Synergie in de werkzaamheid van schimmel Entomopathogens en Permethrin tegen West-Afrikaanse Insecticideresistente Anopheles gambiae muggen.
Website: PLoS ONE Op deze website staat het orginele onderzoek(Engels). Hieronder staat de vertaling van dit onderzoek. Op de PLos ONE website staan de namen van de onderzoekers vermeld. PLoS ONE: Research Article, published 11 Aug 2010 10.1371/journal.pone.0012081
De vertaling is gedaan met: http://translate.google.nl/# en dus niet 100%. Tabellen en noten staan op de website van PLoS ONE Uitleg (vertaling): Anopheles gambiae
Achtergrond Een verhoogde incidentie van resistentie tegen insecticiden in malariavectoren zijn een bedreiging voor het duurzame gebruik van de hedendaagse chemische vector controle maatregelen. Schimmel entomopathogens een mogelijke extra instrument voor de bestrijding van insecticidenresistente malaria muggen. Deze studie onderzocht de verenigbaarheid van het pyrethroïde insecticide permethrin en twee muggen -pathogene schimmels, Beauveria bassiana en Metarhizium anisopliae, tegen een laboratorium kolonie en veld bevolking van West-Afrikaanse insecticidenresistente Anopheles gambiae ss muggen. Methodologie / Beoordeling Een reeks van schimmelinsecticide combinaties werd gebruikt om de effecten van timing en volgorde van de blootstelling te testen. Zowel het laboratoriumgehouden en in het veld verzamelde muggen waren zeer resistent tegen permethrine maar gevoelig zijn voor B. en M. bassiana anisopliae infectie, het induceren van 100% sterfte binnen negen dagen. Combinaties van insecticiden en schimmel toonde synergetische effecten op de mug overleven. Schimmelinfectie verhoogt permethrine-sterfte veroorzaakte in het wild levende An. gambiae S.S. muggen en omgekeerd, de blootstelling aan permethrin toegenomen latere schimmelgeïnduceerde sterfte in beide kolonies. Gelijktijdige blootstelling veroorzaakte het hoogste sterftecijfer, tot 70,3 ± 2% voor een gecombineerde Beauveria en permethrin blootstelling binnen een tijdspanne van een gonotrophic cyclus (4 dagen). Conclusies / Belang Het combineren van schimmels en permethrine induceerde een grotere impact op muggen overleven dan het gebruik van deze bestrijdingsmiddelen alleen. De waargenomen synergie in effectiviteit blijkt het potentieel voor geïntegreerde schimmelinsecticide controlemaatregelen om drastisch te verminderen malariatransmissie en maken de controle op meer gematigde niveaus van dekking, zelfs in gebieden waar resistentie tegen insecticiden heeft gemaakt pyrethroïden wezen ineffectief. Inleiding Malaria blijft een grote invloed hebben op de gezondheid en economische ontwikkeling in Afrika. Naast talrijke factoren die bijdragen tot dit probleem, de toenemende verspreiding van resistentie tegen insecticiden in de primaire mug vectorsoorten is een grote bedreiging voor de hedendaagse bestrijding van malaria inspanningen, die sterk afhankelijk zijn van insecticide-based interventies, zoals een langdurig werkend insectenwerend Netten (LLINs) en Indoor Het spuiten van insecticiden (IRS) Pyrethroïden en dichloordifenyltrichloorethaan (DDT) zijn de meest gebruikte insecticiden tegen malaria vectoren, en handelen op de centrale van het insect zenuwstelsel door het blokkeren van neuronale activiteit en het veroorzaken van een snelle verlamming en de dood. Resistentie tegen deze insecticiden in de belangrijkste vectorsoor-
ten, zoals Anopheles gambiae, kan worden verleend door een puntmutatie in het target site, de natriumkanaal gen, dat bekend staat als knock-down weerstand (KDR). Omdat pyrethroïden en DDT hebben een vergelijkbaar werkingsmechanisme, deze single targetsite modificatie verleent crossresistentie tegen zowel insecticide klassen. Daarnaast kan de weerstand het gevolg zijn van verhoogde metabole afbraak van het insecticide door specifieke enzymen. Verhoogde niveaus van monooxygenases, esterasen of glutathion S-transferase is aangetoond dat resistentie tegen insecticiden malariavectoren. Bovendien is het niet ongewoon voor muggen aan een combinatie van resistentiemechanismen vertonen, met zowel targetsite en metabole weerstand bepalen van de algemene weerstand fenotype. Gezien het belang van insecticide-based interventies voor de bestrijding van malaria, de ontwikkeling van strategieën om de selectie van resistentie te voorkomen of om resistente muggen controle is van essentieel belang. Mogelijke benaderingen omvatten de inzet van verschillende insecticiden in de vruchtwisseling of mozaïeken en de ontwikkeling van nieuwe insecticiden klassen. Echter, gezien de problemen van kruisresistentie tussen de bestaande chemische stoffen en er geen nieuwe klasse van de volksgezondheid insecticide bereikte de markt voor meer dan drie decennia, praktische opties voor eenvoudige chemische-gebaseerde benaderingen zijn beperkt. In dit opzicht is er steeds meer nadruk op de ontwikkeling van nieuwe geïntegreerde vector bestrijdingsstrategieën. Een groeiend lichaam van empirische en theoretische studies suggereert een mogelijke rol voor een nieuwe klasse van brio-insecticiden op basis van insectenpathogene schimmels. Verschillende laboratoriumstudies hebben aangetoond dat het potentieel van de entomopathogene schimmels Metarhizium anisopliae en Beauveria bassiana te infecteren en te doden Anopheles, Aedes en culexmuggen. Sporen (conidiën) van deze twee hyphomycetous schimmels kunnen hechten aan het insect bij contact, waarna ze ontkiemen, dringen de cuticula, vermenigvuldigen zich in de mug lichaam en uiteindelijk de dood veroorzaken De infectie duurt enkele dagen, meestal tussen 3 en 14 dagen, met de totale tijd tot de dood, afhankelijk meestal op schimmel dosis en virulentie van het isolaat. Deze modus van infectie leent zich voor een reeks van systemen voor de overbrenging. Verschillende toepassingsgebieden technieken die droog of geformuleerd sporen gebruik op muggen steunoppervlakken is aangetoond te infecteren en het merendeel van de blootgestelde muggen doden binnen 7-10 dagen. Voorafgaand aan het overlijden, schimmelinfectie kan ook leiden tot verminderde bloed-voerfrequentie en reproductieve fitness en kunnen van invloed zijn op de ontwikkeling van malariaparasieten in de mug. Andere studies tonen een laag risico van spore toepassingen voor de menselijke gezondheid en het milieu. Met betrekking tot resistentie tegen insecticiden, een belangrijke bevinding is dat de kandidaat-schimmels lijken even effectief in het infecteren en doden metabolisch resistent anophelinen als hun tegenhangers gevoelig. Een recente studie toonde aan dat schimmel effect was hoger in een pyrethroïde-resistente (KDR) kolonie van een gambiae ss dan in een insecticidengevoelige kolonie Bovendien, infectie met Metarhizium of Beauveria verhoogd permethrin en DDT gevoeligheid in zeer resistente laboratorium-opgefokt Anopheles muggen afkomstig uit Zuiden Oost-Afrika, die werd voorgesteld te zijn veroorzaakt door een herverdeling van insecticide-
ontgiftende enzymen in de richting van schimmel toxinen Deze bevindingen wijzen op een mogelijke nieuwe geïntegreerd vector management strategieën die conventionele en brio-insecticide tools te combineren. Verdere steun voor dit idee wordt geleverd door een recente theoretische studie, die aantoonde dat de controle van strategieën, zowel schimmels en met insecticide behandelde muskietennetten konden met behulp van grotere invloed op malariatransmissie dan controle maatregelen op basis van hetzij interventie alleen hebben. Dergelijke benaderingen kunnen worden van bijzonder gebruik in landen als Benin, waar een hoge mate van resistentie tegen pyrethroide reeds de impact van conventionele vector controle-instrumenten bedreigende. Pyrethroïde behandeld LLINs zijn momenteel de primaire malariapreventie interventie in Afrika en, realistisch, schimmelgebaseerde vector controle maatregelen zullen veel vaker worden uitgevoerd in combinatie met LLINs dan gebruikt als een substituut. De huidige studie, daarom onderzocht de interactie tussen pyrethroïden en schimmels. Combinaties van M. anisopliae, B. bassiana en permethrin zijn getoetst aan het laboratorium gekweekt en in het veld verzamelde West-Afrikaanse An. gambiae S.S. muggen, die zeer goed bestand tegen pyrethroïden en DDT waren door de expressie van de KDR gen. Voor een optimale ontwerp van geïntegreerde schimmelinsecticide gebied levering formaten, zijn de effecten van timing en volgorde van de blootstelling getest. Uitvoering van LLINs gecombineerd met overdekt resterende schimmel behandelingen kunnen leiden tot muggen contact met beide producten tijdens een enkele voeding episode. Als alternatief, muggen kan de schimmel en insecticide in de volgende voeding cycli contact, bijvoorbeeld wanneer LLINs worden gecombineerd met schimmelgeïmpregneerde rustplaatsen (zoals klei potten, katoen plafond doeken of buitenactiviteiten geur-aas-stations). Experimenten, dus inclusief simultane en sequentiële blootstelling combinaties van schimmel en permethrin effecten op de mug overleven test. Materialen en methoden Zwam Sporen van Metarhizium anisopliae var. anisopliae, ICIPE-30 (met dank Dr N. Maniania, ICIPE, Kenia) en Beauveria bassiana isoleren, isoleren IMI 391510, werden geproduceerd door solid state fermentatie met behulp van glucosegeïmpregneerde hennep als een substraat (met dank F. van Breukelen en M. JUMBE, Wageningen Universiteit, Nederland). Na een standaard groeiperiode van 10 dagen, werden sporen gedroogd bij kamertemperatuur totdat het vochtgehalte is <5% en werden vervolgens geoogst uit het groeimedium door middel van zeven. Droge sporen werden bewaard in 50 ml afgesloten plastic buizen in het donker bij 4 °C tot gebruik. Voor muggen bioassays, werden sporen geformuleerd in de synthetische isoparaffinisch koolwaterstof Shellsol T (Shellsol T ®, Shell, Nederland). Formuleringen werden gemengd door te vortexen en sonicatie gedurende 10 seconden bij 1000 Hz met een Branson probe ultrasoonapparaat (Branson B12, G. Heinemann, Duitsland). Spore concentratie werd bepaald met een Bürker-Türk haemocyte teller (W. Schreck, Hofheim / TS) onder een lichtmicroscoop (400 × vergroting) om het aantal sporen per
ml te kwantificeren. De levensvatbaarheid van schimmelsporen werd beoordeeld met het scoren van het aandeel van gekiemde sporen op Sabouraud dextrose agar met 0,001% Benomyl toegevoegd (het tellen van ≥ 300 sporen / agarplaat) na incubatie bij 27 °C gedurende 22-26 uur, met behulp van een lichtmicroscoop (400 ×). Muggen Het laboratorium kolonie (genaamd VKPer) bestond uit een. gambiae S.S. (S-vorm) muggen afkomstig van de Kouvallei in Burkina Faso die homozygoot zijn vastgesteld voor de KDR gen en gehandhaafd in de insectary van de CREC instituut in Cotonou, Benin. Eieren van deze kolonie werden verscheept naar het Laboratorium voor Entomologie, Wageningen Universiteit, Nederland en een kolonie was daar begonnen. Larven werden gehouden in kunststof bakjes gevuld met leidingwater en gevoed TetraMin Flakes ® visvoer (Tetra, Melle, Duitsland). Volwassenen werden ad libitum op een 6% glucose / water (w / v) oplossing en onderhouden in 30 × 30 × 30 cm kooien binnenklimaatgecontroleerde kamers (27 ± 1 °C, 80 ± 10%). Blootstelling aan experimenten op VKPer muggen werden ook uitgevoerd in deze klimaatkamers, met behulp van 3-5 dagen oude vrouwtjes. Het gebied kolonie bestond uit volwassen muggen gehouden van het veld verzamelde larven en poppen zijn verkregen uit broedplaatsen in de buurt Ladji, Benin (6 ° 23'23N, 2 ° 25'56E) in april 2009. Eerdere studies toonden aan dat op deze locatie de Anopheles bevolking bestaat uit resistente (KDR) Een. gambiae S.S. (M-vorm) muggen Anopheles gambiae larven werden gescheiden van het veld monsters en gekweekt in grote, ronde plastic bakjes in de insectary van de CREC. Larven werden gehouden in kunststof bakjes gevuld met leidingwater en gevoed met lokaal gekocht kattenvoer. Volwassenen werden behouden in het CREC insectary (26 ± 1 °C,> 80% RV) en ad libitum op koningswater mengsels. Bioassays op het veld worden verzameld muggen werden uitgevoerd in de CREC laboratorium, waarbij de temperatuur was ongeveer 20 ± 2 ° C gedurende de dag, en bij 26 ± 1 °C gedurende observatie periodes (6 pm-8 uur) met vocht> 80% relatieve luchtvochtigheid.
Baseline schimmel bioassays Het effect van schimmelinfectie op muggen overleving werd getest met behulp van een gestandaardiseerde blootstelling bioassay in muizen met schimmelgecoate papier. De K-Hand Coater (RK Print Coat Instruments Ltd, UK) werd gebruikt voor het coaten van de blootstelling papier met B. bassiana of M. anisopliae sporen die waren in Shellsol T. geschorst op elke A4-formaat, 0,9 ml van een 4,2 × 109 spore / ml suspensie werd gepipetteerd op de top van de 25 × 15 cm applicatie oppervlak, en bekleed handmatig op het papier met een 0,31 mm bedraad K-bar (K bars ®, RK Print Coat Instruments Ltd, Verenigd Koninkrijk) Dat leverde een 24 pm film borg Controle op papier werden behandeld met 0,9 ml Shellsol. De effectieve spore endconcentratie bestaat uit 1011 spores/m2 en werd geoptimaliseerd om een hoge mate van infectie, terwijl niet veroorzaakt door een te snelle sterfte veroorzaken met het oog op mogelijke interactie-effecten in de tijd te volgen. Deze blootstelling was ook
een dosis gebruikt voor schimmelinsecticide blootstelling aan experimenten. Papers werden overgelaten aan een nacht drogen in een klimaat gecontroleerde ruimte (27 ± 1 °C, 70 ± 10% RV) voordat ze geplaatst in een PVC-buis van 15 cm lang en 8 cm diameter. Papers bestreek de gehele binnenkant van de buis en werden bevestigd met twee paperclips. Elke buis werd afgesloten met plastic magnetronfolie aan beide zijden, op die de muggen niet de neiging om uit te rusten. Voor elke repliceren, werden ongeveer 30 vrouwelijke muggen blootgesteld aan de papieren voor 1 uur en vervolgens overgebracht naar bedrijf emmers schoon via het gratis vlucht. Dagelijkse muggen mortaliteit werd opgenomen en de dode muggen werden verwijderd uit elk segment en gecontroleerd op schimmelinfectie door dompelen kadavers in 70% ethanol aan externe microbiota te verwijderen (die niet de intern groeiende schimmel beïnvloeden) en incubatie ze op vochtig filtreerpapier in verzegelde petrischalen op 27 ± 1 °C. Na 3-5 dagen muggen kadavers werden onderzocht op schimmels sporulatie, dat wil zeggen, opkomende hyfen, met behulp van een dissectie microscoop. Omdat een lage infectie dosis en externe factoren, zoals de microbiota en temperatuur kan schimmelgroei invloed, hyfen groei van kadavers is geen directe indicator voor schimmelinfectie en werd alleen gebruikt als een positieve controle observatie. Proeven bestonden uit vier behandelde en controlegroep repliceert voor de VKPer stam en drie herhalingen voor het veld verzamelde muggen, op verschillende dagen met verschillende muggen batches te stellen. Schimmelinsecticide combinatie assays Het effect van schimmel en insecticide combinaties op muggen mortaliteit werd getest met een reeks van blootstellingen en sequenties, ontworpen om de volgorde en de timing van insecticiden en schimmel vorderingen die zich kunnen voordoen onder verschillende scenario's van de inzet in het veld na te bootsen. Tabel 1 geeft een overzicht van de verschillende behandeling combinaties, en de groep nummers vermeld in deze tabel zijn vervolgens gebruikt om behandelingen te beschrijven in de resultaten. Muggen werden blootgesteld aan insecticide, schimmelsporen, of beide, met behulp van standaard WHO bioassay procedures zoals hieronder beschreven. Een drie dagen interval werd gekozen tussen de twee rondes blootstelling aan de gemiddelde duur van de cyclus van een gonotrophic vertegenwoordigen. gambiae en dus de periode tussen opeenvolgende bloed maaltijden. Dit keerpunt werd gebruikt in eerdere evaluaties van schimmels impact op insecticide gevoeligheid en kwam overeen met het begin van de schimmel proliferatie en de eerste merkbare impact op de overleving en muggen toegestaan voor metingen op schimmel effect, terwijl niet te verliezen te veel insecten door de dood. Blootstelling 1.In de eerste blootstelling ronde, een cohort van ca. 28 vrouwen werden overgebracht naar WHO bioassay buizen met een afzuiger en blootgesteld gedurende 1 uur tot de behandelingen die in tabel 1. Controle groepen werden blootgesteld aan onbehandelde papieren. Insecticide vorderingen gebruikte papier behandeld met 0,75% permethrine uit een enkel WHO productiebatch (Vector Control referentie-eenheid, Universiti Sains Maleisië, Penang, Maleisië). Voor schimmelposities werden muggen blootgesteld aan papier bedekt de vorige dag met B.
bassiana of M. anisopliae (1011 spores/m2). Effecten van gelijktijdige blootstelling werden getest door het blootstellen van muggen eerst gedurende 1 uur tot schimmelgeïmpregneerd papier en onmiddellijk daarna gedurende 1 uur om papieren permethrine. Na blootstelling werden muggen overgebracht naar bedrijf emmers via vrije vlucht en mortaliteit werd gemeten 24 uur en 3 dagen na blootstelling. Blootstelling 2.Three dagen na de eerste blootstelling werden overlevende muggen eens te meer overgedragen van het bedrijf emmers aan de WHO bioassay buizen en hetzij blootgesteld aan papers permethrine of om papieren, zoals aangegeven in tabel 1 controle. Vorderingen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, gedurende 1 uur, waarna muggen terug werden overgebracht naar bedrijf emmers. Mortaliteit werd gescoord na 24 uur (dag 4) en 3 dagen na de tweede ronde de blootstelling (Dag 7). Dode muggen werden verwijderd gecontroleerd schimmelinfectie, dat wil zeggen sporulatie zoals hierboven beschreven. Muggen die nog in leven waren op dag 7 werden verwijderd uit de emmers met een afzuiger en gedood door verdrinking in 70% alcohol alvorens te onderzoeken voor een schimmelinfectie. Permethrine geïmpregneerde papieren werden opnieuw gebruikt voor een periode van maximaal twee weken en gecontroleerd voor werkzaamheid (na gebruik in de blootstelling assays) door het blootstellen van insecticidengevoelige muggen aan de kranten. In Wageningen, twee groepen van 25 vrouwelijke An. gambiae S.S. van de Suakoko stam werden blootgesteld (van oorsprong uit Liberia, gehouden in Wageningen). In Cotonou, twee groepen van 25 vrouwelijke An. gambiae S.S. van de stam Kisumu werden blootgesteld (afkomstig uit Kenia, gehouden in Cotonou). Experimentele gegevens werden alleen gebruikt als de insecticide papieren geïnduceerde 100% sterfte in deze gevoelige stammen. Data-analyse Verschillen in overleving tussen mug schimmel geïnfecteerde en controle groepen werden geanalyseerd met behulp van Cox regressie met SPSS 16.0 software. Voor beide muggen stammen, werden overlevingscurven van Beauveria-of Metarhiziumgeïnfecteerde muggen in vergelijking met de controle. Hazard ratio (HR)-waarden, met vermelding van de gemiddelde dagelijkse risico om te sterven tussen de twee groepen werden berekend om significante verschillen in de totale sterfte te meten. Ter rechtvaardiging van de proportionele risico's veronderstelling, werden plots van een overlevingsfuncties gebruikt om Hazard Ratio evenredigheid te controleren. Permethrine-geïnduceerde sterfte werd berekend op basis van muggen sterftecijfers 24 uur na blootstelling aan permethrin die werden gecorrigeerd voor de overeenkomstige bestrijdingsprogramma sterfte (blootgesteld aan blanco papieren) boven de 5%niveau met behulp van de Abbott formule. Voor alle blootstellingroutes assays, waren de verschillen in groep betekend geanalyseerd voor elke mug bevolking afzonderlijk, met behulp van mortaliteit verhoudingen die boogsinus √ voorafgaand aan de analyse getransformeerd, en vergeleken met behulp van een one-way ANOVA (SPSS 16.0) en een Tukey post-hoc test. Vergelijkingen tussen de verschillende belichting groepen (insecticide, schimmel of beide) gebruikt een teweeg ANOVA (SPSS 16.0).
Synergie tussen de twee soorten van schimmels en permethrin werd geanalyseerd door het vergelijken van sterftecijfers veroorzaakt door een combinatie van beide middelen (waargenomen) met de som van sterfte veroorzaakt door elke agent afzonderlijk (naar verwachting). De verwachte sterfte werd berekend met de formule Me = Mf + Mi (1 - Mf/100), waar Mf en Mi waren de waargenomen procent sterfte veroorzaakt door de schimmel en het insecticide alleen. Voor alle schimmel-insecticide combinaties werden deze berekend verwachte sterfte percentages in vergelijking met hun bijbehorende geconstateerde sterfte percentages (MFI) met behulp van een gepaarde steekproeven T-test in SPSS 16.0, die voor paarsgewijze vergelijkingen toegestaan tussen elk van de herhaalde metingen en uit te sluiten potentiële repliceren variaties zoals de verschillen tussen muggen fokken batches, schimmeltoepassingen en insecticide papier werkzaamheid. Positieve MFI-Me waarden werden beschouwd als synergetische. Een significantieniveau van <0,05 werd gebruikt in alle analyses. Resultaten Baseline schimmel gevoeligheid. Zowel laboratoriumgehouden en in het veld worden verzameld met insecticide tegen An. gambiae S.S. gevoelig waren voor M. anisopliae en B. bassiana, met 100% mortaliteit bereikt binnen negen dagen na de blootstelling (figuur 1) en> 70% sporulatie van kadavers (controles met 0% sporulatie). Survivalanalyse toonde geen significante verschillen in virulentie tussen B. en M. bassiana anisopliae in het laboratorium kolonie (HR = 1,29, p = 0,09) of op het veld worden verzameld muggen (HR = 1,35 p = 0,07). Er was geen significante interactie tussen schimmel behandeling en muggen kolonie (HR = 0,83 p = 0,16), wat aangeeft dat schimmelinfectie had een vergelijkbare impact op de KDR muggen levensduur in het laboratorium en in het veld populaties. Baseline permethrine weerstand Permethrine-geïnduceerde sterfte werden vergeleken tussen de groepen die werden blootgesteld aan permethrin op dag 0 (groep 3), op dag 3 (groep 2), of op dag 0 + dag 3 (groep 4) (tabel 1). Control sterfte (onbelicht groepen) waren onder de 5% en werden daarom niet gebruikt om het insecticidengeïnduceerde sterfte te corrigeren. Zowel het laboratorium VKPer kolonie en de kolonie in het veld verzameld waren zeer resistent tegen permethrine, vertonen slechts 10-20% sterfte na een enkele of herhaalde blootstelling (figuur 2). Gelijkwaardige enkele insecticide blootstelling van de gevoelige mug stammen resulteerde in 100% sterfte. Statistische analyses op de groep betekent toonden aan dat er geen significante verschillen in gevoeligheid voor permethrin tussen het laboratorium en veld muggen (figuur 2). Bovendien heeft permethrin weerstandsniveaus niet toenemen in de drie daagse test periode en werden niet significant beïnvloed door middel van herhaalde blootstelling (figuur 2). Effecten van schimmel-insecticide combinaties Voor het bepalen van het effect van de schimmelinfectie op permethrine werkzaamheid, was de sterfte na blootstelling aan permethrin vergeleken tussen Beauveriageïnfecteerde, Metarhizium-geïnfecteerde en gelijkwaardige niet-geïnfecteerde groepen. Sterftecijfers van schimmelinfectie groepen blootgesteld aan permethrin op
dag 3 (groepen 6 & 10) werden gecorrigeerd voor de sterfte van de desbetreffende (schimmel geïnfecteerde) controle groepen (groepen 5 & 9), terwijl voor de andere behandelingen geen correcties zijn aangebracht sinds de controle op de sterfte niet boven de 5%-niveau Permethrine-geïnduceerde sterfte gemeten op dag 1 was niet hoger in groepen samen worden blootgesteld aan schimmel in vergelijking met groepen blootgesteld aan enige (Figuur 3) permethrin in beide muggen kolonie, aangeeft dat er geen interacties op de zeer vroege stadia van de schimmelinfectie. Echter, had eens schimmelinfectie prolifereerden voor drie dagen, de blootstelling aan permethrin geïnduceerde significant hogere mortaliteit in de Beauveriageïnfecteerde (groep 6, P = 0,02) en Metarhizium-geïnfecteerde (Groep 10, P = 0,009) muggen uit het veld populatie (Figuur 3). Deze verschillen in Permethrinegeïnduceerde sterfte werden niet waargenomen in de KDR VKPer laboratorium kolonie (figuur 3), hoewel schimmelsterftecijfers gebruikt om de juiste coblootgestelde groep sterfte vergelijkbaar waren voor beide kolonies veroorzaakte. Wederkerige effecten van blootstelling aan insecticiden voor latere schimmel werkzaamheid werden beoordeeld door een vergelijking ongecorrigeerde sterfte tussen dag 3 en dag 4 voor groepen muggen blootgesteld op dag 0 tot en met insecticide (groep 3), schimmel (groepen 5 & 9), of beide (groepen 7 & 11). Blootstelling aan alleen permethrine (P) toonde een minimale impact op sterfte onder mug overlevenden drie dagen later (figuur 4). In overeenstemming is met de sterfte trajecten in figuur 1, de blootstelling aan schimmel alleen (F) resulteerde in een significant grotere dag 3-4 mortaliteit in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles (figuur 4). Schimmelgeïnduceerde sterfte waren significant hoger in de schimmel en insecticide gelijktijdige blootstelling behandelingen (F + P) (figuur 4), wat aangeeft dat permethrin augmented de proliferatie van B. en M. bassiana anisopliae in zowel het laboratorium kolonie en veldverzamelde muggen. Alle co-exposure behandelingen bleken synergetisch op elkaar inwerken, zoals die dag 3-4 sterftecijfers waren significant hoger (P <0,05) dan verwacht uit de enkele gecombineerde effecten van behandeling. De effecten op dagelijkse sterfte tarieven op het moment dat wilde muggen zou worden verwacht dat een tweede bloedmaaltijd (bijvoorbeeld op dag 7) te nemen kon niet worden geanalyseerd als mortaliteit van muggen blootgesteld aan de verschillende schimmel-permethrine combinatie behandelingen was 80-90% door dag 7, en niet geschikt voor het vergelijken van synergetische effecten van verschillende belichtingen. Totaal effect van schimmel-insecticide combinaties werden geanalyseerd met behulp van ongecorrigeerde cumulatieve dag 4 sterftecijfers, wijzen op de totale impact binnen het tijdsbestek van 1-2 mug gonotrophic cycli. In het laboratorium kolonie, een enkele permethrine blootstelling als gevolg een aanzienlijke toename van de sterfte ten opzichte van controles, hoewel dit niet verder toegenomen door een tweede blootstelling (figuur 5). In het veld populatie, alleen de dubbele permethrine blootstelling was significant verschillend van de controles. Totale, maximale sterfte veroorzaakt door permethrin was ongeveer 20-30% vergeleken met 10% in de controlegroep (figuur 5), wat aangeeft dat permethrin niet een substantieel effect hebben op de mortaliteit in deze KDR An. gambiae S.S. muggen. Effecten van schimmelinfectie vier dagen na blootstelling, maar nog steeds matig, waren iets
hoger, het induceren van 19-41% sterfte (figuur 5). Gevolgen van de schimmel de neiging om te marginaal hoger op het gebied bevolking, met geen duidelijke verschillen in de effecten van B. en M. bassiana anisopliae. In het laboratorium kolonie, het effect van B. bassiana op muggen overleving was groter dan M. anisopliae in de meeste behandelingen, met significante verschillen (P <0,05) aangegeven door nietcorresponderende letters in figuur 5. Beide soorten schimmel had een grotere impact op muggen mortaliteit in combinatie met permethrine. Alle geteste schimmels en permethrine combinaties (F + P) resulteerde in een hogere cumulatieve sterfte in vergelijking met het gebruik van permethrine-(p) (p <0,001) of schimmel-only (F) (P <0,001) behandelingen in beide muggen stammen (figuur 5). Co-blootstelling aan beide agenten op dag 0 geïnduceerde hoogste totale sterfte (in de orde van 60-70%), met geen extra sterfte van een tweede blootstelling aan permethrin (figuur 5). In het veld populatie, gelijktijdige co-blootstelling aan B. bassiana of M. anisopliae en permethrine (groepen 7,8,11,12), evenals sequentiële blootstelling aan B. bassiana en dan permethrine (groep 6), veroorzaakte significante synergetische verhogingen in de cumulatieve sterfte op dag 4 (tabel 2). In het laboratorium muggen kolonie, was significant synergie tussen schimmel en permethrin alleen waargenomen in de single gelijktijdige blootstelling behandelingen (groepen 7 & 11) (tabel 2). Discussie Het laboratorium kolonie (VKPer) en in het veld populatie van An. gambiae ss uit West-Afrika toonde beperkte gevoeligheid voor permethrin na een enkele of meerdere belichtingen over de duur van een gonotrophic cyclus. Deze resultaten zijn consistent met bekende hoge niveaus van KDR expressie in deze populaties. Terwijl omvang of andere fitness parameters (niet gemeten) mag worden verwacht dat meer variabel in de volwassenen gehouden van het veld verzamelde larven en poppen zijn, hun baseline insecticide gevoeligheid was vergelijkbaar met het laboratorium gekweekte muggen en was consistent tussen de verschillende experimenten. Beide populaties van KDR muggen waren zeer gevoelig voor twee kandidaat-isolaten van B. en M. bassiana anisopliae. Blootstelling aan een intermediaire dosis van schimmel behulp van een standaard WHO bioassay 100% sterfte veroorzaakt binnen negen dagen. Deze behandeling mortaliteit was aanzienlijk hoger dan de sterfte in de controlegroep, zelfs in de Cotonou-laboratorium waar overleving van het veld worden verzameld muggen enigszins waren verminderd. Sporulatie van de schimmel kadavers lager leek te zijn in de Metarhizium-geïnfecteerde gebied muggen, die in overeenstemming is met de bevindingen dat deze schimmel niet is een sterke concurrent van andere microbiota en dat hyfen groei kan worden beïnvloed door omgevingsfactoren. Sterfte echter aangegeven hoge schimmel infectiviteit van beide isolaten in beide muggen populaties. Deze waarnemingen bevestigen bevindingen uit recente studies over hetzelfde en andere resistente muggen soorten en rassen en tonen voor de eerste keer dat ook de wilde populaties van West-Afrikaanse pyrethroïde-resistente An. gambiae S.S. niet resistentie tegen insecten-pathogene schimmels. Gezien de groeiende problemen van pyrethroide weerstand en problemen
van cross-resistentie tegen DDT bij malariavectoren deze resultaten onder de aandacht een belangrijke kracht van de brio-insecticide aanpak. Impact op de overleving was in grote lijnen dezelfde voor beide isolaten, hoewel sommige van de test resultaten suggereren iets verminderde werkzaamheid van M. anisopliae, die waarschijnlijk gekoppeld is aan een lagere kwaliteit van de productieserie beschikbaar voor deze tests, die een lagere levensvatbaarheid bleek op een agar dan de B. bassiana sporen (70% vs 92%). Andere bevindingen echter ook duiden op een hogere persistentie van Beauveria sporen, het geen impliceert dat deze schimmel kan meer geschikt zijn voor in het veld de uitvoering. Spore virulentie en doorzettingsvermogen kunnen sterk verschillen tussen verschillende schimmelstammen binnen en tussen hyphomycetous soorten, en kan worden geoptimaliseerd door middel van productiemethoden en formulering. Uiteindelijk zal de keuze van schimmelstam nodig evaluaties van de lange termijn effectiviteit van verschillende soorten en isolaten na toepassing onder realistische veldomstandigheden, tezamen met de evaluatie van andere operationele criteria zoals massa productie-efficiëntie, pachttermijn opslag levensvatbaarheid en (eco) toxicologie. Afgezien van de mogelijkheid om insecticidenresistente muggen infecteren, deze studie heeft de mogelijkheden voor synergetische interacties tussen schimmels en pyrethroïden. Ten eerste, pre-infectie met schimmel heeft geleid tot een toename van Permethrine-geïnduceerde sterfte niveaus, dwz de 'momentane' sterfte ten gevolge van blootstelling aan permethrin. Dit effect was beperkt tot het terrein mug bevolking en was niet duidelijk in het laboratorium kolonie. Het mechanisme voor dit effect is onduidelijk. Eerdere werk gesuggereerd dat schimmelmetabolieten kunnen interfereren met enzymatische insecticide resistentie mechanismen en het is dus mogelijk dat de waargenomen effecten in een. gambiae van Ladji het gevolg zijn van een effectieve toename van de gevoeligheid voor permethrine in de aanwezigheid van een proliferatieve schimmelinfectie. Hoewel beide An. gambiae populaties bekend zijn uit te drukken KDR en dergelijke gevolgen zou niet per se worden verwacht wanneer weerstand wordt alleen verleend door targetsite ongevoeligheid, de VKPer laboratorium kolonie is vastgesteld voor KDR weerstand door herhaalde selectie en onderhouden in het laboratorium voor vele jaren. Overwegende dat verhoogde niveaus van oxidasen en esterases gemeld voor de wilde An. gambiae S.S. bevolking op Ladji, Benin. Zo zijn de verschillen in reactie op permethrine tussen schimmel geïnfecteerde laboratorium-en veldverzamelde muggen kunnen wijzen op meer complexe meervoudige resistentie mechanismen die werkzaam zijn in het veld. De iets meer variabel milieuomstandigheden in de Cotonou-laboratorium zou kunnen hebben echter ook gevolgen schimmel werkzaamheid en overlevingskansen van het veld worden verzameld muggen. Ten tweede, gelijktijdige blootstelling aan schimmels en permethrine verhoogde de dagelijkse sterfte van muggen op het punt waar schimmel begint te woekeren in de insecten en benaderingen zijn exponentiële groeifase.Deze hogere schimmel virulentie drie dagen na blootstelling is waarschijnlijk veroorzaakt door indirecte effecten van het insecticide, aangezien pyrethroïden zijn meestal snel ontgift door metabolisatie processen en dus niet langer aanwezig is in het insect lichaam op dat momentpunt. Hoewel de exacte mechanismen voor dit effect zijn onduidelijk, insecticiden kan
het insect cuticula beïnvloeden en te vergemakkelijken schimmel penetratie, of kan remmen cellulaire en humorale immuunresponsen en schimmelinfecties in het lichaam te vergemakkelijken, zoals aangegeven in andere insectensoorten. Ten slotte werden in verschillende combinatie behandelingen, en met name gelijktijdige blootstelling, synergetische interacties tussen schimmels en permethrine op de totale mortaliteit waargenomen door muggen. Deze synergetische effecten resulteerde in ongeveer 50-70% mortaliteit na vier dagen in de meeste co-blootgestelde groepen, vergeleken met 15-40% voor permethrin of schimmel alleen. Er was geen extra sterfte in co-kwetsbare groepen na een herhaalde blootstelling aan insecticiden, wat suggereert dat de effecten van insecticiden op de schimmel proliferatie belangrijke mate bijdragen aan de algehele impact en dat een enkel insecticide blootstelling bij de start is voldoende om te induceren synergie. Verschillende theoretische studies hebben aangetoond dat de relatief lage snelheid van afsterving van entomopathogene schimmels voldoende kunnen zijn om invloed op malaria transmissie sinds de extrinsieke incubatietijd van de malariaparasiet binnen de mug (meestal 10-14 dagen in hoge transmissie-instellingen) creëert een venster van enkele dagen voor de schimmel om te handelen.Er kan zelfs worden evolutionaire voordelen in langzame snelheid van doden. Echter, voor een langzaam werkend product om doeltreffend te zijn, de dekking moet voldoende hoog zijn om contact met muggen vroeg in het volwassen leven te verzekeren, omdat ze anders zouden de negatieve effecten van schimmelinfectie te ontsnappen lang genoeg om malaria [31] zenden. Bijgevolg kunnen de synergetische effecten van schimmels en permethrin op de mortaliteit zeer belangrijk; 50-70% sterfte binnen vier dagen heeft de potentie om malariatransmissie drastisch te verminderen over de duur van 1-2 gonotrophic cycli en kon de controle mogelijk te maken op meer gematigde niveaus van dekking. Meer fundamenteel, zou het toevoegen van schimmels entomopathogens maken de bestrijding van malaria mogelijk wanneer resistentie tegen insecticiden heeft pyrethroïden gemaakt wezen ineffectief. Operationele inzet van de schimmel bio-insecticiden voor muggen controle vergt verder onderzoek en ontwikkeling, met inbegrip van de ontwikkeling van haalbare gebied levering methoden die verenigbaar zijn met de huidige chemische controles instrumenten die reeds in de plaats [38], [44]. In de huidige studie, alle schimmelinsecticide combinaties hadden een veel grotere impact op muggen overleven dan schimmel of insecticide alleen. Echter, gezien het feit dat co-blootstelling van de sterkste synergetische effecten geproduceerd, zou het interessant zijn om de levering systemen die min of meer gelijktijdige blootstelling aan zowel producten te promoten tijdens een enkele voeding episode, zoals het gebruik van LLINs samen met overdekt resterende schimmel behandelingen of schimmel te verkennen- behandeld rust doelen [16], [19] die bezocht kunnen worden kort voor of na contact met een klamboe, of het combineren van schimmels en (non-repellent) insecticiden op enkele ondergronden zoals muren, muskietennetten of dakrand gordijnen (resultaten uit andere studies tonen aan goede compatibiliteit van schimmel-insecticide mengsels. Bovendien, hoewel in overeenstemming met standaard WHO-methoden, het type van blootstelling assays gebruikt in de huidige laboratorium onderzoek niet direct simuleren schimmel blootstelling zou kunnen worden naar verwachting in het veld.
Verder onderzoek is dus nodig om de gevolgen van meer realistische schimmelinfecties van de vorderingen (bijv. 'transient contact uit te rusten op verschillende substraten) en hun robuustheid in de verschillende milieuomstandigheden te bepalen. Even belangrijk zou zijn om een dosisafhankelijke effecten en test onderzoeken of schimmelinfectie kan de werkzaamheid van subletale insecticide doses, waarvan is aangetoond dat het geval in andere insecten worden te verbeteren. Momenteel is er grote belangstelling voor het gebruik van gecombineerde ingrepen met verschillende werkingsmechanismen als strategie voor het beheer, niet alleen om resistente muggen controle, maar om de selectie van nieuwe weerstand, die een mogelijke rol voor schimmels met andere categorieën van insecticide geeft vertraging. Dit onderzoek kan mogelijk de ontwikkeling van nieuwe geïntegreerde vector management (IVM) strategieën die de nuttige levensduur van de huidige insecticidebased interventies zou lijden en het maximaliseren van de controle in het gezicht van de opkomende resistentie tegen insecticiden.
