CERTIFIKÁT ISO 9001:2000
ST AIA – PACK cTnI 2nd-Gen NÁZEV A POUŽITÍ AIA-PACK cTnI 2-nd-Gen je určen pouze pro diagnostické užití „in vitro“ ke kvantitativnímu měření srdečního troponinu I (cTnI) v lidském séru a heparinizované plazmě na analyzátorech TOSOH AIA System. Měření srdečního troponinu I je používáno jako pomoc při akutním infarktu myokardu. PŘEHLED A POPIS STANOVENÍ Troponin existuje jako komplex tří odlišných proteinů : troponin T, troponin C a troponin I. Troponiny regulují vzájemné vazby myosinu a aktinu v kosterním i srdečním svalstvu s troponinem I vystupujícím jako actinomyosin-ATPáza inhibitor. Jsou identifikovány tři izoformy troponinu I jako produkty zvláštních genů, které jsou jedinečnou sekvencí aminokyselin. Srdeční troponin I je nalezen výlučně v srdeční tkáni. Ačkoli tři formy troponinu I sdílejí stejnou strukturu, cTnI s pořadím 31 aminokyselinových zbytků v řetězci mohou být imunochemicky rozlišeny tak dobře jako troponin C a troponin T. Monoklonální protilátky reagují s jedinečnými epitopy molekul troponinu a tím umožňují velkou specifitu pro cTnI. Biochemické markery myokardu jsou považovány za „ zlatý standard“ pro diagnostiku AMI a jsou důležité zejména při negativním nálezu EKG. Klinická vyšetření mohou prokázat zvýšenou hladinu troponinu I velmi prospěšnou v určení diagnózy kardiospecifických poranění u pacientů s AMI, myokardiálním zhmožděním a nestabilní anginou. Následně po AMI je cTnI uvolněn do krevního oběhu z poškozeného srdečního svalu a během 4-8 hodin hladina cTnI stoupá nad hladinu stanovenou pro vzorky bez AMI. Vrcholu koncentrace dosáhne obecně za 12-18 hodin po začátku AMI a hodnota cTnI zůstává zvýšená 5-10 dnů. Troponin I se projevuje dočasně vyšší a nižší u AMI pacientů podobně tak u CK-MB. Nedávné studie prokázaly, že díky vyšší specifitě se cTnI využívá více než CKMB při onemocnění myokardu, zejména v přítomnosti poškození kosterního svalu a zranění (rabdomyom, traumata). PRINCIP STANOVENÍ AIA-PACK cTnI 2nd-Gen je sendvičový imunoenzymový test, který se provádí výhradně v AIA-PACKu. Troponin I přítomný v testovaném vzorku se váže s monoklonální protilátkou imobilizovanou na magnetických částicích a monoklonální protilátkou značenou enzymem. Částice jsou promývány, aby se odstranila nenavázaná protilátka značená enzymem, a pak jsou inkubovány s fluorogením substrátem (4MUP). Množství enzymem značené monoklonální protilátky vázané na částice je přímo úměrné koncentraci troponinu I ve vzorku. Kalibrační křivka je sestavena na základě známých koncentrací a neznámé koncentrace vzorků se počítají podle této křivky. ST AIA PACK cTnI 2nd-Gen nahrazuje původní AIA PACK cTnI a je označen jako druhá generace, aby nedošlo k omylu. MATERIÁL DODÁVANÝ (AIA-PACK cTnI 2nd-Gen kat.č. 025205) Plastové kelímky obsahující 12 lyofilizovaných magnetických mikrokuliček potažených myší protilátkou antitroponin a 100 μl monoklonální myší protilátky (k lidskému troponinu I) konjugované s hovězí alkalickou fosfatázou. MATERIÁL POTŘEBNÝ, NEDODÁVANÝ Následující materiál není součástí AIA-PACKu, ale je potřebný ke stanovení troponinu I na analyzátorech TOSOH. Substrátový set kat.č. 020968 Kalibrační set cTnI 2nd-Gen 025305 1 0 ng/ml 2 2 ng/ml 3 5 ng/ml 4 15 ng/ml 5 45 ng/ml 6 120 ng/ml Roztok na ředění vzorků 025505 Promývací koncentrát 020955 Ředící koncentrát 020956 Standardizační kelímky 020970 Ředící kelímky 020971 Pipetovací špičky 019215L Ke stanovení na analyzátoru AIA lze použít pouze reagencie a materiály dodávané firmou TOSOH. VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 1. AIA-PACK cTnI 2nd-Gen je určen pouze pro diagnostiku „in vitro“. 2. Testovací kelímky různých šarží nelze použít ve stejné sérii stanovení.
1
3. AIA-PACK cTnI 2nd-Gen obsahuje azid sodný, který může reagovat s olověnými nebo měděnými instalacemi a vytvářet potenciálně výbušné kovové azidy. Pokud likvidujete takové reagenty, vždy je spláchněte velkým množstvím vody. 4. Lidská séra se při přípravě tohoto produktu nepoužívají, ale vzhledem k tomu, že vzorky jsou lidská séra a kontroly kvality mohou být vyrobeny z lidských sér, použijte standardní laboratorní bezpečnostní postupy při manipulaci se všemi vzorky a kontrolami. 5. Nepoužívejte po uplynutí expirační doby. 6. AIA-PACK cTnI 2nd-Gen je připraven tak, že „hook effekt“ ve vysokých hodnotách pro většinu vzorků není problém. Vzorky s hodnotami troponinu I mezi 120 a 24800 ng/ml jsou načítány jako > 120 ng/ml. „Hook effect“ se může vyskytnout až při koncentracích troponinu > 24800 ng/ml. 7. ST AIA-PACK cTnI 2nd-Gen nelze použít na analyzátoru AIA 600. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Všechny neotevřené materiály jsou stabilní až do data expirace uvedeném na obalu, pokud jsou skladovány při stanovených teplotách. Chladnička (2–8°C): 1. AIA-PACK cTnI 2nd-Gen 2. Kalibrační set 3. Roztok na ředění vzorků 4. Substrátový set 5. Promývací koncentrát 6. Ředící koncentrát Pokojová teplota (18-25°C): 1. Standardizační kelímky 2. Ředící kelímky Testovací kelímky AIA-PACK cTnI 2nd-Gen mohou být do 24 hodin skladovány při pokojové teplotě 18– 25°C. Kalibrátory a ředící roztoky mohou být použity během 7 dní od otevření, pokud jsou dobře utěsněny a uloženy v chladničce při 2 -8 °C. Rekonstituovaný substrátový roztok je stabilní 3 dny při pokojové teplotě (18-25°C) nebo 7 dní v chladničce (2–8°C). Ředící a promývací roztoky jsou stabilní 30 dní při pokojové teplotě (18-25°C). Reagenty by se neměly používat, pokud se jeví zakalené nebo zbarvené ODBĚR A ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ • Pro stanovení je třeba sérum nebo heparinizovaná plazma. Citrátová plazma nesmí být použita. Speciální příprava pacienta není nutná. • Pro stanovení v séru se odebere vzorek žilní krve sterilně bez přídavků. Krev se nechá srazit (obvykle 15-45 minut při 18-25° C) a pak se sérum oddělí centrifugací. • Pro stanovení v plazmě se odebere vzorek žilní krve sterilně s přídavkem heparinu, plazma se oddělí centrifugací. • Typy vzorků nelze zaměňovat během monitorování jednoho pacienta. Měřené hodnoty mohou být nepatrně odlišné u různých typů odběrů. • Vzorky je možné skladovat při 2-8 °C až 24 hodin před analýzou. Pokud není možné provést analýzu do 24 hodin, musí se vzorek zmrazit na –20°C nebo méně. Analýzu je pak možné provést během 60 dní. • Je třeba se vyvarovat opakovaného zmrazování a rozmrazování vzorků. Zakalené vzorky séra nebo vzorky obsahující částečky je nutné odstředit. Před stanovením přeneste zmrazené vzorky do pokojové teploty (18–25°C) a pomalu promíchejte. • V důsledku klinických postupů jako administrace anti-trombolytických činidel u pacientů, pro které je žádán tento test a proto, že je test objednáván často jako statim, může být přítomen ve vzorku fibrin. Přítomnost fibrinu ve vzorku může být příčinou falešně negativních výsledků nebo falešně pozitivních výsledků, když se fibrin sráží během analýzy. Vzorek musí být připraven tak, aby byl bez fibrinu • Pro analýzu je třeba 50 µl vzorku. POSTUPY . Podrobné informace vyhledejte v uživatelském manuálu k analyzátoru AIA 600 II a AIA 360 I. Příprava reagencií 1. Substrát - přidejte celý obsah (100 ml) substrátového ředícího roztoku k lyofilizovanámu substrátu, důkladně promíchejte až do úplného rozpuštění. 2. Promývací roztok - přidejte celý obsah (100 ml) promývacího koncentrátu k cca 2 l destilované vody, dobře promíchejte a doplňte destilovanou vodou na konečný objem 2,5 l. 3. Ředící roztok - přidejte celý obsah (100 ml) ředicího koncentrátu k cca 4 l destilované vody, dobře promíchejte a doplňte destilovanou vodou na konečný objem 5 l. II. Kalibrace Kalibrátory pro ST AIA-PACK cTnI 2nd-Gen jsou připraveny gravimetricky a porovnávány s vnitřními referenčními standardy Kalibrační křivka Kalibrační křivka má platnost po dobu 90 dní, pokud se s reagenciemi manipuluje podle instrukcí výrobce a přístroj je standardně udržován.
2
Častější rekalibrace může být vyžadována, pokud jsou kontroly mimo stanovené rozmezí pro tuto analýzu nebo pokud se provádějí určité servisní zásahy (např. seřizování teploty, změny mechanismu vzorkování, seřizování nebo výměna detektorové lampy ). Kriteria přijatelnosti kalibrace 1. Průměr rychlosti pro kalibrátor 1 by měl být < 0,5 nm/s. 2. Rychlost je přímo úměrná koncentraci, rychlost stoupá s koncentrací. 3. Reprodukovatelnost do 10%. III. Kontrola kvality Komerčně dostupné kontrolní materiály by měli být používány nejméně 1x denně. Šarže kontrolního materiálu, přijatelné limity a opravné kroky, jestliže kontroly nesplnily kriteria laboratoře, jsou zaznamenány v samostatném dokumentu kontroly kvality. POZNÁMKY K POSTUPU 1. Lyofilizovaný substrát musí být zcela rozpuštěn. 2. Je-li koncentrace troponinu I ve vzorku séra vyšší než limit rozsahu analýzy, musí se vzorek zředit pomocí ředícího roztoku cTnI 2nd-Gen a znovu stanovit. Doporučené ředění pro vzorky vyšší než koncentrace nejvyššího kalibrátoru je 1:5 nebo 1:10. Je třeba ředit sérum tak, aby výsledek byl mezi 2-100 ng/ml. Faktor ředění lze zadat do softwaru AIA 600 II. Další informaci k ředění vzorků najdete v konkrétním uživatelském manuálu. 3. Systémy AIA mohou ukládat dvě různé kalibrační křivky pro každou metodu zároveň. Proto mohou být během stejného měření použity dvě šarže testovacích kelímků. 4. Pokud nejsou specifikace pro daný test ještě v systémovém softwaru, musí být zadány pod kódem testu 093. VÝPOČET VÝSLEDKŮ Systémy AIA veškerou manipulaci s výsledky provádějí automaticky. Načítají hodnotu fluorescence vzniklé při reakci a automaticky převádějí na koncentraci troponinu v ng/ml. Pro ředěné vzorky stanovené na AIA 600 II se automaticky vypočítá správný výsledek podle koeficientu ředění, který je zadán do softwaru před stanovením ředěného vzorku. Kalibrační křivka ukazuje algoritmus použitý pro výpočet koncentrace.
HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Kontrola kvality • Za účelem sledování a hodnocení přesnosti analytické metody se doporučuje, aby komerčně dostupné kontrolní materiály byly zpracovávány v každé sérii stanovení. • Jestliže jedna nebo více hodnot kontrolních vzorků leží mimo přijatelný rozsah, je nezbytné ověřit platnost kalibrační křivky před vydáním pacientských výsledků. • Standardní laboratorní postupy by měly být v souladu s nařízenými postupy laboratoře. OMEZENÍ ANALÝZY • Pro diagnostické účely musí být výsledky získané tímto stanovením využity v kombinaci s ostatními údaji ( např. symptomy, výsledky jiných testů, klinické dojmy, způsob léčby, atd. ). Výsledky troponinu nelze nikdy udávat jako jediné faktory v léčbě pacienta. • Lékaři si musí uvědomit, že publikovaná literatura ukazuje možné interference ve stanovení troponinu I, tedy falešně negativní a falešně pozitivní výsledky. Studie pacientů s určenou myokarditidou a s rozšířenou kardiopatií ukazují, že specifické kardiální protilátky mohou být obsaženy v séru i plazmě těchto a dalších pacientů. Protilátky jsou vytvářeny proti srdečním proteinům a ty by mohly způsobit falešně negativní výsledky, jestliže protilátky by zasahovaly do epitopů používaných v částech výroby analýzy. • Vzorky pacientů mohou obsahovat lidské proti-myší protilátky (HAMA) potřebné buď k přirozené tvorbě protilátek nebo protilátky odpovídají na léčbu. HAMA mohou způsobit falešně pozitivní nebo falešně negativní výsledky při použití myších monoklonálních protilátek. I další heterofilní protilátky zasahují do analýzy tohoto typu. AIA Pack cTnI 2nd-Gen může minimalizovat následky heterofilních protilátek, ale interference vysokých titrů nemohou odstranit úplně. • Výsledky z těchto nebo dalších „in vitro“ diagnostických postupů, které nejsou ve shodě s klinickým vyšetřením pacienta, musí být vykládány s extrémní opatrností. • Jednotlivé stanovení troponinu může být zavádějící. Je třeba tak jako u jiných kardiomarkerů dodržet dosavadní model stanovení troponinu, kdy stoupá a klesá v čase, a přesně interpretovat. Uživatelé
3
jsou upozornění, že ke zvýšení troponinu může dojít z dalších příčin než infarkt myokardu a nedostatek hodnot troponinu předem vyloučí AMI a závažné srdeční onemocnění. Analýzy různých výrobců mohou dávat různé výsledky. Kalibrace analýz mezi výrobci není standardizována. • Při použití AIA-PACK Troponin I je nejvyšší měřitelná koncentrace troponinu neředěného vzorku cca 120 ng/ml a nejnižší měřitelná koncentrace 0,02 ng/ml. • Přesná linearita troponinu závisí na použité šarži kalibrátoru. Zatímco přibližná nejvyšší hodnota kalibrátoru je 120 ng/ml, přesná koncentrace může být nepatrně odlišná. V parametrech analýzy by pak měla být hodnota nejvyššího kalibrátoru vložena jako hodnota rozsahu analýzy. • Ačkoli je vliv hemolýzy na výsledek stanovení nepodstatný, hemolytické vzorky mohou indikovat špatné zacházení se vzorkem před analýzou a výsledky by měly být interpretovány s obezřetností. • Lipemie má na výsledek testu nepodstatný vliv vyjma případu velké lipemie, kdy se může vyskytovat prostorová interference. • Vzorky obsahující fibrin se mohou jevit jako falešně vysoké nebo falešně nízké. Fibrin musí být odstraněn ze vzorku před začátkem analýzy. • Pacienti s onemocněním kosterního svalstva nebyli předmětem této studie. • Pro podrobnější informace o omezení postupů se podívejte do jednotlivých oddílů tohoto letákuOdběr vzorků, Bezpečnostní opatření, Skladování a stabilita. OČEKÁVANÉ HODNOTY Každá laboratoř by si měla určit referenční interval, který odpovídá testované populaci. Jako všechny diagnostické postupy musí být klinické výsledky interpretovány s ohledem na doprovodnou léčbu pacienta. Výsledky troponinu mohou být použity současně s celkovým vyšetřením pacienta. Referenční interval • Normální hodnoty byly určeny s ST AIA-PACK cTnI 2nd-Gen v populaci 40 relativně „zdravých“ mužů a žen. Všechny vzorky byly stanoveny pod hranicí dolního limitu analýzy. • Podle literatury jsou falešně pozitivní výsledky u pacientů s vysokým obsahem revmatoidního faktoru, ale byla testovaná heparinizovaná plazma u deseti pacientů s abnormálně vysokým revmatoidním faktorem. Všechny výsledky byly nižší než limit citlivosti analýzy. • Hospitalizovaní pacienti, jejichž diagnóza nezahrnovala kardioparametry a kteří měli zvýšenou hodnotu močoviny a kreatininu, byly vyhodnoceni ST AIA-PACK cTnI 2nd-Gen. Všechny výsledky byly nižší než minimální detekovatelná hladina koncentrace. • Každá laboratoř by měla určit vlastní diagnostické cut-off hodnoty na populaci pacientů a typu vzorků používaných pro analýzu. • V naší studii byli hospitalizovaní pacienti rozděleni do dvou skupin, první (35 pacientů) s diagnózou AMI a druhá (41 pacientů) s diagnózou, která vylučuje AMI. Tyto výsledky ukazují, že klinická citlivost překračuje 90% shodně s klinickou specifičností 100 % s použitím < 0,1 ng/ml jako rozsah hodnot cut-off pro AMI. Tato data reprezentují jen jednu studii a mohou být pouze základem. • Jakékoli poranění způsobené poškozením srdečních buněk může zvyšovat hodnotu troponinu I nad fyziologickou hodnotu. Může stoupat nad cut-off hodnotu a nemusí to být nezbytně AMI. • Heparinizovaná plazma a sérum nelze použít zaměnitelně během postupu vyšetřování pacienta. Výsledky se mohou lišit. SI jednotky: μg/l = ng/ml x 1,0 ANALYTICKÉ CHARAKTERISTIKY Správnost A. Návratnost:Tři vzorky plazmy byly označeny třemi rozdílnými hladinami troponinu I a změřeny před a po označení. Vzorek Plazma A Plazma B Plazma C
Počáteční hodnota (ng/ml) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Přidaná hodnota TROP I (ng/ml) 2,98 5,95 11,9 5,73 11,5 22,9 9,40 18,8 37,6
Očekávaná hodnota (ng/ml) 2,98 5,95 11,9 5,73 11,5 22,9 9,40 18,8 37,6
Naměřená hodnota (ng/ml) 3,11 6,36 12,7 5,50 11,1 22,4 9,05 18,8 38,6
Procento návratnosti (%) 104,5 106,9 106,7 96,1 96,9 97,8 96,3 100,0 102,7
B .Ředění:Tři vzorky heparinizované plazmy s vysokou koncentrací troponinu byly naředěny pomocí ředícího roztoku TROP a analyzovány. Vzorek
Ředící faktor
Plazma A
žádný 7,5/10 5,0/10 2,5/10
Očekávaná hodnota (ng/ml) 50,20 33,5 16,7
Naměřená hodnota (ng/ml) 66,90 50,50 33,90 16,40
Procento návratnosti (%) 100,7 101,2 98,0
4
Plazma B
Plazma C
1,0/10 žádný 7,5/10 5,0/10 2,5/10 1,0/10 žádný 7,5/10 5,0/10 2,5/10 1,0/10
6,69 38,40 25,6 12,8 5,12 39,8 26,5 13,3 5,30
6,43 51,20 38,50 28,00 13,60 5,51 53,0 38,20 24,8 11,70 4,75
96,0 100,3 109,4 105,9 107,7 96,0 93,5 88,4 89,5
Přesnost a. Přesnost metody byla vyhodnocena ve třech vzorcích séra a ve dvou vzorcích plazmy 20 opakovanými měřeními v sérii. Vzorek Sérum A Sérum B Sérum C
Průměr (ng/ml) 0,953 4,696 21,002
SD (ng/ml) 0,029 0,136 0,508
CV (%) 3,0 2,9 2,4
b. Přesnost metody byla vyhodnocena u třech odlišných koncentracích v 20 různých sériích. Vzorek Plazma A Plazma B Plazma C
Průměr (ng/ml) 0,953 4,696 21,002
SD (ng/ml) 0,036 0,158 0,662
CV (%) 3,8 3,4 3,2
Specifičnost metody Následující látky byly testovány na potenciální pozitivitu nebo negativitu interference přídavkem určitých léků v koncentraci 10x vyšší než je terapeutická hladina do lidských sér obsahujících přibližně 9 ng/ml troponinu I. Všechny získané hodnoty byly v rozmezí 4% očekávaných hodnot a ukázaly nevýznamnou interferenci testovaných léků. Acetylsalicylová kyselina Methyldopa Allopurinol Phenytoin Captopril Quinidin sulfat Dioxin Sodium Naprosyn Furosemid Tyroxin Gemfibrozil Zocor Acetaminophen Ibuprofen CITLIVOST Minimální stanovitelná koncentrace troponinu I (MDC) je odhadována na 0,02 ng/ml. MDC je definována jako koncentrace troponinu I, která odpovídá hodnotě fluorescence, která leží mezi dvěma směrodatnými odchylkami od průměrné hodnoty fluorescence při 20 opakovaných stanoveních nulového kalibrátoru. INTERFERENCE • Přidaný hemoglobin (do 436 mg/dl), volný bilirubin (do 16,5 mg/dl) a konjugovaný bilirubin (do 18,6 mg/dl) neinterferují se stanovením • Lipemie indikovaná koncentrací triglyceridů (do 2000 mg/dl) neinterferuje se stanovením. • Přidaný albumin (do 2,50 g/dl) neinterferuje se stanovením. • Přidaná kyselina askorbová (do 20 mg/dl) neinterferuje se stanovením. • Přidaný revmatoidní faktor ( do 45 IU/ml) neinterferuje se stanovením.
5
