pET-abfA

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian Penelitian ini menggunakan desain penelitian deskriptif laboratoris yang meliputi yaitu: (1) produksi AbfA rekombinan dari E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan, (2) Uji aktivitas spesifik AbfA rekombinan, (3) analisis stereospesifitas AbfA secara in silico. 4.2 Variabel Penelitian 4.2.1 Klasifikasi variabel a. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah jenis substrat L- dan Darabinofuranosida. b. Variabel tergantung Varibel tergantung dalam penelitian ini adalah unit aktivitas spesifik AbfA rekombinan. c. Variabel kendali Variabel kendali dalam penelitian ini meliputi jenis enzim, formula reaksi enzimatis, kondisi reaksi enzimatis dan lama inkubasi.

4.2.2 Definisi operasional variabel a. Variabel bebas Variabel jenis substrat L- dan D-arabinofuranosida merupakan varian substrat yang digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik AbfA rekombinan

xliv 22 Tesis

STEREOSPESIFITAS SUBSTRAT .....

MUCH ZAENAL FANANI


yang meliputi substrat L-arabinofuranosida (oat spelt xylan, arabinan, pektin dan arabinogalaktan)

dan

substrat

D-arabinofuranosida

(ekstrak

dinding

sel

Mycobacterium sp dan Mycobacterium tuberculosis H37Rv). b. Variabel tergantung Variabel unit aktivitas enzim merupakan aktivitas relatif (U/mL) AbfA pada varian substrat yang ditentukan menggunakan metode gula pereduksi per kadar protein (mg/mL). c. Variabel kendali 1. Jenis enzim yang digunakan utuk uji aktivitas spesifik adalah α-Larabinofuranosidase rekombinanan yang diproduksi dari isolat E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan. 2. Formula reaksi enzimatis dengan perbandingan enzim : subtrat yaitu 1 : 1. 3. Kondisi reaksi enzimatis yaitu pH 6, suhu 700C dan lama inkubasi selama 30 menit.

4.3 Tempat dan Waktu Penelitian Tempat pelaksanaan penelitian adalah Laboratorium Proteomik Lembaga Penyakit Tropis Universitas Airlangga. Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan yaitu Februari-Juli 2012.

4.4 Bahan dan Alat Penelitian 4.4.1 Sampel penelitian Isolat E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan diperoleh dari penelitiaan sebelumnya koleksi Prof. Ni Nyoman Tri Puspaningsih Departemen Kimia UNAIR yang digunakan untuk produksi AbfA. Isolat Mycobacterium sp. diperoleh dari Biofarma Culture Collection (BFCC) dan sel Mycobacterium

xlv Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


tuberculosis H37Rv diperoleh dari TB Vaccine Testing and Research Material Contract Colorado State University (didistribusikan oleh Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository) untuk isolasi

substrat

dinding sel Mycobacterium.

4.4.2 Bahan penelitian Bahan kimia yang digunakan mempunyai kualitas pro-analisis (p.a) dan biologi molekular, kecuali apabila disebutkan lain. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain yaitu : produksi dan analisis protein ( spiritus, alkohol 70%, dH2O, natrium fosfat, asam sitrat, tripton, yeast extract, NaCl, ampisilin, bacto agar, Na2CO3, 4-nitrofenil , 4-nitrofenil-α-L-arabinofuranosida, etanol 95%, asam fosfat 85%, coomassie brilliant blue G-250, bovine serum albumin), isolasi dan analisis karbohidrat (Middlebrook 7H9 broth base, gliserol, dektrosa, sodium dodecyl sulfate, KCl, Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, aseton, HCl, galaktosa, arabinosa, NaOH, kalium/natrium-tartrat, asam 3,5-dinitrosalisilat, fenol, Nasulfit, arabinogalaktan larch wood, oat spelt xylan, pektin, arabinan).

4.4.3 Alat penelitian Peralatan gelas dan non-gelas serta instrumen dalam penelitian ini merupakan peralatan yang umum digunakan dilaboratorium biokimia. Instrumen penelitian terdiri dari : instrumen untuk molekular docking ( notebook dengan spesifikasi processor Pentium Dual-Core 1,6 GHz dengan RAM 1Gb, hard

disk eksternal 350G,

mouse), instrumen untuk produksi dan analisis protein (autoklaf (OSK 6508

xlvi Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


Steam pressure apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), timbangan analitik (Ohaus), thermoshaker (Heidolph Unimax 1010), sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), laminar air flow cabiner (Kottermann 8580), pipet mikro (Eppendorf), ultrasonikator (Soniprep 150 Sanyo), spektrofotometer UV-Vis (Shimazu 1800), kuvet, waterbath (sansat type syk-382-M), pH meter (Metrohm 744), oven (Memmert, Jerman), lemari pendingin (Sharp Matric), lemari pendingin -200C (Royal Chest Freezer BD195), analisis karbohidrat (hotplate, labu alas bulat, tabung pendingin, pengaduk magnetik, HPLC Shimadzu LC-20AB Detektor RID-10 A.

4.5 Kerangka Operasional Penelitian Secara garis besar, penelitian ini terbagi menjadi 3 bagian yaitu: (1) produksi AbfA rekombinan dari E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan, (2) Uji aktivitas spesifik AbfA rekombinan, (3) analisis stereospesifitas AbfA secara in silico. Tahapan penelitian ini dijelaskan pada bagian 4.5.1 sampai dari 4.5.3.

4.5.1 Produksi AbfA rekombinan dari E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA AbfA diperoleh dari E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA yang diproduksi menggunakan media Luria-Bertani dengan penambahan ampisilin. E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan menghasilkan AbfA rekombinan intraselular, maka diperlukan proses lisis yaitu secara fisika menggunakan sonikator. Ekstrak kasar AbfA rekombinan diberi perlakuan pemanasan pada suhu 70oC selama 1 jam untuk mendenaturasi protein non-termostabil sehingga dapat diperoleh AbfA rekombinan dengan pengotor protein lain yang lebih rendah dengan cara dipisahkan melalui sentrifugasi. Ekstrak kasar dan hasil pemanasan yang

xlvii Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


didapatkan, kemudian digunakan untuk uji aktivitas menggunakan substrat pNP-A dan penentuan kadar protein menggunakan metode Bradford. Diagram alir penelitian tahap pertama ditampilkan pada Gambar 4.2.

E. coli BL21 (DE3)/pET-abfa rekombinan

Kultivasi pada media LB

Sentrifugasi diperoleh supernatan

AbfA rekombinan a

Lisis sel menggunakan sonikator

Panen sel

Pemanasan 70oC selama 1 jam

Ekstrak kasar AbfA

Penentuan kadar protein Uji aktivitas

Gambar 4.1 Skema kerja produksi AbfA rekombinan

4.5.2 Uji aktivitas spesifik AbfA rekombinan Stereospesifitas AbfA terhadap substrat L- dan D-arabinofuranosida ditentukan berdasarkan aktivitas spesifik. Substrat dengan stereokimia Larabinofuranosida diperoleh dari arabinogalaktan, arabinan, pektin, oat spelt xylan, sedangkan substrat stereokimia D-arabinofuranosida diperoleh dari ekstrak dinding sel Mycobacterium sp. BFCC dan Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Karakterisasi ekstrak dinding sel Mycobacteria hasil ekstraksi dilakukan untuk memastikan bahwa hasil ekstraksi mengandung arabinogalaktan/arabinomannan yaitu melalui hidrolisis asam, kemudian dianalisis menggunakan kadar gula pereduksi dan HPLC. Aktivitas spesifik diperoleh melalui unit aktivitas enzim per

xlviii Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


unit total protein. Diagram alir penelitian tahap kedua ditampilkan pada Gambar 4.3. Mycobacterium sp BFCC

Kultivasi pada media Middlebrook 7H9 broth base gliserol dextrose

Debris Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Isolasi dinding sel Mycobacteria

Sterilisasi menggunakan Autoklaf

Panen sel menggunakan setrifugator (debris sel)

Ekstrak dinding sel Mycobacteria Hidrolisis asam

Uji aktivitas enzim

Analisis produk menggunakan HPLC

Aktivitas spesifik

Analisis HPLC dan penentuan kadar gula pereduksi

Gambar 4.2 Skema kerja uji aktivitas spesifik AbfA rekombinan

4.5.3 Analisis stereospesifitas AbfA secara in silico Analisis stereospesifitas substrat AbfA pada L- dan D-arabinofuranosida secara in silico dilakukan menggunakan program docking AutoDock 4. Analisis molekular docking bertujuan untuk menjelaskan mekanisme katalitik yang mungkin terjadi secara in silico. Molekular docking dilakukan menggunakan makromolekul

AbfA

yang

diperoleh

dari

hasil

pemodelan

homologi

menggunakan variasi multiple template. Model AbfA digunakan sebagai makromolekul dan struktur kode 1QW9 dan 2C8N sebagai referensi. Validasi docking dilakukan melalui re-docking dan cross-docking.

xlix Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


Database sekuen asam amino GH51 α-Larabinofuranosidase

Multiplealignment dan analisis motif sekuen Interaksi fingerprint enzim-substrat

Database struktur protein GH51 α-Larabinofuranosidase

Superimpose dan analisis interaksi enzim-substrat

Struktur protein model AbfA dan referensi

Validasi docking (redan cross-docking)

Ligan L- dan Darabinofuranosida

Stereospesifitas substrat secara in silico

Tes molekular docking

Analisis hasil docking

Interaksi enzim-substrat

Gambar 4.3 Skema kerja analisis stereospesifitas AbfA secara in silico 4.6 Prosedur Pengumpulan Data 4.6.1 Analisis protein a. Isolasi AbfA rekombinan dari E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan Pembuatan inokulum dilakukan melalui koloni tunggal E. coli BL21 (DE3)/pET-abfA rekombinan yang ditumbuhkan ke dalam 10 mL media LB ampisilin, diinkubasi pada suhu 370C dengan kecepatan aerasi sebesar 150 rpm selama ±16-18 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menumbuhkan 1% biakan inokulum dimasukkan ke dalam 1000 mL media LB ampicilin diinkubasi pada suhu 370C dengan kecepatan aerasi sebesar 150 rpm selama ±16-18 jam. Panen sel diperoleh melalui sentrifugasi kultur produksi dengan kecepatan 3000 rpm l Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


selama 10 menit sehingga diperoleh pelet yang akan digunakan untuk tahap selanjutnya dan supernatan dibuang. Pelet dicuci menggunakan 50 mL bufer fosfat sitrat 50 mM (pH 6), kemudian disentrifugasi kembali sehingga diperoleh pelet dan supernatan. Supernatan dibuang, kemudian pelet sel dilarutkan 50 mL bufer fosfat sitrat (pH 6) dan dilisis secara fisik menggunakan ultrasonikator dengan frekuensi 20 Hz selama 2 menit diulang 2 kali. Ekstrak kasar AbfA diperoleh melalui sentrifugasi hasil lisis dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit (Puspaningsih, 2004). Aktivitas spesifik AbfA dapat ditingkatkan melalui pemanasan pada 70ºC selama 1 jam sehingga protein non-AbfA yang tidak bersifat termostabil akan mengendap dan diperoleh supernatan melalui sentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3.000 rpm. b. Penentuan kadar protein Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar protein (Bradford, 1976). Standar protein dibuat dengan kisaran konsentrasi 20-100 µg/mL protein. Sebanyak 20 µL sampel direaksikan dengan 1 mL pereaksi coomasive brilliant blue G-250, kemudian dikocok kuat dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Pembuatan blanko dilakukan sama seperti pada analisis sampel, tetapi sampel digantikan dengan H2O. c. Uji aktivitas enzim Larutan enzim sebanyak 20 μL direaksikan dengan 180 μL substrat pnitrofenil-α-L-arabinofuranosida (pNP-A) 1 mM, kemudian diinkubasi pada suhu 700C selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 300 μL Na2CO3 0,4

li Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


M. Kontrol digunakan 20 μL enzim yang diinaktifkan, 180 μL pNP-A 1 mM dan 300 μL Na2CO3 0,4 M. Aktivitas enzim ditentukan dengan mengukur jumlah pnitrofenol yang dilepaskan. Pengamatan jumlah p-nitrofenol yang dilepaskan menggunakan metode spektrofotometri dan dibaca pada λ 405 nm. Standar pnitrofenol yang digunakan berkisar antara 5-60 µg/mL p-nitrofenol. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 µmol pnitrofenol setiap menit pada kondisi percobaan (Saha, 1998).

4.6.2 Analisis karbohidrat a. Preparasi substrat ekstrak dinding sel Mycobacteria Preparasi substrat ekstrak dinding sel Mycobacteria menggunakan isolat Mycobacterium sp. BFCC dan Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Isolasi substrat dari Mycobacterium sp. BFCC terdapat 2 tahapan yaitu (1) produksi sel, (2) ekstraksi substrat ekstrak dinding sel Mycobacteria (Daffe et al., 1990). (1) Koloni tunggal isolat Mycobacterium sp. BFCC ditumbuhkan pada media cair Middlebroack 7H9 dengan penambahan gliserol diinkubasi pada suhu 37 °C dengan kecepatan aerasi 150 rpm selama 21 hari. Kemudian kultur dipanen dengan cara disterilkan terlebih dahulu menggunakan autoklaf. Debris sel (pelet) dipisahkan dari supernatan melalui sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC dan dicuci menggunakan buffer fosfat salin (PBS) selama tiga kali. (2) Pelet sebanyak 3 gram Mycobacteria direaksikan dengan 30 mL 2% SDS dalam larutan PBS, diinkubasi selama 30 menit pada temperatur 37oC dengan pengadukan dan pelet dipisahkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm suhu 25oC selama 10 menit (Pengulangan 2 kali). Pelet yang telah didapatkan di reaksikan dengan 26 mL 2% SDS, diinkubasi selama 30 menit pada lii Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


temperatur 37oC dengan pengadukan dan pelet dipisahkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm suhu 25oC selama 10 menit (Pengulangan 2 kali). Pelet yang didapatkan direaksikan dengan 30 mL 2% SDS diinkubasi selama 60 menit pada temperatur 90oC dengan pengadukan dan pelet dipisahkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm suhu 25oC (Pengulangan 2 kali). Pelet yang didapatkan disuspensikan kedalam 30 mL H2O dan diinkubasi selama 30 menit pada temperatur 37oC dengan pengadukan dan pelet dipisahkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm suhu 25oC selama 10 menit (Pengulangan 2 kali). Pelet yang didapatkan kemudian dicuci menggunakan 5 mL aseton dan diinkubasi selama 10 menit pada temperatur 37oC dengan pengadukan. Pelet dipisahkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm suhu 25oC selama 10 menit. Pelet yang didapatkan kemudian dikeringkan dengan diangin-anginkan diruangan dan ditimbang. Hasil isolasi ekstrak dinding sel Mycobacteria dikarakterisasi dengan cara dilakukan hidrolisis asam. Hidrolisis asam substrat ekstrak dinding sel Mycobacteria dilakukan dengan mereaksikan 750 µL 0.5M HCl pH 1 dengan 750 µL 0.5 % (b/v) ekstrak dinding sel Mycobacteria diinkubasi pada temperatur 900C selama 8 jam. Kemudian sampel dinetralkan menggunakan 1 M NaOH (Kusema et al., 2010). Produk hidrolisis kemudian dianalisis menggunakan metode DNS dan HPLC. b. Spesifitas substrat Spesifitas substrat ditentukan melalui penentuan aktivitas spesifik (U/mg) menggunakan metode DNS pada substrat ekstrak dinding sel Mycobacterium sp, Mycobacterium tuberculosis H37Rv, arabinogalaktan Larch wood, arabinan, oat

liii Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


spelt xylan dan pektin (Miller, 1959). Terlebih dahulu masing-masing sebanyak 1% (b/v) substrat ekstrak dinding sel Mycobacteria dan arabinogalatan Larch wood dilarutkan kedalam buffer fosfat sitrat pH 6. Kemudian, sebanyak 100 µL AbfA ditambahkan 100 µL substrat dan diinkubasi pada temperatur 70oC selama 30 menit. Kemudian ditambahkan 600 µL DNS dan reaksi dihentikan dengan pemanasan pada penangas air mendidih selama 20 menit, kemudian didinginkan dalam penangas air es selama 15 menit. Produk yang terbentuk ditentukan menggunakan spektrofotometer pada λ 550 nm. Kontrol yang digunakan berisi 100 µL AbfA yang telah diinaktif, 100 µL substrat dan 600 µL pereaksi DNS tanpa inkubasi langsung dipanaskan pada penangas air mendidih. Gula pereduksi yang dihasilkan dihitung menggunakan persamaan regresi liner dari kurva standar arabinosa. Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1,0 μmol arabinosa per menit pada kondisi pengujian. c. Analisis produk hidrolisis substrat Produk hidrolisis dianalisis menggunakan HPLC dengan spesifikasi detektor indeks bias, kolom karbohidrat, pelarut air dan menggunakan standar arabinosa dan galaktosa. Sebelum sampel diinjeksikan kedalam kolom HPLC, terlebih dahulu disaring menggunakan filter dengan ukuran 0,2 μm.

4.6.3 Analisis bioinformatika dan molekular docking a. Pengumpulan urutan dan multiple alignment asam amino Pengumpulan urutan asam amino GH51 α-L-arabinofuranosidase dari berbagai organisme didapatkan dari Carbohydrate Acting Enzyme dengan kriteria gen yang telah dikarakterisasi. Informasi kode akses urutan asam amino yang liv Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


diperoleh dari CAZy digunakan untuk mendapatkan file urutan di National Center of Biotechnology Information (NCBI). Setelah urutan asam amino diunduh dari NCBI, selanjutkan digunakan untuk analisis residu asam amino lestari menggunakan program BioEdit yaitu (Hall, 1999): 1. Menjalakan program BioEdit dengan cara double klik pada icon BioEdit. 2. Klik File>Open: dipilih file kumpulan urutan asam amino yang akan digunakan untuk multiple alignment dengan format FASTA. 3. Klik Accessory Application>ClustalW multiple alignment>Run ClustalW >OK. 4. Klik View>View Mode>Identity/Similarity Shading. 5. Residu asam amino yang lestari ditunjukkan adanya shading warna pada latarbelakang. b. Pengumpulan dan superimpose struktur protein dari database PDB Pengumpulan kode struktur protein 3D GH51 α-L-arabinofuranosidase yang telah didepositkan pada PDB didapatkan dari Carbohydrate Acting Enzyme dan diunduh dari database PDB. Setelah didapatkan file struktur 3D dengan format PDB, maka dapat dilakukan analisis superimpose pada struktur GH51 α-Larabinofuranosidase. Superimpose dilakukan hanya pada struktur utama dari masing-masing GH51 α-L-arabinofuranosidase. Superimpose dilakukan dengan menggunakan program PyMol 1.3 yaitu: 1. Menjalakan program PyMol dengan cara klik dua kali pada icon PyMol di dekstop. 2. Klik File>Open: dipilih file struktur protein format pdb, kemudian dibuka satu persatu.

lv Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


3. Klik icon A (action) pada toolbar all sebelah kanan>preset>publication. 4. Klik A>Align>to Molecule> pilih salah satu molekul sebagai referen untuk semua struktur. 5. Klik Display>sequence> klik pada masing-masing asam amino lestari yang didapatkan dari multiple alignment sebelumnya. 6. Klik S (show) pada toolbar sebelah kanan>stick. 7. Klik L (label) pada toolbar sebelah kanan>residu name. 8. Klik C (color) pada toolbar sebelah kana>pilih warna. c. Analisis interaksi enzim-substrat Interaksi enzim-substrat dari struktur protein yang diperoleh dari tahapan sebelum, dipilih struktur protein yang merupakan hasil co-crystalization kompleks protein-substrat dan dianalisis menggunakan program berbasis web yaitu PDBsum (Laskowski, 2009). Analisis menggunakan PDBsum didapatkan gambar 2D interaksi enzim-substrat dengan tahapan sebagai berikut: 1. Membuka halaman web dengan memasukkan alamat web yaitu www.ebi.ac.uk/pdbsum/. 2. Kemudian masukkan kode PDB struktur yang akan dianalisis interaksi 2D enzim-substrat pada kolom PDB code, kemudian klik find. 3. Beberapa menit kemudian akan keluar hasil analisis struktur dan klik Ligands pada toolbar, maka akan didapatkan hasil analisis interaksi enzimsubstrat. 4. Untuk mendapatkan file output dalam bentuk pdf, maka klik icon pdf disebelah gambar interaksi 2D enzim-substrat dan kemudian simpan.

lvi Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


d. Preparasi makromolekul Preparasi makromolekul dilakukan dengan merubah format pdb ke format pdbqt. Model struktur AbfA diperoleh dari Protein Modeling Data Base (PMDB) dengan kode akses PM0078180 yang diperoleh dari hasil pemodelan menggunakan program EasyModeller 2.1. Selain AbfA, struktur lainnya yang digunakan adalah 1QW9 dan 2C8N yang diperoleh dari PDB. Struktur makromolekul yang diperoleh masih dalam format PDB maka perlu dirubah dalam bentuk Rigid Receptor PDBQT dilakukan menggunakan AutoDock Tools (Morris et al., 2009). Rigid Receptor PDBQT: 1. File>ReadMolecule: dipilih file AbfA.pdb dari hasil pemodelan. 2. Edit>Hydrogen>Add: dipilih All Hydrogens, noBondOrder pada Method dan dipilih Yes pada Renumber atoms to include kemudian >OK. 3. Edit>Hydrogens>MergeNonPolar. 4. Grid>Macromolecule>Choose: dipilih file AbfA.pdb >SelectMolecule: simpan file dalam ekstensi PDBQT. e. Preparasi ligan Persiapan ligan dilakukan menggunakan program Autodock Tools. Ligan α D-Arabinobiose dan α-L-Arabinobiose yang digunakan dibangun menggunakan program ChemDrawUltra 7.0 dalam format mol dan optimasi geometri dalam format pdb menggunakan MarvinSpace. Kemudian dilanjutkan dengan tahapan pembuatan ligan format pdbqt dengan tahapan sebagai berikut: 1. Run Autodock Tools 2. Ligand>Input>Open: kemudian pilih file ligan dalam format pdb.

lvii Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


3. Edit>Hydrogens>add>Polar Only, noBonderOrder (for pdb file) pada Methode dan >yes pada Renumber atoms to include hydrogens.>Ok. 4. Ligand>Torsion Tree>Chose Torsion>Done. 5. Ligand>Torsion Tree>Set Number of Torsion>Dismiss. 6.

Ligand>Out put>Save as PDBQT.

f. Autogrid Tahap Autogrid merupakan tahapan penentuan map yang digunakan untuk docking yang meliputi ukuran grid box dan kordinat posisi grid box (Morris et al., 2009). Tahapan Autogrid dilakukan sebagai berikut : 1. Grid>Grid Box: kemudian dipilih number of point in X, Y dan Z sesuai dengan ukuran sisi aktif protein, Spacing (angstrom) 1.000, dan diletakkan Center Grid Box untuk X, Y, dan Z pada sisi aktif makromolekul. 2. File>Close Saving Current. 3. Grid>Output>Save GPF. 4. Grid>Edit GPF>OK. 5. Run>cmd.exe >OK. 6. Dituliskan pada layar Command Prompt yang bertujuan untuk masuk ke folder yang berisi file bentuk GPF, ligan dan makromolekul dalam bentuk pdbqt dengan script : cd[spasi][nama file][enter] 7. Kemudian tahap Autogrid dilakukan dengan mengganti xxx dengan nama file pada script sebagai berikut: Autogrid4[spasi]–p[spasi]xxx.gpf[spasi]–l[spasi]xxx.glg[spasi]&

lviii Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


g. Autodock Pada tahapan Autodock ditentukan parameter search docking yang akan digunakan yaitu Lamarkian Genetic Algoritma (LGA) untuk mendapatkan model pengikatan yang optimal pada sisi aktif. Tahapan Autodock dilakukan sebagai berikut ( Morris et al., 2010) : 1. Docking>Macromolecule>Set Rigid File Name: kemudian dipilih file macromolecule. 2. Docking>Ligand>Chose: kemudian dipilih ligand. 3. Docking>Search Parameters>Genetic Algorithm: Deffault kemudian >Accept. 4. Docking>Docking Parameters>Accept. 5. Docking>Output>Lamarckian GA: kemudian save file DPF. 6. Edit DPF>Ok. 7.

Kemudian tahap running Autodock dilakukan dengan mengganti xxx dengan nama file pada script sebagai berikut: Autodock4[spasi]–p[spasi]xxx.dpf[spasi]–l[spasi]xxx.dlg[spasi]&[enter]

h. Analisis hasil docking Analisis hasil docking dilakukan menggunakan program PyMol, Discovery Studio 2.0, PDBsum dan AutoDock Tools untuk mengetahui energi pengikatan, model pengikatan, kompleks ligan-reseptor dan residu yang berinteraksi dengan ligan sebagai berikut (Morris et al., 2009): 1. Analyze>Dockings>Open: dipilih file log. 2. Analyze>Macromolecule: dipilih file AbfA.pdbqt. 3. Analyze>Docking>ShowInteractions.

lix Tesis


MUCH ZAENAL FANANI


4. Analyze>Conformations>Play, ranked by energy. 5. File>Save>SaveImageAs>Choose>OK. i. Validasi docking Validasi docking dilakukan dengan menggunakan metode re-docking dan cross-docking. Tujuan validasi docking adalah didapatkan parameter grid docking yang menghasilkan hasil docking yang mendekati native. Redocking dilakukan pada struktur hasil co-crystalization yaitu redocking ligan native pada makromolekul. Kemudian hasil docking dianalisis untuk mendapatkan kompleks ligan-makromolekul yang kemudian superimpose dengan struktur native. Jika hasil docking yang didapatkan masih berbeda jauh dengan struktur native, maka parameter grid-docking yang akan divariasi hingga didapatkan hasil docking yang menyerupai dengan kompleks native. Crossdocking digunakan untuk validasi parameter grid-docking dengan superimpose struktur hasil docking dengan struktur kristal dengan ligan non-native. Pada cross-docking, struktur kompleks yang digunakan sebagai referensi adalah struktur kompleks makromolekul-ligan native hasil co-crystalization.

lx Tesis


MUCH ZAENAL FANANI

pET-abfA

Recommend Documents