Studie van de relatie tussen de aminozuursamenstelling van het enveloppe-eiwit en coreceptorgebruik bij HIV-1 non-B subtypes.
Lander Foquet
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Chris Verhofstede Vakgroep Klinische biologie, microbiologie en immunologie
Academiejaar 2009-2010 1
2
De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
25 mei 2010
Lander Foquet
Prof. Dr. Chris Verhofstede
3
Voorwoord
Bij het verwezenlijken van deze masterproef werd ik bijgestaan door een aantal mensen die ik in het bijzonder wil bedanken:
In de eerste plaats wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Chris Verhofstede bedanken. Dankzij haar hulp bij het opvolgen van de resultaten, het verbeteren van het schrijfwerk en het bijsturen waar nodig, kon ik deze masterproef tot een goed einde brengen.
Mijn begeleidster drs. Kristen Chalmet zou ik willen bedanken voor de hulp met het fylogenetisch onderzoek en voor het nalezen en verbeteren van deze masterproef. Veel succes nog met je doctoraat!
Ik waardeer ook ten zeerste de assistentie van Els Demecheleer, Jacqueline Reynaerts, Delfien Staelens en Kenny Dauwe, die me wegwijs maakten in het labo en steeds bereid waren om hulp te bieden.
Als laatste wil ik ook mijn moeder en verloofde bedanken voor hun onvoorwaardelijke steun tijdens de voorbije maanden.
Lander Foquet, 21 mei 2010.
4
Inhoudsopgave Samenvatting ....................................................................................................................................1 Inleiding ............................................................................................................................................1 1.
De geschiedenis van HIV .......................................................................................................2
2.
De HIV pandemie ..................................................................................................................3
3.
Moleculaire virologie van HIV-1...........................................................................................3
4.
3.1.
Structuur en genoom .....................................................................................................3
3.2.
Replicatiecyclus..............................................................................................................4
3.3.
Genetische variabiliteit van HIV-1 ................................................................................6
3.4.
HIV-1 immunopathogenese ...........................................................................................7
3.5.
Antiretrovirale therapie.................................................................................................8
3.6.
Vaccin tegen HIV-1 ........................................................................................................9
HIV-1 tropisme ......................................................................................................................9 4.1.
Ontdekking ....................................................................................................................9
4.2.
Chemokine receptor antagonisten ............................................................................... 10
4.3.
Verandering in coreceptorgebruik .............................................................................. 10
4.4.
Tropismebepaling ........................................................................................................ 11
4.4.1.
Fenotypische test .................................................................................................. 11
4.4.2.
Genotypische test ................................................................................................. 12
Materialen en Methoden ................................................................................................................. 14 1. Selecteren van een goed gekarakteriseerde studiegroep van patiënten geïnfecteerd met verschillende non-B subtype HIV-1 ............................................................................................ 14 2.
RNA extractie ...................................................................................................................... 15 2.1.
Principe ........................................................................................................................ 15
2.2. Werkwijze ......................................................................................................................... 15 3.
4.
5.
Reverse transcriptie en eerste amplificatie ......................................................................... 16 3.1.
Principe ........................................................................................................................ 16
3.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 17
Tweede amplificatie ............................................................................................................. 17 4.1.
Principe ........................................................................................................................ 17
4.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 18
Submarine agarosegel elektroforese ................................................................................... 18 5.1.
Principe ........................................................................................................................ 18
5.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 19 5
Zuivering van de PCR producten ....................................................................................... 20
6.
6.1.
Principe ........................................................................................................................ 20
6.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 20
Sequentiereacties ................................................................................................................. 21
7.
7.1.
Principe ........................................................................................................................ 21
7.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 21
Zuivering sequentieproducten ............................................................................................ 21
8.
8.1.
Principe ........................................................................................................................ 21
8.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 22
Sequentieanalyse ................................................................................................................. 22
9.
9.1.
Principe ........................................................................................................................ 22
9.2.
Werkwijze .................................................................................................................... 23 Analyseren van de sequentieresultaten ........................................................................... 23
10.
10.1.
Principe .................................................................................................................... 23
10.2.
Werkwijze ................................................................................................................ 23
Genotypische methoden voor tropismebepaling ............................................................. 24
11.
11.1.
De 11/25 regel ........................................................................................................... 24
11.2.
Position-Specific Scoring Matrix ............................................................................. 24
11.3.
Geno2Pheno ............................................................................................................. 25
12.
Statistische analyse .......................................................................................................... 25
13.
Fylogenetische analyse ..................................................................................................... 25
Resultaten........................................................................................................................................ 26 1. Optimalisatie van de reactie voor amplificatie en sequentieanalyse van het enveloppe-gen van non-B subtypes ..................................................................................................................... 26 1.1.
Optimalisatie van de amplificatieprimers ................................................................... 26
1.2. Gevoeligheid van geoptimaliseerde primers (PR3) voor amplificatie van stalen met een lage virale lading ............................................................................................................... 29 1.3. 2.
Optimalisatie van de primers gebruikt voor sequentie analyse .................................. 29
Voorspellen van het coreceptorgebruik op basis van de V3 sequentie .............................. 32 2.1.
Uitbreiding aantal stalen ............................................................................................. 32
2.2.
Verdeling tropisme volgens Geno2Pheno.................................................................... 32
2.3.
Phylogenetische analyse van V3 en polymerase sequenties ........................................ 33
2.4.
Vergelijking tussen isolaten van subtype 01_AE, A, B en C ....................................... 34
2.4.1.
Vergelijking van de patiëntenkarakteristieken ................................................... 34
2.4.2.
Invloed van CD4 nadir ......................................................................................... 35 6
2.4.3.
Vergelijking van de False Positive Rate .............................................................. 36
2.4.4.
Vergelijking van tropisme in stalen gecollecteerd bij diagnose (baseline).......... 37
2.5. 3.
Vergelijking tussen drie modellen voor het voorspellen van het tropisme ................. 37
Genetische variabiliteit van de V3 regio ............................................................................. 39
Bespreking ...................................................................................................................................... 41 Besluit .............................................................................................................................................. 45 Referentielijst .................................................................................................................................. 46 Bijlage.............................................................................................................................................. 48
7
Samenvatting
Highly active antiretroviral therapy (HAART), waarbij men een combinatie van verschillende antiretrovirale medicijnen toedient, is in staat de progressie van een HIV-1 infectie naar het AIDS stadium sterk te vertragen. Door de combinatie van de hoge mutatieen replicatiesnelheid van HIV met de selectiedruk veroorzaakt door HAART kunnen nieuwe resistente virussen ontstaan waar de therapie geen effect meer op heeft. Er is bijgevolg een grote vraag naar nieuwe medicijnen die ook deze resistente virussen kunnen indijken. De CCR5 antagonist Maraviroc behoort tot een nieuwe klasse van medicijnen die een ander aangrijpingspunt hebben: het voorkomt het binnentreden van het virus in de gastheercel door de humane coreceptor, CCR5, te blokkeren. HIV-1 herkent zijn doelcellen via de CD4 receptor, en bindt vervolgens via de V3 lus van het enveloppe-eiwit met een chemokine coreceptor: CCR5 (voor R5 virussen) of CXCR4 (voor X4 virussen). Gebruik van de CXCR4 coreceptor is gecorreleerd met een snellere progressie naar AIDS. Aangezien CCR5 antagonisten enkel effectief zijn tegen R5 virussen, is het om een effectieve therapie mogelijk te maken noodzakelijk om het coreceptorgebruik van de viruspopulatie in een patiënt te bepalen. Om het coreceptorgebruik (tropisme) van HIV-1 te onderzoeken is momenteel enkel een fenotypische test klinisch gevalideerd. Hiernaast zijn er ook genotypische testen beschikbaar die op basis van de aminozuursamenstelling van de V3 regio het coreceptorgebruik
kunnen
voorspellen.
Deze
testen
zijn
echter
op
subtype
B
referentiesequenties gebaseerd. Het doel van deze studie was het optimaliseren van de primers gebruikt voor de amplificatie en sequentie analyse van de V3 lus van HIV bij non-B subtypes. Voor evalutatie van de geoptimaliseerde primersets werden at random stalen van verschillende subtypes en recombinante vormen geselecteerd. Met de geoptimaliseerde primersets kon 95 % van de geselecteerde stalen met een virale lading van 1000 RNA kopijen per mL plasma, met succes geamplificeerd en gesequeneerd worden. Voor het tweede deel van dit onderzoek werd het aantal stalen van 4 subtypes uitgebreid. Studie van de R5/X4 verdeling in deze subtypes toonden aan dat het percentage X4 stammen bij CRF 01_AE (76.9 %) significant hoger (p < 0.01) is dan bij de andere subtypes. Dit resultaat moet verder bevestigd worden met een fenotypische test en met grotere aantallen goed gekarakteriseerde stalen.
1
Inleiding
1.
De geschiedenis van HIV
Het Human Immunodeficiency Virus (HIV) behoort tot de lentivirinae, de “trage” virussen uit de retroviridae familie, wegens hun lange incubatieperiode. Zij veroorzaken chronische infecties in een grote reeks zoogdieren, waaronder de primaten (o.a. SIV), hoefdieren (o.a. BIV) en katachtigen (o.a. FIV). In 2008 beschreef Gifford et al. een endogeen lentivirus (pSIVgml) in het genoom van de grijze muislemur (Microcebus murinus) [1]. Dit virus heeft ongeveer 14 MA geleden de germline van deze primaat geïnfecteerd en is als een “genetisch fossiel” geconserveerd in het genoom van deze lemur. Fylogenetisch onderzoek wees uit dat pSIVgml een intermediaire vorm was tussen de primate en non-primate lentivirussen. Deze groep lentivirussen zijn samen met de primaten geëvolueerd en zijn veel ouder dan tot voor kort gedacht. Men heeft reeds vele Simian Immunodeficiency Virussen (SIV) geïdentificeerd bij de primaten. Door fylogenetische vergelijking tussen sequenties van SIV en HIV is gebleken dat de huidige pandemie van de M groep van HIV-1 ontstaan is uit SIVcpz [2]. Dit virus infecteert chimpansees (Pan troglodytes) in West-Centraal Afrika. Naast de pandemische M groep van HIV-1 zijn er nog cross-species transmissies geweest die geleid hebben tot de N, O en P groep en HIV-2 in West Afrika, wat sterk verwant is aan het lentivirus (SIVsm) dat de roetmangabey (Cercocebus atys) infecteert [3, 4]. Door moleculaire klok analyse van de oudst bekende HIV-1 stalen (Kinshasa, 1959) schat men dat de overdracht van chimpansee op mens, die geleid heeft tot de huidige pandemie, plaats vond aan het begin van de twintigste eeuw. Hierna heeft dit virus zich traag en onopgemerkt verspreid over de plaatselijke bevolking. De oudste stalen uit 1959 en 1960 wijzen al op een duidelijke onderverdeling in subtypes [5]. Tussen 1960 en 1970 verspreidde HIV-1 naar Haïti en de Verenigde Staten van Amerika. Vervolgens steeg het aantal infecties snel doordat HIV-1 terecht kwam in een homoseksuele groep met veel seksuele contacten. In 1981 werd de nieuwe ziekte voor het eerst opgemerkt: bij homofiele mannen zag men een verhoogd aantal opportunistische infecties (Pneumocystis jirovecii) en Karposi‟s Sarcoma (KS), die voordien maar zelden werden gezien [6]. Een jaar later begreep men dat een seksueel overdraagbaar pathogeen aan de basis van deze aandoening ligt, welke initieel de naam „Gay-Related Immune Deficiency‟ (GRID) kreeg [7]. Men zag evenwel snel in dat deze nieuwe ziekte niet beperkt bleef tot homoseksuele mannen, ook hemofilie patiënten, immigranten uit Haïti en intraveneuze drug gebruikers vielen ten prooi aan GRID. Het Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC) veranderde de naam 2
hierdoor in AIDS: Acquired Immune Deficiency Syndrome [8]. In 1983 werd het pathogeen dat AIDS veroorzaakt geïdentificeerd: het Human Immunodeficiency Virus [9].
2.
De HIV pandemie
Nu, 27 jaar later blijft het aantal infecties stijgen, met desastreuze gevolgen in sub-Sahara Afrika. Volgens cijfers van UNAIDS waren er in 2008 naar schatting 33.4 miljoen mensen besmet met HIV, waarvan 22.4 miljoen in sub-Sahara Afrika, wat neerkomt op 5.4 % van de bevolking. Twee miljoen mensen overleden dat jaar aan de gevolgen van AIDS, waarvan 1.4 miljoen in sub-Sahara Afrika. Er werden naar schatting 2.7 miljoen mensen besmet met HIV in 2008, waarvan opnieuw het merendeel, 1.9 miljoen personen, in sub-Sahara Afrika. De huidige medicatie is effectief om het AIDS stadium zo lang mogelijk uit te stellen. Er is echter nog geen middel voorhanden dat leidt tot genezing of bescherming. Het aantal infecties en het aantal doden zal dus blijven stijgen [10].
3.
Moleculaire virologie van HIV-1
3.1. Structuur en genoom
Figuur 1. De structuur van een HIV-1 virion. Overgenomen van: www. niaid.nih.gov.
Het HIV-1 virion heeft een sferische vorm met een diameter van 110 nm [11]. Het bevat een diploïde genoom dat bestaat uit twee identieke positieve enkelstrengige RNA moleculen van 9.2 kb, gebonden aan het nucleocapside (p6 en p7) en enzymen noodzakelijk voor de virale cyclus: reverse transcriptase, proteases, ribonuclease en integrase (figuur 1). Zo‟n 2000 capside proteïnen (p24) omgeven het genoom en vormen zo de kegelvormige kern [12]. Deze wordt omgeven door de matrix proteïnen (p17) welke op hun beurt grenzen aan de enveloppe 3
die bestaat uit een dubbele lipidelaag, afkomstig van het celmembraan van de gastheercel, met hierop glycoproteïnespikes. Deze spikes zijn gevormd door non-covalent gebonden trimeren van een oppervlakte component (gp120) en een transmembranair glycoproteïne (gp41) [11]. Het virale RNA bevat negen open reading frames (ORFs) (figuur 2). Drie hiervan coderen voor de drie grote polyproteïnen: Gag (group specific antigen), pol (polymerase) en env (enveloppe), die na translatie geproteolyseerd worden door het protease tot afzonderlijke proteïnen. Het gag gen codeert voor de precursor van structurele proteïnen van de kern (p6, p7, p17, p24), de pol regio codeert virale enzymen (protease, reverse transcriptase en integrase) en het env gen codeert de precursor gp160, welke na maturatie aanleiding geeft tot gp41 en gp120. Hiernaast codeert het HIV-1 genoom ook virale regulatoire en accessoire proteïnen (VRAPs): transactivators (tat en rev), vif, nef, vpr en vpu [12].
Figuur 2. Genomische structuur HIV-1. Overgenomen van www.hiv.lanl.gov.
Het virale genoom komt voor onder twee vormen: in het virus als (+)ssRNA met een lengte van 9.2 kb en geïntegreerd in het gastheergenoom als provirus DNA met een lengte van 9.7 kb. Figuur twee toont het provirale genoom: de long terminal repeats (LTRs) flankeren het virale genoom. Ze zijn noodzakelijk voor de reverse transcriptie, waarbij duplicatie van de U3 en U5 regio van LTR optreedt, en bevatten enkele belangrijke regulatoire sequenties, noodzakelijk voor transcriptie en polyadenylatie [13].
3.2. Replicatiecyclus Om een cel binnen te dringen moet HIV eerst via het extracellulaire deel van gp120 met CD4 interageren. Hierdoor vindt een confirmatieverandering plaats waardoor de V3 lus beschikbaar wordt om een coreceptor te binden op het plasmamembraan. Deze is voornamelijk CCR5 (bèta chemokine receptor) of CXCR4 (alfa chemokine receptor) en bepaalt het tropisme (R5 of X4) van het virus (maar ook andere coreceptoren zijn beschreven [14]). De hierop volgende confirmatieverandering van gp120 leidt tot de penetratie van gp41 in het plasmamembraan, gevolgd door de fusie van de virale dubbele lipidelaag met het 4
plasmamembraan van de cel (figuur 3). Nadat het capside in het cytoplasma vrijkomt vindt reverse transcriptie plaats en wordt lineair dsDNA gevormd. Dit migreert in associatie met virale proteïnes naar de kern waar het provirus via integrase integreert in het chromosomale DNA van de cel. In het tweede deel van de replicatie cyclus worden virale transcripten tot expressie gebracht vanaf een promotor in de LTR regio. Hierbij verhoogt Tat de frequentie van expressie van de virale proteïnen. Eerst worden voornamelijk VRAPs tot expressie gebracht. Eens deze voldoende aanwezig zijn start expressie van de structurele proteïnen en daarna van de enzymes. Het protease treedt op dat ogenblik nog niet in werking waardoor enkel precursor polyproteïnen gevormd worden. Na synthese in het endoplasmatisch reticulum wordt de precursor gp160 getransporteerd naar het plasmamembraan via het Golgi-apparaat, waar het glycosylatie ondergaat. Hier wordt het door een cellulair protease gesplitst in gp120 en gp41. Nadien clusteren de verschillende virale onderdelen samen onder het plasmamembraan waar een virion zich vormt. Nadat het vrijkomt ondergaat het nog een maturatiestap. Tijdens deze stap knipt het protease de gag en gag-pol polyproteïnen tot hun functionele vorm [11, 13, 15, 16].
Figuur 3. De replicatiecyclus van HIV-1. Overgenomen van: www. niaid.nih.gov.
5
3.3. Genetische variabiliteit van HIV-1 Een van de problemen om tot een doeltreffende therapie of vaccinatie te komen is de enorme genetische variabiliteit van HIV-1. Deze wordt veroorzaakt door de snelle replicatiecyclus, waardoor er 109 tot 1010 virions per dag worden aangemaakt, gekoppeld aan het ontbreken van proofreading bij het reverse transcriptase, met een mutatieratio van ongeveer 1 substitutie per replicatie cyclus (1 fout per 10000 nucleotiden) als gevolg. Het reverse transcriptase laat hiernaast ook recombinatie toe, waarbij grote delen genetisch materiaal verwisseld kunnen worden [13]. Dit gebeurt na een superinfectie (waarbij een cel door twee of meer virions geïnfecteerd wordt), waarna virions kunnen ontstaan met twee verschillende ssRNA kopijen. Als zo‟n virion een volgende cel infecteert kan een nieuwe variant ontstaan door recombinatie. HIV-1 verdeelt men in vier groepen op basis van sequentieanalyses: N, M, O en P groep. De N, of non-M groep: deze komt alleen voor in Kameroen. De O-groep (outlier) vindt men slechts zeer zelden terug bij patiënten buiten West-Afrika. De P groep werd slechts zeer recent bij een Kameroenese vrouw in Parijs ontdekt [4]. Groep M (main) is de meest voorkomende HIV-1 groep en verdeelt men verder in subtypes (A-D, F-H, J en K). De subtypes A en F worden onderverdeeld in zogenaamde sub-subtypes (A1-A4 en F1 en F2) [17]. Uit de subtypes zijn door recombinatie de circulating recombinant forms (CRFs) ontstaan (figuur 4). Om tot CRF geclassificeerd te worden moet deze sequentie bij minstens drie personen geïdentificeerd worden die epidemiologisch geen directe link hebben. De lijst bevat momenteel 45 CRFs en zal blijven aangroeien. De naamgeving bevat het voorvoegsel CRF, gevolgd door het nummer en de subtypes waaruit het bestaat (vb: CRF02_AG). Indien het gaat om een combinatie van drie of meer subtypes wordt het achtervoegsel cpx gebruikt (vb: CRF06_cpx, die bestaat uit subtypes A, G, J en K). Door het ontbreken van proofreading zijn de virussequenties binnen een patiënt sterk verschillend. Deze verschillende virussen noemt men quasispecies. Indien een superinfectie plaatsvindt kan dit bij een individu aanleiding geven tot unique recombinant forms (URFs). Onder therapiedruk kan dit resulteren in het doorgeven van resistentiegenen.
Figuur 4. De breekpunten van CRF06_cpx. Overgenomen van www.hiv.lanl.gov.
6
In het westen (Europa en Noord-Amerika) domineert subtype B, waardoor het meeste onderzoek naar medicatie en vaccins op dit subtype gebeurt. Echter, wereldwijd is subtype B slechts verantwoordelijk voor 10 % van de HIV-1 infecties. Als men de mondiale spreiding van HIV-1 bekijkt komt subtype C het meeste voor (50 %). Verder zijn subtypes A (12 %), G (6 %), CRF01_AE (5 %) en CRF02_AG (5 %) de dominante subtypes in de wereld. In subSahara Afrika vindt men de meeste diversiteit in HIV-1 terug, met voornamelijk in centraal Afrika (waar de oorsprong van HIV-1 ligt) een complexe spreiding van subtypes en CRFs zonder een dominante clade [17]. Dit is van belang aangezien 67 % van de seropositieven in dit werelddeel leven [10].
3.4. HIV-1 immunopathogenese
Figuur 5. Verloop van een niet-behandelde HIV-1 infectie. Figuur overgenomen van www.wikimedia.org.
Na infectie met HIV-1 volgt meestal een asymptomatische incubatieperiode, die twee tot vier weken duurt. Vervolgens is er een acute fase waarbij soms griepachtige symptomen optreden. Deze fase wordt voornamelijk gekenmerkt door zeer hoge concentraties virus in het bloed, tot > 107 HIV RNA kopijen per ml plasma (= virale lading), en een hoog aantal geïnfecteerde cellen. Deze cellen sterven door cytopathogenese van het virus en worden gedood door CD8+ T cellen, wat de daling in CD4+ T cellen verklaart. Hierna volgt een latente fase met een tijdelijk herstel van het aantal CD4+ T cellen. Het aantal CD4+ T cellen neemt echter geleidelijk aan terug af, terwijl de virale lading terug stijgt. Als het aantal CD4+ T cellen onder de grens van 200 cellen per mm3 zakt is het immuunsysteem niet meer in staat om een doeltreffend antwoord te bieden op opportunistische infecties en spreekt men van AIDS [15]. De tijd van infectie tot AIDS verschilt zeer sterk van individu tot individu. Bij zogenaamde rapid progressors is het AIDS stadium reeds bereikt binnen vier jaar na infectie (10-15 % van de patiënten). Aan de andere kant van het spectrum vindt men de long term non-progressors (LTNPs) (ongeveer 1 %). Deze patiënten tonen geen symptomen gedurende meer dan 12 jaar. 7
Zij verschillen echter van elite controlers doordat zij uiteindelijk wel het AIDS stadium bereiken. Elite controlers (ongeveer 1 per 3 LTNPs) zijn in staat om zonder therapie en gedurende zeer lange tijd de virale lading sterk te onderdrukken. Het merendeel van de geïnfecteerden bereikt het AIDS stadium echter na ongeveer acht tot tien jaar [18]. De genetica van de gastheer kan ook een effect hebben op het ziekteverloop. Personen die homozygoot zijn voor een 32 basenparen (bp) deletie in het CCR5 gen zijn beschermd tegen infectie met een R5 virus doordat de coreceptor voor deze virussen ontbreekt. Heterozygote patiënten zijn niet beschermd tegen infectie, maar het allel met de 32 bp deletie leidt ertoe dat minder replicatie mogelijk is en hierdoor de virale lading en mutatiesnelheid verlaagd is in vergelijking met patiënten met normale CCR5 allelen [19]. Het subtype waarmee de patiënt besmet is, heeft mogelijk ook een invloed op de progressie. Onderzoek in Oeganda en Kenia heeft uitgewezen dat personen geïnfecteerd met subtype D en CRFs sneller het AIDS stadium bereiken en sterven dan personen geïnfecteerd met subtype A [3].
3.5. Antiretrovirale therapie De therapie om de progressie naar het AIDS stadium af te remmen heeft de verschillende stappen van de replicatiecyclus van HIV-1 als aangrijpingspunt en omvat momenteel zes klassen met 25 geneesmiddelen. De fusie en entry inhibitoren (Enfuvirtide, 2003 en Maraviroc, 2007) verhinderen het virus om een cel binnen te dringen. De nucleoside en nucleotide analoge reverse transcriptase inhibitoren (NRTI) treden in competitie met de natuurlijke dNTPs en remmen de aanmaak van cDNA. Ze worden door het virale RT ingebouwd in de nieuwe provirale DNA streng, maar kunnen niet verlengd worden aan het 3‟ einde door het ontbreken van een 3'-hydroxyl groep. De niet nucleoside analoge reverse transcriptase inhibitoren (NNRTI) binden direct op het virale enzyme, waardoor de werking verstoord wordt. Integrase inhibitoren (Raltegravir, 2007) verstoren de werking van het integrase waardoor er geen provirus gevormd kan worden. De protease inhibitoren (PI) inhiberen het virale protease waardoor de polyproteïnen niet verknipt kunnen worden en geen infectieuze partikels ontstaan [20]. Zidovudine (AZT) kwam na slechts 25 maanden klinische testen in 1987 op de markt, maar er trad reeds snel resistentie op tegen het product [21]. Indien de replicatie niet volledig onderdrukt wordt, verwerft HIV snel resistentie tegen antiretrovirale middelen. Dit gaf in 1996 aanleiding tot highly active antiretroviral therapy (HAART) [22]. Deze bestaat meestal uit twee nucleoside analogen in combinatie met ofwel een PI of een NNRTI. Sindsdien is het 8
mogelijk om met HAART de virale lading onder de detectielimiet te brengen, mits een perfecte
opname
in
het
lichaam
(door
zowel
een
goede
farmacokinetiek
als
therapiegetrouwheid). Het aantal mutaties nodig om resistentie te verkrijgen bepaalt de resistentiedrempel. Door verschillende antiretrovirale middelen samen toe te dienen verhoogd men deze drempel aanzienlijk [20]. Resistentie blijft echter een probleem waardoor ontwikkeling van nieuwe medicatie noodzakelijk blijft.
3.6. Vaccin tegen HIV-1 Tot nu zijn er maar twee vaccins in fase twee studies beland. Het eerste trachtte humorale immuniteit op te wekken tegen het virale enveloppe, maar dit was weinig efficiënt. In de STEP trial poogde men een cytotoxische T cel respons op te wekken om de infectie onder controle te houden. Er werd hierbij noch een vermindering in aantal infecties, noch in virale lading gezien. Bovendien zag men een hoger aantal infecties bij personen met voorafgaande immuniteit tegen de gebruikte adenovirale vector. Aangezien de natuurlijk infectie met adenovirus type 5 via het mucosa gebeurt zullen de prolifererende memory T cellen na vaccinatie een homing signaal naar het mucosa krijgen. Hierdoor zijn er meer permissieve cellen aanwezig op de plaats van contact met het virus, wat kan leiden tot een verhoogd risico op infectie [23]. Dit resultaat leert ons om erg voorzichtig om te gaan met vaccins op basis van virale vectoren. Een doeltreffend vaccin zal waarschijnlijk nog een tijd op zich laten wachten.
4. HIV-1 tropisme 4.1. Ontdekking Op het einde van de jaren ‟80 ontdekte men dat isolaten van HIV-1 in vitro verschillen op basis van replicatieve en cytopathische kenmerken. Enerzijds zijn er de snel replicerende en syncitium-inducerende (SI) isolaten, anderzijds de traag replicerende en non-syncitiuminducerende (NSI) isolaten. De snel replicerende isolaten (maar niet de trage) kunnen een CD4+ tumor cellijn (bvb. MT-2 cellen) infecteren. Dit verschil in replicatieve en cytopathische eigenschappen correleert ook met de progressie naar het AIDS stadium: asymptomatische patiënten dragen meestal virussen met het NSI fenotype, terwijl virussen met het SI fenotype geïsoleerd worden bij AIDS patiënten en patiënten die nadien sneller achteruit gaan [14].
9
Nadat de coreceptoren CCR5 en CXCR4 gekarakteriseerd waren, kon men dit biologisch verschil hiermee correleren en werd de naamgeving veranderd van SI naar X4 (gebruiken CXCR4) en van NSI naar R5 (gebruiken CCR5).
4.2. Chemokine receptor antagonisten Een 32bp deletie in het CCR5 gen leidt tot een leesraamverschuiving waardoor een niet functioneel CCR5 proteïne ontstaat dat niet tot expressie komt op het celmembraan. Personen heterozygoot voor deze Δ32 deletie tonen na infectie met HIV-1 meestal een tragere ziekteprogressie. Homozygoten zijn resistent tegen infectie met R5 virussen, zelfs na herhaaldelijk contact [24]. Deze deletie heeft geen merkbare negatieve invloed op hun gezondheid, alhoewel infecties met West Nijl Virus significant vaker blijken voor te komen bij personen homozygoot voor de deletie [25]. Verschillende farmaceutische bedrijven zijn vervolgens een zoektocht gestart naar kleine moleculen die specifiek op CCR5 binden en zo de interactie met het virale enveloppe verhinderen, maar die geen ernstige bijwerkingen (immunologisch en metabolisch) vertonen. In 2007 bracht Pfizer met Maraviroc (Celsentri®) als eerste een CCR5 antagonist op de markt na positieve resultaten in fase III klinische trials [26]. Deze nieuwe klasse geneesmiddelen verschilt van de andere antiretrovirale middelen aangezien ze binden op een humane receptor en niet inwerken op de virale functies na infectie van een cel. De binding van Maraviroc op CCR5 verstoort de vorm van de tweede extracellulaire lus en verhindert binding met gp120 van HIV-1. Maar door veranderingen in de stam en tip van de V3 lus kan resistentie bekomen worden en kan CCR5 (waarop de coreceptorantagonist aanwezig is) alsnog gebonden worden. De resistentiedrempel is echter hoog en kruisresistentie tegen andere CCR5 antagonisten is nog niet beschreven. Anderzijds bestaat ook het gevaar dat het gebruik van een CCR5 antagonist kan leiden tot selectie van de meer pathogene X4 virussen [27].
4.3. Verandering in coreceptorgebruik Het coreceptorgebruik van HIV-1 verandert van CCR5, in het begin van de infectie, naar CXCR4, op het einde van de latente fase, bij ongeveer 50% van de met HIV geïnfecteerde personen. Door de gelijkaardige vorm van CCR5 en CXCR4 en de hoge mutatieratio in het HIV genoom kunnen er virussen ontstaan die niet enkel CCR5 (R5), maar ook of alleen CXCR4 kunnen binden, respectievelijk R5X4 en X4. Het is nog onbekend waarom deze verandering plaatsvindt. Doordat op de plaats van infectie na sexueel contact (mucosa) 10
voornamelijk CD4+ cellen voorkomen met CCR5 zou er selectie zijn van R5 virussen. Deze hypothese kan verklaren waarom men bij recente infecties zeer weinig X4 isolaten vindt. Omdat de verandering in coreceptorgebruik en hiermee ook de celaffiniteit (= tropisme) correleert met een snellere achteruitgang wil men vermijden dat het gebruik van CCR5 antagonisten bij patiënten met dualtrope virussen of een mix van R5 en X4 virussen (D/M) leidt tot selectie van virussen die CXCR4 als coreceptor gebruiken.
4.4. Tropismebepaling Om dit tropisme te bepalen zijn er twee mogelijkheden. Men kan in vitro virussen of virus like particles (VLP) cellijnen laten infecteren die CXCR4 of CCR5 op het plasmamembraan tot expressie brengen, waarna het fenotypische resultaat via merkers zichtbaar wordt. Anderzijds kan men in silico door middel van sequentie analyse het coreceptorgebruik bepalen via een genotypische methode.
4.4.1. Fenotypische test De oudste fenotypische testen maken gebruik van MT-2 cellen. Hierbij worden virussen geïsoleerd uit de perifere witte bloedcellen van de patiënt en op een geïmmortaliseerde cellijn (MT-2) gebracht. Deze cellen hebben enkel CXCR4 op het celmembraan en kunnen alleen door X4 of dualtrope virussen geïnfecteerd worden. Na infectie verandert de MT-2 cel van vorm en ontstaan reuzecellen (Syncytia). Dit cytopathisch effect, dat visueel kan worden waargenomen na een viertal weken, wordt gebruikt als criterium om infectie en dus de aanwezigheid van X4 virus aan te tonen [28]. Om het tropisme te bepalen is momenteel enkel de commerciële test Trofile Enhanced sensitivity Tropism Assay (Trofile ESTATM) van Monogram Biosciences (San Fransisco,VS) klinisch gevalideerd. Deze test wordt als de gouden standaard beschouwd en werd gebruikt voor de MOTIVATE trials voor de validatie van Maraviroc. Trofile ESTATM maakt gebruik van recombinante pseudovirussen waar een plasmide met het enveloppe-gen uit het toegeleverde staal aan toegevoegd wordt. De VLP‟s die zo ontstaan worden gebruikt om cellijnen die ofwel CXCR4, ofwel CCR5 tot expressie brengen te infecteren. Na replicatie komt een reporter gen tot expressie waardoor luciferase aangemaakt wordt en een visueel signaal de succesvolle transductie aantoont. De virale lading van het staal moet minimaal 1000 kopijen per mL bedragen. Doordat het plasma naar het centrale laboratorium in de VS verzonden moet worden en de test erg
11
arbeidsintensief is, bedraagt de turnover tijd drie tot zes weken. Dit maakt deze methode economisch en praktisch minder aantrekkelijk dan genotypische testen [26]. Verder is het natuurlijk niet zeker of deze resultaten in vitro ook steeds in vivo gelden, waar de CD4+ populatie bestaat uit cellen die verschillende chemokine receptoren dragen.
Figuur 6. Schema van Trofile ESTATM. Overgenomen van www.trofileassay.com.
4.4.2. Genotypische test Het HIV-1 enveloppe-gen bevat vijf sterk variabele regio‟s (V1-V5), gescheiden door meer geconserveerde regio‟s (C1-C5). V1, V2, V4 en V5 zijn gekenmerkt door grote verschillen in lengte en in glycosylatie sites tussen verschillende isolaten. Hierdoor schermen ze de meer geconserveerde bindende regio‟s af van het immuunsysteem [29]. De derde variabele regio van gp120 (V3) bestaat uit 35 aminozuren die een lusvormige secondaire structuur vormen met een disulfide brug aan de basis tussen twee cysteïneresidu‟s. De aminozuren aan de basis zijn sterk geconserveerd, deze van de tip, en voornamelijk de stam, minder. Aangezien de 12
aminozuursamenstelling van de V3 lus het coreceptorgebruik bepaalt, zijn er genotypische testen ontwikkeld waarmee getracht wordt het tropisme te voorspellen op basis van deze sequentie. De meest eenvoudige is de 11/25 regel, die stelt dat indien het aminozuur op positie 11 en/of 25 positief geladen is dit duidt op een CXCR4 gebruik. Bij Position-Specific Scoring Matrices en Geno2Pheno wordt een score berekend voor een sequentie. PSSM baseert zich hiervoor op similariteit met sequenties met gekend tropisme. Geno2Pheno werkt met een beslissingsboom, gegenereerd volgens de Support Vector Machine methode. Voor deze statistische leermethode werd gebruik gemaakt van een dataset bestaande uit V3 sequenties met gekend tropisme. Deze predictie algoritmen zijn beschikbaar op internet en zullen verder besproken worden in de materialen en methoden sectie.
13
Materialen en Methoden
1. Selecteren van een goed gekarakteriseerde studiegroep van patiënten geïnfecteerd met verschillende non-B subtype HIV-1 Na bloedafname bij HIV-geïnfecteerde patiënten in het AIDS Referentie Centrum (ARC, Universitair Ziekenhuis Gent) worden deze EDTA bloedstalen meteen doorgestuurd via buizenpost naar het AIDS Referentie Laboratorium (ARL, Universitair Ziekenhuis Gent) onder gecodeerde en geanonimiseerde vorm zodat de privacy van patiënten te allen tijde beschermd blijft. Na centrifugatie (3000 rpm, 10 min) van het bloed wordt plasma en buffy coat (witte bloedcellen en plaatjes) afgenomen en bewaard bij – 80 °C. Dit plasma wordt deels gebruikt voor het bepalen van de virale lading (concentratie HIV RNA kopijen per ml plasma) met behulp van de COBAS Amplicor HIV Monitor Test TM van Roche (Brussel, België). Verder worden het bewaarde plasma en buffy coat gebruikt voor genotypische testen om resistentiemutaties te bepalen/identificeren en voor onderzoeksdoeleinden. Uit de plasmatheek werden stalen geselecteerd voor het samenstellen van een subtype referentiepanel. Hiervoor werden vijf stalen gekozen van de in België meest voorkomende subtypes (B, 02_AG, 01_AE, C, A1), drie stalen van de minder frequent voorkomende subtypes (D, F1, G) en één staal van elk ander subtype dat in het Aids Referentiecentrum in Gent geregistreerd werd. Het subtype werd hierbij bepaald op basis van het reverse transcriptase en protease gen via het subtyperingssysteem van Smartgene‟s Integrated Database Network SystemTM (IDNS) (Zug, Zwitserland). Verder werden enkele stalen ingesloten waarvan het subtype niet bepaald kon worden omwille van sequentiefalen of een ambigu resultaat. De stalen voor het referentiepanel werden at random geselecteerd maar om voldoende testen mogelijk te maken werden enkel stalen weerhouden met een virale lading van minimaal 10000 RNA kopijen per ml waarvan nog minimum 0.6 mL plasma beschikbaar is. Na verdeling over aliquots van 200 µL werd de gehele verzameling referentiestalen verder bewaard bij - 80 °C.
14
2. RNA extractie 2.1. Principe Viraal RNA kan gezuiverd worden uit verschillende lichaamsvochten (plasma, saliva, urine, etc.). In dit onderzoek vertrekken we van plasma. Met de High Pure Viral RNA kit TM van Roche Applied Science (Brussel, België) worden de viruspartikels eerst gelyseerd door een detergens, waarna het virale RNA vrij in oplossing komt. In de bindingsbuffer zit verder Guanidine-HCl (chaotroop zout) die binding van het RNA op het glasvezelmembraan van een High Pure Spin Filter Tube toelaat. Hierna wordt dit gebonden RNA met wasbuffer en inhibitor removal buffer gewassen zodat alle contaminerende substanties (zouten, proteïnes en andere cellulaire contaminanten) verwijderd worden van het membraan. De inhibitor removal buffer verhoogt de sensitiviteit en reproduceerbaarheid van de RT-PCR die hierna volgt. Als laatste stap wordt het RNA terug vrijgemaakt van het membraan met elutiebuffer waarna het in oplossing blijft bij een lage zoutconcentratie. RNA is een zeer labiele molecule en de bekomen oplossing van gezuiverd viraal RNA wordt dan ook direct gebruikt voor omzetting in cDNA of wordt onmiddellijk ingevroren bij - 80 °C.
2.2. Werkwijze Bij het eerste gebruik van de kit: - 40 mL 95-100 % ethanol toevoegen aan 10 mL wasbuffer (flacon met blauwe dop). Merken met datum. Verder bewaren op kamertemperatuur. - 20 mL 95-100 % ethanol toevoegen aan de Inhibitor Removal Buffer (zwarte dop). Merken met datum. Verder bewaren op kamertemperatuur. - Poly A carier RNA (flacon 2) oplossen in 400 µL elutiebuffer, en verdelen in aliquots van 40 µL. Bewaren bij – 20 °C. Voor de werkoplossing 1 aliquot ontdooien en mengen met 5 mL bindingsbuffer. Behandeling van het plasma: - Voor stalen met een VL <10000 c/mL: breng 500 µL plasma over in een 1.5 mL Sarstedt buisje met schroefkap en gemerkt met het staalnummer. - Centrifugeer bij 4 °C aan 17000 rpm gedurende 60‟. - Verwijder het supernatant met een pasteur-pipet. - Resuspendeer de pellet in 200 µL Phosphate Buffered Saline (PBS). - Voor stalen met een VL > 10000 c/ml start men met 200 µL plasma. - Voer de RNA extractie uit zoals verder beschreven. 15
Zuivering: - Voeg 400 µL werkoplossing (40 µL PolyA in 5 mL binding buffer) toe aan de virusoplossing en vortex. Incubeer 10‟ op kamertemperatuur. - Merk een kolom met glasvezelmembraan met het extractienummer en plaats ze in een 2 mL collectiebuis. - Breng het mengsel van virus en buffer in de kolom. - Centrifugeer aan 10000 rpm gedurende 15” in centrifuge (Biofuge pico). - Verwijder de collectiebuis en plaats de kolom in een nieuwe collectiebuis. Breng 500 µL inhibitor removal buffer (flacon met zwarte dop) in de kolom en centrifugeer aan 8000 rpm gedurende 1‟. - Verwijder de collectiebuis en plaats de kolom in een nieuwe collectiebuis. Breng 450 µL wasbuffer (flacon met blauwe dop) in de kolom en centrifugeer aan 8000 rpm gedurende 1‟. - Herhaal de vorige stap. Centrifugeer aan 8000 rpm gedurende 1‟ en drijf daarna de snelheid op tot 13000 rpm gedurende 10”. - Verwijder de collectiebuis. en plaats de kolom in een steriel, gemerkt (met: dossiernummer, datum van staalname, HP), 1.5 mL buisje met afgeknipt deksel - Breng 50 µL elutiebuffer (flacon kleurloze dop) voorzichtig in het midden van de kolom. Centrifugeer gedurende 1‟ aan 10000 rpm. - Sluit de buis met de RNA oplossing en gebruik onmiddellijk of bewaar bij - 80 °C.
3. Reverse transcriptie en eerste amplificatie 3.1. Principe Voor de omzetting van het gezuiverde RNA in cDNA en de daaropvolgende eerste amplificatie van het enveloppe-gen wordt gebruik gemaakt van de Titan One Tube RT-PCR kitTM van Roche (Brussel, België). Het reactiemengsel van de kit bestaat uit 5x RT-PCR reactiebuffer (bevat MgCl2 en zorgt voor een optimale pH), 100 mM dithiothreitoloplossing (verlaging oppervlaktespanning), RNAsin (inhibitie afbraak RNA) afkomstig van Promega (Leiden, Nederland) en een enzymenmengsel bestaande uit AMV reverse transcriptase (voor de omzetting van RNA in DNA), Taq DNA polymerase en Pwo DNA polymerase (voor de amplificatie van het DNA met hoge specificiteit door proofreading). De polymerase chain reactie (PCR) wordt uitgevoerd op de GeneAmp PCR System 9700TM (PE9700) thermal cycler van Applied Biosystems (Nieuwerkerk aan de Ijssel, Nederland). Eerst vindt reverse transcriptie plaats waarbij het gezuiverde virale RNA omgezet wordt in cDNA door AMV (recombinant Avian Myeloblastosis Virus) reverse transcriptase. Dit vindt 16
plaats bij 45 °C en eindigt met inactivatie van het reverse transcriptase door verhoging van de temperatuur tot 94 °C. Dit wordt gevolgd door amplificatie van het cDNA tijdens 35 cycli bestaande uit drie stappen. Tijdens de denaturatie stap bij 94 °C worden de twee ketens gescheiden. Bij een temperatuur van 45 °C, 50 °C of 55 °C worden de sense en antisense primers specifiek gebonden (annealing stap). Tijdens de elongatiestap verlengt het polymerase (afkomstig van Thermus aquaticus en Pyrococcus woesei) de primer in 3‟ richting van het template bij een optimale temperatuur van 68 °C. Vervolgens wordt een nieuwe cyclus gestart door opnieuw de temperatuur op te drijven tot 94 °C. De laatste elongatiestap duurt langer zodat al het resterende enkelstrengige DNA volledig verlengd wordt.
3.2. Werkwijze - Maak een reactiemix met volgende samenstelling per reactie: 1.5 µL ultrapuur water; 5 µL RT Buffer; 0.2 µL dNTP‟s (25 mM); 1.25 µL DTT oplossing; 0.25 µL RNAsin; 3.2 µL sense primer (5 pmol/µL); 3.2 µL antisense primer (5pmol/µL); 0.5 µL enzymenmix. - Breng per reactie 15 µL reactiemix en 10 µL gezuiverd RNA oplossing in een PCR epje. - Gebruik ultrapuur water als negatieve controle. - Plaats de epjes in de thermal cycler P9700 en start programma Titan 2: 30‟ aan 45 °C, 2‟ aan 94 °C; 10 cycli: 30” aan 94 °C, 30” aan 45 °C, 1‟ aan 68 °C; 10 cycli: 30” aan 94 °C, 30” aan 50 °C, 2‟ aan 68 °C; 15 cycli: 30” aan 94 °C, 30” aan 55 °C, 3‟ aan 68 °C; 7‟ aan 68 °C en afkoelen tot 8 °C.
4. Tweede amplificatie 4.1. Principe Om de hoeveelheid geamplificeerd product te verhogen wordt na de eerste amplificatie een nested PCR uitgevoerd. Hierbij wordt een deel van het reactieproduct opnieuw geamplificeerd met primers die intern liggen ten opzichte van de primers gebruikt voor de eerste amplificatie. Dit verhoogt de sensitiviteit en specificiteit van de amplificatie van het enveloppe-gen. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van de AmpliTaq kitTM van Applied Biosystems (Nieuwerkerk aan de Ijssel, Nederland). Deze bestaat uit 10x PCR buffer (om optimale condities voor de werking van het polymerase te verkrijgen), MgCl2 (vormt een complex met het enkelstrengige DNA) en AmpliTaq DNA polymerase (gezuiverd recombinant polymerase afkomstig van Thermus aquaticus).
17
4.2. Werkwijze - Maak een reactiemix met volgende samenstelling per reactie: 28 µL ultrapuur water; 5 µL 10x PCR buffer; 4 µL MgCl2 oplossing; 8µL dNTPs (1.25 mM); 1.5 µL sense primer (5 pmol/µL); 1.5 µL antisense primer (5pmol/µL); 0.25 µL AmpliTaq DNA polymerase. - Breng per reactie 48 µL reactiemix en 2 µL PCR product van de eerste amplificatie in een PCR epje onder de Captair Biocap DNATM van Erlab (Rowley, VS). - Plaats de epjes in de thermal cycler P9700 en start programma 10XL: 5‟ aan 94 °C; 30 cycli: 30” aan 94 °C, 30” aan 50 °C, 2‟ aan 72 °C; 7‟ aan 72 °C; afkoelen tot 8 °C. - Vervolgens wordt het product bewaard bij 4 °C.
5. Submarine agarosegel elektroforese 5.1. Principe Gel elektroforese is de standaardmethode voor het scheiden van DNA strengen op basis van hun lengte. Hier wordt deze methode toegepast voor het controleren van de PCR. Aangezien de grootte van het geamplificeerde fragment 1106 basenparen (bp) bedraagt, wordt gebruik gemaakt van 2 % agarosegel, welke een scheidend vermogen heeft van 200 tot 1000 bp. De gel wordt gemaakt door agarose MP (Roche, Brussel, België) op te lossen in 0.5 % Tris, Acetyl, EDTA (TAE) buffer (Invitrogen, Merelbeke, Belgie) en aan de kook te brengen, vervolgens wordt ethidiumbromide (EtBr) toegevoegd (10 mg/ml). EtBr heeft de eigenschap om tussen de basenparen in de dubbele helix te intercaleren waarna het fluorescent oplicht na activatie met UV licht. Deze eigenschap maakt van EtBr echter ook een mutagen waardoor men zeer voorzichtig moet omspringen met deze stof. Van het PCR product wordt 10 µL vermengd met 5 µL sample buffer (een oplossing van 25 mg bromofenolblauw (Sigma-Aldrich, Bornem, België), 5 mL glycerol en 5 mL ultrapuur water), waarvan 10 µL op de gel wordt geladen. De samplebuffer zorgt enerzijds dat er visueel een onderscheid is tussen een geladen en niet geladen laantje en anderzijds dat deze mix in het laantje blijft doordat glycerol zwaarder is dan de TAE buffer waarin de gel ligt. In het eerste en laatste laantje wordt een moleculaire gewichtsmerker (GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder, MBI Fermentas, Sankt Leon-Rot, Duitsland) geladen om de lengte van de band te kunnen bepalen.
18
5.2. Werkwijze Oplossen van de agarose en gieten van de gel - Giet 150 mL 0.5% TAE buffer in een beker. - Weeg 3 g agarose af. - Strooi de agarose al roerend bij de TAE buffer in de beker. - Verwarm het mengsel in de microgolf-oven tot het kookt. - Laat het mengsel al roerend afkoelen tot ± 57 °C. - Zet ondertussen de drager voor de gel klaar. - Verwijder de roerstaaf uit de agarose-oplossing en voeg 2 µL EtBr (10 mg/mL) toe. Meng goed en giet de oplossing in de geldrager. Breng de geschikte kammen in en laat de gel afkoelen. - Verwijder voorzichtig de kammen uit de gel door ze recht naar boven te trekken. - Verpak de gel in plastiekfolie en noteer op deze folie de datum van aanmaak en de vervaldatum (2 maanden na aanmaak). Stockeer bij 4 °C.
Electroforese - Haal de gel uit de koelkast en snij er een stuk uit dat voldoende groot is om het gewenst aantal stalen te laden. Stop de restende gel terug in de koelkast. - Plaats het stuk gel in het submarine toestel en vul het bufferreservoir met 0.5X TAE buffer tot enkele mm boven de gel. Duw eventuele luchtbellen uit de uitsparingen in de gel. - Meng 10 µL van het PCR product met 5 µL sample buffer en breng 10 µL van de oplossing in een uitsparing in de gel. - Breng in de eerste uitsparing en in de uitsparing onmiddellijk na het laatste staal, 8 µL van de moleculaire gewichtmerker. - Schakel de stroombron die met het submarine toestel is verbonden aan. Laat de PCR producten gedurende 30‟ in de gel migreren bij een spanning van 100 V.
Nemen van foto - Neem de gel uit de elektroforese tank en leg hem op de transilluminator van de UV lamp (Applitek, Deinze, België). - Bekijk de gel rechtstreeks op de transilluminator, gebruik hiervoor een scherm. - Plaats de OptidocTM camera (Isogen Life Science, Sint-Pieters-Leeuw, België). - Zet de transilluminator aan. - Start de software Optidoc AQ, maak een foto en sla deze op. 19
6. Zuivering van de PCR producten 6.1. Principe Na geslaagde amplificatie worden de PCR producten gezuiverd om interfererende contaminanten (enzymen, nucleotiden, primers en zouten) te verwijderen voordat met de sequentiereacties kan gestart worden. Voor zuivering wordt gebruik gemaakt van de QIAquick PCR Purification kit TM van QIAgen (Venlo, Nederland). Hierbij wordt gebruik gemaakt van de capaciteit van DNA om te binden op een silica-gel membraan bij een correcte zoutconcentratie en een pH van ≤ 7.5. Bindingsbuffer met hoge zoutconcentratie wordt toegevoegd aan het PCR product waarna het in de spin-kolom wordt gebracht. Het DNA (100 tot 10000 bp) zal binden op het membraan, terwijl nucleotiden en korte fragmenten (primers) een nog hogere concentratie chaotropische zouten nodig hebben om te binden. Deze contaminanten worden vervolgens weggewassen met wasbuffer, waarna het gezuiverde DNA wordt geëlueerd met elutiebuffer (lage zoutconcentratie) en bewaard bij - 20 °C.
6.2. Werkwijze - Breng het volledige PCR product over in een gemerkte 1.5 mL reactiebuis. - Voeg 200 µL bindingsbuffer (PB) toe en meng goed door vortexen. - Plaats een QIAampTM kolom in een 2 mL collectiebuis. - Breng het mengsel van PCR product en bindingsbuffer in de kolom. - Centrifugeer (Biofuge pico) aan maximale snelheid (13300 rpm) gedurende 1‟. - Verwijder de doorgelopen vloeistof en plaats de kolom terug in dezelfde collectiebuis. - Breng 750 µL wasbuffer (PE) in de kolom en centrifugeer aan maximale snelheid (13300 rpm) gedurende 1‟. - Verwijder de doorgelopen vloeistof, plaats de kolom terug in de collectiebuis en centrifugeer opnieuw (maximale snelheid, 1‟). - Droog de buitenkant van de kolom met een zakdoekje en breng de kolom over naar een steriel 1.5 mL buisje. - Breng 50 µL elutiebuffer (EB) voorzichtig in het midden van de membraan. - Incubeer 1‟ op kamertemperatuur en centrifugeer daarna op maximale snelheid (13300 rpm) gedurende 2‟. - Verwijder de kolom, sluit het buisje met het gezuiverde materiaal en bewaar bij - 20 °C of voer onmiddellijk de sequentiereactie uit.
20
7. Sequentiereacties 7.1. Principe Voor sequenering via de Sanger methode dient het gezuiverde PCR product opnieuw geamplificeerd te worden met enkel een forward primer en in aanwezigheid van fluorescentgemerkte ketenterminators (2´,3´-dideoxyribonucleoside trifosfaten, ddNTPs). De BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitTM van Applied Biosystems (Nieuwerkerk aan de Ijssel, Nederland) wordt hierbij gebruikt. Deze bestaat uit een 5x sequencing buffer (optimale pH en zoutconcentratie) en een reactiemix die samengesteld is uit nucleotiden voor de elongatie, fluorescente eindnucleotiden en AmplitaqTM DNA polymerase FS. Het resultaat van de reactie is een mix van oligonucleotiden met verschillende lengten, waarbij elk product eindigt met een fluorescent ddNTP.
7.2. Werkwijze - Maak een primerreactiemix met volgende samenstelling per primer gebruikt per reactie: 3.25 µL ultrapuur water; 1.75 µL 5x sequencing buffer uit kit; 0.5 µL reactiemix uit kit; 2.5 µL primer (2 pmol/µL). - Breng per primerreactie 8 µL primerreactiemix en 2 µL gezuiverd PCR product in een PCR epje. - Plaats de epjes in de thermal cycler P9700 en start programma cycle sequencing ENV: 30 cycli: 10” aan 96 °C, 5” aan 50 °C, 4‟ aan 60 °C; afkoelen tot 8 °C.
8.
Zuivering sequentieproducten
8.1. Principe Om interferentie bij de sequentie analyse op de ABI3130XLTM te vermijden moeten alle niet ingebouwde fluorescent-gemerkte ddNTPs verwijderd worden. Dit gebeurt met de Agencourt CleanSEQ kit TM van Beckman Coulter (Massachusetts, VS). Dit is een SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) systeem, dat gebaseerd is op een zuivering via paramagnetische beads. In drie opeenvolgende stappen wordt het staal gezuiverd van contaminanten. Eerst wordt het staal opgelost in 85 % ethanol en gemengd met de paramagnetische beads. Hierdoor wordt het DNA gebonden op de beads en blijven de ddNTPs in oplossing. Door de beads met een magnetisch veld te isoleren kunnen de contaminanten in oplossing verwijderd worden. Vervolgens volgt nog een wasstap met ethanol en wordt het DNA terug vrijgemaakt van de beads door elutie met ultrapuur water. Als het DNA terug in oplossing is wordt dit gescheiden van de beads door deze opnieuw te isoleren onder invloed van een magnetisch veld. 21
8.2. Werkwijze Vooraf: - Maak een verse oplossing van 85 % ethanol op basis van 100 % ethanol en ultrapuur water. De eindconcentratie van ethanol is immers zeer kritiek: te lage concentraties leiden tot verlies van het product, bij te hoge concentraties blijven overtollige ddNTPs aanwezig. Daarom moet ook bij elke uitvoering een verse oplossing van 85 % ethanol aangemaakt worden. - Vortex de CleanSEQTM oplossing goed om alle magnetische beads in oplossing te brengen. - Merk 4 Multi-channel reservoirs met: Beads, Ethanol, Water en afval en breng de vloeistoffen in de reservoirs.
Zuivering: - Breng de stalen van de cycle sequencing PCR over in de microtiterplaat. - Voeg 10 μL CleanSeqTM oplossing toe. - Voeg 42 μL van de 85 % ethanol oplossing toe en meng door op en neer te pipetteren. - Laat de oplossing 1‟ incuberen. - Plaats de plaat op de magneet en wacht 5‟. - Neem alle vloeistof af (breng de tips hierbij loodrecht in de well en zuig langzaam op). - Voeg 100 μL 85 % ethanol toe (eerste wasstap). - Laat 30” staan. - Neem alle vloeistof af (breng de tips hierbij loodrecht in de well en zuig langzaam op). - Herneem de wasstap. Let er op dat de laatste maal alle vloeistof wordt afgezogen. - Plaats de plaat naast de magneet en laat de stalen uitdrogen aan de lucht gedurende 5‟. - Voeg 80 μL ultrapuur water toe aan de beads en meng door op en neer te pipetteren. - Laat de oplossing 1‟ staan. - Plaats de plaat op de magneet en wacht 5‟. - Breng 70 μL van de oplossing over naar een sequencing plaat. - Indien een staal niet volledig helder is, breng dan het staal in een lege positie op de plaat op de magneet en breng na 3‟ terug over naar de sequencing plaat.
9. Sequentieanalyse 9.1. Principe De gezuiverde sequentieproducten worden eerst gescheiden volgens grootte op het capillaire gelelektroforese toestel ABI3130XL Genetic AnalyzerTM van Applied Biosystems (Nieuwerkerk aan de Ijssel, Nederland). Het systeem is uitgerust met een Argon laser die 22
toelaat verschillende fluorescente kleuren tegelijkertijd te lezen en zo de fluorescent gemerkte ddNTPs te detecteren. De ABI3130XLTM scheidt DNA fragmenten volgens grootte doorheen 16 capillairen die gevuld worden met een polymeer. Het vullen van de capillairen, het injecteren van de preparaten en het lezen van de resultaten gebeuren volledig automatisch.
9.2. Werkwijze Na elutie zijn de gezuiverde sequentieproducten in oplossing in ultrapuur water. Aangezien gewerkt wordt met een 16 capillairtoestel moet steeds in veelvoud van 16 gewerkt worden (runs). Indien geen veelvoud van 16 bekomen wordt moeten de lege posities gevuld worden met ultrapuur water. Vervolgens wordt de sequencing plaat afgesloten met een septum en in de ABI3130XLTM geladen.
10. Analyseren van de sequentieresultaten 10.1. Principe Smartgene‟s Integrated Database Network SystemTM (IDNS) (Zug, Zwitserland) is een softwarepakket dat toelaat om contig-files te maken van de voor het reverse transcriptase, protease, gp41, gp120, Gag en Nef gen bekomen sequenties. Hiermee wordt het subtype bepaalt op basis van het RT en PR gen. Verder laat het toe om de chromatogrammen van de bekomen sequenties te bekijken, te vergelijken en waar nodig aan te passen (proofreading).
10.2. Werkwijze In het softwarepakket wordt per staal een nieuw document toegevoegd met de relevante informatie. Bij het onderdeel gp120 worden vervolgens de ABI-chromatogrammen van de primerspecifieke sequenties ingeladen en manueel overlopen en gecorrigeerd. Indien een sequentie onduidelijk is, kan deze volledig of deels verwijderd worden. Een positie met overlappende pieken duidt op een mix van virusvarianten (quasispecies) en wordt door de software automatisch omgezet in de gedegenereerde code. Aangezien dit soms ook kan gebeuren als de sequenties onduidelijk zijn en veel ruis bevatten moet manueel een beslissing worden genomen of deze degeneratie behouden blijft. Vervolgens wordt de sequentie opgeslagen in de IDNS webapplicatie en gekopieerd naar een Fasta alignment bestand voor verdere manipulaties in Bioedit en Jalview [30, 31].
23
11. Genotypische methoden voor tropismebepaling 11.1. De 11/25 regel De 11/25 regel bepaalt dat indien het aminozuur op positie 11 en/of 25 positief geladen is (arginine, histidine of lysine), het virus CXCR4 als coreceptor zal gebruiken. Een negatieve of neutrale lading op deze positie duidt op CCR5 gebruik. Dit is echter een zeer vereenvoudigde regel met een lage sensitiviteit en specificiteit aangezien reeds andere posities beschreven zijn die ook een invloed hebben op het coreceptorgebruik. Bijgevolg is het aangewezen om voor predictie de volledige genetische informatie van de V3 lus te gebruiken [32].
11.2. Position-Specific Scoring Matrix Position-specific scoring matrices worden gebruikt om een uitgebreide analyse te maken van de positie en het voorkomen van alle aminozuren in de V3 regio. Voor elk aminozuur op de 35 posities van V3 wordt door vergelijking met sequenties met gekend fenotype een score berekend die afhangt van die positie, maar onafhankelijk is van de aminozuren die dit residu flankeren. De totaalscore van de ingegeven V3 sequentie zal hoog zijn indien de sequentie meer gelijkenissen heeft met een gekende sequentie afkomstig van een X4 virus en negatief indien het overeenkomsten toont met een R5 virus. Een gemiddelde score duidt op een R5X4 virus. De resultaten bekomen met PSSM houden voornamelijk rekening met de lading van een aminozuur en zijn positie binnen V3 [33]. Op internet zijn twee programma‟s beschikbaar die hiervan gebruik maken: Web PSSM en Fortinbras PSSM. Web PSSM kan enkel overweg met V3 aminozuursequenties zonder degeneraties in de cDNA sequentie (geeft als codon translatie“X”) en zonder stopcodons (afgekort als “*”). Om de gedegenereerde sequenties om te zetten in alle mogelijke aminozuursequenties werd gebruik gemaakt van een Perl script (geschreven door Will Fischer van Het Los Alamos National Laboratory, VS). Er zijn voor subtype B twee matrices beschikbaar: R5X4 en SINSI. Voor subtype C is een SINSI matrix beschikbaar [34]. Voor andere subtypes is geen matrix beschikbaar dus zijn de bekomen scores niet gebaseerd op subtypespecifieke
sequenties
en mag
geen rekening
gehouden
worden met
de
tropismevoorspelling. Fortinbras PSSM is gebaseerd op Web PSSM en voegt er enkele functies aan toe. Zo kunnen nucleotidesequenties met gedegenereerde nucleotiden ook ingevoerd worden en kan gekozen worden om de gemiddelde score of de scores van alle mogelijke combinaties te verkrijgen als output. Voor subtype B kan bovenop de twee matrices van Web PSSM de nieuwe afkapwaarden van Poveda, et al. [35] gebruikt worden.
24
11.3. Geno2Pheno Geno2Pheno werkt volgens de support vector machine (SVM) statistische leermethode en werd ontwikkeld in het kader van het Duitse Arevir project. Hiermee worden de sequenties geclassificeerd als R5 of X4 (en R5X4), door een vergelijking te maken met reeds gekende sequenties (subtype B) volgens een automatische classificatiemethode. Deze methode rangschikt volgens twee klassen, het coreceptorgebruik bestaat echter uit drie klassen: R5, X4 en R5X4. Als oplossing worden X4 en R5X4 virussen als één klasse beschouwd, omdat het voornamelijk van belang is de mogelijkheid om CXCR4 te gebruiken aan te tonen. Op de website geeft men een nucleotidesequentie in die de coderende regio voor V3 bevat. Vervolgens kan men een afkapwaarde kiezen. De False Positive Rate (FPR) die als score bekomen wordt, staat voor de kans dat een R5 sequentie foutief als X4 beschouwd wordt. Bijgevolg zal een pure X4 sequentie een zeer lage score genereren en een R5 een zeer hoge score [36]. Harrigan, et al. gebruiken een afkapwaarde van 5.75 %, maar de gebruiker kan zelf grotere marges kiezen [37]. In deze thesis werd een afkapwaarde van 10 % gekozen, aangezien hierbij de kans dat een R5 sequentie als X4 beschouwd wordt niet te conservatief is, maar anderzijds ook de kans op vals negatieve resultaten niet te hoog wordt. Als resultaat krijgt men de V3 sequentie in aminozuren en nucleotiden gealigneerd tegen de HXB2 referentiestam, de FPR, de tropismevoorspelling en het resultaat volgens de 11/25 regel. Deze worden per sequentie bewaard in een spreadsheet.
12. Statistische analyse Aanmaak van figuren en statistische berekeningen (p < 0.05) werden uitgevoerd in Medcalc software (Mariakerke, België) [38]. Voor kwantitatieve variabelen werd de Kruskal-Wallis test gebruikt. Deze test de hypothese dat een reeks ongepaarde variabelen afkomstig zijn van dezelfde populatie. Voor categorische variabelen werd gebruik gemaakt van Fisher‟s exact test. De nulhypothese gaat er van uit dat de gegevens in een 2x2 tabel niet verbonden zijn.
13. Fylogenetische analyse De fylogenetische bomen werden aangemaakt met de webapplicatie PhyML [39]. Deze werkt op basis van Maximum Likelihood optimalisatie. Als substitutiemodel werd gekozen voor GTR en werden de overige parameters geschat door de applicatie. Voor verbetering van de topologie werd gekozen voor NNI (Nearest Neighbor Interchange) en SPR (Subtree Pruning and Regrafting). Indien bootstrapping onmogelijk was werd met behulp van de approximate Likelihood-Ratio Test de robuustheid van de topologie nagegaan. 25
Resultaten
1. Optimalisatie van de reactie voor amplificatie en sequentieanalyse van het enveloppegen van non-B subtypes 1.1. Optimalisatie van de amplificatieprimers De sequenties van reeds beschikbare primers voor de amplificatie van het enveloppe-gen zijn gebaseerd op de subtype B referentiesequentie HXB2. Door de hoge variabiliteit in het Env gen kan de amplificatie falen door het niet volledig complementair zijn van de primers met de genetisch sterk verschillende subtypes. Om de beschikbare primers voor nested PCR (tabel 1: ENV1, 7294, ENV2, 7238; verder aangeduid als standaard primers (PR1)) aan te passen, werden uit de HIV sequentie databank van Los Alamos (www.hiv.lanl.gov) referentiesequenties van alle gekende subtypes en Circulating Recombinant Forms (CRF‟s) geselecteerd (figuur 7). Vervolgens werd getracht om de primersequenties zodanig aan te passen dat complementariteit met zoveel mogelijk verschillende subtypes wordt bekomen (tabel 1). Indien twee of meer nucleotiden op dezelfde positie kunnen voorkomen, werden de verschillende mogelijke nucleotiden ingebouwd of werd voor een inosine geopteerd (gedegenereerde primers). De aangepaste primers (verder aangeduid als PR2) werden besteld bij Invitrogen (Merelbeke, België). Tabel 1. Primers gebruikt voor de amplificatie van het enveloppe-gen. Eerst wordt de standaardprimer (PR1) vermeld, vervolgens de aangepaste primer (PR2) en tot slot de geoptimaliseerde primer (PR3).
Primers voor eerste amplificatie en nested PCR Locatie vanaf het begin van het HXB2 genoom: ENV_11: 6540 → 6560 (rode balk op figuur)
ENV_22: 7701 → 7721 (groene balk op figuur)
ENV_33: 6561 → 6580 (cyane balk op figuur)
ENV_44: 7645 → 7667 (blauwe balk op figuur)
26
Om de performantie van de primersets PR1 en PR2 (tabel 1) te vergelijken werden ze beide gebruikt voor amplificatie van het enveloppe-gen van stalen uit het subtype referentie panel (SRP). Het SRP bestaat uit 60 at random geselecteerde stalen van 15 verschillende subtypes en CRF‟s: 01_AE (11.7 %); 02_AG (8.3 %); 05_DF (1.7 %); 06_cpx (5 %); 12_BF (3.3 %); 36_cpx (1.7 %); CRF22_01A1 (3.3 %); A1 (8.3 %); A2 (1.7 %); B (10 %); C (8.3 %); D (5 %); F1 (8.3 %); G (5 %); H (1.7 %); en stalen waarvan de pol sequentie niet geanalyseerd kon worden en daardoor niet typeerbaar waren (16.8 %). Alle negatieve amplificatiereacties werden herhaald om toevallige fouten uit te sluiten (tabel 2). Amplificatie met PR2 leidde tot meer succesvolle reacties dan amplificatie met PR1. Bij opsplitsing per subtype bleek dat voornamelijk CRF 02_AG toch nog problemen gaf. Voor 2 stalen bleef de amplificatiereactie negatief met beide primersets. Doordat sommige amplificatiereacties positief waren voor slechts één primerset, werd ook nagekeken of er een mogelijkheid was om beide primersets gecombineerd in een reactie te gebruiken. De resultaten waren vergelijkbaar met die van de individuele reacties (zie tabel 2). Op basis van de verkregen resultaten werden de PR2 primers opnieuw per subtype gealigneerd met referentiesequenties (Los Alamos databank, www.hiv.lanl.gov) en geoptimaliseerd. De subtypespecifieke geoptimaliseerde primers werden onderling vergeleken om tot geoptimaliseerde consensus primers te komen (figuur 7). Met deze geoptimaliseerde primers (PR3) was het succes van de amplificatie het hoogst (tabel 2). Tabel 2. Overzicht van het aantal positieve PCR reacties met de verschillende primersets. Per gebruikt primerset en per subtype wordt het aantal stalen weergegeven die succesvol geamplificeerd werden. PCR succesvol
01_AE
02_AG
A
B
C
D
F
G
Overige
Totaal
aantal stalen
7
5
6
6
5
3
5
3
20
60
PR1
6 (85.7 %)
1 (20 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
2 (66.7 %)
5 (100 %)
2 (66.7 %)
16 (80 %)
49 (81.7%)
PR2
7 (100 %)
2 (40 %)
5 (83.3%)
6 (100 %)
4 (80 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
2 (66.7 %)
17 (85 %)
51 (85 %)
PR1+PR2
7 (100 %)
2 (40 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
17 (85 %)
54 (90 %)
PR3
7 (100 %)
4 (80 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
20 (100 %)
59 (98.3 %)
PCR succesvol na herhaling
01_AE
02_AG
A
B
C
D
F
G
Overige
Totaal
aantal stalen
7
5
6
6
5
3
5
3
20
60
PR1
7 (100 %)
1 (20 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
16 (80 %)
55 (91.7 %)
PR2
7 (100 %)
1 (20 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
19 (95 %)
58 (96.7 %)
PR1+PR2
7 (100 %)
3 (60 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
17 (85 %)
54 (90 %)
PR3
7 (100 %)
1 (20 %)
6 (100 %)
6 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
5 (100 %)
3 (100 %)
20 (100 %)
59 (98.3 %)
27
Figuur 7. Optimalisatie primer ENV_11. Primer ENV_1 (linksboven; gebaseerd op HXB2) werd eerst aangepast volgens subtype referentiesequenties (links). De verkregen primer ENV_11 werd per subtype geoptimaliseerd, waardoor subtypespecifieke primers (ENV_11_”subtype”) werden bekomen (midden). Deze werden vergeleken, waarna een consensus primer ENV_11_OPT gegenereerd werd (rechts).
28
1.2. Gevoeligheid van geoptimaliseerde primers (PR3) voor amplificatie van stalen met een lage virale lading Om de gevoeligheid van het PCR protocol met de geoptimaliseerde primers (PR3) te bepalen werden 14 stalen geselecteerd, van verschillende subtypes met een virale lading tussen 100 cp/mL en 4000 cp/mL. Bij een virale lading hoger dan 1000 cp/mL waren alle reacties succesvol, onder deze grens werd 60 % (6/10) succesvol geamplificeerd (tabel 3). Tabel 3. Resultaten van de amplificatie voor stalen met een lage virale lading tussen 100 en 4000 c/ml. In de tabel zijn de stalen waarvoor de amplificatie faalde vet gedrukt.
199 cp/mL
5
191 cp/mL
9
315 cp/mL
13
2
1354 cp/mL
6
2033 cp/mL
10
832 cp/mL
14
670 cp/mL
3
11211 cp/mL 770 cp/mL
7
3723 cp/mL
11
8
402 cp/mL
12
143 cp/mL 604 cp/mL
15
PC (100000 cp/mL) NC (AD)
1
4
16
519 cp/mL
1.3. Optimalisatie van de primers gebruikt voor sequentie analyse De sequenties van de primers gebruikt voor sequentie analyse zijn eveneens gebaseerd op de subtype B referentiesequentie HBX2. De antisense primer faalde vaker (7336; succesratio van 83.1 %) dan de 2 sense primers (6951 en 6990; succesratio‟s van 100 % en 93.2 %) (tabel 5). Voor het optimaliseren van de drie sequencing primers werd de informatie gebruikt die was verzameld na sequentieanalyse van het subtype referentie panel (SRP). Na alignering per subtype van de verkregen sequenties en van de referentie sequenties (Los Alamos databank, www.hiv.lanl.gov) met behulp van ClustalW [40], werd de variabiliteit ter hoogte van de primerpositie bekeken. De sequencing primers werden vervolgens aangepast om een zo groot mogelijke compatibiliteit te verkrijgen (tabel 4). Vervolgens werden de geoptimaliseerde primers geëvalueerd. De geoptimaliseerde antisense primer (7336OPT; succesratio van 86.1 %) faalt nog altijd meer in vergelijking met de sense primers (6951OPT en 6990OPT; succesratio‟s van 98.2 %) maar er is toch een verbetering in efficiëntie in vergelijking met de oorspronkelijke primers. Vervolgens werd nagekeken of er mogelijke oorzaken konden worden gevonden voor het meer frequent falen van de antisense primer. Uit alignments van de gesequeneerde regio bleek dat inserties en deleties (indels) zeer vaak voorkomen in de regio volgend op V3 (figuur 8). Het gebied tussen V3 en de indels regio bleek bovendien extreem variabel te zijn (figuur 9). 29
Tabel 4. Primers gebruikt voor de sequentieanalyse. Eerst wordt de standaardprimer vermeld, vervolgens de geoptimaliseerde primer.
Primers voor sequentieanalyse Locatie vanaf het begin van het HXB2 genoom: 6951 → 6973 (groene balk op figuur) 6990 → 7012 (blauwe balk op figuur) 7336 → 7318 (rode balk op figuur)
Tabel 5. Resultaten van de sequentieanalyse met de drie sequencing primers. Per gebruikte primer en per subtype wordt het aantal stalen weergegeven die succesvol gesequeneerd werden. Indien de sequentie analyse faalde werd de reactie standaard herhaald. Sequentie-analyse
01_AE
02_AG
A
B
C
D
F
G
O verige
Totaal
aantal stalen
7
4
6
6
5
3
5
3
20
59
6951
6 (85.7 %)
2 (50 %) 5 (83.3 %) 6 (100 %)
6990
7 (100 %)
3 (75 %) 5 (83.3 %) 5 (83.3 %) 5 (100 %) 2 (66.7 %) 3 (60 %) 2 (66.7 %) 17 (85 %) 49 (83.1 %)
7336
5 (71.4 %)
1 (25 %) 5 (83.3 %) 4 (66.7 %) 5 (100 %) 3 (100 %) 5 (100 %) 2 (66.7 %) 12 (60 %) 42 (71.2 %)
sequentie bruikbaar
6 (86.7 %)
2 (50 %) 5 (83.3 %) 4 (66.7 %) 5 (100 %) 3 (100 %) 5 (100 %) 2 (66.7 %) 17 (85 %) 49 (83.1 %)
Succes na herhaling
01_AE
02_AG
A
B
C
D
F
G
O verige
Totaal
aantal stalen
7
4
6
6
5
3
5
3
20
59
6951
4 (80 %)
3 (100 %) 5 (100 %) 3 (100 %)
18 (90 %) 52 (88.1 %)
7 (100 %) 4 (100 %) 6 (100 %) 6 (100 %) 5 (100 %) 3 (100 %) 5 (100 %) 3 (100 %) 20 (100 %) 59 (100 %)
6990
7 (100 %) 4 (100 %) 6 (100 %) 6 (100 %) 5 (100 %) 2 (66.7 %) 3 (60 %) 2 (66.7 %) 20 (100 %) 55 (93.2 %)
7336
5 (83.4 %)
sequentie bruikbaar
2 (50 %) 5 (83.3 %) 6 (100 %) 5 (100 %) 3 (100 %) 5 (100 %) 2 (66.7 %) 16 (80 %) 49 (83.1 %)
7 (100 %) 4 (100 %) 6 (100 %) 6 (100 %) 5 (100 %) 3 (100 %) 5 (100 %) 2 (66.7 %) 18 (90 %) 57 (96.6 %)
30
Figuur 8. Voorbeeld van insertie/deletie (indel) in het geamplificeerd gebied. Het chromatogram van de antisense primer toont een mengsel van twee sequenties als gevolg van een indel van drie nucleotiden. De shift die hierdoor ontstaat is aangegeven door de zwarte pijlen.
Figuur 9. Grafische voorstelling van het ClustalW alignment van de enveloppe sequenties van de stalen van het SRP. De derde constante regio C3 bevat een variabel gebied, veroorzaakt door inserties en deleties (indels). Figuur aangemaakt met Pixel: http://www.hiv.lanl.gov.
31
2. Voorspellen van het coreceptorgebruik op basis van de V3 sequentie 2.1. Uitbreiding aantal stalen Na optimalisatie van de primers voor amplificatie en sequenering waren 57 V3 sequenties beschikbaar voor verdere analyse (tabel 5). Deze lijst werd aangevuld met sequenties die via eerder in het ARL uitgevoerde analyses waren bekomen. Verder werd een extra V3 sequentiebepaling uitgevoerd bij patiënten die HIV seropositief gediagnosticeerd werden in 2009. Dit bracht het totaal aantal sequenties beschikbaar voor verdere analyse op 146 (tabel 6).
2.2. Verdeling tropisme volgens Geno2Pheno Bij tropismevoorspelling met de bio-informaticasoftware van Geno2pheno werd een False Positive Rate (FPR; de kans dat een sequentie foutief als X4 voorspeld wordt) van 10 % als grenswaarde gebruikt om een onderscheid te maken tussen R5 stammen en X4 stammen. Onder deze waarde wordt een sequentie als X4 (of R5X4) beschouwd, erboven als R5. De verdeling van R5 en X4 virussen per subtype is voorgesteld in Tabel 6. Uit deze resultaten blijkt het meer frequent voorkomen van X4 bij isolaten van CRF 01_AE in vergelijking met de andere subtypes.
Tabel 6. Verdeling tropisme per subtype. Het tropisme werd voorspeld met Geno2Pheno. Tropisme (G2P)
01_AE
02_AG
A
B
C
D
F
G
O verige
Totaal
X4
7 (63.6 %)
3 (23.1 %)
2 (16.6 %)
21 (34.4 %)
2 (22.2 %)
1 (33.3 %)
0 (0 %)
1 (12.5 %)
5 (22.7 %)
42 (28.8 %)
R5
4 (36.4 %)
10 (76.9 %) 10 (83.3 %) 40 (65.6%)
7 (77.8 %)
2 (66.7 %) 7 (100 %) 7 (87.5 %)
Totaal
11
13
12
61
9
3
7
8
17 (77.3 %) 104 (71.2 %) 22
146
Om het verschil in R5/X4 verdeling tussen CRF 01_AE en de andere subtypes verder te onderzoeken werd beslist om het aantal stalen van CRF 01_AE uit te breiden. Als controle werd ook de reeks van subtype C geïnfecteerde stalen uitgebreid. Volgens de literatuur zou in dit subtype de switch van R5 naar X4 virussen minder frequent voorkomen [3]. Verder werd ook het aantal stalen van subtype B geïnfecteerden uitgebreid. De resultaten van de uitgebreide set stalen zijn voorgesteld in Tabel 7. Het percentage X4 bij CRF 01_AE bleef hoger in vergelijking met subtype B.
32
2.3. Phylogenetische analyse van V3 en polymerase sequenties Voor alle geanalyseerde stalen werd een phylogenetische boom getekend met PhyML [39] op basis van de V3 regio (sequenties bekomen via dit werk), maar ook op basis van het protease en reverse transcriptase gen (sequenties beschikbaar via de routine analyse voor resistentiebepaling). Zowel in de PR-RT als in de V3 boom clusterden een groot deel van de sequenties van CRF 01_AE hecht samen, terwijl een kleiner deel in de subtype A cluster voorkwam (supplement figuur 1). Dit leek in tegenspraak met de subtypebepaling volgens Smartgene‟s Integrated Database Network SystemTM (IDNS) (Zug, Zwitserland). Op basis van deze bevinding werd het subtype opnieuw bepaald met behulp van de webapplicatie REGA [41]. Deze aanpassing van subtypering herschikte acht 01_AE sequenties bij subtype A (tabel 7).
Voor verdere analyses werden de sequenties, die gegroepeerd werden als subtype 01_AE, A, B, C door de REGA subtyperingstool gebruikt.
Tabel 7. Verdeling tropisme per subtype na herschikking op basis van de REGA subtypering. Subtype D werd niet herkend door REGA, deze stalen werden bij “Overige” gevoegd. Acht stalen die volgens Smartgene foutief bij 01_AE werden gecategoriseerd, hoorden volgens REGA bij subtype A. Over de volledige populatie werden meer stalen niet gecategoriseerd door REGA. Tropisme werd voorspeld met Geno2Pheno. Tropisme (G2P)
01_AE
02_AG
A
B
C
F
G
O verige
Totaal
X4
15 (57.7 %)
2 (12.5 %)
4 (20 %)
23 (29.5 %)
5 (18.5 %)
0 (0 %)
1 (20 %)
6 (16.7 %)
56 (26.2 %)
R5
11 (42.3 %) 14 (87.5 %)
16 (80 %)
55 (70.5 %) 22 (81.5 %)
Totaal
26
16
20
78
27
6 (100 %) 6
4 (80 %) 30 (83.3 %) 158 (73.8 %) 5
36
214
33
2.4. Vergelijking tussen isolaten van subtype 01_AE, A, B en C 2.4.1. Vergelijking van de patiëntenkarakteristieken De karakteristieken van de patiënten gegroepeerd als subtype 01_AE, A, B en C werden vergeleken (tabel 8). Er werd een significant verschil aangetoond tussen de geslachtsverdeling bij de groep geïnfecteerd met subtype B en de drie andere patiëntengroepen. Tussen deze drie groepen onderling was er geen significant verschil in het geslacht van de patiënt. De virale lading is significant hoger bij subtype B en CRF 01_AE dan bij subtypes A en C. Tussen de subtypes A en C onderling was er geen significant verschil in virale lading. De vier groepen zijn niet significant verschillend voor het laagste aantal CD4+ cellen/mm³ dat ooit bereikt werd (CD4 nadir). Tabel 8. Vergelijking van de patiëntenkarakteristieken per subtype. P-waarden werden berekend met Fisher‟s exact test voor “therapie naïef”, “baseline”, “start therapie” en “geslacht”. De Kruskal-Wallis test werd gebruikt voor “leeftijd”, “virale lading staalafname” en “CD4 nadir”. P-waarden die duiden op een significante associatie zijn vet gedrukt. B
01_AE
P-waarde
A
P-waarde
Aantal patiënten
n = 78
n = 26
Therapie naïef
65
20
Therapie experienced
13
6
Baseline
35
13
0.66
6
0.31
11
0.82
Start therapie
38
12
1.00
7
0.23
8
0.12
36.4 (8.9)
39.7 (13.1)
0.43
37.0 (11.2)
0.91
36.7 (9.5)
0.86
36.5 (18 - 61)
37.5 (22 - 66)
8 (10.3 %)
11 (42.3 %)
<0.001 (0.15*)
13 (65.0 %)
<0.001
20 (74.1 %)
<0.001 (0.54*)
4.64 (0.74)
4.64 (0.82)
0.92
4.21 (0.75)
0.01
4.17 (0.88)
0.01 (0.97*)
n = 20 0.56
13
C
P-waarde
n = 27 0.12
7
17
0.03
10
Leeftijd Gemiddelde (SD) Mediaan (min - max)
34.5 (16 - 65)
36.0 (25 - 67)
Geslacht Vrouw Virale Lading (log cp/mL) Gemiddelde (SD) Mediaan (min - max)
4.81 (2.28 - 6.00) 4.85 (2.93 - 5.80)
4.47 (2.37 - 4.98)
4.43 (2.50 - 5.96)
CD4 nadir (cellen/mm3) Gemiddelde (SD) Mediaan (min - max)
313.2 (219.2)
236.3 (183.2)
273.5 (3 - 1030)
164.5 (5 - 564)
0.10
236.9 (173.8) 178.0 (30 - 635)
0.16
273.5 (189.1)
0.50
274.0 (3 - 840)
* P-waarde voor vergelijking met subtype A
34
2.4.2. Invloed van CD4 nadir Vervolgens werd voor elk subtype de patiënten opgedeeld op basis van de CD4 nadir: hoger dan 500 cellen/mm³, tussen 200 en 500 cellen/mm³ en lager dan 200 cellen/mm³. Voor de verschillende subgroepen werd dan de R5/X4 verdeling bekeken. Voor een CD4 nadir lager dan 200 cellen/mm³ lag het percentage X4 sequenties bij CRF 01_AE significant hoger dan bij subtypes B (tabel 9). In vergelijking met subtypes A en C was het percentage X4 bij CRF 01_AE voor CD4 nadir lager dan 200 cellen/mm³ eveneens significant hoger (p < 0.01).Voor de overige onderverdelingen (tussen 200 en 500 cellen/mm³ en hoger dan 500 cellen/mm³) werden geen significante verschillen aangetoond tussen subtype en coreceptorgebruik. De patiënten werden verder vervolgens onderverdeeld op basis van hun therapie-geschiedenis in “therapie naïef” en “therapie experienced”. Er werd geen significant verschil gevonden in R5/X4 verdeling in beide groepen (niet weergegeven).
Tabel 9. Verdeling van X4 en R5 stammen voor de verschillende CD4 nadir groepen. P-waarden werden berekend met Fisher‟s exact test en met subtype B als referentie. Significante verschillen zijn vet gedrukt. Stalen waarvoor geen CD4 nadir beschikbaar was werden niet opgenomen in de analyse. Tropisme werd voorspeld met Geno2Pheno. CD4 nadir (aantal cellen/mm3)
Tropisme (G2P)
B
X4
9 (37.5 %)
01_AE
A
10 (76.9 %)
< 200
2 (20 %)
15 (62.5 %)
3 (23.1 %)
X4
9 (28.1 %)
3 (42.9 %)
R5
23 (71.9 %)
4 (57.1 %)
X4
4 (20 %)
2 (40 %)
R5
16 (80 %)
8 (80 %)
3 (60 %)
4 (26.7 %) 0.65
6 (85.7 %)
1.00 11 (73.3 %)
1 (100 %) 0.56
> 500
0.22 8 (88.9 %)
1 (14.3 %) 0.65
200 - 500
1 (11.1 %) 0.44
0.04 R5
C
0 0.24
0
1.00 2 (100 %)
35
2.4.3. Vergelijking van de False Positive Rate In de volgende stap werd een vergelijking gemaakt van de False Positive Rate (FPR), bekomen met Geno2Pheno, tussen de verschillende subtypes en per groepering volgens de CD4 nadir (figuur 10). De verdeling toont aan dat de FPR het laagst is voor CRF 01_AE (p < 0.001). Na opsplitsing op basis van de CD4 nadir blijft de statistische significantie enkel gelden voor de groep met een CD4 nadir lager dan 200 cellen/mm³ (p = 0.001).
Figuur 10. Verdeling False Positive Rate (FPR) per subtype en CD4 nadir. Mediaan per groep en afkapwaarde voor tropisme (FPR = 10 %) is weergegeven.
36
2.4.4. Vergelijking van tropisme in stalen gecollecteerd bij diagnose (baseline) Wanneer enkel stalen gecollecteerd op het ogenblik van de diagnose werden ingesloten, bleef er een duidelijk verschil in aantal X4 stammen tussen de subtypes CRF 01_AE en A voor de stalen met een CD4 van < 200 cellen/mm3. Statistische significantie werd niet bereikt, waarschijnlijk door het te kleine aantal stalen dat kon ingesloten worden (tabel 10).
Tabel 10. Verdeling van tropisme bij baselinestalen van patiënten geïnfecteerd met CRF 01_AE en subtype A. P-waarden werden berekend met Fisher‟s exact test. Tropisme werd voorspeld met Geno2Pheno.
01_AE
A
CD4 (aantal cellen/mm3)
X4
R5
X4
R5
<200
5 (55.6 %)
4 (44.4 %)
0 (0 %)
5 (100 %)
0.09
200-500
2 (25 %)
6 (75 %)
1 (20 %)
4 (80 %)
1
>500
2 (22.2 %)
7 (77.8 %)
1 (25 %)
3 (75 %)
1
totaal
9 (34.6 %)
17 (65.3 %)
2 (14.3 %)
12 (85.7 %)
0.27
p-waarde
2.5. Vergelijking tussen drie modellen voor het voorspellen van het tropisme In deze studie werd standaard Geno2Pheno gebruikt als genotypische test voor tropismevoorspelling. Doordat Geno2Pheno gebaseerd is op subtype B sequenties, is het mogelijk dat het hoger percentage X4 tropisme, voorspeld bij CRF 01_AE, het gevolg is van een niet correcte voorspelling van het coreceptorgebruik voor dit subtype door Geno2Pheno. WebPSSM is ook gebaseerd op subtype B sequenties, maar werkt volgens een andere methode (zie de materialen en methoden sectie). Om scores met WebPSSM te kunnen verkrijgen, werden de gedegenereerde nucleotidesequenties van de V3 regio‟s eerst omgezet naar alle mogelijke aminozuursequenties. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een Perl script (geschreven door Will Fischer van Het Los Alamos National Laboratory, VS). De WebPSSM scores tonen eveneens een hoger percentage X4 stammen bij CRF 01_AE dan bij de andere subtypes (tabel 11). Algemeen werd met WebPSSM vaker een X4 tropisme voorspeld dan met Geno2Pheno. In totaal kon er op elf van 214 sequenties geen score bepaald worden met WebPSSM wegens teveel degeneraties. Het percentage discordante resultaten tussen Geno2Pheno en WebPSSM was het hoogst bij subtype A. Voor subtype F waren er geen discordanties. De 11/25 methode voorspelt het tropisme op basis van de lading van de aminozuren op positie 11 en 25. De resultaten volgens deze methode geven een veel lager X4 percentage (tabel 11). Met de 11/25 methode werd geen hoger percentage X4 sequenties gevonden bij CRF 01_AE in vergelijking met andere subtypes. 37
30 % 26.9 % 14.8 % 0% 20 % 16.7 % 21.7 %
2 5 2 0 0 2 12
4 16 2 0 1 4 32
2 5 3 0 0 0 11
12 (66.7 %)
12 (15.4 %) 66 (84.6 %) 23 (29.5 %) 55 (70.5 %) 30 (41.1 %) 43 (58.9 %) 19 (79.2 %) 6 (100 %) 3 (60 %) 28 (77.8 %)
6 (33.3 %)
5 (20.8 %) 0 (0 %) 2 (40 %) 8 (22.2 %)
16 (80 %)
22 (81.5 %) 6 (100 %) 4 (80 %) 30 (83.3 %)
4 (20 %)
5 (18.5 %) 0 (0 %) 1 (20 %) 6 (16.7 %)
18 (90 %)
22 (81.5 %)
5 (83.3 %)
5 (100 %)
33 (91.7 %)
2 (10 %)
5 (18.5 %)
1 (16.7 %)
0 (0 %)
3 (8.3 %)
29 (13.6 %) 185 (86.4 %) 56 (26.2 %) 158 (73.8 %) 72 (35.5 %) 131 (64.5 %)
A
B
C
F
G
O verige
Totaal
18.8 % 0
3
1
10 (66.7 %)
5 (33.3 %)
14 (87.5 %)
2 (12.5 %)
13 (81.3 %)
3 (18.8 %)
02_AG
Percentage
R5
X4
onbepaald
11.5 %
R5 1
X4 2
R5
Discordante PSSM
0
X4
PSSM
23 (88.5 %) 15 (57.7 %) 11 (42.3 %) 16 (61.5 %) 10 (38.5 %)
R5
Geno2Pheno
3 (11.5 %)
X4
11/25
01_AE
Subtype
Tabel 11. Vergelijking tussen drie genotypische methoden voor tropismevoorspelling. De discordante resultaten voor PSSM duiden op sequenties die respectievelijk X4 of R5 scoren op PSSM, maar R5 of X4 bij Geno2Pheno. Per subtype zijn de aantallen en percentages van beschikbare sequenties weergegeven.
38
3. Genetische variabiliteit van de V3 regio In het laatste deel werd onderzocht of er significante verschillen zijn in de conservering en aminozuursamenstelling van de V3 regio bij subtypes 01_AE, A, B en C. Door population based sequencing werden slechts weinig sequenties zonder degeneraties bekomen (meerdere aminozuren mogelijk op een bepaalde positie). Om analyse van de aminozuursamenstelling van de V3 lus te kunnen uitvoeren moest het aantal degeneraties beperkt blijven en werden alleen sequenties met minder dan vier degeneraties weerhouden. Hierdoor bleven er 21 01_AE sequenties, 13 subtype A sequenties, 49 subtype B sequenties en 22 subtype C sequenties voor verdere analyse over. Met Jalview [36] werd de “conservering” berekend volgens de overeenkomst van fysische en chemische eigenschappen van de aminozuren die op een bepaalde positie voorkomen. Identieke aminozuren scoren het hoogst, gevolgd door aminozuren met gelijkaardige eigenschappen. Elk aminozuur werd gekleurd volgens de Zappo methode (tabel 12) met kleurintensiteit volgens conservatie. De “quality” werd berekend volgens een BLOSUM62 matrix en duidt op het aantal mutaties. De “consensus” geeft het meest voorkomende aminozuur per positie weer. Indien meerdere aminozuren evenveel voorkomen wordt een “+” weergegeven (figuur 11). Tabel 12. Kleurcode volgens de Zappo methode. Aminozuren zijn weergegeven volgens IUPAC afkorting.
Alifatisch/hydrofoob
ILVAM
Aromatisch
FWY
Positieve lading
KRH
Negatieve lading
DE
Hydrofiel
STN Q
Speciale conformatie
PG
Cysteïne
C
De resultaten tonen de grote variabiliteit binnen de V3 regio aan (figuur 11). Conservering op positie 1 en 35 is volledig (noodzakelijk voor vorming disulfidebrug). Verder is er ook slechts een beperkte mogelijkheid tot variabiliteit op de kroon van de V3 lus (motief GPG). De stam van de V3 lus is echter steeds zeer variabel. In de stam werd een duidelijk verschil geïdentificeerd tussen CRF 01_AE en de andere subtypes: op positie 22 bevindt zich een positief arginine of lysine, waar bij de andere subtypes een alanine of een threonine voorkomt als consensus. Dit werd ook reeds gerapporteerd door Lobritz, et al. [42]. Er werden geen mutaties geïdentificeerd die enkel bij CXCR4 gebruikende stammen voorkomen.
39
Figuur 11. Conservering van de V3 regio bij subtype B, 01_AE, A en C sequenties. Figuur aangemaakt met Jalview [36]. Conservation is de score volgens de overeenkomsten van fysische en chemische eigenschappen, Quality duidt op het aantal mutaties, Consensus geeft het meest voorkomende aminozuur op die positie weer.
40
Bespreking
CCR5 antagonisten zoals Maraviroc behoren tot de nieuwste klasse van antiretrovirale middelen. Doordat CCR5 inhibitoren alleen gebruikt kunnen worden bij patiënten waarvan de infecterende virussen uitsluitend gebruik maken van CCR5 als coreceptor, is er nood aan technieken die toelaten het coreceptorgebruik van de bij patiënten aanwezige virussen routinematig op een betaalbare en efficiënte wijze te bepalen. Om het tropisme vast te stellen is momenteel enkel een fenotypische test (Trofile ESTATM) klinisch gevalideerd. Fenotypische testen zijn echter tijdrovend, arbeidsintensief, duur en kunnen enkel in speciaal uitgeruste laboratoria uitgevoerd worden. Naast fenotypische testen bestaan er ook genotypische testen die op basis van de aminozuursamenstelling van de V3 regio het coreceptorgebruik voorspellen.
Gezien de hoge variabiliteit van HIV-1 en het voorkomen van verschillende subtypes is het noodzakelijk om de primers die zullen gebruikt worden voor de amplificatie en sequentieanalyse van het enveloppe-gen, zorgvuldig te selecteren zodat ze compatibel zijn met de grote diversiteit aan HIV subtypes en recombinante vormen (circulating recombinant form; CRF). Het ontwikkelen van optimale primers moet ook toelaten zoveel mogelijk de verschillende quasispecies binnen eenzelfde patiënt te kunnen karakteriseren.
In dit onderzoek werden zowel de primers voor amplificatie, als de primers voor sequentieanalyse geoptimaliseerd op basis van gekende sequenties van de verschillende subtypes en CRF‟s. Tijdens de eerste experimenten bleken voornamelijk isolaten van CRF 02_AG vaak te falen voor amplificatie. Maar na optimalisatie konden ook de enveloppe sequenties van dit subtype met succes vermenigvuldigd en gekarakteriseerd worden (succesratio van 98.3 % versus 81.7 % bij gebruik van de originele primers).
De primer voor sequenering van de antisense streng faalt, ook na optimalisatie, nog beduidend vaker dan de primers voor sequenering van de sense streng (succesratio van 86 % voor de antisense versus 98 % voor de sense primers). Dit is waarschijnlijk het gevolg van het groot aantal inserties en deleties, en de zeer hoge mate van variabiliteit in de derde constante regio van het enveloppe-gen. Dit leidt, na sequentieanalyse, tot een chromatogram dat een mix toont van nucleotiden op bepaalde posities en dat daardoor niet interpreteerbaar is (figuur 8).
41
Enkel via clonale sequenering kan men deze mengsels correct analyseren. Deze techniek is echter nog niet beschikbaar als routine test wegens te arbeidsintensief en te duur. Door de combinatie van efficiënte sequentie analyse en in silico predictiemethoden, is tropismebepaling beschikbaar voor gebruik in de routine klinische opvolging van patiënten. In deze studie werd het tropisme standaard met Geno2Pheno voorspeld. Deze methode werkt volgens een beslissingsboom en werd ontwikkeld op basis van subtype B sequenties, waarvan het tropisme met een fenotypische test bepaald was. Er werd een vergelijking gemaakt tussen de voorspellingen bekomen met Geno2Pheno, deze bekomen met WebPSSM en via de 11/25 methode. WebPSSM is eveneens gebaseerd op de correlatie tussen fenotype en de V3 sequentie van subtype B sequenties, maar berust op een positiespecifieke score matrix, waarmee het tropisme voorspeld wordt. Voor alle subtypes lagen de percentages X4 isolaten het laagst bij gebruik van de 11/25 methode. Deze methode voorspelt het tropisme alleen op basis van de lading van de aminozuren op positie 11 en 25 van de V3 lus, waarbij een positieve lading op CXCR4 gebruik wijst. Geno2Pheno en PSSM houden daarentegen rekening met de volledige V3 regio. Het percentage X4 lag bij alle subtypes hoger bij gebruik van PSSM dan bij Geno2Pheno. De reden hiervoor is onduidelijk. Verdere studie en vergelijking met fenotypische methodes is noodzakelijk. Een fenotypische methode zoals de MT-2 celkweek kon echter in de beschikbare tijdspanne niet uitgevoerd worden. Hiervoor is een cocultuur met perifere bloed mononucleaire cellen noodzakelijk, maar de gezuiverde verse of onder DMSO in vloeibare stikstof bewaarde perifere bloed mononucleaire cellen waren niet beschikbaar. Een aantal studies waarin fenotypische en genotypische methodes werden vergeleken, toonden een overschatting aan van het aantal X4 virussen door Geno2Pheno bij non B subtypes [32, 36].
Om de geoptimaliseerde primers te evalueren werd eerst een panel samengesteld van at random gekozen plasmastalen met een hoge virale lading, afkomstig van patiënten geïnfecteerd met een verschillend subtype of CRF (supplement figuur 1). In het tweede deel van dit onderzoek werd het aantal stalen van vier geselecteerde subtypes (01_AE, A, B en C) verder uitgebreid met als doel na te gaan of er subtypespecifieke verschillen in coreceptorgebruik kunnen aangetoond worden. Subtype B werd gekozen als referentie, aangezien hierop reeds het meeste onderzoek uitgevoerd is. Volgens de literatuur zou in subtype C stammen de switch van het R5 naar het X4 type minder frequent voorkomen [3]. Bij CRF 01_AE sequenties uit het primer evaluatie panel werd een hoger percentage X4 42
tropisme voorspeld met een genotypische test. Aangezien CRF 01_AE een recombinant is van subtype A, waarbij alleen het Env gen een verschillende oorsprong heeft, werden beide groepen ingesloten voor verdere analyse. Bij vergelijking tussen de karakteristieken van patiënten geïnfecteerd met subtype 01_AE, A, B of C werd het laagste peil CD4+ cellen dat bereikt werd (CD4 nadir) niet significant verschillend bevonden. Aangezien studies hebben aangetoond dat er een correlatie bestaat tussen CD4 nadir en het gebruik van CXCR4 als coreceptor [43, 44], is er in deze studie geen bias van CD4 nadir voor coreceptorgebruik.
Naarmate de infectie evolueert, verandert in 50 % van de gevallen het coreceptorgebruik van CCR5, in het begin van de infectie, naar CXCR4 [3]. Subtype D virussen zouden deze overgang makkelijker maken, wat een verklaring kan vormen voor de snellere progressie die bij individuen geïnfecteerd met subtype D werd opgemerkt [3, 43]. Dit resultaat kon hier niet nagegaan worden omdat er onvoldoende patiënten met HIV subtype D in opvolging zijn in het AIDS Referentie Laboratorium (ARL, Universitair Ziekenhuis Gent) om met voldoende power significante verschillen met andere subtypes aan te tonen. Volgens wetenschappelijk onderzoek zouden virussen van subtype C minder gebruik maken van de CXCR4 coreceptor [3]. In deze studie werden vijf van de 27 subtype C sequenties als X4 geclassificeerd. Dit percentage (18.5 %) is hoger dan de 6 % tot 12.5 % X4 stalen die in de literatuur werden gerapporteerd [14, 44-46]. Alleen in een Zuid-Afrikaanse studie werd een vergelijkbaar hoog percentage X4 virussen (17.2 %) aangetoond bij patiënten in het AIDS stadium [47]. Het hoogste percentage CXCR4 gebruik werd voorspeld bij CRF 01_AE. Dit resultaat werd zowel met de PSSM methode als met Geno2Pheno bekomen. Na het voorspellen van het tropisme van alle beschikbare CRF 01_AE referentiesequenties (in de Los Alamos databank, www.hiv.lanl.gov), werd vastgesteld dat ook hier een hoog percentage X4 virussen wordt gevonden (44.7 % X4 volgens Geno2Pheno). In de literatuur werden fenotypische resultaten van acht van deze referentiestalen teruggevonden [44]. Voor deze referentiestalen correleren de fenotypische resultaten zeer goed met de genotypische voorspelling, wat een aanwijzing is dat de Geno2Pheno en de PSSM voorspelling in de meeste gevallen correct is (supplement tabel 2). Deze bevinding van een hoger aantal X4 stammen bij CRF 01_AE werd nog niet eerder bericht in de literatuur.
43
Door middel van een fylogenetische analyse van de V3 regio werd onderzocht of binnen de subtypes sequenties van het X4 type samen clusteren. Hiervoor werden geen aanwijzingen gevonden, wat wijst op een evolutie naar CXCR4 gebruik die telkens onafhankelijk in elke patiënt opnieuw gebeurt en die niet gekenmerkt wordt door identieke aminozuurwijzigingen in de V3 lus (supplement figuur 1). Fylogenetische analyse van het pol gen toont eenzelfde subtype clustering als deze van de V3 regio. Op positie 22 van V3 is de consensus voor CRF 01_AE arginine, een positief geladen aminozuur. Dit verschilt van alle andere subtypes waar op deze positie een hydrofoob of neutraal aminozuur wordt gezien. Volgens Yang, et al. zou deze mutatie leiden tot een lagere efficiëntie van infectie gebruik makend van CCR5. Het gevolg voor CXCR4 gebruik werd evenwel niet onderzocht [48]. Een gefaciliteerde overgang naar CXCR4 gebruik zou een mogelijke verklaring kunnen vormen voor het hier beschreven hogere percentage X4 virussen bij CRF 01_AE. Het percentage X4 isolaten was significant hoger bij CRF 01_AE dan bij subtype A, B en C voor een CD4 nadir lager dan 200 cellen per mm³. In een Thaise studie werd een snellere progressie gezien bij patiënten geïnfecteerd met CRF 01_AE [49]. CXCR4 gebruik wordt gelinkt aan een verder gevorderde progressie. Het is echter nog niet bekend of CXCR4 gebruik leidt tot een snellere progressie, of net ontstaat onder druk van een ver gevorderd ziekteverloop. Om de associatie tussen coreceptorgebruik en CRF 01_AE verder te kunnen analyseren is er nood aan longitudinaal onderzoek bij patiënten met gekend infectietijdstip en gebruik makend van zowel genotypische als fenotypische tropismebepaling. Het uitvoeren van dit onderzoek is heel belangrijk omdat indien deze bevindingen kunnen worden bevestigd, dit als gevolg heeft dat het gebruik van CCR5 antagonisten mogelijk niet aangewezen is bij patiënten geïnfecteerd met CRF 01_AE.
44
Besluit
Door de primers gebruikt voor amplificatie en sequenering van de V3 regio te optimaliseren, is het nu mogelijk om efficiënt V3 sequentie analyse uit te voeren bij een zeer brede waaier aan verschillende HIV-1 subtypes. Na genotypische voorspelling van het coreceptorgebruik op basis van de V3 sequenties werd bij CRF 01_AE een hoger percentage virussen als X4 geclassificeerd. Dit resultaat moet verder bevestigd worden met een fenotypische test en met grotere aantallen goed gekarakteriseerde stalen. Verder moet ook worden nagegaan of het hoger X4 percentage bij CRF 01_AE te wijten is aan een verhoogde transmissie van X4 varianten of aan een snellere evolutie van R5 naar X4. De bevindingen van deze studie tonen aan dat toediening van CCR5 antagonisten mogelijks minder aangewezen is bij patiënten geïnfecteerd met HIV-1 CRF 01_AE.
45
Referentielijst 1.
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.
20. 21. 22.
23.
24.
25. 26. 27. 28.
Robert J. Gifford, A.K., Michael Tristem, Oliver G. Pybus, Mark Winters, and Robert W. Shafer, A transitional endogenous lentivirus from the genome of a basal primate and implications for lentivirus evolution. PNAS, 2008. 105(51): p. 20362–20367. Sharp, P.M., et al., Origins and evolution of AIDS viruses: estimating the time-scale. Biochem Soc Trans, 2000. 28(2): p. 275-82. Taylor, B.S. and S.M. Hammer, The challenge of HIV-1 subtype diversity. N Engl J Med, 2008. 359(18): p. 1965-6. Plantier, J.C., et al., A new human immunodeficiency virus derived from gorillas. Nat Med, 2009. 15(8): p. 871-2. Worobey, M., et al., Direct evidence of extensive diversity of HIV-1 in Kinshasa by 1960. Nature, 2008. 455(7213): p. 661-4. Pneumocystis pneumonia--Los Angeles. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 1981. 30(21): p. 250-2. Altman, L., Clue Found on Homosexual's Precancer Syndrome. New York Times, 1982. 18. Marx, J.L., New disease baffles medical community. Science, 1982. 217(4560): p. 618-21. Barre-Sinoussi, F., et al., Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science, 1983. 220(4599): p. 868. UNAIDS, W., AIDS epidemic update. Geneva: UNAIDS, WHO, 2009. Lythgo, P.A., Molecular Virology of HIV-1 and Current Antiviral Strategies. BioTeach Journal, 2004. 2. Carla Kuiken, T., B.F. Leitner, Beatrice Hahn, Preston Marx, Franc McCutchan, and Bette Korber, HIV Sequence Compendium 2008. 2008, Los Alamos National Laboratory, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, New Mexico. LA-UR 08-03719. Cann, A., Principles of molecular virology. 4th ed. 2005, Amsterdam ; Boston: Elsevier Academic Press. 92-95. Tscherning, C., et al., Differences in chemokine coreceptor usage between genetic subtypes of HIV-1. Virology, 1998. 241(2): p. 181-8. Janeway, C.A., Immunobiology : the immune system in health and disease. 6th ed. 2005, New York: Garland. 491-508. Jouvenet, N., P.D. Bieniasz, and S.M. Simon, Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature, 2008. 454(7201): p. 236-40. Hemelaar, J., et al., Global and regional distribution of HIV-1 genetic subtypes and recombinants in 2004. AIDS, 2006. 20(16): p. W13. Walker, B.D., Elite control of HIV Infection: implications for vaccines and treatment. Top HIV Med, 2007. 15(4): p. 134-6. Chalmet, K., et al., Impact of Delta 32-CCR5 heterozygosity on HIV-1 genetic evolution and variability--a study of 4 individuals infected with closely related HIV-1 strains. Virology, 2008. 379(2): p. 213-22. Gulick, R., HIV/AIDS Drugs. 2009: Wiley VCH. 77-100. Larder, B.A. and S.D. Kemp, Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT). Science, 1989. 246(4934): p. 1155-8. Gulick R, M.J., Havlir D, Eron J, Gonzalez C, McMahon D, Richman D, Valentine F, Jonas L, Meibohm A, Chiou R, Deutsch P, Emini E, Chodakewitz J, Potent and sustained antiretroviral activity of indinavir(IDV) in combination with zidovudine (ZDV) and lamivudine (3TC), in Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. 1996: Washington D C, USA. p. 162. Benlahrech, A., et al., Adenovirus vector vaccination induces expansion of memory CD4 T cells with a mucosal homing phenotype that are readily susceptible to HIV-1. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(47): p. 19940-5. Faure, E. and M. Royer-Carenzi, Is the European spatial distribution of the HIV-1-resistant CCR5Delta32 allele formed by a breakdown of the pathocenosis due to the historical Roman expansion? Infect Genet Evol, 2008. 8(6): p. 864-74. Glass, W.G., et al., CCR5 deficiency increases risk of symptomatic West Nile virus infection. J Exp Med, 2006. 203(1): p. 35-40. Vandekerckhove, L., C. Verhofstede, and D. Vogelaers, Maraviroc: integration of a new antiretroviral drug class into clinical practice. J Antimicrob Chemother, 2008. 61(6): p. 1187-90. Soulie, C., et al., Primary genotypic resistance of HIV-1 to CCR5 antagonists in CCR5 antagonist treatment-naive patients. AIDS, 2008. 22(16): p. 2212-4. Koot, M., et al., HIV-1 biological phenotype in long-term infected individuals evaluated with an MT-2 cocultivation assay. AIDS, 1992. 6(1): p. 49-54.
46
29. 30. 31. 32. 33.
34. 35. 36. 37.
38. 39. 40. 41. 42. 43.
44.
45. 46. 47. 48. 49.
Wood, N., et al., HIV Evolution in Early Infection: Selection Pressures. Patterns of Insertion and Deletion, 2009. Bioedit is online beschikbaar op http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html. Jalview is online beschikbaar op http://www.jalview.org/. Garrido, C., et al., Evaluation of eight different bioinformatics tools to predict viral tropism in different human immunodeficiency virus type 1 subtypes. Journal of clinical microbiology, 2008. 46(3): p. 887. Jensen, M.A., et al., Improved coreceptor usage prediction and genotypic monitoring of R5-to-X4 transition by motif analysis of human immunodeficiency virus type 1 env V3 loop sequences. J Virol, 2003. 77(24): p. 13376-88. Jensen, M.A., et al., A reliable phenotype predictor for human immunodeficiency virus type 1 subtype C based on envelope V3 sequences. J Virol, 2006. 80(10): p. 4698-704. Poveda, E., et al., Design and validation of new genotypic tools for easy and reliable estimation of HIV tropism before using CCR5 antagonists. J Antimicrob Chemother, 2009. 63(5): p. 1006-10. Raymond, S., et al., Correlation between genotypic predictions based on V3 sequences and phenotypic determination of HIV-1 tropism. AIDS, 2008. 22(14): p. F11-6. Harrigan, P., et al., Screening for HIV Tropism Using Population-Based V3 Genotypic Analysis: A Retrospective Virological Outcome Analysis Using Stored Plasma Screening Samples From MOTIVATE 1. 2009. Medcalc is in proefversie beschikbaar op http://www.medcalc.be/. PhyML is online te gebruiken op http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/. ClustalW is online te gebruiken op http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. REGA is online te gebruiken op http://dbpartners.stanford.edu/RegaSubtyping/. Lobritz, M.A., et al., Natural variation in the V3 crown of human immunodeficiency virus type 1 affects replicative fitness and entry inhibitor sensitivity. J Virol, 2007. 81(15): p. 8258-69. Huang, W., et al., Coreceptor tropism in human immunodeficiency virus type 1 subtype D: high prevalence of CXCR4 tropism and heterogeneous composition of viral populations. J Virol, 2007. 81(15): p. 7885-93. Brown, B.K., et al., Biologic and genetic characterization of a panel of 60 human immunodeficiency virus type 1 isolates, representing clades A, B, C, D, CRF01_AE, and CRF02_AG, for the development and assessment of candidate vaccines. J Virol, 2005. 79(10): p. 6089-101. Bjorndal, A., et al., Phenotypic characteristics of human immunodeficiency virus type 1 subtype C isolates of Ethiopian AIDS patients. AIDS Res Hum Retroviruses, 1999. 15(7): p. 647-53. Tien, P., et al., HIV type 1 envelope subtype C sequences from recent seroconverters in Zimbabwe. AIDS research and human retroviruses, 2000. 16(10): p. 973-979. Cilliers, T., et al., The CCR5 and CXCR4 coreceptors are both used by human immunodeficiency virus type 1 primary isolates from subtype C. The Journal of Virology, 2003. 77(7): p. 4449. Yang, Z.Y., et al., Selective modification of variable loops alters tropism and enhances immunogenicity of human immunodeficiency virus type 1 envelope. J Virol, 2004. 78(8): p. 4029-36. Yu, X.F., et al., Phenotypic and genotypic characteristics of human immunodeficiency virus type 1 from patients with AIDS in northern Thailand. J Virol, 1995. 69(8): p. 4649-55.
47
Bijlage
Supplement tabel 1. Resultaten amplificatie en sequentie analyse van stalen uit het subtype referentie panel. PR1: primerset gebaseerd op subtype B referentiesequentie HXB2; PR2: primers aangepast volgens subtypespecifieke referentiesequenties; PR1+PR2: mengsel van primersets PR1 en PR2; PR3: consensus van subtypespecifieke primersets (Figuur 7). QC Seq: kwaliteit sequentie analyse. F: falen; L: lage kwaliteit; M: gemiddelde kwaliteit (minstens één primer faalt); H: hoge kwaliteit. ID
Afname datum
Virale Lading
Subtype in POL (Smartgene)
1 1 1
31/08/2005 31/08/2005 31/08/2005
44100 44100 44100
01_AE 01_AE 01_AE
+
2 3 3
29/03/2007 13/04/2007 13/04/2007
486000 180000 180000
01_AE 01_AE 01_AE
+ +
4 4
16/04/2007 16/04/2007
62700 62700
01_AE 01_AE
+
+ +
5 6 6
23/12/2008 19/02/2009 19/02/2009
237000 51900 51900
01_AE 01_AE 01_AE
+ +
+
7 7 8
5/07/2004 5/07/2004 28/09/2005
593000 593000 148000
01_AE 01_AE 02_AG
+ + -
8 8
28/09/2005 28/09/2005
148000 148000
02_AG 02_AG
+
9 9 10
9/01/2006 9/01/2006 30/01/2009
13800 13800 10800
02_AG 02_AG 02_AG
-
10 10 11
30/01/2009 30/01/2009 27/02/2009
10800 10800 15498
02_AG 02_AG 02_AG
+
12 12
6/03/2009 6/03/2009
17642 17642
02_AG 02_AG
+
12 13 14
6/03/2009 6/02/2008 17/09/2008
17642 74500 113000
02_AG 05_DF 06_cpx
+ +
14 15 16
17/09/2008 29/08/2007 29/10/2008
113000 50600 25400
06_cpx 06_CPX 12_BF
+ +
17 18
21/03/2008 10/12/2003
1490000 20300
12_BF A1
18 19 20
10/12/2003 27/03/2008 6/02/2009
20300 10200 41200
21 21 21
20/11/2008 20/11/2008 20/11/2008
22 23
PR1 + PR2
sense
sense
antisense
6951
6990
7336
F L M
+ +
+ + +
-
H L M
+ + +
+ + +
+ -
H
+
+
+
H L L
+ + +
+ + +
+ + +
H H F
+ + -
+ + +
+ + -
M L
+ +
+ +
-
M M M
+ +
+ +
-
-
L
+
+
+
-
F H F
+ +
+ +
+ -
+ + +
F M H
+ + +
+
+ +
+ +
+ -
H H
+ +
+ +
+ +
A1 A1 A1
+ + +
+ + +
H M
+ +
+ +
+ +
35600 35600 35600
A1 A1 A1
+
F F L
+ +
+ +
+ -
9/03/2009 16/11/2004
24449 84200
A1 A2
+ +
L H
+
+
+
23 24 25
16/11/2004 22/06/2007 3/07/2008
84200 17200 66500
A2 B B
+ +
H F
+ +
+ +
+ -
25 26 27
3/07/2008 21/11/2008 17/03/2009
66500 204000 36813
B B B
+ +/-
+ + +
L H H
+ + +
+ + +
+ + +
27
17/03/2009
36813
B
+
+
PR1
PR2
PR3
QC Seq
+
+ + + +
+ + + +
+
+
+
+ +
-
-
+
+ +
+
+ + + + + +
+
48
27 28
17/03/2009 19/02/2008
36813 153000
B B
29 29 30
13/03/2003 13/03/2003 29/02/2008
70500 70500 96300
B B C
30 31 32
29/02/2008 8/05/2008 25/07/2008
96300 902000 100000
C C C
33 33
24/12/2008 24/12/2008
28300 28300
C C
34 35 35
20/01/2006 12/03/2009 12/03/2009
100000 10086 10086
35 36 36
12/03/2009 20/08/2008 20/08/2008
37 37
+
L M
+ +
+ +
+ +
F L L
+ + +
+ +
+ +
+ + +
M H H
+ +
+ + +
+ + +
+
+
H
+
+
+
C CRF CRF
+ -
+ -
H
+
+
+
10086 123000 123000
CRF CRF 22/A CRF 22/A
+
M F M
+ + +
+ + +
-
17/01/2003 17/01/2003
10800 10800
36_cpx/02_AG 36_cpx/02_AG
-
L
+
-
-
37 38 38
17/01/2003 6/03/2006 6/03/2006
10800 100000 100000
36_cpx/02_AG CRF22_01A1 CRF22_01A1
+
M F F
+ +
+ +
-
38 38 39
6/03/2006 6/03/2006 30/07/2003
100000 100000 100000
CRF22_01A1 CRF22_01A1 D
+
+
F F H
+ +
+ +
+ +
40 40
7/08/2003 7/08/2003
70300 70300
D D
+
+ +
H
+
+
+
41 42 42
9/08/2005 27/03/2009 27/03/2009
467000 50872 50872
D enkel PR: B enkel PR: B
+ + +
+ + +
+
M H
+ +
+
+ +
43 43 44
7/01/2003 7/01/2003 9/12/2008
24500 24500 12000
enkel RT: 02_AG enkel RT: 02_AG enkel RT: 06_cpx
-
+ +
+
M L
+ +
+ +
-
44 45
9/12/2008 11/05/2006
12000 12700
enkel RT: 06_cpx enkel RT: A1
+
+
M M
+
+ +
+ +
45 46 47
11/05/2006 26/01/2005 25/07/2006
12700 46400 100000
enkel RT: A1 enkel RT: C enkel RT: G
+ + +
+ + +
M M
+
+
+
48 49 50
13/06/2006 14/05/2008 4/04/2003
100000 16600 32500
F F(F1/F2) F1
+ + +
+ + +
M M H
+ + +
+ +
+ + +
51 52
15/01/2007 3/04/2009
60700 57300
F1 F1
+ +
+ +
M H
+ +
+
+ +
52 53 53
3/04/2009 18/10/2006 18/10/2006
57300 100000 100000
F1 G G
+
L L
+ +
+ +
-
54 54 55
5/05/2008 5/05/2008 8/12/2008
30800 30800 68100
G G G
+ +
+ +
F L M
+ +
-
+ +
56 56
24/01/2007 24/01/2007
21300 21300
H H
+
+/-
L M
+ +
+ -
+ -
57 58 59
24/01/2005 21/11/2006 25/03/2009
49800 387000 45519
UD UD UD
+ + +
+ + +
M M H
+ + +
+ + +
+ +
60
8/08/2000
27000
UD
+
+
H
+
+
+
+
+
+ + + + +
+
+
+ + + + + + +
+
+
+ +
+
+
+ +
+ + + +/-
49
Supplement tabel 2. Resultaten fenotypische en genotypische tropismebepaling van CRF 01_AE referentiestalen. Eén staal werd door Geno2Pheno foutief geclassificeerd als X4. De 11/25 methode kon 75 % van de X4 sequenties correct voorspellen. Fenotypische resultaten van MT-2 en GHOST celkweek afkomstig uit Brown, B.K., et al. [44]. NSI: non syncytium inducing; SI: syncytium inducing; FPR: false positive rate. Sample ID
Phenotype
Geno2Pheno FPR (%)
11/25
PSSM
Score
01_AE.TH.90.CM240.U54771
NSI / R5
X4
8.2
N
R5
-3.85
01_AE.TH.96.96TH_M02138.AY713424
SI / X4
X4
0.6
P
X4
7.06
01_AE.TH.96.96TH_NI1046.AY713421
NSI / R5
R5
25.3
N
R5
-4.30
01_AE.TH.96.96TH_NI1149.AY713426
NSI / R5
R5
33
N
R5
-5.51
01_AE.TH.97.97TH_NP1525.AY713420
SI / R5X4
X4
0.2
P
X4
6.76
01_AE.TH.97.97TH_NP1695.AY713419
SI / X4
X4
0.5
P
X4
9.05
01_AE.TH.98.98TH_NP1251.AY713422
NSI / R5
R5
70.5
N
R5
-6.27
01_AE.TH.99.99TH_NI1052.AY713423
SI / X4
X4
0.7
N
X4
9.23
Percentages
50 %
62.5 %
37.5 %
50 %
50
Supplement figuur 1. Fylogenetische analyse van de V3 regio. De bekomen sequenties en enkele referentiesequenties (verkregen op www.hiv.lanl.gov) werden gealigneerd met ClustalW [40] en vervolgens werd een fylogenetische boom aangemaakt met PhyML [39]. Legende: groen: R5, rood: X4, ruit: sequentie ARL, vierkant: referentiesequentie, cirkel: resultaat MT-2 en GHOST beschikbaar [44]; blauw: X4 Geno2Pheno en R5 fenotypisch (discordant resultaat).
51
52
53
54
55
