Studium dlouhých nekódujících RNA u nádoru močového měchýře

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Studium dlouhých nekódujících RNA u nádoru močového měchýře Diplomová práce

Renata Kleinová

VEDOUCÍ PRÁCE: Doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Brno 2016

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Renata Kleinová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Studium dlouhých nekódujících RNA u nádoru močového měchýře

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce:

Doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Akademický rok:

2015 / 2016

Počet stran:

91

Klíčová slova:

Nádor močového měchýře, dlouhé nekódující RNA, TUG1

Bibliographic Entry Author:

Renata Kleinová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis:

Study of long non-coding RNAs in bladder cancer

Degree Programme:

Experimental Biology

Field of Study:

Molecular Biology and Genetics

Supervisor:

Doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Academic Year:

2015 / 2016

Number of Pages:

91

Keywords:

Bladder cancer, long non-coding RNA, TUG1

Abstrakt Nádor močového měchýře je nejčastějším onkologickým onemocněním močového ústrojí. Podle toho, zda nádor prorůstá do svaloviny močového měchýře, se tyto nádory dělí na invazivní a neinvazivní. Prognóza pacientů s neinvazivním typem je většinou příznivá, avšak pacienti často trpí relapsy onemocnění. Invazivní nádor močového měchýře je naproti tomu provázen špatnou prognózou s 5letým přežíváním méně než 50 %. Klíčem k novým terapeutickým přístupům je objasnění složité molekulární patogeneze stojící za touto malignitou. Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou zapojeny do regulace genové exprese a hrají důležitou roli i v molekulární patologii karcinomu močového měchýře. V této studii byla provedena expresní analýza 6 vybraných lncRNA (TUG1, HOTAIR, MALAT1, UCA1, GAS5, MEG3) u párových vzorků nádorové a nenádorové tkáně močového měchýře získaných od 49 pacientů podstupujících chirurgický zákrok pro invazivní karcinom močového měchýře. Hladina TUG1 (p < 0,0001) a HOTAIR (p = 0,0006) byla signifikantně zvýšená v tumoru oproti nenádorové tkáni, zatímco MEG3 (p = 0,044) byla v nádoru významně snížená. Míra exprese TUG1 (p = 0,0102) a MALAT1 (p = 0,0125) také korelovala s celkovým přežitím pacientů. Experimentální umlčení hladiny TUG1 u buněčné linie T-24 odvozené od karcinomu močového měchýře vedlo k významnému snížení proliferace a migrace buněk. Domníváme se proto, že lncRNA TUG1 by mohla sloužit nejen jako nový diagnostický a prognostický biomarker invazivního karcinomu močového mechýře, ale také jako potenciální terapeutický cíl.

Abstract Bladder cancer is the most common cancer of the urinary tract. Based on the invasivity of tumour into the muscle layer, bladder cancer can be divided into two major groups. Nonmuscle invasive bladder cancers have favourable prognosis but frequently recur. Muscle invasive bladder cancers have poor prognosis with five-year survival <50%. To improve treatment, detailed understanding of the bladder cancer pathogenesis and its molecular biology is required. Long non-coding RNAs are important regulators of gene expression and thus play a critical role in the molecular pathology of the bladder cancer.

In this thesis, we analysed expressions of 6 lncRNAs (TUG1, HOTAIR, MALAT1, UCA1, GAS5, MEG3) in 49 bladder cancer tissue samples and normal adjacent tissues. The expression levels of TUG1 (p < 0,0001) and HOTAIR (p = 0,0006) were significantly up-regulated in bladder cancer tissues compared with normal adjacent tissues, whereas expression of MEG3 (p = 0,044) was significantly down-regulated in bladder tissues. Upregulated TUG1 (p = 0,0102) and MALAT1 (p = 0,0125) negatively correlated with overall survival time of patients. Cell proliferation inhibition and decreased motility were observed in TUG1 small interfering RNA-transfected bladder carcinoma T-24 cells. Our data suggest that TUG1 may serve as a new prognostic and diagnostic biomarker and it can be used as a potential therapeutic target for treating human bladder cancer.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému vedoucímu diplomové práce doc. RNDr. Ondřeji Slabému, Ph.D. a svému odbornému konzultantovi Mgr. Robertu Iljevovi.

Obsah Seznam zkratek ............................................................................................................. 12 1

2

3

4

Nádor močového měchýře ..................................................................................... 16 1.1

Molekulární patologie karcinomu močového měchýře .................................. 16

1.2

Molekulární podtypy nádorů močového měchýře .......................................... 22

Dlouhé nekódující RNA ......................................................................................... 23 2.1

Klasifikace lncRNA ........................................................................................ 24

2.2

Funkce lncRNA .............................................................................................. 26

lncRNA a jejich role v patogenezi nádorů močového měchýře ............................. 28 3.1

Supresorové lncRNA u nádorů močového měchýře ....................................... 28

3.2

Onkogenní lncRNA u nádorů močového měchýře ......................................... 29

3.3

LncRNA a jejich zapojení do EMT u nádorů močového měchýře ................. 32

Cíle diplomové práce ............................................................................................. 35 4.1

5

Dílčí cíle:......................................................................................................... 35

Materiál a metody................................................................................................... 36 5.1

Soubor pacientů .............................................................................................. 36

5.2

Homogenizace vzorků a izolace RNA ............................................................ 37

5.2.1 Homogenizace tkáně ................................................................................. 37 5.2.2 Izolace RNA .............................................................................................. 38 5.3

Reverzní transkripce (RT)............................................................................... 38

5.4

Kvantitativní real-time PCR (qRT-PCR) ........................................................ 40

5.5

Statistické zpracování dat ............................................................................... 42

5.6

Kultivace buněčné linie T-24 (ATCC® HTB-4™) ....................................... 42

5.7

Růstová křivka ................................................................................................ 43

5.8

Transfekce ....................................................................................................... 44

5.9

Měření expresních hladin lncRNA po transfekci ........................................... 46

5.10

Viabilita ....................................................................................................... 48

5.10.1 Počítání buněk ......................................................................................... 49

5.10.2 MTT test .................................................................................................. 50 5.11

Scratch wound assay ................................................................................... 50

5.12

Analýza buněčného cyklu a apoptózy metodou průtokové cytometrie....... 51

5.12.1 Analýza buněčného cyklu ....................................................................... 52 5.12.2 Analýza apoptózy .................................................................................... 53 6

Výsledky................................................................................................................. 54 6.1

Výtěžek RNA izolované z tkáně ..................................................................... 54

6.2

Stanovení exprese vybraných lncRNA v párových vzorcích nádorové

a nenádorové tkáně močového měchýře ............................................................................... 54 6.2.1 Výběr vhodné endogenní kontroly ............................................................ 54 6.3 tkáň

Na základě expresních hladin lncRNA je možné odlišit nádorovou a zdravou 56

6.4

Korelace expresních hladin lncRNA s prognózou onemocnění ..................... 58

6.4.1 Souvislost exprese lncRNA a klinického stádia onemocnění ................... 58 6.4.2 Analýza bezpříznakového přežívání a celkového přežití pacientů ........... 59 6.5

Stanovení rychlosti proliferace buněčné linie T-24 ........................................ 63

6.6

In vitro funkční testy ....................................................................................... 63

6.7

Optimalizace transfekce .................................................................................. 64

6.8

Vliv inhibice TUG1 na celkovou viabilitu buněk T-24 .................................. 65

6.8.1 Vliv inhibice TUG1 na metabolickou aktivitu buněk T-24 ...................... 65 6.8.2 Vliv snížení hladiny TUG1 na buněčnou proliferaci ................................ 65 6.9

Vliv snížené hladiny TUG1 na migraci buněk T-24....................................... 66

6.10

Vliv hladiny TUG1 na regulaci buněčného cyklu ....................................... 68

6.11

Vliv hladiny TUG1 na apoptózu ................................................................. 68

7

Diskuze ................................................................................................................... 70

8

Souhrn .................................................................................................................... 75

9

Summary ................................................................................................................ 76

Přehled literatury .......................................................................................................... 77

Seznam obrázků ............................................................................................................ 90 Seznam tabulek: ............................................................................................................ 91

Seznam zkratek ATM

Gen mutovaný u syndromu Ataxia-telangiestasia (Ataxia-telangiestasia mutated)

C/EBPα

CCAAT/enhancer binding protein α

CAGE

cap-analysis gene expression

CCL1

(C-C motif) ligand 1

CCND1, 3

cyklin D1, 3

CDK6

Cyklin-dependentní kináza 6

CDKN2A, B Inhibitor cyklin-dependentní kinázy 2A, B (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, B) cDNA

komplementární DNA

CREB

cAMP responsive element binding protein

CREBBP

CREB-binding protein

DMSO

Dimethylsulfoxid

E2F3

E2F transcription factor 3

EED

Embryonic ectoderm development

EGFR

Receptor epidermálního růstového faktoru (Epidermal growth factor receptor)

EMT

Epiteliálně-mezenchymální tranzice

ERBB2

Homolog 2 virového onkogenu v-erb-b2 izolovaného z erytroblastoidní leukemie (erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2; Her2/Neu)

ERCC2

Excision repair cross-complementation group 2

ERK1, 2

Kinázy regulované extracelulárním signálem (extracellular signal-regulated kinases 1,2)

ESPL

Extra spindle bodies homologue 1

EZH2

Enhancer of zeste 2

FGF

Fibroblastový růstový faktor (Fibroblast growth factor)

FGFR3

Receptor fibroblastového růstového faktoru 3 (Fibroblast growth factor receptor 3)

GAS5

Growth arrest-specific 5

GHET1

Gastric carcinoma high expressed transcript 1

Hk2

Hexokináza 2

HOTAIR

HOX antisense intergenic RNA

KDM6A

Lysine-specific demethylase 6A

KLF2

Kruppel-like factor

lncRNA

Dlouhé nekódující RNA (long noncoding RNA)

LSD1

Lysine (K)-specific demethylase 1A

MALAT1

Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1

MDC1

Mediator of DNA damage checkpoint protein 1

MDM2

E3 ubikvitin protein-ligáza (Murine Double MInute 2)

MEG3

Maternally Expressed Gene 3

MET

Proto-oncogene, receptor tyrosine kinase

MIBCs

Invazivní nádory močového měchýře (Muscle-invasive bladder cancers)

miRNA

microRNA

MLL2

Mixed-lineage leukaemia 2

MM

Močový měchýř

mTOR

Mechanistic target of rapamycin

MTT

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromidu

NIPBL

Nipped-B homolugue

Nkd1

Naked cuticle homolog 1

NMIBC

Neinvazivní nádory močového měchýře (Non-muscle –invasive bladder cancers)

NMM

Nádory močového měchýře

p300

E1A-binding protein p300

PCAT-1

Prostate cancer-associated transcript 1

PI3K

fosfatydylinositol 3-kináza (phosphatidylinositol-3-kinases)

PIK3CA

Katalycká podjednotka fosfatydylinositol 3-kinázy (Phosphatidylinositol-4,5bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha)

PIP2

Fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate)

PIP3

Fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfát (Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate)

piRNA

RNA interagující s Piwi proteiny (piwi-interacting RNA)

PLCγ

Fosfolipáza Cγ (Phosphoinositide phospholipase C)

PRC2

Polycomb repressive complex 2

PTEN

Fosfatázový a tenzinový homolog (Phosphatase and tensin homolog)

PTCH1

Protein patched homolog 1 (Patched 1)

RB1

Retinoblastoma 1

RON

Recepteur d'Origine Nantais

Scr

Scrambled siRNA

siRNA

Malé interferující RNA (small interfering RNA)

STAG2

Stromální antigen (Stromal antigen 2)

STAT3

Transduktor signálu a aktivátor transkripce 3 (Signal transducer and aktivátor of transcription 3)

SUZ12

suppressor of zeste 12

TACC3

Transforming acid coiled coil 3

TSC1

Tuberous sclerosis 1

TUG1

Taurine Up-regulated Gene 1

UBC1

Up-regulated in bladder cancer 1

UCA1

Urothelial Cancer Associated 1

WIF-1

Wnt inhibitory factor-1

Wnt6

Wingless-type MMTV integration site family member 6

ZEB2

Zinc finger E-box binding homeobox 2

1 Nádor močového měchýře Nádory močového měchýře (NMM) se s celosvětovou incidencí 380 000 nových případů ročně řadí na první místo ve výskytu mezi malignitami močového ústrojí. Toto nádorové onemocnění je nejčastěji diagnostikováno u pacientů okolo 65 let a to častěji u mužů než u žen. Prokazatelně vyšší frekvence nádorů močového měchýře je zaznamenána ve vyspělých zemích, což je dáváno do souvislosti s etiologickými faktory podílejícími se na vzniku tohoto nádoru, jako je především kouření, chronické choroby močového traktu a užívání některých cytostatik a analgetik (Ferlay et al., 2010). U více než 90 % případů se jedná o tumory, které vznikly z přechodného epitelu močového měchýře, tzv. urotelu. Ty se potom z hlediska invazivity dělí do dvou hlavních skupin. Až 70 % tvoří neinvazivní nádory NMIBCs (Non-muscle–invasive bladder cancers), které nenarušují svalovou vrstvu močového měchýře, zřídka progredují (10 - 15 %) a celková prognóza bývá příznivá, protože 90 % pacientů přežívá déle jak 5 let. Léčba spočívá především v chirurgickém odstranění nádorového ložiska, popřípadě v kombinaci s adjuvantní imunoterapií nebo chemoterapií. Pacienti však trpí častými recidivami, a je proto nezbytné hledat nové, především neinvazivní přístupy v monitorování těchto pacientů. Druhou skupinu představují invazivní nádory MIBCs (Muscle-invasive bladder cancers) prorůstající svalovinu močového měchýře. Terapie je založena zejména na radikální cystektomii spočívající v kompletním chirurgickém odstranění močového měchýře. I přes tuto radikální léčbu je prognóza pacientů nepříznívá s 5letým přežítím méně než 50 %, což je způsobeno hlavně progresí nádoru a následným rozvojem metastáz (Adam et al., 2010; Grivas et al.; 2015; Knowles a Hurst 2015).

1.1 Molekulární patologie karcinomu močového měchýře Molekulární patologie karcinomu močového měchýře nebyla po dlouhou dobu předmětem intenzivního zkoumání. Je ale zřejmé, že právě detailní objasnění komplexní molekulární podstaty této heterogenní skupiny nádorů bude klíčem k novým terapeutickým přístupům. U NIMBC je výzkum zaměřen především na vývoj neinvazivních monitorovacích metod, které by s velkou specifitou a senzitivitou byly schopné detekovat recidivy, případně možnou progresi nádoru. V případě MIBCs se výzkumy zabývají zejména inovací komplexní

16

léčby a identifikací sady biologických markerů, která by umožnila přesnější stratifikaci pacientů před konvenční chemoterapií (Grivas et al., 2015; Knowles a Hurst 2015). NMIBCs a MIBCs se liší nejenom z hlediska histologie, ale i molekulárním pozadím stojícím za každou z těchto malignit. NIMBCs jsou typické téměř diploidním karyotypem pouze s několika málo genomickými změnami, zatímco MIBCs jsou často aneuploidní s mnoha různými alteracemi (Cancer Genome Atlas Research Network, 2014; Morrison et al., 2014). U MIBC byly rovněž identifikovány četné mutace v genech zapojených do DNA kontrolních a reparačních mechanismů. Jedním z nejčastěji inaktivovaných genů je ATM (ataxia-telangiestasia mutated), což je serin/threonin protein kináza aktivovaná DNA dvouřetězcovými zlomy, která spouští kaskádu reakcí vedoucí k zástavě buněčného cyklu, DNA opravě, případně apoptóze, nebo gen ERCC2 (excision reapir cross-complementation group 2) podílející se na nukleotidové excizní opravě (Knowles a Hurst, 2015). Další skupinou mutacemi často zasažených genů jsou geny zapojené do koheze a segregace sesterských chromatid. STAG2 (stromal antigen 2), který kóduje podjednotku kohesinu, nese mutaci skoro ve 40 % případů NMIBCs, méně pak u MIBCs (Solomon et al., 2013). Mezi další, často mutacemi postižené geny podílející se na kohezi a segregaci chromatid, patří také STAG1 (stromal antigen 1), NIPBL (nipped-B homolugue), ESPL (extra spindle bodies homologue 1) (Guo et al., 2013). Tyto defekty potom vedou k různým chromozomovým aberacím. Delece chromozomu 9 byla detekována více než u poloviny případů NMIBCs i MIBCs a zasahuje některé kandidátní supresorové geny. Příkladem jsou CDKN2A a CDKN2B (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, B), kódující významné inhibitory buněčného cyklu p16, p14ARF a p15 (Williamson et al., 1995) nebo inhibitor signalizace Hedgehog PTCH1 (patched 1) (Aboulkassim et al., 2003) a TSC1 (tuberous sclerosis 1). Tento gen je v komplexu TSC1-TSC2 zapojen do negativní regulace signalizace mTOR, která je součástí dráhy PI3K (fosfatydylinositol 3-kináza), mající klíčovou roli v kontrole proteinové syntézy a buněčného růstu (Sjödahl et al., 2011). Předpokládá se, že některé geny postižené delecí chromozomu 9 jsou haploinsuficientní, proto i ztráta jedné alely může mít přímý patologický dopad (Knowles a Hurst, 2015). Více než 80 % neinvazivních nádorů močového měchýře nese aktivační bodovou mutaci v genu pro FGFR3 (fibroblast growth factor receptor 3), člena rodiny tyrozinproteinkinázových receptorů FGFR, jejichž ligandy jsou FGF (fibroblast growth factor) Detekce této mutace je dávána do souvislosti s dobrou prognózou pacientů (Hernández et al., 17

2006; Tomlinson et al., 2007) a spolu s delecí chromozomu 9 pravděpodobně hraje centrální roli v časných stádiích patogeneze NMM (van Oers et al., 2006; Zieger et al., 2005). V normálním uroteliu je FGFR3 exprimován především ve své IIIb transmembránové izoformě nebo sestřihové variantě FGFR3-∆8-10, která postrádá transmembránovou doménu a funguje jako negativní regulátor signalizace FGF1, protože vyvazuje růstové faktory FGF1, které potom nemohou spustit signalizační kaskádu skrze normální transmembránový FGFR3 receptor. U NMM jsou ale obě tyto varianty redukovány s převažující expresí izoformy FGFR-IIIc (Tomlinson et al., 2005). Tato sestřihová varianta je schopna vázat širší spektrum ligandů FGF, což potom vede ke zvýšení celkové aktivity této mitogenní dráhy (Ornitz et al., 1996). Dokonce i NMM, u kterých nebyla detekována žádná mutace v FGFR3, vykazovaly zvýšenou expresi tohoto receptoru (Tomlinson et al., 2007), což může být způsobeno mimo jiné i sníženými hladinami některých mikroRNA (miR-99a, miR-100), které inhibují expresi FGFR3 (Catto et al., 2009). U některých případů NMM byl také identifikován konstitutivně aktivní fúzní gen FGFR3-TACC3 (transforming acid coiled coil 3) (Williams et al., 2013). FGFR1, další člen receptorové rodiny FGFR, je pravděpodobně také zapojen do molekulární patogeneze NMM. Jeho zvýšené hladiny byly detekovány u obou podtypů NMM. U normálních uroteliálních buněk měla FGFR1 stimulace za následek pokles apoptózy a zvýšení proliferace (Tomlinson et al., 2009). Aktivace FGFR1 v nádorových liniích zase vedla k indukci MAPK a PLCγ (fosfolipáza Cγ) řízené epiteliálně-mezenchymální tranzici (EMT). (Tomlinson et al., 2007). Pravděpodobně nejčastěji zmiňovanou signalizací ve spojitosti s nádory močového měchýře je dráha PI3K. Tato lipid kináza katalyzuje fosforylaci PIP2 (fosfatidylinositol-4,5bisfosfát) za vzniku sekundárního posla PIP3 (fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfát), který aktivuje svoje cílové efektory podílející se na stimulaci buněčného růstu, proliferace a inhibici apoptózy. Mezi její aktivátory patří mimo jiné i receptorová rodina EGFR (epidermal growth factor receptor). Bylo zaznamenáno, že zvýšená exprese některých členů EGFR je spojena s gradem, stagem a celkovou prognózou pacientů (Knowles a Hurst, 2015). Amplifikace nebo zvýšená exprese ERBB2 (erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2; Her2/Neu) byla detekována spíše v nodálních metastázách než v primárním nádoru, což poukazuje na možnou úlohu tohoto receptoru v metastatickém procesu (Fleischmann et al., 2011). Receptorové tyrozinové kinázy Met a RON (Recepteur d'Origine Nantais) patří mezi další spouštěče PI3K signalizace a jejich zvýšená exprese koreluje s gradem, stádiem a velikostí nádoru i s celkovým přežíváním pacientů (Cheng et al., 2005). Rovněž byla popsána aktivační mutace 18

přímo katalytické domény PI3K a to častěji u NMIBC než u MIBC (Kompier et al., 2010). Takto mutovaná PI3K je potom nezávislá na svých regulačních proteinech RAS-GTP a PI3K regulační podjednotce p85, což buňkám postiženým touto mutací poskytuje proliferační výhodu (Platt et al., 2009; Zhao a Vogt, 2008). Fosfatáza PTEN (phosphatase and tensin homolog) konvertuje PIP3 zpátky na PIP2, a tím negativně reguluje dráhu PI3K. Snížená exprese tohoto nádorového supresoru byla popsána u mnoha nádorových onemocnění včetně NMM (Aveyard et al., 1999). Supresorovou funkci má u NMM zřejmě i signalizace NOTCH, u níž byly prokázány různé inaktivační mutace ve více než 40 % případů NMM. Signalizace NOTCH je zapojena do regulace aktivity ERK1 a ERK2 (extracellular signal-regulated kinases 1,2), čímž inhibuje signalizaci MAPK (Rampias et al., 2014). Velmi časté, a to zejména u MIBC, jsou také různé defekty v genech inhibující buněčný cyklus, například RB1 (retinoblastoma 1), TP53 a CDKN2A. Naopak geny podporující průchod buněčným cyklem jako jsou MDM2 (Murine Double Minute 2), E2F3 (E2F transcription factor 3) nebo CCND1, 3 (cyklin D1, 3) bývají především u NMIBC s vysokou frekvencí amplifikované, což je spojeno s prokazatelně kratší dobou do relapsu onemocnění (Grivas et al., 2015; Lopez-Beltran et al., 2004; Mitra et al. 2012). Četné alterace byly rovněž zachyceny u genů podílejících se na remodelaci chromatinu. Mezi často studované geny v tomto kontextu patří KDM6A (lysine-specific demethylase 6A) nebo metyltransferázu kódující MLL2 (mixed-lineage leukaemia 2) a v neposlední řadě CREBBP (CREB-binding protein) a p300 (E1A-binding protein p300), geny pro histonovou acetyltranferázu (Knowles a Hurst, 2015). Nejběžnější genetické změny vyskytující se u NMM jsou shrnuty v tabulce 1 a 2.

19

Tabulka 1: Alterace v onkogenech u nádorů močového měchýře (upraveno podle Kowles a Hurst, 2015)

Alterace u

Gen

Funkce proteinu

HRAS

GTPáza

Bodová mutace

5-10 %

KRAS

GTPáza

Bodová mutace

5%

Transkripční E2F3

faktor (regulace buněčného cyklu)

EGFR

FGFR1

FGFR3

NMIBC

receptor

exprese

Tyrozinkinázový

Zvýšená

receptor

exprese

receptor

10 %

exprese Zvýšená

Alterace u MIBC Bodová mutace Bodová mutace Zvýšená

Zvýšená

Tyrozinkinázový

Tyrozinkinázový

Frekvence

exprese Amplifikace

20 %

50 %

Bodová mutace

60-70 %

Zvýšená

80 %

exprese

Zvýšená exprese Zvýšená exprese Bodová mutace Zvýšená exprese Amplifikace

ERBB2

Tyrozinkinázový receptor

-

-

Zvýšená exprese Mutace

ERBB3 CCND1 MDM2

PIK3CA

Tyrozinkinázový receptor Cyklin E3 ubikvitin ligáza pro p53 Katalytická podjednotka PI3K

Bodová

Frekvence

5-6 %

5%

20 % 9-14 % 50 %

80 %

5-20 %

40 % 5-14 % 8-30 % 8%

-

-

Amplifikace

20 %

Amplifikace

20 %

Amplifikace

3%

Amplifikace

4-5 %

Bodová mutace

25 %

20

mutace

Bodová mutace

11 %

9-20 %

Tabulka 2: Supresorové alterace u nádoreů močového měchýře (upraveno podle Kowles a Hurst, 2015)

Gen

CDKN2A

Funkce proteinu p21, inhibitor buněčného cyklu P16, p14ARF,

CDKN2A

inhibitory buněčného cyklu

RB1

faktor, spouští

ATM

Checkpoint kináza Nukleotidová excizní oprava

TSC1

Inhibitor mTORC1

PTEN

Inhibitor AKT

MLL2

EP300

KDM6A

delece

50-60 %

Homozygotní

15 %

delece

Inaktivační mutace Hemizygotní delece Homozygotní delece

mutace

Kohezin komplex

APC

Hemizigotní

-

MIBC

cyklu

STAG2

PTCH1

-

Alterace u

Inaktivační

apoptózu

ERCC2

NMIBC

Frekvence

Inhibitor buň.

Transkripční TP53

Alterace u

Sonic hedgehog receptor Inhibitor Wnt Histon metyltransferáza Součást histon acetyltranferázy Histon demetyláza

Inaktivační mutace Zvýšená exprese Inaktivační mutace

0-14 %

0-10 %

32-36 %

-

-

-

-

Inaktivační mutace

11-16 %

Hemizigotní

6-8 %

delece -

-

Inaktivační

2-4 %

mutace -

-

-

-

-

-

21

Inaktivační mutace Zvýšená exprese Inaktivační mutace Inaktivační mutace Inaktivační mutace Inaktivační mutace Hemizigotní delece Inaktivační mutace Inaktivační mutace Inaktivační mutace Inaktivační mutace Inaktivační mutace

Frekvence

14 %

50-60 %

20-30 %

11-13 %

24-56 %

30-50 %

9-13 %

14 %

12 %

11-16 %

25-58 %

7%

9-16 %

27 %

15 %

24 %

1.2 Molekulární podtypy nádorů močového měchýře Po dlouhou dobu byl uznáván tzv. two-pathway model, kde výsledek jedné patogenní „cesty“ představuje NMIBC a druhé MIBC. Na základě mnoha expresních studií došlo ale k rozdělení těchto dvou základních skupin do více molekulárních subtypů ve snaze charakterizovat klinickou heterogenitu NMM na molekulární úrovni (Grivas et al., 2015). Sjödahl et al. (2012) definovali pět nových molekulárních tříd karcinomu MM: UroA, UroB (urobasalní A, B), GU (genomicky nestabilní),SCCL (squamous cell carcinoma-like) a infiltrující karcinom podle exprese genů regulující buněčný cyklus, FGFR3, ERBB2, EGFR, cytokeratinů, genů podílejících se na buněčné adhezi a podle mutační frekvence FGFR3, PIK3CA, TP53. Jiná studie zaměřená pouze na MIBC definovala bazální a luminální typ NMM na základě podobností s luminálním a basálním typem karcinomem prsu (Damrauer et al., 2014). Choi et al. (2014) k těmto dvěma skupinám přidali ještě typ p53-like, který je chemorezistentní a typicky se u něj vyskytuje neporušený právě gen pro p53. Zavedení tohoto rozdělení do praxe by mohlo být dobrým nástrojem pro detekci pacientů neprofitujících z podávané chemoterapie (Choi et al. 2014). Celkově lze říci, že detailní stratifikace pacientů do molekulárních subtypů by jednoznačně přispěla k individualizaci léčby, a tím snížila riziko plynoucí z agresivní protinádorové terapie.

22

2 Dlouhé nekódující RNA Lidský genom obsahuje pouze asi 20 000 protein-kódujících genů, což odpovídá přibližně 1,5 % jeho celkové velikosti, přičemž ale až 90 % genomu je aktivně transkribováno. Výsledkem transkripce těchto nekódujících sekvencí je pak velké množství různých druhů dále netranslatované RNA. Současné výzkumy popisují klíčovou úlohu těchto molekul v mnoha buněčných procesech, ale i jejich zapojení do patogeneze některých chorob (Kunej et al., 2014a; Shi et al., 2013). Obecně lze tyto RNA rozdělit na základě jejich velikosti do dvou podskupin. První skupinu tvoří krátké RNA o délce méně než 200 nt. Sem se řadí například siRNA (small interfering RNA), piRNA (piwi-interacting RNA) nebo dnes hojně studované miRNA (microRNA). Naopak druhou skupinu představují tzv. dlouhé nekódující RNA (lncRNA), jejichž délka je více než 200 nt, ale často přesahuje i hranici 100 kb (Kunej et al., 2014a; Sána et al., 2012a). LncRNA byly popsány u živočichů, rostlin, bakterií i virů. Tyto RNA nejsou však evolučně příliš konzervované a jsou transkribovány s menší frekvencí než ostatní druhy RNA, a proto se dříve předpokládalo, že se jedná spíše o jakýsi transkripční šum. Četné studie ale prokázaly jejich ústřední roli v regulaci genové exprese, a tím i jejich zapojení do důležitých buněčných dějů (Ma et al., 2013a). Transkripci lncRNA zprostředkovává zejména RNA polymeráza II a stejně jako protein-kódující RNA se tyto transkripty často podrobují následnému sestřihu, případně polyadenylaci 3’konce a připojení čepičky k 5’konci. Neobsahují ale dostatečně dlouhé čtecí rámce, což jim neumožňuje úspěšný překlad do aminokyselinové sekvence proteinu (Sána et al., 2012a). Funkce lncRNA je stejně jako u většiny RNA řízena zejména sekundární a terciární strukturou determinující jejich funkční a strukturní domény, které interagují s proteiny i nukleovými kyselinami a zároveň stabilizují molekulu lncRNA (Novikova et al., 2012; Wilusz et al., 2012). Transkripčně aktivní geny pro lncRNA vykazují trimetylaci histonu H3K4 na jejich 5’konci a trimetylaci histonu H3K36 uvnitř genu. Tato charakteristická modifikace, také nazývaná K4-K36 doména, je dobrým nástrojem pro identifikaci nových lncRNA (Khalil et al., 2009; Mikkelsen et al., 2007). Většina lncRNA je lokalizována v jádře, mohou však být detekovány i v cytoplasmě a pro některé lncRNA je dokonce lokalizace v cytoplasmě přímo charakteristická. Nicméně všechny jsou tkáňově specifické (Mercer et al., 2008).

23

2.1 Klasifikace lncRNA Podle databáze GENCODE obsahuje lidský genom necelých 16 000 lnc RNA (http://www.gencodegenes.org), je proto nutné najít obecně použitelný klasifikační systém této velmi heterogenní skupiny molekul RNA. Laurent et al. (2015) ve své přehledové práci shrnuli doposud známé způsoby členění a rozdělili lncRNA na základě velikosti, asociace s repeticemi, DNA funkčními elementy, na základě sekvenční a strukturní konzervovanosti, funkce a podle mnoha dalších dříve popsaných kritérií. Shodují se, že klasifikační systém je velmi složitý, protože jednotlivé skupiny se vzájemně překrývají. Bude proto nutné najít jednotné kritérium pro klasifikaci těchto molekul, aby bylo umožněna snažší orientace v systému a rychlé zařazení nových lncRNA (St Laurent et al., 2015). Rozdělení lncRNA do jednotlivých skupin by také mohlo pomoci při funkční charakterizaci lncRNA (Ma et al., 2013a). Vybrané způsoby členění a jednotlivé třídy shrnuje tabulka číslo 3.

24

Tabulka 3: Klasifikace lncRNA Způsob

Skupiny

dělení

lncRNA

Charakteristika V genomu umístěny mezi dvěma geny, evoluční

Mezigenové

konzervovanost, transkripční frekvence podobná kódujícím genům, vysoká tkáňová specifita

Intronové Podle umístění v genomu

Sense

V genomu umístěny uvnitř intronů, málo studovaná skupina lncRNA Přepisovány z negativního

Obsahují typické

(sense) řetězce protein kódujících

modifikace konců

genů, některé se i translatují do

protein kódujících

proteinů

genů (polyadenylace

Přepisována z pozitivního Antisense

(antisense) řetězce protein kódujících genů

a 5´čepička) – detekce pomocí CAGE (cap-analysis gene expression)

Regulují geny v těsné blízkosti, transkripční interference, Podle efektu

Cis

faktory, vazba na promotor cílového genu

působení na DNA

Trans

Signals Podle funkčních mechanismů

modifikace chromatinu, interakce s transkripčními

Decoy

Regulují vzdálené geny, modifikace chromatinu, interakce s elongačními faktory a RNA polymerázou Specifické pro daný buněčný typ, exprimované na základě určitého podnětu Slouží jako „návnada“. Váží se na své cílové molekuly, a tím zabraňují jejich biologickému účinku

Guide

Řídí lokalizaci svých cílových molekul

Scaffol

Vytváří „lešení“ pro tvorbu ribonukleových komplexů

lncRNA

Vznikají transkripcí telomerických oblastí, důležité

Další skupiny

asociované

regulátory telomerázové aktivity expresi ovlivňuje délka

lncRNA

s

telomer, buněčný stres, stupeň diferenciace, stadium

telomerami

nádorového onemocnění,

Pseudogeny

Nefunkční kopie protein kódujících genů, regulace exprese příbuzných kódujících sekvencí

Vytvořeno podle: (Ma et al., 2013a; Sána et al,. 2012a; St Laurent et al., 2015)

25

2.2 Funkce lncRNA Pouze zlomek doposud známých lncRNA bylo rovněž funkčně charakterizováno. Obecně lze ale funkční mechanismy lncRNA rozdělit do tří základních skupin: regulace transkripce, postranskripční regulace a ostatní funkce (Ma et al., 2013a). Do transkripční regulace se řadí především remodelace chromatinu a transkripční interference, při které transkripce jednoho genu ovlivňuje transkripci genu druhého (Ma et al., 2013b; Palmer et al., 2011). Zvláštní skupinu lncRNA řídící genovou expresi na transkripční úrovni tvoří eRNA (enhancer RNA), což jsou pozitivně transkripci regulující lncRNA přepisované z enhancerů- zesilovačů transkripce (Ørom et al., 2010). Posttranskripční regulace je založena zejména na řízení alternativního sestřihu a translace. Některé lncRNA interagují se sestřihovými faktory, a tím inhibují jejich funkci, jiné jsou zase schopny bezprostředně se vázat na své cílové mRNA, a tak blokovat místa sestřihu pro sestřihové faktory (Rintala-Maki a Sutherland, 2009; Tripathi et al., 2010). Samotná regulace translace spočívá v interakcích lncRNA s elongačními faktory nebo přímo ve vazbě na ribozomy (Crawford et al., 1996; Lin et al., 2008). Některé lncRNA jsou dále zpracovány do miRNA, které posttranskripčně regulují genovou expresi. Jiné se na tyto miRNA, popřípadě na jejich cílové RNA molekuly vážou, a tím inhibují jejich biologický účinek (Pink et al., 2011). Mezi ostatní funkce, které jsou zajišťovány lncRNA, patří například specifická lokalizace cílových molekul (Campalans et al., 2004) nebo slouží jako RNA složka telomerázy (Jones et al., 2012).

26

Obrázek 1: Vybrané funkce lncRNA LncRNA mohou inhibovat RNA polymerázu II (1), účastnit se remodelace chromatinu (2). LncRNA mohou hybridizovat s pre-mRNA, a tak blokovat některá místa sestřihu (3). Nebo je vzniklý duplex zprocesován ribonuklázou Dicer za vzniku siRNA (4). LncRNA jsou schopné se taky navázat na miRNA, a tak suprimovat jejich inhibiční funkci (5). LncRNA také může modulovat aktivitu proteinů (6), může zastupovat různé strukturní a regulační funkce (7) nebo určovat lokalizaci proteinů (8). LncRNA jsou zapojeny do epigenetické regulace a také mohou být samy procesovány do krátkých RNA. Převzato a upraveno podle: (Sána et al., 2012b).

27

3 lncRNA a jejich role v patogenezi nádorů močového měchýře LncRNA jsou zapojeny do důležitých buněčných procesů. Není proto divu, že jejich deregulace jsou čím dál častěji spojovány s mnoha onemocněními včetně těch nádorových. LncRNA mohou totiž zastupovat úlohu jak onkogenů, tak i nádorových supresorů v závislosti na genech, které regulují (Gutschner a Diederichs, 2012; Kunej et al., 2014b). Četné studie naznačují, že lncRNA tedy hrají klíčovou roli také v nádorech močového měchýře. Zhu et al. (2014) jako první provedli celogenomovou analýzu lncRNA párových vzorků NMM a přilehlé zdravé tkáně a identifikovali 110 signifikantně odlišně exprimovaných lncRNA. Další globální analýzu lncRNA porovnávající nádorovou a zdravou tkáň močového měchýře zrealizoval kolektiv vědců Wang et al (2014), který identifikoval téměř 3500 tisíce odlišně exprimovaných lncRNA, podle kterých bylo možné odlišit zdravou a nádorovou tkáň. Na základě předpokladu, že lncRNA mohou regulovat geny ve své těsné blízkosti, in silico zanalyzovali potenciální cílové geny deregulovaných lncRNA. Zjistili, že mnoho z těchto genů je zapojeno do signalizace mTOR, p53, buněčné adheze, DNA replikace a reparace (Wang et al., 2014a). Jinému vědeckému týmu se podařilo díky celogenomové analýza lncRNA identifikovat skupiny lncRNA, které byly schopny odlišit nádory s nízkým a vysokým gradem, invazivní nádory a zdravou tkáň (Peter et al., 2014). Pro větší přehlednost diplomové práce byly studie pojednávající o lncRNA zapojených do patogeneze NMM dále rozčleněny do podkapitol podle toho, zda je jejich působení v NMM spíše onkogenního či supresorového charakteru, nebo zda jsou zapojeny do EMT.

3.1 Supresorové lncRNA u nádorů močového měchýře LncRNA MEG3 (Maternally Expressed Gene 3) byla popsána jako tumor supresorová u mnoha typů nádoru a to díky jejímu zapojení do signalizace p53, což vede k akumulaci tohoto proteinu a následné transkripci cílových genů p53 (Zhang et al., 2010). Snížená hladina MEG3 byla detekována i u nádorů močového měchýře, kde pravděpodobně hraje roli v procesu autofagie, což je lysozomem zprostředkovaný intracelulární katalytický proces zajišťující vnitrobuněčnou homeostázu. Zvýšení MEG3 v buněčných liniích nádoru močového měchýře vedlo ke snížení LCR I, LCR II autofagických markerů a současně k poklesu proliferace a nárůstu apoptózy. MEG3 je tedy v nádorové tkáni snížena, což aktivuje autofagii, a tím zvyšuje proliferaci (Ying et al., 2013). Mechanismus, jakým je tento gen umlčován v nádorech močového měchýře, nejspíš spočívá v epigenetických 28

alteracích. MEG3 je součástí klastru 14q32, který nese odlišně imprintované a exprimované tumor supresorové geny. Greife et al. (2014) zjistili, že regulační sekvence řídící expresi tohoto klastru vykazují v nádorech ztrátu aktivní histonové modifikace a jiný metylační vzorec než u zdravé tkáně, což vede k celkovému jak paternálnímu, tak maternálnímu umlčení genů této tumorsupresorové oblasti (Greife et al., 2014). Hladina GAS5 (growth arrest-specific 5) vykazovala v nádorové tkáni MM snížené hodnoty oproti zdravé tkáni. Je zapojena do regulace buněčného cyklu skrze svoji cílovou molekulu cyklin-dependentní kinázu 6 (CDK6), která je klíčová pro přechod z G1 do S fáze buněčného cyklu. Snížení GAS5 má tedy za následek zvýšení CDK6 a vede k poklesu buněk v GO/G1 fázi a nárůstu buněk v S fázi buněčného cyklu, a tím k celkovému zvýšení proliferace (Liu et al., 2013). Rovněž Cao et al. (2015) potvrdili inhibiční roli GAS5 na buněčnou proliferaci, apoptózu a progresi buněčného cyklu. Jako jednu z možných klíčových molekul této negativní regulace určili chemokin CCL1 ((C-C motif) ligand 1), který je zapojen do selhání protinádorové imunitní odpovědi a jehož zvýšená hladina byla detekována v tkáni nádoru MM (Eruslanov et al., 2013). GAS5 tedy inhibuje CCL1, a tím alespoň částečně tlumí proliferaci buněk a brzdí buněčný cyklus (Cao et al., 2015). lncRNA MDC1-AS je antisense transkript silného nádorového supresoru MDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1), který zprostředkovává opravu dvouřetězcových zlomů na DNA. Xue et al. (2015) identifikovali snížené hladiny MDC1 i MDC1-AS v tkáni NMM. Umělé navýšení lncRNA MDC1-AS vedlo ke zvýšení MDC1, a to mělo za následek pokles proliferace, migrace a invazivity buněk in vitro.

3.2 Onkogenní lncRNA u nádorů močového měchýře Nejčastěji studovanou lncRNA v souvisloti s NMM je UCA1 (Urothelial Cancer Associated 1). Tato lncRNA hraje pravděpodobně ústřední roli v patogenezi NMM, protože je zapojena do metastatického procesu, progrese nádoru a chemorezistence, což z UCA1 činí velmi slibný terapeutický cíl (Fan et al., 2014a; Xue et al., 2014a). Jednu z možností, jak cíleně reprimovat UCA1 představují miRNA. Wang et al. (2014b) identifikovali UCA1 jako přímý cíl miR-1. Experimentální navýšení této miRNA vedlo ke snížení UCA1, a tím i ke snížení buněčného růstu, motility a nárůstu apoptózy. Fu et al. (2015) připravili syntetickou miRNA specifickou právě pro UCA1 a zároveň i pro MALAT1 (lncRNA onkogenního charakteru, viz dále). Po transfekci buněk touto miRNA došlo ke stejnému 29

efektu jako v předešlé studii s miR-1, tudíž ke snížení proliferace, migrace a nárůstu apoptózy. Jinou terapeutickou strategii by mohla představovat cílená inhibice vazby určitých transkripčních faktorů k promotoru UCA1. C/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein α) je jedním z transkripčních faktorů indukující transkripci UCA1. Vazebné místo pro C/EBPα často obsahuje u NMM bodovou mutaci, která zvyšuje transkripci UCA1, a tím i viabilitu nádorových buněk (Xue et al., 2014b). Promotor UCA1 rovněž disponuje vazebným místem pro transkripční faktor Ets-2, který je pravděpodobně esenciální pro aktivitu UCA1 promotoru. Autoři rovněž ve své studii zjistili, že Est-2 tedy aktivuje transkripci UCA1 a ta pravděpodobně přes indukci Akt signalizace blokuje apoptózu skrze inhibici proapoptického faktoru Bax (Wu et al., 2013). Yang et al. (2012) popsali zapojení UCA1 do progrese buněčného cyklu rovněž aktivací signalizace Akt a jejího efektorového transkripčního faktoru CREB (cAMP responsive element binding protein). Tato lncRNA indukuje buněčný cyklus i skrze inhibici BRG1, což je chromatin remodelující komplex, který se váže na promotor p21, a tím zvyšuje expresi tohoto inhibitoru buněčného cyklu (Wang et al., 2014c). UCA1 se pravděpodobně vyskytuje ve více transkripčních variantách. Wang et al. (2012) se zabývali transkripční variantou UCA1a a zjistili, že tato lncRNA je podobně jako UCA1 asociována s tumorogeními a apoptickými drahami, což je nejspíš způsobeno identickou klíčovou oblastí obou lncRNA, která by tudíž mohla sloužit jako slibný terapeutický cíl. I v této práci autoři definovali některé cílové molekuly UCA1 a UCA1a jako například ATM nebo apoptózu indukující ligand FAS (Wang et al., 2012). UCA1 je zapojena i do glukózového metabolismu nádorové buňky, kde podporuje tzv. Warburgův efekt, neboli upřednostnění glykolýzy i za aerobních podmínek. UCA1 totiž indukuje mTOR (mechanistic target of rapamycin) a ten skrze aktivaci STAT3 (signal transducer and aktivátor of transcription 3) a inaktivaci miR143 spouští hexokinázu 2 (Hk2), která hraje ústřední roli ve Warburgově efektu (Li et al., 2014b). Jak již bylo zmíněno, UCA1 hraje pravděpodobně roli i v chemorezistenci NMM. Během podávání chemoterapeutika cisplatiny totiž došlo ke zvýšení UCA1, a to vedlo k aktivaci a zvýšení exprese Wnt6 (wingless-type MMTV integration site family member 6). To mělo za následek indukci signalizace Wnt a zvýšenou rezistenci buněk k podávanému chemoterapeutiku (Fan et al., 2014b). Zapojení Wnt signalizace do chemorezistence bylo předešlými studiemi popsáno například u neuroblastomu, hepatocelulárního karcinomu nebo mnohočetného myelomu (Flahaut et al,. 2009; Kobune et al., 2007; Noda et al., 2009). Další hojně studovanou lncRNA v kontextu s NMM je HOTAIR (HOX antisense intergenic RNA), jejíž zvýšená exprese v nádoru přímo koreluje se špatnou prognózou, kratší dobou bezpříznakového přežívání a celkově kratší dobou přežití pacientů (Martínez30

Fernández et al., 2015; Yan et al., 2014). HOTAIR vytváří lešení pro histon-modifikující komplexy, protože jeho 5‘ doména váže PRC2 (polycomb repressive complex 2) a jeho 3‘ doména LSD1 (lysine (K)-specific demethylase 1A). LSD1 funguje jako H3K4 demetyláza, zatímco PRC2 jako metyltransferáza složená z H3K27 metyltransferázové podjednotky, EZH2 (enhancer of zeste 2), SUZ12 (suppressor of zeste 12) a EED (embryonic ectoderm development). HOTAIR se tedy aktivně podílí na epigenetické regulaci genové exprese (Tsai et al., 2010). Mezi cílové geny této regulace patří například WIF-1 (Wnt inhibitory factor-1), což je klíčový inhibitor Wnt/β-katenin signalizace, který vychytává extracelulární Wnt ligandy. HOTAIR navede PRC2 komplex k promotoru WIF-1, způsobí jeho trimetylaci a následné umlčení exprese, které vede ke spuštění Wnt signalizace (Yan et al., 2014). HOTAIR také modifikuje promotorovou oblast miR-205, a tím inhibuje její supresorové účinky. MiR-205 suprimuje proliferaci, migraci, invazivitu a negativně reguluje buněčný cyklus skrze svůj přímý cíl cyklin J (Sun et al., 2015). Heubach et al. (2015) během svého výzkumu nicméně zjistili, že HOTAIR vykazuje nejen silnou tkáňovou specifitu, ale jeho hladiny se velmi liší i v rámci daného typu nádoru, tudíž tato lncRNA pravděpodobně nebude vhodným kandidátem pro univerzální marker NMM. MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1) je zajisté také zapojena do patogeneze NMM, protože její expresní hladina pozitivně koreluje s gradem a mírou invazivity nádoru. Umělé snížení MALAT1 má za následek pokles proliferace, migrace a nárůst apoptózy v buněčných liniích NMM (Han et al., 2013c). Han et al. (2013d) určili MALAT1 jako přímý cíl pro miR-125b. Experimentální navýšení miR-125b v buňkách vedlo ke stejnému efektu jako inhibice MALAT1, což poukazuje na možný terapeutický potenciál této miRNA. LncRNA-n336828 byla výzkumným týmem Chen et al. (2015) určena jako prognostický marker pro NMM, protože její zvýšená expresní hladina korelovala s vysokým stádiem, gradem a kratší dobou přežití, což vedlo autory k hypotéze, že je tato lncRNA pravděpodobně zapojená do progrese onemocnění (Chen et al. 2015). Zvýšená exprese SPRY4-IT1 rovněž korelovala s vyšším gradem, stádiem a kratší dobou přežití. In vitro funkční testy ukázaly, že po umělé redukci této lncRNA v nádorových liniích MM došlo k prokazatelnému poklesu proliferace, migrace a invazivity (Zhao et al., 2015). PCAT-1 (Prostate cancer-associated transcript 1) indukuje proliferaci u nádorových prostatatických buněk díky stabilizaci cMyc (Prensner et al., 2014), avšak její zvýšená hladina byla detekována i u NMM a funkční in vitro testy prokázaly, že inhibice PCAT-1 vede rovněž k poklesu proliferace a indukci apoptózy u buněk NMM (Liu et al., 2015). Stejného efektu během in vitro funkčních testů bylo dosaženo po experimentálním snížení TUG1 (Taurine 31

Up-regulated Gene 1). Na základě expresních hladin této lncRNA bylo rovněž možné odlišit nádorovou a zdravou tkáň. Navíc míra exprese přímo korelovala s gradem a stádiem daného NMM (Han et al., 2013a).

3.3 LncRNA a jejich zapojení do EMT u nádorů močového měchýře Epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) je reverzibilní proces, při kterém se buňky nemotilního epiteliáního charakteru mění na motilní mezenchymální buňky, které jsou vysoce invazivní a vykazují zvýšenou rezistenci k apoptóze. Buňky prodělávající EMT ztrácí charakteristické epiteliální markery, jako jsou proteiny adherentních a těsných spojů (klaudiny, okludiny, E kadherin) a naopak zvyšují expresi markerů mesenchymálních buněk, mezi které patří N kadherin, vimentin, fibronektin a matrixové metaloproteinázy. EMT je fyziologický proces uplatňující se během hojení ran a embryogeneze, nicméně je i jeden z hlavních dějů metastatické kaskády. Buňky, které díky EMT získají invazivní a migrační vlastnosti mohou vstoupit do krevního řečiště a po reverzi zpět do epiteliálního fenotypu založit nové nádorové ložisko. Mezi hlavní induktory EMT se řadí transkripční faktory Snail, Slug, ZEB, Twist, ale i hypoxie a některé složky extracelulární matrix (Guan, 2015; Zeisberg a Neilson, 2009). Hlavní příčinou nádorové mortality je bezesporu rozvoj metastatického onemocnění, jehož hlavním induktorem je právě EMT. Nedávné studie naznačují široké zapojení lncRNA do procesů vedoucích k EMT. Pravděpodobně nejčastěji zmiňovanou lncRNA v souvislosti s EMT

a

metastazováním

je

MALAT1.

Jeho

hladina

je

prokazatelně

zvýšená

u metastazujících NMM oproti nemetastazujícím. Ying et al. (2012) prokázali, že MALAT1 indukuje EMT skrze aktivaci Wnt signalizace, která indukuje transkripci Slug. Tento transkripční faktor potom zapíná přepis proinvazivních genů a iniciuje tak proces EMT. MALAT1 také interaguje se SUZ12, který, jak už bylo zmíněno, je součástí PRC2, a zprostředkovává tak metylaci promotoru E kadherinu, což vede k jeho represi (Fan et al., 2014c). H19 také vykazuje zvýšené hladiny v metastazujících a invazivních nádorech a indukuje migraci jak in vitro, tak in vivo. Luo et al.(2013) popsali interakci této lncRNA s EZH2, který je rovněž součástí PRC2. H19 potom skrze EZH2 způsobuje metylaci antagonisty signalizace Wnt- Nkd1 (naked cuticle homolog 1), což má za následek aktivaci Wnt signalizace. Diky tomu je zahájena exprese transkripčních faktorů Snail a Slug a ty se potom podílejí na inhibici E kadherinu. H19 reprimuje expresi E kadherinu i přímou vazbou 32

EZH2 na jeho promotorovou oblast a jeho následnou metylací (Luo et al., 2013). LncRNA UBC1 (Up-regulated in bladder cancer 1) interaguje s EZH2 i SUZ12. Podílí se tedy na metylaci promotorových sekvencí svých cílových genů, a tím reprimuje jejich expresi. Zvýšená hladina UBC1 byla detekována u téměř 60 % NMM a korelovala s horší prognózou pacientů a výskytem metastáz v nodálních uzlinách. Po cílené inhibici této lncRNA došlo ke snížení proliferace, motility a invazivity in vitro (He et al., 2013b). TUG1 vytváří spolu s miR-125b reciprokou inhibiční smyčku. Zvýšená hladina TUG1 v NMM tedy negativně koreluje s hladinou miR-125b a tato miRNA potom nemůže uplatnit svůj inhibiční efekt na své cílové molekuly, mezi které patří i jeden z hlavních induktorů EMT ZEB2 (zinc finger E-box binding homeobox 2) (Tan et al., 2015a). Do procesu EMT v NMM je zapojena i GHET1 (gastric carcinoma high expressed transcript 1), jejíž hladina pozitivně koreluje s velikostí a pokročilostí tumoru, přítomností nodálních metastáz a celkovým přežitím pacientů. Po utlumení této lncRNA in vitro klesla proliferace, invazivita a rovněž došlo ke zvýšení exprese E kadehrinu a zároveň ke snížení hladin Snail, Slug, Twist a ZEB1 (Li et al., 2014a). Zapojení lncRNA do procesu EMT shrnuje obrázek 2.

33

Obrázek 2: Zapojení lncRNA do procesu EMT u NMM

34

4 Cíle diplomové práce Hlavním cílem této práce bylo provést expresní analýzu lncRNA u párových vzorků nádorů močového měchýře a nenádorové tkáně. Získané hladiny exprese poté korelovat se stádiem nádoru, dobou bezpříznakového přežívání a celkového přežití pacientů. Na základě výsledků těchto analýz vybrat lncRNA, která by mohla sloužit jako prognostický a diagnostický biomarker, a pomocí in vitro analýz tuto lncRNA funkčně charakterizovat.

4.1 Dílčí cíle: 1. Izolace celkové RNA ze 49 párových vzorků. 2. Pomocí qRT-PCR stanovit expresi vybraných lncRNA. 3. Porovnat rozdíly v hladinách exprese mezi nádorovou a nenádorovou tkání. 4. Stanovit efekt analyzovaných lncRNA na stádium nádoru, dobu bezpříznakového přežívání a celkového přežití pacientů. 5. Experimentálně snížit hladinu TUG1 v buněčné linii T-24 odvozené od nádoru močového měchýře. 6. Sledovat vliv snížení hladiny TUG1 na proliferaci, viabilitu, migraci, buněčný cyklus a apoptózu.

35

5 Materiál a metody 5.1 Soubor pacientů V rámci experimentální části této práce byly použity párové vzorky hluboce zmražené tkáně (nádorová tkáň + nenádorová tkáň) od 49 pacientů, u kterých byl diagnostikován invazivní karcinom močového měchýře. Všechny vzorky pocházely z Banky biologického materiálu Masarykova onkologického ústavu a byly odebrány v letech 2005 až 2012. Studie zahrnovala 10 žen a 39 mužů s mediánem věku 67 let v době stanovení diagnózy. Další klinicko-patologické údaje jsou uvedeny v tabulce 4. Tabulka 4: Klinicko-patologická charakterizace souboru pacientů Charakteristika

Počet

Celkový počet

49

Pohlaví

Ženy

10

Muži

39

Věk (medián)

67 (49 - 87)

S relapsem

23

Stádium

Grade

I

1

II

6

III

9

IV

31

Neurčeno

2

1

1

2

1

3

45

4

0

Neurčeno

2

36

5.2 Homogenizace vzorků a izolace RNA Hluboce zmražená tkáň byla nejprve pomocí keramických kuliček homogenizována v přístroji Magna Lyser. Pro izolaci celkové RNA byl použit komerční mirVANA miRNA izolační kit, který je založen na organické extrakci a následné imobilizaci RNA na skleněná vlákna filtru. Organickou extrakcí pomocí kyselého fenol-chloroformu byla odstraněna většina proteinů, buněčných složek, DNA a rovněž došlo k deaktivaci RNáz. Extrakce na pevné fázi za použití křemíkových (skleněných) filtrů umožnila zachytit celkovou RNA obhacenou o frakci malých RNA.

Reagencie: 

MirVana miRNA isolation Kit (Ambion)



Fenol:chloroform (Ambion)



Etanol 96% (Lachner)

Přístroje: 

Minicentrifuga MiniSpin (Eppendorf)



NanoDrop®ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)



MagNa Lyser (Roche)



Termoblok



Vortex-Genie 2 (Scientific Industries)

5.2.1 Homogenizace tkáně Pracovní postup: 1. Napipetovat 500 μl lyzačního pufru (Lysis/Binding Buffer) do vychlazené homogenizační mikrozkumavky (Green Beads Roche). 2. Přidat sterilním skalpelem uříznutý vzorek zmražené tkáně (asi 0,3 mm x 0,3 mm). 3. Vložit do přístroje MagNa Lyser a homogenizovat 2 x 50 s při 6500 rpm. 4. Centrifugovat 5 minut při 14100 rpm. 5. Přenést 400 μl supernatantu do nové zkumavky. 6. K supernatantu přidat 40 μl homogenizačního roztoku a směs promíchat. 7. Inkubovat 10 minut na ledu.

37

5.2.2 Izolace RNA Pracovní postup: 1. Ke směsi supernatantu a homogenizačního roztoku napipetovat 500 μl směsi fenol:chloroform a promíchat. 2. Centrifugovat 5 minut při 13400 rpm. 3. Přenést 300 μl svrchní vodné fáze do nové zkumavky a přidat 375 μl 100% etanolu. 4. Umístit křemíkový filtr do nové mikrozkumavky a přenést na něj 700 μl směsi lyzát/etanol. 5. Centrifugovat 45 s při 13400 rpm. 6. Odstranit eluát a na filtr aplikovat 700 μl promývacího roztoku 1. 7. Centrifugovat 45 s při 13400 rpm. 8. Odstranit eluát a na filtr aplikovat 500 μl promývacího roztoku 2/3. 9. Centrifugovat 45 s při 13400 rpm. 10. Opakovat předchozí promývací krok 8. 11. Centrifugovat 45 s při 13400 rpm. 12. Odstranit filtrát a centrifugovat 1min při 13400 rpm. 13. Přemístit filtr do nové mikrozkumavky. 14. Do středu filtru napipetovat 50 μl na 95°C předehřátého elučního roztoku. 15. Centrifugovat 45 s při 13400 rpm. 16. Změřit koncentraci a čistotu vyizolované RNA na NanoDropu a uchovat RNA při -80°C.

5.3 Reverzní transkripce (RT) Reverzní transkripce je metoda, při které je RNA přepsána do cDNA (komplementární DNA) a ta může být potom použita jako templát pro PCR. Během přípravy vzorků RNA pro přepis do cDNA bylo pracováno na chladících stojáncích a RNA byla udržována na ledu. Pro přepis RNA do cDNA pro analýzu lncRNA byl použit stejný protokol jako pro analýzu genové exprese, protože lncRNA vykazují obdobné vlastnosti jako RNA kódující geny. Přepis do cDNA tedy probíhal pomocí náhodných hexamerů. Jako endogenní kontrola byla v této práci zvolena RNU48, což je molekula RNA řadící se do skupiny malých jaderných RNA. Pro přepis krátkých RNA molekul je nutné použít specifické vlásenkové primery, které mají schopnost odlišit příbuzné RNA lišící se i o jeden nukleotid. 38

Reagencie: RT pro lncRNA: 

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)



DEPC-Treated water (Ambion INC)

RT pro RNU48: 

TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit, (Applied Biosystems)



TaqMan® MicroRNA Assays (Applied Biosystems)



DEPC-Treated water (Ambion INC)

Přístroje: 

Minicentrifuga Eppendorf miniSpin (Eppendorf)



Termocycler PTC-200 (MJ Research)

Pracovní postup (lncRNA i RNU48): 1. Reagencie pro přípravu RT směsi nechat roztát na ledu. 2. Ve zkumavce připravit master mix (MM) pro RT podle následujícího rozpisu: (tab. 5)

Tabulka 5: Příprava MM pro RT MM pro RT lncRNA pro reakci

1 vzorek

MM pro RT RNU48 pro reakci

1 vzorek

v 20 µl

(µl)

v 10 µl

(µl)

10x RT buffer

2

100 mM dNTPs (s dTTP

0,1

MultiScribe™ RT enzym 50 U/μL

0,67

25x dNTP Mix (100mM)

0,8

10x RT Random primers

2

10X RT buffer

MultiScribe Reverse Transcriptase

1

RNase Inhibitor, 20 U/μL

Nuclease free water

Celkem

4,2

10

RT primer pro RNU48

1 0,13 2

Nuclease-free water

2,77

Celkem

6,67

3. Mírně promíchat, stočit a umístit na led. 4. Naředit vzorky RNA, pro analýzu lncRNA na 100 ng/µl, pro analýzu RNU48 na 2 ng/µl. 5. Připravit 0,2 ml stripy a do každého napipetovat 10 µl MM pro analýzu lncRNA, 6,67 MM pro analýzu RNU48. 39

6. Přidat naředěnou RNA, 10 µl pro analýzu lncRNA, 3,33 µl MM pro analýzu RNU48. 7. Lehce promíchat a stočit. 8. Inkubovat na ledu 5 minut. 9. Vložit vzorky do termocycleru a provést přepis podle rozpisu (tab. 6).

Tabulka 6: Nastavení termocycleru pro RT Přepis do cDNA (lncRNA)

Přepis do cDNA (RNU48)

Čas (min)

Teplota

Čas (min)

Teplota

Krok 1

10

25°C

30

16°C

Krok 2

120

37°C

30

42°C

Krok 3

5

85°C

5

85°C

Krok4

∞

4°C

∞

4°C

10. Po přepsání vzorků do cDNA pokračovat amplifikací pomocí PCR nebo uchovat vzorky při -20°C.

5.4 Kvantitativní real-time PCR (qRT-PCR) Metoda qRT-PCR je založena na klasické polymerázové řetězové reakci. Umožňuje ale kontinuálně monitorovat přírůstky DNA během každého cyklu díky specifickým fluorescenčně značeným sondám. Exprese genů potom odpovídá hodnotě CT (treshold cycle) neboli počtu cyklů, za které míra fluorescence detekovaného vzorku překročí prahovou hodnotu. Všechny reakce byly provedeny v duplikátu a výsledné hladiny zprůměrovány a znormalizovány na referenční gen RNU48. Na každé desce byly vyčleněny 2 jamky pro Non-Template Control, kde byla místo vzorku napipetována voda, a 2 jamky pro Interplate Control, která slouží pro vyrovnání variability mezi jednotlivými PCR reakcemi pro stejný gen. Reagencie: 

DEPC-Treated water (Ambion)



TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems)



TaqMan® Non-Coding RNA Assay, SM (Applied Biosystems) 40



TaqMan® 2× Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 5 ml

(Applied Biosystems) 

TaqMan® MicroRNA Assays (Applied Biosystems)

Přístroje: 

Sequence Detection System ABI 7500 (Applied Biosystems)



Centrifuga 5430 (Eppendorf)

Pracovní postup: 1. Připravit si master mix pro PCR podle tabulky (tab. 7).

Tabulka 7: Rozpis pro přípravu MM pro qRT-PCR PCR master mix pro analýzu lncRNA

PCR master mix pro analýzu RNU48

1 vzorek (µl)

1 vzorek (µl)

TaqMan gene expression MM

10

Universal no UNG MM

10

Nuclease free water

8

Nuclease free water

Sonda

1

Sonda

1

Celkem

19

Celkem

18,67

7,67

2. Do 96jamkové PCR desky napipetovat 19 µl MM pro analýzu lncRNA a 18,67 µl pro analýzu RNU48. 3. Do každé jamky napipetovat 1 µl pro analýzu lncRNA a 1,33 µl pro analýzu RNU48 příslušného vzorku, non-template a interplate kontroly v duplikátu. 4. Překrýt desku adhezivní folií. 5. Centrifugovat 1,5 minuty při 1300 rpm. 6. Vložit desku do termocykleru a nastavit teplotní podmínky podle tab. 8

Tabulka 8: Podmínky pro PCR amplifikaci Počet cyklů

40

Čas

Teplota

2 min

50°C

10 min

95°C

15 s

95°C

60 s

60°C

41

5.5 Statistické zpracování dat Výsledné hodnoty CT analyzovaných genů byly získány pomocí softwaru SDS 2.0.1 (Applied Biosystem). K dalším výpočtům byly použity průměry CT duplikátů jednotlivých vzorků. Průměrné expresní hladiny byly normalizovány za použití RNU48 jako endogenní kontroly, která byla vybrána pomocí programu GenEx. Tento software obsahuje dva odlišné výpočetní algoritmy geNorm a NormFinder pro určení vhodné endogenní kontroly z kandidátních genů. Relativní kvantifikace byla provedena metodou 2-ΔCT. ΔCT (cílového genu) = CT (cílového genu) – CT (endogenní kontroly) Zhodnocení rozdílně exprimovaných lncRNA mezi párovými vzorky bylo provedeno pomocí neparametrického Wilcoxonova testu. Korelace hladin exprese jednotlivých lncRNA se stagem nádoru byla analyzována Kruskal-Wallis testem. Korelace exprese jednotlivých lncRNA s celkovou délkou přežití pacientů a s časem do relapsu byly analyzovány pomoci ROC (Receiver Operating Characteristic) a Kaplan-Meierovy analýzy. Pro všechny výpočty byl použit statistický program GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Za statisticky významné výsledky byly považovány ty s hladinou významnosti: p ≤ 0,05.

5.6 Kultivace buněčné linie T-24 (ATCC® HTB-4™) Linie T-24 byla derivována z uroteliálního karcinomu 81leté ženy. Jedná se o adherentní buněčnou linii s epiteliální morfologií vykazující tumorogenní potenciál. Buňky byly kultivovány v McCoy's 5A médiu s 10% obsahem fetálního bovinního séra (FBS). Médium dále obsahovalo 100 μg·ml-1 streptomycinu, 100 U·ml-1 penicilinu a GlutaMAXTM1. Kultivace probíhala na 10cm Petriho miskách při teplotě 37 °C v atmosféře s 5% CO2. Pro udržení optimálních kultivačních podmínek byly buňky pasážovány každý třetí den, kdy byla část buněk přenesena do nové Petriho misky s čerstvým kultivačním médiem. Reagencie: 

McCoy's 5A Médium (Sigma-Aldrich)



FBS (PAA)



GlutaMAXTM-1 (100×) (ThermoFisher Scientific)



Penicillin-Streptomycin (Invitrogen)



0,25% Trypsin-EDTA (Invitrogen) 42

Přístroje: 

Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH)



Termobox (5% CO2)



Vodní lázeň

Pracovní postup: 1. Zkontrolovat stav a konfluenci buněk pod mikroskopem. 2. Odsát z misky médium a přidat 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA. vytemperovaného na 37°C. 3. Po 3 minutách sklidit buňky pomocí 1 ml pipety. 4. 500 µl této buněčné suspenze přenést do nové Petriho misky obsahující 9,5 ml čerstvého na 37°C předehřátého McCoy's 5A média. 5. Množství a stav buněk zkontrolovat pod mikroskopem a umístit misky s buňkami do termoboxu (37°C, 5% CO2).

5.7 Růstová křivka Stanovení růstové křivky je nezbytné pro zjištění optimálního počtu buněk, které je třeba použít na jednotlivé in vitro funkční testy, aby se buňky během experimentu nacházely co možná nejdéle ve fázi log. Během této fáze se buňky dělí konstantní rychlostí a množství odumírajících buněk je minimální. Buňky byly nasazeny ve třech různých koncentracích na 6jamkové desky a každých 24 hodin byly spočítány 3 jamky od každé koncentrace po dobu 5 dnů. Reagencie: 

Trypan Blue Stain 0,4% (Invitrogen)



0,25% Trypsin-EDTA (Invitrogen)



McCoy's 5A Medium (Sigma-Aldrich)

Přístroje: 

Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH)

Pracovní postup: 1. První den experimentu nasadit buňky ve třech různých koncentracích na 6jamkové desky (tab. 9) 43

Tabulka 9: Počty nasazených buněk Počet buněk/jamka

Počet jamek

6

0,125 × 10 0,25 × 10

6

0,5 × 106

Celkový objem média

15 15

2,5 ml

15

2. Každý den odsát ve třech jamkách každé koncentrace médium a přidat 0,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA. 3. Po třech minutách přidat 0,5 - 3 ml (podle hustoty buněčné suspenze) McCoy's 5A média, důkladně promíchat a 100 µl této suspenze přenést do čisté mikrozkumavky. 4. K buněčné suspenzi napipetovat 100 µl 0,4% roztoku trypanové modři a dobře promíchat. 5. Přenést 2 × 10 µl obarvené buněčné suspenze na Neubauerovu komůrku a buňky pod mikroskopem spočítat. 6. Pomocí GraphPad Prism 5 sestrojit graf absolutního počtu buněk na misku a stanovit optimální množství buněk pro jednotlivé in vitro funkční testy (tab. 10).

5.8 Transfekce Transfekce je obecně proces, při kterém je cizorodá DNA nebo RNA zavedena do eukaryotické buňky bez použití virových vektorů. Pro transfekci buněčné linie T-24 byla použita metoda lipofekce, která slouží pro tranzientní transfekci a je založena na elektrostatické interakci pozitivně nabitých lipidů s negativní páteří nukleové kyseliny za vzniku kondenzovaných agregátů tzv. lipozómů. Lipozóm je díky kladnému náboji a lipofilnímu charakteru schopen projít záporně nabitou hydrofobní cytoplazmatickou membránou, a tak přenést cizorodou RNA nebo DNA do buňky. Nukleová kyselina následně vstupuje do jádra, kde se ale nezačleňuje do genomu hostitelské buňky, nemůže tedy dojít k jejímu přenosu do dceřiných buněk během mitózy, a účinek lipofekce je tudíž časově omezený. V této práci byl u buněčné linie T-24 pozorován vliv transfekce siRNA specifické pro TUG1 (v obrázcích a grafech označena jako siRNA) na proliferaci, viabilitu, migraci, buněčný cyklus a apoptózu. Všechny tyto funkční testy byly provedeny ve třech nezávislých 44

biologických opakováních a pro každý test byla jako kontrola použity buňky transfekekované kontrolní siRNA (v obrázcích a grafech označena jako Scr siRNA – Scrambled siRNA) a celková správnost byla sledována také ve vztahu k negativní kontrole (neovlivněné buňky). Před zahájením těchto experimentů bylo nutné provést optimalizaci transfekce, při které bylo zjištěno optimální množství siRNA a transfekčního činidla LipofectamineTM RNAiMAX dostačující pro účinnou transfekci a zároveň minimálně snižující viabilitu buněk. Reagencie: 

McCoy's 5A medium bez antibiotik (Sigma-Aldrich)



OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Invitrogen)



LipofectamineTM RNAiMAX Reagent (Invitrogen)



TUG1 silencer Select Pre-designed siRNA, (50 µM), 4390771 (Ambion)



Silencer Select Negative Control 1 siRNA (50 µM), 4390843 (Ambion)

Pracovní postup 1. První den experimentu nasadit buňky v optimální koncentraci na kultivační misku nebo desku dané velikosti (tab. 10) nechat inkubovat 24 h při 37 °C v 5% CO2. 2. V den transfekce smíchat příslušné množství siRNA a Opti-MEM I média (tab. 10). Smíchat příslušné množství Lipofectamine RNAiMAX a Opti-MEM I média (tab. 10). 3. Inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě. 4. Smíchat obě směsi a inkubovat při laboratorní teplotě 15 minut. Pro optimalizaci nutno připravit všechny kombinace viz tab. 11. 5. Opatrně nakapat příslušné množství (tab. 10) transfekční směsi do jamky/misky. a. Pro optimalizaci transfekce a zjištění vlivu siRNA na expresi studovaného genu inkubovat buňky 24, 48 a 72 h při 37 °C v 5% CO2 a po té provést izolaci RNA, její přepis a qRT-PCR, viz kapitola 4.3, 4.4 b. Buňky inkubovat při 37 °C v 5% CO2 a po té pokračovat podle pracovního postupu jednotlivých funkčních testů. viz dále.

45

Tabulka 10: Příprava transfekční směsi pro jednotlivé in vitro experimenty

Experiment

Optimalizace transfekce

Desky

Buňky/ jamka

Objem

siRNA

LipofectamineTM

média

+

+

(ml)

Opti-MEM® I (μl)

Opti-MEM® I (μl)

Objem transfekční směsi na jamku (μl)

24 j.

55 000

0,5

Viz tab. 11

Viz. tab 11

100

24 j.

55 000

0,5

0,4 + 50

1 + 50

100

24 j.

25 000

0,5

0,4 + 50

1 + 50

100

6 j.

250 000

2,5

2 + 250

5 + 250

500

250 000

5

4 + 500

10 + 500

1000

Exprese TUG1 po transfekci MTT test + počítání Scratch assay Buněčný cyklus a apoptóza

6cm miska

Tabulka 11: Rozpis množství oligonukleotidu a Lipofectamine RNAiMAX pro optimalizaci transfekce Množství oligonukleotidu

Objem Lipofectamine

Počet jamek každé

RNAiMAX

kombinace

20 pmol

0,5 µl

20 pmol

1,0 µl

20 pmol

1,5 µl

30 pmol

0,5 µl

30 pmol

1,0 µl

30 pmol

1,5 µl

3

5.9 Měření expresních hladin lncRNA po transfekci Exprese sledované lncRNA v buňkách T-24 po transfekci byla analyzována pomocí metody qRT-PCR. RNA byla z buněk izolována pomocí komerčního kitu Direct-zol RNA

46

MiniPrep, který je založen na klasické kolonové izolaci. Mezi výhody této metody patří purifikace bez použití fenolu a chloroformu, rychlost a cena kitu.

Reagencie: 

Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research)



Tri Reagent –Qiazol, (Ambion)



abs. Etanol (99,8%) (Lachner)

Přístroje: 

Minicentrifuga Eppendorf miniSpin (Eppendorf)



NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc)

Pracovní postup: 1. Buňky nasadit podle schématu (obr. 3) na 24 jamkovou destičku a transfekovat podle obecného protokolu (tab. 10).

Obrázek 3: Schéma uspořádání experimentu pro stanovení exprese TUG1 po transfekci Scr –scrambled (buňky transfekované kontrolní siRNA) NK – negativní kontrola (neovlivněné buňky)

47

2. Přidat 200 µl Qiazolu přímo do jamky 3. Inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě a zlyzované buňky přenést do 1,5ml zkumavky. 4. Centrifugovat 5 min při 12000 g, přenést supernantant do nové zkumavky. 5. K supernatantu přidat 200 µl absolutního etanolu a dobře promíchat. 6. Nanést vzorek na kolonku a centrifugovat 1 minutu při 12 000 rpm. 7. Odlít eluát, nanést na kolonku 400 µl Direct-zol RNA preWash a centrifugovat 1 minutu při 12 000 rpm. 8. Odlít eluát, nanést na kolonku 700 µl RNA wash bufferu a centrifugovat 1 minutu při 12 000 rpm. 9. Odstranit eluát a centrifugovat kolonku naprázdno 2 min při 12 000 rpm. 10. Přemístit kolonku do čisté zkumavky, nanést na ni 25 µl RNA free vody a centrifugovat 1 minutu při 14100 rpm. 11. Změřit koncentraci a čistotu na NanoDropu. 12. RNA skladovat při -80°C nebo přepsat do cDNA 13. Provést reverzní transkripci pro lncRNA TUG1 a RNU48 (viz kapitola 1.3.) 14. Expresi sledované lncRNA TUG1 stanovit metodou qRT-PCR (viz kapitola 1.4) 15. Znormalizovat výsledné CT hodnoty a vyhodnotit relativní expresi (viz kapitola 1.5)

5.10 Viabilita Viabilita transfekovaných buněk byla zjišťována pomocí MTT testu a přímého počítání obarvených buněk na Neubauerově komůrce. Množství viabilních buněk bylo u počítání stanoveno 24, 48, 72 a 96 hodin a u MTT testu 48, 72 a 96 hodin po transfekci. MTT test je metoda založená na redukci žlutého solubilního 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromidu (MTT) na nerozpustný fialový formazán .K této reakci však dochází pouze na mitochondriální membráně živých buněk. Pomocí silného detergentu např. DMSO (Dimethylsulfoxid), se fialové krystalky formazánu rozpustí a zbarvení se spekrofotometricky vyhodnotí při vlnové délce 570 nm, přičemž sytost zabarvení roztoku přímo odpovídá množství živých buněk.

48

5.10.1 Počítání buněk Reagencie 

Trypan Blue Stain 0,4% (Invitrogen)



McCoy's 5A medium bez antibiotik (Sigma-Aldrich)



0,25% Trypsin-EDTA (Invitrogen)

Přístroje: 

Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH)

Pracovní postup: 1. První den buňky nasadit v příslušné koncentraci (tab. 10) na 24 jamkovou destičku podle schématu (obr. 4) 2. Po 24 hodinách provést transfekci vypočítaným množstvím transfekční směsi (tab. 10) 3. Po dobu 4 dnů počítat vždy po 3 jamkách transfekovaných TUG1 specifickou siRNA, kontrolní siRNA a 3 neovlivněné jamky. 4. Pomocí programu GraphPad Prism 5 sestrojit růstovou křivku a vyhodnotit vliv transfekce siRNA na proliferaci buněčné linie T-24.

Obrázek 4: Schéma uspořádání experimentu pro stanovení viability buněk siRNA – buňky transfekované TUG1 specifickou siRNA Scr –scrambled (buňky transfekované Silencer Select Negative Control 1 siRNA) NK – negativní kontrola (neovlivněné buňky)

49

5.10.2 MTT test Reagencie 

MTT (5 mg/ml, Sigma Aldrich)



DMSO (Sigma Aldrich)



McCoy's 5A médium bez antibiotik (Sigma-Aldrich)



0,25% Trypsin-EDTA (Invitrogen)

Přístroje: 

FLUOstar Omega (BMG LABTECH)

Pracovní postup: 1. První den experimentu nasadit buňky ve vypočtené koncentraci (tab. 10) na 24 jamkovou destičku dle rozpisu (obr. 4). 2. Po 24 hodinách jamky transfekovat příslušným množstvím transfekční směsi (tab. 10) 3. Po 48, 72 a 96 hodinách do příslušných jamek nakapat 60 µl MTT. 4. Buňky s MTT inkubovat 1 hodinu při 37 °C v 5% atmosféře CO2. 5. Z jamek odsát médium a přidat 500 µl DMSO. 6. Nechat rozpustit veškerý formazán. 7. Změřit absorbanci pomocí FLUOstar Omega. 8. Výsledky zanést do grafu a vyhodnotit vliv transfekce na viabilitu buněk.

5.11 Scratch wound assay Scratch wound migration assay je jednoduchá, levná metoda, která umožňuje snadno analyzovat migraci buněk. Její princip spočívá v narušení monovrstvy buněk sterilní špičkou a následném sledování migrace okolních buněk do takto vzniklé mezery za určitý časový interval (nejčastěji 24 hodin). Ragencie: 

McCoy's 5A medium bez antibiotik (Sigma-Aldrich)



0,25% Trypsin-EDTA (Invitrogen)

50

Přístroje: 

Mikroskop OLYMPUS CKX41 (OLYMPUS Europa GMBH)



Fotoaparát OLYMPUS SP-350 (OLYMPUS Europa GMBH)

Pracovní postup: 1. Nasadit a po 24 hodinách transfekovat buňky podle obecného schématu (viz tab. 10). 2. 24 hodin po transfekci vytvořit pomocí 1 ml sterilní špičky rýhu přes celý povrch jamky. 3. Vyfotit vzniklou rýhu na pěti předem vyznačených místech. 4. Inkubovat při 37 °C v 5% atmosféře CO2 a sledovat zarůstání rýhy. 5. Ideálně 24 hodin po vytvoření rýhy (když už je skoro zarostlá) jamky vyfotit na stejných označených místech. 6. Vyhodnotit

migraci

buněk

pomocí

softwaru

TScratch

(Eldgenösische

Technische Hochschule, Zürich, Švýcarsko).

5.12 Analýza buněčného cyklu a apoptózy metodou průtokové cytometrie Průtoková cytometrie je metoda umožňující charakterizaci fyzikalně-chemických vlastností buněk během jejich průchodu laserovým paprskem. V době, kdy buňka prochází tímto paprskem, dochází k lomu a rozptylu světla, který je podle směru a úhlu lomu označován jako přímý rozptyl - forward scatter (FSC) a boční rozptyl - side scatter (SSC). FSC je úměrný velikosti buňky, zatímco SSC je indikátorem vnitřní buněčné struktury. Kromě těchto dvou parametrů průtoková cytometrie detekuje i fluorescenci procházejících buněk, což po cíleném značení fluorochromy umožňuje detekci buněk majících různé vlastnosti. Reagencie: 

Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) (Sigma-Aldrich)



96% etanol (P-lab)



RNAse A (Sigma-Aldrich)



Propidium jodid (Sigma-Aldrich)



Annexin V-FITC Kit (Miltenyi Biotec)



McCoy's 5A medium bez antibiotik (Sigma-Aldrich)



0,25% Trypsin-EDTA (Invitrogen) 51

Přístroje 

BD FACS VerseTM Flow Cytomer (BD Biosciences)



Centrifuga Thermo IEC CL10 (Thermo Scientific)

5.12.1 Analýza buněčného cyklu Během průchodu buněčným cyklem buňka zvyšuje množství své DNA až na dvojnásobek. Tohoto fenoménu využívá analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie, která je schopna detekovat množství DNA. DNA v buňkách je nejprve označena fluorochromem, v našem případě propidium jodidem, což je interkalační barvivo, vážící se do struktury DNA, které po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje záření (> 560 nm). Z fluorescenčního signálu propidium jodidu je potom možné určit množství DNA v buňkách a tedy i fázi buněčného cyklu, ve které se buňky nacházejí. Pracovní postup: 1. Nasadit buňky T-24 a transfekovat podle obecného schématu viz tab 10. 2. 72 hodin po transfekci buňky sklidit a buněčný pelet resuspendovat v 4 ml PBS. 3. Pro analýzu buněčného cyklu odebrat 3 ml, 1 ml použít pro analýzu apoptózy. 4. Centrifugovat zkumavky s buněčnou suspenzí 5 min při 1500 rpm. 5. Odstranit supernatant a promýt buňky 1 ml PBS, centrifugovat 5 min při 1500 rpm. 6. Odstranit supernatant, pelet zafixovat 1 ml 70% vychlazeného etanolu a inkubovat 30 minut na ledu. 7. Centrifugovat 5 min při 1500 rpm. 8. Odstranit supernatant, promýt 1 ml PBS a centrifugovat 5 min při 1500 rpm. 9. Sediment resuspendovat v 250 µl PBS. 10. K suspenzi přidat 50 μl RNázy A (0,1 mg/ml) a směs nechat inkubovat 30 min. při 37 °C. 11. Přidat 10 μl propidium jodidu (1 mg/ml) a inkubovat 10 minut při laboratorní teplotě a potom 20 minut na ledu. 12. Změřit a vyhodnotit fázi buněčného cyklu pomocí BD FACS VerseTM Flow Cytomer.

52

5.12.2 Analýza apoptózy Analýza apoptózy dané buněčné populace pomocí průtokové cytometrie je založena na detekci fosfatidylserinu, který se u živých buněk vyskytuje téměř výhradně na vnitřní straně cytoplazmatické membrány. Pokud se fosfatidylserin objeví i na vnější straně membrány poukazuje to na probíhající programovanou smrt – apoptózu. Annexin V je protein, který s vysokou afinitou váže fosfatidylserin za přítomnosti fyziologické koncentrace iontů vápníku. Fluorescenčně značený Annexin V spolu s propidium jodidem je během analýzy metodu průtokové cytometrie schopen odlišit živé buňky od buněk v rané a pozdní apoptóze, přičemž živé buňky nejsou značeny ani jedním fluorochromem, buňky v raném stádiu apoptózy jsou značeny pouze Annexinem V a buňky procházející pozdní apoptózou váží oba fluorochromy. Pracovní postup: 1. Buněčný pelet získaný z 1 ml buněčné suspenze (viz 4.12.1) promýt 1 ml 1 x Annexin V binding pufru a centrifugovat 10 min při 1500 rpm. 2. Odstranit supernatant a opakovat promývací krok 1. 3. Resuspendovat pelet ve 100 μl Annexin V binding pufru. 4. Přidat 10 μl Annexin V FITC, dobře promíchat a inkubovat 15 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 5. Promýt buňky 1 ml 1× Annexin V binding pufru a centrifugovat 10 minut při 1500 rpm. 6. Odstranit supernantan a resuspendovat pelet v 500 μl 1 x Annexin V binding pufru. 7. Přidat 5 μl roztoku propidium jodidu. 8. Analyzovat procento apoptotických buněk na BD FACS VerseTM Flow Cytomer.

53

6 Výsledky

6.1

Výtěžek RNA izolované z tkáně Ze 49 párových vzorků zmražené tkáně od pacientů s karcinomem močového měchýře

byla izolována RNA. Koncentrace a čistota získané RNA byla změřena na spektrofotometru NanoDrop®ND-1000. Koncentrace dosahovala hodnot 80,69 - 1222,45 ng/µl. Čistota vyizolované RNA byla stanovena poměry absorbance při různých vlnových délkách a nabývala průměrné hodnoty 1,99 pro A260/A280 a 1,74 pro poměr A260/A230.

6.2 Stanovení exprese vybraných lncRNA v párových vzorcích nádorové a nenádorové tkáně močového měchýře Pro expresní analýzu lncRNA bylo na základě literární rešerše vybráno 6 lncRNA, z toho dvě (GAS5, MEG3) byly dříve u NMM popsány jako nádorové supresory a čtyři (TUG1, UCA1, HOTAIR, MALAT1) jako onkogeny. Hladiny těchto lncRNA byly stanoveny pomocí qRT-PCR a výsledné hodnoty CT byly normalizovány k expresní hladině RNU48. 6.2.1 Výběr vhodné endogenní kontroly K určení vhodné endogenní kontroly bylo použito 8 náhodně vybraných párových vzorků. V těchto vzorcích byla poté stanovena hladina jednotlivých kandidátních referenčních genů (viz tab. 12).

54

Tabulka 12: Kandidátní referenční geny Kandidátní referenční geny ACTB

Actin, Beta

B2M

Beta-2-Microglobulin

RPS18

Ribosomal Protein S18

PPIA

Peptidylprolyl Isomerase A

GUSB

Glucuronidase, Beta

HPRT

hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase

PMM1

Phosphomannomutase 1

RNU48

Small Nucleolar RNA, C/D Box 48

TBP

TATA Box Binding Protein

GAPDH

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

SDHA

Succinate dehydrogenase complex subunit A

Kandidátní geny byly testovány pomocí softwaru GenEx, který zahrnuje dva odlišné algoritmy GeNorm a NormFinder (obr. 5, 6).

Obrázek 5: Výběr vhodného referenčního genu pomocí algoritmu GeNorm

55

Obrázek 6: Výběr vhodného referenčního genu pomocí algoritmu Normfinder

Na základě těchto 2 algoritmů se zdál být nejvhodnější endogenní kontrolou gen PPIA. Software GenEx ale při analýze pouze vyřazuje geny s největší mírou expresní variability a nebere v úvahu párové vzorky. Proto byly expresní profily jednotlivých genů v nádorové a zdravé tkáni podrobeny Wilcoxonovu testu, pomocí kterého byla zjištěna míra odlišnosti exprese v rámci jednotlivých párových vzorků. Díky kombinaci těchto dvou statistických přístupů byl referenčním genem zvolen gen pro RNU48, který vykazoval nejstabilnější expresní hladinu v rámci celého souboru vzorků, i mezi členy jednoho páru.

6.3 Na základě expresních hladin lncRNA je možné odlišit nádorovou a zdravou tkáň Relativní expresní hladiny lncRNA byly analyzovány Wilcoxonovým párovým testem a bylo zjištěno, že tři ze studovaných šesti lncRNA jsou schopny odlišit tkáň nádorovou od zdravé. LncRNA TUG1 vykazovala v nádoru významně zvýšené hladiny oproti zdravé tkáni (p < 0,0001, obr. 7A). Stejný trend byl pozorován i u HOTAIR (p = 0,0006, obr. 7B), avšak exprese této lncRNA byla ve vzorcích velmi nízká, v některých případech nedetekovatelná. Průměrná hodnota CT v nádoru byla 36,6 a ve zdravé tkáni 38,8, proto byly i směrodatné 56

odchylky mezi duplikáty poměrně vysoké. Relativní exprese MEG3 nabývala naopak významně vyšších hodnot ve zdravé tkáni oproti tkáni nádorové (0,0044, obr. 7C). Na základě dosažených výsledků se tedy dá předpokládat, že analýza expresních hladin TUG1, HOTAIR a MEG3 by mohla mít diagnostický význam. U expresních hladin MALAT1, UCA1 a GAS5 nebyly zaznamenány signifikantní změny mezi nádorem a zdravou tkání. Podrobné výsledky z Wilcoxonova testu jsou shrnuty v tabulce 13.

Obrázek 7:Rozdílně exprimované lncRNA mezi nádorem a zdravou tkání A: Signifikantně zvýšená hladina TUG1 v nádoru oproti zdravé tkáni (p = 0,0001). B: :Signifikantně zvýšená hladina HOTAIR v nádoru oproti zdravé tkáni (p = 0,0006). C: Signifikantně snížená hladina MEG3 v nádoru oproti zdravé tkáni (p = 0,0044)

57

Tabulka 13: Přehled expresních hladin jednotlivých lncRNA Nádor

Zdravá tkáň

Medián relativní

Medián relativní

exprese

exprese

TUG1

0,058

0,138

2,382

< 0,0001

HOTAIR

0,00005

0,00003

1,505

0,0006

MALAT1

35,010

18,446

1,898

0,1280

UCA1

0,334

0,268

1,243

0,8036

MEG3

0,181

0,386

0,468

0,0044

GAS5

0,077

0,052

1,493

0,1049

lncRNA

Hladina FC*

významnosti (p)

*fold change: Normalizovaná exprese ve zdravé tkáni/ Normalizovaná exprese v tumoru

6.4 Korelace expresních hladin lncRNA s prognózou onemocnění Dílčím úkolem práce bylo také stanovit prognosticky významné lncRNA. Korelace expresní hladiny dané lncRNA s nádorovým stádiem byla testována Mann-Whitneyho testem. Vliv lncRNA na dobu bezpříznakového přežívání a celkového přežití byl zhodnocen na základě Kaplan-Meierových křivek. 6.4.1 Souvislost exprese lncRNA a klinického stádia onemocnění Mann-Whitneyho testem byly nejprve porovnány expresní hladiny v nádorech o nižším (I+II) a vyšším (III+IV) stádiu. Skupiny jednotlivých stádií nebyly porovnány individuálně vzhledem k nerovnoměrnému zastoupení vzorků (viz tab. 4). Nejvýznamnější expresní rozdíl mezi skupinami I+II, III+IV byl pozorován u TUG1 (p = 0,0580, obr. 8).Ani v tomto případě však hladina významnosti nedosahovala signifikantních hodnot. P hodnoty ostatních lncRNA nabývaly pouze statisticky nevýznamných hodnot (viz tab. 11).

58

Tabulka 14: Porovnání exprese lncRNA mezi nádory o nižším (I+II) a vyšším stádiu (III+IV) lncRNA

Hladina významnosti (p)

TUG1

0,0580

HOTAIR

0,1453

MALAT1

0,2888

UCA1

0,3944

MEG3

0,5601

GAS5

0,5601

Normalizovaná exprese TUG1

TUG1 10

p = 0,0580

1 0.1 0.01 0.001

I I+

I

IV

+ III

Stage

Obrázek 8 Korelace expresní hladiny TUG1 se stádiem nádoru (P = 0,058)

6.4.2 Analýza bezpříznakového přežívání a celkového přežití pacientů Prognostický potenciál zkoumaných lncRNA byl nejprve zhodnocen na základě ROC analýzy. Korelace doby do relapsu neboli bezpříznakové přežívaní (DFS- Disease-free survival) a celkové přežití (OS – overal survival) s hladinou jednotlivých lncRNA byla provedena pomocí Kaplan-Meierových křivek. Z obrázku 9A, 9B je patrné, že pacienti s vysokou hladinou TUG1 a MALAT1 mají signifikantně kratší dobu celkového přežití než pacienti s nižší expresí těchto lncRNA. Pacienti s vyšší expresí TUG1 průměrně přežívali 21 měsíců od stanovení diagnózy, zatímco pacienti s nižší hladinou této lncRNA přežívali 33,5 59

měsíce (p = 0,0102). Podobný efekt byl pozorován i v případě MALAT1, kde se pacienti s vyšší expresí průměrně dožívali pouze 22 měsíců a pacienti s nižší expresí 37 měsíců (p = 0,0125). Také lncRNA UCA1 vykazovala stejný trend, avšak její hladina významnosti nedosahovala signifikantních hodnot (obr. 9C, p = 0,0590). U ostatních analyzovaných lncRNA nebyla pozorována statisticky významná souvislost s celkovým přežitím. Statisticky nevýznamné

výsledky

taktéž

vykazovala

korelace

všech

studovaných

lncRNA

s bezpříznakovým přežitím. Nejvýznamnější trend byl zaznamenán u TUG1, u kterého vysoká hladina přímo korelovala s kratší dobou do progrese onemocnění (obr. 10). Podrobné výsledky prognostického potenciálu daných lncRNA získané z ROC analýzy a KaplanMeierovy analýzy jsou zobrazeny v tabulce 15.

60

Obrázek 9: Korelace mezi expresní hladinou lncRNA a dobou přežití pacientů pomocí Kaplan-Meierových křivek (A) Pacienti s vysokou hladinou TUG1 přežívali významně kratší dobu než pacienti s nízkou expresí TUG1 (p = 0,0102).; (B) Pacienti s vyšší hladinou MALAT1 vykazovali signifikantně kratší dobu celkového přežití (p = 0,0125).; (C) V případě Kaplan-Meierovy analýzy UCA1 nebyly zaznamenány statisticky významné výsledky (p = 0,059), avšak křivka ukazuje zřejmý trend, že pacienti s vyšší hladinou UCA1 přežívali kratší dobu.

61

Procento bez recidivy (%)

TUG1 100

Nižší exprese Vyšší exprese

p = 0,2532

80 60 40 20 0 0

50

100

150

měsíce

Obrázek 10: Kaplan-Meierova křivka bezpříznakového přežívání pro TUG1

Tabulka 15: Podrobné výsledky z Kaplan-Meierovy analýzy OS a DFS Medián lncRNA

2-dCt (OS)

OS (měsíce)

< 0,1007 TUG1

21

< 0.000214

19,50

> 0.000212

29

< 21.45

37

MALAT1 > 21.45

22

< 0.2944

25

UCA1 > 0.2944

19

< 0.09237

30

MEG3 > 0.09237

22

< 0.06047

30

GAS5 > 0.06047

významnosti 2-dCt (DFS) (p)

33,50

> 0,1007

HOTAIR

Hladina

23

0,0102

0,3740

Medián

Hladina

DFS

významnosti

(měsíce)

(p)

< 0.1332

26,5

> 0.1332

22,5

< 0.00014

11,5

> 0.00014

17,5

< 34.26

17

> 34.26

12

< 0.2944

17

> 0.2944

12

< 0.1027

12

> 0.1027

15

< 0.06618

11,5

> 0.06618

16

0,0125

0,0590

0,2532

0,9383

0,4846

0,4398

0,1756

0,4080

62

0,6065

0,7461

6.5 Stanovení rychlosti proliferace buněčné linie T-24 Před samotným zahájením in vitro funkčních testů byla stanovena růstová křivka linie T-24. Buňky byly nasazeny ve třech různých koncentracích (125 000, 250 000, 500 000 buněk) na 6jamkové desky. Přibližně 48 hodin po nasazení se buňky rostoucí ve všech třech koncentracích nacházely v log fázi buněčného růstu, tedy ve fázi, během které počet buněk exponenciálně roste. Avšak pouze buňky nasazené v nejnižší koncentraci setrvaly v log fázi přibližně 96 hodin po nasazení. Proto byla tato koncentrace vybrána jako nejvhodnější pro další in vitro experimenty.

Obrázek 11: Růstová křivka linie T-24

6.6 In vitro funkční testy Na základě expresní analýzy vybraných lncRNA u párových vzorků pacientů s karcinomem močového měchýře a následné korelace jednotlivých expresních hladin s prognózou onemocnění byla pro in vitro funkční testy vybrána lncRNA TUG1. TUG1 vykazovala v nádorové tkáni zvýšenou expresi oproti přilehlé tkáni nenádorové. To vedlo k předpokladu, že tato lncRNA vykazuje pravděpodobně onkogenní vliv u NMM. Proto byl v rámci in vitro analýz zkoumán její efekt na proliferaci, buněčný metabolismus, migraci, buněčný cyklus a apoptózu. Aby bylo možné pozorovat možný vliv TUG1 na tyto buněčné procesy bylo nutné nejprve experimentálně snížit její hladinu v buňkách T-24. Toho bylo 63

dosaženo díky transfekci buněk TUG1-sekvenčně specifickou malou interferující RNA (siRNA). Všechny funkční in vitro testy byly provedeny ve třech nezávislých biologických opakováních a získané výsledky byly vztaženy na kontrolní buňky transfekované stejným množstvím lipofektaminu a kontrolní siRNA (v grafech označeny jako Scr siRNA).

6.7 Optimalizace transfekce Pro dosažení dostatečného utlumení TUG1 a zároveň minimální toxicity byla provedena optimalizace transfekce, při které byly buňky na 24 jamkové desce transfekovány dvěma různými množstvími siRNA (20 pmol, 30 pmol) s třemi odlišnými objemy (0,5 µl, 1 µl, 1,5 µl) transfekčního činidla – lipofektaminu. Účinnost transfekce byla stanovena pomocí qRT-PCR. Experiment byl proveden ve třech nezávislých opakováních a výsledné CT hodnoty byly opět normalizovány na RNU48. Pro další in vitro experimenty byla na základě analýzy dosažených výsledků vybrána transfekční směs, která obsahovala 20 pmol siRNA a 1 µl lipofektaminu na 1 jamku 24jamkové desky. Z obrázku 12 je patrné, že po transfekci touto kombinací siRNA a lipofektaminu došlo k výraznému snížení hladin TUG1 oproti buňkám transfekovaných kontrolní siRNA. Již po 24 hodinách po transfekci vykazovaly buňky o 66, 7 % sníženou hladinu TUG1, po 48 hodinách toto snížení dosahovalo 74 % a po

Normalizovaná exprese TUG1

72 hodinách dokonce 78,2 %.

1.5

Scr siRNA siRNA

1.0

0.5

0.0

h 24

h 48

h 72

Obrázek 12: Optimalizace transfekce Utlumení exprese TUG1 pomocí transfekční směsi o obsahu 20 pmol TUG1 sekvenčně specifické siRNA a 1 µl lipofektaminu (v obrázku označeno jako siRNA). Buňky transfekované kontrolní siRNA jsou označeny jako Scr siRNA.

64

6.8 Vliv inhibice TUG1 na celkovou viabilitu buněk T-24 Pomocí MTT testu byl sledován účinek utlumení TUG1 na metabolickou aktivitu buněk. Současně byly transfekované buňky klasicky počítány pod mikroskopem na Neubauerově komůrce, a tak byl zhodnocen i vliv inhibice TUG1 na buněčnou proliferaci. 6.8.1 Vliv inhibice TUG1 na metabolickou aktivitu buněk T-24 Efekt experimentálního utlumení TUG1 na metabolickou aktivitu buněk byl analyzován 48 h, 72 h a 96 h po transfekci na základě MTT testu. Vyhodnocená data spektrofotometrického měření jsou znázorněny na obrázku 13. Redukce hladiny TUG1 vedla k signifikantnímu snížení metabolické aktivity buněk. 48 hodin po transfekci klesla metabolická aktivita buněk o necelých 22 % (21,8 %; p = 0,004), po 72 hodinách o 27 % (27,3 %; p = 0,0001). Největší efekt byl pozorován 96 hodin po transfekci, kdy pokles viability buněk činil téměř 34 % (33,9 %; p = 0,0004).

Absorbance

0.8

* * *

0.6

* *

0.4

Scr siRNA siRNA

* * *

0.2 0.0

48

h

72

h

96

h

Obrázek 13: Pokles metabolické aktivity buněk T-24 způsobený sníženou hladinou TUG1. ( 48 h**: p = 0,004; 72 h***: p < 0,0001; 96 h ***: p = 0,0004)

6.8.2 Vliv snížení hladiny TUG1 na buněčnou proliferaci V případě sledování buněčné viability metodou přímého počítání byl pozorován stejný trend jako během MTT testu. Statisticky významné rozdíly v buněčné proliferaci mezi 65

buňkami trasnfekovanými TUG1 specifickou siRNA a kontrolní siRNA byly ale pozorovány až 72 hodin po transfekci, kdy proliferace buněk s inhibovanou TUG1 klesla o necelých 33 % (32,99 %; p = 0,0004). Po 96 hodinách od transfekce činil pokles proliferace dokonce téměř 40 % (39,2 %; p = 0,0004).

Počet buněk

400000

* * *

* * *

3

4

siRNA Scr siRNA

300000 200000 100000 0 0

1

2

5

Čas (dny)

Obrázek 14: Snížení proliferace buněčné linie T-24 vlivem inhibice TUG1 (3. den ***: p = 0,0004; 4. den ***: p = 0,0004)

6.9 Vliv snížené hladiny TUG1 na migraci buněk T-24 Migrace buněk s experimentálně sníženou hladinou TUG1 byla zhodnocena na základě Scratch-wound analýzy, při které bylo 24 hodin sledováno postupné zarůstání rýhy vytvořené sterilní špičkou. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí softwaru TScratch a vztaženy na kontrolní siRNA transfekované buňky. Z obrázku je patrný statisticky významný účinek snížené hladiny TUG1 na migrační potenciál buněk. Buňky transfekované TUG1-specifickou siRNA migrovali o 23,3 % méně než buňky transfekované kontrolní siRNA (p < 0,0001).

66

**** 80 60 40 20

N A

0

sc rs

iR

si R

N A

Relativní migrace buněk (%)

100

Obrázek 15: Vliv transfekce TUG1 specifické siRNA na migraci buněk. (**** : p < 0,0001)

Obrázek 16: Porovnání míry zacelení rýhy u buněk transfekovaných TUG1 specifickou siRNA (siRNA) a siRNA negativní kontrolou (Scr)

67

6.10 Vliv hladiny TUG1 na regulaci buněčného cyklu 72 hodin po transfekci byla u buněk transfekovaných siRNA specifickou pro TUG1 nebo kontrolní siRNA provedena analýza buněčného cyklu. Buňky byly nejdříve obarveny interkalačním barvivem propidium jodidem a procento zastoupení buněk v dané fázi buněčného cyklu bylo zhodnoceno pomocí průtokové cytometrie. Jak je zřejmé z obrázku 17, experimentální snížení TUG1 nemělo žádný statisticky významný vliv na regulaci buněčného cyklu u buněčné linie T-24.

Počet buněk v (%)

80

Scr siRNA siRNA

60 40 20 0 G

1

S

G

2

Fáze buněčného cyklu Obrázek 17: Vliv snížené hladiny TUG1 na regulaci buněčného cyklu

6.11 Vliv hladiny TUG1 na apoptózu Pomocí průtokové cytometrie byl také zkoumán vliv snížení TUG1 na apoptické dráhy buněčné linie T-24. Buňky transfekované TUG1 specifickou siRNA nebo kontrolní siRNA byly po 72 hodinách po transfekci naznačeny Annexinem V a propidium jodidem. Toto fluorescenční značení umožnilo detekci buněk v rané a pozdní fázi apoptózy. Z obrázku je ale patrné, že snížená hladina exprese nezpůsobila signifikantní změny v procentuálním zastoupení apoptických buněk. Poměrně výrazný rozdíl byl zaznamenán v počtu buněk procházející pozdní apoptózou, kdy buněčná populace transfekovaná TUG1 specifickou siRNA vykazovaly o 37 % více pozdně apoptických buněk než buněčná populace 68

transfekované kontrolní siRNA. Tyto změny však kvůli poměrně vysokým směrodatným odchylkám mezi jednotlivými opakováními nedosahovaly statisticky významných hodnot.

B

Počet buněk v (%)

100

Scr siRNA siRNA

80 60 40 20 0 y ňk

vé Ži

bu

A

Počet apoptických buněk (%)

A

20

Scr siRNA siRNA

15 10 5 0

za tó op

p

R

á an

óz pt o ap

a

d oz P

a ní

za tó p po

Obrázek 18: Vliv snížené hladiny TUG1 na apoptózu buněk T-24. (A) Porovnání zastoupení živých a apoptických buněk. (B) Srovnání množství buněk, které prochází různými stádii apoptózy.

69

7 Diskuze Do studie bylo zahrnuto 49 párových vzorků pocházejících od pacientů s nádorem močového měchýře, přičemž u 23 pacientů byl později zachycen relaps onemocnění. Soubor pacientů obsahoval především vzorky nádorů s vysokým gradem a stádiem onemocnění, což nekoreluje s obecným zastoupením v populaci, kde jsou tyto vysoce agresivní nádory zastoupeny v menší míře v porovnání s méně agresivními formami (Jebar et al. 2005). Na základě literární rešerše bylo vybráno 6 lncRNA, již dříve asociovaných s nádory močového měchýře. Jednalo se o UCA1, MALAT1, HOTAIR a TUG1 předešlými studiemi popsané jako potenciální onkogeny, a GAS5, MEG3, které pravděpodobně plní funkci nádorových supresorů. Prvním úkolem bylo najít vhodnou endogenní kontrolu pro zkoumaný soubor pacientů. Ukázalo se však, že běžně používané referenční geny nejsou pro tuto skupinu vhodné, neboť všechny vykazovaly velké rozdíly mezi parovými vzorky. Jediným stabilně exprimovaným genem, jak v rámci celé skupiny, tak v rámci jednotlivých párů se ukázala být RNU48, a proto byla také v rámci této studie použita jako endogenní kontrola pro normalizaci expresních hladin jednotlivých lncRNA. RNU48 je krátká jadérková RNA a běžně se používá pro normalizaci exprese miRNA. Bylo by tedy vhodné se na problematiku endogenních kontrol pro normalizaci lncRNA u karcinomů močového měchýře detailně zaměřit během příštích výzkumů a najít tak vhodnější endogenní kontrolu, která by lépe odpovídala délce a způsobu biogeneze lncRNA. MEG3 byla popsána jako nádorový supresor, protože indukuje apoptózu, negativně ovlivňuje autofagii, a tím i buněčnou proliferaci. Její hladina je v nádoru snížená oproti přilehlé nenádorové tkáni (Ying et al., 2013), což potvrdily i výsledky této diplomové práce. Greife et al. (2014) během svého výzkumu zjistili, že toto snížení je nejspíš způsobeno epigenetickými modifikacemi chromatinu. Naše studie ale nepotvrdila roli nádorového supresoru v případě GAS5, který ve zkoumaném souboru vzorků dosahoval vyšších expresních hladin v nádorech než ve zdravé tkáni. I když tento rozdíl nebyl statisticky významný, vykazoval silný trend. Výsledek naší práce tedy nepotvrdil studii vědeckého týmu Liu et al. (2013)., kteří mimo jiné popsali také inhibiční efekt GAS5 na proliferaci buněk skrze negativní regulaci CDK6. Zvýšená hladina v nádorové tkáni a tedy i možný onkogenní efekt byl naopak potvrzen u TUG1 a HOTAIR. Tyto dvě lncRNA vykazovaly v nádoru signifikantně zvýšené hladiny oproti nenádorové tkáni, což bylo v souladu s již publikovanými studiemi (Han et al., 2013b; Tan et al., 2015b; Yan et al., 2014). V případě MALAT1 nebyly pozorovány 70

statisticky významné rozdíly expresních hladin mezi nádorovou a nenádorovou tkání, avšak byl zaznamenán výrazný trend. Zvýšená hladina MALAT1 byla detekována především v nádoru, méně často v nenádorové tkáni, což svědčí o možném onkogenním efektu této lncRNA. MALAT1 bývá často spojován s procesem EMT a s ním spojeným metastazováním, a tedy i špatnou prognózou pacientů. V rámci této diplomové práce byla pomocí KaplanMeierovy analýzy potvrzena pozitivní korelace mezi expresní hladinou MALAT1 a celkovým přežíváním pacientů (Fan et al., 2014c). Rovněž v případě UCA1 byl zaznamenán jistý trend mezi přežíváním pacientů a expresní hladinou této lncRNA, nicméně nedosahoval statisticky významných hodnot. Zajímavé ale je, že porovnání expresních hladin v nádoru a nenádorové tkáni nepřineslo v případě UCA1 žádné statisticky významné výsledky. Jedná se totiž o lncRNA nejčastěji spojovanou s nádory močového měchýře. Předešlé studie prokázaly její pozitivní regulační účinek na proliferaci, motilitu, chemorezistenci a invazivitu. Naopak negativní regulace byla popsána u dějů vedoucích k apoptóze (Fan et al., 2014a; Wang et al., 2012; Wang et al., 2014c). Převážná většina studií týkajících se UCA1 a tedy i analyzované soubory pacientů pochází z Činy. Bylo by proto vhodné provést další expresní analýzy této lncRNA i v rámci jiných populací, a tak potvrdit nebo vyvrátit univerzální roli UCA1 v patogenezi NMM. Na základě srovnání expresních hladin jednotlivých lncRNA u nádorů a přilehlé nenádorové tkáně a následné Kaplan-Meierovy analýzy celkového přežití a bezpříznakového přežívání byla pro in vitro funkční testy vybrána TUG1. Expresní hladina této lncRNA byla oproti přilehlé nenádorové tkáni v nádoru významně zvýšena. Kaplan-Meierovou analýzou celkového přežití byla rovněž prokázána přímá souvislost mezi expresní hladinou TUG1 a délkou celkového přežívání pacientů. Pacienti s vyšší expresí této lncRNA přežívali signifikantně kratší dobu než pacienti s nižší expresí. Korelace míry exprese TUG1 se stádiem tumoru sice vykazovala silný trend, avšak nedosahovala statisticky významných hodnot. Z výsledků je ale patrné, že vysoká hladina TUG1 souvisí s vyšším stádiem nádoru, a tedy i s horší prognózou. Nedostatečná statistická relevance získaných výsledků mohla být způsobena nerovnoměrným rozložením vzorků, protože do první skupiny málo invazivních tumorů se stádiem I nebo II bylo zařazeno pouze 7 pacientů. Všechny tyto výsledky byly v souladu s již dříve publikovaným studiemi (Han et al., 2013a; Tan et al., 2015b). TUG1 byla poprvé popsána ve spojitosti s vývojem sítnice u myšího embrya, kde plní klíčovou roli ve správném formování fotoreceptorů (Young et al., 2005). Nedávné studie však poukázaly na její zásadní význam i v nádorové transformaci. Zvýšená exprese oproti normální 71

tkáni byla detekována nejen u karcinomu močového měchýře, ale také například u osteosarkomu, nádoru jícnu nebo hepatocelulárního karcinomu. U všech diagnóz byla zvýšená hladina TUG1 asociována s vysokým proliferačním potenciálem, migrací a sníženou apoptózou, což poukazuje na její možnou onkogenní úlohu u těchto malignit (Han et al., 2013a; Huang et al., 2015; Xu et al., 2015; Zhang et al., 2013). Naopak u nemalobuněčného nádoru plic byla TUG1 označena za nádorově supresorovou lncRNA, protože její snížená hladina byla spojována s vyšším stádiem a kratším celkovým přežíváním pacientů (Zhang et al., 2014). Výše zmíněné poznatky naznačují odlišnou úlohu TUG1 v molekulární patologii u různých typů nádorů. Dílčím úkolem práce bylo tedy také pomocí in vitro analýz funkčně charakterizovat TUG1, a tak ověřit případně rozšířit poznatky o zapojení této lncRNA do komplexní biologie karcinomu močového měchýře. Pro in vitro funkční testy byla vybrána buněčná linie T-24, která byla derivována z uroteliálního karcinomu 81leté ženy. Tato buněčná linie je široce používaným biologickým modelem pro studium nádorů močového měchýře a je charakteristická rychlým buněčným růstem. Aby bylo možné sledovat možný efekt TUG1 na proliferaci, metabolickou aktivitu, buněčný cyklus a apoptózu, bylo nejprve nutné experimentálně snížit v buněčné linii T-24 její expresní hladinu. Pomocí transfekčního činidla lipofektaminu a TUG1 sekvenčně specifické siRNA bylo dosaženo tranzientního snížení hladiny TUG1. Exprese TUG1 byla už po 24 hodinách od transfekce snížena o více než 66 % a po 48 a 72 hodinách bylo snížení její hladiny ještě markantnější. Han et al. (2013) ve své studii prokázali vliv TUG1 na buněčnou proliferaci standartních linií nádorů močového měchýře. Rychlost proliferace výrazně klesla u buněk ošetřených TUG1 specifikou siRNA ve srovnání s buňkami transfekovanými kontrolní siRNA. Moje práce tyto výsledky experimentálně potvrdila pomocí MTT testu a klasického počítání na Neubauerově komůrce. Metabolická aktivita buněk se sníženou TUG1 byla nejsilněji inhibována 96 hodin po transfekci a to o 34 % oproti buňkám tranfekovaných kontrolní siRNA. Podobných výsledků bylo dosaženo i počítáním buněk. Největší rozdíl v rychlosti proliferace byl zaznamenán rovněž 96 hodin po transfekci, kdy proliferace buněk s experimentálně sníženou hladinou TUG1 byla téměř o 40 % nižší než proliferace buněk ovlivněných kontrolní siRNA. Huang et al. (2015) zjistili, že TUG1 indukuje proliferaci u hepatocelulárního karcinomu skrze inhibici KLF2 (Kruppel-like factor). TUG1 totiž epigeneticky tlumí KLF2 díky metylaci jeho promotoru zprostředkovanou metyltransferázou EZH2, která je součástí PRC2. KLF2 je členem rodiny transkripčních faktorů, z nichž mnohé jsou považovány za nádorové supresory (Shen et al., 2014). KLF2 byl popsán u karcinomu pankreatu jako negativní regulátor β-katenin/TCF signalizace, jejíž 72

aktivace vede k transkripci známých onkogenů cMyc nebo cyklinu D1 (Zhang et al., 2015). Zvýšená aktivita této mitogenní signalizace byla popsána i u karcinomu močového měchýře (Du et al., 2015) a je tedy možné, že jedna z příčin této deregulace, a tím i zvýšené proliferace, může spočívat v aberantní expresi TUG1. Hlavní příčinou nádorové mortality je bezesporu rozvoj metastatického onemocnění. Tento proces je spojen především se ztrátou buněčné adheze, vysokou buněčnou invazivitou a zvýšenou schopností migrace, tedy ději provázejícími EMT. V experimentální části této práce byl pomocí Scratch-wound analýzy zhodnocen vliv hladiny eprese TUG1 na schopnost migrace buněk. Buňky transfekované siRNA specifickou pro TUG1 migrovaly prokazatelně méně než buňky transfekované kontrolní siRNA. Stejný efekt experimentálního snížení TUG1 byl pozorován i u buněčných linií nádorů jícnu (Xu et al., 2015). Tan et al.(2015b) ve své práci zkoumali u buněčných linií nádoru NMM zapojení TUG1 do procesu invazivity a radiorezistence. Zjistili, že TUG1 negativně reguluje miR-145, a tím skrze ZEB2 indukuje proces EMT, který je jednou z hlavních příčin buněčné invazivity a radiorezistence. Pomocí průtokové cytometrie byl analyzován účinek umělého snížení TUG1 na apoptické dráhy. Buňky byly transfekovány TUG1 specifickou siRNA podle klasického postupu a 72 hodin kultivovány za standardních podmínek. Pro detekci raně a pozdně apoptických buněk byla použita kombinace fluorochromů Annexin V a propidium jodid. Celkové množství apoptických buněk v populaci transfekované TUG1 specifickou siRNA se ale nelišilo od populace ovlivněné kontrolní siRNA. Znatelný rozdíl byl sice zaznamenán v množství pozdně apoptických buněk, avšak ani v tomto případě nebylo dosaženo statisticky významného rozdílu, což není v souladu se studií výzkumného týmu Han et al (2013b). Ti během své studie zjistili, že snížení TUG1 vede k prokazatelnému zvýšení množství apoptických buněk u linie T-24 a 5637. Rovněž další autoři potvrdili antiapoptický účinek TUG1 u osteosarkomu a hepatocelulárního karcinomu (Huang et al., 2015; Zhang et al., 2013). Nicméně studie zabývající se úlohou TUG1 u karcinomu jícnu nepotvrdila její zapojení do procesu apoptózy (Xu et al., 2015). Zhang et al. (2014) dokonce popsali proapotický potenciál TUG1 u nemalobuněčného nádoru plic a přímé zapojení této lncRNA do dráhy p53. Je tedy zřejmé, že bude nezbytné provést další experimenty, najít cílové molekuly lncRNA TUG1 a celkově objasnit její úlohu v rámci apoptické kaskády. Moje studie rovněž neprokázala zapojení TUG1 do dějů řídících buněčný cyklus. Doposud nebyla publikována žádná práce zabývající se tímto fenoménem u karcinomu močového měchýře. 73

Výsledky této diplomové práce naznačují nespornou úlohu lncRNA v molekulární patologii karcinomu močového měchýře. TUG1 hraje pravděpodobně klíčovou roli v procesech vedoucích k buněčné proliferaci a migraci, což z něj činí potenciální terapeutický cíl. Bude však nezbytné tuto lncRNA podrobněji charakterizovat, určit její buněčné cíle a detailně objasnit její funkční mechanismy. Už dnes je ale zřejmé, že tato skupina dlouhých nekódujích RNA by mohla být jedním z klíčů k objasnění komplexní molekulární biologie nádorů močového měchýře. Podrobné studium těchto RNA molekul by mohlo přinést nové účinné terapeutické přístupy, a tak i lepší vyhlídky pro pacienty trpící tímto onemocněním.

74

8 Souhrn Nádor močového měchýře je nejčastější malignitou močového traktu a celkově se řadí mezi nejběžněji diagnostikovaná onkologická onemocnění. Na základě prorůstání do svaloviny měchýře se NMM dále dělí na invazivní a neinvazivní formu. I když je prognóza pacientů s neinvazivním NMM příznivá, často se u nich objevuje relaps onemocnění. Naproti tomu prognóza pacientů s invazivním nádorem je značně nepříznivá, s 5letým přežitím méně než 50 %. Objasnění složité molekulární patogeneze se zdá být stěžejní pro vývoj nových především

neinvazivních monitorovacích metod

pro včasný záchyt

recidivujícího

onemocnění, ale také pro rozvoj nových terapeutických přístupů a komplexní léčby. LncRNA jakožto důležití regulátoři genové exprese i dalších buněčných dějů, jsou jedním z možných klíčů vedoucích k objasnění patogeneze NMM a tedy i k nové protinádorové léčbě. S využitím qRT-PCR byly u souboru 49 párových vzorků karcinomu močového měchýře a přilehlé zdravé tkáně analyzovány expresní hladiny 6 vybraných lncRNA: UCA1, HOTAIR, MALAT1, TUG1, GAS5 a MEG3. TUG1 a HOTAIR byly signifikantně zvýšené v nádoru ve srovnání s nenádorovou tkání. MEG3 naopak vykazoval významně sníženou hladinu v nádorové oproti nenádorové tkáni. Expresní hladiny TUG1 a HOTAIR negativně korelovaly s celkovou délkou přežití pacientů. Pomocí tranzientní transfekce siRNA sekvenčně specifickou pro TUG1 byla uměle snížena hladina této lncRNA u buněčné linie T-24, a tím bylo umožněno sledovat vliv TUG1 na buněčnou proliferaci, migraci, apoptózu a buněčný cyklus. Po experimentálním snížení TUG1 došlo k statisticky významnému snížení proliferace a viability buněk. Buňky transfekované TUG1 specifickou siRNA vykazovaly o 34 % sníženou metabolickou aktivitu (MTT test) a téměř o 40 % sníženou proliferaci. Rovněž migrace buněk s experimentálně sníženou TUG1 byla signifikantně nižší než u buněk ovlivněných kontrolní siRNA. Vliv TUG1 na apoptózu a buněčný cyklus nebyl v této práci prokázán. Závěrem lze dodat, že tato práce s názvem: Studium dlouhých nekódujících RNA u nádorů močového měchýře, potvrdila zapojení TUG1 do molekulární patogeneze nádoru močového měchýře. Pomocí in vitro testů bylo prokázáno zapojení TUG1 do buněčné proliferace a migrace, tedy stěžejních dějů maligní transformace. Na základě míry exprese TUG1 bylo také možné odlišit zdravou tkáň od nádorové a pomocí Kaplan-Meierovy analýzy byla zjištěna signifikantní korelace mezi expresní hladinou TUG1 a celkovým přežíváním pacientů, což z TUG1 činí potenciální diagnostický a prognostický biomarker. 75

9 Summary Bladder cancer is the most common malignity of urinal tract and one of the most common malignities in general. Based on the invasivity of tumour into the muscle layer, bladder cancer can be divided into two major groups. Non-muscle invasive bladder cancers have favourable prognosis but frequently recur. Muscle invasive bladder cancers have poor prognosis with five-year survival <50%. Understanding of the complex molecular pathogenesis is crucial for development of new therapeutic approaches, especially noninvasive monitoring methods for early detection of recurring disease and more effective complex therapy. LncRNAs are important regulators of gene expression involved in many cellular processes. LncRNAs thus can play critical role in the pathogenesis of bladder cancer. With the use of qRT-PCR , we analysed expressions of 6 lncRNAs (TUG1, HOTAIR, MALAT1, UCA1, GAS5, MEG3) in 49 bladder cancer tissue samples and normal adjacent tissues. The expression levels of TUG1 and HOTAIR were significantly up-regulated in bladder cancer tissues compared with normal adjacent tissues, whereas expression of MEG3 in bladder tissues was significantly down-regulated. Expression level of TUG1 and MALAT1 negatively corelated with overall survival of patients. For experimental downregulation of TUG1 level, we transfected bladder carcinoma T24 cells with TUG1 small interfering RNA. Then we could observe the effect of TUG1 on cellular proliferation, migration, apoptosis and viability of cells. Decreased TUG1 caused significant reduction of proliferation and viability of cells. The metabolic activity of cells transfected with TUG1 small interfering RNA decreased by 34 %. In the case of proliferation, the reduction was even higher almost 40 %. Inhibition of TUG1 expression also led to elimination of migration. We didn’t observe any effect of expression TUG1 on the cell cycle regulation and apoptosis. This thesis, named Study of long non-coding RNA in bladder cancer, confirmed that TUG1 is involved in molecular pathogenesis of the bladder cancer. With the use of in vitro analysis, we determined that TUG1 controls cell proliferation and migration which are the crucial processes of malignant transformation. On the basis of TUG1 expression level, it was possible to distinguish bladder cancers from normal tissues. Kaplan- Meier survival analysis revealed that patients with high expression of TUG1 had shorter overall survival time. In conclusion, TUG1 can be used as a potential diagnostic and prognostic biomarker.

76

Přehled literatury ABOULKASSIM, Tahar O., Hélène LARUE, Patricia LEMIEUX, François ROUSSEAU a Yves FRADET, 2003. Alteration of the PATCHED locus in superficial bladder cancer. Oncogene [online]. 15.5., roč. 22, č. 19, s. 2967–2971. ISSN 0950-9232. Dostupné z: doi:10.1038/sj.onc.1206513 Adam Z., Krejčí M., Vorlíček J. 2010. Speciální onkologie. Praha, Galén (first edition) AVEYARD, J. S., A. SKILLETER, T. HABUCHI a M. A. KNOWLES, 1999. Somatic mutation of PTEN in bladder carcinoma. British Journal of Cancer [online]. 5., roč. 80, č. 56, s. 904–908. ISSN 0007-0920. Dostupné z: doi:10.1038/sj.bjc.6690439 CAMPALANS, Anna, Adam KONDOROSI a Martin CRESPI, 2004. Enod40, a Short Open Reading Frame–Containing mRNA, Induces Cytoplasmic Localization of a Nuclear RNA Binding Protein in Medicago truncatula. The Plant Cell [online]. 4., roč. 16, č. 4, s. 1047– 1059. ISSN 1040-4651. Dostupné z: doi:10.1105/tpc.019406 CANCER GENOME ATLAS RESEARCH NETWORK, 2014. Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma. Nature [online]. 20.3., roč. 507, č. 7492, s. 315–322. ISSN 1476-4687. Dostupné z: doi:10.1038/nature12965 CAO, Qifeng, Ning WANG, Juan QI, Zhengqin GU a Haibo SHEN, 2015. Long non‑coding RNA‑GAS5 acts as a tumor suppressor in bladder transitional cell carcinoma via regulation of chemokine (C‑C motif) ligand 1 expression. Molecular Medicine Reports [online]. 5.11. ISSN 1791-3004. Dostupné z: doi:10.3892/mmr.2015.4503 CATTO, James W. F., Saiful MIAH, Helen C. OWEN, Helen BRYANT, Katie MYERS, Ewa DUDZIEC, Stéphane LARRÉ, Marta MILO, Ishtiaq REHMAN, Derek J. ROSARIO, Erica DI MARTINO, Margaret A. KNOWLES, Mark MEUTH, Adrian L. HARRIS a Freddie C. HAMDY, 2009. Distinct microRNA alterations characterize high- and low-grade bladder cancer. Cancer Research [online]. 1.11., roč. 69, č. 21, s. 8472–8481. ISSN 1538-7445. Dostupné z: doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-0744 CRAWFORD, D. R., G. P. SCHOOLS, S. L. SALMON a K. J. DAVIES, 1996. Hydrogen peroxide induces the expression of adapt15, a novel RNA associated with polysomes in hamster HA-1 cells. Archives of Biochemistry and Biophysics [online]. 15.1., roč. 325, č. 2, s. 256–264. ISSN 0003-9861. Dostupné z: doi:10.1006/abbi.1996.0032 DAMRAUER, Jeffrey S., Katherine A. HOADLEY, David D. CHISM, Cheng FAN, Christopher J. TIGANELLI, Sara E. WOBKER, Jen Jen YEH, Matthew I. MILOWSKY, Gopa IYER, Joel S. PARKER a William Y. KIM, 2014. Intrinsic subtypes of high-grade bladder cancer reflect the hallmarks of breast cancer biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [online]. 25.2., roč. 111, č. 8, s. 3110– 3115. ISSN 1091-6490. Dostupné z: doi:10.1073/pnas.1318376111 DU, Hong-Fei, Li-Ping OU, Chang-Kun LV, Xue YANG, Xue-Dong SONG, Yan-Ru FAN, Xiao-Hou WU a Chun-Li LUO, 2015. Expression of hepaCAM inhibits bladder cancer cell proliferation via a Wnt/β-catenin-dependent pathway in vitro and in vivo. Cancer Biology & Therapy [online]. 10., roč. 16, č. 10, s. 1502–1513. ISSN 1555-8576. Dostupné z: doi:10.1080/15384047.2015.1071732 77

ERUSLANOV, Evgeniy, Taryn STOFFS, Wan-Ju KIM, Irina DAURKIN, Scott M. GILBERT, Li-Ming SU, Johannes VIEWEG, Yehia DAAKA a Sergei KUSMARTSEV, 2013. Expansion of CCR8(+) inflammatory myeloid cells in cancer patients with urothelial and renal carcinomas. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research [online]. 1.4., roč. 19, č. 7, s. 1670–1680. ISSN 1078-0432. Dostupné z: doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2091 FAN, Yu, Bing SHEN, Mingyue TAN, Xinyu MU, Yan QIN, Fang ZHANG a Yong LIU, 2014a. Long non-coding RNA UCA1 increases chemoresistance of bladder cancer cells by regulating Wnt signaling. The FEBS journal [online]. 4., roč. 281, č. 7, s. 1750–1758. ISSN 1742-4658. Dostupné z: doi:10.1111/febs.12737 FAN, Yu, Bing SHEN, Mingyue TAN, Xinyu MU, Yan QIN, Fang ZHANG a Yong LIU, 2014b. Long non-coding RNA UCA1 increases chemoresistance of bladder cancer cells by regulating Wnt signaling. The FEBS journal [online]. 4., roč. 281, č. 7, s. 1750–1758. ISSN 1742-4658. Dostupné z: doi:10.1111/febs.12737 FAN, Yu, Bing SHEN, Mingyue TAN, Xinyu MU, Yan QIN, Fang ZHANG a Yong LIU, 2014c. TGF-β-induced upregulation of malat1 promotes bladder cancer metastasis by associating with suz12. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research [online]. 15.3., roč. 20, č. 6, s. 1531–1541. ISSN 1078-0432. Dostupné z: doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-1455 FERLAY, Jacques, Hai-Rim SHIN, Freddie BRAY, David FORMAN, Colin MATHERS a Donald Maxwell PARKIN, 2010. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer [online]. 15.12., roč. 127, č. 12, s. 2893–2917. ISSN 1097-0215. Dostupné z: doi:10.1002/ijc.25516 FLAHAUT, M., R. MEIER, A. COULON, K. A. NARDOU, F. K. NIGGLI, D. MARTINET, J. S. BECKMANN, J.-M. JOSEPH, A. MÜHLETHALER-MOTTET a N. GROSS, 2009. The Wnt receptor FZD1 mediates chemoresistance in neuroblastoma through activation of the Wnt/beta-catenin pathway. Oncogene [online]. 11.6., roč. 28, č. 23, s. 2245–2256. ISSN 1476-5594. Dostupné z: doi:10.1038/onc.2009.80 FLEISCHMANN, Achim, Diana ROTZER, Roland SEILER, Urs E. STUDER a George N. THALMANN, 2011. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. European Urology [online]. 8., roč. 60, č. 2, s. 350–357. ISSN 1873-7560. Dostupné z: doi:10.1016/j.eururo.2011.05.035 FU, Xing, Yuchen LIU, Chengle ZHUANG, Li LIU, Zhiming CAI a Weiren HUANG, 2015. Synthetic artificial microRNAs targeting UCA1-MALAT1 or c-Myc inhibit malignant phenotypes of bladder cancer cells T24 and 5637. Molecular bioSystems [online]. 5., roč. 11, č. 5, s. 1285–1289. ISSN 1742-2051. Dostupné z: doi:10.1039/c5mb00127g GREIFE, Annemarie, Judith KNIEVEL, Teodora RIBARSKA, Günter NIEGISCH a Wolfgang A SCHULZ, 2014. Concomitant downregulation of the imprinted genes DLK1 and MEG3 at 14q32.2 by epigenetic mechanisms in urothelial carcinoma. Clinical Epigenetics [online]. 23.11., roč. 6, č. 1 [vid. 22. listopad 2015]. ISSN 1868-7075. Dostupné z: doi:10.1186/1868-7083-6-29 78

GRIVAS, Petros D., Marilena MELAS a Athanasios G. PAPAVASSILIOU, 2015. The biological complexity of urothelial carcinoma: Insights into carcinogenesis, targets and biomarkers of response to therapeutic approaches. Seminars in Cancer Biology [online]. 22.8. ISSN 1096-3650. Dostupné z: doi:10.1016/j.semcancer.2015.08.006 GUAN, Xiangming, 2015. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta Pharmaceutica Sinica. B [online]. 9., roč. 5, č. 5, s. 402–418. ISSN 2211-3835. Dostupné z: doi:10.1016/j.apsb.2015.07.005 GUO, Guangwu, Xiaojuan SUN, Chao CHEN, Song WU, Peide HUANG, Zesong LI, Michael DEAN, Yi HUANG, Wenlong JIA, Quan ZHOU, Aifa TANG, Zuoquan YANG, Xianxin LI, Pengfei SONG, Xiaokun ZHAO, Rui YE, Shiqiang ZHANG, Zhao LIN, Mingfu QI, Shengqing WAN, Liangfu XIE, Fan FAN, Michael L. NICKERSON, Xiangjun ZOU, Xueda HU, Li XING, Zhaojie LV, Hongbin MEI, Shengjie GAO, Chaozhao LIANG, Zhibo GAO, Jingxiao LU, Yuan YU, Chunxiao LIU, Lin LI, Xiaodong FANG, Zhimao JIANG, Jie YANG, Cailing LI, Xin ZHAO, Jing CHEN, Fang ZHANG, Yongqi LAI, Zheguang LIN, Fangjian ZHOU, Hao CHEN, Hsiao Chang CHAN, Shirley TSANG, Dan THEODORESCU, Yingrui LI, Xiuqing ZHANG, Jian WANG, Huanming YANG, Yaoting GUI, Jun WANG a Zhiming CAI, 2013. Whole-genome and whole-exome sequencing of bladder cancer identifies frequent alterations in genes involved in sister chromatid cohesion and segregation. Nature Genetics [online]. 12., roč. 45, č. 12, s. 1459–1463. ISSN 1061-4036. Dostupné z: doi:10.1038/ng.2798 GUTSCHNER, Tony a Sven DIEDERICHS, 2012. The hallmarks of cancer: a long noncoding RNA point of view. RNA biology [online]. 6., roč. 9, č. 6, s. 703–719. ISSN 15558584. Dostupné z: doi:10.4161/rna.20481 HAN, Yonghua, Yuchen LIU, Yaoting GUI a Zhiming CAI, 2013a. Long intergenic noncoding RNA TUG1 is overexpressed in urothelial carcinoma of the bladder. Journal of Surgical Oncology [online]. 4., roč. 107, č. 5, s. 555–559. ISSN 1096-9098. Dostupné z: doi:10.1002/jso.23264 HAN, Yonghua, Yuchen LIU, Yaoting GUI a Zhiming CAI, 2013b. Long intergenic noncoding RNA TUG1 is overexpressed in urothelial carcinoma of the bladder. Journal of Surgical Oncology [online]. 1.4., roč. 107, č. 5, s. 555–559. ISSN 1096-9098. Dostupné z: doi:10.1002/jso.23264 HAN, Yonghua, Yuchen LIU, Liping NIE, Yaoting GUI a Zhiming CAI, 2013c. Inducing cell proliferation inhibition, apoptosis, and motility reduction by silencing long noncoding ribonucleic acid metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in urothelial carcinoma of the bladder. Urology [online]. 1., roč. 81, č. 1, s. 209.e1–7. ISSN 1527-9995. Dostupné z: doi:10.1016/j.urology.2012.08.044 HAN, Yonghua, Yuchen LIU, Hu ZHANG, Tiantian WANG, Ruiying DIAO, Zhimao JIANG, Yaoting GUI a Zhiming CAI, 2013d. Hsa-miR-125b suppresses bladder cancer development by down-regulating oncogene SIRT7 and oncogenic long noncoding RNA MALAT1. FEBS letters [online]. 25.10. ISSN 1873-3468. Dostupné z: doi:10.1016/j.febslet.2013.10.023 HERNÁNDEZ, Silvia, Elena LÓPEZ-KNOWLES, Josep LLORETA, Manolis KOGEVINAS, Alex AMORÓS, Adonina TARDÓN, Alfredo CARRATO, Consol SERRA, Núria MALATS a Francisco X. REAL, 2006. Prospective study of FGFR3 mutations as a 79

prognostic factor in nonmuscle invasive urothelial bladder carcinomas. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology [online]. 1.8., roč. 24, č. 22, s. 3664–3671. ISSN 1527-7755. Dostupné z: doi:10.1200/JCO.2005.05.1771 HEUBACH, Judith, Juliana MONSIOR, René DEENEN, Günter NIEGISCH, Tibor SZARVAS, Christian NIEDWOROK, Wolfgang Arthur SCHULZ a Michèle Janine HOFFMANN, 2015. The long noncoding RNA HOTAIR has tissue and cell type-dependent effects on HOX gene expression and phenotype of urothelial cancer cells. Molecular Cancer [online]. roč. 14, s. 108. ISSN 1476-4598. Dostupné z: doi:10.1186/s12943-015-0371-8 HE, Wang, Qingqing CAI, Fenyong SUN, Guangzheng ZHONG, Pei WANG, Hongyan LIU, Junhua LUO, Hao YU, Jian HUANG a Tianxin LIN, 2013a. linc-UBC1 physically associates with polycomb repressive complex 2 (PRC2) and acts as a negative prognostic factor for lymph node metastasis and survival in bladder cancer. Biochimica Et Biophysica Acta [online]. 10., roč. 1832, č. 10, s. 1528–1537. ISSN 0006-3002. Dostupné z: doi:10.1016/j.bbadis.2013.05.010 HE, Wang, Qingqing CAI, Fenyong SUN, Guangzheng ZHONG, Pei WANG, Hongyan LIU, Junhua LUO, Hao YU, Jian HUANG a Tianxin LIN, 2013b. linc-UBC1 physically associates with polycomb repressive complex 2 (PRC2) and acts as a negative prognostic factor for lymph node metastasis and survival in bladder cancer. Biochimica Et Biophysica Acta [online]. 10., roč. 1832, č. 10, s. 1528–1537. ISSN 0006-3002. Dostupné z: doi:10.1016/j.bbadis.2013.05.010 HUANG, Ming-De, Wen-Ming CHEN, Fu-Zhen QI, Ming SUN, Tong-Peng XU, Pei MA a Yong-Qian SHU, 2015. Long non-coding RNA TUG1 is up-regulated in hepatocellular carcinoma and promotes cell growth and apoptosis by epigenetically silencing of KLF2. Molecular Cancer [online]. roč. 14, s. 165. ISSN 1476-4598. Dostupné z: doi:10.1186/s12943-015-0431-0 CHENG, H-L, H-S LIU, Y-J LIN, H H-W CHEN, P-Y HSU, T-Y CHANG, C-L HO, T-S TZAI a N-H CHOW, 2005. Co-expression of RON and MET is a prognostic indicator for patients with transitional-cell carcinoma of the bladder. British Journal of Cancer [online]. 23.5., roč. 92, č. 10, s. 1906–1914. ISSN 0007-0920. Dostupné z: doi:10.1038/sj.bjc.6602593 CHEN, Tao, Wanqin XIE, Linguo XIE, Yan SUN, Yu ZHANG, Zhonghua SHEN, Nan SHA, Hao XU, Zhouliang WU, Hailong HU a Changli WU, 2015. Expression of long noncoding RNA lncRNA-n336928 is correlated with tumor stage and grade and overall survival in bladder cancer. Biochemical and Biophysical Research Communications [online]. 25.12., roč. 468, č. 4, s. 666–670. ISSN 1090-2104. Dostupné z: doi:10.1016/j.bbrc.2015.11.013 CHOI, Woonyoung, Sima PORTEN, Seungchan KIM, Daniel WILLIS, Elizabeth R. PLIMACK, Jean HOFFMAN-CENSITS, Beat ROTH, Tiewei CHENG, Mai TRAN, I.-Ling LEE, Jonathan MELQUIST, Jolanta BONDARUK, Tadeusz MAJEWSKI, Shizhen ZHANG, Shanna PRETZSCH, Keith BAGGERLY, Arlene SIEFKER-RADTKE, Bogdan CZERNIAK, Colin P. N. DINNEY a David J. MCCONKEY, 2014. Identification of distinct basal and luminal subtypes of muscle-invasive bladder cancer with different sensitivities to frontline chemotherapy. Cancer Cell [online]. 10.2., roč. 25, č. 2, s. 152–165. ISSN 1878-3686. Dostupné z: doi:10.1016/j.ccr.2014.01.009 JEBAR, Adel H., Carolyn D. HURST, Darren C. TOMLINSON, Colin JOHNSTON, Claire F. TAYLOR a Margaret A. KNOWLES, 2005. FGFR3 and Ras gene mutations are mutually 80

exclusive genetic events in urothelial cell carcinoma. Oncogene [online]. 4.8., roč. 24, č. 33, s. 5218–5225. ISSN 0950-9232. Dostupné z: doi:10.1038/sj.onc.1208705 JONES, A M, A D BEGGS, L CARVAJAL-CARMONA, S FARRINGTON, A TENESA, M WALKER, K HOWARTH, S BALLEREAU, S V HODGSON, A ZAUBER, M BERTAGNOLLI, R MIDGLEY, H CAMPBELL, D KERR, M G DUNLOP a I P M TOMLINSON, 2012. TERC polymorphisms are associated both with susceptibility to colorectal cancer and with longer telomeres. Gut [online]. 2., roč. 61, č. 2, s. 248–254. ISSN 0017-5749. Dostupné z: doi:10.1136/gut.2011.239772 KHALIL, Ahmad M., Mitchell GUTTMAN, Maite HUARTE, Manuel GARBER, Arjun RAJ, Dianali RIVEA MORALES, Kelly THOMAS, Aviva PRESSER, Bradley E. BERNSTEIN, Alexander VAN OUDENAARDEN, Aviv REGEV, Eric S. LANDER a John L. RINN, 2009. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatinmodifying complexes and affect gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [online]. 14.7., roč. 106, č. 28, s. 11667–11672. ISSN 0027-8424. Dostupné z: doi:10.1073/pnas.0904715106 KNOWLES, Margaret A. a Carolyn D. HURST, 2015. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews. Cancer [online]. 1., roč. 15, č. 1, s. 25–41. ISSN 1474-1768. Dostupné z: doi:10.1038/nrc3817 KOBUNE, Masayoshi, Hiroki CHIBA, Junji KATO, Kazunori KATO, Kiminori NAKAMURA, Yutaka KAWANO, Kohichi TAKADA, Rishu TAKIMOTO, Tetsuji TAKAYAMA, Hirofumi HAMADA a Yoshiro NIITSU, 2007. Wnt3/RhoA/ROCK signaling pathway is involved in adhesion-mediated drug resistance of multiple myeloma in an autocrine mechanism. Molecular Cancer Therapeutics [online]. 6., roč. 6, č. 6, s. 1774–1784. ISSN 1535-7163. Dostupné z: doi:10.1158/1535-7163.MCT-06-0684 KOMPIER, Lucie C., Irene LURKIN, Madelon N. M. VAN DER AA, Bas W. G. VAN RHIJN, Theo H. VAN DER KWAST a Ellen C. ZWARTHOFF, 2010. FGFR3, HRAS, KRAS, NRAS and PIK3CA mutations in bladder cancer and their potential as biomarkers for surveillance and therapy. PloS One [online]. roč. 5, č. 11, s. e13821. ISSN 1932-6203. Dostupné z: doi:10.1371/journal.pone.0013821 KUNEJ, Tanja, Jana OBSTETER, Ziva POGACAR, Simon HORVAT a George Adrian CALIN, 2014a. The decalog of long non-coding RNA involvement in cancer diagnosis and monitoring. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences [online]. 12., roč. 51, č. 6, s. 344–357. ISSN 1549-781X. Dostupné z: doi:10.3109/10408363.2014.944299 KUNEJ, Tanja, Jana OBSTETER, Ziva POGACAR, Simon HORVAT a George Adrian CALIN, 2014b. The decalog of long non-coding RNA involvement in cancer diagnosis and monitoring. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences [online]. 12., roč. 51, č. 6, s. 344–357. ISSN 1549-781X. Dostupné z: doi:10.3109/10408363.2014.944299 LIAO, Anyan, Weijie WANG, Dawei SUN, Yuliang JIANG, Suqing TIAN, Jinna LI, Xiangshan YANG a Ranran SHI, 2015. Bone morphogenetic protein 2 mediates epithelialmesenchymal transition via AKT and ERK signaling pathways in gastric cancer. Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine [online]. 4., roč. 36, č. 4, s. 2773–2778. ISSN 1423-0380. Dostupné z: doi:10.1007/s13277-014-2901-1 81

LI, Lin-Jin, Jian-Long ZHU, Wen-Shuo BAO, Da-Ke CHEN, Wei-Wen HUANG a Zhi-Liang WENG, 2014a. Long noncoding RNA GHET1 promotes the development of bladder cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. roč. 7, č. 10, s. 7196–7205. ISSN 1936-2625. LIN, Daisy, Tatyana V. PESTOVA, Christopher U. T. HELLEN a Henri TIEDGE, 2008. Translational Control by a Small RNA: Dendritic BC1 RNA Targets the Eukaryotic Initiation Factor 4A Helicase Mechanism. Molecular and Cellular Biology [online]. 5., roč. 28, č. 9, s. 3008–3019. ISSN 0270-7306. Dostupné z: doi:10.1128/MCB.01800-07 LIU, Li, Yuchen LIU, Chengle ZHUANG, Wen XU, Xing FU, Zhaojie LV, Hanwei WU, Lisha MOU, Guoping ZHAO, Zhiming CAI a Weiren HUANG, 2015. Inducing cell growth arrest and apoptosis by silencing long non-coding RNA PCAT-1 in human bladder cancer. Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine [online]. 9., roč. 36, č. 10, s. 7685–7689. ISSN 1423-0380. Dostupné z: doi:10.1007/s13277-015-3490-3 LIU, Zhihong, Wei WANG, Juntao JIANG, Erdun BAO, Dongliang XU, Yigang ZENG, Le TAO a Jianxin QIU, 2013. Downregulation of GAS5 promotes bladder cancer cell proliferation, partly by regulating CDK6. PloS One [online]. roč. 8, č. 9, s. e73991. ISSN 1932-6203. Dostupné z: doi:10.1371/journal.pone.0073991 LI, Zhengkun, Xu LI, Shouzhen WU, Mei XUE a Wei CHEN, 2014b. Long non-coding RNA UCA1 promotes glycolysis by upregulating hexokinase 2 through the mTORSTAT3/microRNA143 pathway. Cancer Science [online]. 8., roč. 105, č. 8, s. 951–955. ISSN 1349-7006. Dostupné z: doi:10.1111/cas.12461 LOPEZ-BELTRAN, Antonio, Rafael J. LUQUE, Jose ALVAREZ-KINDELAN, Ana QUINTERO, Felix MERLO, Maria J. REQUENA a Rodolfo MONTIRONI, 2004. Prognostic factors in survival of patients with stage Ta and T1 bladder urothelial tumors: the role of G1-S modulators (p53, p21Waf1, p27Kip1, cyclin D1, and cyclin D3), proliferation index, and clinicopathologic parameters. American Journal of Clinical Pathology [online]. 9., roč. 122, č. 3, s. 444–452. ISSN 0002-9173. Dostupné z: doi:10.1309/LTFU-3UUM-BY09-5HUM LUO, Ming, Zuowei LI, Wei WANG, Yigang ZENG, Zhihong LIU a Jianxin QIU, 2013. Long non-coding RNA H19 increases bladder cancer metastasis by associating with EZH2 and inhibiting E-cadherin expression. Cancer Letters [online]. 10.6., roč. 333, č. 2, s. 213– 221. ISSN 1872-7980. Dostupné z: doi:10.1016/j.canlet.2013.01.033 MA, Lina, Vladimir B. BAJIC a Zhang ZHANG, 2013a. On the classification of long noncoding RNAs. RNA biology [online]. 6., roč. 10, č. 6, s. 925–933. ISSN 1555-8584. Dostupné z: doi:10.4161/rna.24604 MA, Lina, Vladimir B. BAJIC a Zhang ZHANG, 2013b. On the classification of long noncoding RNAs. RNA biology [online]. 6., roč. 10, č. 6, s. 925–933. ISSN 1555-8584. Dostupné z: doi:10.4161/rna.24604 MARTÍNEZ-FERNÁNDEZ, Mónica, Andrew FEBER, Marta DUEÑAS, Cristina SEGOVIA, Carolina RUBIO, Maria FERNANDEZ, Felipe VILLACAMPA, José DUARTE, Fernando F. LÓPEZ-CALDERÓN, Ma José GÓMEZ-RODRIGUEZ, Daniel CASTELLANO, Jose L. RODRIGUEZ-PERALTO, Federico DE LA ROSA, Stephan BECK a Jesús M. PARAMIO, 2015. Analysis of the Polycomb-related lncRNAs HOTAIR and 82

ANRIL in bladder cancer. Clinical Epigenetics [online]. roč. 7, s. 109. ISSN 1868-7075. Dostupné z: doi:10.1186/s13148-015-0141-x MERCER, Tim R., Marcel E. DINGER, Susan M. SUNKIN, Mark F. MEHLER a John S. MATTICK, 2008. Specific expression of long noncoding RNAs in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [online]. 15.1., roč. 105, č. 2, s. 716–721. ISSN 0027-8424. Dostupné z: doi:10.1073/pnas.0706729105 MIKKELSEN, Tarjei S., Manching KU, David B. JAFFE, Biju ISSAC, Erez LIEBERMAN, Georgia GIANNOUKOS, Pablo ALVAREZ, William BROCKMAN, Tae-Kyung KIM, Richard P. KOCHE, William LEE, Eric MENDENHALL, Aisling O’DONOVAN, Aviva PRESSER, Carsten RUSS, Xiaohui XIE, Alexander MEISSNER, Marius WERNIG, Rudolf JAENISCH, Chad NUSBAUM, Eric S. LANDER a Bradley E. BERNSTEIN, 2007. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature [online]. 2.8., roč. 448, č. 7153, s. 553–560. ISSN 1476-4687. Dostupné z: doi:10.1038/nature06008 MITRA, Anirban P., Donna E. HANSEL a Richard J. COTE, 2012. Prognostic Value of CellCycle Regulation Biomarkers in Bladder Cancer. Seminars in oncology [online]. 10., roč. 39, č. 5, s. 524–533. ISSN 0093-7754. Dostupné z: doi:10.1053/j.seminoncol.2012.08.008 MORRISON, Carl D., Pengyuan LIU, Anna WOLOSZYNSKA-READ, Jianmin ZHANG, Wei LUO, Maochun QIN, Wiam BSHARA, Jeffrey M. CONROY, Linda SABATINI, Peter VEDELL, Donghai XIONG, Song LIU, Jianmin WANG, He SHEN, Yinwei LI, Angela R. OMILIAN, Annette HILL, Karen HEAD, Khurshid GURU, Dimiter KUNNEV, Robert LEACH, Kevin H. ENG, Christopher DARLAK, Christopher HOEFLICH, Srividya VEERANKI, Sean GLENN, Ming YOU, Steven C. PRUITT, Candace S. JOHNSON a Donald L. TRUMP, 2014. Whole-genome sequencing identifies genomic heterogeneity at a nucleotide and chromosomal level in bladder cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [online]. 11.2., roč. 111, č. 6, s. E672–681. ISSN 1091-6490. Dostupné z: doi:10.1073/pnas.1313580111 NODA, T., H. NAGANO, I. TAKEMASA, S. YOSHIOKA, M. MURAKAMI, H. WADA, S. KOBAYASHI, S. MARUBASHI, Y. TAKEDA, K. DONO, K. UMESHITA, N. MATSUURA, K. MATSUBARA, Y. DOKI, M. MORI a M. MONDEN, 2009. Activation of Wnt/beta-catenin signalling pathway induces chemoresistance to interferon-alpha/5fluorouracil combination therapy for hepatocellular carcinoma. British Journal of Cancer [online]. 19.5., roč. 100, č. 10, s. 1647–1658. ISSN 1532-1827. Dostupné z: doi:10.1038/sj.bjc.6605064 NOVIKOVA, Irina V., Scott P. HENNELLY a Karissa Y. SANBONMATSU, 2012. Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator. Nucleic Acids Research [online]. 6., roč. 40, č. 11, s. 5034–5051. ISSN 0305-1048. Dostupné z: doi:10.1093/nar/gks071 ORNITZ, D. M., J. XU, J. S. COLVIN, D. G. MCEWEN, C. A. MACARTHUR, F. COULIER, G. GAO a M. GOLDFARB, 1996. Receptor specificity of the fibroblast growth factor family. The Journal of Biological Chemistry. 21.6., roč. 271, č. 25, s. 15292–15297. ISSN 0021-9258. ØROM, U.A., T. DERRIEN, R. GUIGO a R. SHIEKHATTAR, 2010. Long Noncoding RNAs as Enhancers of Gene Expression. Cold Spring Harbor symposia on quantitative 83

biology [online]. roč. 75, doi:10.1101/sqb.2010.75.058

s.

325–331.

ISSN

0091-7451.

Dostupné

z:

PALMER, Adam C., J. Barry EGAN a Keith E. SHEARWIN, 2011. Transcriptional interference by RNA polymerase pausing and dislodgement of transcription factors. Transcription [online]. 2., roč. 2, č. 1, s. 9–14. ISSN 2154-1272. Dostupné z: doi:10.4161/trns.2.1.13511 PETER, Stefan, Edyta BORKOWSKA, Ross M. DRAYTON, Callum P. RAKHIT, Aidan NOON, Wei CHEN a James Wf CATTO, 2014. Identification of differentially expressed long noncoding RNAs in bladder cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research [online]. 15.10., roč. 20, č. 20, s. 5311–5321. ISSN 1078-0432. Dostupné z: doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0706 PINK, Ryan Charles, Kate WICKS, Daniel Paul CALEY, Emma Kathleen PUNCH, Laura JACOBS a David Raul Francisco CARTER, 2011. Pseudogenes: pseudo-functional or key regulators in health and disease? RNA (New York, N.Y.) [online]. 5., roč. 17, č. 5, s. 792–798. ISSN 1469-9001. Dostupné z: doi:10.1261/rna.2658311 PLATT, Fiona M., Carolyn D. HURST, Claire F. TAYLOR, Walter M. GREGORY, Patricia HARNDEN a Margaret A. KNOWLES, 2009. Spectrum of Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Gene Alterations in Bladder Cancer. Clinical Cancer Research [online]. 1.10., roč. 15, č. 19, s. 6008–6017. ISSN 1078-0432, 1557-3265. Dostupné z: doi:10.1158/10780432.CCR-09-0898 PRENSNER, John R., Wei CHEN, Sumin HAN, Matthew K. IYER, Qi CAO, Vishal KOTHARI, Joseph R. EVANS, Karen E. KNUDSEN, Michelle T. PAULSEN, Mats LJUNGMAN, Theodore S. LAWRENCE, Arul M. CHINNAIYAN a Felix Y. FENG, 2014. The long non-coding RNA PCAT-1 promotes prostate cancer cell proliferation through cMyc. Neoplasia (New York, N.Y.) [online]. 11., roč. 16, č. 11, s. 900–908. ISSN 1476-5586. Dostupné z: doi:10.1016/j.neo.2014.09.001 RAMPIAS, Theodoros, Paraskevi VGENOPOULOU, Margaritis AVGERIS, Alexander POLYZOS, Konstantinos STRAVODIMOS, Christos VALAVANIS, Andreas SCORILAS a Apostolos KLINAKIS, 2014. A new tumor suppressor role for the Notch pathway in bladder cancer. Nature Medicine [online]. 10., roč. 20, č. 10, s. 1199–1205. ISSN 1078-8956. Dostupné z: doi:10.1038/nm.3678 RINTALA-MAKI, Nina D. a Leslie C. SUTHERLAND, 2009. Identification and characterisation of a novel antisense non-coding RNA from the RBM5 gene locus. Gene [online]. 15.9., roč. 445, č. 1-2, s. 7–16. ISSN 1879-0038. Dostupné z: doi:10.1016/j.gene.2009.06.009 SÁNA, J., P. FALTEJSKOVÁ, M. SVOBODA a O. SLABÝ, 2012a. [Long non-coding RNAs and their relevance in cancer]. Klinická Onkologie: Casopis Ceské a Slovenské Onkologické Spolecnosti. roč. 25, č. 4, s. 246–254. ISSN 0862-495X. SÁNA, J., P. FALTEJSKOVÁ, M. SVOBODA a O. SLABÝ, 2012b. [Long non-coding RNAs and their relevance in cancer]. Klinická Onkologie: Casopis Ceské a Slovenské Onkologické Spolecnosti. roč. 25, č. 4, s. 246–254. ISSN 0862-495X.

84

SHEN, Pengliang, Jiabin SUN, Guiqin XU, Li ZHANG, Zhaojuan YANG, Suhua XIA, Yang WANG, Yongzhong LIU a Guowei SHI, 2014. KLF9, a transcription factor induced in flutamide-caused cell apoptosis, inhibits AKT activation and suppresses tumor growth of prostate cancer cells. The Prostate [online]. 6., roč. 74, č. 9, s. 946–958. ISSN 1097-0045. Dostupné z: doi:10.1002/pros.22812 SHI, Xuefei, Ming SUN, Hongbing LIU, Yanwen YAO a Yong SONG, 2013. Long noncoding RNAs: a new frontier in the study of human diseases. Cancer Letters [online]. 10.10., roč. 339, č. 2, s. 159–166. ISSN 1872-7980. Dostupné z: doi:10.1016/j.canlet.2013.06.013 SJÖDAHL, Gottfrid, Martin LAUSS, Sigurdur GUDJONSSON, Fredrik LIEDBERG, Christer HALLDÉN, Gunilla CHEBIL, Wiking MÅNSSON, Mattias HÖGLUND a David LINDGREN, 2011. A systematic study of gene mutations in urothelial carcinoma; inactivating mutations in TSC2 and PIK3R1. PloS One [online]. roč. 6, č. 4, s. e18583. ISSN 1932-6203. Dostupné z: doi:10.1371/journal.pone.0018583 SJÖDAHL, Gottfrid, Martin LAUSS, Kristina LÖVGREN, Gunilla CHEBIL, Sigurdur GUDJONSSON, Srinivas VEERLA, Oliver PATSCHAN, Mattias AINE, Mårten FERNÖ, Markus RINGNÉR, Wiking MÅNSSON, Fredrik LIEDBERG, David LINDGREN a Mattias HÖGLUND, 2012. A Molecular Taxonomy for Urothelial Carcinoma. Clinical Cancer Research [online]. 15.6., roč. 18, č. 12, s. 3377–3386. ISSN 1078-0432, 1557-3265. Dostupné z: doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-0077-T SOLOMON, David A., Jung-Sik KIM, Jolanta BONDARUK, Shahrokh F. SHARIAT, ZengFeng WANG, Abdel G. ELKAHLOUN, Tomoko OZAWA, Julia GERARD, DaZhong ZHUANG, Shizhen ZHANG, Neema NAVAI, Arlene SIEFKER-RADTKE, Joanna J. PHILLIPS, Brian D. ROBINSON, Mark A. RUBIN, Björn VOLKMER, Richard HAUTMANN, Rainer KÜFER, Pancras C. W. HOGENDOORN, George NETTO, Dan THEODORESCU, C. David JAMES, Bogdan CZERNIAK, Markku MIETTINEN a Todd WALDMAN, 2013. Frequent truncating mutations of STAG2 in bladder cancer. Nature Genetics [online]. 12., roč. 45, č. 12, s. 1428–1430. ISSN 1061-4036. Dostupné z: doi:10.1038/ng.2800 ST LAURENT, Georges, Claes WAHLESTEDT a Philipp KAPRANOV, 2015. The Landscape of long noncoding RNA classification. Trends in genetics: TIG [online]. 5., roč. 31, č. 5, s. 239–251. ISSN 0168-9525. Dostupné z: doi:10.1016/j.tig.2015.03.007 SUN, X., P. DU, W. YUAN, Z. DU, M. YU, X. YU a T. HU, 2015. Long non-coding RNA HOTAIR regulates cyclin J via inhibition of microRNA-205 expression in bladder cancer. Cell Death & Disease [online]. roč. 6, s. e1907. ISSN 2041-4889. Dostupné z: doi:10.1038/cddis.2015.269 TAN, Jiemei, Kaifeng QIU, Mingyi LI a Ying LIANG, 2015a. Double-negative feedback loop between long non-coding RNA TUG1 and miR-145 promotes epithelial to mesenchymal transition and radioresistance in human bladder cancer cells. FEBS letters [online]. 7.10., roč. 589, č. 20 Pt B, s. 3175–3181. ISSN 1873-3468. Dostupné z: doi:10.1016/j.febslet.2015.08.020 TAN, Jiemei, Kaifeng QIU, Mingyi LI a Ying LIANG, 2015b. Double-negative feedback loop between long non-coding RNA TUG1 and miR-145 promotes epithelial to mesenchymal transition and radioresistance in human bladder cancer cells. FEBS letters [online]. 7.10., roč. 85

589, č. 20 Pt B, s. doi:10.1016/j.febslet.2015.08.020

3175–3181.

ISSN

1873-3468.

Dostupné

z:

TOMLINSON, Darren C, Fiona R LAMONT, Steve D SHNYDER a Margaret A KNOWLES, 2009. FGFR1 promotes proliferation and survival via activation of the MAPK pathway in bladder cancer. Cancer research [online]. 1.6., roč. 69, č. 11, s. 4613–4620. ISSN 0008-5472. Dostupné z: doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-2816 TOMLINSON, Darren C., Corine G. L’HÔTE, Wendy KENNEDY, Eva PITT a Margaret A. KNOWLES, 2005. Alternative splicing of fibroblast growth factor receptor 3 produces a secreted isoform that inhibits fibroblast growth factor-induced proliferation and is repressed in urothelial carcinoma cell lines. Cancer Research [online]. 15.11., roč. 65, č. 22, s. 10441– 10449. ISSN 0008-5472. Dostupné z: doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-1718 TOMLINSON, DC, O BALDO, P HARNDEN a MA KNOWLES, 2007. FGFR3 protein expression and its relationship to mutation status and prognostic variables in bladder cancer. The Journal of pathology [online]. 9., roč. 213, č. 1, s. 91–98. ISSN 0022-3417. Dostupné z: doi:10.1002/path.2207 TRIPATHI, Vidisha, Jonathan D. ELLIS, Zhen SHEN, David Y. SONG, Qun PAN, Andrew T. WATT, Susan M. FREIER, C. Frank BENNETT, Alok SHARMA, Paula A. BUBULYA, Benjamin J. BLENCOWE, Supriya G. PRASANTH a Kannanganattu V. PRASANTH, 2010. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation. Molecular Cell [online]. 24.9., roč. 39, č. 6, s. 925–938. ISSN 1097-4164. Dostupné z: doi:10.1016/j.molcel.2010.08.011 TSAI, Miao-Chih, Ohad MANOR, Yue WAN, Nima MOSAMMAPARAST, Jordon K. WANG, Fei LAN, Yang SHI, Eran SEGAL a Howard Y. CHANG, 2010. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science (New York, N.Y.) [online]. 6.8., roč. 329, č. 5992, s. 689–693. ISSN 1095-9203. Dostupné z: doi:10.1126/science.1192002 VAN OERS, Johanna M. M., Christoph ADAM, Stefan DENZINGER, Robert STOEHR, Simone BERTZ, Dirk ZAAK, Christian STIEF, Ferdinand HOFSTAEDTER, Ellen C. ZWARTHOFF, Theodorus H. VAN DER KWAST, Ruth KNUECHEL a Arndt HARTMANN, 2006. Chromosome 9 deletions are more frequent than FGFR3 mutations in flat urothelial hyperplasias of the bladder. International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer [online]. 1.9., roč. 119, č. 5, s. 1212–1215. ISSN 0020-7136. Dostupné z: doi:10.1002/ijc.21958 WANG, Longxin, Dian FU, Yongbin QIU, Xiaoxiao XING, Feng XU, Conghui HAN, Xiaofeng XU, Zhifeng WEI, Zhengyu ZHANG, Jingping GE, Wen CHENG a Hai-Long XIE, 2014a. Genome-wide screening and identification of long noncoding RNAs and their interaction with protein coding RNAs in bladder urothelial cell carcinoma. Cancer Letters [online]. 10.7., roč. 349, č. 1, s. 77–86. ISSN 1872-7980. Dostupné z: doi:10.1016/j.canlet.2014.03.033 WANG, Tiantian, Jiancheng YUAN, Nenggui FENG, Yuchi LI, Zheguang LIN, Zhimao JIANG a Yaoting GUI, 2014b. Hsa-miR-1 downregulates long non-coding RNA urothelial cancer associated 1 in bladder cancer. Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine [online]. 10., roč. 35, č. 10, s. 10075– 10084. ISSN 1423-0380. Dostupné z: doi:10.1007/s13277-014-2321-2 86

WANG, Xiujuan, Yanbing GONG, Bo JIN, Chenglin WU, Jianming YANG, Le WANG, Zheng ZHANG a Zebin MAO, 2014c. Long non-coding RNA urothelial carcinoma associated 1 induces cell replication by inhibiting BRG1 in 5637 cells. Oncology Reports [online]. 9., roč. 32, č. 3, s. 1281–1290. ISSN 1791-2431. Dostupné z: doi:10.3892/or.2014.3309 WANG, Yu, Wei CHEN, Chen YANG, Wenjing WU, Shouzhen WU, Xuebin QIN a Xu LI, 2012. Long non-coding RNA UCA1a(CUDR) promotes proliferation and tumorigenesis of bladder cancer. International Journal of Oncology [online]. 7., roč. 41, č. 1, s. 276–284. ISSN 1791-2423. Dostupné z: doi:10.3892/ijo.2012.1443 WILLIAMSON, Magall P., Patricia A. ELDER, Margaret E. SHAW, Jayne DEVLIN a Margaret A. KNOWLES, 1995. p16 (CDKN2) is a major deletion target at 9p21 in bladder cancer. Human Molecular Genetics [online]. 1.9., roč. 4, č. 9, s. 1569–1577. ISSN 0964-6906, 1460-2083. Dostupné z: doi:10.1093/hmg/4.9.1569 WILLIAMS, Sarah V., Carolyn D. HURST a Margaret A. KNOWLES, 2013. Oncogenic FGFR3 gene fusions in bladder cancer. Human Molecular Genetics [online]. 15.2., roč. 22, č. 4, s. 795–803. ISSN 1460-2083. Dostupné z: doi:10.1093/hmg/dds486 WILUSZ, Jeremy E., Courtney K. JNBAPTISTE, Laura Y. LU, Claus-D. KUHN, Leemor JOSHUA-TOR a Phillip A. SHARP, 2012. A triple helix stabilizes the 3’ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes & Development [online]. 1.11., roč. 26, č. 21, s. 2392–2407. ISSN 1549-5477. Dostupné z: doi:10.1101/gad.204438.112 WU, Wenjing, Shuwan ZHANG, Xu LI, Mei XUE, Sancheng CAO a Wei CHEN, 2013. Ets2 regulates cell apoptosis via the Akt pathway, through the regulation of urothelial cancer associated 1, a long non-coding RNA, in bladder cancer cells. PloS One [online]. roč. 8, č. 9, s. e73920. ISSN 1932-6203. Dostupné z: doi:10.1371/journal.pone.0073920 XUE, Mei, Xu LI, Wenjing WU, Shuwan ZHANG, Shouzhen WU, Zhengkun LI a Wei CHEN, 2014a. Upregulation of long non-coding RNA urothelial carcinoma associated 1 by CCAAT/enhancer binding protein α contributes to bladder cancer cell growth and reduced apoptosis. Oncology Reports [online]. 5., roč. 31, č. 5, s. 1993–2000. ISSN 1791-2431. Dostupné z: doi:10.3892/or.2014.3092 XUE, Mei, Xu LI, Wenjing WU, Shuwan ZHANG, Shouzhen WU, Zhengkun LI a Wei CHEN, 2014b. Upregulation of long non-coding RNA urothelial carcinoma associated 1 by CCAAT/enhancer binding protein α contributes to bladder cancer cell growth and reduced apoptosis. Oncology Reports [online]. 5., roč. 31, č. 5, s. 1993–2000. ISSN 1791-2431. Dostupné z: doi:10.3892/or.2014.3092 XUE, Yao, Gaoxiang MA, Zhensheng ZHANG, Qiuhan HUA, Haiyan CHU, Na TONG, Lin YUAN, Chao QIN, Changjun YIN, Zhengdong ZHANG a Meilin WANG, 2015. A novel antisense long noncoding RNA regulates the expression of MDC1 in bladder cancer. Oncotarget [online]. 1.1., roč. 6, č. 1, s. 484–493. ISSN 1949-2553. Dostupné z: doi:10.18632/oncotarget.2861 XU, Youtao, Jie WANG, Mantang QIU, Lei XU, Ming LI, Feng JIANG, Rong YIN a Lin XU, 2015. Upregulation of the long noncoding RNA TUG1 promotes proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma. Tumour Biology: The Journal of the 87

International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine [online]. 3., roč. 36, č. 3, s. 1643–1651. ISSN 1423-0380. Dostupné z: doi:10.1007/s13277-014-2763-6 YANG, Chen, Xu LI, Yu WANG, Le ZHAO a Wei CHEN, 2012. Long non-coding RNA UCA1 regulated cell cycle distribution via CREB through PI3-K dependent pathway in bladder carcinoma cells. Gene [online]. 15.3., roč. 496, č. 1, s. 8–16. ISSN 1879-0038. Dostupné z: doi:10.1016/j.gene.2012.01.012 YAN, Ting-Hua, Sui-Wan LU, Yong-Qing HUANG, Gan-Bo QUE, Jun-Hui CHEN, YongPing CHEN, Hong-Bin ZHANG, Xing-Lan LIANG a Jin-Hua JIANG, 2014. Upregulation of the long noncoding RNA HOTAIR predicts recurrence in stage Ta/T1 bladder cancer. Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine [online]. 10., roč. 35, č. 10, s. 10249–10257. ISSN 1423-0380. Dostupné z: doi:10.1007/s13277-014-2344-8 YING, Liang, Yiran HUANG, Haige CHEN, Yawei WANG, Lei XIA, Yonghui CHEN, Yidong LIU a Feng QIU, 2013. Downregulated MEG3 activates autophagy and increases cell proliferation in bladder cancer. Molecular bioSystems [online]. 3., roč. 9, č. 3, s. 407–411. ISSN 1742-2051. Dostupné z: doi:10.1039/c2mb25386k YING, Liang, Qi CHEN, Yawei WANG, Zhihua ZHOU, Yiran HUANG a Feng QIU, 2012. Upregulated MALAT-1 contributes to bladder cancer cell migration by inducing epithelial-tomesenchymal transition. Molecular bioSystems [online]. 9., roč. 8, č. 9, s. 2289–2294. ISSN 1742-2051. Dostupné z: doi:10.1039/c2mb25070e YOUNG, T. L., T. MATSUDA a C. L. CEPKO, 2005. The noncoding RNA taurine upregulated gene 1 is required for differentiation of the murine retina. Current biology: CB [online]. 29.3., roč. 15, č. 6, s. 501–512. ISSN 0960-9822. Dostupné z: doi:10.1016/j.cub.2005.02.027 ZEISBERG, Michael a Eric G. NEILSON, 2009. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions. The Journal of Clinical Investigation [online]. 1.6., roč. 119, č. 6, s. 1429–1437. ISSN 0021-9738. Dostupné z: doi:10.1172/JCI36183 ZHANG, Dexiang, Yuedi DAI, Yuankun CAI, Tao SUO, Han LIU, Yueqi WANG, Zhijian CHENG a Houbao LIU, 2015. KLF2 is downregulated in pancreatic ductal adenocarcinoma and inhibits the growth and migration of cancer cells. Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine [online]. 8.10. ISSN 1423-0380. Dostupné z: doi:10.1007/s13277-015-4053-3 ZHANG, E.-b, D.-d YIN, M. SUN, R. KONG, X.-h LIU, L.-h YOU, L. HAN, R. XIA, K.-m WANG, J.-s YANG, W. DE, Y.-q SHU a Z.-x WANG, 2014. P53-regulated long non-coding RNA TUG1 affects cell proliferation in human non-small cell lung cancer, partly through epigenetically regulating HOXB7 expression. Cell Death & Disease [online]. roč. 5, s. e1243. ISSN 2041-4889. Dostupné z: doi:10.1038/cddis.2014.201 ZHANG, Qiang, Pei-Liang GENG, Pei YIN, Xiao-Lin WANG, Jin-Peng JIA a Jie YAO, 2013. Down-regulation of long non-coding RNA TUG1 inhibits osteosarcoma cell proliferation and promotes apoptosis. Asian Pacific journal of cancer prevention: APJCP. roč. 14, č. 4, s. 2311–2315. ISSN 1513-7368.

88

ZHANG, Xun, Kimberley RICE, Yingying WANG, Wendy CHEN, Ying ZHONG, Yuki NAKAYAMA, Yunli ZHOU a Anne KLIBANSKI, 2010. Maternally Expressed Gene 3 (MEG3) Noncoding Ribonucleic Acid: Isoform Structure, Expression, and Functions. Endocrinology [online]. 3., roč. 151, č. 3, s. 939–947. ISSN 0013-7227. Dostupné z: doi:10.1210/en.2009-0657 ZHAO, Li a Peter K. VOGT, 2008. Helical domain and kinase domain mutations in p110α of phosphatidylinositol 3-kinase induce gain of function by different mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [online]. 19.2., roč. 105, č. 7, s. 2652–2657. ISSN 0027-8424. Dostupné z: doi:10.1073/pnas.0712169105 ZHAO, Xiao-Lei, Zhen-Hua ZHAO, Wen-Chao XU, Jun-Qing HOU a Xin-Yi DU, 2015. Increased expression of SPRY4-IT1 predicts poor prognosis and promotes tumor growth and metastasis in bladder cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. roč. 8, č. 2, s. 1954–1960. ISSN 1936-2625. ZHU, YI-PING, XIAO-JIE BIAN, DING-WEI YE, XU-DONG YAO, SHI-LIN ZHANG, BO DAI, HAI-LIANG ZHANG a YI-JUN SHEN, 2014. Long noncoding RNA expression signatures of bladder cancer revealed by microarray. Oncology Letters [online]. 4., roč. 7, č. 4, s. 1197–1202. ISSN 1792-1074. Dostupné z: doi:10.3892/ol.2014.1843 ZIEGER, Karsten, Lars DYRSKJØT, Carsten WIUF, Jens L. JENSEN, Claus L. ANDERSEN, Klaus Møller-Ernst JENSEN a Torben Falck ØRNTOFT, 2005. Role of Activating Fibroblast Growth Factor Receptor 3 Mutations in the Development of Bladder Tumors. Clinical Cancer Research [online]. 1.11., roč. 11, č. 21, s. 7709–7719. ISSN 10780432, 1557-3265. Dostupné z: doi:10.1158/1078-0432.CCR-05-1130

89

Seznam obrázků Obrázek 1: Vybrané funkce lncRNA ............................................................................ 27 Obrázek 2: Zapojení lncRNA do procesu EMT u NMM ............................................. 34 Obrázek 3: Schéma uspořádání experimentu pro stanovení exprese TUG1 po transfekci ....................................................................................................................... 47 Obrázek 4: Schéma uspořádání experimentu pro stanovení viability buněk ................ 49 Obrázek 5: Výběr vhodného referenčního genu pomocí algoritmu GeNorm .............. 55 Obrázek 6: Výběr vhodného referenčního genu pomocí algoritmu Normfinder.......... 56 Obrázek 7:Rozdílně exprimované lncRNA mezi nádorem a zdravou tkání ................. 57 Obrázek 8 Korelace expresní hladiny TUG1 se stádiem nádoru (P = 0,058) ............... 59 Obrázek 9: Korelace mezi expresní hladinou lncRNA a dobou přežití pacientů pomocí Kaplan-Meierových křivek ........................................................................................... 61 Obrázek 10: Kaplan-Meierova křivka bezpříznakového přežívání pro TUG1............. 62 Obrázek 11: Růstová křivka linie T-24 ........................................................................ 63 Obrázek 12: Optimalizace transfekce ........................................................................... 64 Obrázek 13: Pokles metabolické aktivity buněk T-24 způsobený sníženou hladinou TUG1. ( 48 h**: p = 0,004; 72 h***: p < 0,0001; 96 h ***: p = 0,0004) .................... 65 Obrázek 14: Snížení proliferace buněčné linie T-24 vlivem inhibice TUG1 ..... 66 Obrázek 15: Vliv transfekce TUG1 specifické siRNA na migraci buněk. .......... 67 Obrázek 16: Porovnání míry zacelení rýhy u buněk transfekovaných TUG1 specifickou siRNA (siRNA) a siRNA negativní kontrolou (Scr) ................................. 67 Obrázek 17: Vliv snížené hladiny TUG1 na regulaci buněčného cyklu ...................... 68 Obrázek 18: Vliv snížené hladiny TUG1 na apoptózu buněk T-24. ............................ 69

90

Seznam tabulek: Tabulka 1: Alterace v onkogenech u nádorů močového měchýře ................................ 20 Tabulka 2: Supresorové alterace u nádoreů močového měchýře ................................. 21 Tabulka 3: Klasifikace lncRNA.................................................................................... 25 Tabulka 4: Klinicko-patologická charakterizace souboru pacientů .............................. 36 Tabulka 5: Příprava MM pro RT .................................................................................. 39 Tabulka 6: Nastavení termocycleru pro RT .................................................................. 40 Tabulka 7: Rozpis pro přípravu MM pro qRT-PCR ..................................................... 41 Tabulka 8: Podmínky pro PCR amplifikaci.................................................................. 41 Tabulka 9: Počty nasazených buněk ............................................................................. 44 Tabulka 10: Příprava transfekční směsi pro jednotlivé in vitro experimenty ............... 46 Tabulka 11: Rozpis množství oligonukleotidu a Lipofectamine RNAiMAX pro optimalizaci transfekce ................................................................................................. 46 Tabulka 12: Kandidátní referenční geny ...................................................................... 55 Tabulka 13: Přehled expresních hladin jednotlivých lncRNA ..................................... 58 Tabulka 14: Porovnání exprese lncRNA mezi nádory o nižším (I+II) a vyšším stádiu (III+IV) ......................................................................................................................... 59 Tabulka 15: Podrobné výsledky z Kaplan-Meierovy analýzy OS a DFS .................... 62

91