STUDI KEKERABATAN GALUR-GALUR PADI ADAN HASIL MUTASI SINAR GAMMA MENGGUNAKAN MARKA MOLEKULAR SIMPLE SEQUENCE REPEAT (SSR) Tio Fadel Rafsanjani1, Tri Aminingsih1, Joko Prasetiyono2 1
Program Studi Kimia, FMIPA Universitas Pakuan, Jl. Pakuan PB 452, Bogor, Jawa Barat 16143 2 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Jalan Tentara Pelajar 3A Bogor, Jawa Barat 16111
[email protected] ABSTRAK
ABSTRAK
Salah satu kekayaan plasma nuftah padi di wilayah Provinsi Kalimantan Timur adalah padi lokal Adan yang telah terkenal sampai keluar negeri. Padi Adan berumur 6 bulan sehingga diupayakan diperpendek umurnya agar petani bisa menanamnya 2 kali dalam setahun dengan melakukan iradiasi sinar gamma pada benih padi Adan. Hasil mutasi padi Adan dengan iradiasi sinar gamma perlu dianalisis secara molekuler dengan marka Simple Sequence Repeats (SSR) untuk membandingkan antara padi Adan hasil mutasi dengan padi Adan tetua, sehingga menunjukkan perubahan genetik yang terjadi akibat dari iradiasi sinar gamma. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari keragaman genetik padi Adan hasil mutasi dengan iradiasi sinar gamma yang berumur genjah. Bahan yang digunakan adalah DNA padi Adan generasi M4 sebanyak 9 sampel dan generasi M2 sebanyak 10 sampel, DNA padi IR64 dan Nipponbare. Padi Adan generasi M4 dan M2 merupakan tanaman terpilih berumur sekitar 4 bulan, lebih cepat dua bulan dibandingkan dengan tetuanya. Isolasi DNA dilakukan pada daun padi yang masih muda. DNA padi hasil isolasi diuji kualitasnya dengan elektroforesis gel agarosa, sedangkan konsentrasi dan kemurniannya dengan spektrofotometer. Amplifikasi DNA padi dengan PCR menggunakan 78 primer untuk padi Adan generasi M4 dan 48 primer untuk padi Adan generasi M2 kemudian dielektroforesis dengan gel poliakrilamida lalu direndam dalam larutan Et-Br dan pita DNA divisualisasikan dengan UV-transilluminator. Skoring pita DNA yang terlihat diubah dalam bentuk bilangan biner kemudian diolah dengan program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versi 2.02-pc yang menghasilkan dendrogram kekerabatan. Hasil penelitian yang ditampilkan dalam dendogram menunjukkan mutan padi Adan generasi M4 yang paling dekat kekerabatannya dengan tetua berkode A28 dengan kesamaan genetik sebesar 0,743 sedangkan yang paling jauh dengan tetua berkode A50 yang terpisah dari tetua pada kesamaan genetik sebesar 0,680. Mutan padi Adan generasi M2 (BMA1 – BMA9) terpisah dengan padi Adan tetua pada kesamaan genetik sebesar 0,617.
One of the paddy sperm plasma in East Kalimantan province is the local variety named Adan whose popularity has roamed overseas. Adan paddy has 6 months life span as the result of shortening it so the farmers are able to harvest it twice a year by using gamma ray irradiation on the Adan seeds. The result of Adan mutation by this gamma ray irradiation needs to be analyzed molecularly using Simple Sequence Repeats (SSR) marker in order to compare between mutated Adan and precursor Adan, until it shows the genetic change which is happened from gamma ray irradiation. The objection of this research is to observe the various genetics of the almost-ripe Adan mutation by gamma ray irradiation. The substances used are M4 generation DNA of Adan paddy as many as 9 samples and M2 generation for 10 samples, DNA of IR64 paddy and Nipponbare. Adan paddy of M4 and M2 generations are chosen plant which is 4 months old, it’s 2 months faster than the precursor. DNA isolation is done on young paddy leaves. The paddy DNA quality from isolation is tested by agarosa gel electroforesys, while the concentration and purity is tested by spectrophotometer. The paddy DNA amplification by PCR using 78 primaries for Adan paddy from M4 generation and 48 primaries for M2 generation then it is being electroforesys by polyacrylamide gel then immersed in the Et-Br lacquer and the DNA ribbon is visualized by UV-transilluminator. The visible DNA ribbon scoring is changed into binary numbers form and processed with NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) program version 2.02-pc which creates family dendrogram. The result of research is displayed in the dendogram shows that the M4 generation Adan paddy mutation whose family is the closest to precursor coded A28 with the genetic similarity of 0,743, while the furthest to precursor coded A50 apart from the precursor of genetic similarity of 0,680. Adan paddy mutation from M2 generation (BMA1 – BMA9) is separated from the precursor Adan paddy on the genetic similarity of 0,617.
Kata kunci :
Padi Adan, mutasi, iradiasi sinar gamma, simple sequence repeats, dendogram.
Keywords :Adan paddy, mutation, gamma ray irradiation, simple sequence repeats, dendogram.
PENDAHULUAN Salah satu kekayaan plasma nuftah padi di wilayah Provinsi Kalimantan Timur adalah padi lokal Adan yang telah terkenal sampai keluar negeri. Padi Adan yang memiliki cita rasa tinggi ini hanya bisa ditanam di Kecamatan Krayan, Kabupaten Nunukan, Provinsi Kalimantan Timur ( sekarang menjadi Kalimantan Utara) sehingga sering disebut padi Adan Krayan. Beras Adan merupakan beras organik yang dihasilkan dari persawahan di dataran tinggi Krayan yang bersuhu dingin. Padi Adan berumur 6 bulan sehingga petani hanya bisa menanamnya setahun sekali dan 6 bulan selanjutnya setelah panen, petani membiarkan kerbau mencari makan di sawah sehingga tanah sawah seperti telah terolah melalui injakan kerbau dan mendapat pupuk organik dari kotorannya. Penggunaan mutasi sebagai salah satu cara memperbanyak keragaman genetik yang biasa digunakan di dalam program pemuliaan. Sinar radiasi seperti sinar gamma telah banyak dimanfaatkan dalam memperoleh varietas unggul tanaman, salah satunya adalah memperpendek umur berbunga pada padi. Umur padi Adan yang 6 bulan dapat diperpendek agar petani bisa menanamnya 2 kali dalam setahun. Pemendekan umur padi Adan dilakukan dengan benih padi yang diiradiasi sinar gamma dosis 0, 50, 100, 150, 200, dan 250 Gy. Ternyata padi Adan yang mendapat perlakuan iradiasi sinar gamma lebih pendek umur berbunganya dibandingkan padi Adan yang tidak diiradiasi. Hal ini menunjukkan perlakuan mutasi telah merubah susunan basa-basa nitrogennya. Setiap dosis memiliki 500 benih yang dikecambahkan. Benih padi Adan dengan dosis 250 Gy sangat sedikit yang tumbuh dan tidak menghasilkan bulir padi, sedangkan benih dengan dosis 100 Gy, 150 Gy dan 200 Gy memperlihatkan pemendekan umur, tetapi tingkat kehampaan bulir padinya masih tinggi. Benih padi Adan yang berhasil tumbuh kemudian diseleksi dan menghasilkan 2 generasi yaitu generasi M4 dengan dosis 100 Gy dan 150 Gy dan generasi M2 yang berasal dari keturunan benih dengan dosis 200 Gy (Prasetiyono et al., 2012).
Hasil mutasi dari padi Adan perlu dilakukan analisis molekuler untuk membandingkan perbedaannya dengan padi Adan tetua sehingga menunjukkan perubahan yang terjadi akibat dari iradiasi sinar gamma. Analisis molekuler padi hasil mutasi dapat dilakukan memakai marka molekuler. Marka molekuler bisa mengidentifikasi keragaman genetik dan kekerabatan inter atau antar spesies atau varietas (Wulansari, 2014). Marka molekuler Simple Sequence Repeats (SSR) saat ini masih merupakan marka yang paling populer digunakan dalam studi genetik dan pemuliaan karena berbagai keunggulannya, diantaranya lokasinya yang menyebar di seluruh genom tanaman, multi alelik, memerlukan DNA dalam jumlah dan kemurnian kecil serta mudah diamplifikasi dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Aplikasi marka molekuler SSR telah banyak digunakan untuk mengidentifikasi keragaman genetik beberapa macam plasma nutfah tanaman, seperti pada sorghum, jagung, kedelai, padi beras merah lokal, gandum, kelapa sawit, dan padi (Tasma dan Arumsari, 2013; Dualembang et al., 2011). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari keragaman genetik padi Adan hasil mutasi dengan iradiasi sinar gamma yang berumur genjah. Padi Adan generasi M4 dianalisis dengan menggunakan 78 marka SSR dan padi Adan generasi M2 dianalisis dengan menggunakan 48 primer SSR. CARA KERJA Alat dan Bahan Alat yang dipakai untuk isolasi DNA padi adalah gunting, tabung mikro, mortar dan alu, mikropipet, waterbath, rak tabung mikro, sterofom dan sentrifuse. Alat yang dipakai untuk uji konsentrasi DNA adalah spektrofotometer. Alat yang dipakai untuk amplifikasi DNA adalah PCR T100 thermalcycler dan 96-plate. Alat yang dipakai untuk elektroforesis adalah neraca analitik,
gelas ukur, pengaduk magnet, gelas piala, tissue, kertas film, kertas alumunium, microwave, peralatan elektroforesis vertikal dan horisontal, peralatan UV-transilluminator dan penggoyang barnstead thermolyne. Bahan – bahan yang dipakai adalah DNA padi Nipponbare, DNA padi IR64, DNA padi Adan tetua, 17 jenis DNA padi Adan hasil mutasi (Tabel 1 dan Tabel 2), primer PCR, ddH2O, Aquades, Nitrogen cair, Tris HCl, EDTA, NaCl, SDS, Natrium bisulfit, Etanol absolut, Chisam, NaOAc, Etanol 70%, Agarose, TBE, Loading Dye, Marker 100bp, Marker 50ng/μL, EtBr, Akrilamida, APS, TEMED, Bis-akrilamida, Asam borat, bufer PCR, dNTPS, GcRich, Mg2+ dan taq DNA.
Tabel 1. Padi Adan Generasi M4
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Galur Padi Adan A25 A27 A28 A50 A51 A88 A93-1 A93-2
Keterangan Tetua Mutan 100 Gy Mutan 100 Gy Mutan 100 Gy Mutan 150 Gy Mutan 150 Gy Mutan 150 Gy Mutan 150 Gy Mutan 150 Gy
Tabel 2. Padi Adan Generasi M2 No
Galur
Keterangan
1
Padi Adan
Tetua
2
Nipponbare
Tetua
Isolasi DNA
3
IR64
Tetua
DNA padi diekstrak dari daun dengan ditambahkan nitrogen cair di dalam mortar kemudian digerus sampai menjadi halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL yang telah ditandai kemudian ditambahkan bufer ekstrak 700 µL. Campuran diinkubasi pada suhu 650C selama 15 menit dan tabung mikro dibolak – balik setiap 5 menit. Larutan chisam ditambahkan sebanyak 750 µL dan NaOAc sebanyak 100 µL kemudian divorteks. Campuran disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan (cairan bening yang berada di fase atas) ke tabung mikro 1,5 mL dan ditambahkan etanol absolut 2 kali volume supernatan. Campuran di bolak – balik secara perlahan kemudian disentrifugasi selama 5 menit dan dibuang cairannya. Pelet yang tersisa dicuci dengan etanol 70% sebanyak 500 µL kemudian disentrifugasi selama 1 menit kemudian dibuang cairannya dan pelet dikeringkan pada suhu ruang selama semalam. Pelet dilarutkan dengan ddH2O sebanyak 1 mL.
4
BMA1
5
BMA2
6
BMA3
7
BMA4
8
BMA5
9
BMA6
10
BMA7
11
BMA8
12
BMA9
Uji Kualitas, Konsentrasi dan Kemurnian DNA Sampel DNA padi yang telah diekstrak diuji kualitasnya dengan memakai
Berasal dari satu tanaman M1 yang memiliki umur paling genjah di lapangan. Tanaman M1 itu berasal dari perlakuan iradiasi sinar gamma dengan dosis 200 Gy
elektroforesis gel agarosa. DNA sebanyak 3 µL dicampurkan dengan loading dye 2 µL dan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa yang sudah terendam oleh bufer TBE. Elektroforesis dijalankan pada arus listrik 120 volt selama 30 menit. Pita DNA bisa terlihat dengan mencelupkan gel hasil elektroforesis ke dalam larutan etidium bromida dan divisualisasi oleh sinar UV pada λ 300 nm. Pengujian kuantitasnya dengan memakai spektrofotometer. Spektofotometer dipersiapkan dengan larutan blanko berisi ddH2O selanjutnya sampel DNA padi dipipet sebanyak 2 µL dan dilarutkan dalam 200 µL
ddH2O.
Absorbansi DNA diukur pada λ 260 nm. Amplifikasi DNA Dengan PCR Untuk melakukan amplifikasi PCR diperlukan DNA 3 µL, primer 2 µL dan mix PCR 15 µL yang terdiri dari ddH2O 11,975 µL, bufer PCR 2 µL, dNTPS 0,2 µL, GcRich 0,5 µL, Mg2+ 0,2 µL dan taq DNA 0,125 µL. Reaksi PCR-SSR melalui 3 tahap yang kondisinya disesuaikan dengan DNA padi yaitu denaturasi awal pada suhu 940C selama 2 menit, annealing pada suhu 550C selama 1 menit, ekstensi pada suhu 720C selama 2 menit dan berulang selama 35 siklus dengan perubahan denaturasi selama 1 menit selama siklus berlangsung dan di akhir siklus penambahan waktu ekstensi selama 10 menit. Elektroforesis Vertikal Gel poliakrilamida dibuat dengan komposisi akrilamida-bisakrilamida 8% 50 mL, amonium persulfat 10% 500 µL dan TEMED 50 µL. Larutan dituangkan segera ke dalam sandwich plate yang telah dibersihkan dengan air dan etanol. DNA hasil amplifikasi PCR ditambahkan 5 µL loading dye kemudian dipipet 3 µL dan dimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk di dalam gel poliakrilamida yang telah direndam dalam larutan bufer. Elektroforesis dilakukan pada 90 volt selama 100 menit. Pita DNA bisa terlihat dengan mencelupkan gel hasil elektroforesis ke dalam larutan etidium bromida dan divisualisasi oleh sinar UV pada λ 300 nm Analisis Data Analisis data dilakukan berdasarkan hasil skoring pola pita DNA yang muncul pada gel. Hasil skoring dalam bentuk data biner ditentukan dari pita DNA yang sejajar atau segaris antar pita DNA, jika terdapat pita diberi skor 1 dan jika tidak terdapat pita diberi skor 0. Data biner dianalisis dengan menggunakan program komputer NTSYS-pc versi 2.02.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi Isolasi DNA hanya dilakukan pada padi Adan generasi M4 dengan metode Dellaporta et al. (1983) yang telah dimodifikasi. Sampel dibekukan dengan nitrogen cair kemudian DNA diekstrak dari sampel dengan menghancurkan dinding sel secara kimiawi dengan larutan bufer ekstrak yang terdiri dari Tris-Cl, NaHSO3, EDTA, SDS dan NaCl. TrisHCl berfungsi sebagai bufer penyangga kestabilan pH. NaHSO3 akan meningkatkan daya presipitasi DNA terhadap alkohol dingin (Wulansari, 2014). EDTA akan mengikat ion magnesium yang merupakan kofaktor enzim DNAse. SDS (sodium dodecyl sulfate) akan mendenaturasi protein dari membran dan dinding sel serta mengurangi aktivitas enzim DNAse tetapi tidak mampu menghilangkan polisakarida. (Nurkamila dan Pharmawati, 2014). NaCl akan mengurangi afinitas protein dengan DNA melalui melemahkan ikatan antara kutub positif di protein dengan kutub negatif fosfat di DNA, sehingga DNA mudah dipisahkan dari protein (Schleif, 1993). DNA dan pengotornya dipisahkan dengan penambahan larutan Chisam (Kloroform-isoamil alkohol) dan NaOAc. Kloroform-isoamil alkohol berfungsi mendenaturasi protein dan polisakarida. NaOAc berfungsi untuk membantu pengendapan DNA sehingga terpisah dari RNA dan protein. Sentrifugasi akan memisahkan campuran larutan menjadi 2 lapisan. Pengotor berupa endapan berada di lapisan dasar dan DNA berupa cairan berada di lapisan atas. Larutan DNA diambil dan ditambahkan etanol absolut sebanyak 2x volume larutan agar semua DNA terendapkan. Etanol absolut akan melarutkan semua bahan pengotor, kecuali DNA. DNA akan mengendap setelah disentrifugasi. DNA dicuci dengan etanol 70% sehingga didapatkan DNA dengan kemurnian tinggi (Fatchiyah et al., 2011). Pelet DNA yang dihasilkan berbentuk endapan berwarna putih dan ada beberapa pelet DNA yang berwarna merah sehingga perlu dimurnikan lagi dengan ditambahkan chisam dan NaOAc karena pelet
tersebut masih mengandung RNA, protein atau pengotor lainnya dan dilakukan pencucian ulang dengan etanol absolut dan etanol 70%. Hasil Uji Kualitas DNA DNA yang sudah diisolasi diuji kualitasnya dengan elektroforesis memakai gel agarosa. Gambar 1 memperlihatkan hasil deteksi DNA padi Adan generasi M4 yang dielektroforesis memakai gel agarosa. Konsentrasi marker yang dipakai adalah 50 ng/μl. Profil DNA padi Adan pada kolom nomor 5 (kode A50) tidak terdapat pita DNA dikarenakan konsentrasinya yang terlalu kecil, sedangkan pita DNA pada kolom nomor 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 dan 9 berpendar terang yang menandakan tingginya kontaminan polisakarida atau RNA yang disebut dengan istilah fire type (Pharmawati, 2009) dan terdapat pula fragmen smear. Fragmen smear adalah fragmen yang muncul akibat terpotongnya untaian DNA selama proses isolasi, baik secara mekanik atau enzimatis oleh enzim Dnase (Wulansari, 2014).
pada kolom nomor 3 (IR64) dan 7 (BMA4) menampilkan pita DNA yang paling tebal yang menandakan konsentrasi DNA paling tinggi dan pada kolom nomor 1, 4, 5, 6, 8 sampai 12 menampilkan pita DNA yang tipis yang menandakan konsentrasi DNA kecil. Fragmen smear masih terlihat di semua sampel DNA
Gambar 2. Profil elektroforesis hasil isolasi DNA padi Adan generasi M2 dengan gel agarosa Keterangan gambar : M : Marker ( λ DNA ) 1 : Padi Adan tetua 2 : Padi Nipponbare 3 : Padi IR64 4-12 : Padi BMA 1 sampai 9 Hasil Uji Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Gambar 1. Profil elektroforesis hasil isolasi DNA padi Adan generasi M4 dengan gel agarosa Keterangan gambar : M: Marker ( λ DNA ) 5: Padi A50 1: Padi Adan tetua 6: Padi A51 2: Padi A25 7: Padi A88 3: Padi A27 8: Padi A93-1 4: Padi A28 9: Padi A93-2
Hasil deteksi DNA padi Adan generasi M2 yang dielektroforesis memakai gel agarosa dapat dilihat pada Gambar 2. Pita DNA yang dihasilkan terlihat bersih. Hal ini menunjukkan hasil ekstraksi DNA tersebut relatif baik (tanpa adanya kontaminan RNA maupun polisakarida). Profil pita DNA pada kolom nomor 2 (Nipponbare) menunjukkan tidak terdapatnya pita DNA dikarenakan konsentrasinya yang terlalu kecil, sedangkan
Konsentrasi DNA ditentukan dari perbandingan absorbansi pada λ260 nm untuk DNA atau RNA dan absorbansi pada λ280 nm untuk kontaminan protein atau fenol. Nilai kemurnian DNA berkisar 1,8 - 2,0 (Fatchiyah et al., 2011). Konsentrasi dan kualitas DNA yang diperoleh dipengaruhi oleh teknik ekstraksi yang digunakan, pengalaman dan tingkat keterampilan dalam menangani proses ekstraksi tersebut. Tabel 3 memperlihatkan nilai konsentrasi DNA padi Adan generasi M4 dan M2. Semua nilai kemurnian DNA hasil isolasi padi Adan generasi M4 dan M2 yang didapatkan adalah kurang dari 1,8. Hal ini memperlihatkan bahwa kemurnian DNA yang didapatkan sangat rendah, tetapi tidak mengganggu dalam proses amplifikasi PCR karena metode SSR tidak mengharuskan memakai DNA dengan kemurnian tinggi (Dualembang et al., 2011).
Tabel 3. Konsentrasi dan Kemurnian DNA Padi Adan Generasi M4 dan M2
i M4
asi
34 14 13 36 37 45 57 54 06
Generasi M2 Kemurnian DNA Å260/Å280 1,1650 0,8880 0,8238 1,4081 1,3126 1,2753 0,5371 0,3914 0,6483
Kode Padi AD Nipponbare IR64 BMA1 BMA2 BMA3 BMA4 BMA5 BMA6 BMA7 BMA8 BMA9
Konsentrasi Kemurnian DNA DNA (μg/mL) Å260/Å280 2081,2891 56,6055 218,7028 179,0373 147,0967 129,0536 84,5911 100,4930 177,1995 220,8066 252,9073 230,1988
1,6341 0,6763 0,5551 0,9179 1,0729 0,6815 0,6706 0,3302 0,5268 0,6080 0,8165 0,9214
Hasil Amplifikasi DNA dengan PCR DNA padi diamplifikasi dengan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) memakai marka molekuler SSR (Simple Sequence Repeat), dimana marka ini memiliki banyak primer yang berbeda. Produk PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel poliakrilamida. DNA padi Adan generasi M4 diamplifikasi menggunakan 78 primer. Setiap primer akan memperlihatkan hasil amplifikasi yang berbeda pada DNA target karena primer
menempel pada cetakan DNA dengan urutan nukleotida yang berbeda. Perbedaan letak pita DNA antara DNA padi Adan tetua dengan mutan inilah yang akan menjadi tanda seberapa besar mutasi yang terjadi. Perbedaan letak pita DNA hasil amplifikasi PCR pada padi Adan generasi M4 dapat dilihat dalam Gambar 3. Primer RM524 menunjukkan 4 lokus yaitu 2 pita DNA pada kolom nomor 4, kemudian 1 pita DNA pada kolom nomor 7, sedangkan pada kolom nomor 5, 6, 8 dan 9 terdapat 1 pita DNA yang saling sejajar dan pada kolom nomor 1, 2 dan 3 tidak terdapat pita DNA. Primer RM523 menunjukkan 1 lokus yaitu terdapat 1 pita DNA yang sejajar pada kolom nomor 1, 5 sampai 9 dan pada kolom nomor 2, 3 dan 4 tidak terdapat pita DNA. Primer RM488 menunjukkan 7 lokus yaitu terdapat 1 pita DNA yang sejajar pada semua kolom, kemudian terdapat 3 pita DNA yang sejajar pada kolom nomor 2 dan 3, kemudian 3 pita DNA lagi yang sejajar pada kolom nomor 1, 4 sampai 9.
Gambar 3. Profil elektroforesis DNA padi Adan generasi M4 hasil amplifikasi PCR dengan primer RM524, RM523 dan RM488
DNA padi Adan generasi M2 diamplifikasi menggunakan 48 primer. Letak pita DNA hasil amplifikasi PCR pada padi Adan generasi M2 dapat dilihat dalam Gambar 4. Primer RM160 tidak memperlihatkan 1 pita DNA sama sekali, ini menandakan bahwa primer RM160 tidak menempel pada DNA target, karena pada DNA target tidak terdapat nukelotida yang komplementer dengan nukelotida pada primer, sehingga tidak terjadi proses amplifikasi DNA target saat PCR. Primer RM160 diganti dengan primer yang lain yaitu RM 205. Primer RM 160 berada pada kromosom9 dengan jarak 82,4 cM dan Primer
RM 205 berada pada kromosom9 dengan jarak 114,7 cM, karena itulah primer RM 205 dipilih untuk menggantikan primer RM160. Primer RM185 menunjukkan 9 lokus yaitu 2 pita DNA yang sejajar pada kolom nomor 4 sampai 12, kemudian 1 pita DNA yang terpisah masing-masing terdapat dalam 3 kolom yaitu pada kolom nomor 2, kolom nomor 4 dan kolom nomor 5, kemudian 1 pita DNA yang sejajar dalam 4 kelompok kolom antara lain pada kolom nomor 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 sampai 12, kemudian pada kolom nomor 1, 3 dan 11, kemudian pada kolom nomor 2, 6, 7, 8 dan 10, kemudian terakhir pada kolom nomor 1, 3, 4, 6 sampai 12. Primer RM187 menunjukkan 13 lokus yaitu 3 pita DNA pada kolom nomor 2, kemudian terdapat 3 pita DNA lagi pada kolom nomor 3, kemudian 1 pita DNA pada kolom nomor 10, kemudian 2 pita DNA yang sejajar pada kolom nomor 1, 4 sampai 9, 11 dan 12, kemudian kemudian 1 pita DNA yang sejajar dalam 4 kelompok kolom antara lain pada kolom nomor 2 dan 4, kemudian pada kolom nomor 6, 9 sampai 12, kemudian pada kolom nomor 1, 2 dan 4, kemudian terakhir pada kolom nomor 1, 4, 5, 6, 11 dan 12.
Gambar 4. Profil elektroforesis DNA padi Adan generasi M2 hasil amplifikasi PCR dengan primer RM160, RM185 dan RM187
Analisis Kekerabatan Padi Adan Analisis data dilakukan berdasarkan hasil skoring pola pita DNA yang muncul pada gel. Hasil skoring ditentukan dari pita DNA yang sejajar atau segaris antar pita DNA, jika terdapat pita diberi skor 1 dan jika tidak terdapat pita diberi skor 0, kemudian data tersebut dimasukkan ke dalam program komputer NTSYS-pc versi 2.02 yang akan menampilkan kesamaan genetik dalam bentuk dendogram. Semakin besar koefisiennya, maka
semakin dekat kekerabatan padi Adan mutan dengan padi Adan tetuanya secara genetik. Semakin kecil koefisiennya, maka semakin jauh kekerabatan padi Adan mutan dengan padi Adan tetuanya secara genetik. Salah satu contoh analisis data yang dilakukan pada padi Adan generasi M4 dapat dilihat pada Tabel 4. Analisis kekerabatan sembilan sampel DNA padi Adan generasi M4 dengan program komputer NTSYS-pc versi 2.02 menghasilkan dendogram yang dapat dilihat pada Gambar 5. Dendogram ini memperlihatkan dari sembilan sampel terbagi menjadi 2 kelompok pada kesamaan genetik sebesar 0,680. Kelompok I terdiri dari 4 aksesi dan kelompok II terdiri dari 5 aksesi. Kelompok I pada kesamaan genetik sebesar 0,722 terbagi menjadi 2 sub kelompok. Sub kelompok pertama terdiri dari 2 aksesi yaitu Adan dan A28. Padi Adan mutan dengan kode A28 memiliki kesamaan genetik sebesar 0,743 dan merupakan yang paling dekat kekerabatannya dengan tetua. Sub kelompok kedua terdiri dari 2 aksesi yaitu A25 dan A27 yang terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,810. Kelompok II pada kesamaan genetik sebesar 0,705 terbagi menjadi 2 sub kelompok. Sub kelompok pertama terdiri dari 4 aksesi yang kemudian pada kesamaan genetik sebesar 0,789 terbagi lagi menjadi 2 kelompok yaitu A51 dengan A88 yang terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,804 dan A93-1 dengan A93-2 yang terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,849. Sub kelompok kedua hanya terdiri 1 aksesi yaitu A50 dan ini merupakan padi Adan mutan yang paling jauh kekerabatannya dengan ketua. Analisis kekerabatan dua belas sampel DNA padi Adan generasi M2 dengan program komputer NTSYS-pc versi 2.02 menghasilkan dendogram yang dapat dilihat pada Gambar 6. Dendogram ini memperlihatkan dari dua belas sampel terbagi menjadi 2 kelompok pada kesamaan genetik sebesar 0,617. Kelompok I terdiri dari 2 aksesi dan kelompok II terdiri dari 10 aksesi. Kelompok I terdiri dari Adan dan IR64, yang terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,619. Kelompok II pada kesamaan genetik sebesar 0,659 terbagi menjadi 2 sub kelompok. Sub kelompok pertama hanya terdiri dari 1 aksesi yaitu Nipponbare. Sub
kelompok kedua terdiri dari 9 aksesi dimana pada kesamaan genetik sebesar 0,75 terbagi menjadi 2 sub kelompok lagi. Sub kelompok yang pertama terdiri 6 aksesi yaitu BMA1, BMA6, BMA7, BMA8, BMA9 dan BMA3. BMA3 terpisah dari kelompok pada kesamaan genetik sebesar 0,779, kemudian BMA1 ikut terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,786, sehingga tersisa 4 aksesi. BMA9 terpisah dari kelompok pada kesamaan genetik sebesar 0,795, kemudian BMA8 ikut terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,820, sehingga
tersisa 2 aksesi yaitu BMA6 dan BMA7 yang terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,829. Sub kelompok yang kedua terdiri 3 aksesi yaitu BMA2, BMA4 dan BMA5. BMA 5 terpisah dari kelompok pada kesamaan genetik sebesar 0,811 sedangkan BMA2 dan BMA4 terpisah pada kesamaan genetik sebesar 0,844. Padi Adan mutan (BMA1 – BMA9) hanya memiliki kesamaan genetik sebesar 0,617 dengan padi Adan Tetua.
Tabel 4. Hasil skoring pada pita DNA hasil amplifikasi PCR DNA padi Adan generasi M4 dengan Primer RM524. Kode Primer
Padi Adan 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Adan 25 27 28 51 88 93-1 93-2 50 0 0 0 1 0 0 0 0 0 RM524
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
Gambar 5. Dendogram kekerabatan padi Adan generasi M4
Gambar 6. Dendogram kekerabatan padi Adan generasi M2 Pemakaian DNA padi Nipponbare dan IR64 adalah sebagai pembanding dengan padi Adan mutan. Padi Nipponbare termasuk padi Japonica yang dipakai dalam analisis molekuler karena ukuran genom padi ini relatif kecil (430 Mbp), mudah ditransformasi, serta memiliki ketersediaan informasi molekuler dan genetik. Padi IR64 termasuk padi Indica yang merupakan varietas unggul dan disukai oleh petani karena umur berbunganya cepat (Risky, 2014). KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan dendogram yang didapatkan dari penelitian dapat disimpulkan bahwa : Padi Adan generasi M4 yang paling dekat kekerabatannya dengan padi Adan tetua adalah A28 dengan besar kesamaan genetiknya sekitar 0,743 sedangkan yang paling jauh adalah A50 yang terpisah dari padi Adan tetua pada kesamaan genetiknya sekitar 0,680. Padi Adan generasi M2 (BMA1 – BMA9) hanya memiliki kesamaan genetik sekitar 0,617 dengan padi Adan tetua. Padi Adan tetua dan IR64 memiliki kesamaan genetik sekitar 0,619. Padi Adan mutan dan Nipponbare memiliki kesamaan genetik sekitar 0,659.
Metode dari penelitian ini bisa diterapkan dalam penelitian lain yang meneliti tentang keragaman genetik pada galur-galur tanaman padi atau tanaman lain, jika tanaman itu bukan padi maka harus memakai primer yang khusus untuk tanaman tersebutDAFTAR PUSTAKA 1.
Afrilia. 2014. Http://kaltim.litbang. pertanian.go.id/ind/index.php?option=com content&view=article&id=370:padiadan permatahijaudarikrayan&catid=4:infoaktu al&Ite mid=5/ di akses pada tanggal 21 Agustus 2015 jam 17.31 WIB. 2. Anonim. 2013. Rice Almanac, 4th edition. Los Banos (Philippines) : international rice research institute. 3. Dualembang, E., Y. Musa dan M. Azrai. 2011. Karakterisasi Genetik Koleksi Plasma Nutfah Sorgum (Sorghum Bicolor L. Moench) Berbasis Marka SSR (Simple Sequence Repeats). Journal of The Indonesia Nurtrition Association. 1 – 15. 4. Fatchiyah., E.L. Arumingtyas, S. Widyarti dan S. Rahayu. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analis. Jakarta:Penerbit Erlangga. 5. Gramene. 2002. SSR Primers from McCouch et al. Http://archive.gramene. org/markers/microsat/ssr.html. 11 September 2015. Jam 10.59 WIB.
6. Handoyo, D. dan A. Rudiretna. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas. IX (1); 17 – 29. 7. Kroschwitz, J.I. dan M. Winokar. 1990. Chemistry General, Organic, Biological 2nd Edition. : York Graphic Service Inc. 8. Mulsanti, I.W., M. Surahman, S. Wahyuni dan D.W. Utami. 2013. Identifikasi Galur Tetua Padi Hibrida dengan Marka SSR Spesifik dan Pemanfaatannya dalam Uji Kemurnian Benih. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan. XXXII (1). 9. Nuraida, D. 2012. Pemuliaan Tanaman Cepat dan Tepat Melalui Pendekatan Marka Molekuler. El-Hayah. II (2) ; 97 – 103. 10. Nurkamila, U.S. dan M. Pharmawati. 2014. Ekstraksi DNA Dari Herbarium Anggrek. Jurnal Simbiosis. II (1); 135 – 146. 11. Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi Ekstraksi DNA dan PCR-RAPD Pada Grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi. XIII (1) ; 12 -16. 12. Prasetiyono, J., S. Moeljopawiro, E. Pratiwi, S. Salma, Syakhril dan Riyanto. 2012. Pemendekan Umur Padi AdanKrayan Menggunakan Teknik Radiasi Sinar Gamma. Prosiding Seminar Nasional Sumber Daya Genetik dan Pemuliaan Tanaman. 15 – 22. 13. Prasetiyono, J dan Tasliah. 2004. Marka Mikrosatelit: Marka Molekuler yang Menjanjikan. Jurnal Tinjauan Ilmiah Riset Biologi dan Bioteknologi Pertanian. VI (2). 14. Prasetiyono, J. 2013. Memperpendek Umur Padi Lokal Adan dengan Teknik Bioteknologi. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian. XXXV (6); 6 – 8. 15. Rafina, I. 2012. Beras Adan Tana Tam, Dataran Tinggi Borneo. Http://www.wwf.or.id/program/inisiatif/so cial_development/greenandfairproducts/be ras_adan_tana_tam/. 11 Agustus 2015. Jam 12.29 WIB. 16. Remelia, M. 2008. Analisis Insersi TDNA Pembawa Transposon AcIDs pada
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
T0 dan Aktivitas Ds pada T1 Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Kultivar Nipponbare. Skripsi. Departemen Biokimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia. Depok. Schleif, R. 1993. Genetics and Molecular Biology Second Edition. London: The Johns Hopkins University Press. Silitonga, T.S. 2004. Pengelolaan dan Pemanfaatan Plasma Nuftah Padi di Indonesia. Buletin Plasma Nutfah. X (2); 56 – 71. Soeranto. 2003. Peran Iptek Nuklir Dalam Pemuliaan Tanaman untuk Mendukung Industri Pertanian. Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir P3TM-BATAN. Tasma, I.M. dan S. Arumsari. 2013. Analisis Diversitas Genetik Aksesi Kelapa Sawit Kamerun Berdasarkan Marka SSR. Jurnal Littri. XIX (4); 194 – 202. Wulansari, R. 2014. Studi Kekerabatan dan Morfologi Padi Lokal Adan Hasil Mutasi Sinar Gamma. Skripsi. Departemen Biokimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Yunita, R., N. Khumaida, D. Sopandie dan I. Mariska. 2014. Pengaruh Iradiasi Sinar Gamma Terhadap Pertumbuhan dan Regenerasi Kalus Padi Varietas Ciherang dan Inpari 13. Jurnal Agro Biogen. X (3); 101 – 108. Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Jakarta:Penerbit Erlangga.
