Spektroskopické metody převážně ve viditelné, ultrafialové a blízké infračervené oblasti
Elektromagnetické záření Elektromagnetické záření je postupné vlnění elektromagnetického pole složeného z kombinace příčného magnetického a elektrického vlnění.
Elektromagnetické záření
Elektromagnetické záření Využití elektromagnetického záření o různé energii a různé formy jeho interakce s okolní hmotou.
Interakce záření s hmotou • Odraz a lom • Absorpce • Rozptyl
• Emise záření
Lom světla
Lom světla světlo se láme na rozhraní dvou prostředí, ve kterých se šíří různou rychlostí
Index lomu n – zpomalení světla v určitém prostředí
n=c/v (c – rychlost světla ve vakuu, v – rychlost světla v prostředí)
Snellův zákon popisuje lom elektromagnetického záření na rozhraní dvou rozdílných prostředí
n1sinθ1 = n2sinθ2 n2 / n1 = sinα1 / sinα2 = v1 / v2
a) Při šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici. b) Při šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice.
a
b
Totální odraz (reflexe)
Při přechodu paprsku z opticky hustšího prostředí do prostředí opticky řidšího nastává od určitého úhlu k totálnímu odrazu θ2 = 90o -> tedy -> sinθ2 = 1 sinθ1 = n2 / n1 = v1 / v2
Princip totální reflexe se využívá například v konstrukci světlovodičů
Evanescentní vlna Šíří se podél rozhraní Typicky při totálním odrazu Kolmo na rozhraní ubývá exponenciálně se vzdáleností od rozhraní
Absorpce záření Proces, kdy je energie fotonu (elektromagnetického záření) pohlcena látkou. Každá hmota (atom či molekula) má specifickou absorpci záření, v určitých oblastech frekvencí absorbuje více, jinde méně.
Charakter nebo mechanismus pohlcení záření je dán energií použitého záření • • • •
Ionizace Excitace elektronů do vyšších excitačních stavů Změny ve vibracích vazeb v molekulách Změny v rotacích kolem vazeb v molekulách
Rozptyl záření Odchýlení od původního směru pohybu částice nebo vlny díky poruchám v prostředí (rozptylovým centrům)
Příčiny rozptylu v optické spektroskopii: různé částice, bubliny, kapky, lokální změny hustoty, poruchy krystalové struktury, nerovnosti povrchu, buňky v organismech, prach ... Intenzita rozptýleného světla závisí na jeho vlnové délce a je nepřímo úměrná její čtvrté mocnině. S kratší vlnovou délkou se záření rozptyluje více.
Emise záření Emise záření je proces, při kterém atom nebo molekula vyzáří elektromagnetické záření při přechodu z vyššího do základního energetického stavu
Jablonského diagram
• Fluorescence • Fosforescence • Zpožděná fluorescence
Maximum absorpčního a fluorescenčního spektra látky je posunuto díky vnitřní konverzi a vibrační relaxaci Stokesův posun
Kvantový výtěžek fluorescence počet emitovaných fotonů
Q= počet absorbovaných fotonů látky s vysokým Q jsou účinnými emitory (rhodamin) Vyjádření kvantového výtěžku pomocí rychlostních konstant kr
Q =
τ
= kr + knr
τn = τ / Q τn
Q i τ lze experimentálně změřit a tím získat i τn
Zdroje záření Žárovky, výbojky, LED diody, lasery
Detektory Fotonásobiče, fotodiody, diodová pole, CCD čipy
Fotonásobiče • Fotony dopadají na fotokatodu, z té jsou vyraženy elektrony. • Ty jsou postupně směrovány přes několik dinod k anodě. • Na každé dinodě dochází k zesílení, vyražení většího počtu elektronů.
Fotodiody • Fotony, které dorazí na fotodiodu vybudí elektrony v polovodiči diody. • Dioda se tak stává vodivou a může tak vést proud.
PDA (PhotoDiode Array) • Diodové pole je tvořeno řadou malých nezávislých fotodiod • Výhodou je to, že lze na tuto řadu detektorů promítnout celé spektrum a tak ho číst v jednou okamžiku
CCD (Charge Coupled Device) • Tvořeno polem jednotlivých miniaturních elektrod (μm), pixelů • Ty jsou schopny uchovat náboj vzniklý po jejich ozáření • Čipy o velikosti až několika tisíc na několik tisíc pixelů
CCD
• Front illuminated • Back illuminated
front
back
Disperzní prvky Difrakční mřížky a hranoly, monochromátor
Difrakční mřížka Světlo, které není monochromatické se na mřížce láme pod různým úhlem v závislosti na vlnové délce (barvě) světla
Hranol Světlo, které není monochromatické se stejně jako na mřížce i na hranolu láme pod různým úhlem v závislosti na vlnové délce (barvě) světla
• Hlavní rozdíl mezi difrakční mřížkou a hranolem je nelinearita disperze světla u hranolu • Naproti tomu u hranolu dochází k výrazně nižším ztrátám světla a je levnější na výrobu
Monochromátor zařízení které je schopno pomocí disperzního prvku (mřížky nebo hranolu) rozložit polychromatické světlo do spektra a z něho případně vybrat určitou vlnovou délku
Absorpční spektroskopie • UV-VIS • IR • CD/LD • AAS Fluorescenční spektroskopie • Fluorescenční emisní • fluorescenční excitační • ICP
Absorpční spektroskopie Měření absorpčních spekter ve viditelné a ultrafialové oblasti UV-Vis spektroskopie Určení látek podle absorpčních spekter Měření koncentrace Změny v absorpci v závislosti na čase – reakční kinetiky
Elektronová spektra (UV-Vis) Vibrační spektra IR Rotační spektra
Elektronová spektra σ -> σ * přechody n -> σ * přechody n -> π* a π -> π * přechody
Absorpce záření Teoretický základ -Bouguer-Lambert-Beerův zákon
- log(I / Io) = A = ε . l . c I = Io . 10-ε . l . c
ε ... extinkční koeficient umožňuje, pokud jednu z těchto veličin neznáme, z ostatních 4 veličin ji dopočítat zdaleka nejčastěji to bývá koncentrace nějaké známé látky – veličina c
A=e.l.c A – absorbance e – extinkční koeficient l – optická dráha c – koncentrace absorbující látky extinkční koeficient – jakou absorbanci má látka při jednotkové koncentraci v kyvetě o jednotkové délce při dané vlnové délce
• molární extinkční koeficient (mol-1 . cm-1) • specifický extinkční koeficient (Aλ1%)
Základní uspořádání absorpčního spektrofotometru (jednopaprskového) • • • •
Zdroj světla Mohochromátor Vzorkový prostor Detektor
Vyšší uspořádání absorpčního spektrofotometru (dvoupaprskového) • • • • •
Zdroj světla Mohochromátor Paprsek rozdělen na vzorkový a referenční Vzorkový a referenční prostor Dva detektory
Omezení použití: • Absorbance nesmí být příliš malá (0,4) ani příliš vysoká (1) • Rozptyl světla • Luminiscence vzorku
Absorpční spektrum Absorpce záření o různé energii (frekvenci, vlnové délce) při interakci s hmotou Spektra čárová atomy prvků v plynném stavu Spektra pásová molekuly (atomy v jiném než plynném stavu) Pásy tvoří vzájemně se překrývající spektrální čary (homogenní rozšíření)
Čárová spektra absorpční a emisní
Čárové spektrum vodíku
Rozšíření spektrálních čar Jedna molekula má v principu velmi úzkou spektrální čáru. Homogenní rozšíření Vliv konečné doby života excitovaného stavu (důsledek Heisenbergova principu neurčitosti). Typické doby života excitovaných stavů do 10 ns dávají rozšíření čar do 10-4 cm-1 (resp. 100 kHz). Nehomogenní rozšíření Vliv rozdílného lokálního pole v okolí jednotlivých atomů nebo molekul. Např. vliv rozpouštědla nebo krystalu na látku. Rotačněvibrační stavy molekul.
Rozšíření spektrálních čar – pásová spektra
V (νn) – elektronová pásy V rozšířené o vibrační hladiny ν ν(Jn) – vibrační pásy ν rozšířené o rotační hladiny J
Typická absorpční spektra nejběžnějších rostlinných barviv
• Chlorofyl a • Chlorofyl b • Karotenoidy
Fluorescenční spektroskopie Měření fluorescenčních spekter ve viditelné a ultrafialové oblasti UV-Vis spektroskopie Určení látek podle fluorescenčních spekter Přenos energie FRET Měření koncentrace Změny ve fluorescenci v závislosti na čase – reakční kinetiky
Fluorescenční spektroskopie • Excitace molekulyabsorpce záření o energii odpovídající elektronovému přechodu
• Emise záření – vyzáření energie ve formě fotonů při deexcitaci do základního stavu
Základní uspořádání fluorescenčního spektrofotometru
• Zdroj světla
• Excitační monochromátor • Vzorkový prostor • Emisní monochromátor • Detektor
Emisní – měření spektra emisního záření při jedné excitační vlnové délce
• Excitační monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou maximum absorpce) • Emisní monochromátor skenuje spektrum emitovaného záření
Excitační – měření spektrální účinnosti excitace látky při jedné vlnové délce emise
• Emisní monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou dál za maximem emise fluorescence) • Excitační monochromátor skenuje spektrum ukazující, které vlnové délky jsou schopné excitovat zkoumanou látku
Emisní spektrum je většinou zrcadlovým obrazem absorpčního spektra.
Excitační spektrum molekuly v principu odpovídá spektru absorpčnímu. To neplatí pokud máme směs molekul kde dochází k přenosu energie, je přítomen zhášeč a podobně.
IR – infračervená spektroskopie Spektra v oblasti infračervených vln charakterizují jednotlivé vibrace vazeb v molekulách • Identifikace látek • Určení jejich struktury
CD/LD – cirkulární a lineární dichroismus metody polarizované spektroskopie
CD – cirkulární dichroismus CD - rozdílná absorpce pravotočivě a levotočivě kruhově polarizovaného světla – opticky aktivní látky • Identifikace látek • Sekundární struktura bílkovin • Struktura DNA • Excitonová interakce mezi molekulami
• Asymetrický uhlík – opticky aktivní látky • Opticky aktivní látky mají rozdílnou absorpci pravotočivě polarizovaného a levotočivě polarizovaného světla
Rozdílná CD spektra pro různé proteinové sekundární struktury
LD – lineární dichroismus LD - rozdílná absorpce navzájem kolmého lineárně polarizovaného světla • Určení struktury o orientace chromoforů
Rozdíl mezi absorpcí rovnoběžně a kolmo lineárně polarizovaného světla – spektrum lineárního dichroismu
A║
A┴
LD = A║- A┴
Orientace vzorků
AAS – atomová absorpční spektroskopie ICP – indukčně vázané plasma / optická detekce Analytické metody schopné ve vzorku identifikovat takřka veškeré prvky periodické soustavy
AAS – atomová absorpční spektroskopie
Látka se převede do plynného stavu a atomizuje v plameni (AAS) Měří se absorpce jednotlivých atomů
Čárové absorpční spektrum absorpce atomů jednotlivých prvků
ICP – indukčně vázané plasma / optická detekce
Látka se převede do plynného stavu a atomizuje v plazmatu (ICP) Optická detekce – měří se emise záření jednotlivých atomů excitovaných plazmatem
Čárové absorpční spektrum emise záření z plasmou excitovaných atomů prvků
Čárové spektrum absorpce a emise záření atomů jednotlivých prvků
Schematické shrnutí principů AAS a opticky detekovaného ICP • AAS – čárové absorpční spektrum - absorpce atomů jednotlivých prvků • ICP – čárové emisní spektrum – emise atomů jednotlivých prvků
