Solvolýza PET Úkol: S pomocí
mikrovlnami
polyethylentereftalátu
(PET)
asistované získejte
příslušný
katalyzované ester
kyseliny
alkoholýzy/hydrolýzy tereftalové
(TPA).
Z pozorovaných úbytků pevné fáze stanovte výtěžek. Posuďte možnosti recyklace vedlejších produktů procesu. Úvod: Mnoho plastových výrobků, zejména plastových obalů, má krátkou dobu životnosti a je po použití znehodnoceno. PET obaly zaujímají mezi těmito produkty zvláštní místo. Jednak je tento materiál možné po recyklaci druhotně použít pro výrobu hodnotnějších a trvanlivějších výrobků, než jsou obaly, tedy textilních vláken a z nich látek, za druhé běží o nejrozšířenější materiál pro výrobu nevratných lahví – obalů na nápoje. Ve srovnání se sklem jako tradičním materiálem pro výrobu lahví tento problém zvláště vyniká. Tenkostěnné PET lahve jistě nejsou vratným obalem v tom smyslu, že by se po vymytí daly běžně znovu plnily nápojem, mohou však být více nebo méně racionálně recyklovány. Současné chápání PET lahví jako jednorázových obalů vede k nadměrné produkci PET obalového odpadu, který je sbírán podobně jako ostatní tříděný odpad, což má za následek malou výtěžnost (návratnost) procesu a ekonomické ztráty pro spotřebitele, který poprvé platí náklady na obal při koupi výrobku a podruhé platí za odvoz a likvidaci odpadu. Přitom je PET odpad po vytřídění zpeněžován. Vykoupený PET materiál se poté ponejvíce realizuje na zahraničních trzích. Takto nastavená politika hospodaření s PET materiálem vede jak k finančním ztrátám, tak ke ztrátám energie, která se musí věnovat na třídění a čištění PET odpadu. Zčásti je odpad zpracováván tříděním, mokrým praním, regranulací a vstřikováním na nové předlisky pro PET lahve i v tuzemsku. Část PET odpadu také končí ve spalovnách nebo na skládkách jako složka komunálního odpadu nebo neroztříditelného, či silně znečistěného, plastového odpadu. Připomeňme, že ke třídění odpadu má v takovém systému spotřebitel pouze morální motivaci. Jiný typ systému hospodaření s vratnými obaly nahlíží na PET lahve jako na vratné obaly, i když po jejich vrácení pomocí RVM (Return Vending Machine) jsou tyto lahve rozsekány a slisovány do balíků PET materiálu, který je poté suchou nebo mokrou cestou fyzikálně recyklován. Jedná se tedy spíše o vratný obalový materiál. Výhodou je plná automatizace systému RVM, který provádí úplné roztřídění vracených lahví podle druhu (barvy a tvaru
obalu) materiálu (a/nebo také podle původního obsahu, s vyloučením lahví znečistěných, nebo původně obsahujících nežádoucí obsah – ocet, saponáty, čisticí prostředky, oleje). Výhodou je i automatické zpracování vrácených lahví do slisovaných balíků, které snižuje skladovaný a přepravovaný objem. Systém zálohování lahví tedy přináší nejkvalitnější druhotnou surovinu zároveň s největší mírou návratnosti (Švédsko více než 90%), obojí díky finanční motivaci spotřebitele. Podstatné je i umístění RVM přirozeně v místech distribuce původních výrobků, kdy pro sběr materiálu je využita tatáž optimalizovaná logistická síť jako k distribuci. Kromě zmíněných fyzikálních metod je možné některé polymery depolymerizovat, získat monomer (nebo oligomer, je-li třeba), který lze přečistit a repolymerizovat. Jednou z metod recyklace PET je tedy získávání jejich výchozích monomerů postupem opačným k polykondenzaci – solvolýzou. V úvahu připadají: hydrolýza za superkritických podmínek, kysele nebo bazicky katalyzovaná hydrolýza, methanolýza, glykolýza, atd. Konečným produktem
solvolýzy
PET
mohou
být
podle
způsobu
přípravy
oligomery,
bis(hydroxyethyl)tereftalát (BHET), dimethyltereftalát (DMT), kyselina tereftalová (TPA) a ethylenglykol. O HO CH2 CH2 O C
O C O CH2 CH2 OH
BHET
+ HO CH2 CH2 OH
glykolýza O O C
O C O CH2 CH2 OH
polyesterpolyol
PET
O *
O C
O C O CH2 CH2
n
*
methanolýza O
+ CH3 OH
H3C O C
O C O CH3
- HO CH2 CH2 OH
DMT
hydrolýza +
H2 O
O HO C
- HO CH2 CH2 OH
Obr. 1 Různé způsoby solvolýzy PET.
O C OH
TPA
V laboratorním cvičení je použita jednostupňová solvolýza, konkrétně glykolýza, katalyzovaná octanem zinečnatým. Metodu možno použít i pro solvolýzu n-pentanolem. Chemické reakce (viz. doplňující otázky) jsou zachyceny v přehledném schématu používaných metod chemické recyklace PET na obrázku č. 1. Pomůcky: Předvážky, analytické váhy, odměrný válec, pipeta 25 ml, 100 ml kádinka, sušárna, pH papírky, Petriho miska, skleněná tyčinka, špachtle, lžička, MW rozkladný systém MARS (tři nádobky rozkladné a jedna řídící). Utěrka. Chemikálie: Destilovaná voda, ethylenglykol p.a. (100 ml), dihydrát octanu zinečnatého, PET - váš vzorek (4 x 1,0 g), ethanol, aceton Bezpečnost práce: Po dobu experimentu používejte ochranné brýle, při práci s kyselinami a zásadami rukavice. Postup práce: Příprava vzorku PET – aby se ušetřil čas v laboratoři, použijete vzorek PET předem namletý ve střižném mlýnu, dvoulitrová láhev by měla stačit na 4 ž 5 g PET, které jsou zapotřebí pro tento pokus. Postup solvolýzy: 1. Navažte na analytických vahách přesně asi 1g PET a 0,01g ZnAc2 . 2H2O, které převeďte do reakčních nádobek a přelijte 25ml ethylenglykolu. Dbejte na to, že v řídící nádobce rozkladného systému musí být největší z vašich navážek. (Proč?) Směs se promíchá, nutno dbát aby okraj a horní část vnitřního povrchu nádobek zůstaly suché. Případné kapky možno otřít utěrkou (používanou pouze pro tento účel, vydá vyučující). 2. Nádobky uzavřete, umístěte symetricky do karuselu MW rozkladného systému (pece). Instalujte teplotní a tlakové čidlo. Správnost kontroluje vyučující.
3. Pomocí ovládacích prvků zvolte menu USER PROCEDURES, vyvolejte proceduru PET 001. Po konzultaci s vyučujícím editujte čas a teplotu solvolýzy. Metodu spusťte a sledujte průběh procesu. Při nečekaných únicích hmoty s reakčních nádobek
proces
ukončete.
NEOTEVÍREJTE
PEC,
pokud
procedura
řádněneskončila! 4. Po ukončení procesu MW pece a jejím dostatečném ochlazení, vyjměte nádobky se vzorky, opatrně otevřete. 5. Jednotlivé vzorky přefiltrujte přes plastové sítko, promyjte ethanolem a nerozložený PET vysušte v sušárně. 6. Po vysušení zvažte PET a vypočítejte úbytek hmoty. Srovnejte s daty od ostatních skupin a s výsledkem (a zejména časem solvolýzy s konvenční ohřevem.) 7. Dle možností produkt charakterizujte (FTIR). Kapalnou fázi zpracujte dle pokynů vyučujícího – přinejmenším organický odpad uchovejte pro další recyklaci nebo likvidaci. Doplňující otázky: 1. Kde v experimentálním procesu dochází ke ztrátám snižujícím výtěžnost? Jak by se daly tyto ztráty ovlivnit? 2. Co obsahuje kapalná fáze po glykolýze PET? 3. Jaké jiné metody solvolýzy PET se používají? Jaké jsou produkty? 4. Jaké jsou výhody a nevýhody technologií produkujících bis(hydroxyethyl)tereftalát a dimethyltereftalát? Jaké jsou výhody a nevýhody použití těchto recyklovaných monomerů? 5. Jaké jiné metody recyklace PET se používají? 6. Lze solvolýzou (ammonolýzou) recyklovat i jiné plasty?
Chemická analýza popílku Úkol: Stanovte obsah fosforu v předloženém vzorku popílku. Úloha je po přiměřeném přizpůsobeni vhodná i pro úkoly (Recyklace přírodních makromolekulárních látek kompostováním a Anaerobní recyklace přírodních makromolekulárních látek, kdy se stanoví množství fosforu v sušině) Úvod: Využitím popílků dochází ke zhodnocení původně obtížně likvidovatelného odpadního materiálu v cennou surovinu. Struska a popílky používané ve stavebních materiálech jsou výbornou příměsí zlepšující vlastnosti vyráběného betonu a betonových výrobků. Elektrárenské popílky jsou jemné anorganické zbytky po spalování uhlí, s velkým měrným povrchem (cca 300 m2/kg). Popílky jsou pucolánově aktivní, reagují za studena s hydroxidem vápenatým. (Pokud jsou radioaktivní nelze je použít pro civilní stavby.) Podle původu je dělíme na úletové a ložové. Ložové popely bývají hrubší, v případě fluidního spalování je však samozřejmě možná separace materiálu podle velikosti (a hustoty). Z hlediska složení lze na popílky pohlížet jako směsi obsahující oxidy prvků Al, Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Si a Ti v různých formách. Celkovou koncentraci prvků Al, P, Si a Ti lze stanovit spektrofotometricky, ostatní prvky pak pomocí atomové absorpční spektroskopie. Spektrofotometrické stanovení je založeno na využití změny absorpčního spektra roztoku získaného
rozpuštěním
(viz
dále)
materiálu
(barevné
reakce),
kdy
přídavkem
komplexotvorného činidla vzniká barevný produkt, jehož koncentrace je proporcionální měřené absorbanci. S pomocí standardu lze pak sestrojit kalibrační křivku a stanovit koncentraci sledovaného prvku. Křemík, jako SiO2, hliník, jako Al2O3 a Ti jako TiO2 se stanovují komplexotvornou reakcí se specifickými organickými ligandy (selektivními činidly), fosfor jako P2O5 pomocí metody vanady-molybdenátové, molybdenátové s chloridem cínatým nebo pomocí kyseliny askorbové Druhá metoda pak není rušena přítomností křemičitanů. Stanovení fosforu je z uvedených po experimentální stránce nejjednodušší a příkladné. Sledované materiály nejsou běžně rozpustné a proto se k jejich převedení do roztoku používá několik metod, které kombinují působení minerálních kyselin,jejich směsí, zvýšení
teploty a tlaku. Velmi efektivní, co do složitosti provedení a především rychlosti digesce, je MW rozklad. Provádí se za zvýšeného tlaku v teflonových nádobkách, jejichž obsah je ohříván MW zářením. Absorpce energie v objemu celé náplně nádobky vede k významnému urychlení procesu rozpouštění materiálu, efekt stejný, jako při rychlé úpravě pokrmů pomocí MW trouby. Ve zkoumaném případě je z bezpečnostních důvodů vzorek volen tak, aby ho bylo možno rozpustit pouze pomocí kyseliny dusičné, variantně by bylo zadání modifikováno pro směs s HF. Jsou tedy používány procedury s PE laboratorními nádobami pro práci s kyselinou fluorovodíkovou.
Využití popílků: Polétavé popílky ze spalování uhlí se podle složení rozdělují do dvou tříd: 1. Třída F obsahuje pod 15% CaO a zároveň obsahuje kombinaci oxidů křemíku, hliníku a železa ve značném množství (více než 70%) 2. Třída C popílků obsahuje od 15 až do 30% CaO, a méně oxidů křemíku, hliníku a železa než třída F. Popílky a o něco hrubší ložový popel z fluidního spalování za přídavku mletého vápence obsahují významné množství volného vápna a vykazují pucolánovou aktivitu, takže mohou být za jistých okolností přímo použity jako pojivo. Popílky typu C se mohou používat samostatně k solidifikaci nebo stabilizaci sypkých materiálů (půd, ukládání odpadů, jiných práškových nebo sypkých materiálů apod.), neboť jsou samy o sobě hydraulické, tj. nepotřebují nutně aktivaci přídavkem hydroxidu vápenatého a po smísení s vodou materiál sám ztvrdne. Popílky typu C jsou přidávány také do betonů, které potřebují dosahovat rychlého nárůstu pevnosti ihned po tvarování jako jsou předpjaté betony nebo rychletvrdnoucí směsi. Zrna popílků působí také jako mikroplnivo, které zlepšuje plnění betonu kamenivem, (zlepšuje křivku distribuce velikosti kameniva doplněním submilimetrové frakce), zmenšuje objem pórů v betonu a zvyšuje jeho hustotu a odolnost vůči vnějším vlivům. Stejným mechanismem se snižuje i permeabilita betonového výrobku a tudíž se zvyšuje i jeho odolnost vůči mrazu. Popílek v betonové záměsi pozitivně ovlivňuje její tekutost a zpracovatelnost. Přídavek popílku rozšiřuje rozsah tekutosti betonových směsí dosažitelný ve standardním míchacím zařízení bez použití speciálních strojů. Zvýšení tekutosti betonové směsi umožňuje používat
méně vody v receptuře (hmotnostní podíl vody a cementu se nazývá vodní součinitel) a tak dosáhnout vyšší pevnosti a nižší pórovitosti betonu. Zlepšená zpracovatelnost je provázena zlepšením vzhledu výrobků, povrchy jsou hladší a barevně jednotnější díky lepšímu plnění kamenivem a menším pórům. Vzhled se také zlepšuje z dlouhodobého hlediska, neboť použití popílku zabraňuje vymývání alkalických složek z betonu (potlačuje se tvorba map a výkvětů na pohledových betonových prvcích). Přídavek popílku typu F zvyšuje odolnost betonů vůči síranové a sulfidové korozi, dále vůči korozi minerálními (uhličitými) vodami a mořské vodě. Popílek typu F totiž ve zrajícím betonu reaguje s volným hydroxidem vápenatým za tvorby žádoucího hydrátu křemičitanu vápenatého. V určitých typech betonu se využívá i menší produkce hydratačního tepla popílků při vyzrávání (15 – 35% ve srovnání s teplem uvolněným PC). Celkově se použitím vhodného množství popílku F zvyšuje pevnost betonu v tlaku, což umožňuje používat menší průřezy, tím i objemy konstrukčních prvků, a tak šetřit i všechny ostatní suroviny a energii nutnou k výrobě betonu. Podstatným efektem všech používaných popílků je úspora cementu, což znamená jak úsporu energie nutné k jeho výrobě tak i lepší využití energie, která se uvolňovala během spalování uhlí, z něhož popílek pochází. Pomůcky: Váha s mezní chybou 0,0001 g, zkušební síto z kovové tkaniny se jmenovitou velikostí otvorů 0,063 mm, exsikátor s vysoušecím činidlem, třecí miska s tloučkem, baňka 250 ml, MW rozkladný systém MARS (tři nádobky rozkladné a jedna řídící). Utěrka. Spektrofotometr CARY 300. Laboratorní sklo. Chemikálie: Konc. kyselina dusičná pro digesci, destilovaná voda. Roztoky pro spektrofotometrické stanovení: 1. Standardní roztok pro konstrukci kalibrační křivky: 22 mg bezvodého KH2PO4 bylo rozpuštěno v destilované vodě a rozředěna na 100 ml. (Vypočítejte, jakému obsahu P2O5 toto odpovídá v g/ml), ředěním připravte koncentrační řadu pokrývající 1,5 řádu koncentrací. 2. Zásobní roztok molybdenanu amonného: rozpusťte 12.5 g molybdenanu amonného ve 340 ml destilované vody. Poté přidejte 160 ml 9 M kyseliny sírové. 3. Zředěný roztok molybdenanu amonného: zřeďte 20 ml zásobního roztoku na 1 L.
4. Roztok chloridu cínatého: rozpusťte 0.6 g chloridu cínatého (SnCl2· 2H2O) ve 25 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové, doplňte do 1 L destilovanou vodou. Roztok by měl být připraven těsně před použitím.
Bezpečnost práce: Při práci s popílky (obecně s materiály o vysoké hustotě a/nebo s pucolánovou aktivitou) odpad nutno ukládat do odpadní prachovnice – v žádném případě ne do výlevky, S organickými látkami pracujte v digestoři. Při digesci pomocí konc. kyselin zásadně pracovat v digestoři, používat ochranné brýle a rukavice. Zvýšenou opatrnost věnovat manipulaci při otevírání rozkladných nádobek.
Postup: 1. Vzorek popílku o hmotnosti asi 100 g se proseje zkušebním sítem. Zůstatky na sítě se rozmělní ve třecí misce, až všechny propadnou sítem. Takto získaný vzorek se uloží v exsikátoru až do doby zkoušky. 2. Digesce pomocí MW rozkladného sstému MARS. a. Před prací absolvujete instruktáž od vedoucího praktika. Vedoucí zapne přístroj. b. Do 4 rozkladných nádobek se vloží navážka, přesně asi 0,5 g vzorku a přidá se 10 ml konc. kyseliny dusičné. Směs se promíchá, nutno dbát aby okraj a horní část vnitřního povrchu nádobek zůstaly suché. Případné kapky možno otřít utěrkou (používanou pouze pro tento účel, vydá). c. Nádobky uzavřete, umístěte do MW rozkladného systému (pece). Instalujte teplotní a tlakové čidlo. Správnost kontroluje vyučující. d. Zvolte menu USER PROCEDURES, vyvolejte proceduru POPILEK. Spusťte. e. Po skončení digesce nádobky chladnou, ponechte je v MW peci, řízená ventilace urychluje jejich chlazení. f. Po dosažení bezpečné teploty a tlaku nádobky vyjměte a otevřete. Roztoky kvantitativně převeďte do PE kádinek, zřeďte, zředěný roztok převeďte do 100 ml PE odměrných baněk, doplňte po rysku destilovanou vodou.
3. Spektrofotometrické stanovení a. Převeďte 10 ml alikvotních podílů blanku (slepý vzorek), standardu a roztoku vzorku do 100 ml PE baněk. b. Přidejte 25 ml zředěného roztoku molybdenanu amonného, výslednou směs ponechte 10 minut odstát. c. Přidejte 25 ml roztoku chloridu cínatého. Redukcí molybdenanu vzniká chromofor (jaký?), vzniklé zabarvení je stabilní po dobu přibližně 40 min při laboratorní teplotě. d. Pro blank (slepý vzorek), nastavte koncentrační rozsah spektrofotometru na nulovou hodnotu absorbance při vlnové délce 640 nm. Poté změřte hodnoty absorbance pro koncentrační řadu standardu (mající známou koncentraci oxidu fosforečného) a zkonstruujte kalibrační křivku. Změřte absorbanci roztoků vzorku e. S pomocí kalibrační křivky určete koncentraci P2O5. f. Přepočtěte na původní navážku vzorku.
Výsledek je průměrná hodnota ze čtyř stanovení (roztoky ze čtyř rozkladných nádobek). Doplňující otázky: 1. Jaké typy popílků znáte? Jak se získávají? 2. Jaké je složení hlavních typů popílků? 3. Jaká jsou rizika při použití popílků ve stavebnictví? 4. Jak se likviduje popílek ukládáním? 5. Proč se k palivu pro fluidní spalování přidává mletý vápenec? 6. Co je pucolánová aktivita? 7. Odhadněte, jaké nespalitelné zbytky jsou přítomny v kalech z městských čistíren odpadních vod? 8. Co je energosádrovec, co chemosádrovec?
Zpracování škrobu na glukózu nebo maltózu Úkol: S pomocí enzymaticky katalyzovaného rozkladu škrobu jako modelové látky získejte roztok jednoduchých cukrů, o průběhu reakce se přesvědčete pomocí barevných reakcí. Proces sledujte pomocí spektrofotometrie. Stanovte, jaká doba je potřebná pro úplnou degradaci škrobu za daných podmínek. Reakce můžete provést též na reálném vzorku – zkažená mouka, obilí apod. před reakcí je nutné vzorek rozemlít, po hydrolýze přefiltrovat pro odstranění mechanických nečistot. Úvod: Škrob je polysacharid, jehož monomerní jednotka je tvořena molekulou glukózy. Základními formami jsou amylóza a amylopektin znázorněné na obr. 2. Enzymy, které degradují škrob se nazývají amylázy, nejdůležitější z nich se nazývá α-amyláza (štěpí interní 1,4 glykosidickou vazbu). Tento enzym katalyzuje hydrolýzu polysacharidu na kratší řetězce až k oligosacharidům, které obsahují pouze několik glukózových jednotek (např. dvě – disacharidy u „fungal“ amylázy získané z plísně Aspergillus oryzeae ∗ ). Ty mohou být rozštěpeny dalšími enzymy (amyloglukosidázami) až na jednotlivé molekuly glukózy. Reakce patří mezi hydrolytické, neboť ji lze sumárně popsat: škrob + voda = glukóza, kdy α – D – (1
4) va zba
α – D – (1
6) vazba
CH2 OH O OH
O
OH O CH2 OH
CH2 OH
CH2 OH
CH2 OH
CH2 OH
O
O
O
O
O
OH
O OH
OH
O OH
OH
O OH
OH
O OH
amylóza
OH
CH2 O O
OH
OH
O OH
amylopekti n
Obr. 2 Struktura polysacharidů amylózy a amylopektinu.
∗
Bakteriální a plísňová (houbová = fungal) amyláza je stabilní za vyšších teplot, než amyláza savců, a proto je vhodnější k průmyslovému využití. Bakteriální amyláza patří mezi ztekucující amylázy, neboť napadá náhodně glykosidické vazby uvnitř řetězců amylózy a tak ji degraduje na dextriny. ,,Fungal“ amyláza náleží mezi sacharizující enzymy, odštěpuje disacharidové jednotky postupně od konce polysacharidového řetězce.
voda se vmezeří mezi dvě glukózové jednotky a z glykosidické vazby dá vzniknout jedné skupině hemiacetalové a jedné hydroxylové. Podstatou barevné reakce škrobu s roztokem jodu ve vodném roztoku KI (tedy vlastně K + a I3– v H2O) je tvorba komplexu mezi trijodidovými aniony a několika mery amylózy # . Pochopitelně s disacharidy roztok jódu barevný komplex netvoří. Podstatou reakce roztoku DNS s redukujícím sacharidem je, zjednodušeně, redukce kyseliny 3,5-dinitrosalicylové redukujícím cukrem na kyselinu 3-amino-5-nitrosalicylovou (aldehydová skupina se při tom oxiduje na karboxylovou), viz. obrázek č.18. Reakce je ve skutečnosti komplikovanější.
HO
CHO
O OH
O2N
HO
OH
NO2
+
COOH
O
HO
OH OH
OH OH
O2N
HO
+
OH OH
NH2
CH2OH
CH2OH
3,5-dinitrosylicylová kyselina
α-D-glukóza α-D-glukσza
3-amino-5-nitrosalicylová 3-amino-5-nitrosalicylovα kyselina
α-D-glukonovα α-D-glukonová kyselina
Obr. 1 Zjednodušené reakční schéma DNS a redukujícího sacharidu
Aplikace v recyklaci: Enzymaticky katalyzovanou hydrolýzou lze v průmyslovém měřítku recyklovat např. znehodnocenou surovinu bohatou na škrob, získat základní sacharidy buď jako krmivo (podobně cukry z kukuřice v potravinářství), nebo jako základ pro další biotechnologické zpracování (fermentace → alkohol, kyselina octová, kyselina mléčná, apod.) Pomůcky: Váhy, kádinky, zkumavky, stojan, vodní lázeň (velká kádinka + vařič), pipety, kapátka, teploměr, sušárna, odměrný válec, pH papírky, skleněná tyčinka, lžička, injekční stříkačka, injekční jehly. Spektrofotometr CARY 300, kyveta s optickou dráhou 1 cm.
#
–
Amylóza má strukturu šroubovice, do jejíchž smyček se koordinují lineární I3 aniony. Výsledná barva roztoku závisí na délce polysacharidových řetězců – jde od modré (amylóza) přes fialovou až po rudou (dextriny). Roztoky monosacharidů, disacharidů a amylopektinu se při zkoušce nezabarvují.
Chemikálie: Destilovaná voda (dále jen voda ve všech roztocích), roztok enzymu (1), roztok jodu (2), roztok DNS (3), roztok vínanu draselno-sodného 40%, fosfátový pufr (pH 7, 0,1 mol.dm-3) roztok HCl 0,1 mol.dm-3, ethanol a následující roztoky: 1. roztok enzymu: Fungal Amylase from Aspergillus oryzae, 0,1g/10ml, připraveno ze sterilní vody, uchovávejte v chladu 2. roztok jodu: (12,7 g I2 a 25g KI) / 1l H2O 3. roztok DNS,
&
(1%): kyseliny 3-amino-5-nitrosalicylová (DNS) – 10g, Fenol – 2g,
siřičitan sodný – 0,5 g, hydroxid sodný – 10g, doplnit destilovanou vodou na 1l
Bezpečnost práce: Pozor na vroucí vodu při práci s vařičem, roztok DNS intenzivně barví, je silně zásaditý, jehly a injekční stříkačky odhazujte do zvláštní vyhrazené odpadní nádoby. Postup: 1. Příprava roztoku škrobu o koncentraci 20g/l (stačí přibližně): Smíchejte 2 g rozpustného škrobu s 5 ml studené vody. Přilijte roztok za stálého míchání k 90 ml horké vody (těsně před varem). Míchejte dobře a zvolna ochlaďte želatinující roztok na laboratorní teplotu. Doplňte objem vodou na 100 ml. 2. Odlijte jeden až dva ml roztoku do zkumavky, a přidejte kapku roztoku jodu. Modrá barva indikuje přítomnost škrobu. 3. Kvalitativní stanovení: a. Čtyřikrát oddělte 5 ml připraveného roztoku do kádinek, k všem přidejte po 5 ml fosfátového pufru.
Zamíchejte, získáte čtyři roztoky škrobu o
koncentraci 10g/l v pufrovaném prostředí. b. Započněte enzymatickou hydrolýzu přidáním 0,3 ml roztoku enzymu do dvou pufrovaných roztoků, použijte jehlu a injekční stříkačku, pak promíchejte. Zbylé dva roztoky budou slepé vzorky.
&
DNS reakce probíhá v zásaditém prostředí – proto NaOH, může být rušena přítomností kyslíku – proto siřičitan, fenol prohlubuje zbarvení zásaditého roztoku 3-amino-5-nitrosalicylové kyseliny, Rochellova sůl vínan draselnosodný (tartrate) stabilizuje vzniklý barevný roztok.
c. Nechte probíhat hydrolýzu, jeden roztok při laboratorní teplotě, druhý roztok v sušárně při zvýšené teplotě (zvol od 30 do 50°C, kontrolujte laboratorním teploměrem). Vedle aktivních roztoků mějte i slepé vzorky. d. Co patnáct minut odebírejte po 0,5 ml ze vzorku i slepého vzorku do zkumavek obsahujících již 5 ml roztoku 0,1 mol.dm-3 HCl, která zastaví průběh reakce. e. Ke vzorkům s HCl pak přidejte několik kapek roztoku jodu, sledujte zbarvení. Roztok bude modrý, když by obsahoval nezreagovaný škrob, nebo bude hnědočervený pro částečně zreagovaný škrob, pak červený, pak oranžový a pro zcela rozložený škrob bude jen žlutý až žlutooranžový, to podle množství přidaného roztoku jodu, (zbarvení si ověřte na zkumavce s 5 ml roztoku HCl bez vzorku.) f. Jestliže již proběhla úplná hydrolýza škrobu v aktivním vzorku, odeberte ze vzorku i slepého vzorku 2 ml do zkumavek, přidejte po 2 ml roztoku DNS a zkumavku ohřívejte při 90°C, ale lze i ve vroucí vodní lázni, po dobu 5 – 15 minut a sledujte, zda vzniká intenzivní červenohnědé zbarvení, kterým se okazují redukující sacharidy. Přidejte 1 ml roztoku vínanu, abys stabilizovali zbarvení. Můžete zbarvený roztok zkusit okyselit, pozorujte změnu. g. Výsledky pozorování si zapisujte, hlaste a ukazujte vedoucímu praktika. 4. Spektroskopická pozorování průběhu enzymatické hydrolýzy (pozorování probíhá paralelně nebo následně po kvalitativním, dle přítomnosti ostatních skupin využívajících spektrometr) a. Oddělte 20 ml roztoku (z bodu 1) do kádinky. Přidejte 6 až 8 kapek roztoku jodu. Pozorujte vývin zbarvení. b. Do spektrometrické kyvety odeberte asi 2,5 ml vzorku. Změřte absorpční spektrum. c. Do vzorku v kyvetě dávkujte 0,2 ml roztoku enzymu. Pomocí injekční stříkačky s jehlou roztok ihned promíchejte opakovaným natáhnutím a vypuzením roztoku ze stříkačky.
d. Bez prodlení vložte kyvetu do spektrometru a změřte absorpční spektrum. Tento čas bude startem experimentu. Absorpční spektrum pak snímejte každých pět minut, využijte funkci automatického scanu. Celkem sledujte vzorek po dobu 90 minut. e. Získaná spektra uložte a vykreslete vhodným způsobem grafy. Popište pozorované změny a interpretujte. Interpretaci vztáhněte k výsledkům z kvalitativního zkoumání, tedy, jaký je chemický (resp. fyzikální) podklad změn, které jste byli schopni zaznamenat zrakem. Interpretujte změny absorpčního spektra roztoku. f. V absorpčním maximu ve viditelné oblasti odečtěte hodnotu absorbance pro každé spektrum. Vyneste tuto hodnotu v závislosti na čase a získáte křivku integrální povahy popisující průběh reakce. V protokolu se pokuste její průběh vysvětlit nebo analyzovat, (ambice dle studovaného oboru).
Doplňující otázky a úkoly: 1. Jak je obecně ovlivněna aktivita enzymu faktory jako je pH a teplota? 2. Které vazby štěpí amylázy? Jakými enzymy štěpícími škrob je vybaven člověk, domácí a hospodářská zvířata? 3. Uveďte model postihující kinetiku enzymaticky katalyzované reakce. 4. Jaká jsou uplatnění popisovaných enzymatických reakcí? Návrhy? 5. Jaký enzym štěpí celulózu? Kde lze nalézt přírodní zdroje tohoto enzymu? Existuje průmyslová aplikace pro druhotné využití nezpracovatelného dřevěného odpadu na sacharidy? Jaký prospěch by z použití enzymatické hydrolýzy dřevní hmoty plynul ve srovnání s kysele (H2SO4) katalyzovanou hydrolýzou? 6. Jaká jsou jiná činidla/metody důkazů redukujících sacharidů? Jaké jsou produkty? 7. Využívají se získané monosacharidy v praxi? Jak?
