Stanovení biomarkerů oxidativního stresu u kapra obecného (Cyprinus carpio L.) po dlouhodobém působení simazinu Hlavní řešitel – Ing. Alžběta Stará Vedoucí projektu – dr. hab. Ing. Josef Velíšek, Ph.D. 1
Úvod
Triaziny
• Herbicidní vlastnosti objeveny v roce 1952. • Do rostlin se vstřebávají přes listy a kořeny → inhybují fotosyntézu, (primárním místem účinku je inhibice Hillovy reakce fotosyntetického elektronového přenosu v izolovaných chloroplastech).
• Vážné riziko nebezpečí: – velmi nízká biologická rozložitelnost, – dlouhodobá vytrvalost ve vodním prostředí (podzemní vody). – Poločas rozkladu je - 500 dní ve vodě, - 3 roky v půdě. • V členských státech Evropského společenství jsou identifikovány jako prioritní látky nebezpečné pro vodní prostředí.
• Toxicitu pro ryby: - 96 hLC50 v rozmezí od 1 do 100 mg/l.
2
Úvod
Triaziny
• Charakteristické patologickomorfologické příznaky otravy: • tvorba transudátu v dutině tělní a v trávicím ústrojí, • → zvětšení tělní dutiny.
Akutní test toxicity 96 hLC50 na kapru obecném. A: Kontrolní kapr obecný, B: pokusný kapr obecný po akutní expozici triazinu.
• Klinické příznaky otravy: • útlumové fáze, • tmavé zbarvení.
• Otrava ryb je doprovázena: • poklesem koncentrace hemoglobinu, • výrazným snížením koncentrace plazmatických bílkovin.
3
Simazin Bílá krystalická látka, málo rozpustná ve vodě (5 mg/l při 20 °C), dobře rozpustná v organických rozpouštědlech (chloroform 900 mg/l, methanol 400 mg/l). Selektivní triazinový herbicid
Použití: pre- a postemergentní kontrola plevelů, ničení ponořené vodní vegetace a řas v rybníkách a pomalu tekoucích vodách, neselektivní použití – proti plevelům v průmyslových oblastech. Kontaminace ŽP: při aplikaci, veškerá manipulace s herbicidními přípravky s jeho obsahem, splachem z ošetřených prostor se dostává do vod.
4
Simazin Akutní toxicita: Testovaný organismus
96 h LC50 [mg/l]
Kapr obecný (Cyprinus carpio L.)
4,0
Pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss)
5,0
Slunečnice velkoploutvá (Lepomis macrochirus)
5,0
Karas stříbřitý (Carassius auratus auratus)
40,0
Nejvyšší koncentrace zaznamenaná v českých řekách 0,06 μg/l. Jeden z nejpoužívanějších pesticidů v USA a Australii. V současnosti považován za nebezpečný pro životní prostředí → zahrnut na listině prioritních látek pro testování v EU a USA. 5
Oxidační stres & antioxidanty • Vznik oxidačního stresu v organismu ryb je ovlivněn produkty biologického rozkladu polutantů (pesticidů).
• polutanty → ovlivňují reaktivní formy kyslíku a z měny v antioxidačních systémech. • Oxidativní stres je výsledkem nerovnováhy produkce a eliminace volných radikálů ve prospěch jejich produkce.
• Reaktivní kyslíkové radikály vznikají v buňkách přirozeně → množství je regulováno antioxidačním systémem, skládajícím se z: - enzymatické - neenzymatické části.
Cíl • Posouzení dlouhodobého vlivu simazinu na
vybrané tkáně kapra obecného (Cyprinus carpio L.) pomocí biomarkerů oxidativního stresu a antioxidačních parametrů.
7
Material a metody • kapr obecný (Cyprinus carpio) - délky těla 21,31 ± 2,05 cm - hmotnosti 282,05 ± 38,08 g • osm 200 l akvárií po 16 kusech ryb – teploty vody (19,1 ± 1,3 °C), – pH (7,5 ± 0,4), – nasycení vody kyslíkem (90 – 95 %).
• experimentální koncentrace simazinu: • 0,06 µg/l • 2 mg/l • 4 mg/l • Testy subchronické toxicity → prováděny podle ČSN ISO 10229 a 8 OCED Guideline for Testing of Chemicals 215.
Materiál a metody • Odběr vzorků tkání: • 14, 28 a 60 den • mozek, žábra, sval, játra, střevo • Měřené biomarkery: – oxidačního stresu • reaktivní kyslíkové radikály (ROS) – antioxidační • superoxid dismutáza (SOD), • kataláza (CAT), • glutathion peroxidáza (GPx), • glutathion reduktáza (GR), • redukovaný glutathion (GSH).
Výsledky
Biomarkery oxidačního stresu - Reaktivní kyslíkové radikály: Mozek
kontrolní skupina simazin 2 mg/L
simazin 0.06 μg/L simazin 4 mg/L *
140
120
120
ROS (%)
160
140 100 80
simazin 0.06 μg/L simazin 4 mg/L *
180
160
100 80
60
60
40
40
20
20
0
0 14 dní
28 dní
60 dní
Játra
14 dní kontrolní skupina simazin 2 mg/L
28 dní
60 dní
simazin 0.06 μg/L simazin 4 mg/L
* 180
* *
160 140
ROS (%)
ROS (%)
180
kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Sval
120 100 80 60 40 20 0 14 dní
28 dní
60 dní
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0.01.
Výsledky
Antioxidační biomarkery
- Aktivita superoxid dismutázy: kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Sval 90
*
SOD (U/mg protein)
80
*
70 60
simazin 0,06 μg/l simazin 4 mg/L
* *
50 40
*
30
*
20 10 0 14 dní
28 dní
60 dní
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0.01.
Výsledky
Antioxidační biomarkery
- Aktivita katalázy: kontrolní skupina simazin 2 mg/L
simazin 0,06 μg/L simazin 4 mg/L 40
*
*
kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Sval
*
*
simazin 0,06 μg/L simazin 4 mg/L *
35
CAT (U/mg protein)
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
*
30 *
25 20
*
15
*
10
*
5 0
14 dní
28 dní
60 dní
14 dní kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Játra 80 70
CAT (U/mg protein)
CAT (U/mg protein)
Mozek
*
*
*
28 dní
60 dní
simazin 0,06 μg/L simazin 4 mg/L
*
60 50 40 *
30
*
20 10 0 14 dní
28 dní
60 dní
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0.01.
Výsledky
Antioxidační biomarkery
- Aktivita glutathion peroxidázy
kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Játra
simazin 0,06 μg/L simazin 4 mg/L
GPx (mU/mg protein)
60 50 * 40
*
*
*
*
30 20 10 0 14 dní
28 dní
60 dní
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0.01.
Výsledky
Antioxidační biomarkery
- Hladina redukovaného glutathionu:
kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Mozek
simazin 0,06 μg/L simazin 4mg/L
80
* *
60 50 *
40
*
30 20 10 0
GSH (μg/mg protein)
GSH (μg/mg protein)
70
kontrolní skupina simazin 2 mg/L
Játra
*
70 60
simazin 0,06 μg/L simazin 4mg/L
* *
*
*
*
*
50 40 *
30 20 10 0
14 dní
28 dní
60 dní
14 dní
28 dní
60 dní
Data are means ± S.D., N=8. Significant differences compared with control value, * < 0.01.
Závěr • Dlouhodobé působení simazinu ovlivňuje rovnováhu mezi oxidačním stresem (ROS) a antioxidanty (SOD, CAT, GPx a GSH) v tkáních kapra obecného. • Neprokázal se nám vliv dlouhodobého působení simazinu v tkáních kapra obecného na enzymatickou aktivitu GR.
• V žaberní a střevní tkáni nebyly zjištěny žádné změny měřených parametrů mezi testovanými skupinami. • Výsledky potvrzují předpoklad, že triaziny způsobují oxidativní stres v tkáních ryb.
Děkuji za pozornost
16
