NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides In Vitro diagnosztikai alkalmazásra
Termékkód:
708200, 708205 508200.10, 508205.20, 508205.80
CLIA Bonyolultság: magas
Javasolt alkalmazás NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae egy indirekt immunfluorescens assay a dupla szálú DNS (dsDNA) ellenes antitestek szűrésére és szemikvantitatív meghatározására humán szérumban. Az anti- dupla szálú DNS antitestek kimutatása más szerológiai vizsgálatok eredményével és a klinikai adatokkal együtt segíti a szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnózisának felállítását.
A teszt összegzése és magyarázata
A NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae teszt egy indirekt immunfluorescens antitest vizsgálati módszer, amelyben a Crithidia luciliae hemoflagellata szerepel szubsztrátként. Ez az egysejtű szervezet egy óriás mitochondriumot tartalmaz, amelyben egy igen tömör cirkuláris dsDNA található.1 Ez a dsDNA tömeg, amelyet kinetoplastnak neveznek, hisztontól és egyéb, az emlős szövetekben előforduló nuclearis antigénektől mentesnek tűnik.1,2 Így ez a sejt a dsDNA autoantitestek kimutatására érzékeny és specifikus szubsztrátként szolgál. Autoantitestek dsDNA ellen szinte kizárólag szisztémás lupus erythematosusban (SLE) szenvedő betegekben fordulnak elő, és így marker antitestnek tekinthetők. A dsDNA ellenes autoantitestek jelenléte bekerült a szisztémás lupus erythematosusnak az Arthritis and Rheumatism Association egyik albizottsága által 1982-ben átdolgozott diagnosztikai kritériumai közé (1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus).3 Habár az általánosan használt antinucleáris antitest (ANA) teszt az SLE és más kötőszöveti betegségek érzékeny szűrőtesztje, semmilyen értelemben nem tekinthető specifikusnak SLE-re. Emiatt minden ANA pozitív mintát tovább kell vizsgálni dsDNA-ra specifikus antitestek kimutatása céljából. A dsDNA ellenes antitestek jelenléte erősen utal SLE fennállására, az ilyen antitestek hiánya azonban nem zárja ki minden esetben az SLE diagnózisát. Az évek során a dsDNA ellenes antitestek kimutatására változatos módszereket alkalmaztak. Ezek között megtalálható a komplement fixáció4, passzív agglutináció5 és a RIA.6-8 A C. luciliae használatán alapuló dsDNA teszt fő előnye a specificitása, ami a kinetoplastban szorosan feltekert cirkuláris dsDNA természetének köszönhető.9-11 Ez a tulajdonság egy marker antitest vizsgálati módszer szempontjából életbevágóan fontos.
A módszer elve
Az indirekt immunfluorescens eljárásban a mintákat az antigén szubsztráttal inkubáljuk, majd a feleslegben maradt antitestet mosással eltávolítjuk. Ezután a szubsztrátot specifikus, fluoresceinnel jelölt konjugátummal inkubáljuk, és azután a reagens felesleget ismét lemossuk. Fluorescens mikroszkóppal megtekintve az autoantitest pozitív minták almazöld fluorescenciát mutatnak a sejt vagy a magvak azon területeinek megfelelően, ahol az autoantitest megkötődött.
1
Reagensek 1.
Crithidia luciliae (dsDNA) lemezek, 12 mérőhely/lemez vagy 6 mérőhely/lemez, szárító betéttel
Csak kitekben: 2. Anti-Humán IgG Konjugátum (kecske), fluoresceinnel jelölve, pufferben, 0.09% nátrium azidot tartalmaz 3. dsDNA Positive (dsDNA pozitív kontroll) 1 üveg puffer, benne 0.09% nátrium azid és humán szérum antitestek dsDNA antigénnel szemben, előhígítva 4. IFA System Negative Control (IFA Negatív Kontroll), 1 üveg puffer, 0.09% nátrium azidot tartalmaz és nincsenek benne humán szérum antitestek dsDNA ellen, előhígítva 5. PBS II koncentrátum (40x-es töménységű) 6. Mounting Medium (rögzítő médium) 0.09% nátrium aziddal 7. Coverslips (fedőlemezek)
Veszélyforrások 1.
2.
3. 4.
Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, a dsDNA pozitív kontroll és az IFA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő.12 Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást.
Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. 2. 3. 4.
5.
6.
Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült (Csak kitekben). A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. Az IFA lemezek nem tökéletes vagy hatástalan mosása magas hátteret okozhat. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a használatban lévő mikroszkóp lámpájának fényereje, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás alapossága és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt.
2
Tárolási körülmények 1. 2.
A kit és lemez valamennyi reagensét tárolja 2-8°C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. A hígított PBS II puffer 2-8°C között tartva 4 hétig használható.
A minta vétele és kezelése
Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az CLSI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8°C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20°C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni.
A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok (kitek) 708200 10 1 1 1 1 1 1
6 mérőhelyes dsDNA Crithidia luciliae szubsztrát lemez 4 mL FITC Anti-Humán IgG Konjugátum 0.5mL dsDNA pozitív kontroll 0.5mL IFA Negatív Kontroll 25mL PBS II Koncentrátum (40x –es koncentráció) 7mL Mounting Medium (rögzítő médium) 10 fedőlemez
708205 20 1 1 1 2 1 1
12 mérőhelyes dsDNA Crithidia luciliae szubsztrát lemez 15 mL FITC Anti-Humán IgG Konjugátum 0.5mL dsDNA pozitív kontroll 0.5mL IFA Negatív Kontroll 25mL PBS II Koncentrátum (40x –es koncentráció) 7mL Mounting Medium (rögzítő médium) 20 fedőlemez
A kitben rendelkezésre álló anyagok (lemez) 508200.10 10 x dsDNA Crithidia luciliae szubsztrát lemez (6 mérőhelyes) 508205.20 20 x dsDNA Crithidia luciliae szubsztrát lemez (12 mérőhelyes) 508205.80 80 x dsDNA Crithidia luciliae szubsztrát lemez (12 mérőhelyes)
3
További szükséges anyagok a kiten kívül
Mikropipetták 15 - 1000µL beméréséhez Desztillált vagy ionmentesített víz Összenyomható műanyag flakonok vagy Pasteur pipetták Nedveskamra 1L-es edény (a PBS II hígításához) Coplin jar (jól zárható speciális tartály, festéshez) Fluorescens mikroszkóp 495nm-es gerjesztési és 515nm-es emissziós szűrővel
Módszer
Mielőtt hozzákezd: 1. 2.
3.
Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26oC) A PBS II koncentrátum hígítása: FONTOS:Hígítsa a PBS II koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a PBS II koncentrátumos üveg tartalmát 975 mL desztillált vagy ionmentesített vízhez adja, és alaposan összekeveri. A PBS II puffert használja a minták hígítására, és mosópufferként. A hígított puffer 4 hétig stabil 2 – 8°C között tartva. A betegek mintáinak hígítása: a. Előszűrés: Hígítsa a betegek mintáit 1:10 arányban a hígított PBS II pufferrel (azaz adjon 100µL szérumot 900 µL PBS II pufferhez). b. Titrálás: Készítsen tovafutó 2-szeres (vagyis felező) sorozathígítást minden egyes pozitív minta eredeti, szűrés céljára készített hígításából a hígított PBS II pufferrel (azaz 1:20, 1:40....1:640 arányban)
A módszer kivitelezése 1.
2.
3.
4. 5. 6.
A szubsztrát lemezek előkészítése: Hagyja a lemezeket szobahőmérsékletűre melegedni, mielőtt a tasakból kiveszi. Jelölje meg ceruzával, és helyezze egy alkalmas nedveskamrába. Cseppentsen egy-egy csepp (20-25µL) hígítatlan pozitív és negatív kontrollt az 1-es illetve a 2-es mérőhelyre. A maradék helyekre tegyen egy-egy csepp (20-25µL) hígított beteg-mintát. A lemezek inkubálása: Inkubálja a lemezeket 30 percig nedveskamrában (egy megnedvesített papírtörlő egy zárt műanyag vagy üveg tartály aljára simítva képes fenntartani a megfelelő páratartalmat). Ne engedje a szubsztrátot kiszáradni a teszt kivitelezése közben. A lemezek mosása: Az inkubáció után óvatosan mossa le a szérumot a lemezről hígított PBS II pufferrel, összenyomható műanyag flakon, vagy Pasteur pipetta segítségével. Úgy irányítsa a lemezt és a PBS II puffer folyadéksugarat, hogy minimális legyen a minták mosással okozott átszennyeződése az egyes mérőhelyek között. Ne irányítsa a folyadéksugarat közvetlenül a szubsztrátra, mert az könnyen megsérülhet. Helyezze a lemezeket további 5 percre hígított PBS II pufferbe egy Coplin edényben. A fluorescens konjugátum felvitele: Rázza le a fölösleges PBS II puffert a lemezről. Tegye vissza a lemezt a nedveskamrába, és azonnal fedje minden egyes mérőhely tartalmát egy-egy csepp fluorescens konjugátummal. Inkubálja a lemezeket újabb 30 percig. A lemezek mosása: Ismételje a 3-ik lépést. Fedés fedőlemezzel: A fedőlemezek elhelyezésének technikája laboratóriumonként változó; de javasoljuk az alábbi eljárást: a. Helyezzen egy fedőlemezt egy papírtörlőre. b. Vigyen fel rögzítő médiumot folyamatos vonalban a fedőlemez alsó szélére. c. Rázza le a PBS II felesleget, és érintse a tárgylemez alsó szélét a fedőlemez széléhez. Óvatosan süllyessze a tárgylemezt a fedőlemezre úgy, hogy a rögzítő médium a lemez felső éle felé tudjon folyni, levegőbuborékok képződése vagy csapdába kerülése nélkül.
4
Minőség-ellenőrzés
A dsDNA pozitív kontrollt és az IFA negatív kontrollt fel kell tenni minden egyes lemezre, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -70°C-on történő tárolásával. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. 1. A hígítatlan dsDNA pozitív kontroll ≥ 2+ kell legyen. 2. Az IFA negatív kontrollnak negatív eredményt kell adnia.
Az eredmények értékelése
Negatív reakció. A mintát akkor tekinthetjük negatívnak, ha a specifikus kinetoplast festődés gyengébb, mint az IFA negatív kontroll festődése.Más struktúrák, mint például a basalis testecske (basal body), a flagellum vagy a mag festődése a kinetoplast egyidejű festődése nélkül negatív eredménynek tekintendő a dsDNA reaktivitás szempontjából. Pozitív reakció. A mintát akkor tekinthetjük pozitívnak, ha specifikus kinetoplast festődés, vagy kinetoplast plusz mag-festődés figyelhető meg, és ez nagyobb, mint a negatív kontrollban. Valamennyi pozitív mintát végpontig kell titrálni a sorozatos 2-szeres hígítások használatával. Határozza meg a fluorescencia mértékét vagy intenzitását a következő kritériumok alapján: 4+ Ragyogó almazöld fluorescencia 3+ Fényes almazöld fluorescencia 2+ Világosan megkülönböztethető pozitív fluorescencia 1+ A leggyengébb specifikus fluorescencia, ami még lehetővé teszi a kinetoplast festődés egyértelmű megkülönböztetését a háttér-fluorescenciától.
A módszer korlátai 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
A vizsgálatot végző személynek a lemezek értékelésekor fel kell ismernie az antigén túlsúly lehetséges hatásait, és az esetleg előforduló nem-dsDNA festődési mintázatot. Változatos külső tényezők befolyásolják a teszt érzékenységét, többek között az értékeléshez használt fluorescens mikroszkóp típusa, az izzó ereje és életkora, az alkalmazott nagyítás, a szűrők rendszere és a vizsgálatot végző személy. Ha az 515 nm-re korlátozott szűrő helyett egy szélesebb hullámhossz-sávot átengedő szűrőt használ, a festődésben nagyobb arányban találkozhat műtermékkel A lemezek jelölésére kizárólag ceruzát használjon. Bármilyen más íróeszköz festődési hibát, műterméket okozhat. A lemezek mosására használt coplin tartályoknak bármilyen kis festékmaradványtól mentesnek kell lenniük. A festékmaradványt tartalmazó coplin jar használata festődési műterméket okozhat. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva.
5
A külön árúsított lemezek “Analit specifikus reagens” besorolásúak. Analítikai és működési jellemzői nincsenek megállapítva, kivéve ha a NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae készlet részét képezi.
Várható értékek
A NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae szubsztrát használatával, különböző kötőszöveti betegségekben szenvedő páciensek és 200 random véradó mintáit vizsgálták. Az eredmények az alábbiakban láthatók: Páciens csoport Minták száma száma SLE 105 Gyógyszer-indukált Lupus 24 Rheumatoid Arthritis 40 Scleroderma 24 Dermatomyositis 14 Sjögren Szindróma 14 Egészségesek 200
NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae pozitívak 42 0 0 0 0 0 0
6
Hivatkozások 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
Aarden LA, de Groot ER, Feltkamp TE: Immunology of DNA. III. Crithidia luciliae, a simple substrate for the detection of anti-dsDNA with immunofluorescence techniques. Ann. NY Acad. Sci. 254: 505-515, 1975. Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: 811-814, 1977. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. Arana R, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 46: 1867-1882, 1967. Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. J. Immunol. Methods 3: 287-300, 1973. Aarden LA, Lakmaker F, de Groot ER, et al.: Detection of antibodies to DNA by radioimmunoassay and immunofluorescence. Scand. J. Rheu. Suppl. 11: 12-19, 1975. Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassay for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: 534-543, 1981. Pincus T, Schur P, Rose JA, et al.: Measurement of serum DNA-binding activity in systemic lupus erythematosus. The New England J. of Medicine 281: 701-705, 1969. Somerfield SD, Roberts MW, Booth RJ: Double-stranded DNA antibodies: comparison of four methods of detection. J. Clin. Path. 34: 1032-1035, 1981. Sontheimer RD, Gilliam JD: An immunofluorescence assay for double-stranded DNA antibodies using the Crithidia luciliae kinetoplast as a double-stranded DNA substrate. J. Lab Clin. Med. 91: 550-558, 1978. Stingl G, Meingassner JG, Swelty P, Knapp W: An immunofluorescence procedure for the demonstration of antibodies to native, double-stranded DNA and of circulating DNA-anti DNA complexes. Clin. Immunol. Immunopath. 6: 131-140, 1976. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009
7
A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America
Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628200HUN
December 2012 Revision 3
NOVA Lite és INOVA Diagnostics, Inc. bejegyzett védjegyei. Copyright 2012 Minden jog fenntartva©
8
