Chapter 7 Summary, Samenvatting, List of publications Summary and Conclusions This thesis is focused on the study of the interaction of light with amino acid residues and cofactors, resulting in detectable biological activity. Photoactive proteins are good models for the study of proteins in general, due to the easily detecable (even by unequiped eye) change of their absorption, during different stages of the light-induced reactions. Thus, photoactive proteins provide handles for the understanding of the elementary reactions that are the triggers of biological activity. Light-induced reactions in proteins start by the absorption of a photon by the small chromophore (cofactor) molecule embedded in the protein matrix. This molecule is able to transform the photon energy in extremely short time period, and to utilize it as a driving force for chemical transformations. In this thesis we have explored different light-induced reactions by time-resolved laser spectroscopy. To access the different intermediates during the reactions, we performed ultrafast pump-probe spectroscopy in the visible spectral region. In this way, we could identify the decay rates corresponding to different intermediates and to access the dynamics of the reaction, based on the evolving spectral changes associated with electronic transitions. To access structural changes that often trigger the biological activity of the proteins, we apply vibrational time-resolved spectroscopy, in combination with simulations of the studied systems. We also employed three-pulse different absorption spectroscopy, to rule 104
out overlapping spectral contributions of the intermediates, and to refine the reaction models. We applied combinations of these techniques to three different proteins: proteorhodopsin (chapters 2 and 3), cytochrome P450 (chapter 4) and photoactive yellow protein (chapters 5 and 6). In chapter 2 the protein of interest was proteorhodospin, a proton pump protein from the rhodopsin family. Light absorption by its retinal chromophore initiates a photocycle, driven by trans-cis isomerization, leading to a proton translocation through the cytoplasmic membrane. We compared the reaction dynamics for pR at alkaline and acidic pH. We found that the pH (at least in the range that we studied) does not influence the reaction mechanism, only the efficiency of the isomerization is lowered for the sample at acidic pH. Ultrafast vibrational spectroscopy reveals a very fast conformational change of the protein backbone, on the time scale of less than 10 ps, induced by the isomerization of the chromophore. Chapter 3 is a study of the ground state dynamics of photoisomerization in proteorhodopsin, accessed by three-pulse pump-dump-probe spectroscopy. The application of a pump pulse initiates the photocycle, and with an appropriately tuned dump pulse applied at a time delay after the dump, the molecules in the initial stages of the photochemical process can be de-excited and sent back to the ground state. In this way we resolved an intermediate on the electronic ground state that represents chromophores, unsuccessful in isomerization. Inclusion of this intermediate in the kinetic scheme led to more consistent spectra of the retinal-excited state, and to a more accurate estimation of the quantum yield of isomerization (Φ = 0.4 at pH 6) In chapter 4 we studied the photodissociation and rebinding of carbon monoxide from the heme cofactor in cytochrome P450. We monitored the reaction through the spectral changes of the deligated heme in the visible spectral region, and of the photodissociated CO in the mid-IR. We found 100% yield of the photodissociation reaction, and rebinding on a nanosecond time scale. This indicates that before recombination, the protein is docked within the protein. We identified by a cavity search algorithm docking sites within the protein matrix that can accomodate carbon monoxide molecules. Chapters 5 and 6 are dedicated to photoisomerization in photoactive yellow protein. Absorption of a photon of its chromophore, p-coumaric acid, leads to trans-
cis isomerization around the C=C double bond and breakage of the hydrogen bond between the chromophore C=O and the backbone N-H of Cys69. When the chromophore fails to isomerize, it decays to the ground state through an intermediate with a distorted cis conformation (ground state intermediate). To determine how the protein controls the outcome of the light-induced reaction, we studied the isomerization in a series of mutants of PYP, having proline 68 replaced with a series of hydrophobic amino acids. We applied ultrafast spectroscopy probing in the visible and in the mid-IR (chapter 4,5), molecular dynamics simulations of the mutants in the ground state (chapter 4), and pump-dump-probe spectroscopy (chapter 5). We found, that due to its rigid structure, proline 68 is involved in the optimization of the reaction yield. Mutating it with other residues disturbs the hydrogen bond network around the chromophore, and is opening free space for water molecules within the chromophore-binding pocket. The results presented in this thesis have increased our understanding of the functioning of proteorhodopsin, photoactive yellow protein and cytochrome P450. We showed that the application of complementary techniques provides insight into lightinduced changes at the level of individual atoms and chemical groups. These changes are transferred into the living cell and initiate biologically relevant response. This understanding of protein function can find application in biotechnology, medicine and biology.
Samenvatting Dit proefschrift beschrijft de interactie van licht met aminozuren en cofactoren die leidt to biologische activiteit. Deze interactie vindt plaats in fotoactieve eiwitten. Zulke eiwitten zijn goede modelsystemen om eiwitten in het algemeen te bestuderen, vanwege de eenvoudig detecteerbare (zelfs met het blote oog) absorptieveranderingen gedurende de verschillende fasen van de lichtge¨ınduceerde reacties. Zodoende bieden fotoactieve eiwitten aanknopingspunten voor het begrijpen van de elementaire reacties (namelijk foto-isomerisatie, foto-dissociatie, electron/proton overdracht tussen de cofactor en het eiwit) die het eiwit in staat stellen grotere conformatieveranderingen te ondergaan op een biologisch relevante tijdsschaal. Lichtge¨ınduceerde reacties van eiwitten beginnen met de absorptie van een foton door een kleine chromofoor (cofactor) in de eiwitmatrix. Dit molecuul kan de fotonenergie in extreem korte tijd omzetten in chemische energie die vervolgens gebruikt als drijvende kracht voor chemische omzettingen. In dit proefschrift hebben we verscheidene lichtge¨ınduceerde reacties bestudeerd met tijdsopgeloste laser spectroscopie. Om de verschillende tussenproducten van de reacties te bestuderen hebben we ultrasnelle pomp-meet spectroscopie met zichtbaar licht gebruikt. Zodoende zijn de vervalconstanten van de verschillende tussenproducten bepaald en de dynamica van de reactie bestudeerd door het volgend van de spectrale veranderingen geassocieerd met electronische overgangen. Om structuurveranderingen, die vaak de biologische activiteit in gang zetten, te bestuderen, hebben we tijdsopgeloste vibrationele spectroscopie gebruikt, in combinatie met simulaties. Daarnaast hebben met behulp van drie-puls pomp-dump-meet spectroscopie aangetoond dat de tussenproducten niet spectraal overlappen, en met die kennis het modelleren van de reactiedynamica verfijnd. Combinaties van deze technieken zijn gebruikt voor het bestuderen van drie verschillende eiwitten: proteorhodopsine (hoofdstukken 2 en 3), cytochroom P450 (hoofdstuk 4) and fotoactief geel eiwit (hoofdstukken 5 en 6). Hoofdstuk 2 gaat over proteorhodopsine, een protonpomp-eiwit uit de rhodopsine klasse. Lichtabsorptie door de retinal chromofoor in het eiwit zet een fotocyclus in gang, gedreven door trans-cis isomerisatie, wat leidt to proton translocatie over het cytoplasmatisch membraan. We hebben de reactie dynamica van proteorhodopsine in zuur en basisch milieu vergeleken. De pH blijkt niet van invloed te zijn op het
reactiemechanisme, maar wel op de isomerisatie-effici¨entie (lager bij lage pH). Uit ultrasnelle vibrationele spectroscopie blijkt dat isomerisatie van de chromofoor leidt to een erg snelle conformatieverandering van de eiwitstructuur (sneller dan 10ps). Hoofdstuk 3 is een studie van de foto-isomerisatie in proteorhodopsine. Met driepuls pomp-dump-meet spectroscopie, is verandering van de moleculen in de electronische grondtoestand bestudeerd. Bij deze experimenten en brengt een pomppuls moleculen in de eerste fasen van de fotocyclus. Deze moleculen kunnen vervolgens worden teruggebracht naar de grondtoestand, met een specifieke dumppuls op een specifieke tijd na de pomppuls. Op deze manier hebben we een tussenproduct van de electronische grondtoestand gevonden. Dit tussenproduct is een chromofoor waarin isomerisatie niet succesvol was. Het toevoegen van dit tussenproduct aan het kinetisch schema leidde to meer consistente spectra van de aangeslagen toestand van retinal, en tot een nauwkeurigere schatting van het rendement van isomerisatie (Φ = 0.4 bij pH 6). In hoofdstuk 4 bestuderen we de foto-dissociatie en het herbinden van koolstofmonoxide (CO) aan de heem-cofactor in cytochroom P450. Excitatie met blauw licht leidt tot het verbreken van de covalente binding tussen het heem en de CO ligand. We hebben het verloop van deze foto-dissociatie reactie gevolgd via de spectrale veranderingen van het heem in het zichtbare deel van het spectrum, en van die van CO in het mid-IR. De foto-dissociatie reactie had een opbrengst van 100%, en CO herbindt op een nanoseconde tijdsschaal aan heem. Dit is een aanwijzing dat voordat CO en heem recombineren, CO gebonden zit binnenin het eiwit. Met behulp van de kristalstructuur van het eiwit hebben we plaatsen in de eiwitmatrix ge¨ıdentificeerd waar CO moleculen zouden kunnen binden. Hoofdstukken 5 en 6 gaan over foto-isomerisatie in fotoactief geel eiwit (PYP). Absorptie van een foton door de PYP chromofoor p-coumarine zuur, leidt to transcis isomerisatie om de C=C dubbele binding en het verbreken van de waterstofbrug tussen de C=O van de chromofoor en de N-H van Cys69. Wanneer isomerisatie mislukt, vervalt de chromofoor naar de grondtoestand via een tussenproduct met een vervormde cis conformatie. Om te bepalen hoe het eiwit de uitkomst van de lichtgedreven reactie stuurt, hebben we de isomerisatie bestudeerd in een reeks PYP mutanten, waarin proline 68 vervangen is door verschillende hydrofobe aminozuren. De isomerisatie is bestudeerd met ultrasnelle spectroscopie met detectie in het zichtbare
en het mid-IR deel van het electromagnetisch spectrum (hoofdstukken 5 en 6), met moleculaire dynamica simulaties van de mutanten in de grondtoestand (hoofdstuk 5), en met pomp-dump-meet spectroscopie (hoofdstuk 6). Het blijkt dat door zijn stijve structuur, proline 68 betrokken is bij het optimaliseren van de reactieopbrengst. Het vervangen van proline 68 door andere aminozuren verstoort het waterstofbrugnetwerk rondom de chromofoor, en maakt ruimte beschikbaar voor water moleculen in de chromofoor-bindende holte van het eiwit. De resultaten in dit proefschrift vergroten ons begrip van het functioneren van proteorhodopsine, fotoactief geel eiwit (PYP) en cytochroom P450. We illustreren dat het toepassen van complementaire tijdsopgeloste technieken inzicht biedt in lichtge¨ınduceerde veranderingen op het niveau van individuele atomen en chemische groepen binnen het eiwit. Zodoende biedt het inzicht in beginselen van de biologisch relevante respons. Een gedetailleerd begrip van de beginselen van eiwitfunctie heeft potenti¨ele toepassingen in biotechnologie, geneeskunde en biologie.
List of Publications Light on biological activity. Control of water access and hydrogen bonds in Photoactive Yellow Protein, Alisa B. Rupenyan, Jocelyne Vreede, Ivo. H.M. van Stokkum, Marijke Hospes, John T.M. Kennis, Klaas J. Hellingwerf and Marie Louise Groot; submitted to Nature Molecular and Structural Biology Reaction pathways of photoexcited retinal in Proteorhodopsin studied by pumpdump-probe spectroscopy, Alisa Rupenyan, Ivo H.M. van Stokkum, Jos C. Arents, Rienk van Grondelle, Klaas J. Hellingwerf and Marie Louise Groot; submitted to Journal of Physical Chemistry B CO photodissociation in Cytochrome P450 studied by sub-picosecond visible and mid-IR spectroscopy, Alisa Rupenyan, Jan Commandeur, Marie Louise Groot; Biochemistry, 2009,48 (26), pp 6104-6110 Characterization of the Primary Photochemistry of Proteorhodopsin with Femtosecond Spectroscopy, Alisa Rupenyan, Ivo H. M. van Stokkum, Jos C. Arents, Rienk van Grondelle, Klaas Hellingwerf, and Marie Louise Groot; Biophysical Journal, 2008, 94(10): 4020-4030 Investigation of the protonation site in the dialanine peptide by infrared multiphoton dissociation spectroscopy, Bruno Lucas, Gilles Gr´egoire, Jo¨el Lemaire, Philippe Maitre, Jean-Michel Ortega, Alisa Rupenyan, Bernd Reimann, Jean Pierre Schermann and Charles Desfran cois, Phys. Chem. Chem. Phys., 2004, 6, 2659 Raman spectroscopy studies of the OH stretching band of aqueous solutions of short poly(oxyethyelene)C2E2C2, A. Rupenyan, K. Gyamchev, Mircho Georgiev, N. Goutev, Zh. Nickolov, Georgy K. Georgiev, and H. Matsuura; Proceedings of SPIE 5830, 251 (2005)
