Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici
Sledování změn asimilovatelného dusíku během alkoholové fermentace moštů révy vinné Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Mojmír Baroň, Ph.D.
Vypracovala: Bc. Romana Kyselková Lednice 2014
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Sledování změn asimilovatelného dusíku během alkoholové fermentace moštů révy vinné vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.
V Lednici dne: Podpis
„Ráda bych poděkovala vedoucímu své diplomové práce Ing. Mojmíru Baroňovi, Ph.D. za vstřícný přístup, podporu, odborné vedení, trpělivost a cenné připomínky. Velký dík patří mé rodině a přátelům, kteří mi byli oporou během celého mého studia.“
-5-
OBSAH: ÚVOD............................................................................................................................ 7 CÍL PRÁCE ................................................................................................................... 8 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................... 9 3.1. Dusík ....................................................................................................................... 9 3.1.1. Dusík v půdě .................................................................................................... 9 3.2. Význam dusíku ve výživě révy vinné ................................................................... 10 3.3. Vznik dusíku v hroznech ...................................................................................... 10 3.3.1. Formy dusíku v hroznech .............................................................................. 11 3.4. Dusík v moštech a víně ......................................................................................... 14 3.4.1. Formy dusíku ................................................................................................. 14 3.5. Metabolismus zdrojů dusíku ................................................................................. 17 3.6. Přídavek dusíku..................................................................................................... 18 4 DESIGN POKUSU ..................................................................................................... 19 5 MATERIÁL A METODIKA ...................................................................................... 21 5.1. Materiál ................................................................................................................. 21 5.1.1. Výběr odrůdy ................................................................................................. 21 5.2. Metodika ............................................................................................................... 21 5.2.1. Metody příjmu a zpracování vzorků.............................................................. 21 5.2.2. Metody měření ............................................................................................... 23 6 VÝSLEDKY A DISKUZE .......................................................................................... 27 6.1. Primární rozbor moštu .......................................................................................... 27 6.2. Srovnání metod stanovení asimilovatelného dusíku – enzymatické stanovení spektrofotometrem a formaldehydová titrace .................................................................. 27 6.3. Porovnání dusíku v průběhu fermentace .............................................................. 29 6.4. Porovnání spotřeb dusíku...................................................................................... 34 6.5. Senzorická analýza ............................................................................................... 36 7 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 37 8 DOPORUČNÍ PRO PRAXI ........................................................................................ 38 9 SOUHRN ..................................................................................................................... 39 10 RESUME ..................................................................................................................... 40 11 SEZNAM TABULEK ................................................................................................. 41 12 SEZNAM GRAFŮ ...................................................................................................... 41 13 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ......................................................................... 42 1 2 3
-6-
1 ÚVOD „Znalost vína může být radostí po celý život člověka.“ (E. Hemingway) Víno je považované za kulturní nápoj od samého počátku své existence. Plnilo a plní funkci společenskou, ekonomickou, krajinotvornou a vytváří pracovní příležitosti. Zasahuje do všech společenských vrstev, do množství náboženství a do značného množství kultur. Není divu, že jeho výroba je intenzivně zkoumána. V hroznovém moštu se nachází široká škála dusíkatých sloučenin, jako aminokyseliny, amonné ionty, peptidy a proteiny. Z nich jsou amonné ionty a aminokyseliny asimilovány kvasinkami rodu Sacharomyces cerevisiae, které při kvašení převládají, proto jsou tyto složky nazývány „asimilovatelným dusíkem“, zkráceně YAN. Asimilovatelný dusík je základní výživa pro kvasinky a jeho dostačující obsah umožňuje hladký průběh fermentace. Dusíkaté sloučeniny mají vliv na růst biomasy, stupeň fermentace a čas jejího trvání. Amonné ionty slouží pro stavbu buněčných stěn kvasinek a tvorbě proteinů, zatímco aminokyseliny jsou prekurzory aromatických látek. Problematika asimilovatelného dusíku v moštu nabývá v současné době na významu z více důvodů. Jedním z nich je jeho nedostatek. Zde přichází na řadu bezpočet komerčně dostupných preparátů na doplnění výživy pro kvasinky. Toto sebou přináší další a tím jsou složení komerční výživy, načasování jejího přidání a přidané množství.
-7-
2 CÍL PRÁCE Hlavním cílem této diplomové práce je sledovat změny asimilovatelného dusíku během alkoholové fermentace moštů révy vinné. Kromě teoretické části zabývající se vznikem a rozdělením asimilovatelného dusíku v hroznech a moštu, se práce věnuje i praktickému pokusu, ve kterém se sledují a porovnávají změny dusíku v průběhu fermentace po obohacení moštu různými druhy výživ. Cílem je výsledky statisticky zhodnotit a doporučit načasování přidání a druhu výživy pro praxi.
-8-
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1. Dusík Dusík je významným prvkem pro všechny živé organismy včetně rostlin. Je součástí aminokyselin, amidů, bílkovin, pyrimidinových, purinových bází, nukleových kyselin, chlorofylu, enzymů a dalších biologicky aktivních látek. V rostlinách se jeho obsah pohybuje ve značném rozmezí v závislosti na druhu orgánu a stáří rostliny. V počátečních fázích vývoje je jeho obsah vysoký a s tvorbou biomasy postupně klesá. Přijatý dusík je zabudováván do uhlíkatých sloučenin v aminoskupinách za vzniku aminokyselin. Prakticky rostlina přijímá dusík ze dvou forem, a to jako NO3- a NH4- ionty. Obě formy jsou mobilní, dobře metabolicky využitelné, ale mají značně rozdílný význam, úměrný rozdílům oxidace obou iontových forem. Kromě toho rostliny mohou v omezené míře přijímat i některé dusíkaté organické látky, např. močovinu, aminokyseliny aj. U bobovitých rostlin jako zdroj dusíku slouží i vzdušný N2. (Richter, 2006)
3.1.1. Dusík v půdě Nadbytek a nedostatek dusíku Nadbytek dusíku podporuje intenzivní růst letorostů, tvoří se řídká pletiva, čímž se snižuje odolnost révy proti houbovým chorobám a hrozny jsou náchylné na hnití. Letorosty špatně vyzrávají a jsou citlivější na mrznutí. (Hlušek a kol., 2002) Nedostatek je doprovázen slabou diferenciací květenství, předčasným opadem starých zežloutlých listů. Objevuje se načervenalá barva řapíků a os letorostů, je omezený růst a v důsledku toho kratší letorosty a menší listy.
Opožďuje se rašení, snižuje se
odolnost proti houbovým chorobám a nízkým teplotám. (Hlušek a kol., 2002) Hnojení dusíkem Z pohledu výživy je potřeba základní dávku dodávat révě vinné výhradně půdou, buď v kapalné formě, nebo v podobě tuhého minerálního hnojiva. Listová výživa se využívá jenom v případech výrazné deficience výživy, nebo za dlouhého přetrvávajícího sucha, kdy je dusík těžko přijatelný. Nadměrná listová výživa dusíkem může ale zvyšovat náchylnost k houbovým chorobám a snižovat kvalitu hroznů. V mladých výsadbách se téměř vždy vynechá hnojení dusíkem až do zapěstování pěstitelského tvaru. Aplikace dusíku vede k tvorbě velmi silných letorostů, které jsou pro zapěstování kmínku nevhodné, protože jsou citlivější na zimní mrazy. (Maťas 2012)
-9-
3.2. Význam dusíku ve výživě révy vinné Dusík je pro révu vinnou nejvýznamnějším makroprvkem. Je pro ni limitujícím prvkem růstu, výnosu hroznů a kvality produkce. Pro dosažení jeho vysoké účinnosti musí být ve vyváženém poměru s fosforem, draslíkem a hořčíkem. Je složkou chlorofylu a spoluzajišťuje tak přeměnu sluneční energie na energii chemickou, je stavebním kamenem všech aminokyselin, ze kterých se tvoří bílkoviny. (Hlušek a kol., 2002) Dále je jednou z hlavních zásobních látek, které se ukládají v kořenech a starém dřevě. Požadavky révy vinné na dusík jsou vysoké. Pro jeho ukládání do podoby zásobních zdrojů je důležité období mezi sklizní a opadem listů. Z pohledu tvorby zásobních látek je důležité, aby byly hrozny sklizeny dříve než opadnou nebo zmrznou listy. (Pavloušek, 2011)
3.3. Vznik dusíku v hroznech Množství dusíkatých látek v hroznech ovlivňuje odrůda, podnož, ročník, způsob ošetřování vinice, napadení houbovými chorobami, hnojení a ošetřování půdy ve vinici. Dusíkaté sloučeniny v hroznech nejsou rovnoměrně rozmístněné. Nejvíce je jich ve vnějších vrstvách slupky. V dužnině je jich méně. Obsahuje pouze 20 - 25 % z celkového obsahu dusíku v bobulích. Hlavními složkami jsou amonné ionty, aminokyseliny a bílkoviny. Transport dusíku v révě se neodmyslitelně odehrává ve formě amonných iontů nebo aminokyselin. Nitráty se vyskytují spíše zřídka z důvodu jejich rychlé redukce v kořenovým a listovém systému Z pohledu dusíkatých látek existují dvě důležité syntézy v tvorbě hroznů. První v období tvorby bobulí a druhá v období zaměkávání bobulí a konce zrání. Těsně před koncem zrání může koncentrace dusíku opět stoupnout. Při sběru je polovina dusíku v rostlině obsažena v bobulích. Pokud jsou hrozny nezralé reprezentuje více než polovinu dusíkatých látek amonný ion. Od zaměkávání bobulí potom koncentrace amonných iontů klesá, Přičemž roste koncentrace organických dusíkatých látek. Množství volných aminokyselin během zrání roste 2 až 5 násobně, dosahující 2 – 8 g.l-1 jeho ekvivalentu Lucinu. Ve zralém moštu reprezentují aminokyseliny 50 – 90 % celkového dusíku. Syntéza amonných kationů s α–ketoglutarovou kyselinou tvoří asimilační cestu dusíkatých látek v hroznech. Tato syntéza je katalyzována enzymy glutaminsyntetázou
- 10 -
a glutamátdehydrogenázou. Ostatní aminokyseliny jsou syntetizovány přesunem dusíku z kyseliny glutamové na příslušné uhlíkaté skelety. Mošt ze zralých hroznů obsahuje sotva 20 % celkového dusíku bobulí. Zbytek zůstává ve slupkách a zrncích, ačkoli se ke konci zrání mění v rozpustnou formu dusíku (amonné ionty a aminokyseliny). (Baroň, 2010)
3.3.1. Formy dusíku v hroznech V bobulích révy vinné se může dusík vyskytovat v anorganických formách - NH4+, NO3-, NO2- a nebo organických formách – volné aminokyseliny, bílkoviny, močovina, ethyl karbamát nebo nukleové kyseliny. Jeho celkový podíl v moštu se pohybuje v rozsahu 100 - 1200 ml.l-1. Celkový dusík v hroznech Obsah celkového dusíku (vyjádřeno v g.l-1 dusíku) v hroznovém moštu slouží jako ukazatel zralosti v závislosti na ročníku. Může se rok od roku lišit i čtyřnásobně v závislosti na odrůdě révy a oblasti pěstování. Anorganický dusík v hroznech Anorganický dusík, ve formě amonných solí, je během růstové fáze nejběžnější formou v dužnině bobulí. Amoniakální dusík reprezentuje 80 % celkového dusíku vznikajícího přeměnou dusíkatých látek asimilovaných kořeny rostliny. Má dominantní vliv na změnu barevnosti bobulí a jeho koncentrace začíná rapidně klesat s počátkem transaminačních reakcí. Jakmile jsou hrozny plně zralé, minerální dusík prezentuje méně než 10 % celkového dusíku. Amonné ionty jsou nejsnadněji využitelným zdrojem kvasinek. Jejich koncentrace rapidně ovlivňuje dynamiku, se kterou mošt začíná fermentovat stejně jako potenciál samotné fermentace. Tato forma ke konci alkoholové fermentace obvykle úplně zmizí. (Baroň, 2010) Organický dusík v hroznech Hlavní složkou jsou volné aminokyseliny. V moštu představují zdroj dusíku pro kvasinky, mléčné bakterie pro jablečno-mléčnou fermentaci a mohou podporovat tvorbu aromatických látek. Jsou to sloučeniny, které obsahují na uhlíkatém skeletu vázanou amino skupinu (-NH2) a karboxylovou skupinu (-COOH).Pravidelně se vyskytuje 20 základních aminokyselin. Mají molekulovou hmotnost pod 200 g.mol-1, a 32 z nich bylo identifikováno v moště a ve víně. Přispívají k acidobazické pufrační kapacitě moštu a vína. (Dartiguenave a kol., 2000)
- 11 -
Asimilovatelné volné aminokyseliny tvoří 51-92 % z celkového asimilovatelného dusíku v bobulích v okamžiku sklizně hroznů. K nejvíce zastoupeným aminokyselinám patří arginin a prolin. V závislosti na výživě vinice se hlavní aminokyselinou může stát glutamin. Jelikož slupka obsahuje významný podíl aminokyselin, mají kvasinky při maceraci modrých hroznů a také některých bílých odrůd k dispozici i dostatek aminokyselin. (Pavloušek, 2011) tabulka 1: Aminokyseliny v moštu
- 12 -
Peptidy jsou polykondenzáty 2 až 100 aminokyselin vázaných peptidovou vazbou, která vzniká reakcí aminoskupiny a karboxylové skupiny. Představují významnou část dusíku ve víně. Mohou být odděleny filtrací. Některé malé peptidy mají také zajímavé sladké nebo hořké příchuti, které jsou užitečné při vinifikaci. (Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, Donéche, 2006)
- 13 -
Bílkoviny (proteiny)
jsou
polykondenzáty L-aminokyselin, které
vznikly
proteosyntézou. Obsahují lineární nerozvětvené řetězce s více než 100. Hrozny a víno obsahují mnoho proteinů v široké škále molekulových hmotností (30 000 – 150 000 g.mol-1). Za teplého a suchého počasí se v hroznech vytváří vyšší obsah bílkovin, jenž může způsobovat problémy s kvašením moštů a ve víně pak vést k častějšímu výskytu bílkovinných zákalů. Amidy jsou skupina zastoupená malým množstvím asparaginu a glutaminu. Také obsahuje močovinu a etylkarbamát, který je přísně kontrolován z důvodu vysoké zdravotní závadnosti. Močovina je diamid kyseliny uhličité. Z vinařského hlediska je důležitá především jako prekurzor etylkarbamátu. (Baroň, 2010) Pyraziny jsou šestičlenné heterocykly obsahující dva atomy dusíku a čtyři atomy uhlíku s postranními řetězci, které do značné míry určují jejich aromatické vlastnosti. Přispívají k aroma charakteristického pro 'Cabernetu Sauvignon'.
3.4. Dusík v moštech a víně Výživa dusíkem významně působí na kvalitu vína. Při jeho nedostatku je v hroznech nízký obsah volných aminokyselin a zhoršuje se kvalita tvorby aromatických látek ve víně během fermentace. Při výrobě červených vín může nedostatek dusíku zhoršovat podmínky pro průběh jablečno-mléčné fermentace. Při nadbytku je fermentace bezproblémová, ale zvyšuje se tvorba vyšších alkoholů na úkor aromatických esterů. Tvoří se také bílkoviny způsobující bílkovinné zákaly. V extrémních případech se mohou tvořit biogenní aminy, které zapříčiňují alergie a negativně ovlivňují zdraví člověka. (Pavloušek, 2011)
3.4.1. Formy dusíku Hlavní zdroj dusíku pro kvasinky představují primární aminokyseliny a amonné ionty udávané jako asimilovatelný dusík. Často se vyskytující aminokyselina prolin, sekundární aminokyselina v mnoha révových moštech, není metabolizována vinnými kvasinkami. Nízký obsah asimilovatelného dusíku je spojený s poruchami kvašení a vyšším výskytem sirnatých sloučenin, které nežádoucím způsobem poškozují aroma vína. Z důvodů
předcházení
těmto
problémům
je
potřebné
asimilovatelného dusíku v révových moštech, před začátkem kvašení.
- 14 -
zjišťovat
hodnoty
Hodnota menší než 150 mg.l-1 je spojována s větším výskytem problémů při kvašení. Celkové množství dusíkatých sloučenin v orgánech révy vinné závisí na genetických faktorech, podmínkách okolního prostředí a agrotechnických zásazích. Amonné ionty Běžné hodnoty amonných iontů se pohybují v rozmezí desítek až stovek mg.l-1 (Ough, 1991). Množství amonných iontů v moštu může být použit jako indikátor rychlosti fermentace, jelikož slouží výhradně ke stavbě buněčných stěn kvasinek a tvorbě proteinů (Steidl, 2002). Jejich obsah by neměl výrazně převyšovat množství potřebné k těmto procesům a to především z důvodů zdravotních. Při přebytku amonných iontů dochází k vzniku řady nežádoucích produktů jako jsou těkavé kyseliny, močovina apod. (Bely a kol., 2003; Coulon a kol., 2006). Aminokyseliny Mošt obsahuje asi třicet aminokyselin, ale pouze kolem sedmi z nich jsou přítomny v množství nad 100 mg.l-1 (prolin, arginin, glutamin, alalnin, glutamát, serin a threonin). Aminokyseliny ve víně pocházejí z různých zdrojů, jako z domorodých sloučenin v hroznech metabolizovaných kvasinkami během růstové fáze, vyloučený žijícími kvasinkami nebo uvolněné proteolýzou během autolýze mrtvých kvasinek nebo enzymatickou degradací hroznových proteinů. (Cataldi a kol., 2003) Celkový obsah aminokyselin se může značně lišit, 300 až 5000 mg.l-1, představuje asi 20 - 50 % z celkového dusíku moštu. Kvasinky a bakterie používají tyto aminokyseliny pro růst a mohou uvolnit některé zpět do vína po fermentaci ale víno je obecně chudší než původní mošt. Role aminokyselin v chuti vína byla dříve považována za zanedbatelnou. Výzkumy ukázaly, že mohou interferovat s pocitem kyselosti vzhledem ke své pufrační kapacitě. (Dartiguenave a kol., 2000) Provedená práce (Tirija a kol., 2003) ukázala, že amonný dusík spotřebovávaný kvasinkami má za následek vyšší okyselení média než spotřeba aminokyselin. Mohou také sloužit jako prekurzory pro syntézu aromatických sloučenin, jako je například isoamyl acetát, izovalerová kyseliny a isomáselné kyseliny a jejich ethylestery, stejně tak přiboudliny a methionol, které jsou všechny vedlejší produkty metabolismu aminokyselin. (Ferreira a kol, 2000)
- 15 -
Mohou být také přítomny ve formě polymerů, jako jsou malé oligopeptid o 2 – 4 aminokyselinách až do velkých bílkovin o až 150 000 Da. Tyto peptidy mohou být použity bakteriemi jako živiny a můžou hrát roli při oxidaci moštu: glutathion může reagovat s chinony vyplívající z oxidace fenolických sloučenin. Oligopeptidy mohou hrát roli při vnímání sladkosti. (Desportes a kol., 2001) Proteiny jsou přítomny v nejrůznějším množství v moště a víně. Určování množství se může měnit v závislosti na použité metodě. Celkový obsah bílkovin v moštu a víně se zvyšuje dusíkatým hnojením révy, vysokou teplotou fermentace a dlouhodobým ležením na kvasnicích. Obvykle jsou přítomny v koncentracích v rozmezí 15 – 230 mg.l-1. (Ferreira a kol., 2002) Mohou přispět k rozvoji problémů v procesu kvašení bílých vín v důsledku expozice chladu, horka nebo nízkých kolísajících teplot. Tyto problémy jsou do značné míry nepřítomny v červených vínech vzhledem k vysrážení proteinů s taninami. (Somers a Ziemelis , 1973) Ve srovnání s dalšími sloučeninami, jako jsou cukry a fenoly, organoleptický vliv bílkovin na aroma vína mohou být považovány za zanedbatelné. Bylo ale prokázáno, že proteiny se mohou vázat na těkavé sloučeniny, zvyšovat tak těkavost některých aromatických sloučenin a některé jiné redukovat. (Blouin a Cruège, 2003) Obsah bílkovin má také ekonomický význam, protože významně ovlivňuje průhlednost vína (Ferreira a kol., 2002). Z tohoto důvodu, se obvykle bílkoviny vysráží z vína pomocí bentonitu. Další dusíkaté sloučeniny, které jsou přítomny ve víně jsou močovina, která pochází z argininu a je prekurzorem ethylkarbamátu. Tato sloučenina je známý karcinogen a některé země stanovily omezení na množství, které může víno obsahovat. Nicméně, množství přítomného ethylkarbamátu ve víně je obvykle výrazně nižší než povolené maximum. Víno také obsahuje biogenní aminy, jako je histamin, tyramin, putrescin, kadaverin, spermidin a spermin, které jsou tvořeny hlvaně v průběhu jablečno-mléčné fermentace z aminokyselin obsažených v moštu (Lonvaud-Funel, 2001), ale mohou být také přítomny v hroznech. Vysoké množství těchto biogenních aminů mohou způsobit
- 16 -
problémy pro některé spotřebitele: například, histamin může způsobit bolesti hlavy, vysoký krevní tlak a zažívací problémy, zatímco tyramin může způsobit bolesti hlavy, vysoký krevní tlak a zažívací problémy. Tyto problémy mohou být spojeny s migrénou a hypertenzí. (Sillas-Santos, 1996)
3.5. Metabolismus zdrojů dusíku Když kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae rostou v hroznovém moštu, spotřebovávají značné množství asimilovatelného dusíku k syntéze biomasy (Kunkee, 1991). Hroznová šťáva obsahuje řadu dusíkatých sloučenin, jako je amoniak, aminokyseliny, peptidy, proteiny ale jen některé z nich mohou být asimilovány Saccharomyces cerevisiae (Hensche a Jiránek , 1993) . Během fermentace mohou použít pouze amoniaku a aminokyselin, s výjimkou prolinu, jako zdroje asimilovatelného dusíku (Barre a kol., 1998). Prolin může být asimilován Saccharomyces cerevisiae, ale pouze za aerobních podmínek (Boulton a kol., 1996). Z tohoto důvodu, termín snadno asimilivatelný dusík (YAN) obsahuje veškerý amoniak a aminokyseliny s výjimkou prolinu. (Taylor,1957) Hroznový mošt je poměrně chudý
. na amoniak a aminokyseliny (Kunkee, 1991).
V důsledku toho, příjem těchto sloučenin kvasinkami může být v některých případech kritický. Při nízké koncentraci YAN je riziko pomalého kvašení velmi vysoké (Bisson, 1999). YAN požadavek na kompletní kvašení závisí na kmeni kvasinek ( Manginot a kol., 1998) a potenciálním obsahu alkoholu. Obecně se má za to, že YAN nižší než 130 mg.l-1 může vážně ovlivnit správný vývoj alkoholové fermentace. V kontrastu, nadměrné množství dusíku může vést k přítomnosti neasimilovatelných zbytků dusíku ve víně, což je faktor mikrobiální nestability a může dokonce podporovat vznik ethylkarbamátu a biogenních aminů. Z tohoto důvodu musí být přídavek dusíku pečlivě hlídány a musí se brát v potaz počáteční koncentrace YAN v moštu a potenciální obsah alkoholu. (Moreno-Arribas a kol, 2009) Zdrojem dusíku jsou složité organické sloučeniny. Kvasinky postupují podle určitého výběru tak, že nejdříve asimilují jednoduché látky a poté peptidy a bílkoviny, které nejprve rozkládají. Rozpustné aminokyseliny se v buňce ukládají nejméně ve dvou reakčních prostorech, v cytosole, kde se využívají na stavbu bílkovin a ve vakuolách, kde tvoří většinou největší složku metabolického fondu vakuoly. V izotonickém prostředí se
- 17 -
z vakuoly dezintegrací uvolní jen malé množství těchto aminokyselin a jiných látek, ale při osmotickém šoku, kdy se rozruší tonoplast, uvolňuje se hlavní část. Mezi uvolněnými aminokyselinami převládají ornitin a arginin. Jednotlivé aminokyseliny mají zcela individuální metabolismus. Aminokyseliny se ukládají nejen ve vakuolách, ale jsou ve vakuolách i tvořené rozkladem bílkovin. Bílkoviny se neustále odbourávají a znovu tvoří. Účastní se celkové látkové přeměny mnohem podstatněji než sacharidy a lipidy. V kvasinkách, podobně jako v živočišných buňkách, je ve vakuolách vysoká aktivita kyselých proteáz a objevuje se v rozpustných frakcích po mechanické dezintegraci buněk Saccharomyces cerevisiae. (Kockova-Kratochvilova, 1983)
3.6. Přídavek dusíku Pro růst kvasinek je nezbytný dostatek dusíku v moštu. Amonný kationt je snadno asimilován a je schopen uspokojit potřeby kvasinek po dusíku, zejména pro syntézu aminokyselin. Polypeptidy a proteiny se nepodílí na růstu Saccharomyces cerevisiae, jelikož je kvasinky nedokáží hydrolyzovat. Kvasinky nepotřebují aminokyseliny jakou součást své výživy, protože jsou schopné si je syntetizovat ale jejich přídavek je stimuluje více, než amonný dusík. Směs aminokyselin a amonných iontů je ještě účinnější stimulant. (Henschke a Jiránek, 1992) Ačkoli směs amonných solí a aminokyselin jsou efektivnější pro podporu růstu kvasinek a rychlosti fermentace, amonné soli se využívají pro zvýšení obsahu dusíku v moštu a jejich jednoduchost. Kromě toho, přidání dusíku není vždy dostačující pro řešení obtíží závěrečné fáze fermentace, i když urychluje fermentaci v časných stádiích. Počáteční koncentrace amonných iontů v moště je jeden z nejdůležitějších elementů k rozhodnutí k jeho obohacení. Toto je nezbytné, když koncentrace NH4+ je menší než 25 mg.l-1. (Henschke a Jiránek, 1992) Bely a kol, (1990) zjistili, že přídavek výživy je efektivní, když obsah asimilovatelného dusíku je menší než 130 mg.l-1.
- 18 -
4 DESIGN POKUSU Kvůli dostupnosti materiálu je vybrána odrůda 'Sauvignon'. Z důvodu porovnání rozdílných druhů výživy, jsou vybrány komerčně dostupné přípravky Zimovit a Nutrozim. Tyto výživy jsou přidány v rozdílných dávkách. Máme celkem 7 variant pokusu. tabulka 2: Design pokusu
Varianta
Velikost přídavku Druh výživy výživy (mg.l-1)
Čas přídavku výživy (h)
Dávka
0
-
-
-
1
DAP + Tiamin + Amonnium sulfát
50
nízká
0
1A
DAP + Tiamin + Amonnium sulfát
150
vysoká
0
1B
DAP + Tiamin + Amonnium sulfát
100;50
rozdělená
0;142
2
DAP + těla kvasinek + Tiamin + celuléza
50
nízká
0
2A
DAP + těla kvasinek + Tiamin + celuléza
150
vysoká
0
2B
DAP + těla kvasinek + Tiamin + celuléza
100;50
rozdělená
0;142
DAP - dihydrogenfosforečnan amonný
- 19 -
Design vyústil v 196 vzorků. Jednotlivé vzorky byly odebírány v časových intervalech a následně analyzovány. Ze 7 variant bylo vyrobeno 7 vín. V součtu bylo provedeno 197 měření asimilovatelného dusíku (před a v průběhu fermentace), 196 měření amonných iontů (v průběhu fermentace) a 196 měření aminokyselin (v průběhu fermentace). Dále bylo provedeno 196 měření hodnot pH, celkových kyselin a alkoholu v průběhu fermentace. Dalším cílem práce bylo porovnání metod měření aminokyselin a amonných iontů s formaldehydovou titrací. Posledním cílem práce bylo senzorické zhodnocení pokusu. Analýza proběhla ve dvou termínech. Hodnotily se zde jednotlivé varianty.
- 20 -
5 MATERIÁL A METODIKA 5.1. Materiál 5.1.1. Výběr odrůdy Předmětem pokusu byla odrůda „Sauvignon“ s cílem sledování změn obsahu asimilovatelného dusíku v průběhu fermentace. Sauvignon Původ odrůdy: Pochází pravděpodobně z oblasti Bordeaux ve Francii. Křížení není známo. V registraci je od roku 1952. Charakteristika: List je malý až středně velký, pětilaločnatý s výraznými výkroji. Čepel je prolamovaně zvlněná, vespod chloupkatá. Bazální výkrojek je lyrovitý, lehce překrytý. Řapík je krátký, zelené barvy. Hrozen je malý, válcovitý, hustý. Průměrná hmotnost hroznu je 110g. Bobule je malá až středně velká, oválná, zelenožlutá. Dužnina je rozplývavá, s výrazným a typickým aroma. Odrůda má bujnější růst s hustým olistěním. Raší i kvete středně raně, dozrává koncem září až začátkem října. Odolnost proti houbovým chorobám je nižší, je náchylná na padlí révové, plíseň šedou i červenou spálu. Mrazuvzdornost je rovněž nízká, zejména proti jarním mrazíkům. Plodnost je nižší 8,5 – 11 t.ha-1, cukernatost v moštu je 17 – 20 °NM, obsah kyselin je 9 – 11,5 g.l-1. Odrůda vyžaduje jen velmi dobré slunné polohy chráněné proti mrazu. Nevhodné jsou půdy příliš suché či podmáčené. Nejvhodnější je vyšší vedení s řezem na dlouhé tažně. Vhodné jsou podnože „SO 4“, „T 5C“ a CR 2“. Víno je kvalitní, vysoce extraktivní, velmi aromatické, připomínající nádach kopřiv nebo listy černého rybízu, které se ve zralosti mění na vůni angreštového kompotu či bezového květu nebo dokonce broskví a exotického ovoce. (Sotolář, 2006). Odrůda byla zvolena z důvodu dostupnosti suroviny, blízké lokaci stanoviště.
5.2. Metodika 5.2.1. Metody příjmu a zpracování vzorků Sběr hroznů proběhl mechanizovaně dne 10.10.2013. Po přivezení hroznů do výroby následovalo lisování a statické odkalení v průběhu noci při teplotě kolem 10°C. Další den byl stočený do 350 litové přepravní nádoby a převezený do sklepa Zahradnické
- 21 -
fakulty Mendelovy univerzity v Lednici. Zde byl rozdělen do 7 demižónů o objemu 50 litrů. Výživa byla aplikována v předem stanoveném množství 3 hodiny před inokulací moštu kvasinkami (Tabulka č.3). Následovala inokulace moštu kvasinkami Saccharomyces Cerevisiae, komerčním preparátem značky Lallemand pod názvem Lallemand VL3. Od inokulace moštu byly odebírány vzorky v časových intervalech (viz Tabulka č.4 ). Druhý přídavek výživy proběhl u vybraných variant dne 17.10.2013 ve 14 hod. tabulka 3: Druh, velikost a načasování přídavku výživy
Varianta
Název přípravku
Druh výživy
Velikost přídavku výživy (mg.l-1)
0
-
-
-
1
Zimovit
DAP + Tiamin + Amonnium sulfát +
50
nízká
0
1A
Zimovit
DAP + Tiamin + Amonnium sulfát +
150
vysoká
0
1B
Zimovit
DAP + Tiamin + Amonnium sulfát +
100;50
rozdělená
0;142
2
Nutrozim
DAP + těla kvasinek + Tiamin + celulóza
50
nízká
0
2A
Nutrozim
DAP + těla kvasinek + Tiamin + celulóza
150
vysoká
0
2B
Nutrozim
DAP + těla kvasinek + Tiamin + celulóza
100;50
rozdělená
0;142
DAP – dihydrogenfosforečnan amonný
- 22 -
Dávka
Čas přídavku výživy (h)
-
tabulka 4: Odběr vzorků v čase Oděr 1 Čas přídavku výživy (h)
2
2
3
4
5
16,5 19,5 21,5 23,5
6
25
7
8
9
10
27,5 29,5 40,5 43,5
Oděr
11
12
13
14
15
16
17
Čas přídavku výživy (h)
46
50
52,5
55
65
67,5
72
Oděr
21
22
23
24
25
26
27
Čas přídavku výživy (h)
98
101 117 121 124 137 144 1148
18
19
20
74,5 76,5 91,5 28
5.2.2. Metody měření Stanovení pH Princip: Hodnota pH je záporný dekadický logaritmus aktivity vodíkových kationtů v moštu nebo víně. Stanovujeme ji na základě měření potenciálu skleněné elektrody, jenž závisí do aktivity vodíkových kationtů, vzhledem k referenční kalomelové elektrodě vhodným milivoltmetrem (pH-metrem), kalibrovaným tlumivými roztoky o známém pH. Postup: Provedeme přípravu tlumivých roztoků a kalibraci pH-metru při teplotě laboratoře podle typu přístroje a doporučení výrobce. Ve vzorku moštu o teplotě laboratoře změříme hodnotu pH, s přesností na dvě desetinná místa po ustálení hodnoty nedigitální stupnici (Balík 2006). Stanovení veškerých titrovatelných kyselin Veškerými titrovatelnými kyselinami (veškerou kyselost vína) se rozumí suma sloučenin titrovatelných odměrným alkalickým roztokem do pH 7. Kyselina uhličitá se do veškeré kyselosti nezahrnuje. Postup: Pipetou odměříme 10 ml destilované vody a do směsi ponoříme kombinovanou elektrodu pro měření pH. Za stálého míchání pomalu přidáváme z byrety 0,1 mol. l-1 roztok NaOH do pH rovnající se hodnotě 7 při 20°C (Balík 2006). Vyhodnocení: x = a . f . 0,75 x = g . l-1 veškerých titrovatelných kyselin vyjádřené na jedno desetinné místo jako kyselina vinná x´ = a . f. 10 x´ = veškeré titrovatelné kyseliny vyjádřené na jedno desetinné místo jako miliekvivalenty litru - 23 -
a = ml spotřebovaného 0,1 mol. l-1 roztoku NaOH f = faktor 0,1 mol. l-1 roztoku NaOH Stanovení celkového asimilovatelného dusíku formaldehydovou titrací Množství YAN bylo stanoveno formolovou titrací za použití automatického titrátoru TITROLINE EASY. Jako titrační činidlo byl použit 0,1mol.l-1 roztok NaOH o známém faktoru. Pipetou bylo odebráno 10 ml vzorku, který byl následně zředěn 10 ml destilované vody. Hodnota pH byla zvýšena v rámci stanovení titrovatelných kyselin pomocí 0,1mol.l-1 roztoku NaOH na 8,1. Následně bylo přidáno 10 ml 36 – 38% vodného roztoku formaldehydu (pH formaldehydu bylo upraveno na 8,1 pomocí 1 mol.l-1 roztoku NaOH) a směs byla opět titrována do pH 8,1. Po ukončení titrace byla z displeje titrátoru odečtena spotřeba roztoku NaOH v mililitrech s přesností na dvě desetinná místa. Po vynásobení této hodnoty faktorem roztoku použitého hydroxidu a koeficientem 140 byl zjištěn obsah YAN ve vzorku v miligramech na litr. Oproti způsobu původnímu zde nebylo upravováno pH roztoku formaldehydu na 8,1, ale byl stanoven pouze objem 0,1 mol.l-1 roztoku NaOH na tuto úpravu potřebný. Tento objem se posléze odečítal od spotřeby titračního činidla při formolové titraci. Stanovení amonných iontů a aminokyselin pomocí Miury one Stanovení amonného dusíku Amonný dusík byl stanoven v moštu i víně enzymatickou metodou na automatickém spektrofotometru Miura one. Stanovení je založeno na tvorbě NAD+ projevujícího se poklesem měřeného při absorbanci 340 nm. Veškeré reagencie jsou dodávané formou kitu od specializované firmy oenolab.com. Princip: 2-Oxoglutarate + NH4 + NADH → L-Glutamate + NAD + H2O.
Stanovení v moštu Mošt byl před měřením použit neředěný. Nejprve byl mošt odstředěn při 13 000 ot/min po dobu 3 min. Odstředěný mošt byl uložen do karuselu automatického spektrofotometru. Do mikrokyvety bylo automatickým ramenem napipetováno 200 µl reagencie R1. Poté byl napipetován vzorek moštu a obsah kyvety byl řádně promíchán. Celý prostor karuselu byl temperován na 37 °C. Po inkubační době 5 min při teplotě 37 °C bylo do kyvety napipetováno 40 µl reagencie R2, která spouští enzymatickou reakci. Následovala finální inkubační doba 5 min a po této době byla změřena absorbance při vlnové délce 340 nm. Rychlost enzymatické reakce byla vypočítaná z kalibrační křivky za použití standardů z amonného dusíku z kitu dodaných specializovanou firmou. Výsledky
- 24 -
jsou vyjádřeny v mezinárodních jednotkách U.I. definované jako: množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 μmol substrátu za minutu za standardních podmínek (při definované teplotě). Stanovení ve víně Enzymatická reakce ve víně byla stanovena stejnou metodou jako v moštu s rozdílem před přípravy vzorku. Víno není nutno před samotným měření odstředit. Postup dále viz víše. Stanovení primárního aminodusíku (FAN) Primární aminodusík byl stanoven v moštu i víně kolorimetirckou metodou na automatickém spektrofotometru Miura one. V zásaditém prostředí reaguje primární aminodusík (FAN) s O-ftaldialdehydem v přítomnosti N-acetyl-L-cysteinu a tvoří sloučeniny, jejichž absorbance je následně měřena při vlnové délce 340 nm. Stanovení v moštu Mošt byl před měřením použit neředěný. Nejprve byl mošt odstředěn při 13 000 ot/min po dobu 3 min. Odstředěný mošt byl uložen do karuselu automatického spektrofotometru. Do mikrokyvety bylo automatickým ramenem napipetováno 225 µl reagencie R1. Poté byl napipetován vzorek moštu a obsah kyvety byl řádně promíchán. Celý prostor karuselu byl temperován na 37 °C. Po inkubační době 5 min při teplotě 37 °C bylo do kyvety napipetováno 25 µl reagencie R2, která zahájí reakci. Následovala finální inkubační doba 5 min a po této době byla změřena absorbance při vlnové délce 340 nm. Intenzita zabarvení roztoku byla vypočítána z kalibrační křivky. Standard primárního aminodusíku je součástí kitu. Stanovení ve víně Enzymatická reakce ve víně byla stanovena stejnou metodou jako v moštu s rozdílem předpřípravy vzorku. Víno není nutno před samotným měření odstředit. Postup dále viz víše. Stanovení analytických hodnot moštu pomocí FTIR analyzátoru Bruker Alpha Přístroj ALPHA je kompaktní FTIR analyzátor využívající vzorkovací techniku ATR, která významně zjednodušuje úpravu vzorku před analýzou. Vzorky čirých vín byly tedy analyzovány bez úpravy, zatímco u moštů a kvasících vín byla provedena centrifugace při 13,2 tis. ot./min po dobu 6 minut. Před zahájením měření prvního vzorku byl přístroj důkladně propláchnut deionizovanou vodou a bylo změřeno pozadí (slepý vzorek = deionizovaná voda). Pro analýzu byl pomocí stříkačky odebrán 1 ml čirého
- 25 -
vzorku, přičemž 0,5 ml posloužilo k proplachu systému a z druhého 0,5 ml vzorku byla provedena tři měření. V závislosti na použité kalibraci (mošty / kvasící vína / hotová vína) byla změřená data pomocí softwaru automaticky vyhodnocena a převedena do tabulky.
- 26 -
6 VÝSLEDKY A DISKUZE 6.1. Primární rozbor moštu Ke zpracování dat byly použity dostupné softwary EXCEL a STATISTICA verze 10. Z důvodu velkého množství dat a grafů jsou především v případech korelací uvedeny jen průkazné výsledky. V průběhu měření bylo nasbíráno velké množství dat. Z těchto dat byla pomocí statistických metod zjišťována korelace mezi jednotlivými formami dusíku v průběhu fermentace, potvrzení kvantifikace dusíku a také odběr dusíku kvasinkami v čase. Celý pokus byl senzoricky zhodnocen. V následující tabulce č. 5 jsou analytické hodnoty naměřené u připraveného, nezakvašeného moštu. Veškeré data viz přílohy. tabulka 4: Analytické hodnoty moštu
Cukernatost pH Titrovatelné kyseliny YAN
23°NM 3,25 9,46 g.l-1 237 mg.l-1
Pro účel této práce byl naměření obsah asimilovatelného dusíku v moštu vysoký. Jelikož optimální dávka pro hladkou fermentaci je 180 – 200 mg.l-1 (Baroň, 2009), po přidání výživ do jednotlivých variant se ještě zvýšil jeho obsah.
6.2. Srovnání
metod
stanovení
asimilovatelného
dusíku
–
enzymatické stanovení spektrofotometrem a formaldehydová titrace Pro účely této práce bylo enzymatické stanovení spektrofotometrem referenční metodou k formaldehydové titraci. Formaldehydová titrace je rychlá metoda pro detekci aminoskupiny aminokyselin a je považována za pohodlnou a přesnou. (Haiťan a kol, 2012; Baroň, 2012). Baroň (2010) uvádí, že detekuje až 80 – 100 % amonných iontů. Přesnost byla vyjádřena v procentech míry návratnosti. Po přepočtu se výtěžnost blížila 62 % (výpočet viz Přílohy) Byla nalezena pozitivní korelace mezi asimilovatelným dusíkem a součtem amonných iontů s aminokyselinami (Graf č. 1) Korelace je 0,79.
- 27 -
Bodový graf: FAN + NH4 vs. YAN YAN
(Celé příp. vynech. u ChD)
= 12,083 + ,52653 * FAN + NH4 Korelace : r = ,78474
X: FAN + NH4 N = 196 Průměr = 245,318662 Sm.Odch. = 107,892083 Max. = 471,712927 Min. = 44,140675 Y: YAN N = 196 Průměr = 141,251020 Sm.Odch. = 72,391543 Max. = 266,150000 Min. = 7,050000
100 50 0 300 250
YAN
200 150 100 50 0 -50 -100
0
100
200
300
400
500
600 0
FAN + NH4
50 100 0,95 Int.spol.
Graf 1: Korelace YAN a AM+FAN
Varianta 0 (Grafu č. 2) má jako jediná vyšší obsah asimilovetelného dusíku než je součet amonných iontů a aminokyselin. Její korelace činí 0,83. Bodový graf: součet AM+FAN vs. YAN mg/l (Celé příp. vynech. u ChD) YAN mg/l = 20,600 + 1,1160 * součet AM+FAN Korelace : r = ,83486 10
X: součet AM+FAN N = 28 Průměr = 111,173332 Sm.Odch. = 51,435639 Max. = 200,484163 Min. = 44,140675 Y: YAN mg/l N = 28 Průměr = 144,670357 Sm.Odch. = 68,757435 Max. = 251,910000 Min. = 59,900000
5
YAN mg/l
0 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220 0
součet AM+FAN
Graf 2: Korelace YAN a AM+FAN, VO
- 28 -
5 10 0,95 Int.spol.
Vzhledem k neobvyklým hodnotám u kontrolní Varianty 0, byla tato vyčleněna z celkového výpočtu korelace všech variant. Tímto byla zjištěna velmi silná, pozitivní korelace
0,94
mezi
asimilovatelným
dusíkem
a
součtem
amonných
iontů
s aminokyselinami (Graf č.3). Bodový graf: FAN+NH4 vs. YAN (Celé příp. vynech. u ChD) YAN = -47,19 + ,70186 * FAN+NH4 Korelace : r = ,94213 80
X: FAN+NH4 N = 168 Průměr = 267,676216 Sm.Odch. = 98,207567 Max. = 471,712927 Min. = 127,282218 Y: YAN N = 168 Průměr = 140,681131 Sm.Odch. = 73,161200 Max. = 266,150000 Min. = 7,050000
40 0 300 250
YAN
200 150 100 50 0 -50 0
100
200
300
400
500
FAN+NH4
600 0
40 80 0,95 Int.spol.
Graf 3: Korelace YAN a AM+FAN; V1-V2B
6.3. Porovnání dusíku v průběhu fermentace V sekci 6.3, jsou výsledky porovnávány z hlediska obsahu asimilovatelného dusíku a součtu amonných iontů s aminokyselinami. Byla zjištěna pozitivní korelace mezi asimilovatelným dusíkem a součtem amonných iontů a aminokyselin (viz Přílohy)
- 29 -
U kontrolní Varianty 0, bylo naměřeno, jako u jediné, vyšší obsah asimilovatelného dusíku, než byl součet amonných iontů s aminokyselinami (viz. Graf č.4 ). Obsah dusíku Varianta 0 YAN mg/l
součet AM+FAN
300
Obsah dusíku (mg/l)
250 200 150 100 50
2 16 ,5 19 , 21 5 , 23 5 ,5 25 27 , 29 5 , 40 5 , 43 5 ,5 46 5 52 0 ,5 55 6 67 5 ,5 72 74 , 76 5 , 91 5 ,5 98 1 11 01 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
0
Doba fermentace (h)
Graf 4: Obsah dusíku, VO
Varianta 1 byla před začátkem fermentace obohacena o nízkou dávku nízkou dávku výživy Zimovit. Toto se ukazuje Grafu č.5 . Je zde vidět vyšší obsah dusíku na začátku fermentace, než je u kontrolní varianty. Obsah dusíku Varianta 1 YAN mg/l
součet AM+FAN
400
Obsah dusíku (mg/l)
350 300 250 200 150 100 50
2 16 ,5 19 , 21 5 , 23 5 ,5 25 27 , 29 5 , 40 5 ,5 43 ,5 46 50 52 ,5 55 6 67 5 ,5 72 74 , 76 5 ,5 91 ,5 98 10 11 1 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
0
Doba fermentace (h)
Graf 5: Obsah dusíku, V1
- 30 -
Varianta č. 1A byla před začátkem fermentace obohacen vysokou dávkou výživy Zimovit. Toto je patrné z Grafu č.6, který ukazuje vyšší obsah dusíku na začátku fermentace. Obsah dusíku Varianta 1A součet AM+FAN
YAN mg/l 450
Obsah dusíku (mg/l)
400 350 300 250 200 150 100 50
65 67 ,5 72 74 ,5 76 ,5 91 ,5 98 10 11 1 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
50 52 ,5 55
2 16 ,5 19 ,5 21 ,5 23 ,5 25 27 ,5 29 ,5 40 ,5 43 ,5 46
0
Doba fermentace (h)
Graf 6: Obsah dusíku, V 1A
U Varianta 1B (viz Graf č.7) je patrný přídavek výživy před začátkem fermentace jak u asimilovatelného dusíku, tak i u amonných iontů s aminokyselinami. Ovšem po přidání druhé dávky v čase 142 hod. se tento přídavek projevil pouze u součtu amonných iontů s aminokyselinami. Obsah dusíku Varianta 1B součet AM+FAN
YAN mg/l 450
Obsah dusíku (mg/l)
400 350 300 250 200 150 100 50
65 67 ,5 72 74 ,5 76 ,5 91 ,5 98 10 11 1 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
50 52 ,5 55
2 16 ,5 19 ,5 21 ,5 23 ,5 25 27 ,5 29 ,5 40 ,5 43 ,5 46
0
Doba fermentace (h)
Graf 7: Obsah dusíku, V1B
- 31 -
Varianta č. 2 byla před začátkem fermentace obohacen nízkou dávkou výživy Nutrizime. Toto je patrné z Grafu č.8, který ukazuje vyšší obsah dusíku na začátku fermentace. Obsah dusíku v průběhu fermentace Varianta 2 součet AM+FAN
YAN mg/l
450
Obsah dusíku (mg/l)
400 350 300 250 200 150 100 50
65 67 ,5 72 74 ,5 76 ,5 91 ,5 98 10 11 1 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
50 52 ,5 55
2 16 ,5 19 ,5 21 ,5 23 ,5 25 27 ,5 29 ,5 40 ,5 43 ,5 46
0
Doba fermentace (h)
Graf 8: Obsah dusíku, V2
Varianta č. 2A byla před začátkem fermentace obohacen vysokou dávkou výživy Nutrizime. Toto je patrné z Grafu č.9, který ukazuje vyšší obsah dusíku na začátku fermentace. Obsah dusíku v průběhu fermentace Varianta 2A součet AM+FAN
YAN mg/l
450
Obsah dusíku (mg/l)
400 350 300 250 200 150 100 50
2 16 ,5 19 , 21 5 ,5 23 ,5 25 27 , 29 5 , 40 5 , 43 5 ,5 46 5 52 0 ,5 55 6 67 5 ,5 72 74 , 76 5 , 91 5 ,5 98 1 11 01 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
0
Doba fermentace (h)
Graf 9: Obsah dusíku, V2A
- 32 -
U Varianty 2B (viz Graf č.10) je patrný přídavek výživy před začátkem fermentace jak u asimilovatelného dusíku, tak i u amonných iontů s aminokyselinami. Ovšem po přidání druhé dávky v čase 142 hod. se tento přídavek neprojevil. Obsah dusíku v průběhu fermentace Varianta 2B součet AM+FAN
YAN mg/l
500 450
Obsah dusíku (mg/l)
400 350 300 250 200 150 100 50
65 67 ,5 72 74 ,5 76 ,5 91 ,5 98 10 11 1 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
50 52 ,5 55
2 16 ,5 19 ,5 21 ,5 23 ,5 25 27 ,5 29 ,5 40 ,5 43 ,5 46
0
Doba fermentace (h)
Graf 10: Obsah dusíku, V2B
U všech sledovaných variant se projevilo přidání výživy na začátku fermentace, bez ohledu na zvolený typ výživy. Druhý přídavek se projevil pouze u Varianty 1B, a to u součtu amonných iontů a aminokyselin. U Varianty 2B se toto neprojevilo vůbec. Asimilovatelný dusík i nadále klesal. Byl patrný vzestup dusíku na konci fermentace.Toto mohlo být zapříčiněno autolýzou kvasinek a opětovným navrácením dusíku do vína. (Cataldi a kol, 2003) K nejvýraznějšímu poklesu došlo u všech sledovaných variant mezi 55 a 72 hodinou od přídavku inokula, v exponenciální fázi, kdy množství etanolu v médiu není vysoké. (Beltrán a kol, 2005)
- 33 -
Varianta 0, jakožto kontrolní varianta vykazovala neobvyklé hodnoty v součtu amonných iontů s aminokyselinami. Toto bylo způsobeno nízkým obsahem aminokyselin v moštu (viz Graf č.11). Obsah dusíku Varianta 0 AM N mg/l
FAN mg/l
140
Obsah dusíku (mg/l)
120 100 80 60 40 20
16 2 , 19 5 , 21 5 , 23 5 ,5 25 27 , 29 5 , 40 5 , 43 5 ,5 46 5 52 0 ,5 55 6 67 5 ,5 72 74 , 76 5 , 91 5 ,5 98 1 11 01 6 12 ,5 0 12 ,5 3, 5 13 7 14 11 4 48
0
Doba fermentace (h)
Graf 11: Obsah AM, FAN, VO
6.4. Porovnání spotřeb dusíku V sekci 1.3. jsou výsledky porovnávány z hlediska spotřeby dusíku.(Graf č. 12) Graf č. porovnává spotřebované množství asimilovatelného dusíku, amonných iontů a aminokyselin. U kontrolní Varianty 0 se v případě aminokyselin projevila autolýza kvasinek na konci fermentace, proto zde graf dosahuje záporných hodnot (Cataldi a kol, 2003). Při porovnání spotřeb z hlediska velikosti přídavku výživy vidíme, že nejvyšší spotřebu asimilovatelného dusíku měla varianta, s nízkou dávkou Zimovitu. Nejnižší měla kontrolní varianta. U amonných iontů nejnižší spotřebu měla opět kontrolní varianta. Nejvyšší Varianta 3B. Vyšší spotřebu měly varianty s vysokou dávkou přidané výživy, ať už na začátku fermentace či ve dvou dávkách. Potvrzuje to fakt (Steidl, 2002), že čím více mají kvasinky amonných iontů v prostředí, tím více je spotřebovávají. - 34 -
Nejvyšší spotřeba aminokyselin byla u Varianty 3B. Porovnání spotřeb z hlediska druhu výživy ukazuje, že vyšší spotřebu dusíku měly varianty s přidaným Nutrizimem. Toto neplatí pro asimilovatelný dusík u Varianty 1, jehož spotřeba je nejvyšší ze všech variant. U spotřeby aminokyselin se ukázalo, že přídavek výživy s autolyzáty kvasinek vedl k jejich vyšší spotřebě něž u variant bez autolyzátů.
Spotřeba dusíku YAN
AM
FAN
300,00 237,75
250,00
185,62
Spotřeba dusíku (mg/l)
200,00 154,47
127,37
128,99
150,00 124,11
213,79
209,66
181,34
196,93
100,02
95,96
85,07
100,00 59,33
60,94
78,27
63,71
54,72
146,82
59,75
50,00 0,00 0 -50,00
2
2A
2B
-82,42
-100,00 Varianta
Graf 12: Spotřeba dusíku
- 35 -
3
3A
3B
6.5. Senzorická analýza Senzorická analýza vzorků proběhla ve dvou termínech. (Graf č. 13) V celkovém hodnocení v drtivé většině případů dopadla lépe druhé senzorické hodnocení. (viz Přílohy) Vyšší bodové ohodnocení získaly varianty s vyšším obsahem přidané výživy, a to i v rámci jednotlivých druhů výživ. Překvapivě dobře hodnocená byla varianta 0. Obdobné tomu bylo i u prvních senzorik. Výjimkou byla varianta s komplexní výživou, Varianta 2B, která v prvním hodnocení byla téměř vždy nejméně hodnocená. Hodnotitelé shodně označovaly ve variantě s přídavkem Zimovitu křídové tóny, a varianty s přidaným Nutrizimem jako aromatičtější a plnější. Ferreira a kol. (2000) uvádějí, že přítomné aminokyselin mohou mít vliv na aromaticitu vín.
Body celkem 4.12.2013
28.2.2014
88 86,00
85,56
86
85,89
85,44 84,875
85,67
84,125
Body
84 82
82,89 81,375
82,625
81,625 81,56 80
80
78,75
78 76 74 0
2
2A
2B Varianta
Graf 13: Senzorická analýza, body celkem
- 36 -
3
3A
3B
7 ZÁVĚR Problematika dusíku v půdě, hroznech, moštech i následném víně je rozsáhlá. Každým rokem přibývá množství prací a poznatků o tomto výživovém prvku. S tím roste i počet nových agrotechnických a technologických postupů a preparátů na zvýšení obsahu dusíku a jeho efektivní využití, ať již révou vinnou či kvasinkami. Asimilovatelný dusík je považován za iniciátora fermentace, ovlivňuje její kinetiku, obsah aromatických látek, kyseliny octové a dalších. S postupným oteplováním planety Země se stává důležitým parametrem, neboť je v hroznech ovlivňován teplotou. Jak získává na důležitosti, objevují se i nové komerční preparáty, které zvyšují obsah asimilovatelného dusíku v moštu a tím ovlivňují fermentaci a finální víno. Tato práce sledovala obsah asimilovatelného dusíku v průběhu fermentace, jeho využití kvasinkami. Byl měřen jak obsah asimilovatelného dusíku, tak i aminokyseliny a amonné ionty. Srovnání těchto dvou metod měření ukázalo, že míra návratnosti formaldehydové titrace vůči enzymatickému spektrofotometru byla 62 %. Prokázala se pozitivní korelace 0,79 mezi asimilovatelným dusíkem a součtem amonných iontů s aminokyselinami. V měřeních se projevil počáteční přídavek výživy bez ohledu na druh přidané výživy či jeho množství, ovšem druhý se již neprojevil, pravděpodobně kvůli vysokému obsahu alkoholu v moštu. U obou druhů výživ i ve všech načasováních přídavku byly více odebírány amonné ionty než aminokyseliny a zároveň se potvrdilo, že čím více výživy se kvasinkám přidalo, tím více jej asimilovaly. Z prvního senzorického hodnocení vyšel lépe přípravek Zimovit, tedy přípravek obsahující větší množství amonných iontů. Ovšem při druhém hodnocení se rozdíl mezi Zimovitem a Nutrizimem, jako komplexní výživou, smazal. Mošty obohacené Zimovitem při první degustaci dopadly lépe, ovšem
při druhém hodnocení se potvrdilo, že
aminokyseliny jsou prekurzory aromatických látek, neboť tyto byly hodnocené lépe.
- 37 -
8 DOPORUČNÍ PRO PRAXI Problematika asimilovatelného dusíku se dotýká především teplejších vinařských oblastí. Česká republika patří do chladnějšího klimatu a povětšinou nemá problémy s jeho obsahem. Mohou ovšem nastat výjimky, jako je nepřístupnost dusíku v půdě a tím i v hroznech nebo teplejší ročníky, kdy se i u nás setkáme s nedostatkem dusíku. Z důvodu už jen zjištění jeho dostatku či nedostatku by bylo rozumné, pro střední či velké vinařské podniky, zavést formaldehydovou titraci do rutinních měření. Formaldehydová titrace je rychlá, levná a spolehlivá. Záleží na každém vinaři a vinařství, jaké finální víno chce mít. Pro účely rychlé iniciace fermentace, je dobré použít výživu s vyšším obsahem amonných iontů. Toto může vést k rychlé fermentaci, ovšem může se to odrazit na výsledné chuti vína. Ke zvýšení aromatičnosti vín, může vést přídavek komplexní výživy, s obsahem amonných iontů, těl kvasinek a thiaminu. Při přidávání výživy by mělo platit pravidlo lehké ruky – nesypat výživu bezhlavě a za každou cenu.
- 38 -
9 SOUHRN Sledování změn asimilovatelného dusíku během alkoholové fermentace moštů révy vinné Tato diplomová práce se zabývala sledováním změn asimilovatelného dusíku během alkoholové fermentace moštů révy vinné. V literární části byla popsána role dusíku v révě vinné, jeho geneze v hroznech a problematika asimilovatelného dusíku. V experimentální části byl proveden pokus, při kterém z odrůdy Sauvignon bylo vyrobeno celkem 6 druhů vín s přídavkem dvou komerčně dostupných výživ. Množství výživy a načasování jejího přidání se lišilo v jednotlivých variantách. Byla vyrobena i jedna kontrolní varianta bez přídavku výživy. Během fermentace moštů byly odebírány vzorky, které se následně analyzovaly. Obsah asimilovatelného dusíku, pH a titrovatelné kyseliny byly měřeny formaldehydovou titrací. Amonné ionty a aminokyseliny byly stanovovány spektrofotometricky. Poslední bylo senzorické zhodnocení vín. Tyto výsledky byly hodnoceny statisticky a zkoumala se korelace mezi asimilovatelným dusíkem a amonnými ionty a aminokyselinami. Dále vliv velikosti přídavku a druhu výživy na spotřebované množství dusíku a jejich senzorické vnímání. Na závěr porovnala metodu formaldehydové titrace s enzymatickým stanovením spektrofotometrem. Klíčová slova: asimilovatelný dusík, přídavek, výživa
- 39 -
10 RESUME Observation of changes of yeast assimilable nitrogen during alcoholic fermentation of grape musts This thesis dealt with the monitoring of changes of yeast assimilable nitrogen during alcoholic fermentation of musts of grapes. The literary review described the role of nitrogen in grape musts, its genesis in the grapes and the issue of yeast assimilable nitrogen. In the experimental parf, an experiment was conducted where it was made 6 wines from Sauvignon variety with addition of two commercially available nutrition. The amount of nutrition and timing of its inclusion differed in different variants. A control sample withou added nutrition was also made. During fermentation of musts the samples were taken and analyzed. The content of yast assimilable nitrogen, pH and titratable acids were measured by formmol titration. Ammonium and amino acids were determined by spectrophotometry. The last was the sensory evaluation of wines. These results were statistically evaluated and examined the correlation between the yeast assimilable nitrogen and ammonium ions and amino acids. Furthermore, the influence of the size of the addition and the type of diet consumed by the amount of nitrogen and sensory perception. Finally, the formmol titration and method of enzymatic determination of spectrophotometer were compared. Keywords: yeast assimilable nitrogen, addition, nutrition
- 40 -
11 SEZNAM TABULEK tabulka 1: Aminokyseliny v moštu ...................................................................................... 12 tabulka 2: Design pokusu .................................................................................................... 19 tabulka 3: Druh, velikost a načasování přídavku výživy ..................................................... 22 tabulka 6: Analytické hodnoty moštu .................................................................................. 27
12 SEZNAM GRAFŮ Graf 1: Korelace YAN a AM+FAN .................................................................................... 28 Graf 2: Korelace YAN a AM+FAN, VO ............................................................................ 28 Graf 3: Korelace YAN a AM+FAN; V1-V2B .................................................................... 29 Graf 4: Obsah dusíku, VO ................................................................................................... 30 Graf 5: Obsah dusíku, V1 .................................................................................................... 30 Graf 6: Obsah dusíku, V 1A ................................................................................................ 31 Graf 7: Obsah dusíku, V1B ................................................................................................. 31 Graf 8: Obsah dusíku, V2 .................................................................................................... 32 Graf 9: Obsah dusíku, V2A ................................................................................................. 32 Graf 11: Obsah AM, FAN, VO ........................................................................................... 34 Graf 12: Spotřeba dusíku ..................................................................................................... 35 Graf 13: Senzorická analýza, body celkem ......................................................................... 36
- 41 -
13 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BALÍK, J. Vinařství: návody do laboratorních cvičení. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2006, ISBN: 8071579335, 9788071579335,
BAROŇ, Mojmír. Asimilovatelný dusík v moštech révy vinné aneb sypat či nesypat... Vinařský obzor: Odborný časopis pro vinohradnictví, sklepní hodpodářství a obchod vínem /. Velké Bílovice: Svaz vinařů České republik, 2009, 102 (2009), č. 12, s. 2. ISSN 1212-7884. BAROŇ, Mojmír. Vliv asimilovatelného dusíku na průběh fermentace moštů révy vinné. Lednice, 2010. Disertační práce. Mendelova univerzita v Brně. Vedoucí práce Marie Kyseláková. BAROŇ, Mojmír. Yeast Assimilable nitrogen is South Moravian Grape Musts and its Effect on Acetic Acid Production during Fermentation. Czech Journal Food Science. 2011, č. 6, s. 603-609. BARRE, P., BLONDIN, B., DEQUIN, S., FEUILLAT, M., SABLAYROLLES, J.M., & SALMON, J.M. (1998). La levure de fermentation alcoolique. In C. Flanzy (Ed.), Oenologie: fondements scientifiques et technologiques (pp. 454–497). Paris: Tec Doc Lavoisier BELTRÁN,, G., ESTERE-ZARZOSO, B., ROZÉS, N., MAS, A., GUILLAMÓN, J. M. (2005). Influence of Tininy of nitrogen additions dutiny synthetic grape must fermentations on fermentation kinetice and nitrogen consumption. J. Agric. Food Chem, 53, 996-1002. BELY, M., RINALDI, A., DUBOURDIEU, D., (2003). Influence of assimilable nitrogen on volatile acidity production by Saccharomyces cerevisiae during hight Sugar Fermentation. J. Biosci Bioeng. 96(6), 507 – 512 str.
BELY M., SABLAYROLLES J.M. A BARRE P. (1990) J. Ferment.Bioeng., 70, 246.
BISSON, L.F. (1999) Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Vitic., 50, 107–119. BLOUIN J, CRUÈGE J Analyse et Composition des Vins: Comprendre le Vin, Editions La Vigne, Dunod, Paris, France, 2003, 304 pp BOULTON, R.B., SINGLETON, V.L., BISSON, L.F., & KUNKEE, R.E. (1996). Yeast and biochemistry of ethanol fermentation. In R.B. Boulton (Ed.), Principles and Practices of Winemaking (pp. 139–172). New York: Chapman & Hall. BRISSONNET F, MAUJEAN A Characterization of foaming proteins in a champagne base wine. American Journal of Enology and Viticulture, 1993, 44, 297-307
- 42 -
CATALDI TRI, NARDIELLO D Determination of free proline and monosaccharides, 2003. COULON, J., HUSNIK, J. I., INGLIS, D. L., VAN DER MERWE, G. K., LONVAUD, A., ERASMUS, D. J., VAN VUUREN, H. J. J., (2006). Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae to Minimize the Production of Ethyl Carbamate in Wine. Am. J. Enol. Vitic., June 1, 57(2): 113 – 124. DARTIGUENAVE C., JEANDET P., MAUJEAN A. Changes in the buffering capacity of model solutions of 40 mM tartaric or malic acids in relation to amino acids. Am. J. Enol. Vitic. 200, 51, 347-351. DESPORTES C, CHARPENTIER M, DUTEURTRE B, MAUJEAN A, DUCHIRON F Isolation, identification, and organoleptic characterization of low-molecularweight peptides from white wine. American Journal of Enology and Viticulture, 2001, 52, 376380 DUBOIS E. AND GRENSON M., 1979, Molecular and general genetics, 175, 67–76. FERREIRA RB, PIÇARRA-PEREIRA MA, MONTEIRO S, LOUREIRO VB, TEIXEIRA AR The wine proteins. Trends in Food Science and Technology, 2002, 12, 230-239 FERREIRA V, LOPEZ R, CACHO JF Quantitative determination of the odorants HENSCHK, P.A.,JIRANEK V. (1992) In Wine Microbiology and Biotechnology (ed. G.H.Fleet). Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland. Pp. 77-169. HENSCHKE, P.A., & JIRANEK, V. (1993) Yeast – metabolism of nitrogen compounds. In G.H. Fleet (Ed.), Wine Microbiology and Biotechnology (pp. 77–164). Reading: Hrawood Academic. HLUŠEK, Jaroslav, Rostislav RICHTER a Pavel RYANT. Výživa a hnojení zahradních plodin. Vyd. 1. Praha: [Martin Sedláček], 2002, 81 s. ISBN 80-902-4135-2. in wine samples by high-performance anion-exchange chromatographywith pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51, 3737-3742. KUNKEE, R.E. (1991). Relationship between nitrogen content of must and sluggish fermentation. In Proceedings of the International Symposium of Nitrogen in Grapes and Wine, 18–19 de Juny de 1991, Seattle, Washington (pp. 148–155). Davis CA: American Society of Enology and Viticulture. LONVAUD-FUNEL A Biogenic amines in wines: Role of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 2001,199, 9-13 LORENCOVÁ, Eva. Aminokyseliny produková mikroorganizmy a možnosti jejich stanovení. Zlín, 2008. Dostupné z: http://dspace.k.utb.cz/bitstream/handle/10563/6847/lorencov%C3%A1_2008_bp.pdf?sequ
- 43 -
ence=1. Bakalářská práce. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně. Vedoucí práce Leona Buňková. MANGINOT, C., ROUSTAN, J.L., & SABLAYROLLES, J.M. (1998) Nitrogen demand of different yeast strains during alcoholic fermentation. Importance of stationary phase. Enz. Micro. Technol., 23, 511–51 MAŤAS, J., (2012). Výživa kvasiniek v priebehu fermentácie muštu vinnej révy. Bakalářská práce. Lednice 2012. Mendelova Univerzita v Brně, Zahradnická fakulta, Ústav vinohradnictví a vinařství. Vedoucí práce Mojmír Baroň. MORENO-ARRIBAS, M a M POLO. Wine chemistry and biochemistry. New York: Springer, c2009, xv, 735 p. ISBN 9780387741185 OUGH, C. S., (1991). Winemaking basics. 1. title New York: Binghamton. 663 st. ISBN 1 – 56022 – 006 – 6. PAVLOUŠEK, Pavel. Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví. Praha: Grada, c2011, 333 s. ISBN 978-80-247-3314-2. RIBÉREAU-GAYON, Pascal, Denis DUBOURDIEU a Bernard DONÈCHE. Handbook of enology. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, c2006-, 2 v. ISBN 04-700-1037-1. RIBÉREAU-GAYON, Pascal, Denis DUBOURDIEU a Bernard DONÈCHE. Handbook of enology. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley, c2006-, 2 v. ISBN 04-700-1037-1. SILLAS-SANTOS MH Biogenic amines: Their importance in foods. International Journal of Food Mikrobiology, 1996, 29, 213-231 RICHTER, R. Multimediální učební texty z výživy rostlín, [online]. Aktualizace 2006[cit. 15.4.2014] Dostupné z: http://web2.mendelu.cz/af_221_multitext/vyziva_rostlin/index.htm
SOMERS TC, ZIEMELIS G Direct determination of wine proteins. American Journal of Enology and Viticulture, 1973, 24, 47-50 SOTOLÁŘ Radek. Multimediální atlas podnožových, moštových a stolních odrůd révy. Dostupný z WWW: http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_reva/atlas_reva.pdf STEIDL, R., (2002). Sklepní hospodářství. Valtice: Radix, spol. s.r.o, ISBN 80 – 903201 – 0–4 TAYLOR, W.H. (1957) Formol Titration: An evaluation of its various modifications. Analyst, 82, 488–498. TORIJA MJ, BELTRAN G, NOVO M, POBLET M, ROZES N, MAS A, GUILLAMON JM Effect of organic acids and nitrogen source on alcoholic fermentation: Study of their buffering capacity. Journal of Agricultural and Food Chemistry ,2003, 51, 916-922 WANG, Haiyan, Fenglan ZHANG, Jin CAO, Qingsheng ZHANG a Zhirong CHEN. Comparison of Chromatographic and Titrimetric Methods for the Determination of the - 44 -
amino Nitrogen in Standrard Solution and Fish Protein Hydrolysates. Journal of Food Research. Bratislava: VÚP Food Research Institute, 2012, č. 4. Dostupné z: URL: http://dx.doi.org/10.5539/jfr.v1n4p174
- 45 -
