Stanovení ethanolu v biologickém materiálu pro forenzní účely Stanovení ethanolu (alkoholu) v biologickém materiálu se pro forenzní účely provádí dvěma různými metodami. Především jde o metodu plynové chromatografie s plamenově ionizačním detekorem (GC-FID) s využitím head space a klasickou volumetrickou metodu tzv. Widmarkova metoda (zkouška). Obě uvedené metody mají své výhody a nevýhody. Forenzně uznávaná metoda je dnes pouze plynová chromatografie s využitím head space. Policie využívá ještě i terénní stanovení hladiny alkoholu ve vydechovaném vzduchu. Přepočet na hladinu alkoholu v krvi je možný, ale předpokládá nezávislý poměr vydechovaného vzduchu a krve, což je variabilní.
Fyzikálně-chemické vlastnosti ethanolu Ethanol je alifatický alkohol (CH3CH2OH). Je to bezbarvá kapalina, v bezvodém stavu má ostrou vůni. Ve směsi s vodou je alkoholická vůně jemnější a sladší. Teplota varu ethanolu je 78,5 °C. Hustota ethanolu při teplotě 25 °C rovna 0,789 g.cm-3.Ethanol je méně polární než voda a z tohoto důvodu prochází snadněji buněčnými membránami a difunduje to tkání. Mezní koncentrace absolutního ethanolu, která je zachytitelná lidským čichem ve vzduchu je 350 ppm. Ethanol je snadno zápalná látka a řadí se mezi hořlaviny 1. třídy. Ethanol je neomezeně mísitelný s vodou.
Účinek ethanolu na lidský organismus Na lidský organismus působí ethanol jako droga. Má tlumivý účinek na CNS (přestože v případě počáteční konzumace působí zdánlivě excitačně). Ethanol je ve velice nízké koncentraci obsažen v krvi člověka jako produkt metabolických pochodů. Fyziologická průměrná hladina ethanolu u zdravého člověka se pohybuje okolo 0,03 až 0,05 g.kg-1. Nad koncentrační hladinu 0,05 g.kg-1 už dochází k mentálnímu ovlivnění a tato hladina je tedy považována za mezní hladinu alkoholu, kdy dochází k již znatelnému zhoršení motorických funkcí. S dalším nárůstem hladiny alkoholu v krvi dochází postupně k prohlubování zhoršení motorických funkcí a koordinace pohybu, zhoršení úsudku, odstraňování zábran, dále dochází k vzrušeným emocionálmím projevům až agresivitě. Další zvyšování alkoholu v krvi má pak za následek utlumení CNS až k úpadku do bezvědomí. Letální dávka ethanolu v krvi se pohybuje v rozmezí 5 až 8 g.kg-1 pro dospělé osoby a pro děti je to hladina 3 g.kg-1. Akutní toxicita ethanolu je dále ovlivněna tolerancí na alkohol, interakcí s léčivy a drogami a také případnou hypoglykemií. Korelace mezi hladinou alkoholu v krvi a akutními klinickými projevy v případě akutní intoxikace je uvedena v tabulce 1.
Tabulka 1: Korelace hladin alkoholu v krvi s akutními klinickými projevy Hladina alkoholu v krvi (mg/dL)
Klinický stav
Symptomy a projevy
10-50 (0,1 až 0,5 g.kg-1)
střízlivost
Normální chování. Minimální změny chování odhalitelné pouze speciálními testy.
30-120 (0,3 až 1,2 g,kg-1)
eufórie
Mírná eufórie se zvýšenými sociálním projevy, zvýšení sebevědomí. Snížení pozornosti a sebekontroly.
90-250 (0,9 až 2,5 g.kg-1)
excitace
Emoční nestabilita, ztráta kritického myšlení a kontroly, výpadky paměti. Ztráta pohybové koordinace, zvýšení reakčního času, snížení citlivosti na vnější podněty.
150-230 (1,5 až 2,3 g.kg-1)
zmatenost
Dezorientace, mentální zmatenost, nevolnost, přehnané emocionální reakce, strach, smutek, hněv. Poruchy vidění - zdvojené vidění, změna vnímání tvaru a pohybu. Snížená reakce na bolest, porušená rovnováha a koordinace, setřelá nebo nesrozumitelná řeč.
270-400 (2,7 až 4,0 g.kg-1)
stupor
Apatie, významně snížená odezva na podněty, významná ztráta svalové koordinace, neschopnost stát, inkontinence, poruchy vědomí (letargie, strnulost).
350-500 (3,5 až 5,0 g.kg-1)
Kóma
Potlačení reflexů, poruchy dýchání, aspirace.
>450-500 (>4,5 až 5,0 g.kg-1)
Smrt
Zástava dechu.
Absorpce, distribuce a metabolismu ethanolu Absorbce, distribuce a metabolismus ethanolu je podmíněn genetickými a environmentálním faktory. Absorbce ethanolu při perorálním podání se odehrává především v tenkém střevu. Poměr mezi požitým a absorbovaným ethanolem (tedy rychlost absorbce) je dán celou řadou faktorů, např.: obsahem žaludku, rychlostí požití ethanolu, složením potravy, rychlostí vyprazdňování gastrointestinálního traktu. Ethanol jako malá a relativně polární molekula je distribuován rovnoměrně v závislosti na obsahu vody v jednotlivých tkáních. Distribuovaný objem ethanolu je úměrný celkovému obsahu vody v těle. Faktory ovlivňující celkové množství vody v těle ovlivňují zároveň distribuci ethanolu. Eliminace ethanolu probíhá z asi 90 % metabolickými pochody. Pouze 2 - 10% dávky ethanolu je vyloučena dechem, potem a močí. Metabolická eliminace ethanolu je závislá na enzymatické oxidaci ethanolu v játrech (alkoholdehydrogenáza, aldehyddehydrogenáza). Rychlost eliminace je tedy závislá genetických na variantách enzymů podílejících se na oxidaci ethanolu.
Absorpce Jak bylo uvedeno GI trakt je hlavní cestou absorpce ethanolu přijatého per os. Asi 20% absorbovaného ethanolu přechází do krve pasivní difúzí přes žaludek, zbylých 80 % přechází do krevního řečiště přes duodenum a další části tenkého střeva. Inhalační cesta vstupu a vstup přes kůži
nemá z hlediska absorpce a intoxikace alkoholem velký význam díky relativně vysoké polaritě ethanolu a tedy jeho velké rozpustnosti ve vodě a nízké rozpustnosti v tucích. Absorpce ethanolu v GI probíhá pouze pasivní difúzí a je tedy řízena koncentračním gradientem (podle Fickova zákona). Rychlost absorbce ethanolu z GI traktu je dána zejména následujícími faktory: a) množstvím ethanolu, který je v kontaktu s mukózním povrchem, b) časem, po který zůstává ethanol v kontaktu s žaludeční stěnou, c) množstvím krve, které protéká v místě styku alkoholu s žaludeční stěnou, d) velikostí povrchu žaludeční stěny, který je dostupný pro resorpci alkoholu. U zdravého dospělého jedince se 80 až 90 % požitého alkoholu absorbuje přes GI trakt během 30 - 60 minut.
Distribuce Ethanol je mísitelný s vodou v jakémkoli poměru. Z tohoto důvodu se do jednotlivých tkání ethanol dostává tím více, čím je obsah vody v dané tkáni vyšší. VD ethanolu je závislý na pohlaví, věku a množství tuku v těle (obezita). Například ženy mají VD ethanolu mírně nižší než muži, protože ženské tělo obsahuje přirozeně méně vody a více tuku na jednotku hmotnosti. Distribuční objem ethanolu pro dospělou zdravou ženu se pohybuje v rozmezí 0,54 až 0,71 L.kg-1, zatímco pro dospělého zdravého muže je VD ethanolu v rozmezí 0,63 až 0,76 L.kg-1.
Vazba ethanolu na proteiny Ethanol se neváže na proteiny krevní plazmy či tkání. Distribuční objem úzce koreluje s množstvím vody v těle. Ethanol rovněž neinterferuje při vazbě jiných sloučenin na proteiny plazmy.
Eliminace (biotransformace) ethanolu Hlavními metabolickými pochody ethanolu jsou oxidační metabolické pochody využívající enzym alkoholdehydrogenázu a enzymatický systém mikrosomální ethanol-oxidační (MEOS). Konečným produktem enzymatické oxidace ethanolu je CO2 a H2O. Hlavní metabolická cesta ethanolu je založena na jeho oxidaci alkoholdehydrogenázou. Oxidace ethanolu alkoholdehydrogenázou (ADH) probíhá v játrech za spoluúčasti kofaktoru nikotinamidadeninnikluotidu (NAD+). NAD+ v tomto případě zastává roli akceptoru protonů během oxidace ethanolu na acetaldehyd. ADH je obsažen v cytosolu jaterních buněk. Tato metabolická dráha ethanolu je nasycena při relativně nízké koncentraci ethanolu. Enzymy podílející se na enzymatické oxidaci ethanolu vykazující významný polymorfismus (ADH, aldehydehydrogenáza (ALDH) a CYP2E1. Enzym ALDH, který je dále zodpovědný za oxidaci acetaldehydu existuje v několika formách. Nejvýznamnější jsou dva: ALDH1 - enzym obsažený v cytosolu všech buněk včetně mozkových s omezenou katalytickou aktivitou a ALDH2 - mitochondriální enzym přítomný v játrech a žaludku. ALDH2 vykazuje vysokou katalytickou aktivitu pro oxidaci acetaldehydu. ALDH2 je primární enzym zodpovědný za in vivo oxidaci acetaldehydu. Asijská populace má geneticky podmíněný deficit ALDH2 enzymu, který vede ke zvýšené citlivosti na acetaldehyd vzniklý oxidací ethanolu. U této populace tak dochází ke zvýšené akumulaci acetaldehydu spojené se zvýšením tepové srdeční frekvence, intenzivní zrudnutí obličeje, zvýšené pocení a erythém.
Widmarkova metoda Widmarkova metoda je stále rozšířenou analytickou metodou poměrně velmi přesnou a spolehlivou. Její výhodou je vysoká citlivost a poměrná jednoduchost, která ji řadí mezi rutinní laboratorní úkony. Je využívána i jako princip při dechové zkoušce v detekčních trubičkách, které stanovují orientačně požitý alkohol na základě změny barvy detekční trubičky. Pro provedení Widmarkovy zkoušky se odebírá asi 5 až 8 mililitrů krve. Při odběru se k dezinfekci nesmí užívat alkoholu ani jiných těkavých látek, neboť by došlo ke zkreslení výsledků. Princip Widmarkovy metody spočívá v oddestilování etanolu obsaženého v krvi a jeho oxidaci známým nadbytkem dichromanu draselného v kyselině sírové. Přebytek dichromanu se stanoví jodometrickou titrací. Nevýhodou této zkoušky je její nespecifičnost, protože při Widmarkově metodě jsou mezi redukujícími látkami chovajícími se stejně jako etanol i jiné těkavé redukující látky, jako např. acetaldehyd, isopropanol apod. Rovnice reakcí vystihující půběh Widmarkovi metody: K2Cr2O7 + 3 CH3CH2OH + 8 H2SO4 -> 2 Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4 + 3 CH3COOH + 11 H2O K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4 -> Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 3 I2 + 7 H2O 2 Na2S2O3 + I2 -> 2 NaI + Na2S4O6
Plynová chromatografie s plamenovým ionizačním detektorem (GC-FID) Ethanol (stejně jako jiné těkavé látky) je z vyšetřované krve v uzavřené vialce za teploty okolo 60°C odpařen do prostoru nad tekutinou. Takto vzniklý plynný vzorek je dávkován do kolony plynového chromatografu - jedná se o techniku „ head space“ (obr. 1). Na výsledném záznamu analýzy je pak retenční vzdálenost (retenční čas) mírou kvality jednotlivých rozdělených složek směsi, plocha píku je mírou kvantity. Stanovení se provádí metodou vnitřního standardu. Za konstantních podmínek analýzy je retenční čas alkoholu, stejně jako jiných těkavých látek, jež mohou být obsaženy ve vyšetřovaném vzorku, vždy stejný.
Obr. 1: Schematické znázornění statické head space analýzy
Stanovení ethanolu v biologickém materiálu Widmarkovou metodou Úkol: Stanovte obsah ethanolu v předloženém biologickém materiálu (krev či moč). Pomůcky: Widmarkovy baňky, odměrná baňka na 500 mL, staniolové mističky, odměrný válec, byreta, kádinky, sušárna, analytické váhy, automatické pipety a špičky, centrifuga.
Obr. 2: Widmarkova titrační baňka
Potřebné roztoky a činidla: 1) roztok 5% KI, 2) roztok 0,25% dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové (odpovídá 0,01 M roztoku), 3) roztok 1% škrobu, 4) 10% roztok kyseliny chlorovodíkové, 5) 50 mM thiosíran sodný ve vodě, 6) 5 mM thiosíran sodný ve vodě. Uvedené roztoky a činidla jsou již předem připraveny. Pracovní postup: 1. Stanovení přesné koncentrace odměrného roztoku 0,25% dichromanu draselného Do titrační baňky se odpipetuje 10 mL zásobního roztoku dichromanu draselného a přidá se 30 mL 5% roztoku jodidu draselného a 10 mL 10% roztoku kyseliny chlorovodíkové. Směs se důkladně promíchá a titruje se 50 mM roztokem thiosíranu sodného do žlutého zbarvení. Poté se přidá 1 mL 1% roztoku škorobového mazu a titruje se dále do trvale slabě modrého zbarvení. Ze spotřeby 5% roztoku jodidu draselného se vypočítá přesná koncentrace roztoku dichromanu draselného. 2. Příprava biologického materiálu k analýze a) Krev - zkumavka s předloženou krví se 5 minut centrifuguje při 3000 ot/min. Po centrifugaci se odbírá k jedné titraci 100 mL séra. b) Moč se pipetuje přímo bez předchozí centrifugace. 3. Vlastní stanovení ethanolu a) Do 2 Widmarkových baněk se odměří přesně 1 mL 0,25% roztoku dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové. b) 2 staniolové mističky se zváží na analytických vahách, zapíše se jejich hmotnost. Do zvážených staniolových mističek se odpipetuje 100 mL zkoumaného biologického materiálu a slepý
c) d) e)
f)
vzorek (100 mL roztoku dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové). Diferenčně se mističky zváží a odečte se navážka. Misky s odpipetovaným biologickým materiálem se vloží do držáčku Widmarkových baněk. Baňky se uzavřou na 2 hodiny do sušárny vytemperované na 60 °C. Po dvou hodinách se baňky vytáhnou a nechají zchladit na laboratorní teplotu. Staniolové mističky se opatrně z Widmarkových baněk vyjmou a obsah Widmarkových baněk se zředí 25 mL deionizované vody a promíchá. Přidá se 1 mL roztoku 5% KI. Roztok zežloutne. Dále se přidají 3 kapky roztoku škorobového mazu. Roztok zmodrá a promíchá se. Roztoky ve Widmarkových baňkách se titrují 5 mM roztokem thiosíranu sodného do trvalého odbarvené. Odečte se přesně spotřeba v mL.
Výpočet množství ethanolu v biologickém materiálu
𝑐 = 100. 1,13
(V! − 𝑉! ) .𝑥 m
c…stanovovaná koncentrace ethanolu v g/kg Vb…spotřeba thiosíranu sodného při slepém pokusu Va…spotřeba tiosíranu sodného při titraci vzorku m…navážka vzorku v mg X…faktor zohledňující typ biologického materiálu V případě stanovené alkoholu z krevního séra je nutné celý výsledek vydělit ještě číslem 1,2. Výsledná koncentrace alkoholu pak odpovídá obsahu ethanolu v plné krvi.
Stanovení ethanolu metodou plynové chromatografie Úkol: Stanovte obsah ethanolu v předloženém biologickém materiálu (krev či moč). Pomůcky: skleněné vialky, gumové zátky, pertle, pertlovací kleště, automatické pipety a špičky, centrifuga. 1. Příprava biologického materiálu k analýze a) Krev - zkumavka s předloženou krví se 5 minut centrifuguje při 3000 ot/min. Po centrifugaci se odbírá k jedné titraci 100 mL séra. b) Moč se pipetuje přímo bez předchozí centrifugace. 2. Vlastní analýza a) Do standardizovaných skleněných vialek se nepipetuje 0,5 ml biologického materiálu (séra, moči) a 0,5 ml vnitřního standardu – 0,4 ‰ (v/v) roztoku terciárního buthanolu. b) Vialka se uzavře gumovou zátkou a zapertluje pod dohledem vedoucího cvičení. Zapertlované vialka se vloží na termostatu plynového chromatografu. c) Stejným způsobem se připraví řada kalibračních roztoků se známým obsahem ethanolu o koncentraci 0,05 až 4,0 promile vždy se stejnou koncentrací vnitřního standardu. d) Spolu s vedoucím cvičení se provede nastavení parametrů GC-FID analýzy a spustí se analýza. 3. Vyhodnocení Odečtou se plochy píků odpovídající vnitřnímu standardu a píku ethanolu v kalibračních standardech a biologických vzorcích. Zkonstruuje se kalibrační křivka a vypočítá se koncentrace ethanolu v analyzovaném biologickém vzorku. Získaný výsledek se násobí přepočítávacími faktory zohledňujícími typ biologického materiálu: sérum = 0,7937 moč = 0,9852 Použitá literatura: 1. B. Levine, Principles of Forensic Toxicology, AACC Press; Fourth edition (2013). 2. A. Negrusz, G. Cooper, Clarke's Analytical Forensic Toxicology, Pharmaceutical Press; 2 edition (2013). Doplňující otázky: 1. Napište rovnice reakcí vyjadřující metabolismu ethanolu a ethylenglykolu. 2. Popište stručně princip plamenového ionizačního detektoru (FID), který se v plynové chromatografii využívá k detekci organických látek. 3. Jaký je princip detekčních zařízení pro orientační stanovení ethanolu v dechu při zkoušce řidičů na přítomnost alkoholu?
Příprava roztoků: 1. Roztok 5% jodidu draselného 25 g KI se rozpustí ve 475 mL deionizované vody. Roztok je potřeba uchovávat v temné lahvi. 2. Roztoku 0,25% dichromanu draselného v koncentrované kyselině sírové 1,25 g dichromanu draselného se rozpustní v mírně zahřáté deionizované vodě o objemu cca 15 mL a kvantitativně se převede do odměrné baňky na 500 mL. Roztok se doplní po značku koncentrovanou kyselinou sírovou. Dichroman draselný nesmí vykrystalizovat. Vzniklý roztok je potřeba uchovávat v temné lahvi a připravovat maximálně 2 dny před vlastním cvičením. 3. Roztok 1% škrobového mazu 1 g škrobu se smíchá v kádince s několika mL deionizované vody za vzniku kaše. Kaše se přelije 120 mL vařící deionizované vody a povaří se 15 min. Poté se nechá odpařit na výsledný objem 100 mL. Roztok je nutné uchovávat v tmavé lahvi. 4. Roztok 10% kyseliny chlorovodíkové 100 mL koncentrované kyseline chlorovodíkové (37%) se smíchá s 324 mL destilované vody. 5. Roztok 50 mM thiosíranu sodného 26 g pentahydrátu thiosíranu sodného se rozpustí ve 100 mL deionizované vody a zakonzervuje se přídavkem 1 g kyanidu rtuťnatého. Roztok je nutné uchovávat v lednici. 6. Roztok 5 mM thiosíranu sodného 25 mL 50 mM thiosíranu sodného se rozpustí ve 250 mL deionizované vody. Roztok se připraví vždy čerství před samotným stanovením.
