UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Algemene Biochemie en Fysische Farmacie Academiejaar 2012-2013
AFGIFTE VAN SMALL INTERFERING RNA IN ALVEOLAIR EPITHEEL VIA MET LONGSURFACTANT GECOATTE TE DEXTRAAN NANOGELEN
Vanessa VERBEKE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. apr. De Smedt SC
Commissarissen Dr. apr. Raemdonck K Prof. dr. apr. Sanders N
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Algemene Biochemie en Fysische Farmacie Academiejaar 2012-2013
AFGIFTE VAN SMALL INTERFERING RNA IN ALVEOLAIR EPITHEEL VIA MET LONGSURFACTANT GECOATTE TE DEXTRAAN NANOGELEN
Vanessa VERBEKE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. apr. De Smedt SC
Commissarissen Dr. apr. Raemdonck K Prof. dr. apr. Sanders N
AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 6 mei 2013
Promotor
Auteur
Prof. dr. apr. De Smedt SC
Verbeke V
SAMENVATTING Voor de behandeling van genetische aandoeningen worden vaak macromoleculen aangewend zoals proteïnen of nucleïnezuren. De administratie van nanocarriërs die small interfering RNA (siRNA) bevatten voor RNA interferentie is een beloftevolle manier om genetische aandoeningen te behandelen. Liposomen en polymeren zijn de meest gebruikte nanocarriërs. In eerder gepubliceerd werk door Raemdonck et al. en De Backer et al. werd het potentieel van dextraan nanogelen (NGs) reeds aangetoond. De gebruikte formulatie kan echter nog verder geoptimaliseerd worden. In deze masterproef werd de efficiëntie van met longsurfactant gecoatte dextraan NGs onderzocht. Verschillende formulaties dextraan NGs werden in meerdere in vitro experimenten met elkaar vergeleken. Veel tijd werd besteed aan de fysicochemische karakterisatie van gecoatte en niet-gecoatte dextraan NGs. De klemtoon hierbij lag op de studie van partikelgrootte, zèta potentiaal en colloïdale stabiliteit van gecoatte NGs in verschillende buffers. De verschillende buffers werden gebruikt om verschillende in vivo omstandigheden na te bootsen en het gedrag van de NGs hierin te bestuderen. Besloten kon worden dat de NGs het meest stabiel waren bij zure pH en lage zoutconcentratie. Verder werden transfecties met 5 verschillende formulaties (dextraan NGs, dextraan NGs + longsurfactant vesikels, gecoatte dextraan NGs (al dan niet geültracentrifugeerd) en siRNA) op carcinoma cellen van het alveolaire epitheel uitgevoerd. De klemtoon hierbij lag op het aantonen van een meerwaarde van gecoatte NGs tov. niet gecoatte NGs. Een betere celviabiliteit werd bekomen met gecoatte NGs dan met niet gecoatte NGs. Wanneer gekeken werd naar intracellulaire opname kon gezien worden dat deze lager lag bij gecoatte NGs (negatief geladen) dan bij niet gecoatte. Verder kon een hoge gemiddelde genonderdrukking van 89% en 38% door siNGs geïncubeerd met respectievelijk 100 nM en 10 nM siRNA gezien worden (= 3.33 en 0.333 pmol siRNA/µg NGs). Ondanks de lage intracellulaire opname van gecoatte NGs wordt dus een goede genonderdrukking gezien. Bij een concentratie van 100 nM siRNA kon geen significant verschil in genonderdrukking tussen gecoatte en niet gecoatte NGs aangetoond worden. Bij 10 nM siRNA werd een significant betere onderdrukking door gecoatte NGs aangetoond. Tenslotte kon een verbeterde endosomale vrijstelling van gecoatte NGs niet aangetoond worden, omdat geen besluiten konden genomen worden betreffende de endosomale vrijstelling van niet-gecoatte NGs. De uitgevoerde experimenten zijn veelbelovend maar dienen echter nog herhaald en geoptimaliseerd te worden in de toekomst.
DANKWOORD Uiteraard zou ik heel graag enkele mensen willen bedanken die mij goed geholpen hebben bij het tot stand komen van deze masterproef. Hierbij denk ik in eerste instantie aan mijn promotor prof. dr. apr. De Smedt SC, die me de mogelijkheid gaf dit onderzoek uit te voeren in het Laboratorium voor Algemene Biochemie en Fysische Farmacie. Verder wil ik in het bijzonder mijn persoonlijke begeleidster apr. De Backer L bedanken voor haar uitmuntende begeleiding bij het uitwerken van mijn masterproef. Haar geduld, enthousiasme, vakkennis en opvolging hebben het mij mogelijk gemaakt dit resultaat te realiseren. De uitvoering van de experimenten verliep altijd vlot dankzij haar goed gestructureerde planning. De samenwerking was heel fijn en bijzonder leerrijk. Verder dank ik prof. dr. apr. Braeckmans K, prof. dr. apr. Demeester J, de (post)doctoraatsstudenten en het (labo)personeel voor de aangename sfeer en de goede begeleiding in het labo. Vragen werden immer met een glimlach beantwoord. Tevens wil ik mijn medestudenten bedanken voor de gezellige momenten in het labo en in onze ‘meeting room’, de leuke babbels tijdens de middagpauzes en de nog leukere babbels tijdens onze uitjes. Een bijzonder woord van dank gaat uit naar mijn vriend Cardoen F. Zijn niet aflatend enthousiasme en vakkundige raad helpen mij geholpen om dit resultaat te verwezenlijken. Hij was de persoon die er altijd was om te luisteren naar mijn vragen en twijfels. Oprechte dank daarvoor. Verder wil ik mijn vrienden bedanken voor de nodige ontspanning tijdens deze 4 maanden. Tenslotte bedank ik mijn ouders voor hun mentale en financiële steun. Voor hen was het zeker niet gemakkelijk om te horen te krijgen dat hun dochter na 6 jaar studie diergeneeskunde besloot om nog een bijkomende opleiding aan de Faculteit voor Farmaceutische Wetenschappen te volgen. Ondanks het feit dat ik nu ondertussen al 8 jaar aan de universiteit studeer, en ze al heel wat hectische examenperiodes met mij achter de rug hebben, blijven zij mij immer steunen. Zonder hen zou mijn academische levensloop niet mogelijk geweest zijn,
Oprechte dank aan iedereen, Verbeke V
INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING DANKWOORD INHOUDSOPGAVE LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 1.
INLEIDING .................................................................................................................... 1
1.1.
ALGEMENE INTRODUCTIE OVER NANOMEDICATIE VOOR RNA INTERFERENTIE ........ 1
1.2.
AFLEVERING VAN siRNA IN DE LONG .......................................................................... 3
1.2.1.
Belang van RNAi in de long .......................................................................................... 3
1.2.2.
Verschillende manieren voor administratie van siRNA aan de long ........................... 3
1.2.3.
Longspecifieke barrières.............................................................................................. 4
1.3.
SAMENSTELLING HYBRIDE NANOPARTIKELS ............................................................... 5
1.3.1.
Small interfering RNA (siRNA) ..................................................................................... 5
1.3.2.
Nanopartikels............................................................................................................... 6
1.3.3.
Pulmonair surfactant ................................................................................................... 8
1.3.3.1.
Endogeen pulmonair surfactant .............................................................................. 8
1.3.3.2.
Exogeen pulmonair surfactant ................................................................................. 8
1.4.
AANMAAK HYBRIDE NANOPARTIKELS ......................................................................... 9
1.5.
INTRACELLULAIRE VERWERKING VAN DE HYBRIDE NANOPARTIKEL ........................ 10
2.
OBJECTIEVEN ............................................................................................................. 13
3.
MATERIAAL EN METHODEN ...................................................................................... 14
3.1.
AANMAAK KATIONISCHE DEX-MA-co-TMAEMA NANOGELEN ................................. 14
3.2.
FYSICOCHEMISCHE KARAKTERISATIE VAN DEX-MA NANOGELEN ............................ 15
3.2.1.
Bepalen van de hydrodynamische diameter en zèta potentiaal via dynamische
lichtverstrooiing (DLS) en zèta potentiaal metingen ............................................................... 15 3.2.1.1.
Principe dynamische lichtverstrooiing (DLS) ......................................................... 15
3.2.1.2.
Principe zèta potentiaal ......................................................................................... 16
3.2.1.3.
Praktische uitvoering ............................................................................................. 18
3.2.2.
Bepalen van de ladingscapaciteit van DEX-MA nanogelen met fluorescentie
correlatie spectroscopie (FCS) .................................................................................................. 19 3.2.2.1.
Principe fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) ........................................... 19
3.2.2.2.
Praktische uitvoering ............................................................................................. 20
3.3.
AANMAAK CUROSURF GECOATTE DEX-(HE)MA NANOGELEN .................................. 21
3.3.1.
Bepaling van de optimale Opti-PREP densiteit voor scheiding van gecoatte siDEX-
(HE)-MA NGs en Curosurf vesikels ........................................................................................... 21 3.4.
COLLOÏDALE STABILITEIT VAN CUROSURF GECOATTE siDEX-(HE)-MA NANOGELEN IN
VERSCHILLENDE BUFFERS ........................................................................................................ 22 3.5.
CELCULTUUR .............................................................................................................. 22
3.6.
INVLOED VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN EN CUROSURF VESIKELS
OP DE CELVIABILITEIT ............................................................................................................... 23 3.6.1.
Principe van MTT test ................................................................................................ 23
3.6.2.
Praktische uitvoering ................................................................................................. 24
3.7.
CELLULAIRE OPNAME VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN ONDER
VERSCHILLENDE CONDITIES BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE ....................................... 25 3.7.1.
Principe flow cytometrie ........................................................................................... 25
3.7.2.
Praktische uitvoering ................................................................................................. 26
3.8.
GENONDERDRUKKING DOOR VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN
BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE..................................................................................... 28 3.9.
ENDOSOMALE FUSIE VAN GECOATTE NANOGELEN BEOORDELEN VIA
FLUORESCENTIE RESONANTIE ENERGIE TRANSFER (FRET) TEST ............................................. 28 3.9.1.
Basisprincipe fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) test ........................ 28
3.9.2.
Praktische uitvoering ................................................................................................. 29
4.
RESULTATEN EN DISCUSSIE ....................................................................................... 31
4.1.
FYSICOCHEMISCHE KARAKTERISATIE VAN DEX-MA NANOGELEN ............................ 31
4.1.1.
Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zèta potentiaal metingen ............................ 31
4.1.2.
Bepalen van de ladingscapaciteit van DEX-MA nanogelen met fluorescentie
correlatie spectroscopie (FCS) .................................................................................................. 32 4.2.
AANMAAK CUROSURF GECOATTE DEX-(HE)-MA NANOGELEN................................. 33
4.2.1.
Bepaling van de optimale Opti-PREP densiteit voor scheiding van gecoatte siDEX-
(HE)-MA nanogelen en Curosurf vesikels................................................................................. 33 4.3.
COLLOÏDALE STABILITEIT VAN CUROSURF GECOATTE DEX-(HE)-MA NANOGELEN IN
VERSCHILLENDE BUFFERS ........................................................................................................ 34 4.3.1.
Metingen in HEPES buffer ......................................................................................... 35
4.3.2.
Metingen in MES buffer............................................................................................. 35
4.3.3.
Metingen in PBS buffer.............................................................................................. 36
4.3.4.
Metingen in RNAse vrij water met PBS buffer .......................................................... 37
4.4.
INVLOED VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN en CS VESIKELS OP DE
CELVIABILITEIT .......................................................................................................................... 40 4.5.
CELLULAIRE OPNAME VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN ONDER
VERSCHILLENDE CONDITIES BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE ....................................... 43 4.6.
GENONDERDRUKKING DOOR VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN
BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE..................................................................................... 46 4.7.
ENDOSOMALE FUSIE VAN GECOATTE NANOGELEN BEOORDELEN VIA
FLUORESCENTIE RESONANTIE ENERGIE TRANSFER (FRET) TEST ............................................. 49 5.
CONCLUSIE ................................................................................................................. 56
6.
LITERATUURLIJST ....................................................................................................... 58
BIJLAGEN
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN A
Acceptor
Ago2
Argonaute endonuclease 2
ASOs
Antisense oligonucleotiden
CS
Curosurf
D
Donor
DEX-HEMA
Dextraan – hydroxyethylmethacrylaat
DEX-MA
Dextraan-methacrylaat
dH
Hydrodynamische diameter
DLS
Dynamische lichtverstrooiing
DMSO
Dimethylsulfoxide
DNA
Desoxyribonucleïnezuur
DS
Graad van substitutie
dsRNA
Dubbelstrengig RNA
DTS
Dispersie technologie software
EDTA
Ethyleen diamine tetra-acetaat
EGFP
Enhanced groen fluorescent proteïne
FBS
Foetaal bovien serum
FCS
Fluorescentie correlatie spectroscopie
FRET
Fluorescentie resonantie energie transfer
FSC
Voorwaartse lichtverstrooiing
GFP
Groen fluorescent proteïne
HB
HEPES buffer
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur
HIV
Humaan immunodeficiëntie virus
kDa
Kilo Dalton
MES
2-(N-morpholine)ethaansulfonzuur
mRNA
Messenger RNA
MTT
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NBD-PE
1,2-dioleolyl-sn-glycero-3-phosphatidyl ethanolamine-7-nitrobenzofurazan
NGs
Nanogelen
NPs
Nanopartikels
NT
Nucleotide
ONs
Oligonucleotiden
OptiMEM
Opti-minimaal essentieel medium
PBS
Fosfaat gebufferde zoutoplossing
PC
L-α-phosphatidylcholine
PDI
Polydispersiteitsindex
PE
L-α-phosphatidylethanolamine
PMT
Foto multiplier tube
PS
3-sn-phosphatidyl-L-serine
RDS
Respiratoir distress syndroom
Rho-PE
1,2-dioleoyl-sn-glycero-phosphatodylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammoniumzout
RISC
RNA geïnduceerd genonderdrukkingscomplex (RNA induced silencing complex)
RNA
Ribonucleïnezuur
RNAi
RNA interferentie
RNase
Ribonuclease
RPM
Omwentelingen per minuut
SA
Sodium azide
shRNA
Small hairpin RNA
siCTRL
Controle siRNA
siGFP
Small interfering GFP
siRNA
Small interfering RNA
SSC
Zijwaartse lichtverstrooiing
TMAEMA
[2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethylammoniumchloride
UV
Ultraviolet
1
1. INLEIDING 1.1.
ALGEMENE INTRODUCTIE OVER NANOMEDICATIE VOOR RNA INTERFERENTIE
Genetische aandoeningen ontstaan door één of meerdere mutaties in de DNA-sequentie van een gen. Hierdoor wordt onvoldoende, te veel of niet-functioneel eiwit geproduceerd. Voor de behandeling van genetische aandoeningen worden vaak macromoleculen aangewend zoals proteïnen of nucleïnezuren.1 De administratie van nucleïnezuren voor RNA interferentie (RNAi) is een beloftevolle manier om dergelijke genetische aandoeningen te behandelen.2 RNAi is een krachtig genonderdrukkingssysteem waarbij de expressie van een specifieke gensequentie posttranscriptioneel geïnhibeerd wordt.2,3 Als nucleïnezuren kan gebruik gemaakt worden van antisense oligonucleotiden (ASOs), dubbelstrengig RNA (dsRNA), of small interfering RNA (siRNA, in de masterproef).3 Deze oligonucleotiden (ONs) worden op een verschillende manier cytoplasmatisch verwerkt, zoals duidelijk geïllustreerd wordt in onderstaande figuur. Wanneer gekozen wordt voor dsRNA of siRNA-expressing plasmiden (shRNA) wordt dit gekliefd door Dicer (= RNase type III familie) in siRNAs van 2125 nucleotiden.3,4 SiRNA wordt vervolgens geïncorporeerd in pre-RNA-induced silencing complex (pre-RISC) waardoor dit complex matuur wordt.4 RISC is een groep van katalytische proteïnen, waaronder de Argonaute endonucleasen (Ago2), die een klieving van target mRNA induceren op basis van de siRNA guide strengen.4,5,6 Het is een evolutionair bewaard afweermechanisme voor inactivatie van RNA. Ago2 klieft eerst 1 streng van het siRNA (sense streng of passenger streng) en de resterende streng (antisense streng of guide streng) wordt behouden en begeleidt het mature RISC complex naar de complementaire sequentie op het doelwit-mRNA waarop gebonden wordt.5,7 Sequentie specifieke splitsing van mRNA door Ago2 gebeurt tussen nucleotide (NT) 10 en 12 vertrekkende van het 5’ uiteinde van de antisense streng. Het gesplitste mRNA heeft een onbeschermd uiteinde en wordt afgebroken door exonucleasen.3,4,5,8,9 Zelden zal 100% van het transcript verwijderd worden. Uiteindelijk wordt het mature RISC gerecupereerd waardoor extra mRNA afgebroken wordt.7 Het therapeutisch effect duurt in sneldelende cellen tussen de 3-7d en in niet-delende cellen meerdere weken.3,10 Om een langdurige RNAi te bekomen moet dus herhaaldelijk gedoseerd worden.
2
Figuur 1.1.. Intracytoplasmatisch mechanisme van RNAi door dsRNA en siRNA.7
Nucleïnezuren kunnen momenteel ontwikkeld worden voor de targeting van bijna ieder humaan gen.2,11 Aangezien bij veel genetische genetische aandoeningen de onderliggende defecte genen reeds gekend zijn, kent RNAi heel wat mogelijke toepassingen.12 Zo zou RNAi kunnen toegepast worden voor de behandeling van een uitgebreide waaier van infecties: viraal (HIV, ebola, hepatitis B en C, herpes simplex, si influenza),5 fungaal, parasitair (leishmaniose) en bacterieel (tuberculose).13 Ook heel wat endogene genen zouden mogelijks als target kunnen dienen. RNAi zou kunnen gebruikt worden voor de behandeling van oogaandoeningen (maculaire retina degeneratie, degeneratie, diabetis retinopathie), dermatologischedermatologische en neurologische aandoeningen, metabole ziektes, hart-, hart lever- en longaandoeningen en voor de behandeling van kanker.2,4,5,11,13 Reeds 20 jaar geleden startten de eerste RNAi preklinische studies, maar tot op heden heden is er nog altijd geen product op de markt.4,5,11,13 Het grote probleem is de aflevering van intacte nucleïnezuren thv. de target.3 Om de vele extraen intracellulaire barrières te overwinnen is inclusie van ONs in nanopartikels (NPs) essentieel.14
3
1.2.
AFLEVERING VAN siRNA IN DE LONG
1.2.1. Belang van RNAi in de long De long is een belangrijk doelwitorgaan voor RNAi omwille van de hoge prevalentie van verschillende pulmonale aandoeningen, zowel infectieus als niet-infectieus (longkanker, chronisch inflammatoire aandoeningen, mucoviscidose). Omwille van deze veelvuldigheid aan letale longziektes zijn efficiënte therapieën hoognodig. De aflevering in de long van therapeutische macromoleculen wordt reeds 30 jaar onderzocht. Klinische toepassing van RNAi in de dagdaaglijkse praktijk zou een grote stap in de goede richting zijn.3,4,5,11,15,16,17 In de longen kunnen epitheelcellen, alveolaire epitheelcellen, macrofagen, respiratoire stamcellen en endotheliale cellen als target dienen.18 In de masterproef wordt de afgifte van siRNA aan alveolaire epitheelcellen onderzocht. Er werd gekozen voor dit celtype omdat een gewijzigde genexpressie in alveolaire epitheelcellen bijdraagt tot de pathogenese van bovenstaande aandoeningen.2 Verder vormen deze cellen een primaire toegangspoort voor veel respiratoire pathogenen en zijn ze gemakkelijk toegankelijk na lokale administratie waardoor ze als target kunnen fungeren.5
De longen vormen mogelijks ook een interessante toegangspoort voor de aflevering van siRNA voor het systeem. Door de hoge vascularisatie, de grote oppervlakte en het ultra dun alveolair epitheel lijkt een efficiënte en vlugge siRNA absorptie mogelijk. Nadelig is evenwel dat de lucht-bloed barrière weinig doorgankelijk is voor het grote, hydrofiele siRNA, zodat hiervoor nog een oplossing moet gevonden worden.3
1.2.2. Verschillende manieren voor administratie van siRNA aan de long Er kan gekozen worden voor een systemische administratie met als target de long, maar de lokale administratie wordt meer toegepast omdat deze heel wat voordelen heeft tov. de systemische.3,11 Door lokale administratie heb je bijvoorbeeld direct toegang tot de longepitheelcellen. Hierdoor kan met een lage dosis, een hoge lokale en een lage systemische concentratie bekomen worden (wat aanleiding geeft tot minder systemische neveneffecten). Door de lagere nuclease activiteit in de luchtwegen ivm. het serum blijft het toegediende siRNA langer stabiel. Bijkomend zijn de formulaties die rechtstreeks toegediend worden aan de long niet onderhevig aan first pass effecten.2,3,4,11,15,16,19,20
4
Verschillende manieren voor lokale administratie zijn mogelijk. In dierstudies wordt vaak geopteerd voor een intratracheale of intranasale toediening, in klinische studies voor een opname via inhalatie.3,4 Het is belangrijk om de administratieroute in rekening te brengen bij de beoordeling van de therapeutische werkzaamheid van een formulatie.3
1.2.3. Longspecifieke barrières Om werkzaam te zijn moet het siRNA onaangetast het cytoplasma van de doelwitcel bereiken. Vooraleer de alveolaire epitheelcel bereikt wordt, moet het siRNA eerst enkele longspecifieke barrières omzeilen. Deze barrières zijn zowel fysisch, chemisch als immunologisch van aard.7 Als eerste kan de complexe anatomie van de long vermeld worden. De multipele vertakkingen in de long geven aanleiding tot luchtwegen met verschillende lengtes en diameters. Aangezien veel longziektes de lagere regio’s aantasten moeten de nanocarriërs een lange en moeilijke weg afleggen.3,4 Bovendien kunnen bij ziekte de fysiologische condities van de luchtwegen sterk veranderd zijn, wat een grote impact heeft op de efficiëntie van pulmonale aflevering. Door infectie en inflammatie ontstaat er bijvoorbeeld een verhoogde secretie van mucus waardoor de mucociliaire clearance veranderd. Mucus verhoogt de viscociteit van de vloeistoflaag op de longepitheelcellen thv. de bovenste luchtwegen.3,4 Ter hoogte van de lagere luchtwegen bestaat de vloeistoflaag uit longsurfactant die de alveolaire epitheliale cellen bedekt, en die interactie aangaat met toegediende nanocarriërs.4 De long beschikt, naast de mucociliaire clearance, over verschillende andere mechanismen om geïnhaleerde, vreemde partikels te verwijderen of kapot te maken. Voorbeelden zijn de hoestreflex, de aanwezigheid van nucleasen en de immuunreacties.3,4,5,15 De kwantitatieve relatie tussen al deze eliminatiemechanismen is nog niet goed gekend. Door deze mechanismen ontstaat een snelle klaring van de nanomedicatie waardoor de initieel hoge concentraties maar van korte duur zijn, en het therapeutisch effect gelimiteerd wordt.15 Het is belangrijk dat met al deze factoren rekening gehouden wordt gedurende de ontwikkeling van nanomedicatie voor verschillende therapeutische applicaties.3
5
1.3.
SAMENSTELLING HYBRIDE NANOPARTIKELS
1.3.1. Small interfering RNA (siRNA) Small interfering RNA (siRNA) is de klasse van RNAi therapeutica die het beste scoort in de preklinische en klinische studies en werd daarom ook gebruikt in de masterproef.11 Alle siRNA moleculen hebben dezelfde basisstructuur, alleen de sequentie wordt aangepast naargelang het doelwit mRNA.21 SiRNA is opgebouwd uit een 21-22 NT tellende RNA duplex. Het heeft een moleculair gewicht van 13-14 kDa (met 1 Da = 1.66 x 10-27 kg) en een lengte van 7 nm.4,22 Het bestaat uit een sense of passenger streng en een antisense of guide streng zoals vermeld onder 1.1. Het 5’ uiteinde bevat een fosfaatgroep (plaats waar fluorescent labelen kan gebeuren),2 en het 3’ uiteinde bevat een hydroxyl groep. Iedere streng bevat een overhang van 2 ongepaarde nucleotiden zoals voorgesteld in onderstaande figuur.5,23,24 Er kan voor gekozen worden om siRNA toe te dienen in simpele excipiënten zonder gebruik te maken van een NP. Dit siRNA kan al dan niet chemisch gemodificeerd worden. Chemisch gemodificeerd siRNA is minder onderhevig aan afbraak door nucleasen en veroorzaakt een verminderde immuunrespons, heeft een betere genonderdrukking en een hogere genspecificiteit. De aflevering zonder NP heeft als voordeel dat het simpel is en dat er geen toxiciteit of inflammatie geassocieerd met het gebruik van welbepaalde NPs kan voorkomen. De vraag blijft alleen hoe het siRNA in staat is om intact de biologische celmembraan te passeren. SiRNA is immers een grote, zware, hydrofiele molecule die bovendien sterk negatief geladen is bij fysiologische pH door de aanwezigheid van de fosfaatgroepen.2,3,4,22 Een mogelijke verklaring is dat geïnfecteerde longcellen meer receptief zijn voor uitwisseling van moleculen dan gezonde longcellen.3 Via lokale administratie van naakt siRNA zijn reeds enkele successen in vivo bekomen.11 De werking van naakt siRNA leek veelbelovend maar achteraf is gebleken dat de resultaten veroorzaakt werden door niet-specifieke immuunstimulatie en niet door sequentie specifieke RNAi effecten.3,4
Figuur 1.2. Opbouw van een siRNA duplex.
6
1.3.2. Nanopartikels Vereisten waaraan een nanopartikel moet voldoen voor longadministratie De ontwikkeling van NPs voor de efficiënte en doelgerichte aflevering van siRNA in de long is momenteel het focus van onderzoek in het veld.3,11,13 Het ideale NP voor longaflevering moet aan heel wat vereisten voldoen. Zo moet het zorgen voor een goede complexatie van siRNA, zonder de activiteit ervan te onderdrukken.3,4,20 Het moet een hoge ladingscapaciteit hebben en het moet aan siRNA een goede bescherming bieden tegen enzymatische afbraak in vivo.25,26 Een NP verbetert eveneens de pulmonaire distributie van siRNA. Verder moet het biocompatibel zijn en mag het geen immuunrespons uitlokken.3,4,11,15,26,27 De NPs moeten interactie aangaan met de specifieke targetcel maar de toxiciteit die ze hierop uitoefenen moet verwaarloosbaar zijn.3,4,20 Het voornaamste doel van een NP is om de cytosolische aflevering van siRNA te verbeteren.3,4,11 Het NP moet biodegradeerbaar zijn om problemen bij herhaalde administratie te voorkomen. Door een gecontroleerde en vertraagde vrijstelling van siRNA in het cytoplasma, kan een lage frequentie van doseren bekomen worden. Helaas voldoet geen enkel NP aan al deze voorwaarden.4,15,19,20,27
Fysicochemische eigenschappen van de nanopartikel De partikelgrootte is de belangrijkste factor die de plaats van depositie bepaald. Wanneer die te groot is gebeurt depositie in de nasopharyngeale en oropharyngeale regio. Wanneer te klein, blijven de partikels in de ingeademde lucht zitten en worden ze weer uitgeademd. Een optimale partikelgrootte zorgt voor een maximale depositie in de diepe alveolaire gebieden.3,16,19 Verder bepaald de partikelgrootte de cellulaire opname (zie 1.5.).20 Bij voorkeur worden sferische partikels gebruikt omdat deze een lager contactoppervlak hebben en makkelijker intracellulair opgenomen worden dan niet-sferische.16,20 Het best wordt voor een positieve oppervlaktelading gekozen. Door de juiste partikelgrootte, -vorm en oppervlaktelading willen we een goede interactie van de partikels met de celmembraan en een goede internalisatie bekomen.20 Verschillende formulaties zijn onderzocht geweest voor de aflevering van siRNA in vitro in longcellen. Slechts weinigen ervan zijn effectief gebleken in vivo.4,11 Hieronder worden de verschillende formulaties bruikbaar voor longaflevering besproken.
7
Niet virale nanopartikels Deze NPs zijn, ivm. virale nanopartikels, veel veiliger, veelzijdiger en gemakkelijker te produceren. Nadelig is hun lage transfectie efficiëntie waardoor de therapeutische applicaties momenteel nog beperkt zijn.9 De twee meest gebruikte niet virale nanopartikels zijn liposomen en polymeren.11,20 Polymeren kunnen verwerkt worden in matrix carriër carri systemen, welke is deze masterproef gebruikt worden.3
Kationische liposomen Liposomen zijn amfifiele structuren opgebouwd uit een waterige kern met daaromheen een lipide dubbellaag (zie figuur 1.3.). 1.3 25,27 Liposomen zijn de meest bestudeerde klasse van NPs,26 en worden veel gebruikt voor de aflevering van siRNA in vitro en in vivo.3 De toediening van liposomen aan het respiratiestelsel werd eerst uitgevoerd voor de vervanging van pulmonair surfactant in de behandeling van respiratoir distress syndrome (RDS) (RDS) in prematuren.3,19 Het grote probleem is echter dat liposomen incompatibel zijn met natuurlijk longsurfactant. De lipiden van surfactant en liposoom worden met elkaar gemengd waardoor een suboptimale samenstelling ontstaat in het liposoom en siRNA wordt wordt vrijgesteld. Bovendien vormen deze gemodificeerde liposomen grote aggregaten waardoor transfectie onmogelijk wordt. Liposomen zijn dus geen goede kandidaten voor aflevering in de long, maar coating van polymeren met lipiden kan wel voordelen opleveren (zie (z 1.5.).4
Figuur 1.3.. Opbouw van een lipoplex (= liposoom gecomplexeerd met siRNA).
Polymere matrix carriër systemen Door 3D vernetting van organische polymeren ontstaat een nanoscopische hydrogel die als carriër kan gebruikt worden. In de masterproef wordt gebruik gemaakt van dextraan als polymeer. SiRNA kan dan in deze polymere matrix gecomplexeerd worden waardoor het goed beschermd is en slechts echts traag vrijgesteld wordt intracellulair.19,20 Dergelijke dextraan nanocarriërs hebben een hoge ladingscapaciteit.16,19 Bovendien kunnen de fysicochemische
8
eigenschappen ervan gemakkelijk gemodificeerd worden.13 Deze hydrogelen lokken geen sterke immuunrespons uit en bezitten een hoge structurele stabiliteit.3,13,25,27 Deze carriërs zorgen voor een goede endosomale escape en veroorzaken slechts een lage cytotoxiciteit.3,20 Dextraan hydrogelen hebben als nadeel ze potentieel schadelijk zijn door accumulatie van afbraakproducten.3,13 Een voorstelling van dergelijke matrix carriër systemen wordt weergegeven in onderstaande figuur.
Figuur 1.4. Matrix carriër systeem. Links: schematische voorstelling matrix carriër. Rechts: cryo-TEM beeld dextraan matrix carriër.
1.3.3. Pulmonair surfactant 1.3.3.1.
Endogeen pulmonair surfactant
Pulmonair surfactant wordt gesynthetiseerd en gesecreteerd door alveolaire type II pneumocyten.4 Het bedekt het gehele alveolaire longoppervlak van zoogdieren en is dus een belangrijke barrière die NPs tegenkomen na lokale administratie. Het amfifiele pulmonair surfactant is opgebouwd uit een lipide deel (90 wt%) en een proteïne deel (10 wt%). Het lipide deel is vnl. opgebouwd uit fosfolipiden, waarvan fosfatidylcholine het voornaamste is (70-80 wt% van totale surfactant).2,14 Fosfatidylcholine bestaat uit een hydrofiel, zwitterion hoofd en een hydrofobe vetzuurketen staart. Hydrofiele, hydrofobe en elektrostatische interacties met de NP zijn dus mogelijk.16
1.3.3.2.
Exogeen pulmonair surfactant
De pulmonaire surfactanten die commercieel verkrijgbaar zijn, zijn gemodificeerde, van de long afgeleidde surfactanten die de samenstelling van het humane surfactant benaderen. Ze worden elk op een verschillende manier geëxtraheerd wat aanleiding geeft tot een lichte
9
wijziging van de proportie vetzuren en surfactant proteïnen. Het Curosurf (CS) modelsysteem waarmee gewerkt wordt in deze masterproef voor de coating van de NP (zie 1.4.), is een extract van fijngemaakt varkens longweefsel. Het heeft een lagere concentratie
aan hydrofiele surfactant proteïnen en bevat minder cholesterol dan humaan surfactant.2
1.4.
AANMAAK HYBRIDE NANOPARTIKELS
In plaats van één type NP te gebruiken, werden inspanningen geleverd om de voordelen van de 2 meest prevalente NPs (liposomen en polymeren) te combineren in 1 systeem tot een hybride NP, zoals voorgesteld in figuur 1.5.26 Hybride NPs zijn opgebouwd uit een hydrofiele polymerenmatrix met er rond een lipofiele coat. In deze masterproef wordt gebruik gemaakt van dextraan nanogelen met een CS coat rondomrond.27
Als
dextraan
nanogel
wordt
gebruik
gemaakt
van
dextraan-
hydroxyethylmethacrylaat (DEX-HEMA). HEMA is gekoppeld met de dextraan ruggengraat door een carbonylester die pH-afhankelijke hydrolyse ondergaat onder fysiologische omstandigheden. Als alternatief voor DEX-HEMA kan dextraan-methacrylaat (DEX-MA) gebruikt worden. DEX-MA bevat geen carbonylester functie waardoor deze niet biodegradeerbaar is. DEX-(HE)MA wordt vervolgens gecopolymeriseerd met het methacrylaat
monomeer
[2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethylammonium
chloride
(TMAEMA). Deze groep bevat een tertiair amine dat zorgt voor de kationische lading van DEX-(HE)MA-co-TMAEMA. Hoe meer TMAEMA, hoe hoger de oppervlaktelading van het complex. De opbouw wordt voorgesteld in figuur 1.6. Deze kern wordt geladen met siRNA en vervolgens gecoat met CS.2,22,26,27 De coat wordt vastgehecht aan het oppervlak door adsorptie (hydrofiele, hydrofobe interacties) en door elektrostatische interactie.25 De coat wijzigt de fysicochemische karakteristieken van de dextraan NP. Dextraan NPs hebben een hydrodynamische diameter van ~ 180 nm, hybride NPs een diameter van ~ 200-300 nm.22,26,27 Door coating ontstaat bijkomend een omkering van de oppervlaktelading van het NP van positief naar negatief.2,27
10
Figuur 1.5. Opbouw hybride nanopartikel.. Links: schematische voorstelling van een hybride nanogel. Rechts cryo-TEM TEM beeld Curosurf gecoatte dextraan nanogelen (7.5 mg Curosurf / mg nanogel)
DEX HEMA, TMAEMA en DEXDEX Figuur 1.6.. Voorstelling van de moleculaire structuur van DEX-HEMA, HEMA-co-TMAEMA.
1.5.
INTRACELLULAIRE VERWERKING VAN DE HYBRIDE NANOPARTIKEL
Een efficiënte downregulatie van de genexpressie is afhankelijk van een goede intracellulaire opname, een goede intracellulaire distributie en een efficiënte intracellulaire vrijstelling van siRNA uit de NP thv. het doelwit. Een succesvolle downregulatie wordt wordt vnl. bepaald door een
11
succesvolle endosomale vrijstelling. In de masterproef werd een poging ondernomen om deze verschillende punten te optimaliseren om een zo goed mogelijke RNAi te bekomen.20,22 De gecoatte NPs worden diep in de longen afgeleverd.16,19,20,26 De uitgelokte immuunrespons en cytotoxiciteit in de longen is lager dan bij niet-gecoatte NPs (dit laatste wordt ook aangetoond in de masterproef).26 De adhesie aan de celmembraan is gestegen door de additionele lipidenlaag.25 Gecoatte NPs worden beter intracellulair opgenomen dan nietgecoatte NPs. Een mogelijke verklaring is een bijkomende intracellulaire opname via membraanfusie (passieve opname) zoals bij liposomen. Het mechanisme van verhoogde intracellulaire opname is nog niet volledig opgehelderd en wordt daarom in deze masterproef ook verder onderzocht.20,25 Bij onze waarnemingen zagen wij echter, in tegenstelling tot wat beschreven wordt in de literatuur, een lagere cellulaire opname. Dit is logisch aangezien in de literatuur vaak gewerkt wordt met positief geladen gecoatte NPs, terwijl wij door coating een omslag in zèta potentiaal veroorzaken (repulsie). Actieve opname kan via verschillende mechanismen verlopen zoals fagocytose, macropinocytose of endocytose. Endocytose is de belangrijkste weg voor cellulaire opname van niet-virale vectoren.3,9,20 Voor efficiënte endocytose moeten de partikels kleiner zijn dan 150 nm. Endocytose gebeurt het meest efficiënt bij een partikelgrootte van 30-60 nm. In de masterproef worden partikels van 200-300 nm gebruikt omwille van de hogere ladingscapaciteit die sterk opweegt tegen de verminderde opname. Er zijn verschillende manieren van endocytose afhankelijk van het celtype en de NP. De belangrijkste en best gekarakteriseerde weg is de clathrine gemedieerde endocytose. Deze weg is constitutief aanwezig in alle dierlijke cellen. Opname van partikels gebeurd door omhulling in clathrinecoated vesikels. Het verdere transport gebeurt in vroege endosomen, die dan door fusie met elkaar omgezet worden in late endosomen. Deze versmelten op hun beurt met prelysosomale vesikels om mature, degraderende endolysosomen te vormen. Gedurende het proces daalt de pH naar 5. In de lysosomen wordt de lipidelaag gedestabiliseerd, wordt de polymeer hydrogel gedegradeerd door hydrolyserende enzymes en wordt het siRNA afgebroken door nuclease. Daarom is het van groot belang dat het siRNA uit de endosomen/lysosomen vroegtijdig kan ontsnappen vooraleer een dergelijke degradatie gebeurd.3,16,20,22,28 Deze ontsnapping kan op verschillende manieren gebeuren. Een eerste manier is via de proton sponge hypothese.9 Door de hoge bufferingscapaciteit van de
12
dextraan polymeren over een wijde pH range, worden de aminegroepen van het polymeer geprotoneerd wanneer de pH daalt in de endosomen. Hierdoor ontstaat een influx van chloride ionen, protonen en water, waardoor de osmotische druk stijgt en de endosomen openbarsten met vrijstelling van hun inhoud.3,9,20 Een tweede manier voor endosomale vrijstelling is door accumulatie van afbraakproducten van het polymeer in het endosoom waardoor opnieuw de osmotische druk intracellulair stijgt. Een derde manier van vrijstelling is door fusie van de gecoatte NPs met de endosomale membraan, zoals ook onderzocht werd in de masterproef. Een analoge manier is de lipide mixing die kan voorkomen tussen de lipiden van de carriër en de lipiden van de endosomale membraan. Een laatste techniek is de endosomale breuk door zwelling van het polymeer.5,9,20 Gecoatte NPs vertonen een betere escape dan niet-gecoatte NPs. Eenmaal aanwezig in het cytosol moet de NPs degraderen met vrijstelling van siRNA. Vervolgens kunnen de nucleïnezuren via RNA interferentie hun werking uitvoeren zoals beschreven onder 1.1.
13
2. OBJECTIEVEN Reeds veelbelovende preklinische resultaten bekomen met dextraan nanogelen (NGs) in het doctoraat van Raemdonck K geven aan dat dextraan NGs eventueel een belangrijke rol kunnen spelen in de profylaxie en behandeling van genetische aandoeningen door RNA interferentie. De optimalisatie van deze NGs is het focus van onderzoek in het doctoraat van De Backer L. De Backer L heeft in haar paper2 de invloed van natuurlijk pulmonair surfactant op deze dextraan NGs onderzocht. De fysicochemische karakteristieken, de intracellulaire opname en de mate van RNA interferentie (RNAi) van formulaties met en zonder surfactant werden met elkaar vergeleken. Aangezien met de dextraan NGs voorbehandelt met surfactant een betere genonderdrukking gezien werd, werd besloten om deze formulatie verder te optimaliseren. In deze masterproef worden experimenten analoog aan deze uit de paper van De Backer et al. uitgevoerd met dextraan NGs gecoat met surfactant, in de hoop een meerwaarde van deze coating te kunnen aantonen. In de uitgevoerde experimenten worden gecoatte NGs immer vergeleken met niet gecoatte NGs en met NGs waaraan surfactant werd toegevoegd.
Eerst worden de fysicochemische karakteristieken van gecoatte en niet-gecoatte dextraan NGs onderzocht en onderling vergeleken. De focus hierbij ligt op het onderzoek van partikelgrootte, zèta potentiaal en colloïdale stabiliteit van gecoatte dextraan NGs in verschillende buffers. Bijkomend wordt de ladingscapaciteit van dextraan NGs voor siRNA bepaald mbv. fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) en wordt de invloed van verschillende concentraties siRNA op partikelgrootte en zèta potentiaal bestudeerd.
Verschillende transfectie experimenten met dextraan NGs, dextraan NGs met surfactant, gecoatte dextraan NGs (al dan niet geültracentrifugeerd) en siRNA op carcinoma cellen van het alveolaire epitheel worden eveneens uitgevoerd. Zo wordt de uitgeoefende celtoxiciteit van de verschillende formulaties beoordeeld met spectrometrie, de intracellulair opname en genonderdrukking via flow cytometrie en de endosomale fusie via spectrofluorimetrie. Bij deze experimenten op celcultuur was het de bedoeling de meerwaarde van gecoatte NGs aan te tonen.
14
3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1.
AANMAAK KATIONISCHE DEX-MA-co-TMAEMA NANOGELEN
De kationische dextraan NGs worden in de masterproef aangemaakt via de inversie miniemulsie fotopolymerisatie methode, geoptimaliseerd door Raemdonck et al.22 Een interne, waterige nanogel fase wordt aangemaakt door suspenderen van 100 mg DEX-MA (graad van substitutie (DS) 5.9)29 in 130 µl TMAEMA (80% [w/v] in water, Sigma, Steinheim, Duitsland), 65 µl Irgacure® 2959 (1% [w/v] in HEPES buffer (HB)) (Ciba Specialty Chemicals, Maastricht, Nederland) en 120 µl RNAse vrij water (Ambion, Austin TX, USA). Homogenisatie gebeurt gebruik makende van een CapMixTM (3M ESPE, Seefeld, Duitsland). Vervolgens wordt deze inwendige fase toegevoegd aan de externe fase bestaande uit 4.5 ml minerale olie (Sigma) en 0.5 ml surfactant ABIL EM 90 (10% [v/v]) (Evonik Goldschmidt GMBH, Essen, Duitsland). Een transparante water-in-olie emulsie wordt verkregen door ultrasonicatie met een Branson Tip Digital Sonifier® (Emerson Industrial Automation, Danbury CT, USA)(amplitude 15%, 75 sec). Vervolgens wordt door ultraviolet (UV) irradiatie onder koeling (4°C, 900 sec, 365 nm) met een Bluepoint 2.1. UV bron (Hönle UV technologie, Gräfelfing, Duitsland) een radicale polymerisatie van de emulsie bekomen waardoor DEX-MA-co-TMAEMA NGs, verder vermeld als DEX-MA NGs, ontstaan. Nadien worden de NGs opgezuiverd door precipitatie in aceton (Sigma). De bovenstaande organische fase kan na centrifugatie (2000 g, 30 sec) met een Multifuge 1-S-R (Heraeus, Goffin Meyvis B, Hoeilaert, België) verwijderd worden. Deze wasstap wordt vervolgens nog 3x herhaald in 1:1 [v/v] koud aceton:hexaan (Sigma). Tijdens de laatste 2 wasstappen wordt het staal eveneens gedurende 10 min op een bad soniccator geplaatst (Branson 2510, Emerson Industrial Automation). Het dextraan precipitaat wordt vervolgens gedroogd via vacuüm evaporatie met N2 om resten organisch solvent te verwijderen. De pellet wordt nadien geredispergeerd in 2.5 ml koud RNAse vrij water. Om een lange termijn stabiliteit te garanderen wordt de waterige suspensie gelyofiliseerd waarna het droog bewaard wordt in een exsiccator bij omgevingstemperatuur. Voor verder experimenteel gebruik wordt van de gelyofiliseerde NGs een stocksuspensie (2 mg/ml) aangemaakt in RNAse vrij water. Deze suspensies worden bewaard bij -80°C. DEX-HEMA-coTMAEMA NGs, verder vermeld als DEX-HEMA NGs, worden op dezelfde manier aangemaakt. Voor gebruik worden de NGs suspensies altijd kortstondig gesoniceerd (2x 5 sec, amplitude: 10%) om een uniforme grootte distributie te verkrijgen.
15
3.2.
FYSICOCHEMISCHE KARAKTERISATIE VAN DEX-MA NANOGELEN
3.2.1. Bepalen van de hydrodynamische diameter en zèta potentiaal via dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zèta potentiaal metingen 3.2.1.1.
Principe dynamische lichtverstrooiing (DLS)
Dynamische lichtverstrooiing (DLS) is een techniek die gebruikt wordt om de grootte van partikels gesuspendeerd in een vloeistof, in de sub micron regio, te meten. Een DLS systeem bestaat uit 6 onderdelen. Een laser belicht de suspensie die zich in een meetcel bevindt. De partikels hierin aanwezig veroorzaken lichtverstrooiing. Een detector meet het verstrooide licht op 173°. De intensiteit van het verstrooide licht moet binnenin een specifieke range liggen om succesvol gemeten te kunnen worden. Een attenuator past de intensiteit van de laser aan waardoor de intensiteit van het verstrooide licht geoptimaliseerd wordt. Een correlator analyseert de intensiteit van het verstrooide licht op opeenvolgende tijdstippen en bepaalt de fluctuatie ervan (zie figuur 3.1.A.). Deze fluctuatie wordt veroorzaakt door de Browniaanse beweging van partikels. Kleine partikels veroorzaken veel fluctuatie doordat ze sneller bewegen. Dit spectrum van fluctuaties wordt omgezet in een correlogram zoals voorgesteld in figuur 3.1.B.C. Het tijdstip waarop de correlatie significant begint te dalen geeft een indicatie van de gemiddelde partikelgrootte. Bij grote partikels gebeurt de daling laat, bij kleine partikels gebeurt dit snel. Hoe steiler de helling hoe meer monodispers het staal is. Deze informatie wordt doorgestuurd naar de computer en verwerkt met Nano software. De halfwaardetijd in het correlogram is een maat voor de translatie diffusiecoëfficiënt D. Aan de hand van de Stokes Einstein vergelijking wordt de grootte van het deeltje berekend. =
Met
3
dH: hydrodynamische diameter (m) D: translatie diffusiecoëfficiënt (m2.s-1) k: constante van Boltzmann (J.K-1) T: absolute temperatuur (K) = constante Ƞ: viscositeit (Pa.s) = constante
16
De translatie diffusiecoëfficiënt wordt bepaald door de grootte van de partikels, de aanwezigheid van oppervlakkige structuren op deze partikels en de ionische sterkte van het medium. Met de bekomen informatie kan een intensiteits – grootte distributie opgesteld worden zoals weergegeven in figuur 3.2. Een smalle piek wijst op een monodispers staal. Meer dan 1 piek of tailing wijst op een polydispers staal.http://www.malvern.com
Figuur 3.1.A. Spectrum van intensiteits fluctuaties voor grote en kleine partikels. B. Typisch correlogram van een suspensie van grote partikels waarin de correlatie van het signaal pas laattijdig daalt. C. Typisch correlogram van een suspensie met kleine partikels. http://www.malvern.com
Figuur 3.2. Intensiteits – grootte distributie van een monodispers staal. http://www.jnanobiotechnology.com/content/5/1/6/figure/F6?highres=y
3.2.1.2.
Principe zèta potentiaal
De zèta potentiaal is een fysische eigenschap die elk partikel in een suspensie bezit. http://www.malvern.com
Rond elk geladen deeltje bevindt zich aan het oppervlak een elektrische
dubbellaag zoals voorgesteld in onderstaande figuur 3.3. De binnenste Stern laag bevat sterk
17
gebonden ionen, met een lading tegengesteld aan die van het partikeloppervlak. De buitenste diffuse laag bevat ionen die minder sterk gebonden zijn, vnl. met tegengestelde lading maar ook een aantal met dezelfde lading als het partikel. In de diffuse laag komt een grens voor, het afschuifvlak. Wanneer het partikel beweegt in een vloeistof, bewegen alleen ionen binnenin de straal van deze grens mee met het partikel. De elektrostatische potentiaal thv. dit afschuifvlak is de zèta potentiaal.
Figuur 3.3. Schematische voorstelling van de zèta potentiaal. http://www.malvern.com
De zèta potentiaal wordt beïnvloed door de pH en conductiviteit van het medium. De elektroforetische bepaling ervan gebeurt meestal in waterig medium met gemiddelde elektrolyt concentratie. Aan de hand van de zèta potentiaal kan de stabiliteit van een colloïdaal systeem beoordeeld worden. Bij een grote negatieve of positieve lading gaan de partikels elkaar afstoten en wordt een stabiele suspensie gevormd. Een laag positieve of laag negatieve zèta potentiaal geeft onvoldoende elektrostatische afstoting waardoor aggregatie ontstaat. De grens tussen stabiel en onstabiel ligt bij +30 of -30 mV.http://www.malvern.com
De zèta potentiaal wordt gemeten op hetzelfde toestel dat gebruikt wordt voor DLS. Omwille van de lading aan het oppervlak van de partikels ontstaat beweging wanneer een
18
elektrisch veld aangelegd wordt tussen de 2 elektroden van de zèta meetcel. Geladen partikels bewegen naar de elektrode met tegengestelde lading. In het vlak van dit elektrisch veld kruisen 2 laserstralen elkaar in een bepaald punt. Wanneer partikels doorheen dit punt passeren zullen ze licht verstrooien. De intensiteit van dit verstrooide licht fluctueert met een frequentie die proportioneel is met de snelheid van de deeltjes (hoe sterker de lading, hoe vlugger de deeltjes bewegen, hoe sneller de fluctuaties). Uit deze fluctuaties wordt de snelheid van het partikel in een elektrisch veld of de elektroforetische mobiliteit bepaald. Vervolgens wordt de zèta potentiaal adhv. Henry’s vergelijking berekend. = Met
3μ 2 (
)
µ: elektroforetische mobiliteit (m2/Vs) Ƞ: viscociteit (Pa.s) : diëlektrische constante (C/Vm) f(Ka): Henry’s functie
3.2.1.3.
Praktische uitvoering
De hydrodynamische diameter (dH) en zèta potentiaal van de met controle siRNA (siCTRL, Eurogentec, Seraing, België) beladen DEX-MA NGs wordt bepaald met de Zètasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcesterchire, UK), uitgerust met dispersie technologie software (DTS). De DEX-MA NGs worden geïncubeerd met sequentiële siCTRL verdunningen (20, 30, 40, 50, 60 pmol siCTRL/µg NG in HB) gedurende 10 min bij 4°C. Daaropvolgend worden de verschillende stalen gemeten bij 25°C in een 70 µl volume cuvet (Brand GmbH, Wertheim, Duitsland) voor de partikelgrootte of in een zèta cel (Malvern Instruments) voor de zèta potentiaal. De equilibratietijd bedraagt 120 sec en de duur van de meting wordt op automatisch gezet. Per staal worden 3 opeenvolgende metingen uitgevoerd waarna de gemiddelde waarden en bijhorende standaarddeviaties berekend worden. Iedere meting is het resultaat van verschillende runs.
19
3.2.2. Bepalen van de ladingscapaciteit van DEX-MA nanogelen met fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) 3.2.2.1.
Principe fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)
Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een op microscopie gebaseerde techniek die de fluorescentie intensiteit registreert van fluorescente moleculen die zich in het detectievolume van een confocale microscoop bevinden. Fluctuaties van de fluorescentie intensiteit, veroorzaakt door beweging van fluorescente moleculen in en uit het detectievolume van het FCS instrument, geven informatie over de concentratie van de fluorescent gemerkte moleculen. Er bestaan twee types FCS: single color FCS en dual color FCS waarbij respectievelijk één type fluorofoor of twee spectraal verschillende types fluoroforen gebruikt worden om de te bestuderen moleculen te merken. In deze masterproef wordt gebruikt gemaakt van single color FCS om de associatie van siCTRL met de DEX-MA NGs te bestuderen. Het siCTRL wordt hiervoor fluorescent gelabeld aan het 5’uiteinde met Cy5. Een oplossing van vrije single-gemerkte siCTRL moleculen veroorzaakt een basislijn van fluorescentie fluctuaties zoals hieronder weergegeven wordt in figuur 3.4. Na samenvoegen van deze siCTRL moleculen aan de NGs ontstaan complexen van meerdere siCTRL moleculen in één carriër. Dit complex met meerdere labels migreert doorheen het detectievolume van het FCS instrument waardoor fluorescente pieken ontstaan aangezien meerdere fluoroforen tegelijk het detectievolume inkomen of verlaten. Doordat er minder vrij siCTRL aanwezig is, is de waarde van de basislijn gezakt.
20
Figuur 3.4. Links: FCS profiel van single-gemerkte siCTRL moleculen. Rechts: FCS profiel na complexatie van siCTRL in de polymere NGs.
3.2.2.2.
Praktische uitvoering
Eerst wordt een sequentiële verdunningsreeks van DEX-MA in HB aangemaakt. Vervolgens worden gelijke hoeveelheden siCy5 (0.05 µM) (Eurogentec) en DEX-MA met elkaar gemengd en gedurende 15 min op kamertemperatuur geïncubeerd. Op deze manier worden volgende beladingen gecreëerd: 200, 100, 75, 50, 33.3, 25, 20, 15 en 10 pmol siCy5 /µg NGs. Vervolgens worden de verschillende stalen overgebracht op een 96 well plaat met glazen bodem (Greiner Bio-one, certified DNase/RNase free, Wemmel, België). De FCS metingen worden uitgevoerd met een Nikon TE2000-E inversie microscoop uitgerust met een water immersie objectief lens (Plan Apo 60X, NA 1.2, collar rim correction) (Nikon Benelux, Brussel, België). Deze wordt gecombineerd met de detectiekanalen van de fluorescentie correlatie spectrometer MicoTime 200 (Picoquant GmbH, Berlijn, Duitsland). De gegevensverwerking gebeurt met SymPhoTime software (Picoquant). Een laser met golflengte 637 nm (BioRad, Cheshire, UK) wordt gebruikt om het fluorescent gelabelde siCTRL te exciteren. Het focaal volume van de microscoop wordt 50 µm boven de bodem van de wells geplaatst en de fluorescentie fluctuaties worden vervolgens gemeten gedurende 60 sec (laser power = 12.5, blanco = HB).
21
3.3.
AANMAAK CUROSURF GECOATTE DEX-(HE)MA NANOGELEN
Voor de aanmaak wordt gewerkt met DEX-(HE)MA NGs (0.6 en 2 mg/ml)(DEX-HEMA DS 5.2), CS vesikels (2.25 mg/ml, Poractant Alfa, Chiesi Pharmaceuticals, Parma, Italië), CS aggregaten (7.5 mg/ml) en siRNA (2 en 6.67 µM). De CS vesikels worden immer kort gesoniceerd voor gebruik (5 sec, amplitude 10%). In verder beschreven experimenten worden vaak 5 verschillende formulaties tov. elkaar vergeleken: siDEX-(HE)MA NGs, siDEX-(HE)MA NGs met CS vesikels, gecoatte siDEX-(HE)MA NGs (al dan niet geültracentrifugeerd (UC)) en siRNA. De siDEX-(HE)MA NGs bestaan uit gelijke hoeveelheden DEX-(HE)MA NGs (0.6 mg/ml) en siRNA (2 µM) die 1/2 verdund worden in HB. De siDEX-(HE)MA NGs met CS vesikels bestaan eveneens uit gelijke hoeveelheden DEX-(HE)MA NGs (0.6 mg/ml) en siRNA (2 µM) waaraan nu een dubbele hoeveelheid CS vesikels (2.25 mg/ml) wordt aan toegevoegd. Voor de aanmaak van de gecoatte siDEX-(HE)MA NGs worden gelijke hoeveelheden DEX-(HE)MA NGs (2 mg/ml) en siRNA (6.67 µM) met een dubbele hoeveelheid CS aggregaten (7.5 mg/ml) samengevoegd en kort gesoniceerd. Door de energiepuls bij sonicatie wordt de coat gevormd. Eén vierde hiervan wordt 2.3 keer verdund in HB. Dit zijn de niet opgezuiverde gecoatte siDEX-(HE)MA NGs. Verder wordt 140 µl van de niet verdunde gecoatte siDEX(HE)MA NGs geültracentrifueerd op een 7.5 wt% (siDEX-MA) of op een 10 wt% (siDEXHEMA) OptiPREP oplossing (Sigma, zie 3.3.1). De ultracentrifugatie wordt uitgevoerd op een Beckman L8-70M ultracentrifuge gedurende een 0.5u, aan 15000 omwentelingen per minuut (rpm) bij een temperatuur van 4°C. Na centrifugatie wordt de pellet geresuspendeerd in 140 µl HB. Vervolgens wordt deze suspensie eveneens 2.3 keer verdund in HB. De laatste formulatie bestaat gewoon uit siRNA (2 µM), zonder NGs, dat 1/4 keer verdund wordt in HB. Alle aangemaakt formulaties worden finaal 1/5 verdund in OptiMEM (= minimaal essentieel medium) zodat een eindvolume van 1 ml bekomen wordt. De uiteindelijke concentraties die op die manier bekomen worden zijn: 0.03 mg/ml DEX-(HE)MA NGs, 100 nM siRNA, en 7.5 mg CS/mg NGs.
3.3.1. Bepaling van de optimale Opti-PREP densiteit voor scheiding van gecoatte siDEX(HE)-MA NGs en Curosurf vesikels Voor dit experiment wordt CS fluorescent gelabeld met 1 wt% DID (Life Technologies, Gent, België) in een mengsel van chloroform (Sigma) en methanol (Fiers, Kuurne, België). Het organisch solvent wordt vervolgens verdampt op een Rotavapor R-200 (Büchi, Flawil,
22
Zwitserland) gedurende 30 min. Nadien wordt de CS film geresuspendeerd in HB. Er worden 2 verschillende stalen aangemaakt die elk geültracentrifugeerd worden op 3 verschillende Opti-PREP densiteiten (5, 7.5, 10 wt%). Staal 1 zijn gecoatte siDEX-(HE)MA NGs (aanmaak beschreven onder 3.3; enkel wordt hier gebruik gemaakt van DID gelabeld CS ipv. het gewone CS). Staal 2 bestaat uit vrije DID gelabelde CS vesikels.
3.4.
COLLOÏDALE STABILITEIT VAN CUROSURF GECOATTE siDEX-(HE)-MA NANOGELEN IN
VERSCHILLENDE BUFFERS De 6 verschillende stalen bestaan uit gelijke hoeveelheden DEX-(HE)MA NGs (2 mg/ml) en siCTRL (6.67 µM), gecoat met een dubbele hoeveelheid van verschillende concentraties CS (5, 7.5, 10, 12.5, 15 en 20 mg/mg NGs in HB). Aanmaak en ultracentrifugatie gebeuren zoals beschreven onder 3.3. De geresuspendeerde stalen worden supplementair op een sonicatie bad geplaatst gedurende 5 min. De partikelgrootte en zèta potentiaal worden gemeten op tijdstippen 0u en 4u (incubatie bij 37°C). Dit protocol wordt uitgevoerd in HB, MES buffer, PBS en in RNAse vrij water + PBS.
3.5.
CELCULTUUR
De cellijnen die gebruikt worden zijn wild type humane carcinoma cellen van het alveolaire epitheel (H1299_WT) en humane carcinoma cellen van het alveolaire epitheel die stabiel getransfecteerd zijn met een enhanced groen fluorescent proteïne (EGFP) (H1299_EGFP). Deze cellijnen worden gekweekt in een cultuurmedium samengesteld uit volgende componenten: RPMI 1640 (Life Technologies), 10% hitte geïnactiveerd foetaal bovien serum (FBS) (Hyclone, Thermo Scientific, MA, USA), 2 mM L-glutamine (Life Technologies) en 100 U/ml penicilline/streptomycine (Life Technologies). De celsuspensie wordt geïncubeerd in polystyreen cultuurflessen (75 cm2, SPL life sciences, Korea) bij 37°C in een atmosfeer met 5% CO2. De adherente cellen vormen een monolaag op de bodem. Wanneer de cellen voor 80-90% confluent zijn - 80-90% van de bodemoppervlakte van de cultuurfles die bedekt is met een monolaag van cellen – of wanneer cellen nodig zijn voor transfectie experimenten wordt er gesplitst. Hiervoor wordt de cellen eerst gewassen met een fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, -Ca2+/Mg2+, pH 7.4)(Life Technologies). Daarna wordt een hoeveelheid 0.25% trypsine/ethyleen diamine tetra-acetaat (EDTA) (Life Technologies) toegevoegd om de adherente cellen los te maken en wordt gedurende enkele min bij 37°C geïncubeerd.
23
Vervolgens wordt het trypsine geneutraliseerd met voorverwarmd cultuurmedium. Een kleine hoeveelheid van deze celsuspensie wordt 1:3 verdund met trypaanblauw (Sigma), waarna geteld wordt op een Bürker telkamer (Brand). Het aantal cellen/ml celsuspensie wordt bepaald door telling van de niet gekleurde (levende) cellen. In een nieuwe cultuurfles wordt dan een bepaald volume celsuspensie, naargelang het gewenste aantal cellen, overgebracht. Vervolgens wordt voorverwarmd medium ad 15 ml toegevoegd.
3.6.
INVLOED VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN EN CUROSURF VESIKELS
OP DE CELVIABILITEIT 3.6.1. Principe van MTT test Een MTT test is een colorimetrische test om de activiteit van cellulaire enzymes die de tetrazolium kleurstof MTT reduceren tot formazan te meten. Het door ons gebruikte MTT labelling reagent bestaat uit een 5 mg/ml oplossing van MTT (3[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide = geel tetrazole) in PBS. Door reductie in levende cellen door NAD(P)H-afhankelijke oxidoreductase enzymes ontstaan paarse, onoplosbare formazan kristallen in het cytosol. Reductie van MTT stijgt met cellulaire metabolische activiteit door een verhoogde NAD(P)H flux. Rustende cellen (thymocyten, splenocyten) reduceren weinig MTT, sneldelende cellen (carcinomacellen) reduceren in hoge mate. Na incubatie met het MTT labelling reagent moet een solubilisatie oplossing (10% natriumdodecylsulfaat in 0.01 M HCl) toegevoegd worden om de onoplosbare formazan om te zetten in een gekleurde oplossing. Hoe meer levende cellen aanwezig waren, hoe paarser deze oplossing. De absorbantie van formazan wordt vervolgens gemeten door een scanning multiwell spectrofotometer bij 550-600 nm. De referentiegolflengte moet meer dan 650 nm zijn. De MTT test is een sensitieve, kwantitatieve, geautomatiseerde methode met een hoge accuraatheid. Online computerverwerking van data laten een snelle en gemakkelijke verwerking van een hoog aantal stalen toe. Deze test wordt gebruikt in de celbiologie om het aantal levende cellen (celviabiliteit) te meten. Op deze manier kan celproliferatie, celactivatie (meer levende cellen), cytotoxiciteit of cytostatische activiteit (minder levende of minder metabolisch actieve cellen) door welbepaalde componenten bestudeerd worden. www.roche-applied-science.com
24
3.6.2. Praktische uitvoering Aanmaak van de verschillende formulaties nanogelen en Curosurf vesikels In een eerste proefopzet wordt gewerkt met een verdunningsreeks van DEX-HEMA NGs en van CS vesikels, aangemaakt in HB en 1 op 20 verdund in OptiMEM. De uiteindelijke concentraties voor DEX-HEMA NGs en voor CS vesikels zijn respectievelijk: 10, 20, 30, 40, 50 en 100 µg/ml en 75, 150, 225, 300, 375 en 750 µg/ml. In een tweede proefopzet wordt gewerkt met 4 verschillende formulaties aan 2 verschillende concentraties: DEX-HEMA NGs (10 en 100 µg/ml), DEX-HEMA NGs + CS vesikels (verhouding w:w 1/7.5) en gecoatte DEX-HEMA NGs met dezelfde verhouding, al dan niet geültracentrifugeerd. Aanmaak gebeurt zoals beschreven onder 3.3.
Celcultuur protocol In 24 well platen (SPL Life Sciences) worden H1299_WT cellen uitgezaaid. Per well worden 35 000 cellen uitgezaaid in cultuurmedium. Na 24u incubatie worden de cellen gewassen met 500 µl PBS. Hierna wordt 300 µl van de verschillende aangemaakte formulaties per well geplaatst (1 staal wordt verdeeld over 3 wells) waarna gedurende 4u geïncubeerd wordt bij 37°C. Nadien worden de cellen nogmaals gewassen met PBS, wordt er 1 ml cultuurmedium op geplaatst en wordt er vervolgens geïncubeerd gedurende 24u bij 37°C. De celviabiliteit wordt geanalyseerd met de Cel proliferatie Kit 1 (Roche, Mannheim, Duitsland).
MTT protocol Na incubatie worden de wells waarop dimethylsulfoxide (DMSO) geplaatst gaat worden, gewassen met PBS. Drie verschillende concentraties DMSO (30%, 60%, 100%) worden op de cellen geplaatst. Na een 30 min durende incubatie bij 37°C, worden nu alle wells gewassen. Aan alle wells wordt 200 µl celmedium en 20 µl MTT labeling reagent toegevoegd. Vervolgens wordt gedurende 4u bij 37°C geïncubeerd. Daarna wordt 200 µl solubilisatie oplossing toegevoegd en wordt er overnacht geïncubeerd bij 37°C. De spectroscopische absorbantie wordt gemeten bij 590 nm (formazan) en 690 nm (achtergrond) met een 2104 EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer, Waltham, USA).
25
3.7.
CELLULAIRE OPNAME VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN ONDER
VERSCHILLENDE CONDITIES BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE 3.7.1. Principe flow cytometrie Flow cytometrie wordt gebruikt om de fluorescentie van cellen in suspensie te bestuderen. Honderden cellen kunnen per seconde op meerdere parameters geanalyseerd worden. Op deze manier wordt statistisch significante informatie van de fysische en biochemische eigenschappen van een welbepaald celtype verworven. Een flow cytometer is opgebouwd uit 3 systemen: fluïdica, optica en elektronica. De aangemaakte celsuspensie wordt opgezogen in een nauw capillair in de flowkamer, waardoor een stroom aan cellen ontstaat. In dit capillair migreren de cellen één voor één doorheen het middelpunt van een laserstraal en worden op deze manier elk afzonderlijk bestraald. De flow cytometer waarvan gebruik gemaakt wordt heeft 2 lasers: een 635 nm HeNe laser (rood) en een 488 nm Argon laser (blauw). De lichtverstrooiing die ontstaat als gevolg van de passage van de cellen wordt via optische filters geprojecteerd op 2 verschillende detectoren. De voorwaartse lichtverstrooiing (FSC) wordt gemeten op de FSC Diode (483-493 nm) en geeft informatie over de grootte van de cellen (hoe groter de cel, hoe groter de verstrooiing). De zijwaartse lichtverstrooiing (SSC) wordt gemeten onder een hoek van 90° op de SSC PMT (483-493 nm) en geeft informatie over de granulariteit en complexiteit van de cellen (hoe hoger de granulariteit, hoe meer lichtverstrooiing). Gelijktijdig wordt de fluorescentie gemeten. Enkel moleculen met fluorescente eigenschappen kunnen gedetecteerd worden door één van de fluorescentiedetectoren. Deze moleculen absorberen het invallende laserlicht, worden geëxiteerd en zenden vervolgens licht uit met een hogere golflengte. Ieder fluorofoor heeft zijn karakteristieke excitatie en emissie golflengte. De emissie golflengte wordt gedetecteerd door verschillende perpendiculair opgestelde fluorescentiedetectoren. Een overzicht van de verschillende gebruikte fluorescentiedetectoren wordt weergegeven in tabel 3.1.
26
Tabel 3.1. Eigenschappen van de gebruikte fluorescentiedetectoren. Excitatie laser
Detectie filter
Detector
Voorbeeld fluorofoor
488 nm (blauw)
515-545 nm (groen)
FL1 PMT
Sytox green, EGFP
564-606 nm (geel)
FL2 PMT
PE
>/= 670 nm (oranje)
FL3 PMT
PerCP
653-669 nm (rood)
FL4 PMT
Cy5
635 nm (rood)
Door middel van elektronica worden de gedetecteerde lichtsignalen omgezet in elektronische signalen die verder kunnen verwerkt worden door computer software (CellQuest Pro). Een voorbeeld van hoe deze resultaten verwerkt worden, wordt weergegeven in bijlage 4. Aan de hand van een FSC-SSC scatterplot of dot plot kan gediscrimineerd worden tussen levende cellen en dode cellen/celaggregaten. De FSC-SSC scatterplots van blanco stalen laten toe de juiste celpopulatie (=gating) en de juiste parameters te selecteren voor verdere analyse. Een histogram geeft een grafische weergave van het aantal cellen die een welbepaalde fluorescentie vertonen. In een bijhorende tabel kan meer informatie over de gemiddelde fluorescentiewaarde, de mediaan en de distributie van cellen verkregen worden. Om de fluorescentiewaarden juist te kunnen beoordelen moeten de juiste controlestalen gemeten worden.
3.7.2. Praktische uitvoering Celcultuur protocol Drie keer 18 wells worden op voorhand uitgezaaid op drie 24 well platen en gedurende 24u geïncubeerd. Per well worden 35 000 H1299_WT cellen uitgezaaid. Na incubatie wordt de eerste plaat gedurende 15 min op ijs geplaatst. Eveneens worden PBS, OptiMEM en de 5 te testen formulaties (aanmaak zie 3.3.) op ijs gezet. Eerst worden de cellen van deze plaat met ijskoud PBS gewassen. Daarna wordt op iedere well 300 µl van de verschillende ijskoude formulaties gezet (3 wells/ formulatie). Op de laatste 3 wells wordt 300 µl OptiMEM geplaatst. Vervolgens wordt gedurende 4u geïncubeerd op ijs. De tweede plaat wordt eveneens gewassen met PBS waarna de verschillende formulaties op de wells geplaatst worden (opnieuw 300 µl OptiMEM in de drie laatste wells). De derde plaat ondergaat eveneens de wasstap waarna 300 µl van de licht gewijzigde formulaties op de plaat
27
aangebracht worden. In plaats van OptiMEM te gebruiken in de formulaties wordt een oplossing van Sodium Azide (SA) in OptiMEM gebruikt (125 mM). Daarna worden deze 2 platen gedurende 4u geïncubeerd bij 37°C. Na de 4u incubatie ondergaan alle platen 3 wasstappen vooraleer aan het eigenlijke flow cytometrie protocol wordt begonnen. Eerst wordt gewassen met PBS, erna met dextraan sulfaat (0.1 mg/ml in PBS, Sigma) om de aan het celoppervlak gebonden fluorescentie te verwijderen en tenslotte nogmaals met PBS.
Flow cytometrie protocol De cellen in de wells worden losgemaakt met trypsine/EDTA (0.25%) en vervolgens gesuspendeerd in cultuurmedium. Deze suspensie wordt gecentrifugeerd gedurende 7 min bij 4°C aan 1500 rpm met een Eppendorf centrifuge 5417 R (Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland). Nadien wordt de pellet opnieuw in suspensie gebracht in een verdunning van SYTOX green in HB (100 nM, Life Technologies). Daarna volgt een 30 min durende incubatie in het donker op ijs. Na toevoeging van celmedium wordt een tweede keer gecentrifugeerd. Resuspensie van de celpellet gebeurt in flow buffer bestaande uit PBS, 1% bovien serum albumine en 0.1% sodiumazide (Sigma). De fluorescentiemeting wordt uitgevoerd met een BD Biosciences FACSCaliburTM flow cytometer uitgerust met BD CellQuest Pro analysis software (BD Biosciences, San Jose, CA). Cellen zonder siCy5 worden gebruikt als controle om de achtergrond fluorescentie te bepalen. Per staal worden 2500 – 5000 levende cellen geteld. De instellingen voor de flow cytometer zijn weergegeven in onderstaande tabel. Metingen worden uitgevoerd in drievoud per staal.
Tabel 3.2. Instellingen van de flow cytometer. Voltage
Amp Gain
Mode
FSC
E-1
7.15
Lin
SSC
330 - 340
1.00
Lin
FL1
340 - 380
1.00
Log
FL4
715 - 730
Log
28
3.8.
GENONDERDRUKKING
DOOR
VERSCHILLENDE
FORMULATIES
NANOGELEN
BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE Er wordt gewerkt met DEX-HEMA NGs (0.6 en 2 mg/ml), CS vesikels (2.25 mg/ml), CS aggregaten (7.5 mg/ml), siCTRL (0.2, 0.667, 2 en 6.67 µM) en siGFP (0.2, 0.667, 2 en 6.67 µM, Eurogentec). Aanmaak van de formulaties gebeurt zoals hierboven beschreven onder 3.3. De verschillende formulaties worden nu echter in het dubbel aangemaakt: één keer met siCTRL en één keer met siGFP. De uiteindelijke concentratie ONs die op de cellen geplaatst wordt is dus 10 en 100 nM. Op deze manier wordt een belading van 3.33 en 0.333 pmol siRNA/µg NGs gecreëerd. Het celcultuur protocol is hetzelfde als beschreven onder 3.6.2. Verschilpunten zijn dat gewerkt nu wordt met H1299_EGFP cellen ipv H1299_WT cellen en dat gedurende 48u geïncubeerd wordt na transfectie ipv. de gebruikelijke 24u. Na incubatie worden de cellen losgemaakt met trypsine/EDTA (0.25%) en gesuspendeerd in cultuurmedium. Deze suspensie wordt gedurende 7 min aan 1500 rpm gecentrifugeerd, waarna de pellet in flow buffer geresuspendeerd wordt. Per staal worden 15 000 cellen gemeten. De fluorescentie detector voor GFP meet bij 530 nm ± 30 nm. De instellingen voor de flow cytometer zijn weergegeven in onderstaande tabel.
Tabel 3.3. Instellingen van de flow cytometer Voltage
Amp Gain
Mode
FSC
E-1
6.80
Lin
SSC
350
1.00
Lin
FL-1
555
1.00
Log
3.9.
ENDOSOMALE FUSIE VAN GECOATTE NANOGELEN BEOORDELEN VIA FLUORESCENTIE
RESONANTIE ENERGIE TRANSFER (FRET) TEST 3.9.1. Basisprincipe fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) test In een dergelijke test wordt de fluorescentie resonantie energie transfer (FRET) tussen een geëxiteerde donor (D) en een juiste acceptor (A) fluorofoor, aanwezig in de liposomale membraan, getest. Opdat FRET effectief zou kunnen plaatsvinden, moet het emissie spectrum van de donor overlappen met het absorptie spectrum van de acceptor en moeten donor en acceptor zich op minder dan 10 nm van elkaar bevinden. FRET wordt gebruikt om de fusie/lipide mixing van lipiden te testen. Door fusie/lipide mixing stijgt de afstand tussen
29
donor en acceptor waardoor het acceptor signaal verdwijnt en het donor signaal toeneemt. De FRET tussen 1,2-dioleolyl-sn-glycero-3-phosphatidyl ethanolamine-7-nitrobenzofurazan (NBD-PE) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-phosphatodylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammoniumzout (Rho-PE) wordt in deze masterproef bepaald om de fusie/lipide mixing tussen gecoatte NGs en endosomale liposomen te monitoren. Berekening van de steady-state FRET (%) van de DA_liposomen gebeurt zoals weergegeven in onderstaande formule. Fluorescentie wordt gemeten gebruik makende van een spectrofluorimeter. De FRET efficiëntie wordt gekwantificeerd in functie van de tijd na additie van de NGs aan de D_ en DA_liposomen in een ratio (4:1) (w:w).9
Met
(%) = (
−
)/
× 100
FD: fluorescentie intensiteit van de D_liposomen FDA : fluorescentie intensiteit van de DA_liposomen
3.9.2. Praktische uitvoering Aanmaak van PC:PE:PS:Cholesterol (5:1:1:2) (w:w) liposomen en aanmaak kalibratiecurve De endosomale liposomen zijn opgebouwd uit L-α-phosphatidylcholine (PC, 25 mg/ml, Sigma), L-α-phosphatidylethanolamine (PE, 25 mg/ml, Sigma) en 3-sn-phosphatidyl-L-serine (PS, 25 mg/ml, Sigma) en cholesterol (20 mg/ml, Sigma) in een w:w verhouding 5:1:1:2. Labeling gebeurt met de donor NBD-PE (1 mg/ml, w:w 3.2, λexc = 465 nm - λem = 535 nm, Fluka, Zwitserland) en de acceptor Rho-DOPE (1 mg/ml, w:w 4.5, λexc = 545 nm - λem = 576 nm, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA). Twee verschillende samenstellingen van liposomen in twee verschillende buffers zijn aangemaakt. Het eerste liposoom, genaamd DA_HEPES, is een dubbel gelabeld liposoom van donor/acceptor in HB. Liposoom 2, DA_MES, heeft dezelfde samenstelling maar wordt aangemaakt in MES buffer (25 mM, pH 5.5). Liposoom 3, D_HEPES, is een enkel gelabeld liposoom van donor in HB en liposoom 4, D_MES, wordt analoog aangemaakt in MES buffer. De verschillende volumina lipiden en labeling reagentia worden samengevoegd in kolfjes en op de evaporator gebracht gedurende 30 min bij 60°C onder vacuüm zodat een lipide film gevormd wordt. Deze lipide film wordt nadien gehydrateerd met 2.4 ml warme HB of MES buffer en terug op de evaporator gebracht gedurende 1u bij 70°C. Nadien wordt gedurende 1 min gesoniceerd aan
30
10% amplitude (10 sec aan, 15 sec af). Van elk van de 4 verschillende liposomen wordt volgende verdunningsreeks aangemaakt: 5000, 2500, 1000, 500, 250, 100, 50, 25 en 10 nM. Van iedere verdunning wordt in drievoud de fluorescentie gemeten met de 2104 EnVision Multilabel Plate Reader. NBD-PE wordt gemeten bij 460 nm (excitatie) en 535 nm (emissie).
Aanmaak nanogelen Opnieuw wordt gewerkt met dezelfde 4 formulaties NGs: siDEX-HEMA NGs, siDEX-HEMA NGs + vesikels en de gecoatte siDEX-HEMA NGs (al dan niet UC) die aangemaakt worden in HB of MES buffer naargelang de liposomen waarmee ze samengevoegd zullen worden. De aanmaak wordt beschreven onder 3.3. Een viervoudige overmaat (naar analogie met het experiment uitgevoerd door Hyvönen et al.9) van de 4 verschillende formulaties NGs wordt toegevoegd aan de 4 formulaties liposomen (5000nM) in een zwarte 96 well microtiterplaat. De fluorescentie wordt gemeten op volgende tijdstippen na samenvoeging: 0, 10, 20, 30, 60, 120 min.
31
4. RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1.
FYSICOCHEMISCHE KARAKTERISATIE VAN DEX-MA NANOGELEN
4.1.1. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en zèta potentiaal metingen De wijzigingen in dH en zèta potentiaal van de DEX-MA NGs in functie van additie van stijgende hoeveelheden siCTRL wordt geëvalueerd. DEX-MA NGs hebben een dH van 188.4 ± 0.2121 nm en een zèta potentiaal van 23.3 ± 1.77 mV. Een toevoeging van stijgende hoeveelheden anionisch siCTRL veroorzaakt een graduele daling van de zèta potentiaal van de DEX-MA NGs. Neutrale beladen NGs aggregeren. Dit wordt gezien bij een belading van 40 pmol siCTRL/µg NGs. Raemdonck et al. beschrijven een ladingsneutralisatie al bij een belading van 25 pmol siCTRL /µg DEX-HEMA NGs in HB.22 Aangezien aggregaten minder efficiënt opgenomen worden intracellulair moeten ze vermeden worden.20 Verdere additie van siCTRL leidt tot negatief geladen partikels, die elkaar terug gaan afstoten, geen aggregaten vormen, en bijgevolg dezelfde partikelgrootte hebben als de originele onbeladen NGs. De grootte en polydispersiteit van de complexen daalt dus naarmate de lading meer uitgesproken positief of negatief is (zie 3.2.1.2.). Er kan dus besloten worden dat om stabiele kationische siNGs te bekomen, er gekozen moet worden voor een belading van ≤ 30 pmol/µg NGs. De resultaten zijn verwerkt in onderstaande figuren.
B.
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
30
0
20
30
40
50
60
siCTRL/DEX-MA NGs verhouding (pmol/µg)
Gemiddelde ζ potentiaal (mV)
Gemiddelde dH (nm)
A. 25 20 15 10 5 0 -5
0
20
30
40
50
60
-10 -15
siCTRL/DEX-MA NG verhouding (pmol/µg)
Figuur 4.1. Effect van sequentiële belading met siCTRL verdunningen op de gemiddelde hydrodynamische diameter dH (A.) en gemiddelde zèta potentiaal (B.) van de DEX-MA nanogelen.
32
4.1.2. Bepalen van de ladingscapaciteit van DEX-MA nanogelen met fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) De ladingcapaciteit van NGs is een belangrijke parameter die de efficiëntie van RNAi bepaald. Vandaar dat we de ladingscapaciteit van DEX-MA NGs met behulp van FCS beoordeeld hebben. De verdunningsreeks DEX-MA NGs, gecomplexeerd met 1.125 pmol siCy5, vrij siCy5 en een blanco staal (HB) worden gemeten (n=3). De gemiddelde fluorescentie intensiteit van vrij en gecomplexeerd siCy5 wordt vervolgens berekend. Het gemiddelde signaal van de vrije siCy5 bedraagt 157 kHz (= waarde van de basislijn gecorrigeerd voor HB, zoals voorgesteld in figuur 3.5.). Een signaal van 157 kHz komt dus overeen met 100% decomplexatie of 0% complexatie van siCy5 in NGs. Naarmate het siCy5 gecomplexeerd wordt aan het oppervlak van de NGs, daalt de fluorescentie intensiteit van de basislijn en verschijnen pieken van hoge fluorescentie door de beweging van hoog fluorescente NGs doorheen het excitatie volume. Op basis van de referentiewaarde wordt nu een percentage complexatie aan de verdunningsreeks siDEX-MA NGs toegekend. Een voorstelling van deze resultaten wordt weergegeven in figuur 4.2. Bij een hoeveelheid NGs van 0.034 µg en 0.045 µg bedraagt de waarde van de basislijn respectievelijk 16 kHz en 1 kHz wat duidt op een quasi complete complexatie van alle siCy5 (respectievelijk 90 en 99%). Dus kan heel gemakkelijk berekend worden dat per µg nanogel er maximaal tussen de 25 en 33.3 pmol siCy5 gebonden kan worden. Dit is dus de ladingscapaciteit van de gemeten DEX-MA batch. Deze waarde is een stuk lager dan wat in de literatuur beschreven werd door Raemdonck et al. Hier werd een maximale siRNA belading van tussen de 50 en 100 pmol/µg DEX-HEMA NGs in HB gezien (= ladingscapaciteit van > 70 wt%). Aangezien in dezelfde paper een ladingsneutralisatie van DEX-HEMA NGs vanaf 25 pmol siRNA/µg NGs gezien werd, kon hier besloten worden dat het siRNA niet alleen bindt aan het oppervlak van de NGs maar ook in de kern kan penetreren.22 Aangezien wij een neutralisatie bekomen bij 40 pmol siRNA/ug NGs en een maximale belading via FCS van tussen de 25 en 33.3 pmol siRNA/µg NGs kan besloten worden dan bij ons de siRNA moleculen zich eerder vasthechten aan het oppervlak.
33
% Complexatie
Ladingcapaciteit DEX-MA NGs 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 200
100
75
50
33,3
25
20
15
10
Vrij siCy5
siCy5 / DEX-MA NG verhouding (pmol/µg)
Figuur 4.2. Percentage complexatie van siCy5 toegediend aan een verdunningsreeks DEXMA nanogelen.
4.2.
AANMAAK CUROSURF GECOATTE DEX-(HE)-MA NANOGELEN
DEX-HEMA NGs hebben een dH van 172.3 ± 0.8485 nm en een zèta van 25.5 ± 1.00 mV. In de literatuur wordt voor DEX-HEMA NGs DS 5.2 volgende waarden gezien: (212 ± 1 nm en 24.8 ± 0.4 mV)30 en (184.4 ± 0.8 nm en 25.1 ± 0.9 nm)2. CS vesikels hebben een dH van 122.4 ± 0.3536 nm en een zèta van -39.3 ± 1.95 mV. In de literatuur worden volgende waarden gezien voor CS vesikels: dH: ~120 nm en zèta: ~-30 mV.2 De waarden voor DEX-MA NGs staan beschreven onder 4.1.1. Deze kunnen niet vergeleken worden met het eerder aangehaalde werk van Raemdonck et al.30 aangezien wij met een andere DS werken.
4.2.1. Bepaling van de optimale Opti-PREP densiteit voor scheiding van gecoatte siDEX(HE)-MA nanogelen en Curosurf vesikels De scheiding van gecoatte siDEX-(HE)MA NGs en CS vesikels van elkaar op Opti-PREP gebeurt op basis van densiteit. De densiteit van DEX-(HE)MA NGs is groter dan die van de CS vesikels, waardoor na ultracentrifugatie de eerste gaan uitpelleteren en de tweede bovenaan blijven. Dit experiment wordt uitgevoerd om de optimale densiteit OptiPREP te bepalen om een optimale scheiding te bekomen.
34
Bij een 5 wt% en een 7.5 wt% Opti-PREP wordt een duidelijke pellet gecoatte siDEX-MA NGs waargenomen. Bij een 10 wt% oplossing was de pellet onderaan minder duidelijk. Dit wijst erop dat bij een dergelijke concentratie slechts een deel van de aangebrachte NGs in staat zijn om doorheen de oplossing te diffunderen. Bij een 5 wt% wordt een diffuse blauwe schijn van CS doorheen de oplossing waargenomen. Bij een 7.5 wt% Opti-PREP, en nog sterker bij een 10 wt% OptiPREP, wordt een duidelijke blauwe rand bovenaan waargenomen. Dit wijst erop dat deze laatste oplossingen te dens zijn voor de CS vesikels om hier doorheen te penetreren. Aangezien met de 10 wt% oplossing een veel lager rendement aan NGs bekomen wordt, wordt in verdere proeven met gecoatte siDEX-MA NGs voor een 7.5 wt% oplossing gekozen. De resultaten bekomen voor gecoatte siDEX-HEMA NGs zien er gelijkaardig uit. Hier wordt echter bij een 10 wt% OptiPREP wel een duidelijke pellet bekomen, waardoor in verdere experimenten met gecoatte siDEX-HEMA NGs voor een 10 wt% OptiPREP gekozen wordt.
4.3.
COLLOÏDALE STABILITEIT VAN CUROSURF GECOATTE DEX-(HE)-MA NANOGELEN IN
VERSCHILLENDE BUFFERS Het doel van dit experiment is om na te gaan of er een verschil is in partikelgrootte en zèta potentiaal naargelang er verschillende concentraties CS gebruikt worden en om de colloïdale stabiliteit na 4u incubatie bij 37°C te evalueren. Zowel siDEX-HEMA NGs als siDEX-MA NGs worden gemeten. SiDEX-MA NGs bevatten zoals beschreven onder 1.4. geen carbonylesterfunctie waardoor ze niet gevoelig zijn aan hydrolyse. Wanneer bij siDEX-MA NGs grote dH waargenomen worden is dit alleen te wijten aan aggregatie. SiDEX-HEMA NGs bevatten wel carbonylesters waardoor ze sterk onderhevig zijn aan pH-afhankelijke hydrolyse onder fysiologische omstandigheden. Wanneer bij siDEX-HEMA NGs grote dH waargenomen worden kan dit zowel te wijten zijn aan degradatie als aan aggregatie als aan een combinatie van de twee. Om het verschil te kunnen maken worden immer siDEX-HEMA – en siDEX-MA NGs naast elkaar gemeten. Bovendien worden verschillende buffers met elkaar vergeleken. Door het gebruik van verschillende buffers willen we verschillende in vivo ‘omgevingen’ nabootsen. De bekomen resultaten zijn weergegeven in onderstaande figuur 4.3. Hierbij moet opgemerkt worden dat in de verschillende figuren, een verschillende range van waarden op de y-as gebruikt wordt.
35
4.3.1. Metingen in HEPES buffer De grafische voorstellingen van deze metingen worden weergegeven in figuur 4.3. A en E. De numerieke waarden zijn terug te vinden in bijlage 1. Bij de gecoatte siDEX-HEMA NGs met een CS concentratie van 5 mg/mg NGs kan een duidelijke aggregatie van de licht negatief geladen partikels gezien worden. Naarmate de CS concentratie toeneemt, krijgen de partikels gradueel een meer negatieve zèta potentiaal en vermindert de dH gradueel. Met een CS concentratie van 15 en 20 mg/mg NGs wordt een perfecte partikelgrootte bekomen van respectievelijk 239.0 ± 3.600 nm en 353.8 ± 4.355 nm. Na 4u incubatie wordt de colloïdale stabiliteit getest. Partikels zijn sneller instabiel tussen een zèta van +30 en -30 mV (zie 3.2.1.2.) De hoge dH van de partikels wijzen erop dat de partikels gedegradeerd en geaggregeerd zijn, en dus instabiel zijn. De zèta potentiaal is slechts lichtjes gestegen. Bij siDEX-MA NGs worden voor incubatie gelijkaardige zèta potentialen waargenomen als bij siDEX-HEMA NGs voor incubatie. De NGs hebben echter een grotere partikelgrootte (door aggregatie) gaande van 5980 ± 1912 nm bij de laagste CS concentratie tot 457.5 ± 1.779 nm bij de hoogste. De ideale partikelgrootte van gecoatte NGs van 200-300 nm wordt hier dus niet bekomen. SiDEX-MA NGs zijn in tegenstelling tot siDEX-HEMA NGs wel duidelijk stabiel na incubatie (geen degradatie). De negatieve zèta potentialen blijven duidelijk goed behouden, wat aanleiding geeft tot een quasi identieke partikelgrootte voor en na incubatie. De resultaten worden weergegeven als het gemiddelde van 2 onafhankelijke metingen met standaarddeviatie.
4.3.2. Metingen in MES buffer De grafische voorstellingen van deze metingen worden weergegeven in figuur 4.3. B en F. De numerieke waarden zijn terug te vinden in bijlage 2. Voor deze metingen wordt gebruik gemaakt van de biologische buffer 2-(Nmorpholine)ethaansulfonzuur (MES) met een pH van 5.5. Deze pH waarde is dezelfde als de pH in late endosomen. Door de fysicochemische karakteristieken van gecoatte NGs na te gaan in een dergelijke buffer krijgen we meer inzicht over het gedrag van NGs in de late endosomen, net voor de endosomale escape (NGs worden vnl. via endocytose intracellulair opgenomen). Dit is de laagste pH waarde waaraan NGs die in aanmerking komen voor genonderdrukking blootgesteld worden. De pH in lysosomen is nog iets lager (pH: 4.5-5),
36
maar eenmaal de NGs in het lysosoom terecht komen, worden die toch sowieso afgebroken door enzymen en radicalen. Vandaar dat het dus niet echt zinvol is om te testen bij een dergelijk lage pH. Zoals weergegeven in de vermelde figuren zijn de waarden van siDEX-HEMA NGs voor incubatie vergelijkbaar met de waarden van siDEX-HEMA NGs voor incubatie in HB. In tegenstelling tot na incubatie in HB, blijven de partikelgroottes en zèta potentialen in MES redelijk stabiel. Er wordt dus een tragere hydrolyse gezien bij zure pH ivm. fysiologische pH. De bekomen dH van siDEX-MA NGs gecoat met CS concentraties van 5, 7.5, 10 en 12.5 mg/mg NGs zijn zeer hoog, te wijten aan aggregatie van deze licht negatieve partikels. Bij een concentratie van 15 en 20 mg/mg NGs daalt de diameter naar respectievelijk 523.6 ± 11.03 nm en 306.5 ± 0.9290 nm. Na incubatie worden gelijkaardige partikelgroottes en zèta potentialen gezien. De waarden van siDEX-MA NGs zijn dus zowel voor als na incubatie gelijkaardig aan die bekomen in HB, wat logisch is aangezien de pH geen invloed heeft op siDEX-MA NGs.
4.3.3. Metingen in PBS buffer Hetzelfde experiment wordt ook uitgevoerd met de fysiologische zoutoplossing PBS (pH 7.4). Metingen in dit isotoon zout zouden een betere in vitro - in vivo correlatie mogelijk moeten maken. Het gebruik van PBS geeft echter aanleiding tot degradatie (zowel van de coat als van de kern bij siDEX-(HE)MA NGs) waardoor polydispersiteit ontstaat. De ad random vorming van zoutbruggen tussen de NGs verhoogt de polydispersiteit alleen maar, waardoor met DLS moeilijk een duidelijk beeld van de partikelgrootte kan verkregen worden. De distributie die verkregen wordt na DLS meting is immers gebaseerd op intensiteit. De intensiteit van het verstrooide licht is, zoals reeds eerder vermeld onder 3.2.1.1, sterk gecorreleerd aan de partikelgrootte (I ~ d6). Een 5000 nm partikel verstrooid dus 106 keer meer licht dan een 500 nm partikel. Het verstrooide licht van de grotere partikels maskeert dus het verstrooide licht van de kleinere partikels. Daardoor is het moeilijk om met DLS een mix van grote en kleine partikels te meten omdat de contributie tot het totale verstrooide licht van de kleine partikels extreem klein is.http://www.malvern.com Het gevolg hiervan is dat op basis van de bekomen resultaten slecht voorzichtige besluiten kunnen getrokken worden. Zèta metingen zijn niet mogelijk in een dergelijk zout milieu (zie 3.2.1.2). De grafische
37
voorstellingen van deze metingen worden weergegeven in figuur 4.3. C. De numerieke waarden zijn terug te vinden in bijlage 3.
De siDEX-HEMA NGs hebben een dH tussen de 186.6 en 288.2 nm maar daarbij hoort een polydispersiteitsindex (PDI) waarde van tussen de 0.452 en 0.884 (maximaal toegelaten PDI = 0.300). De procentuele verdeling van de partikelgroottes zag er ongeveer als volgt uit: 3040%: 100 nm (waarschijnlijk losgekomen coat die vesikels vormt), 60-70%: 250-900 nm (kleine aggregaten van gedegradeerd materiaal) en 5% van de partikels vormden grote aggregaten van tussen de 4000 en 5000 nm. Na een 4u durende incubatie worden gelijkaardige partikelgroottes waargenomen. Bij siDEX-MA NGs zien we een gelijkaardige maar iets minder polydisperse verdeling van de partikelgrootte. De partikels hebben een grootte gaande van 213.4 nm-262.6 nm, eveneens met een hoge PDI gaande van 0.501-0.598. De procentuele verdeling van de partikelgroottes ziet er ongeveer als volgt uit: 65%: 600-800 nm, 35%: 100 nm en 3-5% aggregaten van 5000 nm. Na incubatie worden gelijkaardige waarden bekomen. De waarden van siDEX-HEMA NGs en siDEX-MA NGs zowel voor als na incubatie zijn dus met elkaar te vergelijken.
4.3.4. Metingen in RNAse vrij water met PBS buffer Om de vorming van zoutbruggen te voorkomen en om de polydispersiteit te doen dalen wordt een gelijkaardig experiment als voorgaande uitgevoerd. De aanmaak van de gecoatte NGs wordt hier uitgevoerd in RNAse vrij water. Na ultracentrifugatie wordt de bekomen pellet geresuspendeerd in gelijke hoeveelheden RNAse vrij water en dubbel geconcentreerd PBS en vervolgens gemeten. De grafische voorstellingen van deze metingen worden weergegeven in figuur 4.3. D. De numerieke waarden zijn terug te vinden in bijlage 3. Bij siDEX-HEMA NGs worden voor incubatie monodisperse partikels bekomen met een diameter die gradueel daalt van 184.9 nm bij 5 mg CS/mg NGs naar 157.2 nm bij 20 mg CS/mg NGs. Dergelijke lage partikelgroottes zijn te wijten aan de degradatie van siDEX-HEMA NGs in PBS. Na incubatie worden gelijkaardige partikelgroottes gemeten. De bijhorende PDI waarden zijn wel onaanvaardbaar geworden. Bij siDEX-MA NGs wordt een gelijkaardig beeld als na aanmaak in PBS bekomen. De gemiddelde dH van tussen de 190.0 nm en 276.4 nm lijken op zich zeer goed aanvaardbaar,
38
maar de hoge bijhorende PDI waarden die schommelen tussen de 0.424 en 0.559 wijzen op een hoge polydispersiteit. Hier lijken zich dus om een onverklaarbare reden wel zoutbruggen te vormen tussen de NGs, waar dit niet gezien wordt bij siDEX-HEMA NGs. De bekomen waarden voor siDEX-MA NGs zijn het resultaat van 2 onafhankelijke metingen.
Hydrodynamische diameter dH (nm)
A. Size siDEX in HB 30000 25000 20000 siDEX-HEMA NGs-coat 0h
15000
siDEX-MA NGs-coat 0h
10000
siDEX-HEMA NGs-coat 4h
5000
siDEX-MA NGs-coat 4h
0 5
7,5
10
12,5
15
20
Curosurf concentratie (mg/mg NGs)
Hydrodynamische diameter dH (nm)
B. Size siDEX in MES 8000 7000 6000 5000
siDEX-HEMA NGs-coat 0h
4000
siDEX-MA NGs-coat 0h
3000
siDEX-HEMA NGs-coat 4h
2000
siDEX-MA NGs-coat 4h
1000 0 5
7,5
10
12,5
15
20
Curosurf concentratie (mg/mg NGs)
39
Hydrodynamische diameter dH (nm)
C. Size siDEX in PBS 450 400 350 siDEX-HEMA NGs-coat 0h
300
siDEX-MA NGs-coat 0h
250
siDEX-HEMA NGs-coat 4h
200
siDEX-MA NGs-coat 4h
150 5
7,5
10
12,5
15
20
Curosurf concentratie (mg/mg NGs)
Hydrodynamische diameter dH (nm)
D. Size siDEX in RNAse vrij water + PBS 310 290 270 250
siDEX-HEMA NGs-coat 0h
230
siDEX-MA NGs-coat 0h
210
siDEX-HEMA NGs-coat 4h
190
siDEX-MA NGs-coat 4h
170 150 5
7,5
10
12,5
15
20
Curosurf concentratie (mg/mg NGs)
E. Zèta siDEX in HB 15
Zèta potentiaal (mV)
10 5 0 -5
5
7,5
10
12,5
15
siDEX-HEMA NGs-coat 0h siDEX-MA NGs-coat 0h
-10
siDEX-HEMA NGs-coat 4h
-15
siDEX-MA NGs-coat 4h
-20 -25 -30
20
Curosurf concentratie (mg/mg NGs)
40
F. Zèta siDEX in MES 0
Zèta potentiaal (mV)
-5
5
7,5
10
12,5
15
20
-10 -15
siDEX-HEMA NGs-coat 0h
-20
siDEX-MA NGs-coat 0h
-25
siDEX-HEMA NGs-coat 4h
-30
siDEX-MA NGs-coat 4h
-35 -40
Curosurf concentratie (mg/mg NGs)
Figuur 4.3. Size en zèta meting van DEX-(HE)MA NGs in HB, MES, PBS en PBS + RNAse vrij water.
4.4.
INVLOED VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN en CS VESIKELS OP DE
CELVIABILITEIT Met de MTT test kan de celviabiliteit per well berekend worden. Per well wordt een welbepaalde absorbantiewaarde bekomen bij 590 nm (formazan) en 690 nm (achtergrond). De waarde bij 690 nm en de gemiddelde absorbantie van het celmedium worden afgetrokken van de waarde bij 590 nm. Dit zijn de gecorrigeerde absorbantiewaarden. Van de 3 gecorrigeerde absorbantiewaarden per staal, positieve of negatieve controle wordt het gemiddelde
en
de
standaarddeviatie
berekend.
De
viabiliteit
en
bijhorende
standaarddeviatie kan dan via volgende formules berekend worden:
=
− !−
" & + " &( " &) + " &( "# = . % + ( − )& ( − )&
Met: P: A:
percentage viabiliteit gemiddelde van de gecorrigeerde absorbanties voor een zeker staal en σA: bijhorende standaarddeviatie
AL:
gemiddelde van de gecorrigeerde absorbanties voor de negatieve controle en σ
!
: bijhorende standaarddeviatie
41
AD:
gemiddelde van de gecorrigeerde absorbanties voor de positieve controle en σ
: bijhorende standaarddeviatie
De resultaten van de MTT meting van proefopzet 1 staan weergegeven in figuur 4.4. De viabiliteit van de positieve controle (dode cellen, wells zonder cellen) is 0% en deze van de negatieve controle (levende onbehandelde cellen) is 100%. Na transfectie met DEX-HEMA NGs wordt een gedaalde celviabiliteit gezien. Door de sterke kationische lading van de DEXHEMA NGs is de aantrekkingskracht tot de negatief geladen celmembraan groot. Door de sterke interactie ontstaat schade aan deze membraan waardoor de celviabiliteit daalt. Naargelang een hogere concentratie DEX-HEMA NGs gebruikt wordt, wordt een sterkere daling van de celviabiliteit gezien. De hoogste celviabiliteit wordt gezien bij 10 µg/ml (76%), de laagste bij 100 µg/ml (40%). Dit betekent dus een daling van de viabiliteit met 36% wanneer gekozen wordt voor een 10 maal hogere concentratie. Evenwel kan besloten worden dat grote hoeveelheden NGs kunnen opgenomen worden zonder significante toxiciteit. Bij stijgende concentraties CS vesikels blijft een celviabiliteit van tussen de 80-90% behouden. CS heeft dus weinig negatieve invloed op de celviabiliteit. Dit is logisch aangezien de CS vesikels een gelijkaardige opbouw hebben als de celmembraan (beiden zijn vnl. opgebouwd uit negatief geladen lipiden). Bij een CS concentratie van 225 µg/ml wordt een onverklaarbare viabiliteit van 126.4% gezien. De resultaten van proefopzet 2 staan weergegeven in figuur 4.5. Van de verschillende formulaties wordt de laagste viabiliteit (44%) gezien bij de DEX-HEMA NGs aan een concentratie van 100 µg/ml (zoals ook aangetoond in proefopzet 1) en wordt de hoogste celviabiliteit (76%) gezien bij de gecoatte DEX-HEMA NGs (UC, 10 µg/ml). Een iets lagere celviabiliteit wordt gezien na behandeling met gecoatte DEX-HEMA NGs (10 µg/ml), die vergelijkbaar is met de viabiliteit bij DEX-HEMA NGs + CS vesikels (10 µg/ml). Wanneer de concentraties NGs en CS vesikels vertienvoudigd worden zien we een duidelijke daling van de celviabiliteit (meest prominent aanwezig voor de DEX-HEMA NGs). Toevoeging van CS heeft dus een duidelijk positieve invloed op de celviabiliteit. Dit wordt grafisch mooi geïllustreerd door de stijging in viabiliteit wanneer DEX-HEMA NGs (100 µg/ml) met gecoatte DEX-HEMA NGs UC (100 µg/ml) vergeleken worden.
42
160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
B. % Celviabiliteit
% Celviabiliteit
A.
Concentratie Dex-HEMA NGs (µg/ml)
160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Concentratie CS vesikels (µg/ml)
Figuur 4.4. Invloed van verschillende concentraties DEX-HEMA NGs (A.) en CS vesikels (B.)
%CelvViabiliteit
op de celviabiliteit van H1299_WT
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
10 µg/ml 100 µg/ml
Verschillende formulaties
Figuur 4.5. Invloed van verschillende formulaties DEX-HEMA NGs + CS op de celviabiliteit van H1299_WT. De celviabiliteit bij een NGs concentratie van 100 µg/ml wordt voorgesteld door de blauwe balken. De celviabiliteit bij een NGs concentratie van 10 µg/ml wordt voorgesteld door de blauwe en rode balken samen (rode balk = meerwaarde in celviabiliteit bij een concentratie van 10 µg/ml). De verhouding NGs/CS bedraagt 1/7.5.
43
4.5.
CELLULAIRE OPNAME VAN VERSCHILLENDE FORMULATIES NANOGELEN ONDER
VERSCHILLENDE CONDITIES BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE Cellulaire opname kan het gemakkelijkst in beeld gebracht worden gebruik makende van fluorescent gelabelde complexen. Vandaar dat dit experiment uitgevoerd wordt. De fluorescentie wordt gemeten in het FL1 en FL4 kanaal.
In het FL1 kanaal wordt het fluorescent signaal afkomstig van SYTOX green gemeten. Een hoog percentage positieve cellen in het M1 gebied (= de cellen die een fluorescentie bezitten die significant hoger is dan de achtergrondfluorescentie) of een hoge gemiddelde fluorescentie van alle cellen in de gate wijst op een hoog aantal dode cellen aangezien SYTOX green alleen intracellulair kan opgenomen worden eenmaal de celmembraan een verhoogde permeabiliteit heeft. Aangezien er geen hoge fluorescentie wordt gemeten bij de negatieve controle (onbehandelde cellen) kan besloten worden dat SYTOX green op zich geen nadelige invloed heeft op de celviabiliteit. Om uitspraken te kunnen doen over eventuele celtoxiciteit is het percentage positieve cellen in het M1 gebied een betere parameter dan de gemiddelde gemeten fluorescentie. Uit onderstaande grafiek kan afgeleid worden dat het percentage positieve cellen in het M1 gebied voor iedere plaat en voor iedere formulatie lager is dan 9%. Doordat dit percentage zo laag ligt, moet er geen rekening mee gehouden worden in de verdere analyse. De verschillende formulaties geven wel aanleiding tot verschillende celtoxiciteiten. Gecoatte siDEX-HEMA NGs geven de laagste celtoxiciteit en siDEX-HEMA NGs de hoogste. Gecoatte siNGs zijn dus minder toxisch voor de cellen dan siDEX-HEMA NGs met vesikels. Dit komt door het verschil in partikelgrootte (gecoatte siNGs zijn kleiner) en het verschil in lading (gecoatte siNGs zijn meer anionisch). De toxiciteit veroorzaakt door vrij siRNA (sterk anionisch) is vergelijkbaar met die veroorzaakt door de gecoatte siNGs. Deze waarnemingen gelden voor de plaat geïncubeerd bij 37°C en de plaat behandelt met SA en komen overeen met wat eerder gezien werd bij de MTT test (zie 4.4.). Bij de plaat geïncubeerd bij 4°C wordt om een onverklaarbare reden een andere distributie gezien qua toxiciteit (gecoatte siNGs > siNGs met vesikels > siNGs).
% positieve cellen in het M1 gebied (FL1)
44
10 8 6 4 2
Bij 37°C
0
Bij 4°C Bij SA
Verschillende formulaties
Figuur 4.6. Percentage positieve H1299_WT cellen in het M1 gebied (FL1). In het FL1 gebied wordt mbv. Sytox green (nucleïnezuur kleurstof) de celtoxiciteit gemeten. Vijf verschillende formulaties onder 3 verschillenden condities werden getest. Bij de vierde formulatie bij 4°C werd slechts 1 staal gemeten.
De fluorescentie van siCy5 wordt gekwantificeerd in het FL4 kanaal. Hier wordt dus de intracellulaire opname van de verschillende formulaties siNGs, onder verschillende condities gemeten. De resultaten worden voorgesteld in onderstaande grafiek. De gemiddelde fluorescentie en het percentage positieve cellen in het M1 gebied is zeer laag bij de cellen geïncubeerd aan 4°C. Dit is logisch omdat onder deze conditie de ATPafhankelijke processen, zoals endocytose, stilvallen en endocytose nu eenmaal de belangrijkste manier van cellulaire opname voor siNGs is (zie 1.5.). Incuberen op ijs legt de endocytose volledig stil. Opname van complexen is dus enkel mogelijk via directe fusie. Wanneer de gemiddelde fluorescentie van de verschillende formulaties onderling vergeleken wordt, wordt niet echt een verschil gezien. In tegenstelling tot wat beschreven wordt in de literatuur (zie 1.5.) wordt hier dus geen hogere opname van gecoatte siNGs door fusie gezien.
Bij de plaat behandelt met SA is de gemiddelde fluorescentie laag, maar is het aantal positieve cellen in het M1 gebied vrij hoog. SA heeft een minder negatieve invloed op de
45
endocytose dan een lage temperatuur. Bij deze conditie zijn een hoog aantal cellen in staat om een laag aantal complexen op te nemen. Een bijkomend verschil is dat door incubatie bij 4°C er conformatie veranderingen in de lipidencoat kunnen ontstaan waardoor celopname en toxiciteit gewijzigd wordt. SA doet dit niet, en dit is dan ook meteen de reden waarom SA in dit experiment opgenomen werd. Onder deze conditie worden de siDEX-HEMA NGs met vesikels duidelijk het beste opgenomen, gevolgd door de siDEX-HEMA NGs. Hier wordt dus eveneens geen verhoogde opname van gecoatte siNGs door fusie gezien.
Bij de stalen geïncubeerd aan 37°C worden de hoogste gemiddelde fluorescenties en de hoogste percentages positieve cellen in het M1 gebied waargenomen. Er kan gezien worden dat de siDEX-HEMA NGs het beste worden opgenomen. De fluorescentie intensiteit van de siDEX-HEMA NGs met CS vesikels ligt reeds 25% lager en de opname van gecoatte siDEXHEMA NGs (al dan niet UC) ligt 90% lager. Gecoatte siNGs worden dus ook hier minder goed opgenomen dan niet-gecoatte NGs. Vrij siRNA wordt quasi niet opgenomen, onder geen
Gemiddelde fluorescentie van het monster (FL4)
enkele conditie ( verklaring zie 1.3.1).
A. 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
Bij 37°C Bij 4°C Bij SA
Verschillende formulaties
% positieve cellen in het M1 gebied (FL4)
46
B. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Bij 37°C Bij 4°C Bij SA
Verschillende formulaties
Figuur 4.7. Gemiddelde fluorescentie (A.) en % positieve H1299_WT cellen in het M1 gebied (B.)(FL4). In het FL4 gebied wordt mbv. siCy5 de transfectie gemeten. Vijf verschillende formulaties onder 3 verschillende condities werden getest. Bij de vierde formulatie bij 4°C werd slechts 1 staal gemeten.
4.6.
GENONDERDRUKKING
DOOR
VERSCHILLENDE
FORMULATIES
NANOGELEN
BEOORDELEN VIA FLOW CYTOMETRIE Het doel van dit experiment is om de genonderdrukking in H1299_EGFP na transfectie met verschillende formulaties NGs beladen met siCTRL of siGFP te bestuderen. Het gen coderend voor EGFP wordt stabiel tot expressie gebracht in H1299_EGFP en is dan ook een veelgebruikt model om genonderdrukking te testen. De sequentie van het actieve siRNA werd zo ontworpen om selectief de EGFP expressie te onderdrukken.2,20 De resultaten worden voorgesteld in onderstaande figuur 4.8.
Bij de cellen geïncubeerd met verschillende formulaties siNGs beladen met siCTRL wordt quasi geen genonderdrukking gezien (hoge fluorescentiewaarden). Een genonderdrukking door onspecifieke toxische effecten van siRNA kan dus uitgesloten worden. Aangezien de fluorescentiewaarden voor de onbehandelde cellen en voor de cellen die transfectie ondergingen met siNGs beladen met siCTRL nagenoeg identiek zijn, kan opnieuw
47
besloten worden dat de verschillende formulaties nagenoeg geen celtoxiciteit veroorzaken. Dit komt overeen met wat eerder reeds gezien werd in voorgaande MTT-testen en voorgaande flow cytometrie.
Eerst wordt de genonderdrukking veroorzaakt door SiNGs suspensies die 100 nM siGFP bevatten (= optimale belading van 3.33 pmol siGFP/µg NGs) getest. Een gemiddelde downregulatie van de EGFP fluorescentie met 89% tov. de fluorescentie bij siNGs beladen met siCTRL wordt hierbij gezien. Honderd procent van het transcript kan dus niet verwijderd worden (zie 1.1.). SiDEX-HEMA NGs met CS (vesikels, coat) geven in absolute waarden een betere genonderdrukking dan siDEX-HEMA NGs, ondanks het feit dat ze minder goed intracellulair opgenomen worden (zie 4.5.). De stijging van de genonderdrukking bij dergelijke siNGs kan te wijten zijn aan een verbeterde intracellulaire verwerking (zie 1.5.). Er is evenwel nood aan verder onderzoek om dit te bevestigen aangezien de bekomen resultaten niet statistisch significant van elkaar verschillen. De genonderdrukking door siGFP zonder carriër is verwaarloosbaar (3-5% daling in fluorescentie tov. siCTRL zonder carriër) en kan verklaard worden door de lage intracellulair opname van vrij siRNA (zie 4.5.). Er kan dus besloten worden dat met de gebruikte concentratie NGs, beladen met 100 nM siGFP, een goede genonderdrukking en een goede celviabiliteit bekomen wordt. In een tweede fase van dit onderzoek wordt de genonderdrukking veroorzaakt SiNGs suspensies beladen met een suboptimale hoeveelheid (10 nM) siGFP getest (= 0.333 pmol siRNA/µg NGs). Het doel van dit experiment is om de genonderdrukking met suboptimale belading in beeld te brengen, en om te kijken of bij dergelijk lage concentratie siGFP een significant verschil tussen de verschillende formulaties NGs kan aangetoond worden. Wanneer grafiek B vergeleken wordt met grafiek A valt onmiddellijk op dat de genonderdrukking een stuk lager ligt, wat logisch is. Met een dergelijk lage concentratie siGFP in NGs wordt een gemiddelde genonderdrukking van 38% gezien, wat veel hoger is dan verwacht werd. Een tweede doel was om te bestuderen of bij deze concentratie siGFP een significant verschil tussen de verschillende formulaties kan gezien worden. Zoals blijkt uit grafiek C kan hier wel significant bewezen worden dat de gecoatte NGs (UC) beladen met 10 nM siGFP de beste onderdrukking geven.
48
Gemeten fluorescentie EGFP
A. 100 nM siRNA 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
100 nM siCTRL 100 nM siGFP
Verschillende formulaties
Gemeten fluorescentie EGFP
B. 10 nM siRNA 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
10 nM siCTRL 10 nM siGFP
Verschillende formulaties
49
% Genonderdrukking
C. % Genonderdrukking door siGFP 120 100 80 60 40 20 0
100 nM siGFP 10 nM siGFP
Verschillende formulaties
Figuur 4.8. Beoordeling van de fluorescentie van EGFP en de genonderdrukking in H1299_EGFP door verschillende formulaties nanogelen aangemaakt met siCTRL of siGFP aan een concentratie van 100 of 10 nM. % genonderdrukking = % daling in fluorescentie van een formulatie NGs beladen met siGFP tov. fluorescentie gezien na behandeling met dezelfde formulatie NGs beladen met siCTRL.
4.7.
ENDOSOMALE FUSIE VAN GECOATTE NANOGELEN BEOORDELEN VIA FLUORESCENTIE
RESONANTIE ENERGIE TRANSFER (FRET) TEST DLS en zèta meting PC:PE:PS:Cholesterol (5:1:1:2) (w:w) liposomen De resultaten van de metingen van de liposomen, al dan niet gelabeld, in MES of HB staan weergegeven in onderstaande tabellen. Hierin wordt gezien dat liposomen aangemaakt zonder label een hogere dH hebben en meer polydispers zijn. Na labelling worden liposomen met een perfecte partikelgrootte en met een aanvaardbare PDI verkregen. Hoe het komt dat de gebruikte labels een dergelijk grote invloed op de DLS meting hebben is niet geweten. De metingen in HB en MES zijn vergelijkbaar met elkaar. Sonicatie gedurende 2 min ipv. 1 min heeft een zeer grote invloed op de partikelgrootte van de liposomen aangemaakt in HB (degradatie en aggregatie), terwijl nagenoeg geen invloed wordt gezien op de liposomen aangemaakt in MES. Een sterk negatieve en onderling vergelijkbare zèta potentiaal wordt waargenomen bij alle metingen. Wanneer gelabeld wordt is de zèta potentiaal negatiever. In
50
een bijkomend experiment werd de stabiliteit van de liposomen in de tijd bestudeerd. Twee DLS metingen van de 4 verschillende formulaties liposomen in de 2 verschillende buffers met 24u tussentijd werden uitgevoerd. De bekomen resultaten op tijdstip 0u en 24u zijn analoog en zijn sterk vergelijkbaar met de resultaten vermeld in onderstaande tabel (vandaar niet extra weergegeven). De aangemaakte liposomen zijn dus minimum 24u stabiel.
Tabel 4.1. Resultaten DLS en zèta meting liposomen in HEPES buffer. Met D = donor fluorofoor NBD-PE en A = acceptor fluorofoor Rho-DOPE. De waarden cursief gedrukt zijn de standaarddeviaties. dH (nm) Liposoom zonder label
PDI
PDI Width
Zèta Pot (mV)
Zèta Dev (mV)
141,1
0,370
85,86
-46,8
4,57
3,005
0,002
1,537
0,896
0,316
1,586E+04
0,409
2425
2,632E+04
0,339
3305
120,8
0,204
54,58
-50,7
7,29
0,8145
0,004
0,8900
2,44
1,13
113,6
0,235
55,11
-51,0
67,7
0,5292
0,007
0,5707
1,64
4,92
Liposoom zonder label na extra 60'' sonicatie
D_liposoom
DA_liposoom
Tabel 4.2. Resultaten DLS en zèta meting liposomen in MES buffer. Met D = donor fluorofoor NBD-PE en A = acceptor fluorofoor Rho-DOPE. De waarden cursief gedrukt zijn de standaarddeviaties. dH (nm) Liposoom zonder label
PDI
PDI Width
Zèta Pot (mV)
Zèta Dev (mV)
154,5
0,421
100,3
-40,1
4,32
2,623
0,005
2,233
1,97
0,384
136,5
0,427
89,2
2,113
0,0110
2,366
108,1
0,230
51,82
-50,6
7,38
1,323
0,009
1,686
0,503
0,262
111,7
0,227
53,24
-50,5
8,09
0,5508
0,003
0,3092
1,87
0,334
Liposoom zonder label na extra 60'' sonicatie
D_liposoom
DA_liposoom
51
Aanmaak van de kalibratiecurve De fluorescentie van de donor fluorofoor van de verdunningsreeks (5000, 2500, 1000, 500, 250, 100, 50, 25 en 10 nM) wordt voorgesteld in onderstaande figuur 4.9. Bij D_HEPES en D_MES wordt bij hoge concentraties aan liposomen een hoge fluorescentie waargenomen die initieel lineair daalt naarmate meer verdund wordt. Bij de hoogste verdunningen valt deze lineariteit weg en verloopt de curve quasi horizontaal met de x-as en gelijklopend met de curves van DA_HEPES en DA_MES. Bij DA_HEPES en DA_MES wordt een constante, lage fluorescentie bekomen ongeacht de verdunning. De lage fluorescentiewaarden van de donor worden verklaard door een hoge FRET van donor naar acceptor. Het doel van de kalibratiecurve was om de concentratie waarbij het grootste verschil in fluorescentie wordt gezien van de D_liposomen tov. de DA_liposomen, gemeten in HB of MES, te bepalen. Aan de hand van onderstaande grafiek kunnen we besluiten dat dit het geval is bij een concentratie van 5000 nM. Met deze concentratie werd dan ook verder gewerkt in de eigenlijke FRET test.
Gemiddelde fluorescentie
Fluorescentie bij 460 nm / 535 nm 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0
DA_HEPES DA_MES D_HEPES D_MES
5000 2500 1000 500 250 100 50
25
10
Verdunningsreeks liposomen (nM)
Figuur 4.9. Gemiddelde fluorescentie van de enkel of dubbel gelabelde liposomen PC:PE:PS:Cholesterol (5:1:1:2) (w:w) aangemaakt in HB of in MES buffer. D = de donor fluorofoor NBD-PE en A = de acceptor fluorofoor Rho-DOPE.
52
Eigenlijke FRET test Het doel van het FRET experiment is om de verbeterde endosomale escape van gecoatte siNGs tov. niet gecoatte siNGs aan te tonen. Zoals vermeld onder 1.5. verwachten we bij gecoatte siNGs fusie/lipide mixing van de lipidencoat met de lipiden van de endosomale membraan, waardoor deze laatste verbroken wordt en de siNGs in het cytoplasma vrijgesteld worden. De resultaten van de fluorescentiemetingen van de suspensies bestaande uit alleen liposomen of uit liposomen met de verschillende formulaties siNGs in de 2 verschillende buffers op verschillende tijdstippen worden weergegeven in onderstaande grafieken. Hierbij kunnen 2 belangrijke waarnemingen vastgesteld worden. Ten eerste kunnen we zien dat de gemeten fluorescentie niet wijzigt in de tijd. Ten tweede valt op dat de grafieken in HB en in MES er gelijkaardig uitzien (de fluorescentie in MES ligt evenwel iets lager). Hieruit kan besloten worden dat de pH weinig invloed heeft op de waargenomen fluorescentie.
De fluorescentiewaarden van de D_liposomen moeten in principe bij de verschillende geteste suspensies immer dezelfde zijn ongeacht welke formulatie siNGs toegevoegd wordt. Bij de D_liposomen zonder toegevoegde siNGs wordt een fluorescentiewaarde van ~1000000 waargenomen. Wanneer siDEX-HEMA NGs toegevoegd worden daalt dit signaal naar ~200000.
Een mogelijke verklaring voor deze daling in fluorescentiewaarde is de quenching
van het signaal van de D_liposomen door de overmaat toegevoegde siNGs. Door de elektrostatische aantrekkingskracht tussen de negatief geladen liposomen en de overmaat positief geladen siNGs worden immers grote aggregaten gevormd. Hierdoor kunnen de laserstralen de D_liposomen moeilijk bereiken waardoor minder emissie fluorescentie gemeten wordt. Bij de suspensie met gecoatte siDEX-HEMA NGs (al dan niet UC) wordt opnieuw een signaal van ~1000000 gemeten. Gecoatte siNGs (negatief geladen) en liposomen gaan elkaar elektrostatisch afstoten. Doordat er hier geen aggregaten gevormd worden kan het fluorescentiesignaal van de donor nog immer gemakkelijk gemeten worden. Bij de siDEX-HEMA NGs met CS vesikels wordt een signaal dat tussenin vorige 2 signalen ligt gemeten. Hier is dus nog immer een bepaalde graad van quenching aanwezig, evenwel lager dan bij de gewone siDEX-HEMA NGs omwille van de negatieve lading van de siNGs met CS vesikels.
53
Bij de suspensie van DA_liposomen wordt een veel lagere fluorescentie gemeten ivm. de fluorescentie bij D_liposomen omwille van FRET van donor naar acceptor. Het FRET% bij DA_liposomen in HB bedraagt 84-85%, in MES 76-77%. Vandaar dat een daling in fluorescentie signaal van
~1000000
(D_liposomen) naar
~200000
(DA_liposomen)
waargenomen wordt. Na toevoeging van de siDEX-HEMA NGs wordt eenzelfde signaal (in MES), of een mild gestegen signaal (in HB) waargenomen (tov. DA-liposomen). Dit kan wijzen op afwezigheid van fusie of lipide mixing en dus behoud van een intacte endosomale membraan met behoud van FRET. Er kunnen evenwel geen besluiten genomen worden omwille van de massale quenching die eerder gezien werd na toevoeging van siDEX_HEMA NGs aan D_liposomen. Bij de suspensie met de gecoatte siNGs (al dan niet UC) wordt een signaal van ~1000000 gemeten, wat overeenkomt met het signaal gemeten bij D_liposomen met gecoatte siNGs. Hier is dus duidelijk geen FRET meer aanwezig. Door de hydrofobe aantrekkingskrachten tussen liposomen en gecoatte siNGs ontstaat waarschijnlijk fusie/lipide mixing waardoor de afstand donor tov. acceptor in de liposomale membraan stijgt en er geen FRET meer voorkomt. Wanneer gekeken wordt naar onderstaande grafiek zien we dat reeds vanaf de eerste meting op tijdstip 0 min hoge fluorescentiewaarden aanwezig zijn. Dit komt doordat de staalvoorbereiding in de 96 well plaat meer tijd in beslag heeft genomen dan voorzien werd en er dus niet exact op tijdstip 0 min werd gemeten na samenvoegen. Er was dus reeds gedurende enkele minuten interactie aanwezig tussen de verschillende componenten vooraleer gemeten werd. In de toekomst moet dan ook getracht worden om dit tijdsinterval drastisch te beperken. Bij de suspensies siNGs met vesikels wordt opnieuw een tussenliggend signaal gemeten. Door de aanwezigheid van quenching kunnen echter ook hier geen conclusies genomen worden.
Algemeen kan dus geen besluit genomen worden over de verbeterde endosomale vrijstelling van gecoatte siNGs aangezien niets kan gezegd worden over de niet gecoatte siNGs. Dit experiment was de eerste uitvoering van een volledig nieuw opgesteld protocol, dat verdere optimalisatie nodig heeft. Zo moeten pogingen ondernomen worden om de quenching veroorzaakt door siDEX-HEMA NGs te verminderen. Verder wordt een proefopzet met een andere samenstelling liposomen overwogen. Aan de hand van dit experiment kunnen dus alleen nog maar veronderstellingen gemaakt worden en kunnen geen definitieve besluiten genomen worden.
54
Fluorescentie D in HB Gemiddelde fluorescentie
1600000 1400000 1200000 DA_liposomen
1000000 800000
siDEX-HEMA NGs
600000
siDEX-HEMA NGs + CS vesikels
400000
siDEX-HEMA NGs-coat
200000
siDEX-HEMA NGs coat (UC)
0 0
10
20
30
60
120
Tijd (min)
Fluorescentie DA in HB Gemiddelde fluorescentie
1600000 1400000 1200000 DA_liposomen
1000000 800000
siDEX-HEMA NGs
600000
siDEX-HEMA NGs + CS vesikels
400000
siDEX-HEMA NGs-coat
200000
siDEX-HEMA NGs coat (UC)
0 0
10
20
30
60
120
Tijd (min)
Fluorescentie D in MES Gemiddelde fluorescentie
1600000 1400000 1200000 DA_liposomen
1000000 800000
siDEX-HEMA NGs
600000
siDEX-HEMA NGs + CS vesikels
400000
siDEX-HEMA NGs-coat
200000
siDEX-HEMA NGs coat (UC)
0 0
10
20
30
Tijd (min)
60
120
55
Fluorescentie DA in MES Gemiddelde fluorescentie
1600000 1400000 1200000 DA_liposomen
1000000 800000
siDEX-HEMA NGs
600000
siDEX-HEMA NGs + CS vesikels
400000
siDEX-HEMA NGs-coat
200000
siDEX-HEMA NGs coat (UC)
0 0
10
20
30
60
120
Tijd (min)
Figuur 4.10. Fluorescentie van D_liposomen en DA_liposomen in HEPES en MES buffers gemeten op verschillende tijdstippen, zonder en met toevoeging van verschillende nanogelen formulaties. D = de donor fluorofoor NBD-PE en A = de acceptor fluorofoor RhoDOPE.
56
5. CONCLUSIE Het doel van deze masterproef was om de formulatie dextraan NGs, gebruikt voor aflevering van siRNA intracellulair, te optimaliseren. In de masterproef werd specifiek onderzocht of gecoatte NGs een meerwaarde hebben tov. niet-gecoatte NGs.
Eerst werden de fysicochemische karakteristieken van niet gecoatte NGs beladen met stijgende hoeveelheden siRNA onderzocht. Na toevoeging van 40 pmol siRNA/µg NGs werd een ladingsneutralisatie van het oppervlak van de NGs bekomen. Opdat we verder wilden werken met stabiele kationische siNGs mag maximaal 30 pmol siRNA/µg NGs toegevoegd worden. Met FCS werd een maximale ladingscapaciteit van tussen de 25-33.3 pmol siRNA/µg NGs gezien.
Een belangrijk doel was om de invloed van coating met stijgende hoeveelheden CS op de partikelgrootte en zèta potentiaal van dextraan NGs te onderzoeken in verschillende buffers. In HB werd voor de siDEX-NGs een dalende dH, PDI en zèta potentiaal gezien naarmate meer CS werd toegevoegd. De siDEX-HEMA NGs waren in deze buffer niet colloidaal stabiel, dit door de hydrolyse van de carbonaatesterverbindingen bij fysiologische pH. De siDEX-MA NGs waren wel stabiel door het ontbreken van deze verbindingen. De waarden bekomen in MES buffer waren voor siDEX-MA NGs analoog aan deze bekomen in HB. Bij siDEX-HEMA NGs waren enkel de waarden bekomen voor incubatie analoog aan deze in HB. SiDEX-HEMA NGs waren in MES wel colloïdaal stabiel door het ontbreken van hydrolyse bij zure pH. Als laatste werden de partikelgroottes in PBS bestudeerd. In dit milieu waren de dextraan NGs niet stabiel. Zowel de coat als de kern degradeerden onder invloed van de hoge zoutconcentratie. Door een supplementaire vorming van zoutbruggen tussen de partikels onderling werden hoge PDI waarden gezien.
Verschillende transfectie experimenten werden uitgevoerd met 2 cellijnen carcinoma cellen van het alveolaire epitheel. De invloed van verschillende formulaties NGs op celviabiliteit, cellulaire opname, endosomale vrijstelling en genonderdrukking werden bestudeerd. De laagste celviabiliteit werd gezien na transfectie met niet gecoatte NGs, de hoogste na transfectie met gecoatte NGs. De gecoatte NGs hebben hier dus een duidelijke meerwaarde tov. de niet-gecoatte NGs. Nadien werd de cellulaire opname van de verschillende
57
formulaties bestudeerd bij 4°C, bij 37°C en na incubatie met SA. Bij 4°C werd quasi geen intracellulaire opname van de verschillende formulaties waargenomen. Een dergelijk lage temperatuur legt de endocytose stil en opname via endocytose is de belangrijkste manier voor intracellulaire opname van NGs. Na incubatie met SA (legt de endocytose in een mindere mate stil) waren veel cellen in staat om een kleine hoeveelheid NGs op te nemen. De NGs met vesikels werden het beste opgenomen. Onder deze 2 condities kon dus geen verhoogde opname van gecoatte NGs door fusie aangetoond worden. Bij 37°C werd een veel hogere opname voor de verschillende formulaties gezien. De niet-gecoatte NGs gevolgd door de NGs met CS vesikels werden het beste opgenomen. Uit deze transfectie experimenten kan dus besloten worden dat gecoatte NGs (negatief geladen) minder goed intracellulair worden opgenomen ivm. niet-gecoatte NGs (positief geladen). Bijkomend werd de genonderdrukking bestudeerd. Bij een belading van 3.33 pmol siRNA/µg NGs werd geen significant verschil tussen de formulaties aangetoond. Bij een suboptimale belading van 0.333 pmol siRNA/µg NGs werd een betere genonderdrukking door gecoatte NGs (UC) aangetoond. Als laatste werd de endosomale fusie bestudeerd. Endosomale fusie/lipide mixing van gecoatte NGs met de endosomale membraan werd aangetoond. Er kan echter niet besloten worden dat gecoatte NGs een verbeterde endosomale vrijstelling hebben tov. niet gecoatte, aangezien geen uitspraken konden gedaan worden over de endosomale vrijstelling van de niet-gecoatte NGs (massale quenching was aanwezig bij deze formulatie). Dit experiment moet dus herhaald en geoptimaliseerd worden in de toekomst.
Van ieder experiment werd slechts 1 onafhankelijke meting uitgevoerd (tenzij anders vermeld). Herhaling is dus nog nodig om te zien of dezelfde resultaten opnieuw bekomen kunnen worden. Verder moeten het experiment van endosomale vrijstelling herhaald en geoptimaliseerd worden om definitieve uitspraken te kunnen maken.
58
6. LITERATUURLIJST 1. Remaut K, Sanders NN, De Geest BG, Braeckmans K, Demeester J, De Smedt SC: Nucleic acid delivery: Where material sciences and bio-sciences meet. Materials Science and Engineering R58, 117-161 (2007). 2. De Backer L, Braeckmans K, Demeester J, De Smedt SC, Raemdonck K: The influence of natural pulmonary surfactant on the efficacy of siRNA-loaded dextran nanogels. Future Medicine (2013). 3. Ka-Wing Lam J, Liang W, Chan HK: Pulmonary delivery of therapeutic siRNA. Advanced Drug Delivery Reviews 64(1), 1-15 (2012). 4. Merkel OM, Kissel T: Nonviral pulmonary delivery of siRNA. Acc. Chem. Res. 45, 961-970 (2012) 5. Davidson BL, Mccray PB Jr.: Current prospects for RNA interference-based therapies. Nat. Rev. Genet. 12(5), 329-340 (2011). 6. Tolia NH, Joshua-Tor L: Slicer and the Argonauts. Nat. Chem. Biol. 3, 36-43 (2007). 7. Raemdonck K, Vandenbroucke RE, Demeester J, Sanders NN, De Smedt SC: Maintaining the silence: reflections on long-term RNAi. Drug Discovery Today 13(21/22), 917-931 (2008). 8. de Martimprey H, Vauthier C, Malvy C, Couvreur P: Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids: Oligonucleotides and siRNA. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71, 490-504 (2009). 9. Hyvönen Z, Hämäläinen V, Ruponen M, Lucas B, Rejman J, Vercauteren D, Demeester J, De Smedt S, Braeckmans K: Elucidating the pre- and post-nuclear intracellular processing of 1,4dihydropyridine based gene delivery carriers. Journal of Controlled Release 162, 167-175 (2012). 10. Bartlett DW, Davis ME: Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34, 322-333 (2006). 11. de Fougerolles A, Novobrantseva T: siRNA and the lung: research tool or therapeutic drug? Current Opinion in Pharmacology 8, 280-285 (2008). 12. Whitehead KA, Langer R, Anderson DG: Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature reviews 8, 129-138 (2009). 13. Cattaneo AG, Gornati R, Sabbioni E, Chiriva-Internati M, Cobos E, Jenkins MR, Bernardini G: Nanotechnology and human health: risks and benefits. Journal of Applied Toxicology 30, 730-744 (2010).
59
14. De Backer L, Demeester J, De Smedt S, Raemdonck K: Bio-inspired Surfactant-modified Dextran Nanogels Mediate Enhanced Intracellular siRNA Delivery. Human Gene Therapy 23, A136–A137 (2012). 15. Hitzman CJ, Wattenberg LW, Wiedmann TS: Pharmacokinetics of 5-fluorouracil in the Hamster Following Inhalation Delivery of Lipid-Coated Nanoparticles. Journal of Pharmaceutical Sciences 95(6), 1196-1211 (2006). 16. Pilcer G, Sebti T, Amighi K: Formulation and Characterization of Lipid-Coated Tobramycin Particles for Dry Powder Inhalation. Pharmaceutical Research 23(5), 931-940 (2006). 17. DeVincenzo JP: Harnessing RNA interference to develop neonatal therapies: From Nobel Prize winning discovery to proof the concept clinical trials. Early Human Development 85, S31-S35 (2009). 18. Sanders N, Rudolph C, Braeckmans K, De Smedt SC, Demeester J: Extracellular barriers in respiratory gene therapy. Advanced Drug Delivery Reviews 61, 115-127 (2009). 19. Hitzman CJ, Elmquist WF, Wattenberg LW, Wiedmann TS: Development of a Respirable, Sustained Release Microcarrier for 5-Fluorouracil I: In vitro Assessment of Liposomes, Microspheres, and Lipid Coated Nanoparticles. Journal of Pharmaceutical Sciences 95(5), 1114-1126 (2006). 20. Benfer M, Kissel T : Cellular uptake mechanism and knockdown activity of siRNA-loaded biodegradable DEAPA-PVA-g-PLGA nanoparticles. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80(2), 247-256 (2011). 21. Thompson JD: Applications of antisense and siRNAs during preclinical drug development. Drug Discovery Today 7, 912-917 (2002) 22. Raemdonck K, Naeye B, Buyens K, Vandenbroucke RE, HØgset A, Demeester J, De Smedt SC: Biodegradable Dextran Nanogels for RNA Interference: Focusing on Endosomal Escape and Intracellular siRNA Delivery. Advanced Functional Materials 19, 1406-1415 (2009). 23. Zamore PD, Tusch T, Sharp PA, Bartel DP: RNAi: double-stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25-33 (2000). 24. Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ: Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366 (2001). 25. Nguyen J, Reul R, Betz T, Dayyoub E, Schmehl T, Gessler T, Bakowsky U, Seeger W, Kissel T: Nanocomposites of lung surfactant and biodegradable cationic nanoparticles improve transfection efficiency to lung cells. Journal of Controlled Release 140, 47-54 (2009).
60
26. Ashley CE, Carnes EC, Phillips GK, Padilla D, Durfee PN, Brown PA, Hanna TN, Liu J, Phillips B, Carter MB, Carroll NJ, Jiang X, Dunphy DR, Willman CL, Petsev DN, Evans DG, Parikh AN, Chackerian B, Wharton W, Peabody DS, Brinker CJ: The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature Materials 10(5), 389-397 (2011). 27. Cheow WS, Hadinoto K: Factors affecting drug encapsulation and stability of lipidpolymer hybrid nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 85, 214-220 (2011). 28. Elouahabi A, Ruysschaert JM: Formation and Intracellular Trafficking of Lipoplexes and Polyplexes. Molecular Therapy 11, 336-347 (2005). 29. van Dijk-Wolthuis WNE, Tsang SKY, Kettenes-van den Bosch JJ, Hennink WE: A new class of polymerizable dextrans with hydrolyzable groups: hydroxyethyl methacrylated dextran with and without oligolactate spacer. Polymer 38(25), 6235-6242 (1997). 30. Raemdonck K, HØgset A, Demeester J, De Smedt SC: Evaluation of gene silencing kinetics with siRNA loaded dextran nanogels. Doctoraat aan de Universiteit van Gent, Faculteit Farmaceutische Wetenschappen, 163-182 (2009)
http://www.jnanobiotechnology.com/content/5/1/6/figure/F6?highres=y (10-03-2013) http://www.malvern.com (10-03-2013) http://www.roche-applied-science.com (25-03-2013)
7. BIJLAGEN Bijlage 1. DLS en zèta metingen van gecoatte siDEX-(HE)MA NGs (UC) in HEPES buffer. De waarden in cursief zijn de standaarddeviaties. siDEX-HEMA NGs-coat (UC) in HB
172,4 0,8737
Zèta Pot Zèta Dev PDI Width (mV) (mV) 0,113 58,01 23,2 5,69 0,013 3,030 0,252 0,627
2298 1098,6 495,0 159,6 319,0 102,9 314,0 2,312 239,0 3,600 353.8 4.355
0,406 0,180 0,305 0,035 0,233 0,012 0,261 0,014 0,280 0,025 0,258 0,013
1509 491,3 278,8 16,09 157,5 4,804 160,2 3,353 125,3 5,230 179.2 5.493
-6,58 0,568 -9.00 0,486 -15,9 1,52 -12,8 1,15 -22,7 1,99 -15,9 1,46
3,16 0,252 4,12 0,493 5,56 0,326 4,15 0,413 6,56 0,707 4,43 0,117
5980 1912 2375 545,6 1106 327,9 508,9 1,700 509,2 15,10 457,5 1,800
0,828 0,219 0,611 0,264 0,203 0,060 0,245 0,007 0,271 0,012 0,347 0,035
5457 1500 1852 599,0 489,3 85,83 252,0 4,496 265,1 10,07 269,0 13,67
-5,29 0,664 -9,39 0,699 -12,5 0,875 -14,3 1,45 -18,8 1,38 -23,0 1,66
3,38 0,375 3,32 0,158 3,79 0,229 3,89 0,0624 3,77 0,333 4,72 0,794
1,786E+04 1,074E+04 9127 584,2 7357 3424 4151 321,1 551,4 149,5 552.5 10.26
0,788 0,047 0,785 0,369 0,854 0,254 0,960 0,070 0,488 0,039 0.306 0,058
1,015E+04 320,1 7973 2423 6887 971,3 4072 456,3 385,3 19,67 304.7 24.58
10,2 0,821 -1,34 0,682 -8,43 0,863 -10,5 1,03 -14,5 0,928 -14,3 1.26
4,47 1,17 4,30 0,71 3,79 0,588 3,66 0,356 4,52 0,561 4.19 0,367
7797 1656 2157 680,1 1133 298,9 528,7 12,10 560,0 19,90 518,6 9,300
1,000 0,000 0,302 0,084 0,231 0,040 0,260 0,032 0,293 0,024 0,335 0,006
7797 1016 1149 23,57 550,1 77,48 269,7 22,48 302,5 9,631 300,3 6,910
-6,35 0,609 -11,1 0,854 -17,2 1,41 -21,0 2,30 -26.0 1,95 -26,1 2,40
3,48 0,430 3,16 0,0836 3,72 0,385 3,99 0,255 4,09 0,711 4,96 0,537
dH (nm) DEX-(HE)MA NG Na 0h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG Na 4h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG
siDEX-MA NGs-coat (UC) in HB
PDI
dH (nm)
PDI
188,4 0,2121
Zèta Pot Zèta Dev PDI Width (mV) (mV) 0,179 79,69 23,3 6,47 0,013 2,751 1,77 0,233
Bijlage 2. DLS en zèta metingen van gecoatte siDEX-(HE)MA NGs (UC) in MES buffer. De waarden in cursief zijn de standaarddeviaties. siDEX-HEMA NGs-coat (UC) in MES DEX-(HE)MA NG Na 0h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG Na 4h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG
dH (nm) PDI 170,6 1,323
siDEX-MA NGs-coat (UC) in MES Zèta Pot Zèta Dev PDI Width (mV) (mV) 0,131 61,70 28,0 4,73 0,018 3,911 0,252 0,231
dH (nm) PDI 184,6 1,721
Zèta Pot Zèta Dev PDI Width (mV) (mV) 0,111 61,56 25,1 7,90 0,009 2,405 0,764 2,80
1758 51,21 1184 66,90 376,5 4,319 294,1 3,617 274,3 2.551 297.1 1,200
0,311 0,243 0,436 0,108 0,306 0,003 0,288 0,039 0,244 0,017 0,259 0,010
914,8 378,1 774,8 47,60 208,4 1,442 157,5 8,506 135.3 3.313 151.2 1,200
-6,01 0,767 -6,48 0,227 -9,72 0,832 -16,0 0,681 -31.7 2.27 -15,7 0.603
4,22 0,481 3,49 0,0681 9,95 0,131 7,83 0,409 7,68 2.88 5.99 0,406
5012 855,9 4815 312,4 2895 308,1 2234 38,16 523,6 11,03 306,5 0,9292
0,500 0,071 0,875 0,162 0,350 0,070 0,276 0,033 0,381 0,012 0,284 0,014
3560 842.0 4500 650.0 1719 350.0 1172 67,09 323.0 4,283 163,4 4,283
-2,65 0,671 -5,58 0,653 -5,88 1,05 -7,71 0,871 -7,600 0,215 -32,6 0,231
6,28 0,900 5,15 0,378 3,54 0,324 4,51 0,257 3,58 0,171 6,08 0,535
2387 30,55 1664 20,55 633,3 9,195 381,4 5,952 331.9 2.991 353.4 2.095
0,334 0,271 0,106 0,085 0,298 0,015 0,355 0,038 0,269 0,001 0,258 0,007
1286 621,2 514,6 201,1 345,4 10,66 226,9 12,04 172.1 1.607 179.3 1.358
-7,18 0,798 -8,95 0,657 -13,1 0,153 -18,6 0,666 -12,5 1,10 -19,2 2.29
4,20 0,364 3,69 0,233 5,55 1.00 5,71 0,295 5.18 0.0757 6,40 0,262
6412 1152 4151 739,3 2829 224,9 1806 153,1 682.0 8,652 346,6 4,772
0,463 0,104 0,929 0,119 0,265 0,108 0,265 0,077 0,304 0,015 0,298 0,004
4369 1144 4011 880,4 1426 193,9 920,2 149,5 376,2 10,42 189,2 2,676
-7,38 0,172 -5,7 0,382 -7,56 0,420 -8,68 0,597 -11,8 0,321 -36,5 0,643
3,03 0,225 4,99 0,191 4,30 0,487 3,83 0,568 4,14 0,451 5,50 0,386
Bijlage 3. DLS en zèta metingen van gecoatte siDEX-(HE)MA NGs (UC) in PBS (+ RNAse vrij water). De waarden in cursief zijn de standaarddeviaties. siDEX-HEMA NGs-coat (UC) in PBS
DEX-(HE)MA NG Na 0h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG Na 4h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG
siDEX-MA NGs-coat (UC) in PBS
PDI dH (nm) PDI Width 187,1 0,187 80,92 0,3055 0,012 2,593
dH
PDI 177,6 0,7506
siDEX-HEMA NGs-coat (UC) in PBS+ RNAse vrij water
PDI Width 0,150 68,78 0,008 1,625
288,2 22,60 240,1 2,801 215,3 3,275 186,6 2,013 187,9 1,436 200,0 2,173
0,884 0,123 0,545 0,009 0,519 0,029 0,452 0,010 0,458 0,002 0,508 0,013
269,8 14,78 177,2 3,176 155.0 2,307 125,4 2,775 127,1 0,7095 142,5 1,706
244,5 3,843 262,6 6,240 244,8 2,128 213,4 3,482 214,7 3,772 218,9 3,509
0,538 0,035 0,598 0,036 0,560 0,010 0,535 0,031 0,503 0,029 0,501 0,028
179,3 6,048 202,9 5,283 183,1 1,442 156,0 2,450 152,2 2,715 154,8 4,095
389,2 50,70 264,2 9,511 229,7 3,083 190,5 0,3606 195,6 3,843 200,3 4,347
0,738 0,142 0,590 0,013 0,549 0,007 0,511 0,002 0,491 0,019 0,503 0,024
330,4 10,54 202,8 5,395 170,1 3,306 136,2 0,5132 137,0 0,8622 142,1 3,940
261,2 8,779 270,6 13,02 234,5 5,619 214.0 2,548 227,6 0,3786 218,7 2,740
0,598 0,027 0,580 0,064 0,627 0,103 0,527 0,022 0,507 0,004 0,535 0,033
201,9 4,770 205,4 4,331 185.0 10,97 155,2 1,637 162.0 0,4163 159,9 4,153
DEX-(HE)MA NG Na 0h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG Na 4h 5 mg CS/mg NG 7,5 mg CS/mg NG 10 mg CS/mg NG 12,5 mg CS/mg NG 15 mg CS/mg NG 20 mg CS/mg NG
PDI dH (nm) PDI Width 176,1 0,097 54,75 0,5508 0,005 1,583
= voor siDEX-MA NGs-coat (UC) dH
PDI PDI width 194.7 0.133 70.77 1.368 0.029 7.411
184,9 3,855 177,0 3,066 171,5 0,2646 176,5 2,558 164,4 1,044 157.2 1.305
0,343 0,044 0,318 0,027 0,290 0,004 0,290 0,008 0,268 0,008 0,267 0,006
107,9 4,477 99,75 3,044 92,40 0,7108 95,10 2,665 85,05 1,123 81.32 0.2498
276.4 30.43 241.0 25.11 195.5 1.447 191.6 1.010 195.1 1.400 190.0 1.115
0.559 0.051 0.533 0.026 0.466 0.012 0.439 0.008 0.431 0.014 0.424 0.012
207.1 27.52 176.4 22.85 133.5 2.187 126.9 0.9552 128.0 1.610 123.7 2.431
176,8 0,6083 172,5 3,139 166,9 0,8963 167,6 2,402 157,0 2,011 150.9 2.901
0,425 0,011 0,405 0,021 0,375 0,009 0,365 0,007 0,330 0,037 0,309 0,032
115,3 1,779 109,7 1,136 102,3 0,8185 101,2 1,754 90,10 4,015 83.75 3.012
293.0 9.451 228.7 1.527 190.0 1.590 189.9 1.376 190.9 1.351 186.1 0.9739
0.649 0.071 0.553 0.013 0.485 0.012 0.470 0.014 0.460 0.007 0.440 0.010
235.8 6.866 170.2 1.785 132.3 2.068 130.1 2.132 129.5 1.133 123.3 1.823
Bijlage 4a. Voorstelling van hoe de resultaten bekomen met flow cytometrie weergegeven worden door BD CellQuest Pro analysis software voor het opname experiment.
Bijlage 4b. Voorstelling van hoe de resultaten bekomen met flow cytometrie cytometri weergegeven worden door BD CellQuest Pro analysis software voor het genonderdrukkings experiment.
Kort verslag van 4 geselecteerde evening lectures Biedt het Kiwimodel voor geneesmiddelen antwoord op het probleem van de betaalbaarheid van de gezondheidszorg? Door Dirk Van Duppen Op dit moment zijn er in België voor dezelfde actieve stof en dosis meerdere producten op de markt die onderling sterk in prijs kunnen verschillen. Daarenboven zijn onze geneesmiddelen een pak duurder dan in Nederland of Nieuw-Zeeland. De meerkost van die geneesmiddelen die wij betalen gaat niet naar tewerkstelling of onderzoek en ontwikkeling maar naar marketing en buitensporige winsten voor aandeelhouders. Het doel van Geneeskunde voor het Volk (GVHV) is dan ook om de geneesmiddelenprijzen drastisch te verlagen. Om dit te bewerkstelligen wil GVHV het Kiwimodel in België implementeren. Het Kiwimodel komt oorspronkelijk uit Nieuw-Zeeland en wordt ook toegepast in Nederland. Bij dit model verwerft de overheid voor ieder geneesmiddel de laagste prijs door openbare aanbesteding (tot 90% goedkoper). GVHV heeft door zijn opgelegde druk al prijsverlagingen kunnen realiseren. Zo was er tussen 2005-2006 een forse daling van de uitgaven aan geneesmiddelen met 40 miljoen euro - de zogenaamde Kiwi knik – en dit doordat firma’s de prijs van 900 geneesmiddelen fors in prijs deden zakken. Ook werd door minister Onkelinx een VOS systeem voor antibiotica en anti-mycotica ingevoerd. Dit houdt in dat voor deze 2 klassen de apotheker verplicht is het goedkoopste merk af te leveren. Deze maatregel veroorzaakte wel heel wat problemen en de kritiek bleef dan ook niet uit. Verder bleek uit onderzoek in opdracht van minister Onkelinx dat het Kiwimodel in België juridisch perfect mogelijk is. Momenteel is de farmaceutische industrie echter sterk gekant tegen dit model. Zelf denk ik dat een implementatie van het Kiwimodel niet direct voor morgen is. Het doorvoeren van dit model zou de hele farmaceutische industrie op zijn kop zetten. Er zouden heel wat producten van de markt verdwijnen, winstmarges voor farmaceutische bedrijven zouden immens verkleinen en volgens mij zal dit de tewerkstelling en de onderzoek en ontwikkeling niet ten goede komen (alhoewel het omgekeerde wordt beweerd door dr. Van Duppen). Ik ben het er met eens dat er prijsverlagingen moeten komen maar het Kiwimodel lijkt mij te radicaal. Verder vind ik dat het geld dat de overheid bespaart door eventuele prijsverlagingen voor een groot deel naar onderzoek en ontwikkeling moet gaan en naar een verbetering van de farmaceutische zorg. Want het hoofddoel is toch een zo goed mogelijke gezondheidszorg te bewerkstelligen? Registratie van nieuwe vaccins, geen eenvoudige klus in Europa… Door Pieter Neels In Europa bestaat er een uitgebreide hiërarchie aan regulerende instanties die de registratie van vaccins bepalen. Voorbeelden van dergelijke instanties zijn het FAGG, de Hoge Gezondheidsraad, de Europese commissie, de EMA en het CHMP. Vaccins zijn preparaten die gebruikt worden om een individu te immuniseren tegen infectieuze agentia. Het is de meest belangrijke klasse van geneesmiddelen die op de markt zijn. Vaccins verschillen in heel wat opzichten van de klassieke geneesmiddelen. Zo zijn ze zeer efficiënt en hebben ze een enorme impact op de algemene wereldgezondheid. Vaccinaties werden voor het eerst uitgevoerd in 1775 door Jenner. Een andere belangrijke pionier was Louis Pasteur. Sindsdien kende de ontwikkeling van vaccins een exponentiële groei. Een ander opmerkelijk punt is dat de vaccinologie voor een groot deel empirisch blijft. Van een aantal vaccins is het exacte werkingsmechanisme nog altijd niet gekend (vb. HPV). Ook uniek is dat vaccins toegediend worden aan jonge, gezonde mensen. In de vaccinologie staan kwaliteit en veiligheid voorop. Bij vaccins wordt alles getest tot in het detail en worden er geen AE toegelaten. Daardoor staan vaccins in schril contrast met vb. oncologische producten. Als er AE zijn, worden die meestal veroorzaakt door de toegevoegde excipiëntia of adjuvantia. De vergunning gebeurt bij voorkeur op basis van efficacy. Wanneer dit niet mogelijk is wordt een vergunning op basis van effectiveness of efficiency afgeleverd. Pieter Neels was duidelijk gefascineerd door de wetenschappelijke wereld van de vaccinologie. Zijn mening over anti-vaccinatie lobby’s was dan ook niet mals, waar ik volledig kan inkomen. Mij lijkt het ook onwaarschijnlijk dat er heden ten dage mensen zijn die alle wetenschappelijke positieve resultaten helemaal negeren of zelfs verdraaien om alleen negatieve kritiek te geven. Alhoewel de voordracht interessant was, verliep hij wel redelijk chaotisch. Heel veel verschillende subthema’s werden aangesneden die vervolgens maar deels behandeld werden. Misschien was het beter geweest wanneer het aantal onderwerpen aangekaart in de voorstelling iets beperkter was geweest.
Innovating for a Better and Sustainable Healthcare door Rudi Pauwels Wereldwijd gaat ieder jaar 7000 miljard dollar naar gezondheidszorg, en deze kosten nemen alleen maar toe door de sterk gestegen levensverwachting. Het is dan ook duidelijk dat ons huidig systeem van gezondheidszorg niet houdbaar is op lange termijn. Fundamentele innovaties dringen zich op om nog immer in staat te zijn de juiste therapie, voor de juiste patiënt, op het juiste tijdstip, aan de juiste dosis te laten inwerken op de juiste plaats. Een nieuwe manier om aandoeningen te diagnosticeren is adhv. biomerkers. Momenteel zijn reeds een hoog aantal biomerkers voor verschillende aandoeningen gekend. Evenwel is er nood aan een nieuwe techniek om deze biomerkers op een accurate en reproduceerbare manier te analyseren aangezien huidige labotechnieken suboptimaal zijn. Een oplossing kan verschaft worden door nieuwe moleculaire platforms die in staat zijn om op een gestandaardiseerde, eenvoudige, kosten-effectieve manier om het even welk klinisch staal te analyseren. Rudi Pauwels is in zijn bedrijf Biocartis momenteel in de eindfase van de ontwikkeling van een dergelijk nieuw diagnosetoestel: het Apollo platform (Apollo’s lab in a box). Rudi Pauwels is een Belgische topwetenschapper die een zeer vooruitstrevende visie heeft over hoe diagnosticering en behandeling van verschillende aandoeningen in de toekomst er moet uitzien. Zijn grootse project met het Apollo platform is mogelijks het begin van een nieuw tijdperk in de diagnostiek. Op het toestel kunnen 30 verschillende moleculen gemeten worden, waardoor het in staat is om zeer uiteenlopende ziektes op te sporen (infectieziekten, kanker, Alzheimer). Een analyse duurt gemiddeld 35-90 minuten en is dus veel sneller dan de gebruikelijke labo-analyses (1-2 weken). Het eerste diagnosetoestel moet normaal gezien dit jaar op de markt komen. Dergelijke innovaties kunnen volgens mij zeer zeker bijdragen aan een goedkopere gezondheidszorg. Mocht door verdere ontwikkeling het platform in staat zijn om nog meer moleculen te analyseren zou dit een duidelijke vooruitgang zijn in de labo-analyse. Het was dan ook een mooie ervaring om deze lezing te mogen bijwonen. Hospital Admissions Related to Medication (HARM). A preventable health and economic burden? Door Patricia van den Bemt Door het gebruik van geneesmiddelen kunnen intrinsieke of extrinsieke ongewenste effecten ontstaan. Intrinsieke schade of adverse drug reactions (ADRs) worden veroorzaakt door het normaal gebruik van een geneesmiddel, extrinsieke schade door het verkeerdelijk gebruik van een geneesmiddel. Samen vormen ze de ADEs of adverse drug events. De frequentie van voorkomen is moeilijk te bepalen omdat het moeilijk is om te beslissen wie er in een studie gaat opgenomen worden en wie niet (volledig hospitaal, acute gevallen, specifieke afdelingen, specifieke patiëntenpopulatie). Ook is er geen consistentie in de literatuur in het gebruik van de verschillende definities. Om een duidelijk beeld te scheppen werd de HARM studie opgericht. De HARM studie is een prospectieve, multicenter studie waarin alle aanmeldingen in ziekenhuizen onderzocht werden. De studie is representatief voor alle types ziekenhuizen uit alle regio’s in Nederland en staat daarmee in schril contrast tot eerder opgerichte studies die vaak retrospectief werden uitgevoerd in 1 hospitaal. Het doel van deze studie was om de frequentie van HARM te bepalen en de risicofactoren die hiertoe aanleiding geven. Besloten kon worden dat er in Nederland jaarlijks 34 000 HARMs zijn wat overeenkomt met 2.4% van de volledige populatie mensen die zich aanmelden in het ziekenhuis, of 5.6% van de mensen die zich aanmelden op spoed. 46% hiervan zijn te voorkomen. In een daaropvolgende interventie studie, de PHARM studie (Preventing Hospital Admissions by Reviewing Medication) werd een multidisciplinaire medicatie review uitgevoerd gedurende 1 jaar om zoveel mogelijk HARMs te vookomen. Een gelijkaardige studie was de High’s 5. Het resultaat was dat alleen oudere non-compliant patiënten die minstens 5 verschillende geneesmiddelen gebruiken en minstens 5 comorbiditeiten hebben een voordeel hebben van de medicatie review. Door dergelijke studies is men in Nederland in staat geweest een beeld te vormen van de ongewenste effecten die geneesmiddelen kunnen veroorzaken. Aanpakken van dit problemen kan heel wat onnodige kosten en leed besparen. Alleen moet nu nog onderzocht worden welke aanpak gekozen moet worden.
