STUDI INTERAKSI Fusarium sp. DENGAN POHON GAHARU (Aquilaria sp.) MENGGUNAKAN PENDEKATAN SITOLOGI
ADE LIA PUTRI
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul ”Studi Interaksi Fusarium sp. dengan Pohon Gaharu (Aquilaria sp.) menggunakan Pendekatan Sitologi” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2011
Ade Lia Putri G351080011
ABSTRACT ADE LIA PUTRI. Studies on Fusarium sp. and Agarwood Trees (Aquilaria sp.) Interaction by Cytological Approach. Supervised by GAYUH RAHAYU and UTUT WIDYASTUTI. The research is aiming to study the pathogenesis mechanism of Fusarium sp. IPBCC. 08.569 on Aquilaria sp. seedling in respect to the respons of the host towards Fusarium sp. IPBCC. 08.569 infection. Penetration mechanism was determined by observing the appresorium formation on the bark surface in vitro, the potency to produce lignocellulase and toxin. While colonization was studied by histopathological methods using both staining process and SEM. The respons of the tree towards infection was observed at either cellular by histochemestry or organ level using scoring system. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 showed no appresorium formation but had lignocellulolytic activity. Hypersensitivity reaction of tobacco leaf towards crude extract of extracellular substance indicated that Fusarium sp. IPBCC. 08.569 produce toxin. Direct penetration into the bark was not found, therefore penetration had to be through wounded area. While modification of hyphae was observed in the living cells of the wood tissue (parenchyma rays, included phloem, and pith) these cells might contain terpenoid as conversion of starch. These cellular changes might be observed as discolored wood and the wood became scented. Discolored wood was extended outside the colonization area, indicated that the dark substance might be part of hypersensitive respons to delimit the infection. Using scoring system, after inoculation Fusarium sp. IPBCC. 08.569 can be stated as wound infection fungi with limited colonization in living tissue and induce terpenoid formation in certain tissue. Key word: Aquilaria sp, colonization, Fusarium lignocellulase, living cells, terpenoid, toxin.
sp.
IPBCC. 08.569,
RINGKASAN ADE LIA PUTRI. Studi Interaksi Fusarium sp. dengan Pohon Gaharu (Aquilaria sp.) menggunakan Pendekatan Sitologi. Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan UTUT WIDYASTUTI. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang mekanisme patogenesis Fusarium sp. IPBCC. 08.569 terhadap pohon gaharu (Aquilaria sp.) dalam proses pembentukan gaharu ditingkat sel dan organ. Mekanisme penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 dipelajari dengan mengamati kemungkinan cendawan membentuk apresorium di permukaan kulit kayu, menghasilkan enzim lignoselulase (mencakup enzim polifenol oksidase, lakase, tirosinase, dan CMCase), serta melihat kemampuan cendawan dalam menghasilkan toksin. Sedangkan pengamatan kolonisasi dipelajari dengan metode histopatologi menggunakan pewarnaan biru tripan dan mikroskop pemindai elektron (SEM). Respon tanaman terhadap infeksi cendawan pada tingkat sel dan jaringan diamati dengan uji histokimia sedangkan pada tingkat organ ditentukan dengan sistem skor terhadap tiga parameter yaitu klorosis daun, perubahan warna kayu, dan terbentuknya aroma wangi. Selain mengamati terjadinya perubahan warna kayu, pengamatan juga dilakukan pada panjang dan dalam zona perubahan warna kayu. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak membentuk apresorium, namun memiliki aktifitas lignoselulolitik. Reaksi hipersensitifitas daun tembakau terhadap ekstrak kasar dari substansi ekstraseluler membuktikan bahwa Fusarium sp. IPBCC. 08.569 menghasilkan toksin. Penetrasi secara langsung tidak ditemukan, oleh karena itu penetrasi harus melalui pelukaan. Enzim lignoselulolitik yang dihasilkan diduga berperan dalam proses penetrasi. Sedangkan toksin yang dihasilkan diduga berperan dalam membantu proses penetrasi atau perkembangan infeksi. Kolonisasi cendawan terdapat di dalam parenkima jejari dan included phloem pada pengamatan 7 dan 14 hsi, kemudian berlanjut ke daerah empelur pada 21 hsi. Di luar daerah inokulasi, kolonisasi juga ditemukan pada jaringan xilem yang sama. Ketika modifikasi hifa ditemukan di dalam sel hidup pada jaringan kayu (parenkima jejari, included phloem, dan empelur), sel membentuk senyawa terpenoid yang menggantikan akumulasi pati. Perubahan yang terjadi pada tingkat sel ini diduga menyebabkan terjadinya perubahan warna kayu dan terbentuknya aroma wangi. Perubahan warna yang terjadi meluas ke luar daerah infeksi, hal ini mengindikasikan bahwa substansi gelap diduga merupakan respon hipersensitifitas tanaman untuk membatasi infeksi. Setelah menggunakan sistem skor untuk menentukan tingkat pembentukkan gaharu, maka Fusarium sp. IPBCC. 08.569 dapat dinyatakan sebagai cendawan penginfeksi luka dengan kolonisasi terbatas pada jaringan hidup dan menginduksi terbentuknya senyawa terpenoid pada jaringan tertentu. Kata kunci : Apresorium, Aquilaria sp, CMC-ase, empelur, Fusarium sp. IPBCC. 08.569, included phloem, lakase, lignoselulase, polifenol oksidase, tirosinase, toksin, parenkima jejari, terpenoid.
@ Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011 Hak cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar bagi IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
STUDI INTERAKSI Fusarium sp. DENGAN POHON GAHARU (Aquilaria sp.) MENGGUNAKAN PENDEKATAN SITOLOGI
ADE LIA PUTRI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Suryo Wiyono, M.Sc. Agr.
HALAMAN PENGESAHAN Judul Tesis Nama
: Studi Interaksi Fusarium sp. dengan Pohon Gaharu (Aquilaria sp.) menggunakan Pendekatan Sitologi : Ade Lia Putri
NIM
: G351080011
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Gayuh Rahayu Ketua
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. Anggota
Diketahui
Ketua Koordinator Mayor Mikrobiologi
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr. Ir. Gayuh Rahayu
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr.
Tanggal Ujian: 1 Juli 2011
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT yang senantiasa melimpahkan segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tesis yang berjudul “Studi Interaksi Fusarium sp. dengan Pohon Gaharu (Aquilaria sp.) menggunakan Pendekatan Sitologi” merupakan hasil penelitian yang dilakukan di Laboratorium
Bagian
Mikologi
Departemen
Biologi
FMIPA
IPB
dan
Laboratorium Reproduksi Zoologi LIPI Cibinong sejak April 2010 sampai dengan Maret 2011. Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu penyelesaian karya ilmiah ini terutama kepada Dr. Ir. Gayuh Rahayu sebagai pembimbing serta yang telah menyediakan dana penelitian. Ucapan terimakasih juga penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti M.Si. selaku pembimbing kedua, serta Dr. Ir. Suryo Wiyono, M.Sc. Agr selaku penguji yang telah memberikan bimbingan dan saran hingga tersusunnya tesis ini. Penghargaan juga diberikan pada Staf Laboratorium Bagian Mikologi IPB dan Laboratorium Reproduksi Zoologi LIPI Cibinong yang telah banyak membantu dalam melaksanakan penelitian dan penyusunan tesis. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Suami, Ibu, Papa, Da en, Da pi, Abang, Siska dan keluarga besar yang senantiasa memberikan dukungan, kasih sayang, dan doa yang tak ternilai. Kepada Bu dewi, Uni Dezi, Ica, Izul, Lia, Evi, Rina, Riana dan teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, penulis ucapkan terimakasih atas kebersamaan dan bantuannya. Semoga tesis ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2011
Ade Lia Putri
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Mudiak Lolo Kota Muara Labuh Kabupaten Solok Selatan, pada tanggal 18 April 1984 dari ayah Muhamad Yunis dan ibu Nurlaili. Penulis merupakan anak ke empat dari lima bersaudara. Pada tahun 2002 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Muara Labuh dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB untuk program sarjana. Penulis memasuki Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada tahun yang sama. Setelah lulus sarjana pada tahun 2007, penulis bekerja sebagai dosen Biologi di Universitas Bangka Belitung sampai saat ini. Pada tahun 2008 penulis diberi kesempatan untuk melanjutkan pendidikan ke Sekolah Pascasarjana IPB, pada Program Studi Mikrobiologi. Semasa perkuliahan di tingkat sarjana, Penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan sebagai anggota Himpunan Mahasiswa Biologi 2003/2004, anggota
Organisasi
Kewirausahaan
Mahasiswa
Biologi
(BIOWORLD)
2003/2004. Semasa perkulihan sarjana penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Biologi pada Tingkat Persiapan Bersama, Fisiologi Tumbuhan, Botani Umum dan Biologi Cendawan. Semasa perkuliahan di tingkat Pasca Sarjana, penulis juga aktif mengikuti berbagai seminar di bidang Biologi, Mikrobiologi dan Molekuler.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii I
PENDAHULUAN .......................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang........................................................................................ 1 1.2 Tujuan Penelitian .................................................................................... 2 1.3 Hipotesis Penelitian ................................................................................ 2
II
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 3 2.1 Gaharu .................................................................................................... 3 2.1.1 Definisi dan Manfaat Gaharu ...................................................... 3 2.1.2 Gejala Pembentukan Gubal Gaharu ............................................ 3 2.1.3 Cendawan Penginduksi Gaharu .................................................. 4 2.2 Fusarium sp. ........................................................................................... 5 2.3 Patogenesis ............................................................................................. 5 2.3.1 Mekanisme Penetrasi dan Infeksi Patogen ................................. 5 2.3.2 Mekanisme Pertahanan Tanaman dari Serangan Patogen .......... 9 2.4 Studi Sitologi Patogenesis .................................................................... 11
III METODE PENELITIAN ........................................................................... 13 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................. 13 3.2 Bahan dan Alat ..................................................................................... 13 3.3 Metode Penelitian ................................................................................. 13 3.3.1 Persiapan Inokulum Cendawan ................................................ 15 3.3.2 Pengamatan Proses Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 .......................................................................... 15 3.3.3 Respon Aquilaria sp. terhadap Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 .................................................... 20 3.3.4 Analisis Data ............................................................................. 22 IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 23 4.1 Hasil Penelitian ..................................................................................... 23 4.1.1 Proses Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 ...................... 23 4.1.2 Respon Aquilaria sp. terhadap Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 .................................................... 30 4.2 Pembahasan .......................................................................................... 33 V
SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 38 5.1 Simpulan ............................................................................................... 38 5.2 Saran ..................................................................................................... 38
VI DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 39 LAMPIRAN ......................................................................................................... 44
DAFTAR TABEL Halaman 1
Cara penilaian aktivitas hipersensitifitas toksin ......................................... 18
2
Sistem skor respon Aquilaria sp. terhadap inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569....................................................................... 21
3
Kategori tingkat pembentukan gaharu ........................................................ 21
4
Pengaruh perlakuan terhadap zona perubahan warna (mm) kayu Aquilaria sp. ....................................................................................... 32
5
Pengaruh periode inkubasi terhadap zona perubahan warna (mm) kayu Aquilaria sp. ....................................................................................... 32
6
Pembentukan gaharu akibat inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 ......... 33
DAFTAR GAMBAR Halaman 1
Bagan alur penelitian ................................................................................... 14
2
Perkecambahan konidia Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di permukaan kulit kayu Aquilaria sp. utuh. ............................................... 23
3
Persentase perkecambahan konidia Fusarium sp. IPBCC. 08.569 .............. 23
4
Perkecambahan konidia dan hifa penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di permukaan kayu Aquilaria sp. yang dilukai ................. 24
5
Diskolorisasi medium MEAG akibat aktifitas polifenol oksidase .............. 25
6
Diskolorisasi medium MEAT dan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni akibat aktifitas polifenol oksidase ............................... 25
7
Perubahan warna koloni Fusarium sp. IPBCC. 08.569 setelah ditetesi 0,1 M naftol dan 0,1 M p-kresol ......................................... 26
8
Zona jernih yang terbentuk pada medium CMC 1% . ................................. 26
9
Gejala hipersensitifitas daun tembakau . ..................................................... 27
10
Perkembangan hifa dan kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di dalam sel-sel jaringan xilem Aquilaria sp.. ............................................ 28
11
Struktur hifa berfragmentasi menyerupai konidia ....................................... 29
12
Sayatan membujur kayu Aquilaria sp. yang dilukai, serta sayatan melintang dan membujur kayu Aquilaria sp. sehat................ 29
13
Senyawa terpenoid pada sayatan melintang kayu Aquilaria sp. ................. 30
14
Akumulasi butir pati pada sayatan melintang Aquilaria sp. sehat .............. 31
15
Klorosis daun Aquilaria sp. setelah diinokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 ...................................................................... 31
16
Perubahan warna kayu ................................................................................. 32
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi medium dan bahan yang digunakan ................................................ 45 2 Kurva standar glukosa ........................................................................................ 46
I 1.1
PENDAHULUAN
Latar Belakang Gaharu adalah sejenis kayu dengan warna yang khas (coklat-kehitaman) dan
memiliki kandungan kadar damar wangi (Dewan Standar Nasional 1999). Gaharu terbentuk sebagai reaksi pohon gaharu terhadap adanya gangguan biotik atau abiotik. Gangguan biotik yang paling banyak dilaporkan berperan dalam pembentukan gaharu adalah gangguan oleh cendawan salah satunya adalah Fusarium sp. (Gong & Shun 2008; Siregar 2009; Isnaini et al. 2009; Mohamed et al. 2010). Penelitian mengenai gaharu telah banyak dilakukan seperti cendawan yang berasosiasi dengan gejala gubal gaharu, cendawan yang berpotensi menginduksi pembentukan gubal gaharu, formulasi cendawan potensial (Rahayu 2009). Penelitian tentang senyawa yang terkandung dalam gaharu serta jaringan pengakumulasi senyawa akibat infeksi cendawan juga telah dipelajari (Putri et al. 2008; Bhuiyan et al. 2009). Namun demikian, sampai saat ini masih banyak aspek biologi cendawan penginduksi gubal gaharu yang belum digali terutama dalam interaksi dengan inangnya yaitu pohon gaharu. Pada proses interaksi antara cendawan dengan inangnya, patogenesitas cendawan merupakan hal yang terpenting. Keberhasilan cendawan dalam interaksi dengan inangnya bergantung pada strategi cendawan dalam melakukan penetrasi tanaman inangnya (Mendgen & Deising 1993). Interaksi cendawan patogen akan menyebabkan terjadinya perubahan fisiologis pada tanaman yang berdampak terhadap terjadinya perubahan visual pada sel, jaringan, atau organ tanaman. Diantara ketiga perubahan visual yang terjadi, perubahan pada tingkat sel memberikan informasi yang lebih akurat tentang terjadinya perubahan fisiologi saat terjadi interaksi cendawan dengan inangnya (Kunoh 1995). Penggunaan cendawan dalam menginduksi pembentukan gubal gaharu menyebabkan terjadinya perubahan fisiologis pada pohon gaharu. Perubahan fisiologis yang terjadi berupa klorosis daun, perubahan warna kayu di daerah terinfeksi, terbentuknya aroma wangi (Pojanagaroon & Kaewrak 2002; Putri et al.
2
2008) dan adanya akumulasi senyawa golongan terpenoid pada daerah yang diinokulasi (Nobuchi & Siripatanadilok 1991; Putri et al. 2008). Namun studi sitologi tentang infeksi cendawan dan responnya belum pernah dilaporkan. Studi sitologi interaksi patogen dan inangnya dapat dipelajari dengan mengamati terjadinya perubahan-perubahan ultrastruktur dan komposisi di dalam sel tanaman inang secara langsung menggunakan mikroskop cahaya, mikroskop elektron, atau mikroskop konfokal (Kunoh 1995). Studi histopatologi dan histokimia merupakan salah satu pendekatan studi sitologi. Studi ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai perilaku patogen dalam sel inang, sekaligus dapat memberikan dasar pengetahuan mengenai respon fisiologi untuk penelitian selanjutnya ditingkat molekuler (Kunoh 1995). 1.2
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang mekanisme
patogenesis Fusarium sp. IPBCC. 08.569 terhadap pohon gaharu (Aquilaria sp.) dalam proses pembentukan gaharu ditingkat sel dan organ. 1.3
Hipotesis Penelitian Hipotesis dalam penelitian ini adalah Fusarium sp. IPBCC. 08.569
mempenentrasi tanaman Aquilaria sp. secara fisik, enzimatik, atau dengan bantuan toksin. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 mengkolonisasi jaringan tertentu tanaman yang menyebabkan timbulnya respon fisiologis. Respon fisiologis pada tingkat sel dapat diamati berupa deposit senyawa terpenoid. Akumulasi senyawa terpenoid menyebabkan kayu berubah warna dan menghasilkan aroma wangi.
II 2.1 2.1.1
TINJAUAN PUSTAKA
Gaharu Definisi dan Manfaat Gaharu Gaharu dikenal juga dengan nama eaglewood, aloewood, agarwood, dan
jinkoh (Barden et al. 2000). Gaharu adalah sejenis kayu dengan warna yang khas (coklat-kehitaman) dan memiliki kandungan kadar damar wangi (Dewan Standar Nasional 1999). Gaharu berasal dari pohon atau bagian pohon penghasil gaharu sebagai akibat dari gangguan dan proses infeksi yang terjadi baik secara alami atau buatan pada pohon tersebut, umumnya terjadi pada pohon Aquilaria sp. (Ng et al. 1997). Beberapa jenis pohon Aquilaria yang terbukti bisa menghasilkan gubal gaharu adalah A. agalocha, A. beccariana, A. crassna, A. filaria, A. hirta, A. malaccensis, dan A. microcarpa (Ng et al. 1997; Soehartono & Newton 2001). Gaharu digunakan untuk berbagai tujuan seperti bahan dasar industri parfum, bahan kosmetik, dan obat-obatan (Barden et al. 2000). Cina telah memanfaatkan gaharu sejak ratusan tahun yang lalu sebagai obat sakit perut, penghilang rasa sakit, kanker, diare, cegukan, ginjal, dan tumor paru-paru. Di Eropa gaharu digunakan sebagai obat kanker dan di India digunakan sebagai obat tumor usus. Selain itu gaharu juga digunakan untuk kegiatan keagamaan, seperti yang dilakukan oleh umat Budha, Hindu, dan Islam (Barden et al. 2000; Compton & Ishihara 2006). 2.1.2
Gejala Pembentukan Gubal Gaharu Banyak pendapat yang berkembang mengenai proses pembentukan gaharu.
Menurut Ng et al. (1997) gaharu terbentuk karena adanya pelukaan atau pelukaan yang diikuti infeksi cendawan. Mohamed et al. (2010) menemukan pembentukan gaharu yang wangi pada bekas luka yang disertai adanya miselium cendawan. Namun secara umum cendawan banyak dilaporkan berpengaruh dalam proses pembentukan gaharu (Qi et al. 2005). Gaharu dihasilkan tanaman sebagai respon tanaman terhadap adanya cendawan yang masuk ke dalam jaringan tanaman yang terluka (Qi et al. 2005; Bhuiyan et al. 2009). Gejala umum yang ditimbulkan akibat infeksi cendawan diantaranya terjadi perubahan warna pada daerah yang diinfeksi dan klorosis daun (Putri et al. 2008).
4
Gejala yang terjadi bisa teramati beberapa hari setelah tanaman diinokulasi cendawan. Namun, pada pohon gaharu alam yang terbentuk secara alami dan terinfeksi selama bertahun-tahun perubahan warna kayu terbentuk hampir pada semua bagian kayu tapi terjadinya klorosis daun tidak terlihat lagi, sehingga ketika dilihat secara visual tanaman terlihat sehat (Barden et al. 2000). Cendawan yang masuk ke dalam jaringan tanaman gaharu merupakan benda asing sehingga sel tanaman akan menghasilkan suatu senyawa, sebagai respon terhadap serangan patogen (Bhuiyan et al. 2009). Senyawa tersebut berupa resin berwarna coklat dan beraroma harum (Ng et al. 1997). Senyawa utama gaharu adalah seskuiterpenoid (golongan terpenoid) dan turunan peniletil kromon. Kedua senyawa tersebut berperan dalam menghasilkan aroma wangi khas gaharu. Berbagai jenis senyawa seskuiterpeoid dan peniletil kromon telah berhasil diisolasi dari berbagai kayu gaharu. Kelompok seskuiterpen tersebut diantaranya turunan guia dienal, selina-dienone, dan selina dienot, isopronoid, a-guaiene, ahumulene dan d-guaiene (Ishihara et al. 1991; Qi 1995; Michiho 2005; Bhuiyan et al. 2009; Okudera & Ito 2009). Kelompok peniletil kromon diantaranya 6,7dimethoxy-2- (2-phenylethyl chromonne, dan 6-methoxy-2- [2-(4-methoxyphenyl) ethyl] chromone (Qi 1995; Konishi et al. 2002; Qi et al. 2005; Fudai et al. 2009; Okudera & Ito 2009). Senyawa–senyawa tersebut akan menumpuk pada jaringan xilem dan membentuk aroma wangi gaharu. 2.1.3
Cendawan Penginduksi Gaharu Santoso (1996) menyatakan bahwa ada 17 genus cendawan yang telah
berhasil diisolasi dari gubal gaharu alami yaitu Botryodiplodia, Curvularia, Cercosporella, Chaetomium, Cladosporium, Cythospaera, Diplodia, Fusarium, Pestalotia, Papularia, Phialogeniculata, Phytomyces, Pythium, Rhinocladiella, Rhizoctonia, Spidostibella, dan Trichoderma. Siregar (2009) mengisolasi 6 jenis cendawan (Cladosporium sp, Fusarium sp, Mucor sp, Rhizopus sp, Trichoderma sp, dan Sopulariopsis sp.) di Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Erari & Ruimassa (2009) menemukan 3 jenis cendawan (Cochliobolus sp, Fusarium lateritum dan Trichoderma sp.) yang berasosiasi dalam pembentukan gubal gaharu di Provinsi Papua. Isnaini et al. (2009) menemukan 3 jenis cendawan (Fusarium spp, Rhizoctania, Trichoderma) di Kep. Lombok. Selain itu Mohamed
5
et al. (2010) berhasil mengisolasi Cunninghamella, Curvularia, Fusarium dan Trichoderma dari bekas patahan tanaman Aquilaria malaccensis. Diantara banyak cendawan yang berhasil diisolasi dari gubal gaharu, Fusarium sp. merupakan cendawan yang paling dominan (Isnaini et al. 2009). 2.2
Fusarium sp. Fusarium sp. termasuk ke dalam kelompok cendawan bermitospora.
Bentuk spora aseksual (konidia) merupakan ciri utama dari cendawan ini. Fusarium sp. memiliki 2 jenis konidia yaitu mikrokonidia memiliki 0-1 septat sederhana yang terdiri atas satu atau dua sel atau makrokonidia yang terdiri atas beberapa sel (2-10 sel) yang berbentuk seperti bulan sabit. Konidia dibentuk di atas monopialid. Selain membentuk makro dan mikro konidia, Fusarium sp. juga membentuk klamidospora ketika kondisi lingkungan dan bahan makan kurang menguntungkan (Groenewald 2005). Selain dapat menginduksi terbentuknya gaharu, Fusarium sp. merupakan cendawan patogen tanaman yang sering menyebabkan berbagai penyakit pada tanaman seperti busuk pangkal batang, tumor akar (root crown), penyakit pembuluh xilem, dan penyakit pasca panen (Wang & Jeffer 2000; Ploetz 2005). 2.3
Patogenesis Patogenesis merupakan proses perkembangan penyakit mulai infeksi sampai
menghasilkan gejala penyakit (Groenewald 2005). 2.3.1
Mekanisme Penetrasi dan Infeksi Patogen Perkembangan penyakit secara umum diawali dengan tahapan pra infeksi
yang mencakup melekatnya spora dan hifa ke permukaan inang, perkecambahan spora, dan pembentukan struktur penetrasi seperti apresorium. Kemudian dilanjutkan dengan tahapan infeksi dan kolonisasi (Prins et al. 2000; Lee & Bostock 2006). Proses pelekatan inokulan merupakan tahapan awal cendawan melakukan kontak dengan permukaan inang yang akan menentukan keberhasilan proses infeksi (Mendgen & Deising 1993). Proses pelekatan dipengaruhi oleh bahan ekstraseluler dan struktur kimia yang dihasilkan cendawan. Penyusun bahan untuk pelekatan cendawan diperkirakan berupa protein serta glukoprotein yang dapat
6
melindungi spora dari metabolit sekunder yang dihasilkan inangnya. Spora yang telah stabil akan berkecambah dengan membentuk tabung kecambah. (Prins et al. 2000; Li et al. 2005; Lee & Bostock 2006). Spora membutuhkan kondisi lingkungan seperti suhu dan kelembapan yang optimum untuk bisa berkecambah (Prins et al. 2000). Gula dan asam amino yang diekresikan oleh inang dapat mempercepat terjadinya proses perkecambahan (Mendgen & Deising 1993; Prins et al. 2000). Kebanyakan spora bisa langsung berkecambah setelah spora matang dan lepas dari sel pembentukannya, namun beberapa spora lainnya membutuhkan periode dormansi untuk beberapa saat sebelum berkecambah dengan membentuk klamidospora ketika kondisi lingkungan kurang menguntungkan (Groenewald 2005). Proses penetrasi dapat dibagi dua yaitu penetrasi secara aktif dan penetrasi pasif melalui jaringan yang terluka atau terbuka (Prins et al. 2000). Mekanisme penetrasi yang dilakukan oleh cendawan mencakup aktivitas penetrasi secara fisik, enzimatik, dan toksisitas. Mekanisme patogenesis secara fisik terjadi dengan kemungkinan terbentuknya struktur khusus penetrasi seperti apresorium. Apresorium dibentuk pada ujung tabung kecambah sebagai penyangga hifa penetrasi. Terbentuknya apresorium dan hifa penetrasi tergantung pada faktor lingkungan, struktur fisika (hidropobisitas dan topografi) permukaan kayu, dan bahan kimia yang dihasilkan tanaman seperti monomer kutin, etilen, dan lilin (Mendgen & Deising 1993; Dean et al. 1995; Lee & Bostock 2006). Sebagian cendawan akan membentuk apresorium sebelum menembus jaringan inang, namun pada sebagian cendawan tidak membentuk apresorium. Secara umum Fusarium sp. tidak membentuk apresorium (Kang & Buchenenauer 2002 Lagopodi et al. 2002; Kikot et al. 2009). Fusarium oxysporum tidak membentuk apresorium dan tidak mampu menembus permukaan luar tanaman gandum yang masih utuh (Kang & Buchenauer 2002). Ketika cendawan patogen tidak membentuk apresorium, enzim pendegradasi dinding sel diduga berperan dalam proses patogenesis (Mendgen & Deising 1993). Enzim oksidatif dan hidrolitik yang dikeluarkan cendawan berfungsi untuk mengurai dinding sel tanaman menjadi sederhana. Enzim oksidatif merupakan enzim non spesifik yang bekerja melalui mediator bukan protein yang berperan
7
dalam degradasi lignin, sedangkan enzim hidrolitik untuk mendegradasi selulosa dan hemiselulosa yang bekerja pada substrat spesifik (Perez et al. 2002). Enzim perombak lignin tergolong dalam kelompok enzim peroksidase yang mampu mengoksidase gugus non fenolik dalam lignin serta kelompok enzim fenol oksidase yang mampu mengoksidasi gugus δ-dan p-fenol serta gugus aromatik amina menjadi quinon (Hatakka 2001; Lankinen 2004). Contoh enzim peroksidase adalah mangan peroksidase (MnP) mengoksidasi Mn+2 menjadi Mn+3 yang kemudian mengoksidasi unit non fenol menjadi radikal fenoksi. Lignin peroksidase (LiP) yang mengoksidasi unit fenol dan non fenolik lignin melalui pelepasan satu elektron menghasilkan kation dan fenoksi (Hatakka 2001; Lankinen 2004). Sedangkan enzim fenol oksidase dibagi menjadi dua. Kelompok pertama terdiri dari enzim polifenol oksidase, tirosinase, dan katekol oksidase, kelompok kedua adalah enzim lakase (Ogel et al. 2006). Enzim selulase dibagi dalam tiga kelompok yang pertama endoglukanase atau endo-ß-1,4-glukanase (disebut juga Cx, CMC (Carboxymethyl Cellulose)-ase atau 1,4- ß-D-glukan-4-glukanohidrolase), kedua eksoglukanase atau ekso-ß-1,4glukanase, dan yang ketiga 1,4-glukosidase (Lymar et al. 1995; Perez et al. 2002). Enzim endoglukanase menghidrolisis molekul selulosa secara acak dan menyerang disembarang lokasi dan menghasilkan oligosakarida dengan fragmen yang berbeda membentuk ujung rantai baru (Lynd et al. 2002). Enzim eksoglukanase bekerja terhadap lokasi khusus dekat ujung yang tidak tereduksi dan menghasilkan fragmen dengan bobot molekul yang rendah, melepaskan unitunit selobiosa atau glukosa dari ujung selulosa yang tidak tereduksi seperti ß-1,4glukan selobiohidrolase. Endo dan eksoglukanase berperan dalam perombakan selulosa pertama karena menyukai selulosa dengan bobot tinggi, yang akan menghasilkan molekul selobiosa. Hidrolisis selulosa secara efektif memerlukan enzim 1,4-glukosidase (Perez et al. 2002). Fusarium spp. dapat menghasilkan berbagai jenis enzim lignoselulase. Diantaranya Fusarium oxysporum dapat menghasilkan enzim fenol oksidase, lignin peroksidase dan selulase (Tamuli et al. 2008; Ramanathan et al. 2010).
8
Cendawan kadang menghasilkan senyawa toksin yang disekresikan saat penetrasi jaringan inang untuk merubah fisiologi tanaman dan mengganggu permeabilitas dinding sel tanaman (Bushnell 1995). Terganggunya permeabilitas sel tanaman akibat ikatan toksin pada membran sel menyebabkan kerusakan struktur membran (Bushnell 1995). Kebanyakan toksin merupakan senyawa sekunder berbobot molekul rendah yang dikeluarkan secara ekstraseluler oleh cendawan (Prins et al. 2000). Beberapa jenis toksin yang dihasilkan Fusarium spp. diantaranya enniatin, fumonisin, sambutoksin, dan trikotesen (Kim et al. 1995; Hermann et al. 1996; Seo et al. 1996; Kang & Buchenenauer 2002; Langevin et al. 2004). Cendawan juga bisa menghasilkan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang bisa mengganggu perkembangan tanaman seperti asam absisat (ABA), etilen, dan auksin (Prins et al. 2000; Groenewald 2005). ZPT dalam konsentrasi tinggi bisa menyebabkan pertumbuhan abnormal inang yang menguntungkan pertumbuhan patogen, seperti ABA yang dihasilkan cendawan patogen pada umbi kentang dapat menghambat akumulasi fitoaleksin risitin dan albumin (Prins et al. 2000). Struktur polisakarida dinding sel cendawan juga bisa mengganggu permeabiltas sel tanaman dan menginduksi terbentuknya fitoaleksin pada tanaman inang. Infeksi merupakan tahapan cendawan yang berada pada kondisi stabil dan menetap di dalam sel atau jaringan inang dan memperoleh nutrisi dari inangnya. Cendawan membentuk hifa infeksi setelah cendawan masuk ke dalam sel inang. Hifa infeksi merupakan perpanjangan hifa penetrasi. Pada beberapa cendawan setelah terbentuk hifa penetrasi terbentuk vesikel dan selanjutnya membentuk hifa infeksi. Terakhir cendawan akan menghasilkan haustorium agar dapat memanfaatkan nutrisi sel inang (Mendgen & Deising 1993). Secara umum Fusarium spp. tidak membentuk struktur seperti haustorium (Kikot et al. 2009). Setelah proses infeksi, cendawan melakukan kolonisasi dengan berkembang atau memperbanyak diri, atau dua-duanya dalam jaringan tanaman (Prins et al. 2000; Lee & Bostock 2006). Berdasarkan sifat patogenesis dan interaksinya dengan sel inang, cendawan dikategorikan menjadi dua kelompok yaitu cendawan nekrotof dan biotrof.
9
Cendawan nekrotrof akan menyebabkan kematian inangnya ketika cendawan mengkolonisasi sel inang. Cendawan biotrof merupakan cendawan yang memanfaatkan nutrisi dari sel tanaman yang masih hidup, sehingga perlu untuk menjaga kelangsungan hidup sel tanaman dalam periode waktu yang lama. Pada cendawan biotrof, jaringan terinfeksi sering menjadi „sink‟ metabolit yang mengubah arah pergerakan fotosintat dari bagian lain ke jaringan terinfeksi. (Mendgen & Deising 1993). Sedangkan cendawan biotrof yang dapat ditumbuhkan pada media sintetik termasuk kedalam kelompok hemibiotrof (Mendgen & Deising 1993; Cooke 1978). Proses kolonisasi bisa hanya terjadi pada daerah antara kutikula dan epidermis (kolonisasi subkutikula), terdapat pada permukaan tanaman tapi mengirim haustoria ke dalam semua jaringan tanaman yang diinfeksinya, atau berkembang diantara sel tanaman dengan miselium interseluler. Sedangkan pada Fusarium sp. yang menyebabkan vascular wilt, cendawan menyerang jaringan pembuluh xilem secara sistemik menembus pori yang terdapat dalam jaringan xilem, kemudian berkembang ke jaringan parenkima. Mikrokonidia akan terbentuk dalam jaringan tersebut (Groenewald 2005). 2.3.2
Mekanisme Pertahanan Tanaman dari Serangan Patogen Secara umum tumbuhan akan memberikan respon terhadap serangan
patogen dan respon tersebut akan bertanggung jawab terhadap resistensi tanaman terhadap patogen. Tanaman akan mempertahankan diri dengan dua cara, pertama dengan adanya sifat-sifat struktural pada tanaman yang berfungsi sebagai penghalang fisik dan akan menghambat patogen untuk masuk dan menyebar di dalam sel tanaman. Kedua respon biokimia berupa reaksi-reaksi kimia yang terjadi di dalam sel dan jaringan tanaman sehingga patogen dapat mati atau terhambat pertumbuhannya (Groenewald 2005). Permukaan tanaman merupakan penghalang struktural pertama patogen. Patogen harus bisa menembus penghalang tersebut sebelum menyebabkan infeksi. Struktur-struktur seperti lapisan lilin dan bulu-bulu halus mencegah terbentuknya lapisan air dan mencegah patogen berkecambah dan memperbanyak diri. Kutikula yang menutupi sel epidermis menghalangi terjadinya penetrasi secara langsung. Dinding sel tersusun atas selulosa yang berikatan kuat dengan hemiselulosa dan
10
lignin menghambat proses infeksi (Perez et al. 2002). Kematian sel atau jaringan yang terserang oleh patogen dapat melindungi tanaman dari serangan selanjutnya. Kejadian tersebut disebut nekrotik atau reaksi pertahanan hipersensitif (hypersensitive defense reaction). Sel dan jaringan inang akan bereaksi terhadap kerusakan, baik yang disebabkan oleh patogen atau karena mekanik dan kimia melalui serangkaian reaksi biokimia untuk mengisolasi gangguan dan menyembuhkan luka (Mert-Turk 2002). Ketahanan biokimia dapat disebabkan oleh senyawa penghambat patogen yang memang telah dibentuk dalam metabolisme tanaman walaupun tidak terjadi serangan patogen atau senyawa penghambat patogen yang terbentuk ketika adanya serangan patogen yang disebut fitoaleksin (Mert-Turk 2002). Senyawa fitoaleksin adalah senyawa antimikrob dengan berat molekul rendah yang dihasilkan tanaman setelah terjadi gangguan (Mert-Turk 2002). Setiap tanaman menghasilkan fitoaleksin yang berbeda. Fitoaleksin dihasilkan oleh sel sehat yang berdekatan dengan sel-sel rusak dan nekrotik untuk mencegah patogen berkembang. Fitoaleksin yang terbentuk bisa berupa senyawa fenolik, alkaloid, atau terpenoid (Zwenger & Basu 2008). Akumulasi fitoaleksin dipicu oleh molekul abiotik atau biotik yang disebut elisitor (Mert-Turk 2002). Pada cendawan, elisitor bisa berupa struktur polisakarida dinding sel cendawan. Inokulasi cendawan pada tanaman gaharu dapat menginduksi terbentuknya senyawa pertahanan berupa seskuiterpenoid yang merupakan kelompok terpenoid (Ishihara et al. 1991; Qi 1995; Michiho 2005; Bhuiyan et al. 2009; Okudera & Ito 2009). Serangan dan infeksi cendawan dapat mengganggu proses fisiologis dan morfologi tanaman (Nieamann & visintini 2005; Lee & Bostock 2006). Berdasar kan perluasan gejala yang terjadi dikenal gejala lokal dan gejala sistimetik (Christiansen et al. 1999). Gejala lokal adalah gejala yang hanya terdapat di daerah inokulasi primer. Sedangkan gejala sistemik adalah gejala yang terjadi jauh dari derah inokulasi.
11
2.4
Studi Sitologi Patogenesis Studi sitologi interaksi patogen inang dapat dipelajari menggunakan
mikroskop konfokal, mikroskop cahaya, atau mikroskop elektron (Kunoh 1995). Mikroskop konfokal bisa digunakan untuk mengamati terjadinya perubahanperubahan ultrastruktur dan komposisi di dalam sel tanaman inang secara langsung (Kunoh 1995). Mikroskop konfokal bisa membedakan struktur antar organel sel dengan sangat baik. Namun studi dengan cara ini memiliki kelemahan karena kadang sukar untuk memperoleh gambar sel terinfeksi yang berbeda dengan sel yang sehat. Sel yang terserang patogen atau sel yang tidak diserang patogen kadang memiliki arsitektur sel yang sama (Kunoh 1995). Studi histopatologi dan histokimia merupakan salah satu pendekatan studi sitologi. Studi ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai perilaku patogen dalam sel inang sekaligus dapat memberikan dasar pengetahuan mengenai respon fisiologi untuk penelitian selanjutnya ditingkat molekuler (Kunoh 1995). Studi histopatologi dapat digunakan untuk mempelajari perkembangan patogen di dalam jaringan-jaringan inang dan studi histokimia dapat digunakan untuk mempelajari terbentuknya akumulasi senyawa pertahanan sebagai respon terhadap serangan cendawan. Uji histokimia terbentuknya senyawa terpenoid
dapat
dilakukan
dengan
menggunakan
tembaga
asetat
yang
menyebabkan senyawa terpenoid menjadi bewarna coklat kekuningan (Martin et al. 2002). Pengamatan struktur cendawan di dalam sel menggunakan mikroskop cahaya atau mikroskop elektron memerlukan proses preparasi terlebih dahulu. Preparasi yang dilakukan bisa dengan mewarnai sel cendawan sehingga dapat dibedakan dengan sel tanaman atau dengan melakukan fiksasi agar sel cendawan tidak berubah. Metode pewarnaan cendawan merupakan metode yang memanfaatkan zat pewarna (staining) untuk mewarnai dinding sel cendawan. Pewarna yang digunakan diantaranya lactofenol blue, biru tripan dan chlorazol black E. Pewarna tersebut akan bereaksi dengan dinding sel cendawan baik cendawan yang masih hidup atau yang sudah mati (Waller 2002). Penggunaan mikroskop elektron seperti mikroskop pemindai elektron (SEM) bisa digunakan
12
untuk studi detil arsitektur permukaan sel. SEM tidak memerlukan sampel yang ditipiskan, sehingga bisa digunakan untuk melihat obyek dari sudut pandang 3 dimensi. Sebelum dilakukan pengamatan menggunakan SEM dilakukan preparasi terlebih dahulu agar tidak terjadi perubahan arsitektur dari sel tanaman atau cendawan (Flegler et al. 1993).
III 3.1
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan dari bulan April 2010-Maret 2011. Penelitian
bertempat di Laboratorium Mikologi Biologi IPB dan Laboratorium Reproduksi Zoologi LIPI Cibinong. 3.2
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah isolat cendawan Fusarium sp. IPBCC. 08.569
koleksi IPBCC., asam galat, asam tanat, Dinitrosalycylic Acid (DNS), I2KI 1%, Carboxy Methyl Cellulose (CMC) 1%, media agar dekstrosa kentang, media cair dekstrosa kentang, pewarna merah kongo, media Malt Ekstrak Agar (MEA), tanaman gaharu (Aquilaria sp.), pewarna biru tripan 50%, tembaga asetat 50%, 0.1M 1-naftol, 0.1M p-kresol, 1 M NaCl. Alat yang digunakan mikrotom beku, mikroskop cahaya, mikroskop pemindai elektron (SEM). 3.3
Metode Penelitian Penelitian yang dilakukan secara garis besar dibagi menjadi 3 bagian
(Gambar 1) yaitu : 1. Pengamatan mekanisme penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 2. Analisis kolonisasi cendawan menggunakan metode pewarna biru tripan dan SEM. 3. Pengamatan perubahan fisiologi secara visual pada tingkat sel dan didukung dengan respon lainnya.
14
Mekanis (pembentukan apresorium) Mekanisme penetrasi
Enzimatik (lignoselulo litik) Hipersensitifitas toksin Pewarna biru tripan
Cendawan Kolonisasi
SEM Patogenesis Fusarium sp. IPBCC 08.569 pada Aquilaria sp. (Inokulasi)
Akumulasi terpenoid Uji histokimia Akumulasi pati Tanaman Klorosis Gejala luar
Perubahan warna kayu Aroma wangi
Gambar 1 Bagan alur penelitian
15
3.3.1
Persiapan Inokulum Cendawan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 diperoleh dari bagian batang pohon yang
wangi dan dengan lubang gerekan serangga. Pohon gaharu berasal dari desa Pasir Garam, Kabupaten Bangka Tengah. Isolat tersebut diremajakan pada media agar dekstrosa kentang dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Isolat akan digunakan sebagai sumber inokulum untuk mempelajari proses patogenesis cendawan meliputi proses kolonisasi dan respon tanaman terhadap kolonisasi cendawan. 3.3.2
Pengamatan Proses Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569
3.3.2.1 Mekanisme Penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Mekanisme penetrasi mencakup aktivitas penetrasi secara fisik, enzimatik, dan toksisitas. Mekanisme penetrasi secara fisik diamati dengan kemungkinan terbentuknya struktur khusus penetrasi seperti apresorium, pengamatan enzimatik mencakup uji lignoselulolitik. Sedangkan uji toksisitas berhubungan dengan gejala hipersensitifitas terhadap ekstrak kasar toksin. Kemampuan Perkecambahan Konidia dan Pembentukan Apresorium Konidia cendawan diperoleh dari isolat yang berumur 7 hari pada media MEA (Lampiran 1). Sebanyak ±10 ml air steril dituang di atas kultur tersebut. Cawan selanjutnya digoyangkan selama 1 jam. Suspensi yang berisi konidia cendawan dimasukkan ke dalam falkon 15 ml dan divortek selama ±1 menit. Suspensi selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 10.000 xg selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan dibuang dan pelet konidia diresuspensikan dengan penambahan 5 ml akuades steril. Jumlah konidia diatur sampai konsentrasi konidia berkisar (1-3x105/ml). Perkecambahan konidia dan terbentuknya apresorium diuji mengikuti metode Lee & Bostock (2006) yang dimodifikasi. Pengamatan
terhadap
perkecambahan
konidia
dan
pembentukan
apresorium dilakukan dengan cara mengoleskan suspensi konidia ke bagian kulit kayu tanaman Aquilaria sp. sehat yang telah disterilisasi permukaannya. Kulit kayu disayat selanjutnya diletakkan di dalam cawan petri steril yang telah berisi kertas tissue basah. Pengamatan terbentuknya apresorium juga diamati dengan cara meletakan sebanyak 3-5 tetes suspensi konidia di atas gelas objek.
16
Pengamatan terbentuknya apresorium dilakukan 2, 4, 6, 8, dan 24 jam setelah inkubasi. Sebelum pengamatan, kulit kayu yang diberi perlakuan konidia direndam dengan biru tripan selama 20-30 menit, sedangkan konidia yang di atas gelas objek ditetesi dengan biru tripan. Kemudian diamati menggunakan mikroskop cahaya. Uji Aktivitas Enzimatik Aktifitas enzimatik yang diamati meliputi aktifitas lignolitik dan selulolitik. Aktifitas lignolitik diuji secara kualitatif sedangkan aktifitas selolitik dipelajari secara kualitatif dan kuntitatif. Aktivitas lignolitik yang diuji mencakup kemampuan cendawan dalam menghasilkan enzim polifenol oksidase, lakase, dan tirosinase mengikuti metode Gramms et al. (1998). Sedangkan aktivitas selulolitik yang
diuji
adalah
kemampuan
cendawan
dalam
menghasilkan
enzim
endoglukonase (CMC-ase). Enzim polifenol oksidase dideteksi dengan cara menumbuhkan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 pada media MEA dengan penambahan asam galat 0,05% (MEAG) atau dengan penambahan asam tanat 0,05% (MEAT) selama 7 hari pada suhu ruang. Terbentuknya warna coklat di bawah dan di sekitar koloni menunjukkan bahwa isolat bereaksi Bavedamm positif atau menghasilkan enzim polifenol oksidase. Sedangkan deteksi adanya lakase dan tirosinase dilakukan dengan melihat perubahan warna berturut-turut setelah penetesan 1-2 tetes 0,1 M 1-naftol pada posisi pukul 12 dan 1-2 tetes 0,1 M p-kresol pada posisi pukul 6 pada koloni isolat uji umur 7 hari pada media MEA yang diinkubasi pada suhu ruang. Perubahan warna diamati 1 jam dan 24 jam setelah penetesan. Terjadinya perubahan warna koloni dan medium di sekitar tempat penetesan 1-naftol menjadi biru sampai ungu menandakan terbentuknya lakase. Jika terbentuk merah orange sampai coklat setelah penetesan p-kresol menandakan terbentuknya tirosinase. Aktivitas selulolitik diuji secara kualitatif mengikuti metode Teather & Petter (1987). Fusarium sp. IPBCC. 08.569 ditumbuhkan pada media agar CMC 1% (Lampiran 1) dalam dua tahapan dan masing-masing dalam tahapan penumbuhan, kultur diinkubasi pada suhu ruang selama 4 hari. Aktivitas selulolitik ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih pada medium tersebut.
17
Zona jernih yang terbentuk divisualisasikan dengan cara menuangkan pewarna merah kongo 0,1% selama 15 menit. Kemudian zat warna dibuang dan medium dibanjiri dengan 1M NaCl selama 15 menit. Pada saat ini zona bening akan tampak, sedangkan di luar zona jernih medium akan bewarna merah. Analisis kuantitatif aktivitas selulolitik dilakukan dengan dua tahap yaitu persiapan ekstrak kasar enzim dan asai enzim. Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan menanamkan 3 potongan inokulum (dengan diameter 0.5 cm/potongan) pada 100 ml medium cair CMC 1% dengan pH 7 di dalam erlenmeyer 250 ml. Inokulum berasal dari biakan yang ditumbuhkan dalam medium agar CMC 1% yang berumur 7 hari. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang di dalam mesin penggoyang selama 7 hari. Filtrat biakan disaring dengan kertas saring Whatman no 1. Filtrat hasil saringan kemudian disentrifugasi dua kali dengan kecepatan 10.000 xg selama 10 menit, suhu 4oC. Filtrat yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk asai enzim CMC-ase. Aktivitas CMC-ase diuji mengikuti metode Miller (1959). Sebanyak 0,5 ml filtrat ditempatkan dalam tabung reaksi 21 x 1.5 cm dan dicampur dengan 0,5 ml larutan CMC 1% dalam buffer posfat pH 7.5 (Lampiran 1), diinkubasi selama 60 menit pada suhu 30oC. Selanjutnya reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 ml DNS (Lampiran 1) dan diinkubasikan selama 15 menit pada suhu 100oC. Absorbansi kemudian dibaca pada panjang gelombang 540 nm dengan spektrofotometer. Konsentrasi CMC-ase yang dihasilkan diperoleh melalui konversi absorbansi dengan menggunakan kurva standar glukosa (Lampiran 2). Aktivitas CMC-ase dinyatakan dalam unit per ml filtrat. Satu unit setara dengan satu mikromol glukosa yang dihasilkan selama 1 jam. Uji Hipersensitif Toksin Uji hipersensitifitas ekstrak kasar toksin dilakukan pada daun tembakau yang telah berumur ±4 bulan. Pertama-tama ekstrak kasar toksin diproduksi dengan cara menumbuhkan sebanyak tiga potong koloni cendawan (dengan diameter 0.5 cm/potongan) di dalam erlenmeyer yang telah berisi 100 ml media cair dekstrosa kentang. Kemudian cendawan diinkubasi pada suhu 28oC, sambil digoyang dengan kecepatan 121 rpm selama 7 hari. Filtrat biakan disaring dengan
18
kertas saring Whatman no 1. Filtrat hasil saringan kemudian disentrifugasi dua kali dengan kecepatan 5.000 xg selama 15 menit, suhu 4oC. Filtrat yang terbukti bebas dari konidia cendawan selanjutnya siap digunakan untuk uji aktivitas toksin. Sebanyak ±1 ml filtrat yang telah bebas konidia cendawan dioleskan ke permukaan daun tembakau steril. Tanaman yang telah diberi perlakuan disungkup menggunakan plastik bening selama 2 hari. Setelah dua hari tutup plastik dibuka dan tanaman dibiarkan kembali tumbuh pada lingkungan biasa. Aktivitas toksin yang dihasilkan diamati secara visual dengan timbulnya gejala nekrosis pada permukaan daun yang diberi perlakuan. Sebagai kontrol digunakan daun yang hanya dioles dengan media cair dekstrosa kentang tanpa biakan isolat dan daun sehat tanpa perlakuan. Toksisitas dinyatakan sebagai rataan skor (Tabel 1). Tabel 1 Cara penilaian aktivitas hipersensitifitas toksin Skor 0 1 2
Gejala tidak adanya gejala nekrosis kurang dari setengah luas permukaan daun yang mengalami nekrosis lebih dari setengah luas permukaan daun yang mengalami nekrosis.
3.3.2.2 Analisis Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Analisis kolonisasi dilakukan dengan dua cara yaitu dengan menggunakan pewarna biru tripan dan SEM. Analisis kolonisasi cendawan diamati pada daerah kayu yang diinokulasi dan di luar daerah inokulasi (di atas dan di bawah kayu yang diinokulasi) pada 7, 14, dan 21 hari setelah inokulasi (7, 14, dan 21 hsi). Inokulasi Cendawan ke Batang Aquilaria sp. Sebelum
pengamatan
kolonisasi,
Fusarium
sp.
IPBCC.
08.569
diinokulasikan pada batang bibit Aquilaria sp. sehat, umur ±1 tahun dengan diameter ±0,5 cm, dan tinggi ±30 cm. Bagian batang yang akan diinokulasi dilukai sepanjang ±2 cm dengan membuang setengah dari kulit dan kambium batang. Seluruh permukaan batang yang telah dilukai selanjutnya ditempel dengan isolat uji, dilapisi dengan kapas basah, dan terakhir dibalut dengan selotip. Sebagai pembanding digunakan batang tanaman yang hanya dilukai tanpa diberi
19
perlakuan sebagai kontrol positif dan tanaman yang sehat sebagai kontrol negatif. Inokulasi dilakukan pada 10 tanaman. Pewarnaan Menggunakan Biru Tripan Bagian kayu yang telah diinokulasi, kayu yang dilukai, dan kayu tanaman sehat dipotong dengan ukuran ± 0.5x0.5x0.5 cm. Kemudian kayu dicuci dengan akuades. Potongan kayu selanjutnya dibekukan pada suhu -18 oC sebelum disayat secara melintang dan membujur dengan mikrotom beku (Yamato RV-240). Proses pewarnaan biru tripan dilakukan mengikuti metode Kormanick & McGraw (1982). Sayatan kayu direndam dalam larutan KOH 10% (v/v) pada suhu 90oC selama 30 menit dan direndam kembali pada suhu ruang selama 24 jam. Apabila selama proses tersebut kolonisasi cendawan masih belum bisa diamati, maka perendaman diperpanjang sampai kolonisasi cendawan dapat dibedakan dengan sel tanaman. KOH dibuang dan sisanya dihilangkan dengan membilas sebanyak 3 kali dengan akuades steril. Sayatan kayu direndam dalam larutan HCl 1N selama 2-3 jam. kemudian diwarnai dengan pewarna biru tripan 0.05% (Lampiran 1) selama 20-30 menit dan disimpan dalam larutan gliserin 50% (Kormik & Graw 1982). Sayatan yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop cahaya (Nikon Afx-dx dan Nikon Obtiphot 2). Proses kolonisasi yang terjadi selanjutnya didokumentasikan menggunakan kamera digital. Pengamatan di bawah Mikroskop Pemindai Elektron (SEM) Bagian kayu yang telah diinokulasi 7, 14, dan 21 hsi, kayu yang dilukai, dan kayu tanaman sehat dipotong sepanjang ±1 cm. Bagian kayu tersebut selanjutnya siap untuk dipreparasi. Preparasi diawali dengan membersihkan kayu di dalam caccodylate buffer ± 2 jam, kemudian diagitasi dalam ultrasonic cleaner selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan proses prefiksasi dengan cara merendam kayu di dalam larutan glutaraldehyde 2.3% selama 2 hari. Sedangkan proses fiksasi dilakukan dengan cara merendam kayu di dalam tannic acid 2 % selama 6 jam, kemudian sampel dicuci 4 kali dengan caccodylate buffer selama 5 menit. Proses selanjutnya adalah proses dehidrasi, kayu secara bertahap direndam 4 kali di dalam alkohol 50% selama 5 menit, 1 kali di dalam alkohol 70% selama 20 menit, 1 kali di dalam alkohol 85% selama 20 menit, 1 kali di dalam alkohol 95% selama
20
20 menit, dan 2 kali di dalam alkohol absolut selama 10 menit. Terakhir dilakukan proses pengeringan dengan cara merendam kayu dua kali di dalam tert butanol selama 10 menit, dibekukan di dalam freezer sampai beku, dan terakhir dimasukkan ke dalam freezed drier sampai kering. Kayu yang sudah kering diletakan di atas batang besi, kemudian bagian permukaan batang yang diinokulasi dan dilukai dilapisi dengan emas dalam technic Hummer V sputter coater. Pengamatan pada bagian dalam kayu yang terinfeksi dilakukan dengan membuang bagian permukaan kayu yang diinokulasi menggunakan mikrotom beku, kemudian dilapisi kembali dengan emas tanpa preparasi kembali. Selanjutnya struktur cendawan yang terdapat pada kayu yang terinfeksi diamati menggunakan mikroskop elektron model JSM 5000 LV yang dioperasikan pada tegangan 20 kv. Pengamatan menggunakan SEM dilakukan di laboratorium mikroskop SEM, Zoologi LIPI Cibinong. 3.3.3
Respon Aquilaria sp. terhadap Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Respon tanaman terhadap isolat uji diamati dengan melihat gejala yang
ditimbulkan setelah inokulasi. Gejala yang terjadi pada tingkat sel/jaringan diamati dengan uji histokimia. Sedangkan gejala yang teramati pada tingkat organ dinyatakan dalam bentuk rataan skor. Pengamatan terhadap gejala yang ditimbulkan diamati 7, 14, dan 21 hsi. 3.3.3.1 Uji Histokimia Uji histokimia yang diamati meliputi uji terpenoid dan pati. Bagian kayu yang telah diinokulasi dan daerah perubahan warna dipotong secara melintang menggunakan mikrotom beku (Yamato RV-240). Sayatan kayu kemudian direndam dalam larutan tembaga asetat 50% selama 30 menit untuk uji terpenoid (Martin et al. 2002). Sayatan selanjutnya diletakkan di atas gelas objek dan ditetesi dengan larutan gliserin 50%. Sedangkan untuk pengamatan pati, sayatan ditetesi dengan larutan I2KI 1% tanpa perendaman dengan larutan tembaga asetat 50%. Selanjutnya preparat diamati di bawah mikroskop cahaya. Sebagai kontrol digunakan sayatan batang tanaman yang hanya dilukai (kontrol positif) dan batang tanaman sehat (kontrol negatif).
21
3.3.3.2 Gejala Luar Gejala luar yang diamati pada tingkat organ berupa klorosis daun, perubahan warna kayu pada daerah terinfeksi, dan adanya aroma wangi yang dinyatakan dalam sistem skor 0-10 (Tabel 2). Selanjutnya dinyatakan dalam bentuk rataan skor pada setiap pengamatan. Tabel 2 Sistem skor respon Aquilaria sp. terhadap inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Nilai 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Daun tidak klorosis/klorosis tidak klorosis/klorosis tidak klorosis/klorosis klorosis tidak klorosis klorosis tidak klorosis klorosis tidak klorosis klorosis tidak klorosis
Gejala Warna Kayu putih putih kecoklatan coklat putih kecoklatan putih kecoklatan coklat coklat putih kecoklatan putih kecoklatan coklat coklat
Wangi tidak wangi tidak wangi tidak wangi agak wangi agak wangi agak wangi agak wangi wangi wangi wangi wangi
Rumus rataan skor adalah sebagai berikut :
Keterangan : Xn = Tanaman ke–n Skor yang diperoleh menunjukkan tingkat pembentukan gaharu. Tingkat pembentukan gaharu dinyatakan dalam 3 kategori (Tabel 3). Tabel 3 Kategori tingkat pembentukan gaharu Kategori 1 2 3
skor 7-10 3-6 0-2
Tingkat pembentukan gubal gaharu gaharu sudah terbentuk gaharu mulai terbentuk gaharu tidak terbentuk
Selain melakukan pengamatan terhadap perubahan warna kayu, pengamatan juga dilakukan terhadap pertambahan panjang dan dalam zona perubahan warna. Pertambahan panjang zona perubahan warna adalah panjang kayu yang
22
mengalami pertambahan panjang perubahan warna ke arah tajuk (atas) atau ke arah akar (bawah) dari daerah yang diinokulasi atau dilukai. Kulit kayu di sisi atas dan bawah daerah yang diinokulasi dan dilukai dikupas dan panjang perubahan warnanya diukur. Sedangkan kedalaman perubahan warna diamati pada sayatan melintang daerah yang diinokulasi atau dilukai. 3.3.4
Analisis Data Data hasil pengamatan panjang dan dalam zona perubahan warna dianalisis
dengan perangkat lunak SAS versi 9.1 menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor dan RAL dengan waktu serta diuji F pada α = 5%. Bila terdapat pengaruh nyata dari perlakuan yang diamati maka setiap taraf perlakuan dibandingkan dengan menggunakan uji lanjut Duncan pada taraf 5%.
IV 4.1
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Penelitian
4.1.1
Proses Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak membentuk apresorium di permukaan
kulit kayu Aquilaria sp utuh. Konidia membentuk tabung kecambah pada jam ke6 (Gambar 2a) dan terus memanjang membentuk hifa pada jam ke-8 (Gambar 2b). Pengamatan pada jam ke-24 memperlihatkan adanya kumpulan miselium di permukaan kulit kayu (Gambar 2c). Kulit kayu Aquilaria sp. tidak memiliki lentisel dan hifa tidak ditemukan menembus permukaan kulit kayu. hifa
kb
5 µm
a
5 µm
Miselium
b
5 µm
c
Gambar 2 Perkecambahan konidia Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di permukaan kulit kayu Aquilaria sp utuh. Konidia berkecambah (kb). (a) 6 jam, (b) 8 jam, dan (c) 24 jam. Pada uji perkecambahan konidia secara in vitro di atas gelas objek, konidia belum berkecambah pada jam ke-0. Konidia baru mulai menunjukkan adanya perkecambahan pada jam ke-4, dan tabung kecambah terus memanjang membentuk hifa pada jam ke-6 dan ke-8. Jumlah konidia yang berkecambah sebesar 2.92% pada jam ke-4. Sampai pengamatan jam ke-8 persentase perkecambahan konidia meningkat, namun hanya mencapai 5.42% (Gambar 3). Sama halnya dengan pengamatan perkecambahan konidia pada permukaan kulit kayu, apresorium juga tidak terbentuk di atas gelas objek.
Gambar 3 Persentase perkecambahan konidia Fusarium sp. IPBCC. 08.569
24
Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak memiliki kemampuan menembus kulit kayu sebagai penghalang fisik penetrasi serta persentase perkecambahan yang juga rendah, maka pada studi kolonisasi inokulasi dilakukan pada batang yang telah dilukai. Batang dilukai dengan jalan membuang kulit kayu dan jaringan floem. Inokulan yang diberikan berupa biomasa Fusarium sp. IPBCC. 08.569. Sama halnya dengan pengamatan pembentukan apresorium di permukaan kulit kayu yang utuh dan di atas gelas objek apresorium juga tidak terbentuk pada permukaan kayu yang dilukai tempat kontak langsung dengan inokulan. Setelah hifa dan konidia melekat di permukaan kayu yang dilukai (Gambar 4a), konidia berkecambah (Gambar 4b), selanjutnya membentuk hifa penetrasi (Gambar 4c). Hifa penetrasi tersebut masuk ke sel-sel xilem yang terluka (Gambar 4c). Pada jaringan parenkima jejari yang terluka, hifa berkembang ke sel tetangga melalui pori-pori sel (Gambar 4d).
kb hifa
konidia
a
b
pori hp hp c
d
Gambar 4 Perkecambahan konidia dan hifa penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di permukaan kayu Aquilaria sp. yang dilukai pada 7 hsi. a) hifa dan konidia (k), b) konidia berkecambah (kb), c) hifa penetrasi (hp) masuk melalui jaringan terluka, dan d) hifa penetrasi (hp) di dalam parenkima jejari terluka menembus sel berikutnya melalui pori. Perbesaran 2000x.
25
Meskipun Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak mampu membentuk apresorium, cendawan ini dapat menghasilkan enzim lignoselulolitik. Uji lignolitik Fusarium sp. IPBCC. 08.569 secara kualitatif di dalam media yang mengandung lignin membuktikan bahwa Fusarium sp. IPBCC. 08.569 mampu merombak atau menggunakan lignin sebagai sumber karbon. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 mampu menggunakan beberapa sumber karbon kompleks seperti asam galat, asam tanat, naftol, dan p-kresol. Pada medium MEAG, Fusarium sp. IPBCC. 08.569 menyebabkan terjadinya perubahan warna medium menjadi kuning kecoklatan di permukaan bawah koloni (Gambar 5). Pada medium MEAT, Fusarium sp. IPBCC. 08.569 menyebabkan terjadi perubahan warna medium menjadi kuning kecoklatan di permukaan bawah koloni dan terbentuk zona bening di sekeliling koloni (Gambar 6). Terjadinya diskolorisasi pada media MEAG dan MEAT
menunjukkan
reaksi
Bavedamm
positif
yang menjadi
indikasi
terbentuknya enzim polifenol oksidase.
Gambar 5
Diskolorisasi medium MEAG akibat aktifitas polifenol oksidase (kiri) dan kontrol (kanan) setelah 7 hari inkubasi.
Gambar 6
Diskolorisasi medium MEAT dan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni akibat aktifitas polifenol oksidase (kiri) dan kontrol (kanan) setelah 7 hari inkubasi.
Fusarium sp. IPBCC. 08.569 juga menghasilkan lakase dan tirosinase. Lakase ditunjukkan oleh perubahan warna medium dan koloni menjadi ungu setelah 1 jam penetesan 0,1M 1-naftol, warna ungu menjadi semakin pekat setelah
26
pengamatan pada jam ke-24 (Gambar 7). Sedangkan tirosinase ditunjukkan oleh perubahan warna medium dan koloni menjadi kuning kemerahan setelah pengamatan 1 jam penetesan 0,1M p-kresol dan menjadi merah setelah pengamatan jam ke-24 (Gambar 7).
a) 1 jam Gambar 7
b) 2 jam
Perubahan warna koloni Fusarium sp. IPBCC. 08.569 setelah ditetesi 0,1 M naftol (pk. 12.00) dan 0,1 M p-kresol (pk. 6.00). Sebelum penetesan (kiri) dan setelah penetesan (kanan). a) satu jam setelah penetesan, b) 24 jam setelah penetesan.
Fusarium sp. IPBCC. 08.569 juga memiliki aktivitas enzim selulolitik. Galur ini memiliki indeks selulolitik (Gambar 8) sebesar 0,039 dan aktivitas enzim sebesar 0,01 U/ml filtrat. Berdasarkan kemampuan cendawan dalam menggunakan CMC sebagai sumber karbon membuktikan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 membentuk enzim CMC-ase.
Gambar 8
Zona jernih yang terbentuk pada medium CMC 1% sebelum divisualisasikan dengan merah kongo 1% (kiri) dan setelah divisualisasikan dengan merah kongo (kanan) 4 hari inkubasi.
Selain menghasilkan enzim lignoselulolitik, Fusarium sp. IPBCC. 08.569 juga menghasilkan toksin. Uji hipersensitifitas ekstrak kasar filtrat pada daun tembakau menyebabkan timbulnya gejala hipersensitifitas berupa nekrosis. Gejala hipersensitifitas yang ditimbulkan sangat rendah dengan rataan skor sebesar 0,43. Gejala nekrosis muncul pada hari ke-3. Pada pengamatan hari ke-5 dan ke-7 tidak terjadi penambahan gejala nekrosis (Gambar 9a). Berbeda dengan daun yang dioles dengan ekstrak kasar filtrat, pada daun baik yang hanya diolesi dengan
27
media cair dekstrosa kentang tanpa biakan isolat (Gambar 9b) maupun daun sehat (Gambar 9c) tidak terlihat adanya gejala nekrosis.
a) Gambar 9
b)
c)
Gejala hipersensitifitas daun tembakau a) setelah dioles dengan ekstrak kasar toksin, b) dioles media cair dekstrosa kentang tanpa biakan isolat, dan c) daun sehat pengamatan hari ke-5. Tanda panah menunjukkan bagian daun yang mengalami nekrosis.
Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 yang teramati sampai akhir pengamatan terbatas pada jaringan hidup. Kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 pada 7 hsi ditemukan pada jaringan parenkima jejari dan lapisan pertama included phloem dari permukaan tempat inokulasi. Pada 14 hsi, kolonisasi telah mencapai setengah dari tebal jaringan xilem dan terdapat pada jaringan xilem yang sama dengan 7 hsi. Kolonisasi pada 21 hsi juga ditemukan pada jaringan yang sama dengan pengamatan sebelumnya pada daerah xilem dan berkembang ke bagian empelur. Kolonisasi ke arah luar daerah inokulasi baru teramati 14 hsi, ± 100 um ke arah atas dan bawah dari daerah inokulasi di jaringan xilem yang sama (hanya sebagian kecil dari daerah perubahan warna) dan tidak terjadi penambahan luas daerah kolonisasi pada pengamatan 21 hsi. Struktur cendawan yang dibentuk di dalam sel tanaman setelah hifa penetrasi adalah vesikel/gelembung (Gambar 10a) dan hifa infeksi (Gambar 10b). Sedangkan struktur seperti haustorium tidak ditemukan. Hifa menembus sel tetangga melalui pori-pori sel (Gambar 10c) dan masuk ke dalam sel-sel di included phloem (Gambar 10d) yang terletak di dekat sel parenkima jejari yang terinfeksi. Infeksi cendawan menyebabkan jaringan included phloem mengalami kerusakan (Gambar 10d). Pada pengamatan 14 hsi, klamidospora ditemukan di permukaan batang yang diinokulasi (Gambar 10e).
28
hi v
1 µm a)
1 µm
b)
hifa hifa
c)
5 µm
d)
k
1 µm
e) Gambar 10
Perkembangan hifa dan kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 di dalam sel-sel jaringan xilem Aquilaria sp. a) vesikel (v) di dalam parenkima jejari pada 7 hsi, b) hifa infeksi (hi) di dalam parenkima jejari pada 14 hsi, c) hifa menembus sel tetangga melalui pori sel pada 14 hsi, d) hifa di dalam included phloem pada 14 hsi, dan e) struktur mirip klamidospora (k) pada 14 hsi. a,b,d, dan e merupakan hasil foto mikroskop, sedangkan c merupakan hasil foto SEM perbesaran 1500x.
Pada 21 hsi, struktur hifa yang berfragmentasi menyerupai konidia ditemukan pada beberapa sel included phloem (Gambar 11a) dan parenkima jejari (Gambar 11b) ±50 µm di bawah daerah yang diinokulasi. Sebagian dari fragmen tersebut berkecambah (Gambar 11b). Pada 21 hsi hifa sudah mencapai sel-sel di jaringan empelur (Gambar 11c).
29
hb
hb
a)
b)
hifa 5 µm
c) Gambar 11 Struktur hifa berfragmentasi (hb) menyerupai konidia pada 21 hsi di dalam included phloem (a) dan parenkima jejari (b), serta hifa di dalam sel-sel empelur (c). Gambar a dan b merupakan hasil foto SEM (perbesaran 2000 kali), sedangkan gambar c merupakan hasil foto mikroskop cahaya. Berbeda dengan tanaman yang diinokulasi, pada tanaman yang dilukai (Gambar 12a & 12b) maupun tanaman yang sehat (Gambar 12c) tidak ditemukan adanya strutur cendawan.
ip
pj utx
utx
a)
pj
pj
5 µm
b)
c)
Gambar 12 Sayatan membujur (a) kayu Aquilaria sp. yang dilukai, serta sayatan melintang (b) dan membujur (c) kayu Aquilaria sp. sehat pada 14 hsi. Parenkima jejari (pj), included phloem (ip), dan unsur trakea xilem (utx). Gambar a dan c merupakan hasil foto SEM perbesaran 750x, sedangkan b merupakan hasil foto mikroskop cahaya.
30
4.1.2
Respon Aquilaria sp. terhadap Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 Respon Aquilaria sp. terhadap inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 yang
teramati pada tingkat sel dan jaringan berupa akumulasi senyawa terpenoid. Di daerah inokulasi, akumulasi senyawa terpenoid dapat ditemukan pada jaringan xilem di dalam parenkima jejari, included phloem (Gambar 13a), dan unsur trakea xilem (Gambar 13b) pada 7 hsi dan 14 hsi. Kemudian berlanjut ke daerah empelur pada pengamatan 21 hsi (Gambar 13c). Di luar daerah inokulasi, senyawa terpenoid ditemukan pada jaringan xilem yang sama dengan daerah inokulasi di daerah perubahan warna (Tabel 4), begitupun pada tanaman yang dilukai (Gambar 13d). Pada tanaman sehat akumulasi senyawa terpenoid tidak ditemukan, namun pada jaringan parenkima jejari dan included phloem (Gambar14a), serta empelur (Gambar 14b) ditemukan adanya butir pati. Pada tanaman yang diinokulasi cendawan dan dilukai butir pati ditemukan pada jaringan yang sama di dalam sel yang tidak terdapat akumulasi terpenoid. pj utx ip 5µm
5µm
b
a
utx e
5µm
pj
c
ip
5µm
d
Gambar 13 Senyawa terpenoid (kuning kecoklatan) pada sayatan melintang kayu Aquilaria sp. a-c) setelah diinokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 pada 21 hsi dan d) setelah pelukaan pada 21 hsi. Parenkima jejari (pj), included phloem (ip), unsur trakea xilem (utx).
31
e
pj
5µm
ip a
5µm
b
Gambar 14 Akumulasi butir pati (biru kehitaman) pada sayatan melintang Aquilaria sp. sehat a) di dalam included phloem (ip) dan parenkima jejari (pj), serta b) di dalam empelur (e). Respon tanaman akibat inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 yang teramati pada tingkat organ adalah klorosis daun, perubahan warna kayu di daerah inokulasi, dan terdeteksinya aroma wangi gaharu. Klorosis daun dan perubahan warna kayu juga terjadi pada tanaman yang dilukai, sedangkan aroma wangi gaharu tidak terdeteksi akibat pelukaan. Daun yang mengalami klorosis adalah daun yang berada dekat daerah inokulasi dan juga dilukai (Gambar 15). Daun-daun yang klorosis dapat gugur atau bertahan sampai akhir pengamatan. Perubahan warna terjadi di daerah kayu yang diinokulasi dan dilukai. Perubahan warna yang terjadi berkisar dari putih kecoklatan sampai coklat. Inokulasi cendawan menyebabkan perubahan warna kayu menjadi coklat, sedangkan pelukaan menyebabkan warna menjadi putih kecoklatan sampai akhir pengamatan (Gambar 16). Pada tanaman sehat gejala tersebut tidak terjadi sampai akhir pengamatan.
Gambar 15 Klorosis daun Aquilaria sp. setelah diinokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 pada 7 hsi (kiri) dan tanaman sehat (kanan).
32
a
b
c Gambar 16 Perubahan warna kayu a) putih, b) putih kecoklatan, dan c) coklat. Inokulasi cendawan dan pelukaan memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap pertambahan panjang dan dalam zona perubahan warna (P<0.01). Tingkat perubahan warna kayu tertinggi terjadi akibat inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 dan berbeda sangat nyata dengan pelukaan (Tabel 4). Periode inkubasi juga berpengaruh terhadap pertambahan panjang dan dalam zona perubahan warna kayu (Tabel 5). Pertambahan panjang zona perubahan warna akibat inokulasi cendawan hanya meningkat sampai pengamatan 14 hsi, kemudian menurun pada pengamatan 21 (Tabel 5). Tabel 4 Pengaruh perlakuan terhadap zona perubahan warna (mm) kayu Aquilaria sp. Zona perubahan warna Perlakuan panjang dalam Fusarium sp. 9,9c 1,0c Kontrol + 1,4b 0,3b Kontrol 0,0a 0,0a Keterangan : Angka-angka yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Tabel 5 Pengaruh periode inkubasi terhadap zona perubahan warna (mm) kayu Aquilaria sp. Zona perubahan warna Periode Kontrol + Fusarium sp. inkubasi (hari) panjang dalam panjang dalam 7 7,9a 0,6a 0,4a 0,1a 14 11,6c 1,0b 2,0b 0,4b 21 10,3b 1,3b 1,8b 0,5b Keterangan : Angka-angka yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata berdasarkan uji Duncan pada taraf 5%.
Respon tanaman yang teramati pada tingkat organ berupa klorosis daun, perubahan warna kayu, dan adanya aroma wangi yang dinyatakan dalam bentuk rataan skor. Rataan skor menunjukkan pengaruh inokulasi dan pelukaan terhadap terbentuknya gaharu. Inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 berpotensi
33
mengindulsi terbentuknya gaharu. Pengamatan yang dilakukan pada 7 hsi diperoleh rataan skor sebesar 3,73 yang berarti tanaman berpeluang menunjukkan pembentukan gaharu. Pada pengamatan 14 hsi rataan skor meningkat menjadi 7,8 yang berarti semua tanaman telah menunjukkan pembentukan gaharu. Namun pada pengamatan 21 hsi terjadi penurunan terbentuknya gaharu menjadi kategori ke-2 dengan rataan skor sebesar 5,64 (Tabel 6). Berbeda dengan tanaman yang diinokulasi, gejala terbentuknya gaharu tidak ditemukan pada tanaman yang dilukai saja. Pada pengamatan 7 hsi rataan skor sebesar 0, pada pengamatan 14 hsi rataan skor sebesar 1,27, dan pada 21 hsi rataan skor sebesar 1. Tanaman masih dikategorikan ke dalam kelompok ke-3 karena rataan skor masih berada di bawah 2 sampai akhir pengamatan (Tabel 6). Tabel 6 Pembentukan gaharu akibat inokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08. 569 Perlakuan Fusarium sp. Kontrol + Kontrol 4.2
Rataan skor perubahan fisik dan pembentukan aroma wangi 7 hsi 3,73 0 0,00
14 hsi 7,8 1,27 0,00
21 hsi 5,56 1 0,00
Pembahasan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak membentuk apresorium di permukaan
kulit kayu Aquilaria sp. utuh maupun pada batang yang dilukai tempat kontak langsung dengan inokulan. Cendawan ini mirip dengan Fusarium oxysporum yang tidak membentuk apresorium di permukaan luar gandum yang masih utuh (Kang & Buchenauer 2002). Tapi berbeda dengan Fusarium moniliforme yang mampu membentuk apresorium pada saat menyerang benih kedelai (Rahman et al. 2010). Namun secara umum Fusarium spp. dilaporkan tidak membentuk apresorium untuk membantu penetrasi (Kikot et al. 2009). Fusarium sp. IPBCC. 08.569 diketahui tidak dapat menembus penghalang fisik penetrasi (kulit kayu), maka cendawan ini membutuhkan pelukaan untuk memulai penetrasi. Proses penetrasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 terjadi secara pasif melalui daerah yang terluka atau pori-pori sel. Meskipun Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak mampu membentuk apresorium, cendawan ini dapat menghasilkan enzim lignoselulolitik. Enzim
34
lignoselulolitik yang dihasilkan diduga berperan dalam membantu penetrasi cendawan. Menurut Mendgen & Deising (1993) ketika cendawan patogen tidak membentuk apresorium, enzim ekstraseluler pendegradasi dinding sel yang dihasilkan diduga berperan dalam proses patogenesis. Tamuli et al. (2008) melaporkan
bahwa
Fusarium
oxysporum
juga
menghasilkan
enzim
lignoselulolitik saat menginfeksi batang Aquilaria malaccensis. Aktivitas polifenol oksidase tertinggi dihasilkan pada 40 hari inkubasi (0,083 U/ml), sedangkan aktivitas selulase tertinggi dihasilkan pada 20 hari inkubasi (5,01 U/ml). Terjadinya perubahan aktivitas enzim yang dihasilkan diduga berperan dalam perkembangan infeksi dan gejala penyakit pada batang A. malaccensis (Tamuli et al. 2008). Selain menghasilkan enzim lignoselulolitik, Fusarium sp. IPBCC. 08.569 juga menghasilkan senyawa toksin ekstraseluler yang menyebabkan sel tanaman menjadi nekrosis. Toksin yang dihasilkan kemungkinan juga berperan dalam proses penetrasi atau mungkin berperan untuk proses infeksi. Kang dan Buchenauer (1999) melaporkan bahwa Fusarium culmorum mengasilkan toksin trikotesen pada saat menginfeksi gandum. Toksin yang dihasilkan ditemukan pada dinding sel, organel sel, jaringan floem, dan xilem. Toksin yang ditemukan pada dinding sel diduga berperan dalam membantu penetrasi (Kang dan Buchenauer 1999), sedangkan toksin yang ditemukan di dalam sel dan jaringan inang berperan dalam perkembangan proses infeksi (Kang dan Buchenauer 2002). Pengamatan lebih lanjut ke dalam jaringan Aquilaria sp. menunjukkan bahwa kolonisasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 terbatas pada jaringan hidup (parenkima jejari, included phloem dan empelur) tempat ditemukannya akumulasi pati. Ketika Fusarium sp. IPBCC. 08.569 menginfeksi jaringan included phloem, terjadi kerusakan pada jaringan tersebut, karena included phloem memiliki dinding sel yang lebih tipis dibanding jaringan xilem lainnya. Enzim lignoselulolitik atau toksin yang dihasilkan diduga mampu merusak jaringan tersebut. Hal ini membuktikan bahwa Fusarium sp. IPBCC. 08.569 merupakan cendawan patogen dan tergolong kedalam kelompok cendawan hemibiotrof (Cooke 1978).
35
Kondisi
lingkungan
kurang
menguntungkan
untuk
perkembangan
cendawan, karena telah ditemukan klamidospora dipermukaan kayu yang diinokulasi pada 14 hsi. Diduga metode inokulasi yang digunakan kurang efektif untuk perkembangan cendawan. Menurut Jensen (2010) aerasi yang baik dibutuhkan untuk menjaga dan meningkatkan perkembangan kolonisasi cendawan di dalam tanaman gaharu sehingga dapat menghasilkan gaharu berkualitas. Cendawan ini diduga telah bersporulasi pada pengamatan 21 hsi dengan ditemukannya hifa berfragmentasi yang menyerupai konidia (Groenewald 2005). Infeksi Fusarium sp. IPBCC. 08.569 menyebabkan timbulnya respon non spesifik dan spesifik tanaman terhadap infeksi yang terjadi baik pada tingkat sel, jaringan maupun organ. Respon non spesifik yang teramati adalah akumulasi senyawa terpenoid, klorosis daun, dan perubahan warna kayu. Gejala tersebut selain terjadi pada batang yang diinokulasi, juga terjadi pada batang yang hanya dilukai. Sedangkan respon spesifik dicirikan dengan terbentuknya aroma wangi khas gaharu dan hanya terdeteksi pada batang yang diinokulasi Fusarium sp. IPBCC. 08.569. Hal yang sama juga pernah dilaporkan oleh Putri et al. (2008) bahwa inokulasi isolat uji dan pelukaan pada Aquilaria crassna menyebabkan terjadinya respon non spesifik dan spesifik tanaman terhadap perlakuan. Senyawa terpenoid diduga merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan Aquilaria sp. sebagai respon terhadap luka dan infeksi Fusarium sp. IPBCC. 08.569. Senyawa terpenoid tersebut disintesis di dalam jaringan hidup (parenkima jejari, included phloem, dan empelur) yang akan merusak akumulasi pati ketika proses infeksi dan pelukaan terjadi. Menurut Qi et al. (2005); Okudera & Ito (2009) seskuiterpenoid (golongan terpenoid) dibentuk pada sel hidup. Hal yang sama juga dilaporkan oleh Nobuchi dan Siripatanadilok (1991) bahwa parenkima merupakan tempat terjadinya biosintesis senyawa gaharu. Kandungan pati dalam parenkima akan menurun setelah pelukaan atau inokulasi cendawan. Sedangkan senyawa terpenoid yang ditemukan pada unsur trakea xilem diduga hanya tempat deposit tapi bukan tempat sintesis senyawa terpenoid. Respon tanaman yang teramati pada tingkat organ berupa klorosis daun diduga berhubungan dengan terganggunya ketersediaan hara akibat adanya
36
pelukaan. Kekurangan hara tersebut menyebabkan daun menjadi kekurangan pigmen klorofil sehingga daun menjadi klorosis (Nieamann & Visintini 2005). Sedangkan perubahan warna kayu diduga terjadi akibat adanya akumulasi senyawa terpenoid dalam jaringan kayu. Terjadinya perluasan perubahan warna di luar daerah infeksi diduga merupakan respon hipersensitif tanaman untuk membatasi infeksi Fusarium sp. IPBCC. 08.569. Menurut Prins et al. (2000) respon hipersensitifitas tanaman bisa berupa terjadinya nekrosis sel dan adanya akumulasi senyawa pertahananan. Inokulasi cendawan menyebabkan terjadinya perubahan warna lebih gelap dibanding pelukaan. Selain itu inokulasi cendawan juga menyebabkan panjang dan dalam zona perubahan warna yang sangat berbeda nyata bila dibandingkan akibat pelukaan. Infeksi cendawan diduga menyebabkan peningkatan akumulasi senyawa terpenoid, sehingga warna menjadi lebih gelap dan lebih panjang. Perubahan warna masih digunakan sebagai indikator kayu gaharu akan menghasilkan senyawa gaharu. Semakin gelap warna yang dihasilkan, semakin tinggi tingkat gubal gaharu yang dihasilkan (Ng et al. 1997; Barden et al. 2000). Aroma wangi hanya terdeteksi pada kayu yang diinokulasi dengan Fusarium sp. IPBCC. 08.569. Diduga senyawa utama aroma wangi gaharu (turunan seskuiterpenoid dan peniletil kromon) tidak terbentuk akibat adanya pelukaan namun karena infeksi cendawan. Inokulasi cendawan pada tanaman gaharu dapat menginduksi terbentuknya seskuiterpenoid yang merupakan kelompok terpenoid (Ishihara et al. 1991; Qi 1995; Michiho 2005; Bhuiyan et al. 2009; Fudai et al. 2009; Okudera & Ito 2009). Hal yang sama juga dilaporkan oleh Qi (1995); Qi et al. (2005); dan Bhuiyan et al. (2009) bahwa senyawa utama yang berperan dalam menghasilkan aroma wangi gaharu (seskuiterpenoid dan turunan peniletil kromon) tidak ditemukan pada pohon Aquilaria sp. yang sehat maupun tanaman yang hanya dilukai, tapi pada pohon yang sakit dan terinfeksi. Diduga cendawan merangsang sintesis senyawa tersebut. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 berpotensi menginduksi terbentuknya gaharu, sedangkan pelukaan tidak berpotensi dalam menginduksi terbentuknya gaharu. Hal tersebut didukung dengan hasil rataan skor yang diperoleh. Terjadinya
37
perubahan peningkatan dan penurunan gejala pembentukan gaharu diduga karena metabolit sekunder yang berperan dalam pembentukan senyawa gaharu terus berubah-ubah di dalam pohon gaharu. Perubahan tersebut diduga berhubungan dengan aktivitas infeksi cendawan. Senyawa gaharu yang dihasilkan akan meningkat bersamaan dengan mulai terjadinya proses infeksi dan aroma wangi menurun dan hilang bersamaan dengan berhentinya proses infeksi cendawan. Selain karena proses infeksi berhenti, terjadinya penurunan rataan skor pada akhir pengamatan diduga juga disebabkan karena penguapan senyawa terpenoid (seskuiterpenoid). Senyawa seskuiterpenoid merupakan senyawa yang mudah menguap dan diduga berpengaruh terhadap perubahan warna dan terbentuknya aroma wangi (Okudera & Ito 2009). Hal yang sama juga dilaporkan oleh Okudera & Ito (2009) bahwa terjadi penurunan jumlah senyawa seskuiterpenoid yang dihasilkan Aquilaria sp. setelah beberapa minggu diberi perlakuan metil jasmonat, asam salisilat, atau ß-glucan, diduga hal tersebut terjadi karena senyawa seskuiterpenoid yang dihasilkan menguap ke udara.
V 5.1
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan Fusarium sp. IPBCC. 08.569 tidak membentuk apresorium namun memiliki
aktifitas lignoselulolitik dan menghasilkan toksin. Penetrasi secara langsung tidak ditemukan sehingga penetrasi terjadi melalui pelukaan. Modifikasi hifa ditemukan di dalam sel hidup pada jaringan kayu (parenkima jejari, included phloem, dan empelur). Respon tanaman pada tingkat sel berupa akumulasi senyawa terpenoid ditemukan pada parenkima jejari, included phloem, unsur trakea xilem, dan empelur. Perubahan yang terjadi pada tingkat sel menyebabkan terjadinya perubahan warna kayu dan terbentuknya aroma wangi. Perubahan warna yang terjadi meluas ke luar daerah infeksi. Fusarium sp. IPBCC. 08.569 dapat dinyatakan sebagai penginduksi pembentukan gaharu dengan menggunakan sistem skor. 5.2
Saran Saran untuk penelitian selanjutnya adalah perlu mencoba menggunakan
teknik inokulasi lain sehingga kualitas gaharu yang dihasilkan tidak menurun. Perlu dilakukan penelitian ditingkat molekuler untuk memperbaiki sifat galur yang dimiliki sehingga dapat menginduksi gaharu menjadi lebih baik. Melakukan identifikasi jenis senyawa golongan terpenoid yang terbentuk pada jaringan. Serta melakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan apakah senyawa gaharu yang dihasilkan termasuk senyawa fitoaleksin.
VI
DAFTAR PUSTAKA
Barden A, Anak NA, Mulliken T, Song M. 2000. Heart of the Matter: Agarwood Use and Trade and CITES Implementation for Aquilaria malaccensis. Cambridge: Traffic Int. Bhuiyan NI, Jaripa B, Nurul HB. 2009. Analysis of essential oil of eaglewood tree (Aquilaria agalocha Roxb) by gas chromatography mass spectrometry. J Bangl Pharma Soc 4: 24-28. Bushnell WR. 1995. Pogress in Understanding Host-Parasite Interaction-the U.S.Japan Seminar Series, 1966-1955. Di dalam Mills D et al, editor. Moleculer Aspect of Pathogenicity and Resistance: Requirement for Signal Tranduction. United States of America: APS Press. Hlm 1-10. Christiansen E et al. 1999. Mechanical injury and fungal infection induce acquired resistance in norway spruce. J Tree Physiol 19: 399-403. Compton J, Ishihara A. 2006. The Use and Trade of Agarwood in Japan. Japan: Traffic Int. Cooke R. 1978. The Biology of Symbiotic Fungi. New York: Pitman Press. Dean RA et al. 1995. Cell Surface Communication in Apressorium Development. Di dalam Mills D et al, editor. Moleculer Aspect of Pathogenicity and Resistance: Requirement for Signal Tranduction. United States of America: APS Press. Hlm 59-72. Dewan Standar Nasional. 1999. SNI 02-5009. 1-1999 Gaharu. Jakarta: Badan Standardisasi Nasional. Erari DK, RMR Ruimassa. 2009. Identifikasi patogen penyebab gaharu di Provinsi Papua. Makalah Seminar Menuju Produksi Gaharu Secara Lestari di Indonesia. Bogor: IPB International Convention Center, 12 November 2009. Hlm A8. Flegler SL, Heckman JW, Karen L. 1993. Scanning and Transmission Electron Microscopy an Introduction. New York: Oxford University Press. Fudai H et al. 2009. A new 2-(2-Phenylethyl) chromone from chinese eaglewood. Molecules 14: 5165-5168. Gong LJ, Shun XG. 2008. Endophytic fungi from Dracaena cambodiana and Aquilaria sinensis and their antimicrobial activity. African J Biotech 8: 731-736. Gramms G, Gnther T, Fritsche W. 1998. Spot tests for oxidative enzymes in ectomycorrhizal, wood- and litter-decaying fungi. Mycol Res 102:67-72. Groenewald S. 2005. Biology, pathogenicity and diversity of Fusarium oxysporum f.sp.cubense [Thesis]. Universitas of Pretoria: Pretoria. Hatakka A. 2001. Biodegradation of lignin. Di dalam M. Hofrichter and A. Steinbuchel, editor. Biopolymers volume 1: Germany: Wiley-VCH Weinheim. Hal 129-180.
40
Hermann M, Zocher R, Haese A. 1996. Enniatin produced by Fusarium strains and its effect on potato tuber tissue. App Environ Microbiol 62: 393-398. Ishihara M, Tomoyuki T, Tsuneya, Kenji U. 1991. Fragrant sesquiterpenes from agarwood. Phytochem 33:1147-1155. Isnaini M, H. Suheri, C. Cerboncini, Krause J, C. Muellenborn. 2009. Isolasi dan uji kemampuan berbagai isolat jamur dalam menginduksi gubal gaharu pada tanaman Grynops sp. dan Proffiling kimiawi hasil inokulasi. Makalah Seminar Menuju Produksi Gaharu Secara Lestari di Indonesia. Bogor: IPB International Convention Center, 12 November 2009. Hlm A9. Jensen A. 2010. Domestication of aquilaria spp. And rural poverty–socioeconomic and genetic aspects of the planting boom in the “wood of the gods”. www.agarwood.org.vn. 5 Desember 2010. Kang Z, Buchenenauer. 2002. Studies on the infection process of Fusarium culmorum in wheat spikes: Degradation of host cell wall components and localization of trichothecene toxins in infected tissue. Europ J Plant Pathol 108: 653-660. Kang Z, Buchenenauer. 1999. Immunocytochemical localization of Fusarium toxins in infected wheat spikes by Fusarium culmarum. Europ J Plant Pathol 55: 275-288. Kim JC, Lee Y, Yu SH. 1995. Sambutoxin-producing isolates of Fusarium species and occurrence of sambutoxin in rotten patato tuber. Appl Environ Microbiol 61: 3750-3757. Kikot GE, Roque AH,Teresa MA. 2009. Review contribution of cell wall degrading enzymes to pathogenesis of Fusarium graminearum: a review. J Basic Microbiol 49: 231-241. Konishi T, Konoshima T, Yasuo S, Shiu K. 2002. Six new 2-(2-phenylethyl) chromones from Agarwood. Chem Pharm Bull 50: 419-422. Kormanick PP, McGraw AC. 1982. Quantification of Vesicular-Arbuskular Mycorrhiza in Plant Roots. St Paul: The American Pythophatology Society. Kunoh H. 1995. Cytological approaches in understanding host-parasite interaction. Di dalam Mills D et al, editor. Moleculer Aspect of Pathogenicity and Resistance: Requirement for Signal Tranduction. United States of America: APS Press. Hlm 15-26. Langevin FO, F Eudes, Andre C. 2004. 2004 Effect of trichothecenes produced by Fusarium graminearum during Fusarium head blight development in six cereal species. Europ J Plant Pathol 110: 735–746. Lagopodi AL et al. 2002. Novel aspects of tomato root colonization and infection by Fusarium oxysporum f. Sp. Radicis-lycopersici revealed by confocal laser scanning microscopic analysis using the green fluorescent protein as a marker. Mol Plant-Mic Interact 15: 172-179.
41
Lankinen P. 2004. Ligninolytic enzymes of the basidiomycetous fungi Agaricus bisporus and Phlebia radiata on lignocellulose-containing media [Disertasi]. University of Helsinki: Finland Lee MH, Bostock RM. 2006. Induction, regulation, and role in pathogenesis of appressoria in Monilinia fructicola. Phytopathology 96:1072-1080. Li YH, et al. 2005. Spore germination, infection structure formation, and colony development of Erysiphe pulchra on dogwood leaves and glass slides. Plant Dis. 89:1301-1304. Lymar ES. Bin Li, V. Renganatan. 1995. Purification and characterirization of a cellulose-degrading culture of Phaneroccaete chrysosporum. Appl Environ Microbiol 61:2976-2980. Lynd LR, PJ Weimer, WH Van Zyl, IS Pretorius. 2002. Microbial cellulose utilization: fundamental and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66: 506-577. Martin D, Tholl D, Gershenzon J. 2002. Methyl jasmonate induces traumatic resin ducts, terpenoid resin biosynthesis, and terpenoid resin accumulation in developing xylem of Norway Spruce stems 1. Plant Physiol 129:10031008. Mendgen K, H Deising. 1993. Infection structures of fungal plant pathogen-a cytological and physiological evaluation. New Phytol 124: 193-213. Mert-Turk F. 2002. Phytoalexin: defence or just a respon to stress. Cell Mol Biol 1: 1-6. Michiho I. 2005. Induction of sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell suspension culture. Essent Oil Res 1-6. Miller L. 1959. Use of dinitro salicylicacid reagent for determination of reducing sugars. Anal Chem 31: 426-428. Mohamed R, Jong PL, S. Zali. 2010. Fungal diversity in wounded stems of Aquilaria malaccensis. Fungal Divers 43:67–74. Ng LT, Chang YS, Kadir AA. 1997. A review on agar (gaharu) producing Aquilaria species. Trop Forest Product 2:272-285. Nieamann KO, Visintini. 2005. Assessment of potential for remote sensing detection of bark beetle-infested areas during green attack: a Literature Review. Canada: Mountain Pine Beetle Initiative. Nobuchi T, Siripatanadilok S. 1991. Preliminary observation of Aquilaria crassna wood associated with the formation of aloewood. Bull of Kyoto Univ 63: 226-235. Okudera Y, Ito M. 2009. Production of agarwood fragrant constituents in Aquilaria calli and cell suspension cultures. Plant Biotechnol 26: 307– 315.
42
Ogel et al. 2006. Production, properties and application to biocatalysis of a novel extracellular alkaline phenol oxidase from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum. Microbiol Biotechnol 71: 853–862. Pojanagaroon S, Kaewrak. 2002. Mechanical methods to stimulate aloewood formation in Aquliaria crassna (Kritsana) trees [Abstract]. Acta Horticul 676: 161-166. Perez J et al. 2002. Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int Microbiol 5: 53-63. Ploetz RC. 2005. Fusarium induced diseases of tropical, perennial crops. Phytopathol 96: 648-652. Prins TW et al. 2000. Infection strategy of Botrytis cinera and related necrotrophic pathogens. Di dalam: JW Kronstad, editor. Fungal Pathology. London: Kluwer Academic Publishers. Hlm 33-64. Putri AL, Gayuh R, Juliarni. 2008. Induksi pembentukan senyawa terpenoid pada pohon gaharu (Aquilaria crassna) dengan Acremonium sp. dan metil jasmonat. Enviagro 2: 23-28. Qi SY. 1995. Aquilaria spesies: In vitro culture and production of eaglewood (agarwood). Di dalam: Bajaj YPS, editor. Biotechnology in Agriculture and Forestry 33. Volume ke-15. New York: Springer. Hlm 36-46. Qi SY et al. 2005. Production of 2-(2-phenylethyl) chromones in Cell Suspension cultures of Aquilaria sinensis. Plant Cell Tissue Organ Cult 83: 217–221. Rahayu G. 2009. Status penelitian dan pengembangan gaharu di Indonesia. Makalah Seminar Menuju Produksi Gaharu Secara Lestari di Indonesia. Bogor: IPB International Convention Center, 12 November. Hlm A1 Rahman ME et al. 2010. Scanning eletron microscopy of invasion process by Fusarium moniliforme on soybean seed. Plant Protection Res 50: 288292. Ramanathan G, S Banupriya, D Abirami. 2010. Production and optimization of cellulase from Fusarium oxysporum by submerged fermentation. Scien Ind Res 69: 454-459. Santoso E. 1996. Pembentukan gaharu dengan cara inokulasi. Makalah diskusi hasil penelitian dalam menunjang pemanfaatan hutan yang lestari. Bogor: Pusat Litbang Hutan dan Konservasi Alam, 11-12 Maret 1996. Hlm 1-3. Seo JA, Kim JC, Lee YW. 1996. Isolation and characterization of two new type C fumonisins produced by Fusarium oxysporum. Nat Prod 59: 1003-1005. Siregar MEB, 2009. Potensi dan induksi pembentukan gubal gaharu (Aquilaria malaccensis) di Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Makalah Seminar Menuju Produksi Gaharu Secara Lestari di Indonesia. Bogor: IPB International Convention Center, 12 November 2009. Hlm A7. Soehartono T, Newton AC. 2001. Reproductive ecology of Aquilaria spp. in Indonesia. Forest Ecol Manage 152: 59-71.
43
Tamuli P, Baruah P, R Samanta. 2008. Enzyme activities of agarwood (Aquilaria malaccensis Lamk.) stem under pathogenesis. Spic Arom Crops 17 : 240–243. Teather RM, Petter JW. 1987. Use of congo red-polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteri from the bovine rumen. Appl Environ Microb 43: 777-780. Waller JM. 2002. Disiase diagnosis and investigation “Microscopy”. Di dalam Waller JM, Lenne JM, & SJ Waller, editor. Plant Pathologist’s 3rd Edition. New York: CABI Publishing. Hlm. 216-220. Wang B, and Jeffers SN. 2000. Fusarium root and crown rot: A disease of container-grown hosts. Plant Dis. 84:980-988. Zwenger S, C Basu. 2008. Plant terpenoid: application and future potentials. Biotech Mol Biol 3: 001-007
LAMPIRAN
45
Lampiran 1 Komposisi medium dan bahan yang digunakan Medium Malt Extract Agar Ekstrak malt 20 gr Agar 15 gr Akuades 1l Medium agar CMC 1 % CMC MgSO4.7H2O KNO3 K2HPO4 FeSO4. 7H2O CaCl2.2H2O Agar Glukosa Antibiotik Akuades
10 gr 0,2 gr 0,75 gr 0,5 gr 0,02 gr 0,04 gr 15 gr 1 gr 0,25 gr 1l
Larutan CMC 1 % CMC Air hangat Larutan buffer phospat pH 7.5 Pereaksi DNS NaOH padat KNO tartrat Na2SO3 DNS Akuades
10 gr 182 gr 0,5 gr 10 gr 1l
Pewarna Biru tripan 0,05% Biru tripan 50 gr Asam laktat 33,3 ml Gliserin 33,3 ml Akuades 33,3 gr
1 gr 90 ml 10 ml
46
Lampiran 2 Kurva standar glukosa
0.6
y = 0.5276x + 0.0217 2
R = 0.9973
Absorban
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0
0.2
0.4 0.6 0.8 Konsentrasi glukosa (mg/ml)
1
Kurva standar glukosa untuk pengukuran CMC-ase
1.2
IPB 2011
ADE LIA PUTRI
G351080011
