Spektrofotometrie
(KATA & Geochemie)
Stanovení disociační konstanty acidobazického indikátoru Teorie: Acidobazické indikátory se chovají buď jako slabé kyseliny nebo slabé báze a disociují ve vodných roztocích omezeně. Kvantitativní mírou disociace je hodnota disociační konstanty. Pro slabou jednosytnou kyselinu platí: HA(solv) ⇔ H+(solv) + A-(solv)
KA =
a H + ( solv ) ⋅ a A− ( solv ) a HA ( solv )
pH = pK A + log
a A− ( solv ) aHA ( solv )
(1) (2)
(3)
Hodnotu kyselé disociační konstanty lze tedy vypočítat ze změřených aktivit solvatovaného protonu, aniontu kyseliny a nedisociované formy kyseliny. Absorbuje-li solvatovaná forma aniontu, či nedisociované kyseliny elektromagnetické záření ve vhodné oblasti vlnových délek, je možno k měření jejich aktivit použít spektrofotometrii. Se změnou pH se rovnováha popsaná rovnicí (1) posouvá doleva nebo doprava. V silně kyselém prostředí je tedy aktivita aA-(solv) velmi malá, zatímco v zásaditém prostředí je zanedbatelná aktivita aHA(solv). Intenzita zabarvení při vlnové délce odpovídající absorpci A-(solv) se zvyšuje se zvyšujícím se pH, zatímco pro HA(solv) se snižuje (Obr. č. 1). Vlnová délka λiso, při které je hodnota absorbance nezávislá na míře disociace (tedy na poměrném zastoupení jednotlivých forem) látky, se nazývá „isosbestický bod“. V tomto bodě se všechny křivky závislosti absorbance na vlnové délce protínají (Obr. č. 1). Závislost absorbance kterékoliv formy (A-(solv), HA(solv)) na pH (Obr. č. 2) je sigmoidní křivka symetrická podle bodu inflexe, ve kterém je pKA = pH, neboť log (aA-(solv)/aHA(solv)) = 0, viz rovnice (3).
Obr. č. 1: Absorpční spektra roztoků methylové oranže při různých hodnotách pH roztoku
1
Spektrofotometrie
(KATA & Geochemie)
Stanovení disociační konstanty acidobazického indikátoru 1,600
A
1,400
-
1,200
HA
Absorbance
1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
pH
Obr. č. 2: Závislost absorbance disociované formy (měřeno při λmax (A-)) a nedisociované formy (měřeno při λmax (HA)) acidobazického indikátoru na hodnotě pH roztoku
Praktická část: Úkol: Zjistěte hodnotu kyselé disociační konstanty vzorku acidobazického indikátoru orientačně vlastním zrakem a porovnejte s výsledky získanými pomocí spektrofotometru. Určete hodnotu molárních absorpčních koeficientů obou forem tohoto indikátoru.
Chemikálie: • • • • •
kyselá složka – standardní Brittonův - Robinsonův pufr (0,04 mol·l–1 H3PO4, 0,04 mol·l–1 CH3COOH a 0,04 mol·l–1 H3BO3; pH = 1,81) zásaditá složka (0,2 mol·dm–3 NaOH) destilovaná voda vzorek indikátoru standardní kalibrační roztoky o pH 4,01 a 7,01
Přístroje: •
Laboratorní pH metr pHM 82 (Radiometer, Dánsko) s kombinovanou skleněnou elektrodou, kalibrovaný standardními kalibračními roztoky o pH 7,01 a 4,01. Dosaženou hodnotu pH pufru vždy kontrolujeme pH metrem! Při práci s pH metrem dejte pozor, aby nedošlo k rozbití baničky měrné elektrody – je z tenkého skla.
•
Spektrofotometr Pye-Unicam PU 8800 (Philips-Unicam, Anglie) připojený k řídícímu počítači a ovládaný vytvořeným software (Labview, National Instruments, USA).
•
Skleněné kyvety s tloušťkou absorpční vrstvy 10,00 mm.
•
Odměrné nádobí.
2
Spektrofotometrie
(KATA & Geochemie)
Stanovení disociační konstanty acidobazického indikátoru Pracovní postup: 1. Orientační určení pKA: a. Zjistěte zabarvení disociované a nedisociované formy indikátoru pomocí roztoku pufru a hydroxidu. Do jedné kádinky odlijte cca 20 ml kyselé složky Brittonova-Robinsonova pufru a do druhé cca 20 ml 0,2 M NaOH. Do obou kádinek přidejte cca 10 kapek indikátoru, roztoky promíchejte a pozorujte jejich zabarvení. b. Nakalibrujte si pH-metr pomocí standardních roztoků. Zjistěte přibližnou hodnotu pH pro barevný přechod indikátoru: Do kádinky, která se vejde pod hlavici pH-metru, odměřte odměrným válcem cca 80 ml kyselé složky Brittonova-Robinsonova pufru a přidejte cca 1 ml vzorku indikátoru. K takto připravenému roztoku přidávejte z byrety roztok NaOH a sledujte změny zabarvení roztoku. Změní-li indikátor zabarvení tak, že tato barva bude odpovídat přibližnému zastoupení disociované a nedisociované formy v poměru 1 : 1, odečtěte hodnotu pH, která přibližně odpovídá hodnotě pKA, viz rovnice (3). Během tohoto experimentu sledujte, zda váš vzorek indikátoru nejeví dva barevné přechody. V případě dvoupřechodového indikátoru se dále zabývejte pouze druhým přechodem (tj. tím, při vyšší hodnotě pH). 2. Spektrofotometrické stanovení pKA: a. Připravte do 50ml odměrných baněk sadu alespoň 10-ti roztoků vzorku indikátoru o vždy stejné analytické koncentraci indikátoru (ředění je uvedeno na lahvičce se vzorkem indikátoru) a proměnné hodnotě pH: Odměrné baňky s indikátorem doplňte po rysku připravenými roztoky Brittonova-Robinsonova pufru o zvolených hodnotách pH. Hodnoty pH pufrů volte tak, abyste obsáhli barevný přechod indikátoru (± 1 jednotka pH od orientačně určené hodnoty pK) a dále pH disociované A-(solv) a nedisociované HA(solv) formy indikátoru. b. Proměřte pečlivě spektra všech připravených roztoků ve viditelné oblasti. Ovládání spektrofotometru a řídícího software je popsáno v samostatném oddílu na další straně. 3. Vyhodnocení výsledků: a. Ze všech digitalizovaných spekter zkonstruujte jeden jediný graf. (Jako na Obr. č. 1.) b. Odečtěte pečlivě polohy maxim absorbance pro disociovanou (λmax (A-)) a nedisociovanou (λmax (HA)) formu a polohu isosbestického bodu (λiso) vašeho vzorku indikátoru. c. Odečtěte příslušné hodnoty absorbancí při λmax (A-) a λmax (HA) a vyneste je opět do jednoho grafu v závislosti na pH. (Jako na Obr. č. 2.) d. Pro tyto dvě závislosti zkonstruujte ještě derivační křivky, opět do společného grafu. e. Odečtěte hodnoty pKA z inflexních bodů sigmoidních křivek a extrémů (maxima a minima) jejich derivací a porovnejte je. Odpovězte na otázky ve výsledkovém listu. f. Z limitních hodnot (absorbance) sigmoidních křivek vypočítejte podle LambertovaBeerova zákona přibližnou hodnotu molárních absorpčních koeficientů disociované a nedisociované formy vašeho vzorku indikátoru. g. Získaná data přehledně zpracujte a spolu s výsledky uveďte do protokolu.
3
Spektrofotometrie
(KATA & Geochemie)
Stanovení disociační konstanty acidobazického indikátoru Ovládání spektrofotometru a řídícího software: Registrační spektrofotometr PU 8800 může pracovat samostatně bez nutnosti připojení řídícího počítače, kdy jsou výstupem křivky na milimetrovém papíře ze zapisovače. Spektrofotometr je vybaven sériovým rozhraním RS-232C, přes které je možné ho řídit, nastavovat podmínky, spouštět měření a také sbírat naměřená data. Připojením k řídícímu počítači bylo docíleno možnosti zisku dat (spekter) v elektronické podobě.
Postup: •
Zapněte spektrofotometr hlavním vypínačem a počkejte na proběhnutí testovacího programu.
•
Zapněte řídicí počítač a spusťte program „Měření spekter.vi“.
•
Inicializujte spojení spektrofotometru s počítačem postupným stlačením těchto tlačítek: „*“,
„MODIFY“,
„ENTER“,
„ENTER“
a
otočte
klíčkem
do polohy
„LOCK/REMOTE“. Tímto je spektrofotometr přepnut do modu řízení počítačem; to se projeví pípnutím přístroje, když kliknete na bílou šipku základního ovládání Labview v levé horní části obrazovky. •
Na čelním panelu programu navolte parametry měření: „Počáteční vlnová délka: 700 nm“, „Konečná vlnová délka: 400 nm“, „Rychlost snímání spektra: 2 nm·s–1“, „Šířka spektrálního intervalu: 1 nm“, „Krok digitalizace spektra: 2 nm“, zapněte „Overlay“ a „Vynulování spektrometru“ a potvrďte tlačítkem „Potvrdit parametry“.
•
Dále postupujte dle dialogových oken programu.
•
Po skončení měření se výsledné spektrum objeví na obrazovce počítače a zároveň je uloženo na harddisk počítače v podobě textového dokumentu se sloupcem vlnových délek a sloupcem hodnot absorbance.
•
Již v průběhu měření lze odečítat hodnoty absorbancí a vlnových délek z naměřených spekter. Způsob odečtu ukáže na požádání dozor praktika.
4
VÝSLEDKOVÝ LIST – Spektrofotometrie – Stanovení disoc. konst. acidobazického indikátoru Příjmení, jméno:
Úloha vypracována dne:
Turnus číslo:
Datum odevzdání protokolu:
Studijní obor: Přepracovat a doplnit (+ datum):
V pořádku dne:
Úkol: Určení důležitých analytických vlastností acidobazického indikátoru pomocí spektrofotometru a porovnat s vlastním pozorováním chování vzorku. Chemikálie, přístroje, pomůcky a pracovní postup: Viz návod k úloze. 1. Tab. 1 Orientační určení pKA: forma indikátoru nedisociovaná první rovnováha disociovaná do I. stupně druhá rovnováha disociovaná
pH
barva
Odhadnutá hodnota pKA = ______. 2. Vlastnosti indikátoru určené ze spektrofotometrických měření: λiso = ______ nm Tab. 2
ε(HA) = _______ ________
ε(A-) = _______ ________
Absorbance indikátoru v maximech pro zvolené hodnoty pH: AHA (λmax(HA) = ______ nm) AA- (λmax(A-) = ______ nm) pH
Grafy vynesených závislostí včetně grafu derivačních křivek a spekter na zvláštním listu přiložte k tomuto výsledkovému listu. Do grafů vyznačte vlnové délky absorpčních maxim, isosbestický bod a způsob odečtení hodnoty pKA acidobazického indikátoru. Výsledek, závěr a diskuze: Použitá koncentrace vzorku č. _____ indikátoru ________ mol·l–1 Hodnota pKA acidobazického indikátoru odečtená ze sigmoidních křivek je _____. Hodnota pKA acidobazického indikátoru odečtená z derivačních křivek je _____. Která z metod určení pKA je vhodnější a proč? Z jakého důvodu se liší odhadnutá hodnota pKA od té naměřené?
1/1
