STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM ® ANTIOXIDAČNÍ KAPACITA RŮZNÝCH DRUHŮ MASA (drůbeží, rybí)
Princip metodiky: Analyzátor Photochem® je určen pro stanovení antioxidační kapacity vybraných komodit rostlinného i živočišného původu a krevní plasmy. Analýza je založená na fotochemiluminescenci, která je využita pro stanovení antioxidační kapacity antioxidantů rozpustných ve vodě (ACW) a antioxidační kapacity antioxidantů rozpustných v tucích (ACL) a umožňuje kvantifikaci antioxidačního stavu. Princip měření je založen na produkci volných radikálů optickou excitací fotosensitivního roztoku (je součástí setu pro analýzu). Tyto radikály jsou částečně eliminovány reakcí s antioxidanty ve vzorku. Zbylé radikály vyvolávají luminiscenci, která je detekována detektorem a využita pro stanovení antioxidační kapacity vzorku. Výsledky jsou kvantifikovány srovnáním s kalibrační křivkou a vyjádřeny jako ekvivalenty standardu (využitého ke kalibraci) a to Troloxu ® (analog vitaminu E) pro ACL antioxidanty a jako ekvivalenty kyseliny askorbové pro ACW antioxidanty. Výsledky jsou vyhodnoceny softwarem PCLSoft a vyjádřeny jako ekvivalenty standardu v nmol/l, případně v μmol/l
spolu s relativní směrodatnou odchylkou (RSD)
vyjádřenou v procentech.
STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ANTIOXIDANTŮ ROZPUSTNÝCH VE VODĚ (ACW) Složení setu pro stanovení ACW:
-
Činidlo R1 – diluent (sample solvent, ředidlo) – nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce)
-
Činidlo R2 – reaction buffer (pufr) – nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce)
-
Činidlo R3 – fotosensitivní roztok - uchováván při -20 ºC a po naředění při 4 ºC 1
-
Činidlo R4 – standard – kyselina askorbová - uchováván při -20 ºC Činidlo R3 (fotosensitivní roztok) je nutno před vlastní analýzou nechat rozpustit při
laboratorní teplotě a následně naředit 750 μl činidla R2. Tím je činidlo R3 dostatečné pro 40 stanovení. Je nutné jej uchovávat v temnu a chladu (cca 4 ºC) a to i při vlastní analýze, protože je velmi citlivý na světlo.
Kalibrace Kalibrace, respektive příprava kalibrační přímky, je provedena pomocí ředění standardního roztoku. -
příprava zásobního roztoku (10 nmol/l) - rozpuštěním standardu (zamražený a vysušený) v 500 μl činidla R1
-
příprava pracovního roztoku R5 (0,1 nmol/l) – naředěním zásobního roztoku 1:100 (10 μl zásobního roztoku a 990 μl činidla R1) činidlem R1 Dále je nutno sestrojit kalibrační křivku na základě série měření standardů kyseliny
askorbové v rozmezí 0,2 – 2,5 nmol (to je 2 – 25 μl pracovního roztoku) metodou lineární regrese. Před každým měřením je nutno stabilizovat přístroj měřením slepých vzorků (minimálně 3x) a následně jednoho ze standardů, využitých pro kalibraci. Preanalytická příprava vzorku Pro stanovení antioxidační kapacity vzorků mase je možné využít různé matrice (maso hovězí, vepřové, kuřecí, nebo rybí). Nevýhodou hovězího a vepřového masa je vyšší podíl šlach, které někdy komplikují homogenizaci vzorku. Nejvhodnější matricí se jeví jako maso kuřecí, která ale rychleji podléhá procesu kažení a s tím souvisejícím úbytkem antioxidantů. Maso rybí je vhodnou matricí, ale je nutné zde počítat s vyšším obsahem tuku. U rybího masa je vhodné odebírat svalovinu z boku, jako filet, bez kostí a tu potom použít pro homogenizaci. Vzorky je nutné zhomogenizovat na homogenizátoru s deionizovanou vodou (nejčastěji v poměru 1:3). Homogenát se odstřeďuje 4000ot/20 min. Odebere se supernatant, 2
který se dále používá pro vlastní analýzu. Je možné supernatant používat neředěný, nebo dle potřeby naředit 10-50x. (Pro oddělení lipidové fáze se nejčastěji využívá chloroform, který se následně odpaří a získá se vodní fáze).
Dále pokračujte dle tabulky: Činidlo [ml]
R1
R2
R3
R5
Vzorek
Slepý vzorek
1,5
1
0,025
0
0
Kalibrace
1,5-X
1
0,025
X (0,0020,025)
0
Měření
1,5-Y
1
0,025
0
Y
VÝSLEDKY Pomocí softwaru PCLSoft je vytvořena kalibrační přímka, vyjádřena její rovnice včetně R2 koeficientu. Na jejím základě jsou výsledky vzorků extraktů masa vyjádřeny jako ekvivalenty kyseliny askorbové v nmol/l nebo μmol/l. Doporučuje se každý vzorek měřit jako triplikát, standardy 2-3x a slepý do ustálení přístroje.
STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ANTIOXIDANTŮ ROZPUSTNÝCH V TUCÍCH (ACL) Složení setu pro stanovení ACL:
-
Činidlo R1 – diluent (sample solvent, ředidlo) – METHANOL
-
Činidlo R2 – reaction buffer (pufr) – nutno uchovávat při 4 ºC (v chladničce)
-
Činidlo R3 – fotosensitivní roztok - uchováván při -20 ºC a po naředění při 4 ºC
-
Činidlo R4 – standard – Trolox = ve vodě rozpustný analog vitaminu E - uchováván při -20 ºC 3
Činidlo R3 (fotosensitivní roztok) je nutno před vlastní analýzou nechat rozpustit při laboratorní teplotě a následně naředit 750 μl činidla R2. Tím je činidlo R3 dostatečné pro 40 stanovení. Je nutné jej uchovávat v temnu a chladu (cca 4 ºC) a to i při vlastní analýze, protože je velmi citlivý na světlo.
Kalibrace Kalibrace, respektive příprava kalibrační přímky, je provedena pomocí ředění standardního roztoku. -
příprava zásobního roztoku (10 nmol/l) - rozpuštěním standardu (zamražený a vysušený) v 500 μl činidla R1
-
příprava pracovního roztoku R5 (0,1 nmol/l) – naředěním zásobního roztoku 1:100 (10 μl zásobního roztoku a 990 μl činidla R1) činidlem R1 Dále je nutno sestrojit kalibrační křivku na základě série měření standardů Troloxu
v rozmezí 0,2 – 2,5 nmol (to je 2 – 25 μl pracovního roztoku) metodou lineární regrese. Před každým měřením je nutno stabilizovat přístroj měřením slepých vzorků (minimálně 3x) a následně jednoho ze standardů, využitých pro kalibraci. Preanalytická příprava vzorku Pro stanovení antioxidační kapacity vzorků mase je možné využít různé matrice (maso hovězí, vepřové, kuřecí, nebo rybí). Nevýhodou hovězího a vepřového masa je vyšší podíl šlach, které někdy komplikují homogenizaci vzorku. Nejvhodnější matricí se jeví jako maso kuřecí, která ale rychleji podléhá procesu kažení a s tím souvisejícím úbytkem antioxidantů. Maso rybí je vhodnou matricí, ale je nutné zde počítat s vyšším obsahem tuku. U rybího masa je vhodné odebírat svalovinu z boku, jako filet, bez kostí a tu potom použít pro homogenizaci. Pro stanovení antioxidační kapacity ACL jsou vzorky extrahovány spolu s organickým rozpouštědlem. Po odpaření rozpouštědla je vhodné vzorek zamrazit dusíkem (pod tlakem), aby nedocházelo ke ztrátám antioxidantů (tento způsob úchovy je možné využít i pro vzorky 4
ke stanovení antioxidační kapacity ACW). Lipidový extrakt ze svaloviny (cca 11 mg) je následně rozpuštěn v 1 ml methanolu a 0,4 ml n-hexanu (extrakt z lososa je v množství cca 100 mg rozpuštěn v 1 ml n-hexanu). Dále pokračujte dle tabulky: Činidlo [ml]
R1
R2
R3
R5
Vzorek
Slepý vzorek
2,3
0,2
0,025
0
0
Kalibrace
2,3-X
0,2
0,025
X (0,0020,025)
0
Měření
2,3-Y
0,2
0,025
0
Y
VÝSLEDKY Pomocí softwaru PCLSoft je vytvořena kalibrační přímka, vyjádřena její rovnice včetně R 2 koeficientu. Na jejím základě jsou výsledky vzorků extraktů masa vyjádřeny jako ekvivalenty Troloxu v nmol/l nebo μmol/l. Doporučuje se každý vzorek měřit jako triplikát, standardy 23x a slepý do ustálení přístroje.
5
Obr. 1. Naměřené křivky slepého vzorku (blanku) a kalibračních standardů pro stanovení ACW antioxidační kapacity. Slepý vzorek (A) a standardy (B, C, D, E).
Obr. 2. Naměřené křivky slepého vzorku (blanku) a kalibračních standardů pro stanovení ACL antioxidační kapacity. Slepý vzorek (A) a standardy (B, C, D, E). 6
Obr. 3. Příklad kalibrační křivky (lineární regrese) kyseliny askorbové, stanovení ACW.
Obr. 4. Příklad kalibrační křivky (lineární regrese) Troloxu, stanovení ACL.
7
