
CH2
CH2
C
3) DMGP, KI, pH 9,5
N
O
C m
CH 2 CH2 NHtrityl
CH2
CH
O
O
O
C
C
O
O
NH
NH
NH
CH 2
CH2
CH2
CH 2
CH2
CH2
OH
NH
N
C HN
NH2
HN
Figuur 2.27: synthese van p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
In tabel 2.4 wordt de samenstelling en het Mw van de verschillende polymeren weergegeven. Tabel 2.4: overzicht van de gesynthetiseerde polymeren
molaire samenstelling Polymeer
Mw (Da)
p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
10'168
22
60
18
p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
9965
15
49
36
% guanidines % hydroxyl % imidazol
56
Bepaling van de samenstelling van de verschillende copolymeren gebeurt aan de hand van het 1HNMR (figuur 2.28). De hoeveelheid imidazol groepen kan direct afgeleid worden door integratie van de pieken afkomstig van de protonen op de imidazol groepen. Door de α-piek aan 100 gelijk te stellen kan direct hieruit afgeleid worden hoeveel procent van het copolymeer bestaat uit imidazol functionele groepen. Beide waterstofpieken van het guanidine zijn gelegen onder verschillende andere pieken en kunnen niet rechtreeks bepaald worden. Aangezien HEG een piek bezit die geen overlap vertoont met een ander waterstof, kan de hoeveelheid HEG bepaald worden. De hoeveelheid guanidine wordt dan bekomen door de reeds bepaalde gehalten aan andere structuurenheden van 100% af te trekken.
1
Figuur 2.28: H-NMR van p(HEG-GuAEG-HIS)
E.6) Synthese en bespreking van poly(hydroxyethyl-L-glutamine–co-guanidylethyl-L-glutamine) (p(HEG-co-GuAEG)) derivaten Bij de synthese van dit polymeer worden er hydroxylgroepen en guanidinegroepen in het polymeer geïntroduceerd. De hydroxylgroepen zorgen voor een gereduceerde positieve lading van het polymeer en zijn in staat om waterstofbruggen te vormen met anionen aanwezig in het DNA of op het celmembraan. De primaire amines worden omgezet tot guanidinegroepen omdat een sterk gelocaliseerde lading leidt tot een hoge cytotoxiciteit. De guanidinegroepen hebben nog steeds een 57
positieve lading, maar zijn in staat deze te delocaliseren over 2 van de N-atomen van de guanidine functie waardoor de toxiciteit verlaagd wordt. De aminolysereactie gaat door op 50°C in DMF. Er wordt steeds een 5-voudige overmaat 2-HP toegevoegd om transamidering van de hoofdketen te beperken. Niet alle reagentia die gebruikt worden voor aminolyse vertonen dezelfde reactiviteit. Om toch een zekere hoeveelheid primaire amines in te bouwen worden beide reagentia (AE en TrAEA) op verschillende tijdstippen aan het mengsel toegevoegd. De reactie wordt dan verder geroerd voor 72 uur om volledige conversie te verkijgen. Het primair amine wordt ontschermd door acidolyse in TFA. Na precipitatie in diëthylether en dialyse wordt het gezuiverd product verkregen. De primaire amines worden in een volgende stap omgezet tot guanidine groepen zoals voorheen beschreven in sectie E.2. Na dialyse en vriesdrogen wordt het eindproduct p(HEGx-co-GuAEGy) bekomen (figuur 2.29). O
O HN
CH
HN
C
CH
C
x
C
H2N
CH
+
O CH2
H2N
CH2 CH2 OH AE
1) 2-HP/DMF 2) CF3COOH
C
3 )DMGP, KI, pH 9,5
CH2
CH2 C
O HN
CH
C
n
CH2
CH2 CH2 NHtrityl TrAEA
O
HN m
CH2 CH2
O
CH2 O
C
o CH2 CH2
O
C
NH
NH
NH
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
OH
NH
NH2
O
C HN
NH2
Figuur 2.29: synthese van p(HEGm-co-GuAEGn)
Door bepaalde factoren kan het zijn dat er geen volledige omzetting plaatsgevonden heeft van de primaire amines in guanidine groepen. In sommige gevallen blijven er naast de gevormde guanidine groepen nog een kleine hoeveelheid primaire amines aanwezig in het polymeer. Alle gesynthetiseerde copolymeren met hun Mw en procentuele samenstelling zijn weergegeven in onderstaande tabel.
58
Tabel 2.5: overzicht van de chemische samenstelling en het gewichtsgemiddeld moleculair gewicht van de gesynthetiseerde polymeren
polymeer
Mw (Da)
p(HEG-co-GuAEG) p(HEG-co-AEG-co-GuAEG) p(HEG-co-AEG-co-GuAEG) p(HEG-co-AEG-co-GuAEG) p(HEG-co-AEG-co-GuAEG) p(HEG-co-AEG-co-GuAEG) p(HEG-co-AEG-co-GuAEG) p(HEG-co-GuAEG) p(HEG-co-GuAEG) p(HEG-co-GuAEG)
153507 18432 17913 18012 18932 8972 17125 9345 102372 119148
overmaat reagentia TrAEA
AE
10 15 15 10 10 13 15 10 10 20
10 10 10 10 15 10 10 10 10 10
samenstelling % amines % guanidines / 3 8 3 3 6 4 / / /
% Hydroxyl
43 14 13 21 5 24 26 27 19 37
57 83 79 76 92 70 70 73 81 63
De procentuele samenstelling werd bepaald aan de hand van het 1H-NMR spectrum (figuur 2.30). De piek op 4,79 ppm is afkomstig van water. “Solvent residue”, DMF is zichtbaar door een dubbel singlet bij 2,7 ppm en 2,8 ppm en een singlet bij 7,92 ppm. Om de procentuele samenstelling te weten van het gesynthetiseerde copolymeer wordt de integratie van het α-waterstof (4,06 ppm) aan 100 gelijk gesteld. De CH2-eenheden naast het amide en de eind functionele groepen van HEG hebben een chemische verschuiving van 3,39 ppm en 3,09 ppm. De piek bij 3,39 ppm vertoont geen overlap en kan dan ook gebruikt worden om de hoeveelheid hydroxylgroepen te bepalen. Aangezien deze piek integreert voor 2 waterstoffen wordt het procentuele aantal bekomen door de integratie te halveren. Dit is niet het geval voor de piek met een chemische verschuiving van 3,09 ppm omdat er overlap optreedt met het signaal afkomstig van een guanidine gemodificeerde zijketen met een zelfde chemische verschuiving. Het 1H-NMR kan ook aangewend worden om na te gaan of alle primaire amines omgezet zijn tot guanidine groepen. De twee waterstoffen gelegen op het koolstofatoom naast het primaire amine genereren een triplet bij 2,9 ppm. De omzetting tot een guanidinegroep zorgt voor een verandering in chemische verschuiving van deze twee protonen tot 3,1 ppm. Als er geen piek meer aanwezig is bij 2,9 ppm zijn alle primaire amines omgezet tot guanidines. Bij een onvolledige omzetting kan de hoeveelheid resterende primaire amines bepaald worden uit de integratie van deze piek.
59
Figuur 2.30: 1H-NMR van p(HEGm-co-GuAEGn)
Het Mw van derivaten afkomstig van een primair amine geïnitieerde pBG werd tevens bepaald uit het 1
H-NMR. Het Mw wordt bekomen door het aantal structuureenheden te bepalen uit de integratie van
de δ-H piek (± 1 ppm) van het primaire amine. Het aantal structuureenheden wordt bekomen door 100 te delen door de integratie van één δ-proton. Door het aantal structuureenheden dan te vermenigvuldigen met het Mw van één enkele structuureenheid (219,234 Da) wordt het Mw bekomen van het copolymeer. In de tabel 2.5 zijn naast de samenstelling van alle gesynthetiseerde polymeren ook de overmaat van elk reagens die gebruikt werd aangegeven. Voor bijna alle polymeren werd AE pas toegevoegd na pBG overnacht te laten reageren met TrAEA. Het polymeer met 83% hydroxylgroepen, 14% guanidine en 3% primaire amines werd gesynthetiseerd door AE en TrAEA vanaf het begin, samen toe te voegen aan het reactiemidden in respectievelijk 10- en 15-voudige overmaat. Het copolymeer bevat drie keer meer hydroxylfuncties t.o.v. aminefuncties, doch is AE in een kleinere overmaat dan TrAEA toegevoegd aan het reactiemidden. Dit wijst erop dat AE veel reactiever is dan TrAEA. Bij de hogere moleculaire gewichten (153507 Da, 102372 Da, 119148 Da) vertonen de gesynthetiseerde polymeren een verschillende samenstelling ondanks dat alle reagentia in dezelfde overmaat toegevoegd werden. Wanneer na overnacht reageren van een 10-voudige overmaat TrAEA, een 10-voudige overmaat AE toegevoegd wordt, is de statistische samenstelling van het polymeer niet gelijkaardig. Dit komt door het verschil in reactietijd. De reagentia waaruit het 60
polymeer met 81% hydroxylgroepen bekomen werd, heeft 12 uur langer gereageerd dan deze met 57% hydroxylgroepen. Door de langere reactietijd was AE in staat, door zijn hogere reactiviteit, meer te reageren met de aanwezige esterbindingen in pBG waardoor er meer hydroxylgroepen ingebouwd zijn. Een langere reactietijd zorgt dus duidelijk voor een hogere invoer van hydroxylfuncties in p(HEGco-GuAEG). Uit de tabel 2.5 blijkt ook dat voor hogere moleculaire gewichten de omzetting van primaire amines in guanidines kan doorgaan met een hogere conversie dan voor de meeste lage moleculaire gewichten (< 30 kDa). Bij de hoge moleculaire gewichten kunnen alle aanwezige primaire amines volledig omgezet worden in guanidine groepen. Bijna alle polymeren gesynthetiseerd met een primair amine initiator bevatten nog restfracties primaire amines in de zijketen na de guanidileringsreactie. Dit heeft te maken met een verlies van macromoleculair effect dat door het toevoegen van 6M KI gestimuleerd werd en bij lagere moleculaire gewichten minder efficiënt tot uiting komt (figuur 2.31) [22].
Figuur 2.31: 1) guanidilering in waterige oplossing, 2) guanidilering in aanwezigheid van 6M KI [22]
De overmaat gebruikt voor aminolyse heeft bij een zelfde moleculair gewicht een kleine invloed. Er werden verschillende verhoudingen van reagentia uitgeprobeerd om een invloed hiervan op de samenstelling van het geaminolyseerde product te bekomen. De bekomen polymeren bezitten telkens een overmaat aan hydroxylfuncties. Deze overmaat kan min of meer bepaald worden door het controleren van de verhouding van de in overmaat gebruikte reagentia en het tijdstip van hun toegevoeging. Wanneer beide reagentia in 10-voudige overmaat toegevoegd worden met een tijdsverschil van 12 uur, bevat het polymeer ± 75% hydroxyl groepen en ± 25% amine groepen. Wanneer meer amine groepen gewenst zijn, kan dit verkregen worden door de verhouding tussen de reagentia aan te passen.
61
De invloed van het Mw op de uiteindelijke samenstelling kan ook nagegaan worden door de samenstelling te vergelijken tussen de polymeren die gesynthetiseerd zijn met een gelijke overmaat aan reagentia. Het AE wordt hiertoe in 10-voudige overmaat toegevoegd nadat de reactie gedurende 14 uur is doorgegaan in aanwezigheid van een 10-voudige overmaat TrAEA. De uiteindelijke samenstelling is niet afhankelijk van het Mw. De meeste polymeren bezitten tussen de 70% en 80% hydroxylfuncties. Aangezien de samenstelling van het copolymeer niet afhankelijk is van het Mw, wil dit zeggen dat de ruimtelijke structuur van een polymeer met hoog Mw het naderen van de reagentia tot het substraat niet belemmert. Uit de samenstelling van de gesynthetiseerde polymeren kan dus afgeleid worden dat de reactiviteit van AE veel hoger ligt dan die van TrAEA. Dit verschil in reactiviteit zorgt ervoor dat de samenstelling van het polymeer bepaald wordt door verschillende factoren. Hoe groter de overmaat AE is, hoe langer de reactie doorgaat en hoe sneller AE aan het reactiemengsel toegevoegd wordt, hoe meer hydroxylgroepen het copolymeer uiteindelijk zal bezitten. Deze methode waarbij eerst een bepaalde overmaat TrAEA toegevoegd wordt aan het reactiemengsel en later een overmaat AE wordt toegediend, stelt ons in staat om een bepaalde hoeveelheid aan aminefuncties in te bouwen in pBG. Met behulp van deze reagentia en deze reactiemethodiek is het wellicht niet mogelijk om meer dan 50% amines in te bouwen. Dit komt door de grote, beschermende, sterisch hinderende trityl groep en zou kunnen verholpen worden door gebruik te maken van een andere beschermende groep.
62
F. Referenties 1.
2.
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
11. 12. 13.
14.
15. 16. 17. 18.
19.
20.
21.
Bashford, C.L., et al., MEMBRANE DAMAGE BY HEMOLYTIC VIRUSES, TOXINS, COMPLEMENT, AND OTHER CYTOTOXIC AGENTS - A COMMON MECHANISM BLOCKED BY DIVALENTCATIONS. Journal of Biological Chemistry, 1986. 261(20): p. 9300-9308. Blout, E.R. and R.H. Karlson, POLYPEPTIDES .3. THE SYNTHESIS OF HIGH MOLECULAR WEIGHT POLY-GAMMA-BENZYL-L-GLUTAMATES. Journal of the American Chemical Society, 1956. 78(5): p. 941-946. Vercauteren, R., Doctoraatswerk. 1992, Universiteit Gent: Ghent. Fridkin, M. and S. Shaltiel, LEUCHS ANHYDRIDE OF NIM-DNP-L-HISTIDINE AND ITS USE IN SYNTHESIS OF POLYAMINO ACIDS. Israel Journal of Chemistry, 1971. 9(6): p. BC7-&. Farthing, A., J. Chem. Soc., 1950. Fuller, W.D., M.S. Verlander, and M. Goodman, PROCEDURE FOR FACILE SYNTHESIS OF AMINO-ACID N-CARBOXYANHYDRIDES. Biopolymers, 1976. 15(9): p. 1869-1871. Katakai, R., et al., STEPWISE SYNTHESIS OF OLIGOPEPTIDES WITH N-CARBOXY-ALPHA AMINO ACID ANHYDRIDES .4. GLYCINE NCA. Journal of Organic Chemistry, 1972. 37(2): p. 327-&. Kricheldorf, K., alfa-Aminoacid-N-Carboxyanhydrides and Related Heterocycles, B. Heidelberg, Editor. 1987: New York. Deming, T.J., Living polymerization of alpha-amino acid-N-carboxyanhydrides. Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry, 2000. 38(17): p. 3011-3018. Lundberg, R.D. and P. Doty, POLYPEPTIDES .17. A STUDY OF THE KINETICS OF THE PRIMARY AMINE-INITIATED POLYMERIZATION OF N-CARBOXY-ANHYDRIDES WITH SPECIAL REFERENCE TO CONFIGURATIONAL AND STEREOCHEMICAL EFFECTS. Journal of the American Chemical Society, 1957. 79(15): p. 3961-3972. Bamford, C.H., A.C.P. Pugh, and H. Block, POLYMERIZATION OF 3-SUBSTITUTED OXAZOLIDINE-2,5-DIONES. Journal of the Chemical Society, 1961(MAY): p. 2057-&. Scoffone, E., et al., MOLECULAR WEIGHT DISTRIBUTION OF POLYMERS OF GAMMA-BENZYLL-GLUTAMATE. Biopolymers, 1965. 3(5): p. 535-&. Solomon, O.F., Détermination de la Viscosité Intrinsique de Solutions de Polymères par une Simple Détermination de la Viscosité. Journal of applied Polymer Science, 1962. VI(24): p. 683-686. Gibson, M.I. and N.R. Cameron, Experimentally Facile Controlled Polymerization of NCarboxyan hydrides (NCAs), Including O-Benzyl-L-threonine NCA. Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry, 2009. 47(11): p. 2882-2891. DuPrez, F., Inleiding tot de polymeerwetenschap. 2007. Lupulota.N, et al., CONFORMATION CHANGES IN NONIONIZABLE WATER-SOLUBLE SYNTHTIC POLYPEPTIDE POLY-N5-(3-HYDROXYPROPYL) -L-GLUTAMINE. Biopolymers, 1965. 3(6): p. 625. Soyez, H., Doctoraatswerk. 1997, Ghent University: Ghent. Nimesh, S. and R. Chandra, Guanidinium-grafted polyethylenimine: An efficient transfecting agent for mammalian cells. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2008. 68(3): p. 647-655. Nakase, I., et al., Methodological and cellular aspects that govern the internalization mechanisms of arginine-rich cell-penetrating peptides. Advanced Drug Delivery Reviews, 2008. 60(4-5): p. 598-607. Rothbard, J.B., T.C. Jessop, and P.A. Wender, Adaptive translocation: the role of hydrogen bonding and membrane potential in the uptake of guanidinium-rich transporters into cells. Advanced Drug Delivery Reviews, 2005. 57(4): p. 495-504. Habeeb, A.F.S., A NEW REAGENT FOR THE GUANIDINATION OF PROTEINS. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 1960. 38(5): p. 493-501.
63
22.
Debanov, V.G., Synthesis if poly-L-arginine and the statistical copolymer of L-arginine, Llysine, and neutral amino acids Khimia Prirodnykh Soedinenii, 1966. 2(3): p. 195-200.
64
Hoofdstuk 3: Fysicochemische evaluatie van poly-Lglutamine derivaten Een polymeer moet voldoen aan een aantal criteria om een goede vector te zijn voor therapeutisch DNA. Het moet in staat zijn om negatief geladen DNA te condenseren tot kleine partikels door elektrostatische interacties tussen de positief geladen groepen in het polymeer en de fosfaatgroepen aanwezig in het DNA [1]. Deze polyelektrolietcomplexen moeten dimensies vertonen die klein genoeg zijn om te worden opgenomen in de cel. De effectieve diameter van het polyplex wordt bepaald door de verhouding van positieve lading (polymeer) en de negatieve lading (DNA). Niet alleen moet het deeltje voldoen aan bepaalde afmetingen, het moet ook een zekere positieve oppervlaktelading bezitten. Een overmaat aan positieve oppervlakteladingen van het polyplex is noodzakelijk om repulsie tussen het DNA en de negatief geladen celmembraan te vermijden, en het partikel te stabiliseren [2].
A. Polyplexformatie Een polyplex onstaat door de elektrostatische interactie tussen het positief geladen polymeer en het negatief geladen DNA. De lading van het polymeer kan worden toegeschreven aan bij fysiologische pH positief geladen stikstofatomen, aanwezig in de zijketens. De negatieve lading in DNA is afkomstig van de fosfaatgroep aanwezig in de ruggegraat van elke DNA-streng. De fosfaatgroep verbindt twee opeenvolgende 2-deoxyribosen door een fosfodiëster (3-5) binding in een complex met behoud van één negatieve lading (gedeprotoneerde fosforzuurrest) [3]. De verhouding postieve lading tot
65
negatieve lading wordt uitgedrukt als de ladingsverhouding (LV). De LV waarbij het DNA en het polymeer een polyplex vormen is afhankelijk van het type polymeer en wordt ook vaak het ‘condensatiepunt’ genoemd. Om de ladingsverhouding te berekenen van een polyelektrolietcomplex moet de “mass per charge” (M/C) gekend zijn van elk polyelektroliet. De M/C is de massa van het polyelektroliet nodig om één mol lading te bekomen en is afhankelijk van de samenstelling van dit polyelektroliet. De M/C van DNA is 325 Da/mol maar verschilt voor elk polymeer. Deze M/C is het gewogen gemiddelde van de vier basen (A,G,C,T), de deoxyribose eenheid en het fosfaat aanwezig in DNA [4]. Bij de berekening van de M/C van een polymeer moet rekening gehouden worden met de aanwezigheid van een tegenion (Cl-) om de elektroneutraliteit te bewaren. In het geval van copolymeren moet gelet worden op de aanwezigheid van een lading op de verschillende structuureenheden en hoeveel lading aanwezig is in het polymeer. De M/C van kationische polymeren wordt bepaald door het Mw van een structuureenheid (inclusief tegenion) te delen door het aantal ladingen aanwezig op elk monomeer. Bij de berekening wordt er vanuit gegaan dat de guanidine en amine derivaten volledig geprotoneerd zijn. Indien het polymeer een imidazolfunctie (pka ≈ 6) bezit, wordt aangenomen dat slecht de helft van alle monomeereenheden geprotoneerd zijn. De M/C voor alle gesynthetiseerde polymeren wordt weergegeven in onderstaande tabel. Tabel 3.1: M/C van de gesynthetiseerde polymeren uitgedrukt in g/mol
polymeer
M/C
polymeer
M/C
DNA
325
p(HEG70%-co-GuAEG30%)
648,9
p(HEG38%-co-DMAEG62%)
339,2
p(HEG81%-co-GuAEG7%-co-AEG12%)
965,2
p(HEG57%-co-GuAEG43%)
471,7
p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%)
637,9
p(HEG83%-co-GuAEG17%)
1081,9
p(HEG73%-co-GuAEG27%)
713,9
p(HEG79%-co-GuAEG21%)
882,7
p(HEG81%-co-GuAEG19%)
695,8
p(HEG76%-co-GuAEG24%)
797,4
p(HEG63%-co-GuAEG19%)
541,7
p(HEG92%-co-GuAEG8%)
2173,3
p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%)
766,5
Voor de vorming van de DNA/polymeer complexen of polyplexen wordt een kalf thymus DNA oplossing gebruikt van 20 μg/ml. Alle uitgevoerde fysicochemische testen worden uitgevoerd in 2 ml oplossing. Bijgevolg bedraagt de hoeveelheid DNA altijd 40 μg. De hoeveelheid polymeer nodig, is naast de gewenste LV, ook afhankelijk van de M/C van het DNA en het polymeer en wordt bepaald via onderstaande formule. 40 . ⁄
.
66
De dosis polymeer (hoeveelheid lading afkomstig van het polymeer) aanwezig in het polyplex wordt weergegeven door x. Naast het toevoegen van polymeer, wordt de oplossing verder aangelengd tot 2 ml met ultra zuiver water en gevortext. Een minimum volume van 2 ml is nodig voor het uitvoeren van dynamische licht verstrooiingstesten en Ethidium Bromide fluorescentie.
B. Ethidium Bromide fluorescentie B.1) Techniek De verhouding waarbij polymeer en DNA beginnen te condenseren is afhankelijk van de samenstelling van het polymeer. Via Ethidium Bromide fluorescentie kan naast de LV waarbij complexvorming optreedt ook de mate waarin de complexvorming doorgaat bepaald worden. Ethidium Bromide (EtBr) is een vlakke aromatische molecule die in de “minor groove” van de DNA dubbele helix tussen twee basenparen kan intercaleren via van der Waals interacties (figuur 3.1). De twee basenparen waartussen EtBr zich bevindt, worden gedeeltelijk uit elkaar geduwd [5]. Dit wordt tegengehouden door de de beperkte beweeglijkheid van de deoxyribose-fosfaat ruggengraat. Deze lokale verandering in de DNA structuur kan de functie van het DNA verstoren. De intercalatie van EtBr met DNA wordt verhinderd wanneer polyplexen ontstaan. De elektrostatische interactie met polymeer is veel sterker dan de krachten die horen bij intercalatie. Hierdoor daalt de fluorescentie bij 590 nm [6].
H2N
NH2
N
Br CH3
Figuur 3.1: structuur van Ethidium Bromide (links); plaats van intercalatie van EtBr in de “minor groove” (rechts)
Het optreden van intercalatie kan worden benut bij fluorescentiemetingen. Als EtBr zich in de “minor groove” bevindt, wordt deze molecule geëxciteerd als licht van 510 nm doorheen de oplossing gestuurd wordt. Dit geeft aanleiding tot fotonemissie bij 590 nm (= fluorescentie proces). De additie van kationische polymeren zorgt ervoor dat het EtBr niet langer kan intercaleren. Dit zorgt voor een daling van de fluorescentie bij 590 nm. De LV waarbij een polyplex gevormd wordt tussen het DNA en 67
het polymeer gaat gepaard met een scherpe afname in fluorescentie. De mate van deze afname is een maat voor de interactiesterkte. De EtBr-concentratie is een belangrijke factor waarmee moet rekening gehouden worden in Ethidium Bromide Fluorescentie metingen. Een te hoge concentratie aan EtBr zou het DNA zodanig stabiliseren dat condensatie van het DNA door kationische polymeren onmogelijk wordt. De optimale EtBrconcentratie voor fluorescentiemetingen bedraagt 400 ng/ml. Deze concentratie is hoog genoeg om gedetecteerd te worden door de fluorometer en laag genoeg om geen permanente gevolgen voor de stabilisatie van DNA te veroorzaken [7]. Voor de experimenten werd dan ook deze concentratie EtBr aangewend. Voor de fluorescentiemeting wordt een oplossing gemaakt van DNA en EtBr. Het volume van de EtBroplossing waarin het DNA opgelost wordt, is afhankelijk van de hoeveelheid polymeer die nodig is om een 2/1 LV polymeer/DNA te verkrijgen. In afwezigheid van het polymeer wordt de relatieve fluorescentie gelijk gesteld aan 100 %. Er wordt verder stapsgewijs polymeer toegevoegd nodig om een stijging in de LV te verkrijgen met 0,2 eenheden (met een korte vortex stap tussen elke additie) tot uiteindelijk een LV van 2/1 bekomen wordt. EtBr wordt geëxciteerd met een golflengte van 510 nm. De emissiefluorescentie wordt gemeten bij een golflengte van 590 nm. Alle metingen worden uitgevoerd in drievoud.
B.2) Resultaten Als de relatieve fluorescentie uitgezet wordt in functie van de toegevoegde hoeveelheid polymeer wordt het condensatieprofiel van een polymeer/DNA complex verkregen. In het begin is er altijd een stijging te zien in de waargenomen relatieve fluorescentie. Dit komt omdat bij lage ladinsgverhoudingen, de kleine hoeveelheid polymeer nog niet in staat is het DNA te condenseren waardoor enkel stabilisatie optreedt van DNA met een kleine conformatieverandering als gevolg zodat er meer EtBr kan intercaleren. Deze ruimtelijke herschikking stelt meer intercalatiesites ter beschikking met een verhoging van de fluorscentie opbrengst (ϕ) als gevolg. Bij overschrijding van een kritische hoeveelheid polymeer treedt er uiteindelijk condensatie van het DNA op. Dit gaat gepaard met een afname in relatieve fluorescentie daar de zwakkere EtBr interactie (van der Waals interactie) vervangen wordt door een sterkere elektrostatische binding bij vorming van een polyplex. De meeste metingen werden uitgevoerd tot een 2/1 LV in stappen van 0,2 LV. Achteraf werd voor een aantal polymeren ook de fluorescentie gemeten bij een LV van 3/1. Dit wordt enderzijds gedaan om de invloed van een extra lading na te gaan, anderzijds omdat er nog niet voldoende indicatie voor complexvorming waar te nemen viel. Uit deze condensatieprofielen kan de LV bepaald worden waarbij polyplexen worden gevormd. Zodoende kunnen de verschillende polymeren met elkaar vergeleken worden door hun FImin68
waarden (intensiteit van de fluorescentie bij LV 2/1) naast elkaar te leggen. De FImin-waarde is een indicatie voor de affinteit voor complexatie van het polyplex. Een lagere FImin-waarde correspondeert met een grotere neiging tot interactie van het polymeer met DNA [7]. Hieronder is het condensatieprofiel weergegeven voor enkele gesynthetiseerde polymeren (figuur 3.2). Het belang van de verschillende functionele groepen (imidazol, hydroxyl, guanidine) en de invloed op de complexvorming kan op deze manier vergeleken worden. 140,00 1 p(HEG38%-DMAEG62%) 145
2 p(HEG70%-AEG6%-GuAEG24%)
120,00
relatieve fluorescentie (%)
kDa
100,00
3 p(HEG60%-GuAEG22%-ImEG18%) 10
kDa
4 p(HEG49%-GuAEG15%-ImEG36%) 10
kDa
5 p(HEG57%-GuAEG43%) 150
80,00
10 kDa
kDa
60,00
40,00
20,00
0,00 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
ladingsverhouding (+/-)
Figuur 3.2: Condensatieprofiel van vijf gesynthetiseerde kationische copolymeren
Aanvankelijk stijgt de relatieve fluorescentie voor alle polymeren door de verhoogde stabilisatie van DNA waardoor er meer EtBr kan intercaleren. De relatieve fluorescentie stijgt het meest voor de polymeren die imidazol groepen bevatten (p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%) en p(HEG49%-coGuAEG15%-co-ImEG36%)). Uit de resultaten blijkt dat p(HEG57%-co-GuAEG43%), p(HEG38%-co-DMAEG62%) en p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%) de grootste afname in fluorescentie vertonen. Deze drie polymeren zijn in staat DNA relatief goed te condenseren bij een lage LV wegens de grote hoeveelheid positieve lading die aanwezig is. De andere twee polymeren p(HEG70%-co-AEG6%-coGuAEG24%) en p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%) condenseren DNA minder goed en doen dit slechts geleidelijk aan. De invloed van het aantal geladen groepen blijkt op het eerste zicht van groter belang dan het Mw. De resulterende sterkere interactie zorgt ook voor de lagere FImin-waarde van p(HEG38%co-DMAEG62%) en p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%) t.o.v. p(HEG70%-co-AEG6%-co-GuAEG24%)en p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%). Uit de resultaten blijkt ook dat guanidine groepen (p(HEG57%-coGuAEG43%)) beter DNA kunnen condenseren dan tertiaire amines (p(HEG38%-co-DMAEG62%)). Beiden hebben een vergelijkbaar Mw (150 kDa) maar ondanks de grotere afstand tussen de positieve ladingen bereikt het guanidine derivaat toch een lagere FImin-waarde. Uit de resultaten blijkt ook dat 69
p(HEG38%-co-DMAEG62%) het condensatiepunt iets sneller bereikt dan p(HEG57%-co-GuAEG43%). De invoer van imidazol en guanidine groepen blijkt ook een gunstig effect op DNA condensatie te hebben. De FImin-waarde van p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%) is lager dan p(HEG38%-coDMAEG62%), ondanks een grotere ladingsseparatie. De condensatieprofielen van een reeks p(HEGx-co-GuAEGy) met verschillend Mw is uitgezet in figuur 3.3. Ook hier neemt de relatieve fluorescentie eerst toe voor alle polymeren. Uit het condensatieprofiel van p(HEG73%-co-GuAEG27%) van 9345 Da en p(HEG63%-co-GuAEG37%) van 120 kDa is af te leiden dat p(HEG63%-co-GuAEG37%) van 120 kDa leidt tot een lagere FImin-waarde doordat het iets meer positieve ladingen bevat. p(HEG73%-co-GuAEG27%) van 9345 Da condenseert dan weer vanaf een lagere LV dan p(HEG63%-co-GuAEG37%) van 120 kDa. p(HEG81%-co-GuAEG19%) van 100 kDa en p(HEG81%-co-AEG12%-co-GuAEG7%) van 16,5 kDa hebben een verschillende Mw maar bezitten elk ongeveer 20% geladen groepen, waardoor de FImin-waarde voor beiden ongeveer overeenkomstig is (± 65). Het verschil in Mw zorgt er echter voor dat p(HEG81%-co-GuAEG19%) van 100 kDa pas condenseert bij een hogere LV. Kationische polymeren met een laag Mw hebben kleinere dimensies (wat betreft kluwen diameter) waardoor deze mobieler zijn en vlotter een andere oriëntatie kunnen aannemen om optimale condensatie met DNA mogelijk te maken. Het Mw beïnvloedt dus voornamelijk de hoeveelheid massa nodig om polyplexformatie te laten optreden (in zekere mate een kinetisch effect) en niet de neiging tot complexatie, wat afhankelijk is van het aantal positieve ladingen (thermodynamisch aspect). 140,000
P p(HEG 100k
kDa 9345 Da P p(HEG 120k 63%-co-GuAEG37%) 120 kDa
130,000 120,000
relatieve fluorescentie (%)
81%-co-GuAEG19%) 100
P p(HEG 9k 73%-co-GuAEG27%)
P p(HEG 16k 81%-co-AEG12%-co-GuAEG7%)
110,000
16,5 kDa
100,000 90,000 80,000 70,000 60,000 50,000 40,000 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
ladingsverhouding (+/-)
Figuur 3.3: Condensatieprofiel van verschillende gesynthetiseerde p(HEGx-co-GuAEGy) met verschillend Mw
In figuur 3.4 zijn de condensatieprofielen terug te vinden voor p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz) derivaten met Mw van 20 kDa maar met een verschillende samenstelling. Alle polymeren, behalve het derivaat met
slechts
8%
geladen
groepen
(p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%)),
vertonen
bij
het 70
condensatiepunt een duidelijke afname in relatieve fluorescentie. De relatieve fluorescentie van p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%) neemt slechts langzaam af bij een stijgende LV. Uit de FImin-waarde van 92% kan besloten worden dat p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%) niet genoeg positieve ladingen bezit om DNA stevig te condenseren. Er is evenwel voldoende stabilisatie om intercalatie tot op zekere hoogte te verhinderen waardoor toch een fluorescentie daling optreedt. Het derivaat met 21% geladen groepen (p(HEG79%-co-AEG8%-co-GuAEG13%)) bezit ongeveer dezelfde FImin-waarde als p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%) maar bij een 4/1 ladingsverhouding is de relatieve fluorescentie al gedaald tot 65%. Dit is ± 25% lager dan deze van p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%), wat bevestigt dat dit polymeer toch als vector kan gebruikt worden bij verhoogde LV. De FImin-waarden van de gesynthetiseerde polymeren liggen sterk uiteen. Dit is een gevolg van het verschil in aanwezige ladingen tussen de polymeren. Als p(HEG83%-co-AEG3%-co-GuAEG14%) buiten beschouwing wordt gelaten, daalt de FImin-waarde met stijgende ladingsdichtheid. De interacties tussen het polymeer en het DNA in het gevormde polyplex zijn dus sterker wanneer er meer ladingen aanwezig zijn. Niet alleen de mate waarin complexvorming optreedt wordt bepaald door het aantal positief geladen groepen op het polymeer, ook de ladingsverhouding waarbij condensatie optreedt is hiervan afhankelijk. Hoe meer positieve ladingen het polymeer bevat, hoe vroeger condensatie optreedt.
p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%)
125,00
P 8%
p(HEG74%-co-AEG3%-co-GuAEG21%)
P 24%
115,00
p(HEG83%-co-AEG3%-co-GuAEG14%)
P 17%
relatieve fluorescentie (%)
105,00
p(HEG70%-co-AEG4%-co-GuAEG26%)
P 30%
p(HEG79%-co-AEG8%-co-GuAEG13%)
P 21%
95,00
85,00
75,00
65,00
55,00
45,00 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
ladingsverhouding (+/-)
Figuur 3.4: Condensatieprofiel van verschillende p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz) met vergelijkbaar Mw van 20 kDa maar met verschillende hoeveelheid lading
71
C. Agarose gel-elektroforese C.1) Techniek Een andere manier om de LV te bepalen waarbij polyplexvorming optreedt, is agarose gelelektroforese. De methode is gebaseerd op een vermindering van de mobiliteit van DNA na condensatie en een verschil in scheiding onder invloed van een aangelegd elektrisch veld. Niet gecondenseerd DNA zal wegens zijn negatieve lading migreren naar de postieve pool (anode) toe. De mobiliteit vermindert wanneer polyplexvorming optreedt. Bij volledige condensatie is migratie onmogelijk (door neutralisatie van de negatieve lading) en treedt er retentie op in de “wells”. De agarose gel wordt bereid door 1 gram agarose op te lossen in 100 ml ultra zuiver water en te laten koken voor 15 minuten (Au bain-marie). De gel wordt nadien in een mal gegoten, gehard en ondergedompeld in een TBE buffer (1x). In een agarose gel worden elf polymeer/DNA verhoudingen ingebracht in “wells”. De LV loopt op van 0/1 (puur DNA) tot 2/1, in stappen van 0,2/1 en zijn bereid zoals beschreven in sectie A van dit hoofdstuk. Aan 20 μl-oplossing wordt telkens 2 μl ladingsbuffer toegevoegd. Het toevoegen van deze ladingsbuffer is tweeledig. Het verhoogt de densiteit van de polyplexen waardoor ze op de bodem van de “wells” blijven. Het bromofenol blauw in de buffer visualiseert het migratiepatroon van het DNA tijdens elektroforese. Na de scheiding door elektroforese bij een spanning van 90 V gedurende 1 uur wordt de gel gekleurd door te incuberen gedurende 2 uur in een 0,5 μg/ml Ethidium Bromide oplossing. De gel wordt nadien gevisualiseerd met een UV-transilluminator en gefotografeerd met een digitale camera.
C.2) Resultaten Via agarose gel-elektroforese testen kunnen vergelijkbare eigenschappen bepaald worden als bij EtBr-fluorescentie. Ondanks de verschillende techniek kunnen de resultaten bekomen bij fluorescentie via deze techniek bevestigd worden. Bij gel-elektroforese kan naast de LV waarbij complexatie optreedt ook een idee verkregen worden over de mate waarin polyplexen gevormd worden (bv. geleidelijk vs. abrupte overgangen). Nadat een DNA-polymeer scheiding is bekomen onder invloed van een potentiaalverschil kan het DNA gekleurd worden met EtBr. Via belichting (UVB) wordt het DNA gevisualiseerd. Het DNA dat door de anode aangetrokken is, werd zo als een smeer zichtbaar. Dit komt doordat het gebruikte kalf thymus DNA fragmenten bevat van verschillende Mw en de migratie doorheen de gel verschilt per fragment, waardoor na kleuring geen fijne band, maar een brede smeer DNA wordt waargenomen. De lengte van deze band neemt geleidelijk of abrupt af
72
met toenemende DNA condensatie. Indien totale condensatie van het DNA is opgetreden, is geen band meer zichtbaar. Aangezien agarose gel-elektroforese metingen op andere principes berusten dan fluorescentie metingen, worden licht gewijzigde resultaten bekomen maar een gelijkaardig trend blijft behouden. Een analoge indeling als bij fluorescentie werd aangewend waarbij de resultaten in figuur 3.5 terug te vinden
zijn
voor
p(HEG38%-co-DMAEG62%),
p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%),
p(HEG60%-co-
GuAEG22%-co-ImEG18%), p(HEG57%-co-GuAEG43%) en p(HEG70%-co-AEG6%-co-GuAEG24%). Bij agarose gelelektroforese treedt condensatie op voor p(HEG38%-co-DMAEG62%) bij een LV van 1/1, een gelijkaardige verhouding zoals bepaald met EtBr-fluorescentie. p(HEG70%-co-AEG6%-co-GuAEG24%) condenseert DNA volledig bij een 1,2/1 LV, 0,4-0,6 LV sneller dan bij de EtBr fluorescentie metingen. Het derivaat met 36% imidazol groepen (p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%)) complexeert hier slechts volledig bij een LV van 1,6/1. Complexatie treedt geleidelijk op bij stijgende ladingsverhouding, zichtbaar door de langzame afname van de DNA smeer. Bij EtBr-fluorescentie treedt condensatie op vanaf 0,8/1. Blijkbaar is de polyplex vorming dan nog niet volledig, wat de verdere daling in fluorescentie bij hogere LV’en kan verklaren. Het derivaat met 18% imidazol groepen (p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%)) is niet in staat om DNA volledig te condenseren bij een LV lager dan 2/1. Dit bevestigt het profiel en de hoge FImin-waarde (± 80) bekomen uit het condensatieprofiel via EtBr-fluorescentie. Uit deze resultaten blijkt ook dat de invoer van imidazol groepen zorgt voor een geleidelijkere afname van de DNA smeer. Andere functionele groepen (tertiaire amines en guanidines) zorgen voor een meer abrupte afname. Een andere conclusie is dat afhankelijk van het type polymeer via agarose gel-elektroforese stabilisatie voldoende is om migratie te voorkomen zonder dat de polyplex formatie volledig is. Hierdoor zijn de waarden van de metingen verschoven t.o.v. EtBr-fluorescentie. p(HEG57%-coGuAEG43% )
p(HEG38%-co DMAEG62% )
p(HEG70%-coAEG6%-coGuAEG24%)
p(HEG60% -coGuAEG22% -coImEG18%)
>2/1
p(HEG49%-coGuAEG15%-coImEG36%) 2/1
1,8/1 1,6/1 1,4/1
1,2/1 1/1 0,8/1
1,2/1 1/1 0,8/1 0,6/1 0,4/1 0,2/1 0/1
Figuur 3.5: agarose gel-elektroforese van vijf gesynthetiseerde kationische polymeren met verschillende functionele groepen
73
De resultaten voor verschillende p(HEGx-co-GuAEGy) derivaten zijn weergegeven in figuur 3.6. Algemeen gezien worden dezelfde resultaten bekomen als bij de EtBr-fluorescentie, behalve voor P 100, die een shift vertoont van 0,4-0,6 LV’en naar een vroegere condensatie. De plotste afname bevestigt de sterke interactie tussen het polymeer en het DNA. Ondanks de meestal hoge FIminwaarden (70-80) zijn alle vectoren toch in staat om DNA migratie te voorkomen. De condensatie verloopt voor sommige polymeren geleidelijk aan, voor anderen, die met meer geladen groepen, abrupter. p(HEG81% -coAEG12%-coGuAEG7%) 2/1 16,5 kDa
p(HEG73% -coGuAEG27%) 9350 Da
P(HEG81%-coGuAEG19%) 100 kDa
p(HEG63%-coGuAEG37%) 2/1 120 kDa
1,8/1 1,6/1 1,4/1
1,4/1 1,2/1
1/1
1/1 0,8/1 0,6/1 0,4/1 0,2/1 0/1
Figuur 3.6: Agarose gel-elektroforese van p(HEGx-co-GuAEGy) met verschillend Mw.
In figuur 3.7 zijn de agarose gel-elektroforese foto’s terug te vinden voor gesynthetiseerde guanidine derivaten met analoog Mw maar met verschillend aantal positief geladen groepen. De bekomen resultaten bevestigen de gemaakte conclusies op basis van de condensatieprofielen bij EtBrfluorescentie. p(HEG92%-co-AEG3%-co-GuAEG5%) is niet in staat om DNA te condenseren bij een LV lager of gelijk aan 2/1, door de lage densiteit aan positieve ladingen. Bij een hogere LV kan er evenwel beperkte condensatie optreden. Het DNA wordt niet voldoende weerhouden in de “wells” en kan dus voor alle LV’en migreren naar de anode toe. Uit deze resultaten blijkt dat ook hier de complexatie vroeger optreedt met een stijgend aantal positieve ladingen aanwezig in het polymeer. Bovendien verschilt de LV waarbij condensatie optreedt gemiddeld 0,2 ladingsverhoudingen van de waarde bekomen bij EtBr-fluorescentie.
74
p(HEG83%-coAEG3%-coGuAEG14%)
p(HEG76% -coAEG3%-coGuAEG21%)
p(HEG92% -coAEG3%-coGuAEG5%)
> 2/1
p(HEG79% -coAEG8%-coGuAEG13% ) 2/1
p(HEG70% -co2/1 AEG4%-coGuAEG26% )
1,6/1 1,2/1
1,8/1
1,6/1 1,4/1 1,2/1 1/1 0,8/1 0,6/1 0,4/1 0,2/1 0/1
Figuur 3.7: agarose gel-elektroforese van verschillende p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz) met vergelijkbaar Mw (± 20 kDa), maar met verschillende hoeveelheid lading
D. Dynamische licht verstrooiing D.1) Techniek Zoals vermeld moeten de gesynthetiseerde vectoren in staat zijn om DNA te condenseren bij bepaalde LV’en. DNA condensatie is echter niet voldoende om als geschikte vector te dienen. De afmeting van het polyplex moet kleiner zijn dan ± 200 nm om efficiënt te kunnen opgenomen worden in de cel. De deeltjesgrootte en distributie van de gevormde polyplexen bij verschillende LV werd daarom in het kader van deze thesis bepaald via dynamische licht verstrooiing (DLS). Dynamische licht verstrooiing, soms ook foton correlatie spectroscopie genoemd, kan op basis van tijdelijke intensiteitfluctuaties, die optreden wanneer een lichtbundel verstrooid wordt door in oplossing aanwezige deeltjes, de grootte van in oplossing aanwezige deeltjes bepalen. Wanneer de deeltjes zeer klein zijn in vergelijking met de golflengte van de invallende lichtbundel (< λ/20) wordt het licht verstrooid in alle richtingen met dezelfde intensiteit, de zogenaamde Rayleigh verstrooiing. Deeltjes in oplossing bewegen volgens de Brownse beweging. Deze beweging ontstaat door botsing van de partikels met de solvent moleculen die constant in beweging zijn wegens hun thermische energie. Als de deeltjes bestraald worden met een laser zullen de partikels zorgen voor een intensiteitsfluctuatie van het verstrooide licht. De intensiteitsfluctuaties die optreden zijn afhankelijk van de grootte van de deeltjes. Kleine partikels bewegen veel sneller na botsing met een solventmolecule dan grote partikels, waardoor de intensiteitsfluctuatie groter is bij kleinere partikels. De detector, opgesteld onder een hoek van 90° om interferentie met het invallende licht te minimaliseren, vangt deze intensiteitsfluctuaties op en zet ze om in een elektrische puls.
75
Deze elektrische puls wordt doorgegeven aan een digitale correlator die een correlatiefunctie genereert. Deze functie beschrijft hoe snel het signaal verandert en is een dalende exponentiële functie. De snelheid waarmee de functie daalt kan gecorreleerd worden aan de grootte van de deeltjes aanwezig in oplossing. Uit deze correlatiefunctie kan de diffusiecoëfficiënt D berekend worden. Door deze in te vullen in de Stokes-Einstein vergelijking kan de hydrodynamische straal, rD van het partikel worden bepaald.
Met:
k = Boltzmann constante T = absolute temperatuur η = viscositeit van het solvent D = diffusiecoëfficiënt
De gemeten diameter is de hydrodynamische diameter en geeft weer hoe diffuus een sferisch partikel is in oplossing [8]. De diameter verkregen door DLS is deze van een deeltje die dezelfde translationele diffusiecoëfficiënt vertoont als het partikel dat gemeten wordt [9]. De grootte van de polyplexen wordt bepaald bij drie verschillende LV’en, 1/1, 2/1 en 4/1. De grootte wordt bepaald door een 10 mW laser (488 nm) te laten invallen op de oplossing en de intensiteit van de verstrooide lichtstralen te meten onder een hoek van 90° bij een temperatuur van 25°C. De oplossingen werden gemaakt zoals eerder beschreven. Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd en bestonden elk uit 10 subruns.
D.2) Resultaten Om een efficiënte celopname mogelijk te maken, moet het gevormde polyplex een diameter hebben die kleiner is dan ± 200 nm. Alle gesynthetiseerde p(HEGx-co-GuAEGy) derivaten voldoen aan deze voorwaarde, behalve p(HEG83%-co-GuAEG14%-co-AEG3%) bij een 1/1 LV (tabel 3.1). Er is niet echt een invloed merkbaar van het Mw of van de ladingsseparatie op de deeltjesgrootte. Uit de resultaten blijkt ook dat de polyplex grootte daalt bij een stijgende LV. Een andere zichtbare trend is dat wanneer de polyplexen een optimale interactie bereikt hebben, een stijgende LV ervoor zorgt dat het partikel groter wordt. Bij sommige polymeren is dit zelfs al zo vanaf een 1/1 LV. Wanneer er nog polymeer toegevoegd wordt, zal dit niet meer leiden tot een verdere condensatie van het DNA. Het additionele polymeer zal associëren en zo de hydrodynamische radius doen toenemen.
76
Tabel 3.1: overzicht van de deeltjesgrootte bij een 1/1, 2/1 en een 4/1 ladingsverhouding van alle gesynthetiseerde p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
Polymeer
Mw (Da)
deeltjesgrootte (nm) bij ladingsverhouding 1/1
2/1
4/1
p(HEG57%-co-GuAEG43%)
153500
23,0
42,2
29,3
p(HEG83%-co-GuAEG14%-co-AEG3%)
18430
360
64,2
35,7
p(HEG76%-co-GuAEG21%-co-AEG3%)
18010
116
53,5
62,8
p(HEG92%-co-GuAEG5%-co-AEG3%)
18930
26,5/800
25,8/650
25,4/600
p(HEG70%-co-GuAEG24%-co-AEG6%)
8970
41,1
45,8
36,0
p(HEG79%-co-GuAEG13%-co-AEG8%)
17910
90,7
36,1
34,0
p(HEG70%-co-GuAEG26%-co-AEG4%)
17130
60,6
75,6
33,7
p(HEG81%-co-GuAEG7%-co-AEG12%)
16570
24,8
32,0
48,0
p(HEG73%-co-GuAEG27%)
9350
76,7
49,3
52,9
p(HEG81%-co-GuAEG19%)
102370
23,9
26,5
27,2
p(HEG63%-co-GuAEG37%)
119150
46,1
31,1
67,8
Tussen deze resultaten, bevindt zich een opmerkelijk polymeer. Uit de resultaten van EtBr fluorescentie en agarose gel-elektroforese blijkt dat p(HEG92%-co-GuAEG5%-co-AEG3%) slechts beperkt in staat is om DNA te condenseren. Dit is in contradictie met de resultaten bekomen via DLS. Reeds vanaf een 1/1 ladinsgverhouding is p(HEG92%-co-GuAEG5%-co-AEG3%) schijnbaar in staat om DNA partikels te vormen. De gemeten diameter van ± 25 nm, is bij LV 4/1 kleiner dan de meeste polymeer/DNA complexen bij een 4/1 LV. Door de beperkte condensatie eigenschappen is wellicht slechts een klein deel van de totale hoeveelheid polymeer tot een polyplex gevormd en dit laat vermoeden dat nog een distributie met een hogere deeltjesgrootte bestaat (± 600 nm). Voor andere polymeren konden soms ook nog additionele distributies met hogere deeltjesgrootte opgemerkt worden maar deze waren slechts in verwaarloosbare mate aanwezig. Ook polymeren met zowel hydroxyl groepen als tertiaire amines of imidazol groepen zijn in staat om DNA te condenseren tot partikels die kunnen opgenomen worden in de cel. Deze polymeren condenseren DNA tot polyplexen met een grootte weergegeven in de onderstaande tabel. Tabel 3.2: overzicht van de deeltjesgrootte bij een 1/1, 2/1 en een 4/1 ladingsverhouding van imidazol en tertiaire amine bevattende gesynthetiseerde polymeren
Polymeer
Mw (Da)
p(HEG38%-co-DMAEG62%)
deeltjesgrootte (nm) bij ladingsverhouding 1/1
2/1
4/1
153500
46,8
61,0
67,6
p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%)
10168
51,3
50,1
46,3
p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEg36%)
9965
36,4
39,4
38,2 77
Imidazol bevattende polymeren zorgen voor een gunstige interactie met DNA, want het derivaat met het hoogste aantal imidazol-groepen is in staat om de kleinste polyplexen te vormen. p(HEG38%-coDMAEG62%) heeft de kleinste hydrodynamische straal bij een 1/1 LV. De EtBr-fluorescentie en agarose gel-elektroforese toonden aan dat p(HEG38%-co-DMAEG62%) bij een 1/1 LV reeds in staat is om DNA te condenseren. Bij een 2/1 en 4/1 LV is de optimale lading nodig voor complexatie al overschreden waardoor toevoeging van extra polymeer enkel leidt tot grotere polyplexen. De imidazol bevattende polyplexen blijken vrij constant bij LV verandering. Er is geen merkbare stijging of daling in diameter waargenomen bij de verschillende LV’en voor beide imidazol gebaseerde poly-L-gutamaat derivaten. Hieronder zijn de resultaten weergegeven voor de verschillende LV voor p(HEG38%-DMAEG62%) onder de vorm van een Gauss-achtige distributie. Het is mogelijk dat de bekomen gauss-curves een staart bevatten (“tailing”) of een bimodale piek vertonen vanwege de aanwezigheid van een tweede distributie. Grafiek D, werd bekomen door de resultaten van de drie LV’en op elkaar te leggen en toont de evolutie van de partikel diameter aan over de verschillende LV’en. Size distribution(s)
1/1
A 30
2/1
B % in c las s
% in cl as s
Size distribution(s)
40
20 20 10
5 10
50100 500 Diameter (nm)
5 10
Size distribution(s)
4/1
C
% in c las s
% in c las s
Size distribution(s)
30
50100 500 Diameter (nm)
P(HEG-DMAEG)
D
1/1
40
20
2/1 20
4/1
10
5 10
50100 500 Diameter (nm)
5 10
50100 500 Diameter (nm)
Figuur 3.8: Gaussiaanse distributies verkregen voor p(HEG38%-co-DMAEG62%) bij verschillende ladingsverhoudingen. A: 1/1 ladinsgverhouding; B: 2/1 ladingsverhouding; C: 4/1 ladingsverhouding; D: “overlay” van de verschillende verhoudingen, de 1/1, 2/1 en 4/1 zijn respectievelijk weergegeven in het groen, zwart en blauw.
78
E. Zeta-potentiaal E.1) Techniek De lading aan het oppervlak van het polyplex p kan worden bepaald via zeta-poteniaal poteniaal metingen. De zeta-potentiaal iss de elektrische potentiaal op een specifieke afstand van het oppervlak van een geladen partikel en is een maat voor de stabiliteit van geladen partikels in oplossing of suspensie [10]. Colloïdale dale deeltjes in oplossing zijn elektrisch geladen door ionisatie ionisatie van functionele groepen of door adsorptie van geladen deeltjes aan het oppervlak [11]. De aanwezigheid van dezee ladingen zorgt voor een wijziging in de distributie van ionen in de nabije omgeving van dit deeltje. In de buurt van het he deeltje zijn tegenionen, met een lading tegengesteld aan de oppervlaktelading van het partikel, terug te vinden in verhoogde concentratie. Er onstaat een zogenaamde dubbellaag, bestaande uit twee regio’s (figuur 3.9). Een binnenste ste regio met ionen die relatief sterk gebonden zijn aan het oppervlak en een diffuse, buitenste regio (enkele nm) waarvan de samenstelling gereguleerd wordt w door de constante thermische bewegingen van de solventmoleculen en elektrostatische aantrekkingsaantrekkings krachten [12]. In de binnenste regio neemt de elektrostatische potentiaal lineair af doorheen doorhee de eerste laag met tegenionen. Binnenin de diffuse laagg is er een exponentiële afname te zien van de elektrostatische potentiaal. In een elektrisch veld zullen de deeltjes, samen met hun omgeven ionen en een deel van de diffuse laag, aangetrokken worden door de tegengesteld geladen elektrode. Dit wil zeggen dat de zeta-potentiaal potentiaal overeenkomt met de potentiaal aan de solventlaag die door de elektrische aantrekkingskrachten stationair meebeweegt doorheen de oplossing.
Figuur 3.9: De oriëntering rond een geladen deeltje in oplossing
79
De zeta-potentiaal heeft een invloed op de snelheid waarmee deeltjes migreren in een elektrisch veld [13]. De bepaling van de zeta-potentiaal gebeurt dan ook aan de hand van een meting van de snelheid door een aangelegd elektrisch veld. Deze snelheid kan bepaald worden door middel van laser doppler velocimetrie. Bij laser doppler velocimetrie wordt aan de hand van de snelheid (v) van de deeltjes en de grootte van het aangelegd per elektrisch veld (E), de elektroforetische mobiliteit (μ) gemeten.
!
". #
%$&
' ( ⁄#) * ("⁄ )
De zeta-potentiaal (ζ) kan dan via onderstaande formule bepaald worden uit de elektroforetische mobiliteit (µ). In bovenstaande formule is
+. , 2 +2 + , 6./ 3 /
ζ = zeta-potentiaal (V) ε = permitiviteit van de buffer (=4ε0εrπ) ε0 = permitiviteit van het vacuüm (8,85 10-12 C²/N.m²) εr = diëlektrische constante (78 voor water bij 25°C) η = viscositeit van het medium (0,89 cP)
De aanwezigheid van een kationische lading in een polyplex en of aan het oppervlak draagt bij tot de stabiliteit van het polyplex. Een zeta-potentiaal tussen ± 30 en ± 40 mV geeft een goede stabiliteit [14]. Een te lage potentiaal zorgt voor een zekere destabilisatie van het polyplex, terwijl een hogere zeta-potentiaal
verhoogde
stabiliteit
veroorzaakt.
De
meeste
polyplexen
bezitten
een
oppervlaktelading tussen de 30 en 60 mV. Er bestaat echter nog geen zekerheid over de optimale lading die een polyplex moet bezitten om een ideale interactie te vertonen met de cel. De zeta-potentiaal wordt bepaald voor drie verschillende LV’en nl. 1/1, 2/1 en 4/1. De oplossingen worden op dezelfde manier bereid als bij dynamische licht verstrooiings experimenten. Het enige verschil is dat nu 4 ml oplossingen gemaakt worden. Alle stalen werden tien maal gemeten bij 1000 Hz en een celvoltage van 220 V.
E.2) Resultaten De resultaten bekomen door middel van zeta-potentiaal metingen zijn uitgezet in figuur 3.10. Uit deze resultaten blijkt dat de zeta-potentiaal toeneemt bij stijgende LV. De polymeren die niet genoeg positieve ladingen bezitten om complexatie mogelijk te maken bij een LV van 1/1 vertonen een negatieve zeta-potentiaal. Niet alle negatieve ladingen van het DNA kunnen geneutraliseerd worden door de hoeveelheid polymeer aanwezig in het polyplex, waardoor de zeta80
potentiaal een negatieve waarde vertoont. De zeta-potentiaal blijkt lager voor polymeren met een lagere ladingsdichtheid. Dit is het geval voor de sterk negatieve zeta-potentiaal van het polymeer met 37% guanidine groepen omdat de interactie met DNA niet sterk genoeg is om reeds complexatie te krijgen bij een 1/1 LV. Dit kan te maken hebben met conformatieveranderingen die het gevolg zijn van stabilisatie door het polymeer dat nog niet in voldoende mate aanwezig is om optimale condensatie uit te lokken. De polymeren met de hogere ladingsdichtheid vertonen bij een LV van 4/1 ook een hogere zeta-potentiaal. Het excess aan positieve ladingen die niet gebruikt worden om DNA te complexeren worden in lagen rondom het partikel toegevoegd waardoor de zeta-potentiaal van het partikel toeneemt. De zeta-potentiaal metingen bevestigen de resultaten die bekomen zijn uit EtBr-fluorescentie en agarose gel-elektroforese. Polymeren die geen DNA condensatie vertoonden bij een LV van 1/1 bezitten hier een neutrale of negatieve zeta-potentiaal. Een overwegend positieve oppervlaktelading laat een sterkere membraaninteractie toe wat gunstig zou zijn voor cel internalisatie. Daarnaast is ook de stabiliteit in waterige oplossingen hoger.
mV 50 40 30 20 10 0 0,00 -10 -20 -30
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
LV
p(HEG 76% - co -AEG 3% - co - GuAEG 21%) p(HEG 83% - co- AEG 3% - co - GuAEG 14%) p(HEG 57% - co - GuAEG 43%) p(HEG 38% - co - DMAEG 62%)
-40 -50 -60
p(HEG 49% - co - GuAEG 15% - co -ImEG 36%) p(HEG 63% - co - GuAEG 37%) p(HEG 60% - co - GuAEG 22% - co - ImEG 18%)
Figuur 3.10: zeta-potentiaal bij een 1/1, 2/1 en 4/1 ladingsverhouding voor verschillende gesynthetiseerde polymeren
81
F. Referenties 1. 2. 3.
4. 5.
6. 7. 8.
Lin, C. and J.F.J. Engbersen, Effect of chemical functionalities in poly(amido amine)s for nonviral gene transfection. Journal of Controlled Release, 2008. 132(3): p. 267-272. Wiethoff, C.M. and C.R. Middaugh, Barriers to nonviral gene delivery. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003. 92(2): p. 203-217. Watson, J.D. and F.H.C. Crick, MOLECULAR-STRUCTURE OF NUCLEIC-ACIDS - A STRUCTURE FOR DEOXYRIBOSE NUCLEIC-ACID. Jama-Journal of the American Medical Association, 1993. 269(15): p. 1966-1967. E. Chargaff, R.L.s., C. green, Composition of the desoxypentose nucleic acids of four genera of sea-urchin. Journal of Biological Chemistry, 1952. 195(1): p. 155-160. Tsuboi, M., J.M. Benevides, and G.J. Thomas, The complex of ethidium bromide with genomic DNA: Structure analysis by polarized Raman Spectroscopy. Biophysical Journal, 2007. 92(3): p. 928-934. Doenecke, D., ETHIDIUM-BROMIDE (EB) BINDING TO NUCLEOSOMAL DNA - EFFECTS ON DNA CLEAVAGE PATTERNS. Experimental Cell Research, 1977. 109(2): p. 309-315. Dubruel, P., Studie van synthetische polymeren als vectoren voor gentherapie. 2003, Universiteit Gent: Gent. Reschel, T., et al., Physical properties and in vitro transfection efficiency of gene delivery vectors based on complexes of DNA with synthetic polycations. Journal of Controlled Release, 2002. 81(1-2): p. 201-217.
9.
10. 11. 12. 13. 14.
http://www.malvern.com/labeng/technology/dynamic_light_scattering/dynamic_light_ scattering.htm. Wong, S.Y., J.M. Pelet, and D. Putnam, Polymer systems for gene delivery-past, present, and future. Progress in Polymer Science, 2007. 32(8-9): p. 799-837. http://www.malvern.com/LabEng/technology/zeta_potential/zeta_potential_LDE.htm. www.colloidal-dynamics.com/docs/CDElTut1.pdf. http://www.lenntech.com/library/fine/zeta/zeta-potential.htm. "Zeta Potential of Colloids in Water and Waste Water", A.S.D.-., American Society for Testing and Materials, 1985.
82
Hoofdstuk 4: Biologische evaluatie van poly-Lglutamine derivaten Het ultieme doel van deze thesis is de ontwikkeling van een poly-L-glutamine derivaat dat als vector kan gebruikt worden voor de in vivo aflevering van therapeutisch DNA. Het is dan ook van groot belang dat de kationische polymeren geen toxische neveneffecten veroorzaken wanneer deze in het lichaam gebracht worden. Gedurende de evolutie heeft het lichaam verschillende afweermechanismen opgebouwd om extern DNA uit het lichaam te houden (bijvoorbeeld via degradatie). Na intraveneuse inbreng van het therapeutisch DNA wordt dit gedegradeerd door in het bloed aanwezige serum nucleasen. De vorming van een polyplex is noodzakelijk om degradatie tegen te gaan en zo de werking van het therapeutisch DNA niet te belemmeren vooraleer het zijn doelweefsel bereikt. Via intracellulaire vrijstelling komt het polymeer of het polyplex uiteindelijk in de lysosomen terecht. Als het polymeer niet biodegradeerbaar is, kan er in de lysosomen lokale opstapeling ontstaan en op die manier toxische neveneffecten veroorzaakt worden. Een manier om lysosomale ophoping van polymeer te vermijden is het invoeren van biodegradeerbare bindingen die kunnen afgebroken worden door hydrolyse of lysosomale enzymen. Wanneer de vector gebruikt wordt voor in vivo toepassingen moet zeker ook de interactie met bloed onderzocht worden. Rode bloedcellen (RBC) zijn van essentieel belang in het lichaam en zeer talrijk aanwezig. De agglutinatie of lysering van RBC door de vrije polymeren of polyplexen is nefast voor hun werking en moet ten alle tijde vermeden worden. Om na te gaan in welke mate de polymeren degradeerbaar zijn werd de invloed van peptidase enzymes op het Mw van de polymeren nagegaan. Hiertoe werden de gesynthetiseerde polymeren
83
geïncubeerd met een een bepaalde dosis van een peptidase enzyme. Deze zijn in staat om de amidebinding te verbreken en het polymeer te degraderen. Voor de polymeren en polyplexen werden de interacties met rode bloedcellen (RBC) nagegaan door het uitvoeren van hemolyse en hemagglutinatie testen. De stabiliteit van het gecomplexeerde DNA ten opzichte van nucleasen, werd onderzocht door incubatie in een oplossing van DNAse I enzymen.
A. Biodegradatie door peptidasen A.1) Inleiding Synthetische poly-α-aminozuur afgeleiden, zoals poly-L-glutamine derivaten zijn vaak ideale kandidaten voor biomedische toepassingen, zoals gen-afgiftesystemen. Naast het feit dat ze gemakkelijk kunnen gesynthetiseerd en gemodificeerd worden, bestaat de mogelijkheid tot degradatie door proteolytische enzymen; wat als een groot voordeel wordt gezien t.o.v. andere virale en niet-virale systemen. Vaak wordt aangenomen dat de ingebrachte vectoren uit het lichaam verwijderd worden via de urinewegen (renale filtratie). Dit is niet altijd het geval omdat een groot deel van de kationische polymeren na cellulaire opname via endocytose uiteindelijk in de lysosomen terechtkomen [1]. Dit zijn celorganellen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van nutriënten en afvalstoffen in de cel. De complete vertering van eiwitten gebeurt dus hoofdzakelijk in deze celorganellen en niet door het spijsverteringsstelsel. De gesynthetiseerde polymeren kunnen gezien worden als homologen van peptiden. Er kan evenwel niet vanuit gegaan worden dat deze synthetische varianten ook afbreekbaar zijn. Als de vector niet volledig biodegradeerbaar is, kan accumulatie optreden in het lysosoom, een gevolg dat beter bekend staat als “lysosomal storage disease” [2]. Proteïnen worden in het lysosoom afgebroken door aanwezige proteolytische enzymen of proteasen. Het meest gekende lysosomale cysteïne protease is Cathepsine B, dit enzym kan poly-alfaaminozuren degraderen door de amidebindingen aanwezig in de hoofdketen te verbreken [3]. De biodegradeerbaarheid van het polymeer is afhankelijk van de hydrofobiciteit, de aard van de chemische binding tussen de monomeereenheden, de lading en de macromoleculaire structuur van het polymeer. Voor de degradatiestudies, uitgevoerd in het kader van deze thesis, werd gewerkt met het protease Papaïne. Papaïne is een goed gekarakteriseerd, uit planten afkomstig thiol endopeptidase en is in staat om via het endopeptidase mechanisme poly-L-glutamine derivaten efficiënt af te breken tot oligomeren. Deze oligomeren kunnen dan verder door exopeptidasen gedegradeerd worden tot individuele aminozuureenheden. Het lysosomale membraan is impermeabel voor grote polaire componenten. Het product moet dus degradeerbaar zijn tot fragmenten die klein genoeg zijn om door het lysosomale membraan te dringen, anders blijft restproduct in het lysosoom bestaan [4]. In deze experimenten werd voorlopig alleen met een 84
endopeptidase gewerkt waarbij afbraakproducten van oligomere grootte (4-8 aminozuren) konden worden bekomen. Door deze initiële testen kon zo een preliminair beeld verkregen worden van de degradatie eigenschappen zodat in een latere fase via een mengsel van enzymes een optimale degradatie kan bereikt worden. Bovendien liet het scheidend vermogen van de gebruikte GPC kolommen geen scheiding toe van componenten kleiner dan 1000-2000 Da. De verschillende gesynthetiseerde polymeren werden onderworpen aan een degradatiestudie, om na te gaan of ze na modificatie nog steeds gevoelig zijn voor degradatie. Daarnaast werd ook de invloed van de samenstelling (verschillende functionele groepen) en het Mw op de degradatie eigenschappen onderzocht. Hiervoor werden de polymeren (10 mg) opgelost in 1,6 ml fosfaat/citraat buffer (0,2 M) met een pH = 6. Nadat het polymeer opgelost is, wordt 200 µl van een EDTA oplossing (20 mM) en een dithioerythritol oplossing (20 mM) aan het mengsel toegevoegd en geïncubeerd bij 37°C. Wanneer de temperatuur van de oplossing 37°C bedraagt, wordt Papaïne (200 µg) toegevoegd zodat een totaal volume van 2 ml wordt bekomen. Het degradatievermogen van de polymeren wordt binnen een tijdspanne van 72 uur onderzocht aan de hand van GPC metingen. Hiervoor wordt op welbepaalde tijdstippen 20 µl uit de oplossing op een GPC kolom gebracht en geanalyseerd (GPC buffer: 5% NaH2PO4, 3% CH3CN, pH = 4).
A.2) Resultaten Uit de resultaten (figuur 4.1 en 4.2) blijkt dat alle gesynthetiseerde polymeren vlot gedegradeerd worden door Papaïne. De degradatiesnelheid wordt deels bepaald door de ladingsdichtheid op de polymeerketen. p(HEG38%-co-DMAEG62%) degradeert trager door het hoge aantal postieve ladingen. Bij alle p(HEGx-co-GuAEGy) van hoog Mw (figuur 4.2) is het Mw na een uur al teruggevallen op minder dan 10% van hun oorspronkelijk Mw, terwijl deze van p(HEG38%-DMAEG62%) nog 30% van zijn oorspronkelijk gewicht bedraagt. De omzetting van primaire amines in guanidine groepen heeft ook een gunstige invloed op de degradatiesnelheid. De delocalisatie van de lading op de guanidine groepen zorgt ervoor dat p(HEGx-co-GuAEGy) met ± 40% geladen groepen toch snel kan degraderen. De invoer van imidazolfuncties in het polymeer beïnvloedt de degradatiesnelheid ten opzichte van guanidines niet. De afbraak tot oligomeren van vier structuureenheden lang kon niet worden waargenomen omdat het scheidend vermogen van de gebruikte GPC-kolom een ondergrens heeft van ongeveer 1000-2000 Da, wat overeenkomt met afbraakproducten van gemiddeld 6 tot 8 eenheden. Voor verdere degradatietesten is het aan te raden om een lagere dosis enzyme te gebruiken zodat degradatie trager verloopt en de invloed van de samenstelling, lading en het Mw nog duidelijker wordt.
85
Figuur 4.1: Effect van papaïne op de moleculaire gewichtsafname van gesynthetiseerde kationische polymeren in functie van de tijd
Figuur 4.2: Effect van papaïne op de moleculaire gewichtsafname van gesynthetiseerde kationische polymeren in functie van de tijd
B. Interactie met rode bloedcellen B.1) Hemolyse studie B. 1.1 INLEIDING Wanneer polykation/DNA complexen intraveneus toegediend worden, kan het interacties aangaan met plasmaproteïnen, leukocyten, trombocyten en erytrocyten . Om een idee te verkrijgen van de mate van interactie worden testen uitgevoerd op RBC daar deze de meest abundante bloedcellen zijn (± 5x106/µl). RBC hebben geen nucleus en om hun voornaamste functie, zuurstoftransport, optimaal te kunnen uitvoeren bezitten ze een flexibele biconcave vorm (figuur 3.4). Zuurstof wordt opgenomen in de longen door een koppeling met hemoglobine, een complex metalloproteïne dat 85% van het RBC-volume uitmaakt. Het gebonden zuurstof wordt vrijgesteld in weefselcellen door 86
een samendrukking in de capillairen, die overal aanwezig zijn in het lichaam. Ze zorgen in een beperkte mate ook voor het transport van CO2 terug naar de longen. Het membraan van erytrocyten is opgebouwd uit een lipide dubbellaag met transmembraanproteïnen (40% w/w), een membraan skelet (52% w/w), een proteïnenetwerk, gelegen aan de binnenkant van de lipide dubbellaag, dat zorgt voor stevigheid. De buitenkant bestaat uit een laag rijk aan carbohydraten (8% w/w) [1]. De carbohydraten vormen glycoproteïnen of glycolipiden na binding met een proteïne of een lipide [5]. Van alle glycoproteïnen is glycophorine A belangrijk voor extracellulaire interacties. Het hydrofiele aminogetermineerde uiteinde van glycophorine A koppelt met sacchariden rijk aan N-acetylaminozuur of siaalzuur [6]. De aanwezigheid van deze negatief geladen sacchariden aan het membraanoppervlak, zorgt ervoor dat het membraan van RBC negatief geladen is. Wanneer positief geladen polyplexen in de bloedbaan gebracht worden kan het interageren met alle aanwezige anionische componenten, zo ook erytrocyten. De kationen kunnen sterk elektrostatisch interageren met de membraan proteïnen en fosfolipiden, waardoor de structuur en het functioneren van het membraan en dus de cel verstoord wordt [7]. Hemolyse of lysering van de RBC kan geïnduceerd worden door deze elektrostatische effecten of door cellulaire opname en activatie van intracellulaire transductie signalen [8] [9].
Figuur 3.4: Structuur van RBC
Om het effect van de gesynthetiseerde polymeren na te gaan werden de polymeren opgelost in een HBS buffer (pH = 7,4) bestaande uit 20 mM Hepes en 150 mM NaCl. Aan een 2% suspensie van vooraf geïsoleerde RBC’en wordt het polymeer toegevoegd in verschillende concentraties en geïncubeerd op 37°C. Na 24 uur incubatie worden de polymeer/rode bloedcelsuspensie gecentrifugeerd. De absorbantie van het bekomen supernatans wordt gemeten bij 545 nm met een UV/VIS-spectrometer [10]. De absorbantie, is een maat voor de hoeveelheid hemoglobine die is vrijgekomen door lysering van de rode bloedcellen. Als positieve controle wordt een RBC suspensie in buffer gemeten terwijl voor een negatieve controle Triton X-100 gebruikt wordt. Dit product is een niet-ionisch surfactant
87
met amfifiele eigenschappen die sterk interageert met het celmembraan en zo volledige lysering induceert. Het lyseringsgehalte wordt bepaald aan de hand van onderstaande vergelijking: %
100% 100
Met: A(sample) = de absorbantie na incubatie in aanwezigheid van het polymeer A(blanco) = de absorbantie van een 2% RBC-oplossing in afwezigheid van polymeer A(T X-100) = de absorbantie veroorzaakt door Triton X-100 B. 1.2 RESULTATEN Uit de bekomen resultaten blijkt dat de meeste gesynthetiseerde polymeren een lager percentage RBC lyseren dan PEI en bijgevolg ook minder hemolytisch actief zijn ten opzichte van RBC dan PEI. De meeste polymeren veroorzaken slechts ± 10% lysering bij hun maximale concentratie. Enkel p(HEG57%-GuAEG43%) induceert bij lage concentraties een aanzienlijke lysering van RBC. De hogere ladingsdichtheid van dit polymeer zorgt voor een sterkere interactie met het membraan. In een aantal gevallen is een “burst” hemolyse merkbaar bij zeer lage concentratie. Dit effect, dat bij hogere concentraties teniet gedaan wordt, vormt geen probleem aangezien dit polymeerconcentraties betreft die lager zijn dan deze gebruikt in courante ladingsverhoudingen (vb. 2/1, 4/1). Tenslotte moet ook zeker vermeld worden dat het imidazol gebaseerde poly-L-glutamaat derivaat beperkte hemolyse vertoont. Het verschil in hemolytische activiteit tussen p(HEG57%–co-GuAEG43%) en p(HEG38%-co-DMAEG62%) enerzijds en PEI anderzijds is o.a. te wijten aan een ander type van de functionele groep waarop de positieve lading gelokaliseerd is. Bij p(HEG38%-co-DMAEG62%) zorgen de twee methylgroepen voor sterische hindering waardoor er minder interactie kan optreden met de membraancomponenten. De omzetting van primaire amines in guanidine groepen verlaagt de interactie met het membraan doordat een delokalisatie van de postieve lading mogelijk is. Aangezien het hier gebruikte PEIderivaat 25% -primaire amines, 50% -secundaire amines en 25% tertiaire amines bevat, kan besloten worden dat lage hemolyse percentages kunnen bekomen worden door geladen groepen te gebruiken in deze volgorde: primaire amines / secundaire amines / Guanidines / tertiaire amines.
88
%lysering 80,00% P(HEG 38% - co - DMAEG 62%) P(HEG 57% - co - GuAEG 43%)
70,00%
p(HEG 83% - co - GuAEG 17%) 60,00% p(HEG 63% - co - GuAEG 37%) p(HEG 49% - co - GuAEG 15% - co - ImEG 30%)
50,00%
PEI 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 0
500
1000
1500
2000
2500
(µg/ml)
Figuur 4.4: Hemoglobine vrijstelling geïnduceerd door kationische polymeren na 24 uur incubatie bij 37°C
B.2) Hemagglutinatie studie B. 2.1 INLEIDING Erytrocyten leveren zuurstof in alle delen van het lichaam via de bloedcirculatie. Na opname, door binding met hemoglobine, stellen RBC zuurstof vrij wanneer ze door aders en cappilairen gestuwd worden. Het samenklitten van RBC kan leiden tot een verstopping van deze capillairen [11]. Polykationen agglutineren RBC reeds na enkele minuten bij zeer lage concentraties (± 5 µg/ml) [12]. Deze agglutinatie is inherent aan polymeren want kationische monomeren vertonen zelfs bij concentraties tot 5 mg/ml geen agglutinatie. De agglutinatie wordt o.a. bepaald door de lading, de functionele groepen en de conformatie van het polymeer. De agglutinatietesten werden uitgevoerd voor polymeer/DNA complexen bij een 2/1 LV. Indien enkel het polymeer getest werd, was er een identieke hoeveelheid polymeer aanwezig als de hoeveelheid polymeer aanwezig in een 2/1 LV. De RBC worden geïncubeerd (37°C) gedurende 1 uur in aanwezigheid van vrij polymeer of van polymeer/DNA complexen. De agglutinatie wordt gevisualiseerd door middel van optische microscopie. PEI werd opnieuw gebruikt als referentie. B.2.2 RESULTATEN p(HEG57%–co-GuAEG43%) en p(HEG38%-co-DMAEG62%) agglutineren RBC met vorming van grote clusters. De clusters van p(HEG57%–co-GuAEG43%) blijken groter en diffuser dan het p(HEG38%-coDMAEG62%). Een licht gewijzigd type interactie met het celmembraan kan hier aan de basis van liggen. p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%) vertoont quasi geen clustervorming. Deze verlaagde agglutinatie komt door het verschil in pKa tussen guanidines (pKa ≈ 12,5) en tertiaire amines (pKa ≈ 89
10,5). Door dit verschil zullen guanidines bij fysiologische pH meer geladen zijn dan tertiaire amines aanwezig in p(HEG38%-co-DMAEG62%). Dit zorgt ervoor dat ondanks de hogere ladingsdichtheid van het derivaat met tertiaire amines de interactie toch sterker is voor het guanidine derivaat. De imidazol groep (pKa ≈ 6) is minder geladen bij fysiologische pH en vertoont dan ook een lagere interactie. Complexatie van het polymeer met DNA, leidt tot een verlaagde oppervlakte lading. Deze verlaagde oppervlaktelading vermindert elektrostatische interacties met het negatief geladen membraan. Uit de resultaten is duidelijk minder aggregatie te zien bij de RBC in aanwezigheid van polyplexen. Voor de gesynthetiseerde polymeren met imidazol functionele groepen en tertiaire amines is er geen agglutinatie meer waar te nemen. Het derivaat met 43% guanidine groepen zorgt in een 2/1 LV nog steeds voor agglutinatie, dit slechts in beperkte mate. Uit deze resultaten kan besloten worden dat in het algemeen een lagere ladingsdichtheid leidt tot minder agglutinatie van erytrocyten en dat de meeste polymeren in een 2/1 LV geen agglutinatie veroorzaken. Bovendien blijkt de sterische hinder van 2 methylgroepen voor een lagere toxiciteit te zorgen dan de postieve lading op de guanidine groepen. De imidazol functionele groep kan door zijn chemische aard (aromatische ring delokalisatie en pKa) de lading op een danige manier dissiperen. p(HEG38%-co-DMAEG62%)
p(HEG38%-co-DMAEG62%) - DNA
90
p(HEG57%-co-GuAEG43%)
p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%)
PEI
p(HEG57%-co-GuAEG43%) - DNA
p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%) - DNA
Buffer
Figuur 4.5: agglutinatie van RBC door kationische polymeren en polymeer-DNA complexen (2/1)
91
C. Stabiliteit van DNA ten opzichte van nucleasen C.1) Inleiding Nucleasen zijn alom vertegenwoordigd in het menselijk lichaam. Nucleasen zijn enzymen die in staat zijn om fosfodiëster bindingen te verbreken en zo polynucleotiden waaronder DNA en RNA kunnen openbreken. Nucleasen zijn noodzakelijk voor het DNA en RNA bij de cellulaire en virale ontwikkeling en worden teruggevonden in allerlei processen binnenin de cel zoals bij de degradatie van extern DNA, het herstel van DNA en de DNA-synthese [13, 14]. Nucleasen worden onderverdeeld in endonucleasen en exonucleasen, waarbij sommige enzymen tot beide categoriëen kunnen behoren. Endonucleasen knippen de keten van nucleïnezuren op om het even welke plaats in de keten, terwijl exonucleasen alleen nucleotiden aan het einde van DNA-keten kunnen verwijderen. Binnen elke categorie wordt er ook nog een onderscheid gemaakt naargelang de richting waarin ze werkzaam zijn, van 3’ → 5’ of van 5’ → 3’. Vrij DNA wordt snel gedegradeerd wanneer het in contact komt met DNAses [15]. Deze degradatie kan tegengegaan worden door het DNA te condenseren met een kationisch polymeer. De mate waarmee het DNA beschermd wordt is verschillend voor elk type polymeer. Om de stabiliteit van de gevormde polyplexen ten opzichte van nucleasen na te gaan werd DNAse I toegevoegd aan verschillende polymeeroplossingen. DNAse I hydrolyseert fosofodiester bindingen preferentieel naast een pyrrimidine base met 5’ getermineerde nucleotiden. Voor elk polymeer werden drie oplossingen gemaakt in TRIS-buffer met een verschillende ladingsverhouding (1/1, 2/1 en 4/1). De TRIS-buffer bevat 40 mM TRIS-HCl, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 en wordt nadien op pH = 7,9 gebracht en gefiltreerd. De degradatie van het polymeer wordt gevolgd door, na toevoeging van 40 units DNAse I (4µl) bij een temperatuur van 37 °C de verandering in absorbantie te meten. De vrijstelling van nucleotiden verhoogt de absorbantie bij een golflengte van 260 nm.
C.2) Resultaten In de figuur 4.6 worden de resultaten van de in vitro degradatie van DNA met DNAse I weergegeven. Het DNAse I is duidelijk efficiënter in de degradatie van DNA bij 37°C dan bij 25°C, om deze reden werden alle testen uitgevoerd bij 37°C (figuur 4.6). Uit deze grafiek is af te leiden dat de polymeren het gecomplexeerde DNA zeer efficiënt beschermen tegen degradatie van nucleasen en dit al vanaf een LV van 1/1. Indien er geen goede bescherming en dus degradatie optreedt zou de absorbantie sterk moeten stijgen. Voor alle gesynthetiseerde polymeren met verschillende ingebrachte functionele groepen is het zelf zo dat de absorbantie iets lager is na incubatie met DNAse I, dan voor incubatie. De absorbantiewaarde is initieel lager omdat het DNA omringd is door polymeer en deze 92
zorgt voor een afscherming van het signaal van DNA bij 260 nm. Een andere reden voor de negatieve absorbantie zou kunnen te wijten zijn aan een kleine conformatiewijziging van het DNA [16]. Hieruit kan geconcludeerd worden dat zelfs polymeren die via fluorescentie of agarose gel-elektroforese nog geen optimale condensatie vertoonden toch al in staat zijn om het DNA in voldoende mate te beschermen van nucleasen. p(HEG 57% - co - GuAEG 43%)
DNA 0,16
0,14
0,11
0,12
0,06
0,1 DNA 25 °C
0,08
DNA 37 °C
0,06
1/1 (+/-) 2/1 (+/-) 4/1 (+/-)
0,01
Abs (260 nm)
Abs (260 nm)
0,16
-0,04 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
-0,09 -0,14
0,04
-0,19 0,02
-0,24
0 -0,02 0
1000
2000
3000
-0,29
4000
seconden
seconden
p(HEG 63% - co - GuAEG 37%)
p(HEG 81% - co - GuAEG 19%)
0,16
0,16
1/1 (+/-)
0,11
1/1 (+/-) 2/1 (+/-)
0,11 2/1 (+/-)
4/1 (+/-)
0,01 -0,04 0
1000
2000
3000
Abs (260 nm)
Abs (260 nm)
0,06
4000
-0,09 -0,14
0,06
4/1 (+/-)
0,01 -0,04 0
1000
2000
3000
4000
-0,09
-0,19 -0,24
-0,14
seconden
p(HEG 38% - co - DMAEG 62%)
seconden
p(HEG 49% - co - GuAEG 15% - co - ImEG 36%)
0,16 0,16
1/1 (+/-)
0,11
0,06
2/1 (+/-) 4 /1 (+/-) 0,01 -0,04 0
1000
2000
3000
4000
Abs (260 nm)
Abs (260 nm)
0,06 -0,04 0
-0,24
-0,14
-0,34
seconden
2000
3000
4000 1/1 (+/-)
-0,09
-0,19
1000
-0,14
2/1 (+/-) 4/1 (+/-)
-0,44 seconden
Figuur 4.6: in vitro degradatie van DNA onder invloed van DNAse I
93
D. Referenties 1. 2. 3. 4.
5.
6. 7. 8. 9. 10.
11.
12.
13.
14. 15. 16.
Dekie, L., Synthese en evaluatie van poly-L-glutaminezuurderivaten als vectoren voor gentherapie. 2001, Ugent: Gent. Sedel, F., J.C. Turpin, and N.B. Aumann, Neurological presentations of lysosomal diseases in adult patients. Revue Neurologique, 2007. 163: p. 919-929. Hayashi, T., et al., PREPARATION AND PROPERTIES OF COPOLY(N-HYDROXYALKYL-D,LGLUTAMINE) MEMBRANES. European Polymer Journal, 1995. 31(5): p. 453-458. Pytela, J., R. Kotva, and F. Rypacek, Enzymatic degradation of poly[N-5-(2-hydroxyethyl)-Lglutamine] and poly[N-5-(2-hydroxyethyl)-L-glutamine-stat-L-glutamic acid]: Analysis of final degradation products. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 1998. 13(3): p. 198209. Mohandas, N. and J.A. Chasis, RED-BLOOD-CELL DEFORMABILITY, MEMBRANE MATERIAL PROPERTIES AND SHAPE - REGULATION BY TRANSMEMBRANE, SKELETAL AND CYTOSOLIC PROTEINS AND LIPIDS. Seminars in Hematology, 1993. 30(3): p. 171-192. Viitala, J. and J. Jarnefelt, THE RED-CELL SURFACE REVISITED. Trends in Biochemical Sciences, 1985. 10(10): p. 392-395. Moreau, E., et al., Interactions between red blood cells and a lethal, partly quaternized tertiary polyamine. Journal of Controlled Release, 2000. 64(1-3): p. 115-128. Fischer, D., et al., In vitro cytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis. Biomaterials, 2003. 24(7): p. 1121-1131. Jan, K.M. and S. Chien, ROLE OF SURFACE ELECTRIC CHARGE IN RED BLOOD-CELL INTERACTIONS. Journal of General Physiology, 1973. 61(5): p. 638-654. Wanda, P.E., L.T. Lee, and C. Howe, A SPECTROPHOTOMETRIC METHOD FOR MEASURING HEMOGLOBIN IN ERYTHROLEUKEMIC CELLS (K562). Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 1981. 29(12): p. 1442-1444. Zijlstra, W.G. and A. Buursma, Spectrophotometry of hemoglobin: Absorption spectra of bovine oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, carboxyhemoglobin, and methemoglobin. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, 1997. 118(4): p. 743-749. Katchalsky, A., et al., INTERACTIONS OF BASIC POLYELECTROLYTES WITH THE RED BLOOD CELL .2. AGGLUTINATION OF RED BLOOD CELLS BY POLYMERIC BASES. Biochimica Et Biophysica Acta, 1959. 33(1): p. 120-138. Schurz, J., et al., ZETA POTENTIAL AS AN ANALYTICAL TOOL FOR GRAFT-COPOLYMERS AND FOR POLYMER SURFACES. Journal of Macromolecular Science-Chemistry, 1990. A27(13-14): p. 1673-1692. Karchalsky, A., Interaction of basic polyelectrolytes with the red blood cell II. Biochimica Et Biophysica Acta, 1959. 33(1): p. 18. Wickstrom, E., OLIGODEOXYNUCLEOTIDE STABILITY IN SUBCELLULAR EXTRACTS AND CULTURE MEDIA. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1986. 13(2): p. 97-102. Maruyama, A., et al., Characterization of interpolyelectrolyte complexes between doublestranded DNA and polylysine comb-type copolymers having hydrophilic side chains. Bioconjugate Chemistry, 1998. 9(2): p. 292-299.
94
Hoofdstuk 5: Besluit Gefunctionaliseerde poly-L-glutamine afgeleiden werden in deze thesis succesvol bereid uitgaande van poly-γ-benzyl-glutamaat. Om meer inzicht te verkrijgen in de synthese van pBG op basis van een tertiar amine initiator uit benzyl-glutamaat N-carboxyanhydride werd een master curve opgesteld. Hiervoor werd eerst BG-NCA bereid uit de reactie van γ-benzyl-L-glutamaat met difosgeen. Door gebruik te maken van deze master curve, (die een logaritmisch verband vertoont) kan het moleculair gewicht voorspeld worden bij een bepaalde monomeer/initiator verhouding. Alle polymeren en tussenproducten werden gekarakteriseerd via FTIR, 1H-NMR, GPC en viscosimetrie. Uit de resultaten van Ethidium Bromide fluorescentiemetingen en agarose gel-elektroforese kan gehaald worden dat alle polymeren in staat zijn om DNA te condenseren bij een specifieke ladingsverhouding (vaak tussen 1/1 en 2/1 ladingsverhouding). Er is duidelijk een invloed merkbaar van ladingsdichtheid en het moleculair gewicht van het polymeer. Niet alleen de mate waarin condensatie optreedt met DNA wordt bepaald door het aantal positief geladen groepen op het polymeer, ook de ladingsverhouding waarbij condensatie optreedt is hiervan afhankelijk. Hoe meer positieve ladingen het polymeer bevat, hoe vroeger condensatie optreedt. De aanwezigheid van imidazol of guanidine groepen zorgen voor een optimale interactie met het DNA waardoor er minder lading nodig is om condensatie te verkrijgen dan verwacht op basis van de massa per lading. Naast de functionele groepen en de hoeveelheid lading is er ook een beperkte maar duidelijke invloed te zien van het moleculair gewicht op het condensatieprofiel. Een laag Mw-polymeer is door zijn kortere en mobielere ketens in staat om vlotter een andere oriëntatie rondom het DNA aan te nemen waardoor optimale condensatie bij een lagere ladingsverhouding kan optreden. Aan de hand van DLS metingen werd dan ook bepaald dat bijna alle polymeren in staat zijn om DNA te condenseren tot partikels die klein genoeg zijn om opgenomen te worden in de cel. De meeste 95
polyplexen hebben een diameter tussen de 30 en 60 nm bij een ladingsverhouding van 2/1. De polyplexgrootte daalt ook bij een stijgende ladingsverhouding tot een optimale interactie bereikt wordt. Hierna veroorzaakt additionele polymeer toediening een lichte toename van de partikel diameter. Bij imidazol polymeren is dit niet het geval. Door de gunstige interactie die het kan aangaan met DNA blijft de deeltjesgrootte nagenoeg constant en klein genoeg voor celopname bij verandering van de ladingsverhouding. Uit de Zeta-potentiaal metingen blijkt dat de polymeren na condensatie bij een 2/1 en 4/1 ladingsverhouding een positieve potentiaal bezitten tussen de 20 en 40 mV. De polymeren met de hoogste ladingsdichtheid vertonen zowel hogere Zeta-potentialen na complexatie als meer negatieve potentialen voor condensatie. Door middel van een biologische evaluatie die in vivo applicaties simuleert blijkt dat de gesynthetiseerde polymeren goed gedegradeerd kunnen worden door lysosomale peptidasen. De degradatiesnelheid is onafhankelijk van het moleculair gewicht maar wordt lichtjes beïnvloed door het aantal en type positieve ladingen aanwezig in het polymeer. Een groot aantal positieve ladingen vertraagt de degradatie. De invoer van guanidine eindgroepen verlaagt ook de hemolytische activiteit t.o.v. primaire amines, doch dit effect is meer uitgesproken voor tertiaire amines. De sterische hinder van de twee methyl groepen zorgt voor een gewijzigde interactie met de membraancomponenten van rode bloedcellen. De invoer van imidazol groepen in het polymeer heeft niet echt een invloed op de degradatiesnelheid en de hemolytische activiteit. Naast een goede degradatie en beperkte hemolyse vertonen imidazol bevattende derivaten geen agglutinatie. Zowel het complex als het vrij polymeer met imidazol functies induceren geen agglutinatie omdat de lading goed kan worden verdeeld over de 5-ring. In het algemeen is het zo dat een lagere ladingsdichtheid leidt tot een vermindering van de membraaninteracties waardoor er minder agglutinatie optreedt. De vectoren die tertiaire amines bevatten, zorgen ondanks hun hoge ladingsdichtheid voor minder agglutinatie t.o.v. guanidine gebaseerde vectoren. De gereduceerde kationische lading zorgt na complexatie met DNA bij DMAEG voor verminderde agglutinatie (sterische hinder), bij GuAEG-polyplexen zijn er nog steeds clusters van rode bloedcellen aanwezig. Verder maakten de biologische studies ook duidelijk dat de gesynthetiseerde polymeren het DNA effectief beschermen tegen nucleasen. Bij verschillende ladingsverhoudingen treedt er efficiënte bescherming op. Ook polymeren die via fluorescentie of gel-elektroforese nog geen optimale condensatie vertoonden, zijn toch al in staat om het DNA in voldoende mate af te schermen van nucleasen. Uit alle vectoren die gesynthetiseerd, fysicochemisch en biologisch geëvalueerd zijn is er één polymeer dat bij alle testen gunstige resultaten vertoont. Dit poly-L-glutamine derivaat is opgebouwd 96
uit 36% imidazol functies, 49% hydroxylgroepen en 15% guanidines. Door zijn laag Mw (beweegbare kluwen) en gemiddelde hoeveelheid positieve lading is dit polymeer in staat DNA reeds te condenseren bij een lage LV. De hoeveelheid guanidines en imidazol zorgen voor een optimale interactie met DNA. Dit resulteert in de vorming van een complex dat bij verschillende geteste ladingsverhoudingen een grootte vertoont die klein genoeg is voor celopname (± 40 nm) en een oppervlakte lading bezit die zorgt voor een goede stabiliteit (25 – 40 mv). Door deze interactie wordt het DNA ook goed beschermd tegen aanvallen van nucleasen. Dat dit polymeer uitermate geschikt zou zijn voor in vivo toepassing wordt duidelijk uit de andere uitgevoerde biologische evaluaties. Niet alleen is het polymeer goed biodegradeerbaar maar de reacties met bloedcomponenten zijn ook beperkt. De lage hemolyse (10%) en het niet-induceren van agglutinatie van rode bloedcellen maakt dit polymeer een zeer geschikte kandidaat als gen-afgifte systeem.
97
Hoofdstuk 6: Experimenteel deel A. Hoofdstuk 2: Synthese van biodegradeerbare poly-Lglutamine derivaten A.1) Synthese van γ-benzyl-L-glutamaat NCA De synthese wordt gestart door 15 g γ-benzyl-L-glutamaat in 250 ml droge ethylacetaat te suspenderen en op te warmen tot 60 °C. Een oplossing van 15 ml disfosgeen in 55 ml EtOAc (10% w/v) wordt in 7 porties van 10 ml toegedruppeld aan het reactiemengsel. Na 20 minuten reactie en toevoeging van 1 portie van de difosgeen-oplossing, wordt het gevormde HCl uit de oplossing verwijderd door argon gedurende 10 minuten doorheen de oplossing te borrelen. Deze procedure wordt herhaald tot alle γ-benzyl-L-glutamaat is omgezet. De oplossing wordt nadien eerst 45 minuten geflushed met Argon op 60°C en na afkoelen tot kamertemperatuur verder ontgast voor 45 minuten met argon. Na filtratie wordt het bekomen product ingedampt tot 150 ml aan de rotavapor. Hierna wordt het product geïsoleerd door precipitatie in koude pentaan waarna gedroogd wordt aan de oliepomp gedurende 15 minuten. De herkristallisatie gebeurt door het product op te lossen in een minimale hoeveelheid ethylacetaat en te refluxen (10 min) waarna gekoelde pentaan wordt toegevoegd om neer te slaan. Deze omkristallisatie wordt herhaald tot het product voldoende chloride vrij is. Chloride test: Een spatelpunt BG-NCA wordt opgelost in 1 ml HNO3 (2 M). Hieraan worden 4 druppels 0,05 M AgNO3 toegevoegd. Als de troebelheid van de oplossing lager is dan deze van leidingswater na een analoog experiment, is het NCA voldoende Cl—vrij. Rendement: 72,5 % 98
A.2) Synthese van poly-γ-benzyl-L-glutamaat met n-butylamine Voor de polymerisatie van BG-NCA wordt 1,2 gram opgelost in 18 ml DCM/EtOAc (6/1). De hoeveelheid initiator nodig om een bepaald Mw te synthetiseren met n-butylamine wordt berekend via onderstaande formule.
263,1568
219,234 Waarbij: Mw = het gewenste moleculair gewicht; x = de hoeveelheid afgewogen BG-NCA en [I] = het aantal mol initiator. Voor de synthese van pBG met een Mw van 20 kDa uit 1,2 BG-NCA ziet de formule er als volgt uit:
20000 219,234
1,2 263,1568
Er is dus 4,9987x10-5 mol n-Butylamine nodig om een Mw van 20 kDa te verkrijgen. Uit de dichtheid (0,74 g/ml) en het Mw van n-butylamine wordt berekend dat er 4,94 µl van de primaire amineinitiator nodig is om een Mw van 20 kDa te verkrijgen. De reactie wordt na 48 uur roeren op kamertemperatuur gestopt door een 10-voudige overmaat (t.o.v. het aantal esters) aan triëthylamine (83,63 µl) en azijnzuuranhydride (56,72 µl) toe te voegen. De reactie wordt verder geroerd voor 3,5 uur op kamertemperatuur. Het eindproduct kan worden bekomen na neerslaan in gekoelde ether/methanol (4/1). Na filtratie en wassen wordt het product gedroogd in vacuo. Rendement: 92% Karakterisatie: FTIR, NMR en viscosimetrie
A.3) Synthese van poly-γ-benzyl-L-glutamaat met tributylamine 0,700 g BG-Nca (2,66 mmol) wordt opgelost in een mengsel van 9 ml DCM en 1,5 ml EtOAc. Voor een M/I-verhouding van 40/1 wordt de hoeveelheid initiator bepaald via onderstaande formule:
185,35 40 0,778
Er wordt voor een M/I-verhouding van 40/1 dus 15,853 µl tributylamine toegevoegd. Na reactie voor 48 uur op kamertemperatuur wordt het polymeer neergeslaan in een oplossing van 100 ml methanol/diëthylether (2/1). Het Mw van het polymeer wordt bepaald met viscosimetrie in dichloorazijnzuur. Na filtratie en wassen wordt het product gedroogd in vacuo. Rendement: 87% 99
Karakterisatie: FTIR en NMR
Aminolyse van poly-γ-benzyl-L-glutamaat Als voorbeeld wordt de aminolyse van pBG beschreven waarbij het bekomen polymeer, p(HEGDMAEG), 62% tertiaire amines en 38% hydroxylgroepen bevat. De verhouding tertiaire amine/hydroxyl wordt gecontroleerd aan de hand van de verhouding van de reagentia. 326 mg pBG (1,49 mmol esters) wordt opgelost in 5 ml droge DMF en opgewarmd tot 50°C. In aanwezigheid van 0,709 g 2-HP (7,457 mmol) wordt aan het mengsel 2,44 ml DMAEMA (22,37 mmol) en 0,50 ml AE (7,457 mmol) toegevoegd en geroerd. Na 48 uur wordt 0,2 ml AE (2,98 mmol) en 0,326 ml DMAEMA (2,98 mmol) toegevoegd om een volledige conversie van de estergroepen te bekomen. Het reactiemengsel wordt neergeslaan in koude diëthylether, waar na affiltreren en wassen het product bekomen wordt. Na het polymeer te drogen aan de oliepomp voor 30 minuten wordt het heropgelost in 20 ml ultra zuiver water waaraan enkele druppels HCl werden toegevoegd. Verdere zuivering gebeurt door dialyse t.o.v. ultra zuiver water, een 0,1 M NaCl-oplossing, een 0,05 M HCloplossing en terug ultra zuiver water. Het gezuiverd polymeer wordt geïsoleerd door middel van vriesdrogen. Rendement: 50% - 70% Karakterisatie: FTIR en NMR
Conversie van primaire amines in guanidines De guanidilering van primaire amines zal hier beschreven worden aan de hand van p(HEG57%-AEG43%). 150 mg polymeer (0,35 mmol amines) wordt opgelost in 4 ml ultra zuiver water in een kolf van 25 ml. Er wordt een aparte oplossing gemaakt waarin 1,1 g DMGP (5,5 mmol) opgelost wordt in 4 ml ultra zuiver water. Na deze oplossing op een pH van 9,5 te brengen m.b.v. 0,81 ml kaliumhydroxideoplossing (4M), wordt het in de 25 ml kolf overgebracht. Het reactiemengsel wordt geroerd voor 24 uur in aanwezigheid van 8,81 g (6M) KI. De oplossing wordt na reactie in zijn geheel onderworpen aan een dialyse t.o.v. ultra zuiver water gedurende 24 uur. Nadien wordt de oplossing aangezuurd tot pH = 4 en onderworpen aan een standaard dialyseproces. Hierbij wordt het product eerst gedialyseerd t.o.v. ultra zuiver water, dan t.o.v. 0,1 M NaCl, daarna t.o.v. 0,05 M HCl en nadien terug t.o.v. ultra zuiver water. Het gezuiverde product wordt bekomen na vriesdrogen. Het Mw werd bepaald via GPC chromatografie van een 5mg/ml oplossing van het polymeer in ultra zuiver water.
100
Rendement: 91,3% Karakterisatie: FTIR en NMR
B. Hoofdstuk 3: Fysicochemische evaluatie van poly-Lglutamine derivaten B.1) Bepaling van de M/C De mass per charge (M/C) van een polymeer komt overeen met de massa voor 1 mol ladingenDe M/C wordt hier berekend voor p(HEG57%-GuAEG43%). Dit polymeer bevat 57 % hydroxylgroepen die niet geladen zijn in oplossing en 43% geladen groepen. Om de M/C van polymeren met elkaar te kunnen vergelijken wordt de M/C berekend voor 100% lading. Eén HEG-eenheid heeft een molaire massa van 172 g. Eén structuureenheid GuAEG heeft een massa van 247,7 g in oplossing die wordt bekomen door bij de molaire massa van GuAEG (211,2 g/mol) de molecuulmassa van HCl (36,5 g/mol) bij te tellen. De M/C wordt bekomen via onderstaande formule die rekening houdt met de samenstelling van ladingen. In het geval van niet volledig geladen polymeren wordt de waarde aangepast door te delen door het percentage geladen groepen. # (0,43 247,7) * (0,56 172) ! 100% 471,7 ! 0,43 % $% &% $' %#%
B.2) Ethidium bromide fluorescentiemetingen Voor fluorescentiemetingen wordt DNA (2,5 mg/ml) opgelost in een EtBr-oplossing (400 ng/ml). In een kuvet wordt 16 µl (40 µg) DNA (2,5mg/ml) gebracht en opgelost in EtBr-oplossing. De hoeveelheid EtBr waarin het DNA opgelost wordt, is afhankelijk van hoeveel polymeer dat nodig is om een 2/1 LV te verkrijgen. Een totaal volume van 2 ml oplossing wordt uiteindelijk bekomen bij een LV van 2/1. De hoeveelheid polymeer is afhankelijk van de M/C en kan bepaald worden via onderstaande formule. 40 μ$ ,- . ! # / %%' . 01 μ$ # / %%' ,! Voor p(HEG57%-GuAEG43%) met een M/C van 471,2 g/mol wordt dit voor een LV 2/1: 40 μ$ , 471,7 $/345 2 116,11 μ$ # / %%' 325 $/ Als vertrokken wordt van een stockoplossing polymeer van 1 mg/ml, moet dezelfde hoeveelheid µl afgetrokken worden van 1984 µl (2 ml-16 µl) om de preciese hoeveelheid toe te voegen EtBr te bepalen. De EtBr/DNA oplossing wordt gevortexed vooraleer de meting gestart wordt. In afwezigheid 101
van het polymeer wordt de relatieve fluorescentie gelijk gesteld aan 100% door hierbij te kalibreren. Er wordt telkens polymeer toegevoegd nodig om een stijging in de LV te verkrijgen met 0,2 eenheden (11,6 µl voor p(HEG57%-GuAEG43%), gevortext en gemeten. Dit wordt herhaald tot een LV van 2/1 bekomen wordt. EtBr wordt geëxciteerd met een golflengte van 510 nm. De emissiefluorescentie wordt gemeten bij een golflengte van 590 nm. Alle metingen worden uitgevoerd in drievoud.
B.3) Agarose gel-elektroforese metingen De agarose gel wordt bereid door 1 gram agarose op te lossen in 100 ml ultra zuiver water en te laten inkoken voor 15 minuten au bain marie. De gel wordt nadien in een mal gegoten, gehard gedurende 1 uur en ondergedompeld in een 1 x TBE buffer (0,1 M trisbase, een 0,09 M boorzuur en 1 mM Na2EDTA·2H2O). In een agarose gel worden elf polymeer/DNA verhoudingen ingebracht in “wells”. De LV loopt op van 0/1 (puur DNA) tot 2/1, in stappen van 0,2/1. Deze oplossingen worden bereid in een plastiek testbuisje. 16 µl (40 µg) DNA wordt opgelost in een hoeveelheid ultra zuiver water om uiteindelijk een totaal volume van 2 ml te bekomen. De hoeveelheid water die moet toegevoegd worden is afhankelijk van de ladingsverhouding en het M/C van het polymeer. Aan 20 μl van elke oplossing wordt 2 μl ladingsbuffer (50 % (v/v) glycerol, 100 mM Na2EDTA·2H2O, 0,1% (w/v) bromofenol blauw en gedestilleerd water) toegevoegd en gemengd. Hiervan wordt 20 µl gepipetteerd in de “wells”. Na de scheiding door elektroforese bij een spanning van 90 V gedurende 1 uur wordt de gel gekleurd door het twee uur te incuberen in een 0,5 μg/ml Ethidium Bromide oplossing. De gel wordt gevisualiseerd met een UV-transilluminator (λex = 312 nm) en gefotografeerd met een digitale camera.
B.4) Dynamische licht verstrooiingsmetingen De grootte van de polyplexen wordt bepaald bij drie verschillende LV’en, 1/1, 2/1 en 4/1. De samples (2 ml) worden op dezelfde manier gemaakt als bij agarose gel-elektroforese. De grootte wordt bepaald door een 10 mW laser (488 nm) te laten invallen op een kuvetje die ± 2 ml bevat van de oplossing. De intensiteit van de verstrooide lichtstralen wordt gemeten onder een hoek van 90° en bij een temperatuur van 25°C. Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd en bestonden elk uit 10 subruns.
B.5) Zeta-potentiaalmetingen Het Zeta-potentiaal wordt bepaald voor drie verschillende LV’en nl. 1/1, 2/1 en 4/1. De oplossingen worden op dezelfde manier bereid als bij dynamische licht verstrooiing experimenten. Alle stalen werden tien maal gemeten bij 1000 HZ en een celvoltage van 220 V.
102
C. Hoofdstuk 4: Biologische evaluatie van poly-L-glutamine derivaten C.1) Biodegradatie door proteasen 10 mg polymeer wordt opgelost in 1,6 ml fosfaat/citraat buffer van 0,2 M (pH = 6 met 0,2 % (w/v) Triton X-100). Hieraan wordt 200 µl EDTA (20 mM in buffer) en 200 µl dithioerythritol (20 mM in buffer) toegevoegd. Als het polymeer opgelost is, wordt het geïncubeerd bij 37°C. Na 15 minuten wordt hieraan 40 µl (200 µg) Papaïne toegevoegd en verder geïncubeerd bij 37°C. Het Mw van het polymeer in functie van de tijd wordt gevolgd door middel van GPC. Hiervoor wordt telkens 20 µl oplossing geïnjecteerd en op verschillende tijdstippen gemeten (30m, 1u, 2u, 4u, 8u, 24u, 48u en 72u) (standaard GPC buffer :NaH2PO4 5%, CH3CN 3%, pH =4).
C.2) Hemolyse studie De rode bloedcellen worden gescheiden van het plasma door deze te centrifugeren op 3700 RPM gedurende 5 minuten en 2 x te wassen met HBS buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4). Nadien worden de RBC opgelost in HBS buffer (2%) waarna de oplossing moet gebruikt worden binnen de eerste 24 uur na preparatie. De verschillende polymeren worden in verschillende concentraties (1 -2000 µg/ml) aan de RBC-suspensie toegevoegd en geïncubeerd voor 24 uur bij 37°C. Tijdens incubatie moeten de testbuisjes met polymeer en RBC volgens de schudrichting van de incubator geplaatst worden (60 rpm). Nadien worden de oplossingen gecentrifugeerd (3800 rpm) gedurende 5 minuten en wordt de absorbantie van het supernatans gemeten op een UV-meter. Elk staal wordt drie maal gemeten bij 545 nm met een tijdsinterval van 10 seconden. De positieve controle met Triton X-100 wordt gelijk gesteld aan 100% hemolyse, terwijl de blanco met enkel HBS aanwezig overeenkomt met 0% hemolyse.
C.3) Hemagglutinatie studie De complexen worden bereid in een 2/1 LV en aan een 2% (v/v) RBC-oplossing in HBS buffer toegevoegd. Indien de agglutinatie van het vrij polymeer onderzocht wordt, werd een zelfde hoeveelheid polymeer aan een 2% (v/v) RBC-oplossing in HBS buffer toegevoegd als deze aanwezig in de complexen. De oplossing wordt geïncubeerd bij 37°C gedurende 1 uur vooraleer de agglutinatie bepaald werd via microscopie. Hiervoor werd 1 druppel van de geïncubeerde oplossing opengestreken op een glasplaatje en vergroot voor 50 maal zodat een foto getrokken kan worden.
C.4) Stabiliteit van DNA ten opzichte van nucleasen De polymeer/DNA-complexen worden bereid in verschillende ladingsverhoudingen (1/1, 2/1, 4/1). Hiervoor wordt 16 µl (40 µg) DNA en de hoeveelheid polymeer nodig voor een 2/1 LV aangelengd tot 103
1 ml met ultra zuiver water. Nadien wordt dan 1 ml van TRIS buffer (80mM Tris.HCl, 20 mM NaCl, 12mM MgCl2, 10 mM CaCl2 en pH = 7,9) toegevoegd die vooraf gefiltreerd (0,45 µm) en ontgast werd met Argon gedurende 10 minuten. Er wordt aan deze 2 ml-oplossing 4 µl (40 units) van DNAse I toegevoegd. De degradatie van DNA over een bepaalde tijdspanne (0-3600 s) wordt gevolgd door de stijging in absorbantie bij 260 nm te meten (bij 37°C). Alle metingen worden uitgevoerd in een kwartz-kuvet.
104
Bijlage A: English Report
Poly-L-Glutamine Derivatives as Non-viral Gene Delivery Systems A. Goesa, V. Vermeerscha, P. Dubruela a
Polymer chemistry & Biomaterials research group, University of Gent, Gent B9000, Belgium In this article the synthesis of biodegradable poly-L-glutamine derivatives as vectors in therapeutic gene delivery is described as well as their physicochemical and biological properties. All functionalized polymers are able to condense DNA into positively charged particles with a typical radius of about 50 nm (via dynamic light scattering). Particle formation is determined by EtBrfluorescence and agarose gel electrophoresis measurements. Surface charge was investigated via the zeta potential. All polymers show an excellent biodegradability by proteases and some polymers induced a low extent of lysis and agglutination of red blood cells only. Imidazol based derivatives prove to be promising candidates to replace PEI as non-toxic gene delivery systems. Introduction
Gene therapy is a promising technique for treatment of inherited or acquired genetic diseases like cancer, AIDS and cystic thrombosis for which there is no adequate therapy at the moment. Gene therapy is based on the introduction of therapeutic DNA into target cells or tissue that encodes for a specific therapeutic protein. The genetic material is brought into the body by specific carriers or vectors because the injection of naked DNA is inefficient due to its size, negative charge and susceptibility to degradation by nucleases. These vectors (viral or non-viral) need to protect and transport the DNA into the target cells nucleus (1). The use of viruses (retrovirus, adenovirus, herpes simplex virus) would be natural since they are capable of inserting their DNA into the hosts nucleus and using its transcription mechanism to synthesize their own proteins (2). The limited use of viruses is derived from their inherent toxicity and limited cargo capabilities. This has led to the development of synthetic or non-viral vectors for gene delivery (liposomes, cel-penetrating peptides, cationic polymers). Many polymer-carrier systems have been developed and investigated like poly(L-lysine) (PLL) (3), polyethyleneimine (PEI) (4) and poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) also known as pDMAEMA (5). These positively charged polymers form polyelectrolyte complexes with DNA (polyplexes). In doing so a polymer reduces the size and surface charge of DNA and enhances the DNA stability towards nucleases. The drawback for the in vivo applications of these polymers is the lack of biodegradability. The aim of this thesis is the synthesis of biodegradable poly-L-glutamine derivatives as vectors for gene therapy, containing primary and tertiary amines, guanidine and imidazol functional groups. They are characterized by gel-electrophoresis, EtBr fluorescence, dynamic light scattering and zeta-potential measurements. The biodegradability and the possible influence on red blood cells (RBC) are also evaluated. Synthesis All synthesized vectors based on poly-L-glutamic acid were obtained by aminolysis of poly-γ-benzyl-L-glutmate (pBG). In a first step L-glutamic acid is converted into γi
benzyl-L-glutamate by a selective esterification. The polymerization of γ-benzyl-Lglutamate is possible after formation of a cyclic product, a N-carboxyanhydride (NCA). pBG can be synthesized by a ring-opening polymerization of the formed γ-benzyl-Lglutamate-NCA (BG-NCA) (figure 1). Synthesis of BG-NCA. The easiest and safest way to polymerise an amino acid is to convert it into its corresponding NCA with diphosgene. A suspension of γ-benzyl-Lglutamate is made in dry ethylacetate (EtOAc) and heated to 60°C. The diphosgene is dissolved in EtOAc (10% w/v) and added dropwise to the solution (10 ml). After 20 minutes reaction, the solution is flushed (Ar) to remove the produced HCl in order to minimize side reactions (10 min). This is repeated until all the benzylglutamate is converted. After extensive flushing (Ar), the solution is precipitated in pentane and purified by recrystallization. O O
O
HN O H 2N
CH CH 2 CH 2
COOH protection cyclisation
COOH L-glutamic acid
HN
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
C
polymerisation O
O CH2
C
O
C
HN
CH
C
CH2 CH2
aminolysis O
C
O
O
NH
CH2
CH2 CH2 R
BG-NCA
pBG R=
N
NH2
OH N NH
Figure 1. synthesis of different copolymers based on L-glutamic acid Synthesis of poly(γ-benzyl-L-glutamate). The polymerization of BG-NCA in pBG can be initiated by a primary or tertiary amine each with a different polymerisation mechanism. For low Mw’s (< 35 kDa) the synthesis of pBG is initiated by a nucleophilic attack by n-butylamine. The Mw is determined by 1H-NMR. High molecular weight (< 250 kDa) pBG’s are initiated by deprotonation of the NCA by tributylamine and the polymerisation is carried out by the activated monomer mechanism. The Mw is determined by viscosimetry in dichloroacetic acid. Both reactions are carried out at room temperature for 48 hours in CH2Cl2/EtOAc (6/1). The polymer is precipitated in methanol/diethyl ether (2/1). Prior to precipitation the polymer chains initiated by nbutylamine are terminated by reaction with triethylamine and acetic acid anhydride (3 hrs). The Mw’s for different M/I ratio’s determined by viscosimetry have been used to compose a master curve for this polymerisation reaction. By making use of the following equation, the Mw of the polymers can be estimated up front reaction dependent on the M/I-ratio used. Mw = 36828 ln (M/I) + 40834
[1]
Synthesis of funtionalized poly-L-glutamate derivatives. Because pBG lacks DNA or cell interacting properties, different functional groups (imidazol, primary and tertiary ii
amines, hydroxyl) are introduced by aminolysis. The reaction is carried out at 50°C in presence of 2-hydroxypyrridine acting as a bifunctional catalyst minimizing backbone disruption and an excess of reagentia. The composition of the final polymer is determined by the amount of aminolysis reagent, the reaction time and the sequence of reagent addition. After stirring for 48 hrs in dimethylformamide (DMF), the most reactive reagens is added in excess to ensure a full conversion of all esters. The product is precipitated in diethyl ether and purified by dialysis. Afterwards, the primary amines are converted to guanidine groups to delocalize the surface charge of the polyplex. The composition of all synthesized polymers can be found in table I. Table I: overview synthesized copolymers with their molar composition and Mw polymer
Mw guanidine
molar composition prim. hydroxyl imidazol amines 38%
p(HEGx-co-DMAEGy)
170 kDa
p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
10168 Da
22%
60%
18%
p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
9965 Da
15%
49%
36%
p(HEGx-co-GuAEGy)
153 kDa
43%
57%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
18432 Da
14%
83%
3%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
17913 Da
13%
79%
8%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
18012 Da
21%
76%
3%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
18932 Da
5%
92%
3%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
8972 Da
24%
70%
6%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
17125 Da
26%
70%
4% 12%
p(HEGx-co-AEGy-co-GuAEGz)
16570 Da
7%
81%
p(HEGx-co-GuAEGy)
9345 Da
27%
73%
p(HEGx-co-GuAEGy)
102 kDa
19%
81%
p(HEGx-co-GuAEGy)
120 kDa
37%
63%
tert. amin. 62%
Physicochemical characterization Ethidium Bromide fluorescence (EtBr). The ability of vectors to condense DNA is determined by measuring the EtBr fluorescence (figure 2). The polymer was added stepwise to a DNA-EtBr solution and polyplex formation was correlated to a drop in fluorescence. Results show that guanidine and imidazol groups have a positive effect on the complexation, even with a lower amount of charges they condense better then tertiary amines (pDMAEG). Not only the electrostatic interaction between DNA and polymer is enhanced by an increasing amount of charges, also the condensation starts at a lower charge ratio (CR) (+/-). The influence of the Mw is limited to the condensation speed, vectors with a low Mw induce condensation at a lower CR because of their higher mobility in solution. Agarose gel electrophoresis (AGE). Another way to determine the condensation point of a vector is AGE. Complexation of DNA with a polymer disables the migration of DNA in an electric field. The mobility decreases when polymer stabilisation starts and retention occurs when the DNA is fully condensated. The results confirm the fluorescence tests and show that introduction of imidazol functions induces a slower decrease in detectable DNA signal, while tertiary amines and guanidines show a sudden decrease. Dependent of the polymer type, stabilisation of DNA is already sufficient to iii
prevent migration even if the polyplex is not yet formed. Therefore the condensation values are slightly different compared to fluorescence measurements.
140,00 1 p(HEG38%-DMAEG62%) 2
relatieve fluorescentie (%)
120,00
100,00
3 p(HEG60%-GuAEG22%-ImEG18%)
10 kDa
4 p(HEG49%-GuAEG15%-ImEG36%)
10 kDa
5 p(HEG57%-GuAEG43%)
80,00
145 kDa
p(HEG70%-AEG6%-GuAEG24%) 10 kDa
150 kDa
60,00
40,00
20,00
0,00 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
ladingsverhouding (+/-)
Figure 2. condensation profile of 5 synthesized polymers Particle size determination. For an efficient cell uptake it is necessary that the formed polyplexes are small enough (< ±200 nm). Dynamic light scattering was used to determine the particle size at a 1/1, 2/1 and 4/1 CR. All complexes meet the requirements for cell-uptake by endocytosis (Table II), except p(HEG83%-co-GuAEG17%) at a 1/1 CR. The particle size is independent of Mw or the amount of charges. It can be seen that the size decreases with increasing CR. The radius is the smallest when polyplexes have reached an ideal interaction. Extra polymer addition does not lead to tighter and smaller particles but slightly increases in size due to association of polymer to the polyplex. Measurement of zeta potential of complexes. The presence of a cationic charge on the surface of the polyplex affects its stability and interaction with the membrane of cells. The polyplex possesses good stability when the zeta-potential has a value of 30-40 mV. A lower potential leads to instability of the polyplex, while a higher zeta-potential increases the stability. The zeta-potential is determined by the particle’s speed in an electric field. The measurements confirm the results acquired by fluorescence and electrophoresis (Table II). Polymers that do not induce condensation at a 1/1 CR, display a neutral or negative zeta-potential at this CR while for higher CR’s positive potentials are obtained. Table II. Results DLS and zeta-potential results DLS (nm)
Polymer
4/1
results zeta-potential (mV)
1/1
2/1
1/1
2/1
4/1
p(HEG38%-co-DMAEG62%)
46,8
61,0
67,6
p(HEG57%-co-GuAEG43%)
23,0
42,2
29,3
18,1
20,0
34,4
18,1
26,8
31,6
p(HEG83%-co-GuAEG17%)
360
64,2
35,7
-13,2
10,4
15,7
p(HEG76%-co-AEG3%-co-GuAEG21%)
116
53,5
62,8
-9,60
23,6
25,8
p(HEG60%-co-GuAEG22%-co-ImEG18%) 51,3
50,1
46,3
-23,1
-3,21
24,7
p(HEG81%-co-GuAEG19%)
46,1
31,1
67,8
-47,4
32,9
36,5
p(HEG49%-co-GuAEG15%-co-ImEG36%) 36,4
39,4
38,2
25,7
34,3
39,7
iv
Biological evaluation Stability of DNA towards nucleases. A suitable vector protects the DNA against the attack of nucleases, enzymes capable of degrading DNA by cleavage of the phosphodiester bond. Polyplexes of different CR are prepared in a TRIS buffer. Degradation is measured at selected time points during 1 hour after addition of DNAse I at 37°C. The release of free nucleotides increases the absorbance at 260 nm. The results confirm that all polymers protect DNA efficiently and this already at a 1/1 CR. Hemolysis/Hemagglutination study. For in vivo applications it is necessary to investigate the interactions of the polymer/polyplex with blood components. The positively charged polymer induces agglutination and lysis of RBC, seriously hampering their function of oxygen transport. For hemolysis different amounts of polymer were added to an RBC-suspension and incubated (37°C) for 24 hrs. After centrifugation the absorbance of the supernatans was measured with an UV/VIS-spectrometer. The increase in absorbance at 545 nm is an indication for the amount of released hemoglobin due to lysis. The agglutination of the polyplexes was visualized by a microscope after incubation (37°C) of a RBC suspension for 1 hr with polymers or polyplexes. It was found that all complexes show less agglutination then the polymers because of the reduced positive charge (figure 4). A lower charge density results in a less agglutination and most polymers show no or little cluster formation at a 2/1 CR. All vectors also show a lower hemolytic activity then PEI. The introduction of tertiary amines and guanidines has a positive effect on hemolysis and hemagglutination The steric hinderance caused by the methyl groups reduces hemolysis and hemagglutination more efficient (pDMAEG) then delocalization of the positive charge in p(GuAEG). The imidazol derivatives show little or no clustering because the chemical nature of the imidazol (aromatic ring and charge dissipation). p(HEG38% -co-DMAEG62%)
p(HEG38%-co-DMAEG62%) - DNA
p(HEG57% -co-GuAEG43%)
p(HEG57%-co-GuAEG43%) - DNA
PEI
Figure 4. Hemagglutination of p(HEG38%-co-DMAEG62%) and p(HEG57%-co-GuAEG43%) and their polyplexes. The hemagglutination of PEI is added as reference. Biodegradation study. The biodegradation of the obtained compounds was investigated using the protease, papain. The polymer (10 mg) was dissolved in a phosphate buffer with EDTA and dithioerythritol. The solution was incubated (37°C) and a dose of papain was added. The Mw decrease was followed with GPC over 72 hrs. All polymers show a good degradability (figure 3) and the positive charges have only minor influence on the degradation speed, higher charge density slightly slows down degradation.
v
Figure 3: Effect of papain on the Mw of the obtained cationic polymers as a function of time Conclusion Poly-L-glutamic derivatives modified with different functional groups suitable for DNA complexation have been synthesized. All polymers are able to condense DNA and reduce the size strong enough to be taken up by the cell. Positive surface charges at custom used CR’s induce few hemolyis/hemagglutination and some derivatives showed also excellent nuclease protection and biodegradation. Compared to PEI, mainly imidazol containing vectors show promising results to overcome some key features in the toxicity of PEI as genetic delivery system. References 1. 2. 3. 4. 5.
S.Y. Wong, Progress in Polymer science, 2007, 32, 8-9, p. 799 C. Lin, Journal of Controlled Release, 2008, 132, 8, p. 267 V. Toncheva, Biochimica Et Biophysica Acta-General Subj., 1998, 1380, 3, p.354 T. Merdan, Pharmaceutical Research, 2002, 19, 2, p.14à P. Dubruel and E.H. Schacht, Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2000, 15, 4, p. 279
vi
