Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav výživy zvířat a pícninářství

Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat Diplomová práce

Vedoucí práce: Mgr. Ing. Eva Mrkvicová, Ph.D.

Vypracovala: Bc. Helena Kovaříková

Brno 2015

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem práci: Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb. o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:………………………..

…………………………………………………….. podpis

ZADÁNÍ

PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucí své bakalářské práce Mgr. Ing. Evě Mrkvicové, Ph.D. za její odborné vedení, cenné rady a připomínky. Poděkování patří též mému konzultantovi MVDr. Ing. Václavu Trojanovi a Ing. Tomáši Vyhnánkovi, Ph.D. za spolupráci při výzkumné části práce. Tato diplomová práce vznikla na základě řešení projektu TP IGA MENDELU v Brně 1/2014.

ABSTRAKT Sledování transferu genetické informace z krmiva u modelových zvířat Cílem této práce je zjistit možnost přenosu genetické informace z krmiva vyrobeného z pšenice s netradičním zbarvením obilky a pšenice s běžným zbarvením do krve pokusných potkanů. Z celkového počtu 64 potkanů bylo 32 krmeno pšenicí odrůdy Konini s purpurovým perikarpem a tvořilo pokusnou skupinu. Zbylých 32 potkanů, krmených pšenicí se standardním zbarvením odrůdy Bohemia, představovalo kontrolní skupinu. Z pokusných zvířat byl odebrán vzorek krve. U 12 vzorků (6 vzorků z každé skupiny) byla izolována DNA. Detekce rostlinné DNA ve vzorcích DNA potkana byla provedena pomocí PCR s použitím primerů amplifikujících fragmenty provozních genů specifických pro DNA pšenice (pšeničné geny Gapdh a Actin). Pomocí PCR nebyly detekovány fragmenty DNA pšenice v krvi žádného potkana. Naše výsledná data nepotvrdila, že by docházelo k přenosu genetické informace krmiva prostřednictvím trávicího traktu do krve zkoumaných zvířat. Klíčová slova: barevná pšenice Konini, cizorodá DNA, PCR, potkani, krev

ABSTRACT The Monitoring of gene transfer from feed to model organisms The aim of this thesis is to observe the possibility of transfer of genetic information from feed, made of wheat with unusual grain colour and wheat with standard grain colour, into the blood of rat test subjects. Out of 64 rats that were tested, 32 were fed with purple grain (Konini variety) and formed the test group. A further 32 rats represented the study’s control group and were fed with standard coloured wheat (Bohemia variety). The blood sample was acquired from the test animals. From 12 samples (6 samples from each group) DNA was isolated. Plant DNA was detected in the samples of DNA of rats by PCR using primers amplifying fragments of housekeeping genes specific for DNA of wheat (wheat genes Gapdh and Actin). No DNA fragments of wheat were detected in the blood of the rats. The results show, that there is no transfer of genetic information from the feed through the gastrointestinal tract to the blood of the animal. Key words: coloured Konini wheat, foreign DNA, PCR, rats, blood

OBSAH 1

ÚVOD ................................................................................................................ 8

2

LITERÁRNÍ PŘEHLED .................................................................................... 9 2.1

Využití pšenice ........................................................................................... 9

2.1.1 2.2

Látkové složení pšeničného zrna ....................................................... 10

Typy barevné pšenice ............................................................................... 11

2.2.1

Červená pšenice ................................................................................. 12

2.2.2

Purpurová pšenice ............................................................................. 13

2.2.3

Další netradiční zbarvení pšenice ...................................................... 16

2.3

Laboratorní potkan .................................................................................... 17

2.3.1 2.4

Výživa laboratorních potkanů ........................................................... 18

Transgenní DNA v krmivu a její transfer do organismu .......................... 21

2.4.1

Krmné studie na potkanech ............................................................... 21

2.4.2

Krmné studie na brojlerech ............................................................... 22

2.4.3

Krmné studie na snášejících slepicích a křepelkách.......................... 23

2.4.4

Krmné studie na mléčném skotu ....................................................... 24

2.4.5

Krmné studie na ostatních živočiších ................................................ 24

3

CÍLE PRÁCE ................................................................................................... 28

4

MATERIÁL A METODIKA ........................................................................... 29 4.1

Pokus na potkanech .................................................................................. 29

4.1.1

Krmné směsi ...................................................................................... 29

4.2

Izolace živočišné DNA z krve .................................................................. 30

4.3

Izolace rostlinné DNA z krmiva ............................................................... 32

4.4

Postup PCR ............................................................................................... 32

4.4.1

Použité primery ................................................................................. 32

4.4.2

Příprava a provedení reakce .............................................................. 34

4.5

Gelová elektroforéza ................................................................................. 36

VÝSLEDKY A DISKUSE .............................................................................. 37

5

5.1

Izolace DNA ............................................................................................. 37

5.1.1 5.2

Problémy při izolaci DNA ................................................................. 38

PCR a její vizualizace ............................................................................... 39

5.2.1

Optimalizace pro specifické primery DNA potkanů ......................... 39

5.2.2

Optimalizace pro specifické primery DNA pšenice .......................... 42

5.2.3

Detekce DNA potkanů v izolátu z krve ............................................. 45

5.2.4

Detekce DNA z krmiva v DNA potkanů ........................................... 47

6

ZÁVĚR ............................................................................................................ 51

7

POUŽITÁ LITERATURA............................................................................... 53

8

SEZNAM OBRÁZKŮ ..................................................................................... 61

9

SEZNAM TABULEK ...................................................................................... 62

10

SEZNAM ZKRATEK ...................................................................................... 63

1

ÚVOD

Pšenice setá (Triticum aestivum L.) je jednou z nejdůležitějších a nejrozšířenějších plodin nejen v potravinářském průmyslu, ale i v krmivářství. Její jednotlivé odrůdy s mezi sebou liší nejen obsahem látek významných pro technologické zpracování, ale i zastoupením barviv přítomných v obilce, která způsobují netradiční zbarvení zrn. Purpurová barva pšenice Konini je způsobena zvýšeným množství barviv anthokyanů v perikarpu obilného zrna, jež chrání rostlinu před působením vnějších vlivů a navíc mají pozitivní účinky na zdraví konzumentů. Jejich nejvýznamnějším pozitivem pro člověka je jejich schopnost „vychytávat“ volné radikály (ROS) a tím chránit organismus vůči oxidativnímu stresu. Laboratorní potkan (Rattus norvegicus) patří mezi nejvýznamnější modelové organismy v laboratorní praxi. Potkani jsou často využíváni pro krmné studie nebo pro pokusné studie v biomedicínských oborech. K tomuto účelu je předurčuje jejich klidná povaha, malá velikost těla, krátký generační interval, nenáročnost na podmínky chovu, přizpůsobivost podávanému krmivu a relativně podobný genotyp s člověkem. Používání potkanů v laboratořích má dlouhou historii, proto jsou tato zvířata z fyziologického

hlediska

dobře

prozkoumána,

jejich

požadavky

na

výživu

jsou zdokumentovány a jejich genom byl jeden z prvních zmapovaných savčích genomů. Chov potkanů je také méně finančně a prostorově náročný než chov prasat nebo dalších zvířat používaných pro pokusné účely. Cílem této práce je shromáždit data z prací autorských skupin, jež provedly krmné studie zabývající se transferem rostlinné DNA z krmné dávky do krve a dalších tkání potkanů i jiných zvířat. Následně podrobit vybranou skupinu potkanů krmnému experimentu s pšenicí, která má netradičně zbarvenou obilku. Po ukončení krmného experimentu odebrat vzorky krve pokusných zvířat a vzorky krmiva, ze kterých se pomocí komerčních izolačních kitů získá DNA. Posledním krokem práce je prokázání nebo vyvrácení teorie, že rostlinná DNA z krmiva může přecházet do DNA živočichů, což bude provedeno pomocí polymerázové řetězové reakce amplifikující specifické fragmenty pšeničné DNA. Nakonec by měly být porovnány výsledky studií autorů zabývajících se podobným tématem s výsledky získanými během laboratorních analýz v rámci této práce.

8

2

LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1 Využití pšenice Pšenice setá (Triticum aestivum L.) je nejen nejvíce pěstovanou obilninou, ale i plodinou jak v České republice, tak v celosvětovém měřítku. Největší podíl pšenice, která je v tuzemsku vyprodukována se používá ke krmivářským účelům. Menší podíl vypěstované pšenice je využit v potravinářském průmyslu. Jednotlivé odrůdy pěstované v ČR jsou rozdělovány do těchto kategorií podle způsobu využití: 

Pšenice pro pekárenské využití



Pšenice pečivárenské (pro výrobu sušenek a oplatků)



Pšenice pro speciální použití (výroba škrobu a lihu)



Pšenice pro výrobu těstovin



Krmné pšenice

Odrůdy pšenice, jež jsou využívány v potravinářském průmyslu, musí splňovat odlišná kritéria jakosti než ty, které jsou vhodné pro krmivářské účely. Nejdůležitějším kritériem je složení zásobních bílkovin endospermu, především tzv. lepkových bílkovin. Pšenice vhodná pro pekárenské zpracování se dle jakosti rozděluje do těchto tříd: 

Elitní pšenice E



Kvalitní pšenice A



Chlebová pšenice B



Nevhodné pšenice C (tyto odrůdy jsou nevhodné pro výrobu kynutých těst, proto jsou často používány pro krmivářské účely)

Prolaminové bílkoviny nacházející se v endospermu jsou schopné tvořit hydratovaný bílkovinný komplex, jež nazýváme lepek. Lepek

je přítomen

v endospermu zrna a slouží jako zdroj dusíku, síry a uhlíku během klíčení semen (Sharma & Rallabhandi, 2015). Lepek umožnuje svými dvěma nejdůležitějšími vlastnostmi, tažností a pružností (různým poměrem elasticity a tažnosti těsta), výrobu těst a pečivárenských výrobků. Naproti tomu pšenice pro krmivářské účely by měla obsahovat nižší podíl bílkovin tvořících lepek, především málo rozpustných frakcí 9

prolaminů a gluteninů, které stojí za nižší využitelností krmiva u nepřežvýkavých zvířat, a měla by obsahovat jiné složení aminokyselin (Zimolka, 2005). Neškrobové polysacharidy (NSP) jsou součástí vlákniny žádané v lidské výživě. Vláknina se u lidí podílí na snižování hladiny cholesterolu, ochraně před vznikem rakoviny tlustého střeva a na prevenci obezity, zácpy a cukrovky. Naopak u zvířat NSP snižují využitelnost živin. Nejvýznamnější NSP jsou z tohoto pohledu β-glukany a arabinoxylany. Pšenice (oproti ječmenu, ovsu a žitu) obsahuje těchto nežádoucích látek menší množství (Zeman, 2006). Obiloviny, do kterých patří pšenice, mají ve výživě zvířat důležitou úlohu jako nositelé velké části dusíkatých látek rostlinného původu a jsou nezastupitelným zdrojem energie ve formě škrobu. Obiloviny jsou řazeny mezi sacharidová (glycidová) krmiva. Pšenice má v porovnání s ostatními obilninám více dusíkatých látek (NL) a to průměrně 12,5 %. Je dobrým zdrojem kyseliny glutamové a prolinu, limitující aminokyselinou je lysin (Prugar & kolektiv, 2008). Pšenice je vhodná pro krmení všech druhů zvířat v poměrně vysokém poměru v krmné dávce (Zeman, 2006).

2.1.1

Látkové složení pšeničného zrna

Sacharidy jsou nejdůležitější látkou tvořící pšeničné zrno. Do této kategorie zahrnujeme polysacharidy (škrob, celulóza, hemicelulózy, pentozany a slizy), dále jsou přítomny oligosacharidy i monosacharidy. Obsah škrobu v zrnu, který je složený z amylózy a amylopektinu, je variabilní mezi 50–70 % a je závislý na odrůdě a způsobu pěstování. Škrob a tvorba škrobového matu má významnou úlohu v pekárenském průmyslu (Prugar & kolektiv, 2008). Nejdůležitějšími látkami ovlivňujícími technologickou, nutriční a krmnou hodnotu pšenice jsou bílkoviny, které jsou zastoupeny v množství 12–13 % v sušině. Nejvýznamněji jsou zastoupeny tyto esenciální aminokyseliny: lysin, valin, leucin a fenylalanin. Vyšší obsah bílkovin je v aleuronové vrstvě a klíčku pšeničného zrna. Podíl lepkových bílkovin tvořících tažný a elastický hydratovaný gel je asi 80 % z veškerých bílkovin. V souvislosti s obsahem bílkovin lepku se u lidí setkáváme s o onemocněním celikakií. Celiakie je nemoc spojená s trávení bílkovin obsažených v pšeničných zrnech. Vyskytuje se poměrně často v evropské populaci a to asi u 1 ze 100 jedinců. Je způsobena neschopností trávit bílkovinu gliadin nacházející 10

se v pšenici. Postiženým chybí ve střevech enzym peptidáza, který tak není schopen štěpit peptidy vznikající na začátku trávení gliadinu. Peptidy se hromadí v gastrointestinálním

traktu

(GIT)

a

způsobují

onemocnění.

Jedinci

trpící

touto chorobou jsou odsouzeni k celoživotní bezlepkové dietě (Woodward, 2011). Minerální látky jsou zastoupeny v rozsahu 1,4–3,0 % a jejich podíl je ovlivněn nejen zvolenou odrůdou, ale hlavně obsahem živin (minerálních látek) v půdě a podmínkami během vegetace. V největší míře jsou přítomny esenciální minerální látky fosfor, draslík, síra, hořčík, vápník a sodík (Cornell & Hoveling, 1998). Minerální látky jsou soustředěny v klíčku a obalových částech zrna. Vitamíny přítomné v pšenici jsou důležité nejen pro potravinářství, ale taktéž pro výživu zvířat. Nejvíce zastoupené jsou niacin, pyridoxin, kyselina pantotenová, tiamin a riboflavin. Tyto látky jsou nejvíce zastoupeny v klíčku nebo aleuronové vrstvě zrna. Stejně jako na minerální látky, tak i na vitamíny jsou bohatší celozrnné výrobky, jelikož se tyto látky nacházejí především ve vnějších vrstvách obilky. Pšeničné zrno obsahuje asi 1,5–3,0 % lipidů složených především z kyseliny linolové a olejové a také fosfatidy, které obsahují dusíkatou bázi a kyselinu fosforečnou (cholin a lecitin). Lipidy se převáženě nalézají v klíčkové části zrna. Obsah lipidů je důležitý z hlediska skladování zrn a produktů, při oxidačních změnách může docházet ke žluknutí vzorku (Prugar & kolektiv, 2008).

2.2 Typy barevné pšenice Většina současných odrůd pšenice má obilku červené nebo žluté barvy. Barva obilky pšenice je ovlivněna zastoupením barevných pigmentů jako jsou karotenoidy, flavonoidy, anthokyany a fenolické látky. Barevné pigmenty jsou charakteristické svými antioxidačnímu vlastnostmi, které pozitivně ovlivňují zdraví konzumentů, díky navázání volných radikálů a tím bojují proti oxidativnímu stresu (Grotewold, 2006). Pomocí šlechtění je možné zvýšit genetický potenciál tvorby barevných pigmentů ve známých odrůdách pšenice a využít tak jejich antioxidační vlastnosti ve větším měřítku nejen pro výživu zvířat, ale zejména lidí (Martinek et al., 2013). Konzumace obilovin obsahujících barevné látky podobných těm, které se nacházejí v ovoci a zelenině, jsou spojovány se snížením rizika výskytu kardiovaskulárních

11

onemocnění, rakoviny, diabetu II. typu a obezity. Pšenice je plodinou, která je výrazně zastoupena ve stravě zvířat a lidí, tudíž potenciál využití antioxidačních látek v obilkách je vysoký (Guo & Beta, 2013).

2.2.1

Červená pšenice

Červené zbarvení zrna pšenice je řízeno dominantními geny R-1, které se nacházejí na dlouhém raménku chromozomů 3A, 3B, a 3D (geny R-A1, R-B1 a R-D1). Červená barva obilek pšenice je způsobena látkami polyfenolické povahy, jimiž jsou anthokyany flobafen a proanthokyanidin, což jsou deriváty katechinu a taninu. Tyto polyfenoly jsou syntetizovány pomocí biosyntetické dráhy flavonoidů (Himi et al., 2005). Zastoupené

flavonoidy

nejen

že

způsobují

pigmentaci

rostlinných

orgánů,

ale jsou schopné rostlinu chránit proti UV záření, patogenům, chorobám a nepříznivým vnějším vlivům jako je sucho nebo zvýšená salinita půdy (Ma et al., 2014). Flobafeny jsou výsledky polymerizace flavan-4-olů, které jsou syntetizované třemi enzymy chalkonsyntáza (CHS), chalkonizomeráza (CHI) a dihydroflavonol 4-reduktáza (DFR). Proanthokyanidin je vytvořen pomocí 3,4-deoxy flavonoidů, které jsou syntetizovány za pomocí čtyř enzymů CHS, CHI, flavono 3-hydroxyláza (F3H) a DFR (Obrázek 1). Aby došlo k aktivaci biosyntetických drah flavonoidů, musí dojít k aktivaci odpovědných genů. R-1 geny byly zařazeny do skupiny transkripčních faktorů typu MYB (obsahují doménu MYB) (Himi et al., 2011). Bílá barva obilek je způsobena recesivními alelami genu R-1, konkrétně jsou to alely r-A1, r-B1 a r-D1 (Himi & Noda, 2005). Bílá pšenice a její produkty mají výrazně menší podíl látek s antioxidačním účinkem než barevné odrůdy (Martinek et al., 2011) a liší se taktéž zastoupením jednotlivých fenolických látek (Challacombe et al., 2012).

12

Obrázek 1

Biosyntetická dráha flavonoidů (Himi et al., 2011; upraveno).

Názvy enzymů jsou zkráceny na: ANS) anthokyadininsyntáza, CHI) chalkonizomeráza, CHS) chalkonsyntáza, DFR) dyhydroflavonol 4-reduktáza, F3H) flavono 3-hydroxyláza, FS) flavon syntáza.

2.2.2

Purpurová pšenice

Purpurová barva zrna je způsobena obsahem anthokyanů v perikarpu (povrchová vrstva) obilek (Obrázek 2). Nejvíce zastoupenými anthokyany v perikarpu obilek jsou kyanidin-3-glukosid a peonidin-3-glukosid (Hu et al. 2007). Nejdůležitějším enzymem při syntéze kyanidin-3-glukosidu je chalkonsyntáza (CHS), jehož tvorba je řízena genem CHS (Trojan et al., 2014).

13

Obrázek 2

Podélný řez obilkou pšenice (Trojan et al., 2014).

Popis obrázku: A) endosperm, B) perikarp (barviva pro purpurové zbarvení), C) osemení, D) Aleuronová vrstva (barviva pro modré zbarvení), E) zárodek.

Biosyntéza anthokyanů v perikarpu je řízena dvěma dominantními geny Pp. Gen Pp1 se nachází na chromozomu 7B. Gen Pp3, tento je tvořen dvěma alelami Pp3a a Pp3b, které se nacházejí v centromerické oblasti chromozomu 2A. Geny Pp1 a Pp3 mají komplementární účinek a na jejich expresi působí vnější podmínky (Knievel et al., 2009). Shoeva et al. (2014) dává do souvislosti s produkcí anthokyanů v perikarpu obilek gen TaMyc1, který řídí transkripční faktor MYC a nachází se taktéž na chromozomu 2A. Analýza kombinací alel genu Pp1 a Pp3 a jejich vlivu na expresi genu TaMyc1 ukázala, že dominantní alela Pp-D1 potlačila transkripci genu TaMyc1 (Obrázek 3).

14

Obrázek 3

Transkripce genu TaMyc1 v perikarpu pšenice kombinacemi alel Pp (Shoeva et al., 2014; upraveno).

s různými

Anthokyany nacházející se v purpurové pšenici mají potenciální zdraví prospěšné účinky pro konzumenty. Pokud jsou rostliny pšenice vystaveny teplotnímu stresu, produkce kyanidin-3-glukosid se zvyšuje, což potvrzuje jeho antioxidační aktivitu (Hosseinian et al., 2008). Produkty z purpurové pšenice mají vyšší hodnoty antioxidační aktivity (AA), celkové množství fenolických látek (TPC) a celkové množství anthokyanů (TAC), a přestože díky zpracování klesá hodnota bioaktivních látek, mají tyto produkty výrazně vyšší hodnotu než výrobky z klasické pšenice. Pozitiva červené pšenice spočívají nejen ve vyšší aktivitě antioxidantů, ale také v ochrana proti oxidaci lipidů při zpracování (Pasqualone et al., 2015).

15

2.2.3

Další netradiční zbarvení pšenice

Modré zbarvení obilky je způsobeno stejnými typy pigmentů jako purpurové zbarvení, avšak tato barviva se nacházejí v aleuronu obilky (Obrázek 2). Nejdůležitějšími anthokyany způsobujícími modré zbarvení pšenice jsou delfinidin-3-glukosid a delfinidin-3-rutinosid (Hu et al., 2007; Abdel-Aal et al., 2006). Anthokyany přítomné v purpurových obilkách se v modrých nacházejí taktéž, ale v mnohem menší míře. Tvorba modrého zbarvení je kódována dvěma geny Ba1 a Ba2, které jsou neúplně dominantní. Gen Ba1 se nachází na dlouhém raménku chromozomu 4B a gen Ba2 se nachází na dlouhém raménku chromozomu 4A. Přestože je složení anthokyanů u modrých obilek jiné než u purpurových, antioxidační vlastnosti těchto odrůd a výrobků z nich jsou podobné. Žlutá barva pšenice je způsobena přítomností pigmentů karotenoidů v endospermu obilek. Geneticky je tvorba karotenoidů řízena geny Psy. Gen Psy1 byl nalezen na chromozomu skupiny 7 a gen Psy2 na chromozomu skupiny 5 (Pozniak et al., 2007). Geny Psy ovlivňují enzym fyteonsyntázu, který je hlavním činitelem v biosyntetické dráze karotenoidů. Pro lepší pochopení dědičnosti žlutého zbarvení bylo provedeno mapování QTL genu Psy1. QTL genu Psy1-A1 byla přiřazena ke chromozomu 7A (Singh et al., 2009) a gen Psy1-B1 byl zmapován na chromozomu 7B (Zhang & Dubcovsky, 2008). Odrůdy pšenice s větším množstvím barviv zastoupených v obilkách mají většinou menší výnosy než standardní odrůdy. Nejvíce anthokyanů se vyskytuje u odrůd s modrým aleuronem, poté následují odrůdy s purpurovým perikarpem (Varga et al., 2013). Méně barviv je přítomno u červených odrůd a téměř žádná barviva nejsou u bílých odrůd, u nichž jsou přítomny látky fenolické povahy a ne anthokyany. Barviva karotenoidy se nacházejí v největším množství u žlutých odrůd, v menším množství v ostatních barevných typech (Martinek et al., 2011).

16

2.3 Laboratorní potkan Kmeny laboratorních potkanů (Rattus norvegicus) jsou velmi vhodné modelové organismy pro studium mnoha biomedicínských jevů, jako jsou kardiovaskulární choroby, metabolické poruchy, sklon k tvorbě rakoviny nebo citlivosti k toxickým látkám. Jsou vhodní pro testování při vývoji nových léků v humánní medicíně a ověřování toxicity látek v prostředí. Oblíbenost potkanů pramení i z jejich přizpůsobivosti a toleranci k zacházení v laboratorních podmínkách. Pokud jsou pokusná zvířata chována správně s důrazem na welfare a eliminuje-li se jejich vystavení stresu z okolního prostředí, můžeme získat přesnější výsledky z pokusů (Keenan et al., 2000). Potkani jsou druhým nejcitovanějším zvířecím modelem v odborné literatuře. Oproti myším jsou potkani větší, divočejší a odolnější vůči různým onemocněním. Sprague-Dawley a Wistar jsou nejpoužívanějšími albinotickými kmeny potkanů používaných v laboratorní praxi. Oba tyto kmeny jsou outbrední, zatímco kmeny myší používaných v laboratoři jsou ve většině případů inbrední (Johnson, 2012). Důležitost potkanů dokládá i fakt, že jejich genom byl zmapován a publikován jako třetí savčí genom v roce 2004 (jako první byl lidský genom a druhá byla myš). Znalost genomu umožnila srovnání genomů člověka a potkana a tím umožnila přesnější studium jejich odlišností a podobností. Celková velikost genomu potkana je 2,75 Gb, takže je menší než genom člověka (2,9 Gb), ale je větší než genom myši (2,6 Gb) a obsahuje přibližně stejné množství genů jako genom člověka. Téměř všechny známé geny spojované s chorobami u člověka mají svůj protějšek i v genomu potkana. Potkani mají celkem 42 chromozomů (20 párů autozomů a 1 pár gonozomů) v diploidním stavu (Gibbs et al., 2004). Laboratorní potkan je často používán pro krmné experimenty díky jeho vhodné velikosti, bezproblémové reprodukci (krátký generační interval), učenlivému chování a variabilitě v potravě. Zvířata jsou všežravá a navíc mají vysokou schopnost přizpůsobit se krmné dávce modelující deficienci některé z důležitých složek stravy (Koolhaas, 2010). Potkani jsou také vhodným modelovým organismem pro zkoušení inovativních krmných směsí a nových krmných zdrojů potenciálně vhodných jako zdroj bílkovin pro hospodářská zvířata (Vavrečka & Procházková, 2003).

17

2.3.1

Výživa laboratorních potkanů

Potkani jsou jedním z nejvhodnějších modelů pro studium potřeby živin, efektu nedostatku živin nebo efektu výživy na jejich růst a rozmnožování.

Výživa

laboratorních potkanů by měla obsahovat dostatečné množství energie, aby pokryla jejich nároky na růst, březost, laktaci, fyzickou aktivitu, produkci tepla a další fyziologické či patologické procesy pro potkany

chované

v laboratorních

(Rogers, 1979). Běžně používaná krmiva podmínkách

obsahují

asi

16–17

kJ

metabolizovatelné energie na gram krmiva (Subcommittee on Laboratory Animal Nutrition et al., 1995). Krmná dávka laboratorních potkanů by měla obsahovat minimálně 15 % bílkovin, aby správně prospívali, avšak doporučená hodnota obsahu bílkovin je 18–23 %. Nepostradatelnými esenciálními aminokyselinami (aminokyseliny, které si organismus nedokáže syntetizovat z jiných aminokyselin a musí být získávány v potravě) jsou arginin, histidin, izoleucin, leucin, lysin, metionin, fenylalanin, treonin, tryptofan a valin (Keenan et al., 2000). Nedostatečný příjem proteinů vede ke sníženému příjmu krmiva a sníženému růstu, anemii, ztrátě svalů, hrubé srsti a nízké reprodukční schopnosti. Potkani s nedostatečným příjmem bílkovin mohou být citlivější na infekční částice, protože buněčná a humorální imunita může být potlačena (Rogers, 1979). Pro správnou funkci organismu je také důležitý optimální příjem minerálních látek a vitamínů. Předpokládané množství minerálních látek potřebné pro správný růst je uvedeno v tabulce 1. Významnými prvky jsou vápník a fosfor. Vápník a fosfor jsou zastoupeny ve velkých koncentracích především v kostech a zubech. Vápník je potřebný pro správné fungování membrán, srážení krve a nervosvalový přenos vzruchu. Fosfor je důležitou stavební jednotkou nukleových kyselin, proteinů, lipidů, sacharidů a vysokoenergetických látek. Při nedostatku těchto minerálních látek se u starších potkanů může projevit osteoporóza (Rogers, 1979; Subcommittee on Laboratory Animal Nutrition et al., 1995). Potřeba vitamínů pro správné prospívání potkanů je shrnuta v tabulce 2.

18

Tabulka 1

Předpokládané množství minerálních látek potřebných pro správný růst laboratorních potkanů v krmivu obsahujícím 90 % sušiny (Keenan et al., 2000; upraveno). Potřeba 0,50 0,30 0,05 0,36 0,005 0,005 35,0 5,0 10,0 12,0 0,15 0,15 0,15

Nutrient Vápník (%) Fosfor (%) Hořčík (%) Draslík (%) Sodík (%) Chlorid (%) Železo (mg/kg) Měď (mg/kg) Mangan (mg/kg) Zinek (mg/kg) Jód (mg/kg) Molybden (mg/kg) Selen (mg/kg)

Tabulka 2

Předpokládané množství vitamínů potřebných pro správný růst laboratorních potkanů v krmivu obsahujícím 90 % sušiny (Keenan et al., 2000; upraveno).

Vitamín

Potřeba

Vitamín A (IU/kg)

2300

Vitamín D3 (IU/kg)

1000

Vitamín E (IU/kg)

27,0

Vitamín K (mg/kg fylochinonu)

1,0

Thiamin-HCl (mg/kg)

4,0

Riboflavin (mg/kg)

3,0

Niacin (mg/kg)

15,0

Kyselina pantotenová (mg/kg)

8,8

Vitamín B6 (pyridoxin) (mg/kg)

6,0

Kyselina folová (mg/kg)

1,0

Vitamín B12 (mg/kg)

0,05

Biotin (mg/kg)

0,2

Cholin (volně vázaný) (mg/kg)

750

19

Dostatečný příjem sacharidů je pro potkany důležitý zejména pro úspěšnou reprodukci a laktaci. Sacharidy jsou pro ně hlavním zdrojem energie v krmivu (Keenan et al., 2000), avšak nadměrný příjem sacharidů vede k tloustnutí zvířat, obezitě a vzniku metabolických poruch (Rodrigues et al., 2015). Lipidy by měly být v krmivu zastoupeny v množství kolem 5–15 %. Důležitý je především příjem esenciálních mastných kyselin (EFA). EFA jsou důležité pro dostatečný růst, prevenci abnormalit vyskytujících se na kůži, tvorbu fosfolipidů a triacylglycerolů v tkáních, tvorbu prostaglandinu, zachování správného poměru polynenasycených mastných kyselin (PUFA) pro tvorbu buněčných membrán, vstřebávání a uchovávání vitamínů rozpustných v tucích. Z PUFA je nejdůležitější příjem kyseliny linolové, jež slouží k tvorbě kyseliny arachidonové, která je důležitou součástí buněčných membrán (Lewis et al., 2006).

20

2.4 Transgenní DNA v krmivu a její transfer do organismu V současném světě se zvětšuje nabídka produktů obsahujících geneticky modifikované plodiny jak v oblasti výroby krmiv pro zvířata, tak v oblasti humánní výživy, což vede ke zvýšené potřebě informací týkajících se bezpečnosti GMO plodin. Tyto nové plodiny mají nejen nové a neznámé nutriční hodnoty, ale existuje i riziko přenosu transgenů z takto upravených plodin inkorporovaných z krmiva do krve či orgánů jedince (Řehout et al., 2008; Aumaitre, 2010). Krmné pokusy na zvířatech jsou důležité i z hlediska přesahu do oblasti humánní výživy. Výsledky chování transgenní DNA v průběhu trávicích procesů může naznačit, co se děje s DNA potravy v těle lidí, protože provádět podobné pokusy na člověku je obtížné (EFSA, 2008; Snell et al., 2012). Podle Zdziarski et al. (2014) je nutné provést další krmné pokusy hlavně na potkanech, jelikož studie, které byly doposud zveřejněny, nejsou dostatečně přesvědčivé nebo neobsahují dostatek informací o daných pokusech. Navíc jsou používány různé metodiky pokusů, a tudíž se jednotlivé výstupy nedají snadno porovnat a vyvodit z nich jednotné závěry. Schubbert et al. (1994) jako první provedli studii zabývající se osudem cizorodé transgenní DNA v trávicím traktu pokusného zvířete. Vkládali do krmiva myším kruhovou a lineární DNA fága M13. Výkaly pokusných zvířat původně tuto DNA neobsahovaly. U jedinců krmených 1–7 h před odběrem našli v krvi malé množství DNA fága M13, což podporuje hypotézu, že fragmenty cizorodé DNA po krátkou dobu zůstávají v trávicím traktu a přecházejí do krve jedince.

2.4.1

Krmné studie na potkanech

Grønsberg et al., (2011) podávali potkanům v různém stádiu vývoje plazmidovou DNA a zkoumali její přenos do různých tkání. U 4 ze 12 potkanů byla detekována cizorodá DNA alespoň v jednom z těchto orgánů: játrech, mezenterických lymfatických uzlinách, slezině, ledvinách a slinivce. U březích samic nebyly nalezeny žádné fragmenty cizorodé DNA a totéž platí pro jejich plody/mláďata. Tyto poznatky dokazují, že fáze vývoje života jedince nemá vliv na transfer cizorodé DNA. El-Sanhoty et al. (2006) přidali do krmiva potkanů jedné skupiny lyofilizované brambory odrůdy Spunta a do krmiva druhé skupiny přidali geneticky modifikované 21

brambory téže odrůdy. Pro detekci DNA brambor použili primery pro chloroplastovou DNA brambor. Tuto DNA detekovali v játrech, ledvinách, slezině a svalstvu potkanů. Když však použili primery specifické pro GMO odrůdu Spunta, žádný produkt PCR nebyl zachycen. Tento jev vysvětlují tím, že úsek chloroplastové DNA se v buňkách rostliny vyskytuje ve 100 kopiích oproti 1 kopii transgenu a chloroplastová DNA je krátká a odolná vůči degradaci. Kiliç & Akay (2008) sledovali na potkanech vliv krmiva s přídavkem GM Bt kukuřice (vložený gen půdní bakterie Bacillus thuringiensis), ale zaměřili se na celkový zdravotní stav pokusných zvířat oproti kontrolní skupině. Tato dieta neměla žádný vliv na prospívání jedinců ani v jedné ze tří generací, které byly zkoumány. Jedinci podrobení testu nevykazovali náznaky pomalejšího růstu a ani jednotlivé orgány a tkáně nevykazovaly odchylky od kontrolních vzorků. (Tyshko et al., 2014) provedli pokus, při kterém posuzovali vliv krmiva obsahujícího GM kukuřici LibertyLink® na tři generace potkanů, jejich reprodukci a vývoj. Kukuřice LibertyLink® byla geneticky upravena tak, aby obsahovala gen pat, čímž byla získána odolnost této plodiny vůči glufosinát amonium. Tato chemická sloučenina je účinná látka některých herbicidů používaných v zemědělství. Získaná data potvrdila, že zvířata konzumující GM kukuřici prospívala stejně jako zvířata z kontrolní skupiny.

2.4.2

Krmné studie na brojlerech

Řehout et al. (2008) použili ve svém pokusu krmivo s přídavkem GM sóji Roundup Ready (RR), která je odolná vůči glyfosátu a Bt kukuřice MON810. Genomickou DNA získávali z jater a ledvin. Pro identifikace případné cizorodé transgenní DNA v izolátech použili komerční kity pro detekci GMO a to konkrétně GMOIdent Roundup Ready TM Soy a GMOIdent MON810TM Corn (Eurofins – GeneScan). Každý z těchto kitů je navržen tak, aby detekoval jednu specifickou oblast transgenní DNA. Bylo odebráno 40 vzorků tkání. Celkem byla transgenní DNA detekována ve třech opakováních. V 17 vzorcích zachytili transgenní DNA v 1–2 opakováních a v 1 vzorku ji zachytili ve všech třech opakováních. Výsledky poukázaly na to, že přenos DNA fragmentů z trávicího traktu do orgánů příjemce je možným rizikem konzumace GM plodin. 22

Naproti tomu další studie provedené Swiatkiewicz et al. (2010) na brojlerech krmených GM Bt kukuřicí a RR sójou nedetekovali pomocí PCR žádné fragmenty DNA těchto krmiv v krvi ani v tkáních kuřat, fragmenty cizorodé DNA byly nalezeny pouze v horní části trávicího traktu, kde nedošlo ke kompletnímu rozkladu. V další studii Rossi et al. (2005) zkoumali obsah svalnatého žaludku, jejuna a slepého střeva brojlerů a také odebírali vzorky krve pokusných zvířat. Jako pozitivní kontrola byla použita detekce genu Zein (v mnoha kopiích se vyskytující gen u kukuřice). Ten byl úspěšně nalezen u většiny jedinců v horním trávicím traktu a v menším počtu případů ve slepém střevu a krvi. Fragment transgenu Cry1Ab byl nalezen pouze ve svalnatém žaludku. Einspanier et al. (2001) nalezli chloroplastovou DNA (199 bp) v malém množství ve svalech, játrech, slezině a ledvinách brojlerů krmených Bt kukuřicí. V průběhu trávení dochází k postupnému trávení DNA obsažené v krmivu. El-Sanhoty (2004) nalezl v jejunu a ileu slepic více krátkých fragmentů (111 bp) DNA GM brambor než v konečných částech GIT. Stejně dopadla i analýza velkých fragmentů rostlinné DNA (1000 bp). U kuřat krmených bramborami byly nalezeny fragmenty chloroplastové DNA v prsním a stehenním svalu, játrech, ledvinách, slezině a kůži, avšak specifické transgenní fragmenty GM brambor nalezeny nebyly.

2.4.3

Krmné studie na snášejících slepicích a křepelkách

Ma et al. (2013) zkoumali u snášejících slepic krmených PTC (fytáza transgenní kukuřice) osud trávené DNA a prostup transgenní DNA do krve, tkání a vajec. Fragment DNA běžné kukuřice byl objeven v trávicím traktu zvířat, ale transgenní fragment byl nalezen jev v horní části GIT. Žádné transgenní fragmenty nebyly nalezeny v krvi, srdci, játrech, slezině, prsním svalu nebo vejcích. Halle & Flachowsky (2014) taktéž ve své čtyřgenerační studii použili snášející slepice, které byly krmeny směsí obsahující GM kukuřici Bt 176. U pokusných zvířat nebyly zjištěny žádné rozdíly v růstu, produkci ani reprodukci oproti kontrolním jedincům. Korwin-Kossakowska et al. (2013) v jiné studii použili japonské křepelky (Coturnix cot. japonica) a zkoumali nejen přenos transgenů do tkání jedince, ale i jejich prostup do vajíček. Bylo použito celkem 3 684 křepelek a 4 628 vajíček, křepelky byly krmeny RR sójou a Bt kukuřicí MON 810. Vzorky pro PCR analýzu byly odebrány z prsního svalu, svalnatého žaludku, jater, sleziny, ledvin a srdce. Současně byl odebrán 23

i blastodisk z vajíček. V odebraných vzorcích nebyla nalezená žádná transgenní DNA a dieta neměla žádný negativní efekt na vývoj ptáků a vajíček.

2.4.4

Krmné studie na mléčném skotu

Taktéž u mléčného skotu byly provedeny experimenty zahrnující dlouhodobé krmení transgenní Bt kukuřicí. Guertler et al. (2010) ve výkalech těchto zvířat nalezli fragment kukuřičného genu rubisco, ale fragment genu Cry1Ab (transgen) nebyl pomocí PCR detekován. Stejně tak v krvi zvířat byl nalezen fragment genu rubisco (173 bp) a dále Cry1Ab (206 bp), naopak v mléce získaném od zkoumaných jedinců ani jeden z těchto fragmentů nalezen nebyl. Phipps et al. (2003) v další krmné studii na mléčném skotu detekovali kukuřičný transgen Cry1Ab a navíc hledali taktéž transgen z GM sóji cp4epsps. V bachorové tekutině, pevném obsahu duodena a výkalech byl detekován pouze gen rubisco. Zatímco v pevném obsahu bachoru a pevném obsahu duodena byly nalezeny i oba transgenní fragmenty. V krvi byl detekován fragment genu rubisco pouze v jednom případě, další geny však ne. Stejně tak v mléce byl detekován fragment tohoto genu (189 bp) a to u většiny jedinců. Menší fragmenty genu rubisco (351 a 189 bp) byly nalezeny ve všech vzorcích, větší fragmenty (850 a 1176 bp) byly nalezeny pouze v bachorové tekutině a pevném obsahu duodena a 850bp fragment byl nalezen i v krvi. Podobně byl nalezen fragment specifické chloroplastové rostlinné DNA v lymfocytech a trávenině skotu krmeném Bt kukuřicí (Einspanier et al., 2001).

2.4.5

Krmné studie na ostatních živočiších

Podobné studie byly provedeny i na větších savcích než jsou potkani či brojleři, a to především na ovcích a prasatech. Sharma et al. (2006) zkoumali ovce, které byly krmeny krmnou dávkou obsahující GM RR řepku (Monsanto) a nalezli specifickou chloroplastovou DNA v obsahu bachoru, slézu a tlustého střeva, v menším počtu případů našli fragmenty genu rbc (rubisco) i transgenní fragment genu cp4 epsps. To znamená, že přijímaná DNA nebyla v průběhu trávení zcela degradována. Také byly nalezeny fragmenty této DNA v játrech a ledvinách.

24

U prasat zkoumali obsah slepého střeva a transgenní fragment cp4 epsps byl nalezen u malého počtu zkoumaných jedinců a to konkrétně u 7 z celkového počtu 108 vzorků. Stejného výsledku bylo dosaženo při analýze obsahu GIT. Při analýze vzorků odebraných z orgánů jako jsou játra, ledviny a slezina, žádná cizorodá DNA nalezena nebyla. Příjem těchto fragmentů do orgánů je velmi malý a fragmenty, které byly nalezeny v GIT, zůstávaly v detekovatelném množství pouze po krátký časový interval po příjmu krmiva. Negativní výsledky u zkoušek na přítomnost transgenní DNA ve tkáních byly dosaženy i u lososů (Salmo salar L.) krmených GM RR sójou. Studie na lososech byla provedena proto, že dosavadní pokusy využívaly jako modelových organismů nepřežvýkavé či přežvýkavé živočichy nebo drůbež. Ryby však mají mírně odlišnou stavbu těla a fyziologie jejich trávicího traktu je také mírně odlišná, ne však natolik, aby byly výsledky těchto studií neporovnatelné. Význam GM sóji ve výživě ryb stále stoupá, jelikož krmiva založená na sóje začínají nahrazovat dříve běžné zdroje bílkovin. Sanden et al. (2004) odebírali vzorky z jater (nejsnazší přenos z krve), svalů (konzumovány člověkem) a mozku. V odebraných tkáních žádnou cizorodou DNA nezaznamenali, ve vzorcích z trávicího traktu hledaná cizorodá DNA objevena byla, nebyla tedy 100% degradována. Tudisco et al., (2006) nalezli v krvi, svalech, ledvinách játrech a srdci některých králíků krmených transgenní RR sójou fragmenty chloroplastové DNA. Fragmenty dalších rostlinných genů, které hledali, však nalezeny nebyly. Chloroplastová DNA je odolnější než genomická DNA, a tak snáze odolává trávicím procesů v GIT.

25

Tabulka 3

Shrnutí krmných studií zabývajících se přenosem transgenní DNA z krmiva do tkání modelových zvířat.

Modelové organismy

Příměs krmiva

Myši

DNA fága M13 plazmidová DNA

Potkani

GM brambory Bt kukuřice LibertyLink® kukuřice RR sója Bt kukuřice Bt kukuřice RR sója

Brojleři

Odebírané vzorky

Přítomnost cizorodé DNA

Autor

krev

ANO

(Schubbert et al., 1994)

játra, mezenterické lymfatické uzliny, slezina, ledviny, sliznice

ANO

plody/mláďata

NE

játra, ledviny, slezina, svaly

ANO

varlata, srdce, plíce, kůže

NE

žádný vliv na zvířata

-

žádný vliv na zvířata

-

játra, ledviny

ANO

tkáně

NE

horní část GIT

ANO

druhý žaludek

ANO

GIT, krev

NE

Bt kukuřice

GM brambory

svaly, játra, ledviny, slezina GIT, stehenní sval, játra, ledviny, slezina, kůže

PTC

krev, tkáně vejce

NE

Bt kukuřice

žádný vliv na zvířata

-

Bt kukuřice

tkáně, vajíčka

NE

Bt kukuřice

Snášející slepice

Křepelky

26

ANO ANO

(Grønsberg, 2011)

(El-Sanhoty et al., 2006) (Kiliç & Akay, 2008) (Tyshko et al., 2014) (Řehout et al., 2008) (Swiatkiewicz et al., 2010)

(Rossi et al., 2005) (Einspanier et al., 2001) (El-Sanhoty, 2004) (Ma et al., 2013) (Halle & Flachowsky, 2014) (Korwinkossakowska et al., 2013)

Tabulka 3

Modelové organismy

Shrnutí krmných studií zabývajících se přenosem transgenní DNA z krmiva do tkání modelových zvířat – pokračování.

Odebírané vzorky

Přítomnost cizorodé DNA

krev, výkaly

ANO

mléko

NE

Bt kukuřice RR sója

GIT, krev

ANO

(Phipps et al., 2003)

Bt kukuřice

GIT, lymfocyty

ANO

(Einspanier et al., 2001)

GIT, játra, ledviny

ANO

GIT

ANO

orgány

NE

Příměs krmiva Bt kukuřice

Mléčný skot

Ovce Prasata

RR řepka

Autor

(Guertler et al., 2010)

(Sharma et al., 2006)

Lososi

RR sója

tkáně GIT

NE ANO

(Sanden et al., 2004)

Králíci

RR sója

krev, tkáně

ANO

(Tudisco et al., 2006)

27

3

CÍLE PRÁCE  Izolovat DNA ze vzorků krve potkanů odebraných po krmném experimentu s pšenicí Konini.



Následně pomocí polymerázové řetězové reakce detekovat přítomnost cizorodé DNA pšenice v DNA izolátu z krve modelových organismů.



Potvrdit nebo vyvrátit teorii, že cizorodá DNA z krmiva může být vstřebávána z trávicího traktu do krve a tkání živočichů.

28

4

MATERIÁL A METODIKA

4.1 Pokus na potkanech Pokus probíhal na laboratorních potkanech outbredního kmene Wistar albino, kteří byli zakoupeni z konvenčního chovu BioTest s.r.o. Konárovice. Aby byla krmná skupina co nejhomogennější, byli použiti pouze samci ve věku 6–7 týdnů. Celkem se jednalo o 64 zvířat rozdělených do dvou skupin po 32 jedincích. Zvířata byla chována v prostorách ústavu výživy zvířat a pícninářství (č. j. akreditace 57890/2012-MZE-17214. Pokus probíhal v souladu se zákonem 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání a podle příručky Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources et al., 1996) Průměrná počáteční váha zvířat zařazených do kontrolní skupiny byla 239 g a průměrná váha zvířat zařazených do skupiny krmené pšenicí Konini byla 246 g. Prvních 5 dnů po přijetí byla zvířata krmena komerční granulovanou směsí BIOSTAN určenou pro hlodavce. Tato směs se skládá z 92,8 % sušiny, z čehož 26,88 % jsou NL; 3,96 % je vláknina; 4,14 % je tuk a 6,22 % je popel. Plodiny, z nichž byly tyto granule vyrobeny, jsou: pšenice, ječmen setý, oves setý, proso seté, vojtěšková moučka, kukuřice, slunečnice. Po skončení této lhůty byla pokusná skupina zvířat krmena pšenicí Konini, tedy pšenicí s purpurovým zbarvením obilky. Zvířata v kontrolní skupině byla krmena běžnou pšenicí odrůdy Bohemia.

4.1.1

Krmné směsi

Pro krmení byly z pšenice vyrobeny suché, které byly potkanům zakládány do krmítek. Příjem krmiva byl denně sledován (přidělené a nezkonzumované krmivo bylo váženo a zaznamenáváno). Aby bylo dosaženo totožného obsahu NL v obou skupinách, bylo kontrolní krmivo z ADW pšenice obohaceno o lepek. Složení jednotlivých krmných směsí je znázorněno v tabulce 4. Data byla získána od Mgr. Ing. Evy Mrkvicové, Ph.D. Během pokusu byly řízeny klimatické podmínky v chovném prostoru. Teplota se průměrně pohybovala kolem 23,5 °C a vlhkost byla průměrně 55,7 %. Intenzita světla byla maximálně 200 lx a světelný režim byl zvolen na16 hodin světla a 8 hodiny tmy. 29

Tabulka 4

Zastoupení jednotlivých látek v krmivu zjištěných pomocí laboratorní analýzy.

Krmivo

Sušina (%)

Dusíkaté Vláknina (%) látky (%)

Konini

89,07

15,13

Kontrola

89,11

14,4

Tuk (%)

Popel (%)

Brutto energie (MJ)

2,13

1,44

1,59

15,64

2,28

1,63

1,85

15,69

Pokus probíhal po dobu 21 dnů, po této době byli potkani usmrceni předávkováním anestetikem Isofluranem. Krev z pokusných potkanů byla odebírána po uspání punkcí srdce do k tomu určených zkumavek obsahujících 3,6 mg K3EDTA, aby se zabránilo nežádoucímu srážení krve, poté byly vzorky zmraženy na -20°C až do dalšího zpracování. Těla potkanů byla zlikvidována ve Veterinárním asanačním ústavu Medlov s.r.o.

4.2 Izolace živočišné DNA z krve Do krmného pokusu bylo zahrnuto 64 potkanů rozdělených do dvou skupin (kontrolní a pokusná). Pro analýzu jejich DNA bylo náhodně vybráno 6 vzorků ze skupiny krmené purpurovou pšenicí Konini a 6 jedinců krmených kontrolním krmivem skládajícím se z pšenice s běžným zbarvením obilky odrůdy Bohemia. Vzorky byly označeny písmenem P a číslem vzorku, jež odpovídalo pořadí potkanů při odebírání krve. P1–P32 byly vzorky krve potkanů z kontrolní skupiny a P33–P64 byly vzorky krve potkanů krmených pšenicí Konini. Izolace DNA ze vzorků krve potkanů byla provedena pomocí Geneomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) od firmy Genaid. Tento kit je určen pro purifikaci celkové DNA (což zahrnuje genomickou DNA, mitochondriální a virovou DNA) z krve, kultivovaných živočišných buněk nebo trombocytů a leukocytů. Tento kit obsahuje chaotropní sůl jako prostředek pro lýzi buněk a degradaci proteinů, která zároveň umožňuje navázání DNA na silikátovou matrici uvnitř kolonky. Kontaminující látky jsou odstraněny promytím pufrem obsahujícím ethanol a navázaná DNA je eluována pomocí elučního pufru obsahujícím malé množství solí. DNA získaná touto metodou 30

je vhodná pro použití při PCR a dalších enzymatických reakcích (Geneaid.com, nedatováno). Izolace byla prováděna podle výrobcem přiloženého návodu ke Geneaid Genomic DNA Mini Kitu pro izolaci DNA z krve dostupného na Geneaid.com (nedatováno) a následně modifikována. Pomůcky, které byly použity, ale nejsou obsaženy v použitém kitu, zahrnují: mikrozkumavky (1,5 ml), centrifugu, pipety a špičky, termoblok, vortex. Modifikace návodu přiloženého výrobcem: 

Během přípravy vzorku bylo do mikrozkumavky přeneseno 100 µl vzorku krve oproti standardně používanému množství 200 µl.



Ve fázi č 2. – lýze buněk byla doba inkubace při teplotě 60 °C prodloužena na 1 hodinu (oproti doporučeným 10 minutám).



Při lýzi buněk bylo také přidáno 2 µl RNázy A (100mg/ml) z důvodu odstranění nežádoucí RNA.



Ve fázi č. 5 – DNA eluce bylo přidáno pouze 50 µl předehřátého elučního pufru do středu matrice kolonky pro zvýšení koncentrace DNA.

V průběhu izolace (ve druhém kroku, kdy probíhala lýze buněk) byly přidány 2 µl RNázy A (100 mg/ml), což výrobce uvádí jako volitelný krok pro odstranění RNA. Kvůli nedostatečnému výtěžku DNA při prvních izolacích bylo ve druhém kroku při lýze buněk přidáno 20 µl Proteinázy K (izolovaná z Tritirachium album, 20 mg/ml), což bylo provedeno, aby došlo k úplné lýze buněk ve vzorku a uvolnění veškeré DNA. Zároveň byla prodloužena doba inkubace na 1 hodinu opět z důvodu dokonalejší lýzi buněk. Získaná DNA byla krátkodobě přechovávána v lednici při 4 °C, mezi analýzami byla DNA umístěna do mrazničky při teplotě -20 °C. Kvalita a koncentrace DNA byla ověřena pomocí přístroje Picodrop Spectrometr od firmy Picodrop Ltd., přičemž byly použity 2 µl vzorku obsahujícího DNA a jako slepý vzorek byl použit eluční pufr z Geneomic DNA Mini Kitu (Blood/Cultured Cell) od firmy Genaid. S využitím tohoto kroku byla ověřena koncentrace DNA a jeho kvalita díky poměru absorbancí při 260 nm a 280 nm.

31

4.3 Izolace rostlinné DNA z krmiva Pro izolaci krmiva byl použit DNeasy Plant Mini Kit, jehož výrobcem je firma Qiagen. Tento kit je určen pro snadnou purifikaci DNA z rostlinné nebo houbové tkáně. Výsledkem

procedury

je

zisk

celkové

DNA

(genomická,

mitochondriální

a chloroplastová) použitelná pro další analýzy jako je např. PCR. DNeasy membrána zajišťuje odstranění všech látek inhibujících PCR a další enzymatické reakce. Purifikovaná DNA je eluována do roztoku s malým obsahem solí. DNA byla izolována ze vzorku krmiva z pšenice odrůdy Bohemia se standardním zbarvením a ze vzorku krmiva z barevné pšenice Konini. Bylo použito 20 mg rostlinného materiálu a byl dodržen postup uvedený výrobcem v příručce ke kitu DNeasy® Plant Handbook (Qiagen.com, nedatováno), kde však byl vynechán první krok zahrnující zmražení materiálu tekutým dusíkem, jelikož krmivo již bylo nadrceno. Pro izolaci byly použity následující pomůcky, které nejsou obsaženy v balení s kitem: vybavení pro homogenizaci materiálu, pipety a špičky, termoblok, vortex, ethanol (96–100%), mikrozkumavky, chlazená centrifuga, led. Kvalita a koncentrace DNA byla zjištěna spektrofotometricky pomocí přístroje Picodrop Spectrometr. Měření proběhlo na 2 µl izolátu a jako slepý vzorek sloužil eluční pufr z Dneasy Plant Mini Kit. Získaná DNA v roztoku byla uchovávána při 4 °C pro další analýzy.

4.4 Postup PCR 4.4.1

Použité primery

Primery byly vybrány z dostupné literatury zabývající se PCR identifikací provozních (housekeeping) genů (referenční gen exprimovaný ve všech tkáních daného organismu) u potkanů. Podle Langnaese et al. (2008) byly vybrány dva provozní geny pro identifikaci DNA potkanů: primery pro gen Gapdh (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza). Sekvenci tohoto genu je možné najít pod číslem NM_017008.4 v nukleotidové databázi NCBI. Tato databáze sdružuje veškerá biomedicínská data a informace o genomech (NCBI, nedatováno). Byly použity primery, které amplifikují specifický fragment tohoto genu o délce 118 bp cDNA potkana, tyto primery vypadají následovně: 32



Forward primer: 5‘ CAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA 3‘



Reverse primer: 5‘ GGCATGGACTGTGGTCATGA 3‘

Jako druhý provozní gen byl vybrán Rpl13a (ribozomální protein L13A), jehož sekvence

je

dostupná

v NCBI

databázi

pod

číslem

NM_173340.2,

byly syntetizovány primery amplifikující fragment o velikosti 132 bp. Tento gen byl vyřazen, protože nebyl amplifikován při testovací reakci a jako provozní gen byl použit pouze gen Gapdh. 

Forward primer: 5‘ GGATCCCTCCACCCTATGACA 3‘



Reverse primer: 5’CTGGTACTTCCACCCGACCTC 3‘

Následně byly vybrány dva provozní geny pro identifikaci DNA pšenice. První gen byl provozní gen Gapdh (cytosolická glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza). Sekvence tohoto genu je dostupná v databázi NCBI pod číslem AF251217.1. S danými primery tvoří přibližně 400 bp dlouhý produkt s použitou genomickou DNA pšenice. 

Forward primer: 5’ CGAAGCCAGCAACCTATG 3‘



Reverse primer: 5’ CAAAGTGGTCGTTCAGAGCA 3‘

Jako druhý provozní gen byl zvolen gen pro pšeničný aktin (Actin), dostupný v databázi nukleotidové NCBI pod číslem AB181991.1. Vybrané primery amplifikují část tohoto genu asi o velikosti 500 bp na genomické DNA pšenice (Himi et al., 2011). 

Forward primer: 5’ GAGGGATACACGCTTCCTCA 3‘



Reverse primer: 5’ GAAAGTGCTAAGAGAGGCCAAA 3‘

PCR primery byly dodány v lyofilizované podobě od firmy Metabion International AG a naředěny do podoby 1× koncentrovaného roztoku, který byl použit k analýze a 10× koncentrovaného roztoku, jenž byl uskladněn při 4 °C a ponechán jako roztok zásobní.

33

4.4.2

Příprava a provedení reakce

Mastermix pro PCR byl připraven v mikrozkumavce o objemu 1,5 ml přidáváním jednotlivých složek v reakční směsi (Tabulka 5). V reakční směsi byly použity kromě deionizované vody i zelený PCR pufr (Green Go® Taq Reaction Buffer, pH 8,5), směs deoxynukleotid trifosfátů (dNTP) připravená smícháním stejného množství deoxyadenosin trifosfátu (dATP), deoxycytidin trifosfátu (dCTP), deoxyguanosin trifosfátu (dGTP) a deoxythymidin trifosfátu (dTTP), zpětný a přímý primer a nakonec Taq polymeráza (60 Taq DNA polymarase od značky Promega uchovávaná při -20 °C). Po smísení byl mastermix promíchán na vortexu a rozdělen po 24 µl do 0,2ml zkumavek určených pro PCR, nakonec byl do směsi přidán 1 µl vzorku s DNA a zkumavky byly umístěny do termocykleru. Gradientová PCR byla provedena v termocykleru od firmy Quanta Biotech a klasická PCR v termocykleru od firmy Biometra.

Tabulka 5

Jednotlivé složky a jejich objem použité pro PCR jednoho vzorku. Objem reagencií (µl)

Složka reakce deionizovaná H2O PCR pufr směs dNTP primer přímý primer zpětný

16,8 5 0,1 1 1

Taq polymeráza

0,1

Teplotní a časový profil pro PCR provedenou s primery pro gen Gapdh u potkanů, primery pro gen Rpl13a a gen Gapdh u pšenice je uveden v tabulce 6 a profil reakce s primery pro pšeničný Actin je uveden v tabulce 7.

34

Tabulka 6

Časový a teplotní profil PCR pro gen Gapdh. Fáze

Teplota

Délka

94 °C

3 min

94 °C

30 s

Annealing

60 °C

45 s

Elongace Závěrečná polymerační reakce

72 °C

60 s

72 °C

5 min

Počáteční denaturace Denaturace

Tabulka 7

Počet opakování

30×

Časový a teplotní profil PCR pro gen Actin. Fáze

Teplota

Délka

94 °C

3 min

94 °C

30 s

Annealing

62 °C

45 s

Elongace Závěrečná polymerační reakce

72 °C

60 s

72 °C

5 min

Počáteční denaturace Denaturace

35

Počet opakování

30×

4.5 Gelová elektroforéza Pro separaci jednotlivých PCR produktů byla použita 1% agarózová elektroforéza (Serva Blue Marine 200), její příprava probíhala podle následujícího postupu: 

Bylo odměřeno 1274 ml deionizované H20,



poté bylo odměřeno 26 ml 50× TAE pufru,



TAE pufr byl přidán do odměřené vody,



po důkladném promíchání bylo odlito 160 ml směsi a přidáno 1,6 g agarózy,



po promíchání byla směs provařena v mikrovlnné troubě po dobu asi 3,5 minuty (aby došlo k úplnému rozpuštění agarózy).



Po povaření byla směs mírně zchlazena a bylo přidáno 1,5 µl EtBr,



poté byl do vany pro elektroforetický gel nasazen hřebínek pro tvorbu jamek,



následně byla směs nalita do elektroforetické vany, vytvořené bublinky byly odstraněny a směs se nechala ztuhnout.



Po ztuhnutí byla vana zasazena do přístroje na elektroforézu,



posléze byl zbytek zředěného TAE pufru nalit na gel,



po nalití pufru byl vyndán hřebínek pro tvorbu jamek, do nichž byly napipetovány vzorky a velikostní marker.



Přístroj na elektroforézu byl uzavřen a elektroforéza byla spuštěna.

Elektroforéza probíhala po dobu jedné hodiny při 69 V. Jako nanášecí pufr při elektroforéze sloužil PCR pufr, Green GoTaq Reaction Buffer, který má pH 8,5 a obsahuje modré barvivo pro zviditelnění. Na gel se nanášelo 20 µl vzorku a 12 µl markeru Produkt PCR byl zviditelněn pomocí přídavku ethidium bromidu do gelu a po separaci byly fragmenty zviditelněny v transiluminátoru a vyfoceny. Vyhodnocení bylo provedeno pomocí určení velikostí výsledných fragmentů, k čemuž sloužil 100 bp PCR ladder od firmy New England Biolabs jako marker při elektroforéze.

36

5

VÝSLEDKY A DISKUSE

5.1 Izolace DNA Tabulka 8 ukazuje výsledky měření koncentrace a čistoty DNA v roztoku po izolaci pomocí komerčních kitů. Tabulka 8

Koncentrace a čistota DNA izolované z krve potkanů a ze vzorků krmiva měřená spektrofotometricky. Koncentrace (ng/µl)

A 260/280

P5

5,3

1,602

P11

4,2

1,195

P12

3,6

1,186

P14

7,5

1,431

P22

5,6

1,738

P26

8,7

1,810

P34

5,7

1,337

P42

16,9

2,909

P45

7,5

1,400

P49

5,3

2,269

P53

4,9

2,487

P59

7,2

1,766

krmivo Konini

74,2

1,665

krmivo kontrola

62,0

1,657

Vzorek

Popis tabulky: P5–P59) vzorky obsahující DNA potkanů izolovanou z krve, krmivo Konini a kontrola) vzorky obsahující DNA z krmiv.

37

5.1.1

Problémy při izolaci DNA

Přestože byl při prvních pokusech o izolaci DNA ze zmražené krve dodržen postup doporučovaný výrobcem, izolovanou DNA se nepodařilo získat v dostatečné koncentraci a čistotě. Autoři Grønsberg et al. (2011); El-Sanhoty et al. (2006) použili k izolaci DNA v podobné studii komerční kit od firmy Qiagen, pomocí něhož izolovali dostatečné množství DNA pro PCR (20–30 ng/µl). Krev, ze které byla DNA izolována, byla zmražená, tudíž mohlo dojít k nedokonalému rozmražení tekutiny nebo k nedostatečnému promíchání vzorku. Krev také mohla být příliš rychle rozmražena. Tudisco et al. (2006) při izolaci DNA z krve králíků doporučují velmi pomalé zahřívání zmražených vzorků v ledové lázni, aby nedošlo k poškození obsažené DNA. Při dalším opakování se však kvalita izolované DNA nezlepšila, proto se přistoupilo k modifikaci izolačního postupu. Krev byla skladována při -20 °C, takže nemohlo dojít k znehodnocení DNA v důsledku dlouhého skladování. Tento jev by mohl nastat, pokud by krev byla skladována při 4 °C Richardson et al. (2006) pozorovali klesající výtěžnost izolace DNA z krve až po uskladněním delším než 200 dní při uskladnění při 4 °C. Výrobcem doporučené množství krve (200 µl) bylo zredukováno, aby došlo k dokonalejší lýzi buněk ve vzorku a nedocházelo ke tvorbě sraženiny při přečišťování vzorku

během

izolace.

Ze

stejných

důvodů

byla

při

izolaci

přidána

Proteináza K a byla zvýšena doba inkubace během lýzi buněk na 1 hodinu. Proteináza K, jak uvádí Eychner et al. (2014) slouží k narušení buněk a uvolňování DNA z jádra. Po izolaci DNA ze vzorků krve potkanů s výše popsanými modifikacemi byla získána dostatečně kvalitní DNA pro následující reakce, což je znázorněno na obrázku 6, 7 a 8. Hodnoty získané spektrofotometricky pomocí přístroje Picodrop spectrometr nemusí být zcela přesné, jelikož koncentrace DNA ve vzorku je velmi nízká a tudíž špatně měřitelná

(Picodrop.com,

nedatováno).

Z tabulky 8

je patrné,

že izolovaná DNA nebyla příliš čistá. Pokud je poměr absorbancí A260/280 vzorku roven 1,8, je DNA považována za čistou, pokud je tato hodnota menší než 1,8, jedná se o znečištění proteiny, fenolem nebo dalšími kontaminanty. Při vyšší absorbanci než 1,8 se jedná o znečištění RNA (Wilfinger et al., 1997).

38

5.2 PCR a její vizualizace 5.2.1

Optimalizace pro specifické primery DNA potkanů

Pro úspěšnou detekci DNA pomocí PCR metody bylo nejprve potřeba zjistit optimální teplotu annealingu pro jednotlivé páry primerů. Optimalizace PCR je podle Roux (2009) důležitá pro to, aby nedošlo k amplifikaci nespecifických fragmentů místo získání požadovaného DNA produktu. Obrázek 4 ukazuje výslednou vizualizaci agarózového gelu po provedení PCR při annealingové teplotě 60 °C pro oba primery určené pro identifikaci DNA potkanů. Pro tento test byl použit vzorek DNA potkana P59, který byl vybrán, protože se vyznačoval vyšší koncentrací a čistotou než ostatní vzorky izolované DNA. Jako kontrola byl použit vzorek DNA z krmiva konkrétně krmivo Konini.

Obrázek 4

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 60 °C.

Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery GCH1 specifickými pro kuře, 2) DNA kuřete s primery GCH1 specifickými pro kuře, 3) DNA kapra s primery GCH1 specifickými pro kuře, 4) krmivo Konini s primery GCH1 specifickými pro kuře, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro potkana, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro potkana, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro potkana, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro potkana, 9) P59 s primery Rpl13 specifickými potkana, 10) DNA kuřete s primery Rpl13 specifickými pro potkana, 11) DNA kapra s primery RPL13 specifickými pro potkany, 12) Krmivo Konini, primery Rpl13 specifické pro potkany.

39

Pomocí této testovací PCR byla zjišťována správná teplota nejen pro vzorky DNA potkanů a příslušné primery, ale také pro vzorky z kuřat a kaprů, jenž byly podrobeny podobnému krmnému pokusu s pšenicí Konini, a pro ně specifických primerů. Z tohoto důvodu jsou na vizualizaci gelu zobrazeny i tyto produkty PCR. Z vizualizace agarózového gelu vzorků po PCR je patrné, že DNA genu Gapdh ze vzorku potkana byla namnožena pomocí příslušného primeru (jamka č. 5), tudíž teplota annealingu 60 °C je pro tento pár primerů optimální. Do jamky č. 9 byl nanesen vzorek DNA potkana a primery pro gen Prpl13. Na obrázku je patrné, že došlo ke špatnému namnožení hledané PCR a navíc došlo během PCR ke tvorbě nespecifických fragmentů, a tudíž není tato annealingová teplota optimální pro tento pár primerů. Potvrdilo se, že u vzorků DNA neobsahujících DNA potkana neproběhla PCR s primery pro gen Gapdh (jamka č. 6, 7 a 8). Naopak u jamky č. 10, 11 a 12 došlo k tvorbě nespecifických fragmentů, takže primery Rpl13 nasedaly i na ostatní vzorky nejen na DNA izolovanou z krve potkanů. Obrázek 5 zobrazuje stejný test jako předchozí obrázek gelu, ale tentokrát při annealingové teplotě 58 °C. Přestože primery pro gen Gapdh nasedaly dostatečně specificky na templátovou DNA, ověřili jsme, zda je annealing pro 60 °C skutečně nejoptimálnější pro další analýzy. Jako vzorek DNA potkana byl znovu zvolen vzorek P59.

40

Obrázek 5

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 58 °C.

Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery GCH1 specifickými pro kuře, 2) DNA kuřete s primery GCH1 specifickými pro kuře, 3) DNA kapra s primery GCH1 specifickými pro kuře, 4) krmivo Konini s primery GCH1 specifickými pro kuře, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro potkana, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro potkana, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro potkana, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro potkana, 9) P59 s primery Rpl13 specifickými potkana, 10) DNA kuřete s primery Rpl13 specifickými pro potkana, 11) DNA kapra s primery RPL13 specifickými pro potkany, 12) Krmivo Konini s primery Rpl13 specifické pro potkany.

Z obrázku je patrné, že optimální teplota pro nasedání primerů Gapdh je 60 °C, což odpovídá metodice, kterou uvádí Langnaese et al. (2008). Při teplotě annealingu 58 °C došlo nejen k amplifikaci požadovaného fragmentu, ale taktéž ke tvorbě nespecifických fragmentů, které by mohly ovlivňovat výsledek PCR. Primer Rpl13 nefungoval správně ani při nasedání při 58 °C ani při 60 °C, pokaždé došlo k tvorbě druhého nespecifického fragmentu a dalších nespecifických fragmentů u dalších vzorků. Z tohoto důvodu byly pro další analýzy vybrány primery amplifikující specifickou oblast genu Gapdh potkanů. Také velikost amplifikovaného fragmentu odpovídá délce fragmentu 118 bp v cDNA (Langnaese et al., 2008).

41

5.2.2

Optimalizace pro specifické primery DNA pšenice

Stejně jako v předcházející kapitole bylo potřeba optimalizovat teplotu annealingu specifických pšeničných primerů. Nejprve byla provedena PCR s teplotou annealingu nastavenou na 60 °C (Obrázek 6).

Obrázek 6

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 60 °C.

Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery Actin specifickými pro pšenici, 2) DNA kuřete s primery Actin specifickými pro pšenici, 3) DNA kapra s primery Actin specifickými pro pšenici, 4) krmivo Konini s primery Actin specifickými pro pšenici, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 9) P59 s primery 40S specifickými kapra, 10) DNA kuřete s primery 40S specifickými pro kapra, 11) DNA kapra s primery 40S specifickými pro kapra, 12) Krmivo Konini, primery 40S specifické pro kapra.

Do jamky č. 4 byla nanesena pšeničná DNA a přidány specifické primery pro pšeničnou DNA, tudíž měla proběhnout amplifikace specifického fragmentu, ke které nedošlo. Pravděpodobně došlo k chybě při přípravě PCR reakční směsi, jako například nepřimíchání

vzorku s DNA,

nebo

špatné promíchání

směsi.

Tento fragment by se měl při annealingové teplotě 60 °C po PCR na gelu objevit (Obrázek 8). Naopak v jamce č. 8 je vidět, že byl pomocí primerů pro Gapdh namnožen specifický fragment pšeničné DNA o velikosti přibližně 400 bp a nedošlo k tvorbě 42

nespecifických

fragmentů.

který umožňuje

srovnání

Podle

přiložení

ověřovaných

pomocí

primerů

nástroje

Primer-BLAST,

s nukleotidovou

databází

(Primer-BLAST, nedatováno), by měla být velikost fragmentu amplifikovaná těmito primery 174 bp, avšak tento údaj platí pro cDNA. Zde byla použita genomická DNA, takže je pravděpodobné, že větší velikost fragmentu je zapříčiněna přítomností intronu. Následující reakce byla opět provedena za stejných podmínek a se stejnými vzorky, ale při nižší teplotě annealingu (Obrázek 7).

Obrázek 7

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 58 °C.

Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P59 s primery Actin specifickými pro pšenici, 2) DNA kuřete s primery Actin specifickými pro pšenici, 3) DNA kapra s primery Actin specifickými pro pšenici, 4) krmivo Konini s primery Actin specifickými pro pšenici, 5) P59 s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 6) DNA kuřete s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 7) DNA kapra s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 8) krmivo Konini s primery Gapdh specifickými pro pšenici, 9) P59 s primery 40S specifickými kapra, 10) DNA kuřete s primery 40S specifickými pro kapra, 11) DNA kapra s primery 40S specifickými pro kapra, 12) Krmivo Konini, primery 40S specifické pro kapra.

Při podrobném zkoumání gelu vychází najevo, že při annealingové teplotě vznikají při použití obou párů primerů specifických pro pšenici nespecifické fragmenty. I když je u jamek č. 4 patrné, že došlo k amplifikaci požadovaného fragmentu o velikosti přibližně 500 bp, což odpovídá výsledku z přiložení těchto primerů k dané sekvenci v nástroji Primer-BLAST, jenž ukázal velikost výsledného fragmentu 558 bp na cDNA. Na amplifikovaném fragmentu se pravděpodobně nenachází žádný intron.

43

Kvůli tvorbě nespecifických produktů však není annealingová teplota 58 °C vhodná ani pro jeden z primerů specifických pro pšenici. Protože při dvou předcházejících PCR nebyla odhalena optimální teplota annealingu pro amplifikaci pšeničného genu Actin, přistoupilo se ke gradientové PCR, kde lze nastavit rozdílné teploty annealingu pro testovaný vzorek a tudíž snadno určit nejoptimálnější teplotní rozmezí. Tato PCR byla provedena pouze s jedním vzorkem krmiva a to s krmivem Konini a rozmezí teplot začínalo na 56 °C a končilo téměř na 62 °C (Obrázek 8).

Obrázek 8

Vizualizace agarózového gelu po gradientové PCR pro primery pšeničného genu Actin pro optimalizaci annealingové teploty.

Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) krmivo Konini (annealing 56 °C), 2) krmivo Konini (annealing 57,2 °C), 3) krmivo Konini (annealing 58 °C), 4) krmivo Konini (annealing 58,9 °C), 5) krmivo Konini (annealing 59,9 °C), 6) krmivo Konini (annealing 60,8 °C), 7) krmivo Konini (annealing 61,9 °C).

Na obrázku se ukázalo, že nižší teploty annealingu při použití těchto primerů, mají za následek tvorbu nežádoucích nespecifických fragmentů. Jelikož by tyto fragmenty mohly ovlivnit výsledky dalších analýz, byla pro tyto primery k dalším analýzám použita teplota annealingu 62 °C. Vzorek v jamce č. 7 je nejzřetelnější a nejsou kolem něj viditelné žádné rušivé fragmenty. Takto vysoká teplota annealingu při PCR je poměrně neobvyklá, ale zvyšuje se specifita detekce transgenů ze vzorků krve potkanů (Rychlik et al., 1990). 44

5.2.3

Detekce DNA potkanů v izolátu z krve

Po tom, co byla optimalizována PCR pro primery Gapdh, byla provedena detekce tohoto specifického fragmentu DNA potkanů v izolátu DNA. PCR byla provedena celkem se 14 vzorky. 6 vzorků byla DNA potkanů ze skupiny krmené pšenicí Konini a dalších 6 vzorků byla DNA jedinců z kontrolní skupiny. Poslední 2 vzorky, krmivo Konini a krmivo kontrola. Cílem této PCR bylo dokázat, že izoláty skutečně obsahují DNA potkanů a PCR pro tento specifický pár primerů je správně optimalizovaná (Obrázek 9).

Obrázek 9

Výsledné zobrazení PCR provedené s DNA potkanů a kontrolní DNA krmiva a primery specifickými pro DNA gen potkana Gapdh při annealingové teplotě 60 °C.

Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P5, 2) P11, 3) P12, 4) P14, 5) P22, 6) P26, 7) P34, 8) P42, 9) P45, 10) P49, 11) P53, 12) P59, 13) krmivo Konini, 14) krmivo kontrola.

Z výše zobrazeného gelu je zřejmé, že vzorky DNA krmiva, jež byly použity jako kontrola (jamky č. 13 a 14), neobsahují DNA potkanů. Na gelu není zřetelný žádný fragment. Naopak je jasné, že vzorky DNA izolované z krve potkanů skutečně DNA potkanů obsahují. Vzorek nanesený do jamky č. 8 nebyl ve směsi pro PCR amplifikován, jelikož nevidíme 118bp dlouhý fragment jako u ostatních vzorků. Tato chyba mohla být způsobena jednak chybou při přípravě mastermixu pro PCR, nepřidáním templátové DNA do PCR nebo nebyla DNA ve vzorku P42 dostatečně koncentrovaná nebo byla příliš znečištěná. Pro potvrzení, že všechny získané izoláty 45

obsahují skutečně DNA potkanů, bylo provedeno opakování PCR s primery specifickými pro jejich DNA. K tomuto účelu vylo vybráno pouze 5 vzorků zahrnujících vzorek P42, který nebyl během předchozí PCR amplifikován (Obrázek 10). Parametry PCR byly nastaveny na stejné hodnoty jako u předchozí PCR.

Obrázek 10 Výsledek PCR vybraných vzorků DNA potkana a primery specifickými pro DNA potkana gen Gapdh. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P34, 2) P42, 3) P45, 4) P49, 5) P53.

Z obou výše uvedených gelů vychází tvrzení, že u všech 12 vzorků bylo prokázáno, že obsahují DNA potkanů, což je důležité pro další analýzy. Na obrázku jsou patrné 118bp fragmenty DNA potkanů a vyplývá z něj, že vzorek P42, který byl umístěn do jamky č. 2, pravděpodobně nebyl při první PCR přenesen do reakční směsi nebo došlo k jeho nedostatečnému rozmražení či rozmíchání. K amplifikaci tak nedošlo kvůli

problému

při

přípravě

reakce

nikoliv

nebo její nekvalitě pro potřebné reakce.

46

nepřítomnosti

DNA

potkana

5.2.4

Detekce DNA z krmiva v DNA potkanů

Po průkazu DNA potkana ve všech vzorcích byla provedena samotná detekce rostlinné DNA v krvi zkoumaných potkanů. Pro tuto analýzu bylo použito 12 vzorků obsahujících izolát DNA potkanů a jako pozitivní kontrola byly použity vzorky obsahující izolovanou DNA kontrolního krmiva a krmiva obsahujícího Konini. Ke stanovení byly nejprve použity primery pro gen Gapdh (Obrázek 11) a následně primery Actin (Obrázek 12). Parametry PCR byly nastaveny podle předchozí optimalizace. Teplota annealingu pro primery Gapdh byla 60 °C a teplota annealingu primerů Actin byla 62 °C. Byly použity všechny vzorky, u kterých bylo primárně určeno, že obsahují dostatečné množství DNA potkanů pro PCR.

Obrázek 11 Agarózový gel po vizualizaci, který zobrazuje výsledek opakování PCR vzorků DNA potkanů a krmiva při použití specifických primerů pro pšeničný gen Gapdh při annealingové teplotě 60 °C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P5, 2) P11, 3) 12, 4) P14, 5) P22, 6) P26, 7) P34, 8) P42, 9) P45, 10) P49, 11) P53, 12) P59, 13) krmivo Konini, 14) krmivo kontrola.

47

Obrázek 12 Agarózový gel po vizualizaci, který zobrazuje výsledek PCR vzorků DNA potkanů a krmiva při použití specifických primerů pro pšeničný gen Actin při annealingové teplotě 62 °C. Popis obrázku: M) velikostní marker, 1) P5, 2) P11, 3) P12, 4) P14, 5) P22, 6) P26, 7) P34, 8) P42, 9) P45, 10) P49, 11) P53, 12) P59, 13) krmivo Konini, 14) krmivo kontrola.

Pomocí PCR s těmito dvěma sadami primerů bylo stanoveno, že ani v jednom vzorku DNA potkana nebyla přítomna cizorodá DNA přenesená z krmiva. V jamkách 1–2 není patrný žádný PCR produkt, takže přítomná DNA nebyla amplifikována primery specifickými pro pšeničnou DNA. Naopak v jamkách 13 a 14 je na gelu zřetelný proužek DNA obsahující fragmenty DNA. Na obrázku 11 jsou vidět menší fragmenty o přibližné velikosti 400 bp odpovídající specifické amplifikaci použitých primerů Gapdh. Na obrázku 12 jsou patrné větší fragmenty o velikost 558 bp získané amplifikací pomocí primerů Actin. Tyto kontrolní produkty potvrzují, že PCR byla správně provedena a pokud by DNA potkanů obsahovala rostlinnou DNA, byla by zobrazena na těchto gelech. Cizorodá DNA nebyla získána ani u skupiny potkanů krmených běžnou pšenicí ani u druhé skupiny potkanů krmených pšenicí Konini s purpurovým zbarvením perikarpu. V provedeném krmném experimentu se potvrdilo, že tato pšenice neměla vliv na trávení, vstřebávání a prostup DNA z krmiva do krve a tkání modelových zvířat. Další stanovení v tkáních potkanů nebyla provedena, neboť z fyziologie trávicího traktu savců vyplývá, že látky prostupují z trávicího traktu nejprve do krve a až později do dalších orgánů jako jsou játra nebo svalovina.

48

Dosud nebyla provedena žádná krmná studie na potkanech, kde by byla využita netransgenní pšenice, a která by sledovala přenos cizorodé DNA z tohoto krmiva do krve a těla orgánů. Někteří autoři se však zabývali přenosem transgenní DNA z krmiva obsahujícího geneticky upravené plodiny. Kiliç & Akay (2008) použili ve své studii na potkanech krmnou dávku s přídavkem geneticky modifikované Bt kukuřice a sledovali její vliv na růst a zdravotní stav sledovaných zvířat. Jejich cílem nebyla identifikace transgenních fragmentů v krvi zvířat, ale sledovali primárně prospívání zvířat. Autoři nenalezli žádné náznaky zhoršení zdravotního stavu pokusné skupiny oproti zvířatům kontrolním. To potvrzuje ve své studii Tyshko et al. (2014), kteří došli k závěru, že krmivo s obsahem geneticky upravené kukuřice nemělo vliv na prospívání potkanů. Navíc zjistili, že zvířata nevykazovali žádné reprodukční problémy ani špatný zdravotní stav potomstva. Dá se říci, že jejich výsledky potvrzují výsledky této diplomové práce. Výsledky Grønsberg et al. (2011) jsou ovšem s tímto v rozporu. Tito autoři stopy plazmidové DNA (pDNA) přidané do krmiva, ve tkáních zkoumaných potkanů našli. Avšak dávka plazmidové DNA mohla být vyšší, než u přirozeného příjmu pDNA v průběhu trávení běžné krmné dávky. Navíc pDNA je výrazně odolnější vůči poškození, tudíž není při průchodu trávicího traktu tak dokonale štěpena jako jaderná DNA. Krmivo s odlišným genotypem nijak nepřispívá k prostupu cizorodé DNA z krmiva do modelových organismů, což by se mohlo projevit právě vlivem na zhoršení zdravotního stavu potkanů nebo jejich problémy s reprodukcí a prospíváním potomků. Nejčastějším modelovým organismem podobných krmných experimentů je drůbež, jak brojleři, tak snášející slepice. Výsledky jednotlivých experimentů u těchto ptáků jsou však rozporuplné. Dalo by se říci, že přibližně polovina autorů se přiklání k závěru, že DNA z krmiva přechází do tkání jedince a druhá polovina autorů tvrdí opak. Mezi těmito studie lze pozorovat společné znaky. Většina autorů nalezla nestrávené fragmenty rostlinné DNA v horní části trávicího traktu (Swiatkiewicz et al., 2010; El-Sanhoty, 2004; Rossi et al., 2005) a naopak nedetekovali DNA krmiva ve spodnějších částech trávicího traktu (Rossi et al., 2005). Tyto výsledky svědčí o tom, že k degradaci DNA přijímané v krmivu dochází průběžně během průchodu GIT, avšak na konci trávicího procesu dochází k úplné degradaci genetické informace. Když se takto trávené krmivo dostane do míst, kde dochází ke vstřebávání živin, cizorodá DNA je příliš degradována, aby mohlo docházet k prostupu molekul do krve 49

a jejich ukládání ve tkáních. Výsledky výzkumu Swiatkiewicz et al. (2010); Rossi et al. (2005) tuto tezi potvrzují. Naopak autoři Řehout et al. (2008); Einspanier et al. (2001) a El-Sanhoty (2004) detekovali přítomnost cizorodé DNA ve tkáních brojlerů. Všichni tito autoři používali k detekci cizorodé DNA metodu PCR s primery vybranými

pro

amplifikaci

specifického

úseku

rostlinného

podílu

krmiva

(GM kukuřice, GM sója respektive GM brambory). Pozitivní výsledky detekce pomocí PCR by mohly být způsobeny špatným výběrem primerů (pokud nebyly primery dostatečně specifické a amplifikovali živočišnou DNA), ale pravděpodobněji mohlo dojít ke kontaminaci vzorků živočišné DNA rostlinnou DNA během manipulace se vzorky. S výsledky krmných experimentů provedených na kuřatech korespondují závěry práce Korwin-Kossakowska et al. (2013), kteří použili jako modelového organismus křepelky. Jejich práci dodává na věrohodnosti, že použili 4 generace zvířat, ale u žádného

jedince

nenašli

stopy

cizorodé

DNA

pocházející

z geneticky

modifikované sóji. Výsledek jejich dlouhodobého experimentu tedy koresponduje s výsledky této DP. Pro simulaci chování transgenních plodin ve stravě člověka jsou prasata následována mléčným skotem a ovcemi. Krmné experimenty s těmito hospodářskými zvířaty jsou však finančně, časově i logisticky mnohem náročnější než pokusy s menšími zvířaty, proto jich nebylo provedeno příliš mnoho. Autoři Sharma et al. (2006); Phipps et al. (2003); Einspanier et al. (2001) a Guertler et al. (2010) se shodují v poznatcích, že rostlinná transgenní DNA procházející GIT není zcela degradována. Všichni autoři detekovali transgeny ve vzorcích odebraných z trávicího traktu nebo dokonce ve výkalech a v krvi některých pokusných zvířat. Pouze málo transgenní DNA bylo nalezeno v orgánech, žádná rostlinná DNA však nebyla přenesena do mléka dojnic. Přestože byla v těchto studiích využita jak přežvýkavá, tak nepřežvýkává zvířata, všichni autoři došli k podobnému závěru, že přenos DNA z krmiva do krve je možný, avšak ne příliš častý. A dále, že rostlinná DNA není během trávení zcela degradována. Rozdíly mezi výsledky na menších zvířatech a větších savců mohou být způsobeny odlišnou fyziologií trávicího traktu, delší dobou zpracování potravy a rozdílným množstvím krmné dávky.

50

6

ZÁVĚR

V současné

době

roste

podíl

geneticky

upravených

plodin

pěstovaných

pro potravinářské a krmivářské účely, takže je důležité získat co nejvíce poznatků týkajících se bezpečnosti jejich konzumace. Dosud však nebylo dostatečně prozkoumáno, co se v trávicím traktu lidí nebo živočichů děje s rostlinnou DNA přijatou v potravě či krmivu. V současné době neexistuje jednotné stanovisko, zda je možný

prostup

rostlinné

DNA

(popřípadě

transgenní

rostlinné

DNA)

z gastrointestinálního traktu do krve a dalších tkání živočichů. Mnoho vědeckých týmů provedlo krmné studie s různými živočichy, jimž byla do krmné dávky přidány geneticky modifikované plodiny. Přibližně polovina autorů došla k závěru, že přenos rostlinné DNA z krmiva do tkání živočichů je možný. Naopak druhá polovina autorů žádné fragmenty rostlinné DNA v odebraných vzorcích tkání pokusných živočichů nenašla. Cílem krmného experimentu a následných laboratorních analýz bylo vyvrátit či potvrdit hypotézu o možnosti přenosu DNA z pšenice dvou odrůd (Bohemia se standardním zbarvením a Konini s purpurovým perikarpem) využité jako krmiva do krve popřípadě tkání pokusných potkanů. U 12 náhodně vybraných vzorků krve (od 6 potkanů z každé skupiny) byla izolována DNA pomocí komerčního kitu. Postup izolace podle protokolu doporučeného výrobcem nebyl dostatečně efektivní, proto byl postup modifikován, aby docházelo k dokonalejší lýzi buněk. DNA byla rovněž izolována ze vzorků obou krmiv. Přítomnost DNA potkanů byla nejprve potvrzena pomocí PCR, pro niž byly vybrány primery amplifikujícími fragment genu Gapdh specifického pro potkany. Rovněž přítomnost pšeničné DNA byla potvrzená s využitím PCR se specifickými primery amplifikujícími fragment provozních genů Actin a Gapdh. Nakonec byla v několika opakováních provedena detekce přítomnosti pšeničné DNA s využitím PCR amplifikace s těmito primery pro pšeničné geny. Všechny PCR produkty byly vizualizovány pomocí agarózové elektroforézy. Výsledkem provedených pokusů bylo zjištění, že DNA pokusných zvířat neobsahovala žádné fragmenty cizorodé DNA, pocházející z krmné dávky. Pšeničná DNA nebyla nalezena v krvi potkanů ani jedné krmné skupiny a to jak při použití primerů amplifikujících oblast genu Actin, tak Gapdh.

51

Negativní výsledek detekce provedené v této práci koresponduje se zjištěními několika autorů provádějících podobné krmné studie s modelovými organismy a koresponduje s tvrzeními, že rostlinná DNA v krmivu je během průchodu trávicím traktem příliš degradována na to, aby mohla přecházet do tkání živočichů. Problematika transferu genetické informace z krmiva popřípadě potravy není ještě dostatečně prozkoumána, aby mohly být stanoveny jednoznačné závěry. Měly by být provedeny další krmné studie, které by přispěly k poznání osudu konzumované rostlinné DNA obsažené v krmivu. Mělo by být také blíže prozkoumáno, v jaké části trávicího traktu zvířat dochází k úplné degradaci DNA krmiva.

52

7

POUŽITÁ LITERATURA

ABDEL-AAL E.-S. M. S. M., YOUNG J. C. a RABALSKI I., 2006. Anthocyanin composition in black, blue, pink, purple, and red cereal grains. Journal of Agricultural and Food Chemistry. roč. 54, č. 13, s. 4696–4704. ISSN 00218561. AUMAITRE A., 2010. Safety assessment and feeding value for pigs, poultry and ruminant animals of pest protected (Bt) plants and herbicide tolerant (glyphosate, glufosinate) plants: interpretation of experimental results observed worldwide on GM plants. Italian Journal of Animal Science. roč. 3, č. 2, s. 107–121. ISSN 1594-4077. CORNELL H. a HOVELING A. W., 1998. Wheat: Chemistry and Utilization. CRC Press, Lancaster, Pennsylvánie, 426 s, ISBN 9781566763486. EFSA G. P. W. G. on A. F. T., 2008. Safety and nutritional assessment of GM plants and derived food and feed: The role of animal feeding trials. Food and Chemical Toxicology. 3., roč. 46, Supple, Safety and nutritional assessment of GM plants and derived food and feed: The role of animal feeding trials, s. S2–S70. ISSN 0278-6915. EINSPANIER R., KLOTZ A., KRAFT J., AULRICH K., POSER R., SCHWÄGELE F., JAHREIS G. a FLACHOWSKY G., 2001. The fate of forage plant DNA in farm animals: a collaborative case-study investigating cattle and chicken fed recombinant plant material. European Food Research and Technology. 1., roč. 212, č. 2, s. 129–134. ISSN 1438-2377, 1438-2385. EL-SANHOTY R. M. E. S., 2004. Quality control for foods produced by genetic engineering. in Diss.-Stelle (Technischen Universität Berlin), Berlin, 168 s. EL-SANHOTY R. M. E. S. S., EL-MAGED A. D. A. a RAMADAN M. F., 2006. Safety assessment of genetically modified potato Spunta: degradation of DNA in gastrointestinal tract and carryover to rat organs. Journal of Food Biochemistry. 10., roč. 30, č. 5, s. 556–578. ISSN 0145-8884. EYCHNER A. M., LEBO R. J. a ELKINS K. M., 2014. Comparison of proteases in DNA extraction via quantitative polymerase chain reaction. Analytical biochemistry. 4.9., roč. 478, s. 128–130. ISSN 1096-0309. GENEAID.COM, nedatováno. Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) GB100/GB300 | Geneaid [citován 16. březen 2015]. Dostupné z: http://www.geneaid.com/products/genomic-dna-purification/dna-extraction-kit-bloodcultured-cell-miniprep GIBBS R. A., WEINSTOCK G. M., METZKER M. L., MUZNY D. M., SODERGREN E. J., SCHERER S., SCOTT G., STEFFEN D., WORLEY K. C., BURCH P. E., OKWUONU G., HINES S., LEWIS L., DERAMO C., DELGADO O., DUGANROCHA S., MINER G., MORGAN M., HAWES A., GILL R., CELERA, HOLT R. A., ADAMS M. D., AMANATIDES P. G., BADEN-TILLSON H., BARNSTEAD M., CHIN S., EVANS C. A., FERRIERA S., FOSLER C., GLODEK A., GU Z., 53

JENNINGS D., KRAFT C. L., NGUYEN T., PFANNKOCH C. M., SITTER C., SUTTON G. G., VENTER J. C., WOODAGE T., SMITH D., LEE H.-M., GUSTAFSON E., CAHILL P., KANA A., DOUCETTE-STAMM L., WEINSTOCK K., FECHTEL K., WEISS R. B., DUNN D. M., GREEN E. D., BLAKESLEY R. W., BOUFFARD G. G., DE JONG P. J., OSOEGAWA K., ZHU B., MARRA M., SCHEIN J., BOSDET I., FJELL C., JONES S., KRZYWINSKI M., MATHEWSON C., SIDDIQUI A., WYE N., MCPHERSON J., ZHAO S., FRASER C. M., SHETTY J., SHATSMAN S., GEER K., CHEN Y., ABRAMZON S., NIERMAN W. C., HAVLAK P. H., CHEN R., DURBIN K. J., EGAN A., REN Y., SONG X.-Z., LI B., LIU Y., QIN X., CAWLEY S., WORLEY K. C., COONEY A. J., D’SOUZA L. M., MARTIN K., WU J. Q., GONZALEZ-GARAY M. L., JACKSON A. R., KALAFUS K. J., MCLEOD M. P., MILOSAVLJEVIC A., VIRK D., VOLKOV A., WHEELER D. A., ZHANG Z., BAILEY J. A., EICHLER E. E., TUZUN E., BIRNEY E., MONGIN E., URETAVIDAL A., WOODWARK C., ZDOBNOV E., BORK P., SUYAMA M., TORRENTS D., ALEXANDERSSON M., TRASK B. J., YOUNG J. M., HUANG H., WANG H., XING H., DANIELS S., GIETZEN D., SCHMIDT J., STEVENS K., VITT U., WINGROVE J., CAMARA F., MAR ALBÀ M., ABRIL J. F., GUIGO R., SMIT A., DUBCHAK I., RUBIN E. M., COURONNE O., POLIAKOV A., HÜBNER N., GANTEN D., GOESELE C., HUMMEL O., KREITLER T., LEE Y.-A., MONTI J., SCHULZ H., ZIMDAHL H., HIMMELBAUER H., LEHRACH H., JACOB H. J., BROMBERG S., GULLINGS-HANDLEY J., JENSEN-SEAMAN M. I., KWITEK A. E., LAZAR J., PASKO D., TONELLATO P. J., TWIGGER S., PONTING C. P., DUARTE J. M., RICE S., GOODSTADT L., BEATSON S. A., EMES R. D., WINTER E. E., WEBBER C., BRANDT P., NYAKATURA G., ADETOBI M., CHIAROMONTE F., ELNITSKI L., ESWARA P., HARDISON R. C., HOU M., KOLBE D., MAKOVA K., MILLER W., NEKRUTENKO A., RIEMER C., SCHWARTZ S., TAYLOR J., YANG S., ZHANG Y., LINDPAINTNER K., ANDREWS T. D., CACCAMO M., CLAMP M., CLARKE L., CURWEN V., DURBIN R., EYRAS E., SEARLE S. M., COOPER G. M., BATZOGLOU S., BRUDNO M., SIDOW A., STONE E. A., VENTER J. C., PAYSEUR B. A., BOURQUE G., LÓPEZ-OTÍN C., PUENTE X. S., CHAKRABARTI K., CHATTERJI S., DEWEY C., PACHTER L., BRAY N., YAP V. B., CASPI A., TESLER G., PEVZNER P. A., HAUSSLER D., ROSKIN K. M., BAERTSCH R., CLAWSON H., FUREY T. S., HINRICHS A. S., KAROLCHIK D., KENT W. J., ROSENBLOOM K. R., TRUMBOWER H., WEIRAUCH M., COOPER D. N., STENSON P. D., MA B., BRENT M., ARUMUGAM M., SHTEYNBERG D., COPLEY R. R., TAYLOR M. S., RIETHMAN H., MUDUNURI U., PETERSON J., GUYER M., FELSENFELD A., OLD S., MOCKRIN S. a COLLINS F., 2004. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. Nature. 4., roč. 428, č. 6982, s. 493–521. ISSN 0028-0836. GRØNSBERG I. M., 2011. Uptake and Organ Distribution of Feed Introduced Plasmid DNA in Growing or Pregnant Rats. Food and Nutrition Sciences. roč. 02, č. 04, s. 377– 386. ISSN 2157-944X. GROTEWOLD E., 2006. The science of flavonoids. Springer, Columbus, 274 s, ISBN 9780387288215.

54

GUERTLER P., PAUL V., STEINKE K., WIEDEMANN S., PREISSINGE W., ALBRECHT C., SPIEKERS H., SCHWARZ F. J. a MEYER H. H. D., 2010. Longterm feeding of genetically modified corn (MON810) — Fate of cry1Ab DNA and recombinant protein during the metabolism of the dairy cow. Livestock Science. roč. 131, č. 2–3, s. 250–259. ISSN 1871-1413. GUO W. a BETA T., 2013. Phenolic acid composition and antioxidant potential of insoluble and soluble dietary fibre extracts derived from select whole-grain cereals. Food Research International. 5., roč. 51, č. 2, s. 518–525. ISSN 0963-9969. HALLE I. a FLACHOWSKY G., 2014. A four-generation feeding study with genetically modified ( Bt ) maize in laying hens. Journal of Animal and Feed Science. č. 23, s. 58–63. HIMI E., MAEKAWA M. a NODA K., 2011. Differential Expression of Three Flavanone 3-Hydroxylase Genes in Grains and Coleoptiles of Wheat. International Journal of Plant Genomics. 9., roč. 2011, s. e369460. ISSN 1687-5370. HIMI E., NISAR A. a NODA K., 2005. Colour genes (R and Rc) for grain and coleoptile upregulate flavonoid biosynthesis genes in wheat. Genome / National Research Council Canada = Génome / Conseil National De Recherches Canada. 8., roč. 48, č. 4, s. 747–754. ISSN 0831-2796. HIMI E. a NODA K., 2005. Red grain colour gene (R) of wheat is a Myb-type transcription factor. Euphytica. 9., roč. 143, č. 3, s. 239–242. ISSN 0014-2336, 15735060. HOSSEINIAN F. S., LI W. a BETA T., 2008. Measurement of anthocyanins and other phytochemicals in purple wheat. Food Chemistry. 8., roč. 109, č. 4, s. 916–924. ISSN 03088146. HU C., CAI Y.-Z., LI W., CORKE H. a KITTS D. D., 2007. Anthocyanin characterization and bioactivity assessment of a dark blue grained wheat (Triticum aestivum L. cv. Hedong Wumai) extract. Food Chemistry. roč. 104, č. 3, s. 955–961. ISSN 0308-8146. CHALLACOMBE C. A., ABDEL-AAL E.-S. M., SEETHARAMAN K. a DUIZER L. M., 2012. Influence of phenolic acid content on sensory perception of bread and crackers made from red or white wheat. Journal of Cereal Science. 9., roč. 56, č. 2, s. 181–188. ISSN 0733-5210. INSTITUTE OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES, COMMISSION ON LIFE SCIENCES a NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1996. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academies Press, Washington D.C., 136 s, ISBN 0309-05377-3. JOHNSON M., 2012. Laboratory Mice and Rats. Materials and Methods. 10., roč. 2. ISSN 2329-5139.

55

KEENAN K. P., BALLAM G. C., HAUGHT D. G. a LAROQUE P., 2000. Chapter 5 – Nutrition. In: KRINKE G. J., ed. The Laboratory Rat. Elsevier Academic Press, USA, s. 57–75. ISBN 9780124264007. KILIÇ A. a AKAY M. T., 2008. A three generation study with genetically modified Bt corn in rats: Biochemical and histopathological investigation. Food and Chemical Toxicology. roč. 46, č. 3, s. 1164–1170. ISSN 02786915. KNIEVEL D. C., ABDEL-AAL E.-S. M., RABALSKI I., NAKAMURA T. a HUCL P., 2009. Grain color development and the inheritance of high anthocyanin blue aleurone and purple pericarp in spring wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Cereal Science. roč. 50, č. 1, s. 113–120. ISSN 0733-5210. KOOLHAAS J. M., 2010. The laboratory Rat. In: HUBRECHT R. a KIRKWOOD J., ed. The UFAW Handbook on the Care and Management of Laboratory and Other Research Animals, Eighth Edition. Wiley-Blackwell, Singapore, s. 311–326. ISBN 9781444318777. KORWIN-KOSSAKOWSKA A., SARTOWSKA K. a LINKIEWICZ A., 2013. Evaluation of the effect of genetically modified Roundup Ready soya bean and MON 810 maize in the diet of Japanese quail on chosen aspects of their productivity and retention of transgenic DNA in tissues. Archiv Tierzucht. roč. 56, č. 60, s. 597–606. ISSN 0003-9438. LANGNAESE K., JOHN R., SCHWEIZER H., EBMEYER U. a KEILHOFF G., 2008. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in a rat asphyxial cardiac arrest model. BMC molecular biology. roč. 9, s. 53. ISSN 1471-2199. LEWIS S. M., ULLREY D. E., BARNARD D. E. a KNAPKA J. J., 2006. Chapter 9 – Nutrition. In: SUCKOW M. A., WEISBROTH S. H. a FRANKLIN C. L., ed. The Laboratory Rat (Second Edition). Elsevier Academic Press, USA, s. 219–301. ISBN 9780120749034. MA D., SUN D., WANG C., LI Y. a GUO T., 2014. Expression of flavonoid biosynthesis genes and accumulation of flavonoid in wheat leaves in response to drought stress. Plant Physiology and Biochemistry. roč. 80, s. 60–66. ISSN 0981-9428. MA Q., GAO C., ZHANG J., ZHAO L., HAO W. a JI C., 2013. Detection of Transgenic and Endogenous Plant DNA Fragments and Proteins in the Digesta, Blood, Tissues, and Eggs of Laying Hens Fed with Phytase Transgenic Corn. PLoS ONE. roč. 8, č. 4, s. 1–10. ISSN 19326203. MARTINEK P., JIRSA O. O., VACULOVÁ K. K., CHRPOVÁ J., WATANABE N., BUREŠOVÁ V., KOPECKÝ D., ŠTIASNA K., VYHNÁNEK T., TROJAN V., KOPECKY D., STIASNA K., VYHNÁNEK T. a TROJAN V., 2013. Use of wheat gene resources with different grain colour in breeding. In: 64. Tagung der Vereinigung der Pflanzenzüchter und Saatgutkaufleute Österreichs. s. 75 – 78. ISBN 9783902849007.

56

MARTINEK P., VYHNÁNEK T., PODHORNÁ J., NOVOTNÁ P., VACULOVÁ K., KADLÍKOVÁ M., JIRSA O. a KUREČKA R., 2011. Pšenice s odlišným zabarvením zrna a možnost jejich využití v potravinářství. Úroda, vědecká příloha časopisu. roč. 2011, č. 12, s. 117 – 123. ISSN 0139-6013. NCBI, nedatováno. National Center for Biotechnology Information [citován 3. duben 2015]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PASQUALONE A., BIANCO A. M., PARADISO V. M., SUMMO C., GAMBACORTA G., CAPONIO F. a BLANCO A., 2015. Production and characterization of functional biscuits obtained from purple wheat. Food Chemistry. 8., roč. 180, s. 64–70. ISSN 0308-8146. PHIPPS R. H., DEAVILLE E. R. a MADDISON B. C., 2003. Detection of Transgenic and Endogenous Plant DNA in Rumen Fluid, Duodenal Digesta, Milk, Blood, and Feces of Lactating Dairy Cows. Journal of Dairy Science. 12., roč. 86, č. 12, s. 4070– 4078. ISSN 0022-0302. PICODROP.COM, nedatováno. No Title [citován 30. březen 2015]. Dostupné z: http://www.picodrop.com/index.asp POZNIAK C. J., KNOX R. E., CLARKE F. R. a CLARKE J. M., 2007. Identification of QTL and association of a phytoene synthase gene with endosperm colour in durum wheat. TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik. 2., roč. 114, č. 3, s. 525–537. ISSN 0040-5752. PRIMER-BLAST, nedatováno. Primer designing tool [citován 1. duben 2015]. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ PRUGAR J. a KOLEKTIV autorů, 2008. Kvalita rostlinných produktů na prahu 3. tisíciletí. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský ve spolupráci s Komisí jakosti rostlinných produktů ČAZV, Praha, 327 s, ISBN 978-80-86576-28-2. QIAGEN.COM, nedatováno. DNeasy Plant Mini Kit - QIAGEN [citován 21. březen 2015]. Dostupné z: https://www.qiagen.com/cz/products/catalog/sampletechnologies/dna-sample-technologies/genomic-dna/dneasy-plant-minikit/#orderinginformation RICHARDSON A. J., NARENDRAN N., GUYMER R. H., VU H. a BAIRD P. N., 2006. Blood storage at 4 degrees C-factors involved in DNA yield and quality. The Journal of laboratory and clinical medicine. 6., roč. 147, č. 6, s. 290–4. ISSN 00222143. RODRIGUES L., MOUTA R., COSTA A. R., PEREIRA A., CAPELA E SILVA F., AMADO F., ANTUNES C. M. a LAMY E., 2015. Effects of high fat diet on salivary αamylase, serum parameters and food consumption in rats. Archives of Oral Biology. roč. 60, č. 6, s. 854–862. ISSN 0003-9969.

57

ROGERS A. E., 1979. Chapter 6 - Nutrition. In: BAKER H. J., LINDSEY J. R. a WESIBROTH S. H., ed. The Laboratory Rat: Volume I Biology and Diseases. Academic Press Inc, USA, s. 123–152. ISBN 9781483268613. ROSSI F., MORLACCHINI M., FUSCONI G., PIETRI a, MAZZA R. a PIVA G., 2005. Effect of Bt corn on broiler growth performance and fate of feed-derived DNA in the digestive tract. Poultry science. roč. 84, č. 7, s. 1022–1030. ISSN 0032-5791. ROUX K. H., 2009. Optimization and troubleshooting in PCR. Cold Spring Harbor protocols. 1.4., roč. 2009, č. 4, s. 2274–2275. ISSN 1559-6095. RYCHLIK W., SPENCER W. J. a RHOADS R. E., 1990. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic acids research. roč. 18, č. 21, s. 6409–6412. ISSN 0305-1048. ŘEHOUT V., HANUSOVÁ L., KADLEC J., ČÍTEK J. a HOSNEDLOVÁ B., 2008. Detection of DNA fragments from roundup ready soya and Bt maize in organs of broilers. Journal of Agrobiology. roč. 25, s. 141–144. ISSN 1803-4403. SANDEN M., BRUCE I. J., RAHMAN M. A. a HEMRE G. I., 2004. The fate of transgenic sequences present in genetically modified plant products in fish feed, investigating the survival of GM soybean DNA fragments during feeding trials in Atlantic salmon, Salmo salar L. Aquaculture. roč. 237, č. 1-4, s. 391–405. ISSN 00448486. SHARMA G. M. a RALLABHANDI P., 2015. Chapter 36 -The Effects of Processing on Gluten from Wheat, Rye, and Barley, and its Detection in Foods. In: PREEDY V. R., ed. Processing and Impact on Active Components in Food. Elsevier Academic Press, USA, s. 303–308. ISBN 9780124046993. SHARMA R., DAMGAARD D., ALEXANDER T. W., DUGAN M. E. R., AALHUS J. L., STANFORD K. a MCALLISTER T. a., 2006. Detection of transgenic and endogenous plant DNA in digesta and tissues of sheep and pigs fed roundup ready canola meal. Journal of Agricultural and Food Chemistry. roč. 54, č. 5, s. 1699–1709. ISSN 00218561. SHOEVA O. Y., GORDEEVA E. I. a KHLESTKINA E. K., 2014. The regulation of anthocyanin synthesis in the wheat pericarp. Molecules (Basel, Switzerland). roč. 19, č. 12, s. 20266–20279. ISSN 1420-3049. SCHUBBERT R., LETTMANN C. a DOERFLER W., 1994. Ingested foreign (phage M13) DNA survives transiently in the gastrointestinal tract and enters the bloodstream of mice. Molecular and General Genetics MGG. 3., roč. 242, č. 5, s. 495–504. ISSN 0026-8925. SINGH A. K., REIMER S., POZNIAK C. J., CLARKE F. R., CLARKE J. M., KNOX R. E. a SINGH A. K., 2009. Allelic variation at Psy1-A1 and association with yellow pigment in durum wheat grain. TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik. 5., roč. 118, č. 8, s. 1539–1548. ISSN 1432-2242. 58

SNELL C., BERNHEIM A., BERGÉ J. B., KUNTZ M., PASCAL G., PARIS A. a RICROCH A. E., 2012. Assessment of the health impact of GM plant diets in long-term and multigenerational animal feeding trials: A literature review. Food and Chemical Toxicology. Elsevier Ltd,B.m., roč. 50, č. 3-4, s. 1134–1148. ISSN 02786915. SUBCOMMITTEE ON LABORATORY ANIMAL NUTRITION, COMITTEE ON ANIMAL NUTRITION, BOARD ON AGRICULTURE a NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1995. Nutrient Requirements of Laboratory Animals, Fourth Revised Edition. National Academies Press, Washington D.C., 192 s, ISBN 9780309051262. SWIATKIEWICZ S., TWARDOWSKA M., MARKOWSKI J., MAZUR M., SIERADZKI Z. a KWIATEK K., 2010. Fate of transgenic DNA from Btcorn and Roundup Ready soyabean meal in briolers fed GMO feed. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy. roč. 54, s. 237–242. ISSN 0042-4870. TROJAN V., MUSILOVÁ M., VYHNÁNEK T., KLEJDUS B., HANÁČEK P. a HAVEL L., 2014. Chalcone synthase expression and pigments deposition in wheat with purple and blue colored caryopsis. Journal of Cereal Science. 1., roč. 59, č. 1, s. 48–55. ISSN 0733-5210. TUDISCO R., LOMBARDI P., BOVERA F., DˇANGELO D., CUTRIGNELLI M. I., MASTELLONE V., TERZI V., AVALLONE L. a INFASCELLI F., 2006. Genetically modified soya bean in rabbit feeding: detection of DNA fragments and evaluation of metabolic effects by enzymatic analysis. Animal Science. 4., roč. 82, č. 02, s. 193–199. ISSN 1748-748X. TYSHKO N. V., ZHMINCHENKO V. M., SELYASKIN K. E., PASHORINA V. A., UTEMBAEVA N. T. a TUTELYAN V. A., 2014. Assessment of the impact of genetically modified LibertyLink® maize on reproductive function and progeny development of Wistar rats in three generations. Toxicology Reports. roč. 1, s. 330–340. ISSN 2214-7500. VARGA M., BANHIDY J., CSEUZ L. a MATUZ J., 2013. The Anthocyanin Content of Blue and Purple Coloured Wheat Cultivars and their Hybrid Generations. Cereal Research Communications. 6., roč. 41, č. 2, s. 284–292. ISSN 0133-3720. VAVREČKA J. a PROCHÁZKOVÁ J., 2003. Efekt různých bílkovinných komponentů v krmných směsích na růst modelových zvířat. In: CERKAL R. a STŘEDA T., ed. MZLU v Brně, Brno, s. 77. ISBN 80-7157-723-5. WILFINGER W. W., MACKEY K. a CHOMCZYNSKI P., 1997. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 3., roč. 22, č. 3, s. 474–6, 478–81. ISSN 0736-6205. WOODWARD J., 2011. Coeliac disease. Medicine. 3., roč. 39, č. 3, Gastroenterology Part 2 of 4, s. 173–177. ISSN 1357-3039.

59

ZDZIARSKI I. M. M., EDWARDS J. W. W., CARMAN J. A. A. a HAYNES J. I. I., 2014. GM crops and the rat digestive tract: A critical review. Environment International. 12., roč. 73, s. 423–433. ISSN 0160-4120. ZEMAN L., 2006. Výživa a krmení hospodářských zvířat. 1. vyd. Profi Press, Praha, 360 s, ISBN 80-86726-17-7. ZHANG W. a DUBCOVSKY J., 2008. Association between allelic variation at the Phytoene synthase 1 gene and yellow pigment content in the wheat grain. TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik. 3., roč. 116, č. 5, s. 635–645. ISSN 0040-5752. ZIMOLKA J., 2005. Pšenice: pěstování, hodnocení a užití zrna. 1. vyd. Profi Press, Praha, 179 s, ISBN 80-86726-09-6.

60

8

SEZNAM OBRÁZKŮ

Obrázek 1

Biosyntetická dráha flavonoidů. ................................................................ 13

Obrázek 2

Podélný řez obilkou pšenice. ..................................................................... 14

Obrázek 3

Transkripce genu TaMyc1 v perikarpu pšenice s různými kombinacemi alel Pp. ....................................................................................................... 15

Obrázek 4

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 60 °C. ................................ 39

Obrázek 5

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 58 °C. ................................ 41

Obrázek 6

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 60 °C. ................................ 42

Obrázek 7

Gel získaný po PCR při annealingové teplotě 58 °C. ................................ 43

Obrázek 8

Vizualizace agarózového gelu po gradientové PCR pro primery pšeničného genu Actin pro optimalizaci annealingové teploty. ................ 44

Obrázek 9

Výsledné zobrazení PCR provedené s DNA potkanů a kontrolní DNA krmiva a primery specifickými pro DNA gen potkana Gapdh při annealingové teplotě 60 °C. ....................................................................... 45

Obrázek 10

Výsledek PCR vybraných vzorků DNA potkana a primery specifickými pro DNA potkana gen Gapdh. ................................................................... 46

Obrázek 11

Agarózový gel po vizualizaci, který zobrazuje výsledek opakování PCR vzorků DNA potkanů a krmiva při použití specifických primerů pro pšeničný gen Gapdh při annealingové teplotě 60 °C. ......................... 47

Obrázek 12

Agarózový gel po vizualizaci, který zobrazuje výsledek PCR vzorků DNA potkanů a krmiva při použití specifických primerů pro pšeničný gen Actin při annealingové teplotě 62 °C. ................................................................. 48

61

9

SEZNAM TABULEK

Tabulka 1

Předpokládané množství minerálních látek potřebných pro správný růst laboratorních potkanů v krmivu obsahujícím 90 % sušiny. ...................... 19

Tabulka 2

Předpokládané množství vitamínů potřebných pro správný růst laboratorních potkanů v krmivu obsahujícím 90 % sušiny. ...................... 19

Tabulka 3

Shrnutí krmných studií zabývajících se přenosem transgenní DNA z krmiva do tkání modelových zvířat. ....................................................... 26

Tabulka 4

Zastoupení jednotlivých látek v krmivu zjištěných pomocí laboratorní analýzy. ...................................................................................................... 30

Tabulka 5

Jednotlivé složky a jejich objem použité pro PCR jednoho vzorku. ......... 34

Tabulka 6

Časový a teplotní profil PCR pro gen Gapdh. ........................................... 35

Tabulka 7

Časový a teplotní profil PCR pro gen Actin. ............................................. 35

Tabulka 8

Koncentrace a čistota DNA izolované z krve potkanů a ze vzorků krmiva měřená spektrofotometricky. ..................................................................... 37

62

10 SEZNAM ZKRATEK 40S

gen kódující ribozomální protein u kapra

AA

(antioxidative activity) – antioxidační aktivita

Actin

gen pro pšeničný aktin

ANS

(anthocyanidin synthase) – athokyanidinsyntáza

Ba

gen zodpovědný za modrou barvu obilky pšenice

Bt kukuřice

kukuřice s vloženým genem půdní bakterie Bacillus thuringiensis

CGH1

gen kódující růstový hormon u kuřete

Cp4 epsps

gen z bakterie Agrobacterium tumefaciens kmene CP4

Cry1Ab

kódující produkci proteinu dávající rostlině odolnost vůči škůdcům

DFR

(dihydroflavonol 4-reductase) – dihydroflavonol 4-reduktáza

dNTP

deoxyribonukleotid trifosfát

dATP

deoxyadenosin trifosfát

dCTP

deoxycytidin trifosfát

dGTP

deoxyguanosin trifosfát

dTTP

deoxythymidin trifosfát

EFA

(essential fatty acids) – esenciální mastné kyseliny

EFSA

European Food Safety Authority

EtBr

Ethidium bromid

F3H

(flavonoid 3-hydroxylase) – flavono 3-hydroxyláza

FS

(flavone synthase) – flavonsyntáza

Gapdh

gen pro glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu u potkana, gen pro cytosolickou glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu u pšenice

GIT

(gastrointestinal tract) – gastrointestinální trakt

GMO

(genetically modified organisms) – geneticky modifikované organismy

CHI

(chalcone isomerase) – chalkonizomeráza 63

CHS

(chalcone synthase) – chalkonsyntáza

MYB

(myeloblastosis) – DNA vázající doména

MYC

typ transkripčního faktoru

NCBI

(National Centre for Biotechnology Information) - sdružující databáze Národní centrum pro biotechnologické informace

NL

dusíkaté látky

NSP

(non-starch polysaccharides) – neškrobové polysacharidy

pDNA

plazmidová DNA

Pp

gen zodpovědný za purpurovou barvu obilky pšenice

Psy

gen zodpovědný za biosyntézu karotenoidů a žlutou barvu obilky pšenice

PTC

fytáza transgenní kukuřice

PUFA

(Polyunsaturated fatty acids) – polynenasycené mastné kyseliny

QTL

(Quantitative trait loci) – lokus kvantitativních vlastností

R-1

gen zodpovědný za červenou barvu obilky pšenice

Rbc

gen pro rubulózu-1,5-bifosfátkarboxylázu/oxygenázu

ROS

(reactive oxygen species) reaktivní volné radikály

Rpl13a

gen pro ribozomální protein L13A

RPM

(revolutions per minute) – počet otáček za minutu

RR

(Roundup Ready) – GM plodina odolná vůči glyfosátu

TAC

(total anthocyanin content) – celkové množství akthokyanů

TAE pufr

Tris-acetátový pufr

TaMyc1

gen kódující transkripční faktor typu MYC

Taq polymeráza

polymeráza získávaná z bakterie Thermus aquaticus

TPC

(total phenolic content) – celkové množství fenolických látek

UV záření

(ultraviolet) – ultrafialové záření

Zein

gen pro prolamin vyskytující se u kukuřice

64