BIOSENZORY
• Senzory snímají zvolenou fyzikální, chemickou, elektrickou, mechanickou, optickou nebo jinou veličinu v určité formě, například: – změna tvaru (deformace) – změna elektrického odporu, kapacity, … – změn intenzity světelného toku – frekvence vibrací – změna charakteru akustických vln
Senzory – příklad člověk • Senzor – uši, nos, hmat, jazyk, oči • Převodník – mozek převádí analogové vjemy na elektrické signály, které dále zpracovává • Akční člen – ruce, nohy provedou analogový výstup (pohyb) na základě elektrického signálu dodaného mozkem
Senzory – příklad, kardiostimulátor • Senzor – elektroda, detekuje elektrické pulsy na srdci • Převodník – tělo kardiostimulátoru – analyzuje tepovou frekvenci a rozhoduje o úpravě rytmu • Akční člen – elektrody – vydávají elektrické pulsy, a tak stimulují nebo upravují srdeční činnost
BIOSENZORY IUPAC: A self-contained integrated device which [sic] is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element WIKIPEDIA: A biosensor is an analytical device, used for the detection of an analyte, that combines a biological component with a physicochemical detector.
2 základní části: bio- element a sensor-element
Princip:
Vzorek
Biologický rozpoznávací prvek
Převodník
SIGNÁL
VZOREK: cokoliv co je nějakým způsobem spojené s bio (živou přírodou) BIOLOGICKÝ ROZPOZNÁVACÍ PRVEK: rozeznává analyt/target (molekulu, buňku, …), který se snažíme detekovat PŘEVODNÍK (TRANSDUCER): schopen převést informaci o rozpoznání hledané molekuly na měřitelnou veličinu (resonantní, optické, elektrochemické,…)
Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures, Sensors 2008, 8, 1400-1458
UPLATNĚNÍ: 1. Quality assurance in agriculture, food and pharmaceutical industries (E. Colli, Salmonella) 2. Monitoring environmental pollutants and biological warfare agents (Bacillus anthracis) 3. Medical diagnostics (glukóza) 4. Biological assays (DNA microarrays) Typy biosenzorů: 1. Katalytické: zařízení, které měří koncentraci chemické složky vzniklé či zaniklé díky biokatalytické aktivitě (enzymy, microorganismy, organely, tkáně) 2. Afinitní biosenzory: receptor specificky váže molekulu, což způsobuje fyzikálně-chemickou změnu na převodníku receptory: protilátky, nukleové kysliny, receptory hormonů - detekce molekul biologického původu na základě specifických interakcí ENZYMATICKÝ BIOSENZOR
Analyt = chemický či biologický target Polopropustná membrána: upřednostňuje průchod analytu (zabraňuje zanášení) Rozpoznávací element: specifická interakce Polopropustná membrána 2: upřednostňuje průchod produktu specifické interakce Elektrolyt: iontově vodivé médium Převodník: detekce události rozpoznání převodem na měřitelnou veličinu
TYPY ROZPOZNÁVACÍCH (specifických) PRVKů: 1. Enzymy 2. Protilátky 3. Nukleové kyseliny (aptamery) 4. 5. 6. 7.
Buňky Tkáně Polysacharidy MIP
Monoklonální vs. polyklonální
Enzymy
- Biokatalyzátory - Specifické vůči substrátu (S + E ----> SE ----> P + E)
- Komerčně dostupné biosenzory: glukóza, laktát, alkohol, sukróza, galaktóza, uric acid, alfa amyláza, cholin, L-lysin = všechny amperometrické O2 / H2O2) Glucose + O2 + H2O ------> Gluconic acid +H2O2 H2O2 -----> O2 + 2H+ + 2e- (proud na anodě) Afinitní: nejčastěji protilátky a fragmenty nukleových kyselin Molecularly imprinted polymers: PRINCIP: Zámek a klíč
IMOBILIZACE ROZPOZNÁVACÍCH PRVKů: Fyzikální adsorpce (Van der Waalsovy síly, hydrofobní síly, vodíkové vazby, iontové vazby) Kovalentní vazba Uchycení v membráně nebo např. polymerní matrici Kovalentní vazba: funkční skupiny –NH2 -COOH –SH –COH (crosslinking chemistry) Invitrogen:
Self-assembled monolayers: např. thioly na kovech, především zlatě
- Molekulární vrstva spontánně vytvořená na nějakém povrchu (adsorpcí) a uspořádaná do více či méně organizovaných domén
Senzor - vlastnosti • Citlivost – minimální velikost měřené veličiny (např. koncentrace) k dosažení požadované hodnoty výstupního signálu (například nárůstu absorbance) • Dolní detekční limit – nejnižší hodnota veličiny, kterou je senzor schopen rozlišit od pozadí • Horní detekční limit – nejvyšší hodnota veličiny, kterou je senzor schopen detekovat • Dynamický rozsah – poměr mezních hodnot, které je senzor schopen změřit • Reprodukovatelnost – opakovatelnost měření – statistické vyhodnocení
OPTICKÉ BIOSENZORY
„Optical Transducers“, optické převodníky •
zdroj
Luminiscenční - fotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - chemiluminiscenční (emise světla následkem chemické reakce)
světlo
vzorek
- bioluminiscenční (emise následkem biochemické reakce)
•
SPR (surface plasmon resonance)
•
Absorpční (málo využívané – krátká optická dráha v mikrosystémech)
světlo
čidlo
Luminiscence • Uvolňování energie ve formě světla. • Luminiscence vzniká působením elektrického pole, chemickou reakcí, přeměnou mechanické energie, při fázové přeměně aj.
Typy luminiscence • • • • •
•
• • •
Bioluminescence, by a living organism Chemoluminescence, resulting of a chemical reaction – Electrochemiluminescence, by an electrochemical reaction Crystalloluminescence, produced during crystallization Electroluminescence, in response to an electric current passed through it – Cathodoluminescence, where beam of electrons impacts on a luminescent material such as a phosphor Mechanoluminescence, resulting from any mechanical action on a solid – Triboluminescence, generated when bonds in a material are broken when that material is scratched, crushed, or rubbed – Fractoluminescence, generated when bonds in certain crystals are broken by fractures – produced by the action of pressure on certain solids[1] Photoluminescence, absorption of photons causing re-radiation of photons – Phosphorescence, delayed re-radiation – Fluorescence, where the emitted photons are of lower energy than those absorbed Radioluminescence, produced in a material by the bombardment of ionizing radiation Sonoluminescence, from imploding bubbles in a liquid when excited by sound Thermoluminescence, when absorbed light is re-emitted on heating
Princip fluorescence: (http://www.uni-leipzig.de/~pwm/web/?section=introduction&page=fluorescence)
GFP
Fluorescence • Fluorofor absorbuje světlo určité vlnové délky a emituje světlo s delší vlnovou délkou. Fluorescein – absorbuje modré 480 nm, uvolňuje zelené 520 nm. • Fluorofory – organické látky, proteiny (GFP), kvantové tečky • U látek, které přirozeně nefluoreskují je fluorofor kovalentně vázán na detekovanou látku (značka) • Problém – pokles intenzity fluorescence při dlouhodobé excitaci vlivem strukturních změn molekul (neplatí pro kvantové tečky) Absorpční a emisní spektrum FITC nejběžnější fluorofor
Absorpční a emisní spektrum GFP
Emisní spektra kvantových teček o velkosti 2 nm (modré) – 5 nm (červené). Excitace světlem 365 nm.
Fluorescenční spektroskopie
Zdroj – výbojka, dioda nebo laser Optické filtry Detektor – spektrofotometr, fotonásobič
Kvalitativní i kvantitativní
ELISA in a microfluidic chip
fluorescein di-b-D-galactopyranoside (FDG) – nefluoreskující substrát Ultrasensitive microfluidic solid-phase ELISA using an actuatable microwell-patterned PDMS chip, Lab Chip, 2013, 13, 4190
Fluorescence lifetime imaging • Pulsní zdroj (dioda, laser LIF) • Intenzita fluorescence po vypnutí zdroje klesá exponenciálně (pokud byl puls velmi krátký) • Intenzita emise je závislá na okolním prostředí – pH, obsah kyslíku, koncentrace iontů • Využití zejména v biologii
Chemiluminiscence • Chemická (biochemická) reakce spojená s uvolněním světelného kvanta • Příklad – enzym peroxidáza katalyzuje přeměnu luminolu v alkalickém prostředí • Peroxidáza bývá využívaná jako enzymová značka různých proteinů (například protilátek) 2H2O2 + Luminol + OH- 3-aminoftalát + N2 + 3H2O + hn - Luminol ve forenzní analýze
Chemiluminiscenční detekce aminokyselin v mikrofluidním čipu
Dansylace
Elektroforetická separace glycinu a lysinu značených dansylem a následná chemiluminiscenční kvantifikace. Reakce aminoskupin dansylu a aminokyseliny s oxidačním činidlem vede k intenzivní chemiluminiscenci.
Dansyl chloride – značka navázaná na aminokyseliny
bis[(2-(3,6,9-trioxadecanyloxycarbony)-4-nitrophenyl]oxalate + H2O2 + dansyl-amino acids hn Hashimoto et al., Journal of Chromatography A 867, 2000, 271-279
Bioluminiscence • Zvláštní forma chemiluminiscence, která nastává v živých organizmech. • Je spjatá s enzymovými reakcemi zprostředkovávající přenos energie, zejména ATP a NADH. • Enzym luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu za současného uvolnění fotonů. • Pozorováno například u světlušek či mořských živočichů. ATP + Luciferin + O2 AMP + Oxyluciferin+ PP + CO2 + hn
Detekce ATP a metabolitů konjugovaných s ATP To analyze ATP, all channels and reservoirs were first filled with buffer. Buffer solution was then replaced by BL (bioluminiscence) solution in the BL reagent reservoir (BRR). Afterward, a vacuum was applied at the buffer waste reservoir (BWR) to drive the BL solution into the channel connecting to the BRR. Then the buffer solution in the sample reservoir (SR) was changed to sample.
The sample containing ATP or ATP conjugates was electroosmoticaly injected at the “cross”, delivered to the joint of “Y”, where it mixed and reacted with the BL reagent electroosmotically driven through one arm of “Y” from BRR, and then emitted luminescence in the stem of “Y” (1) Picking up log-phase E. coli cells from cell culture. (2) On-chip cell lysis and sample extraction. (3) Injection with gated mode. (4) Separation from cell background. (5) Mixing and reacting with BL reagent. (6) Result read-out.
Liu B.F. et al., ANALYTICAL CHEMISTRY 77, 573-578, 2005
Surface Plasmon Resonance • SPR (“surface plasmon resonance”) = Rezonance povrchových plazmonů, Povrchová plazmová rezonance – optický hranol s nanesenou vrstvou kovu (zlata) – zdrojový paprsek se v místě kovové vrstvy odráží a generuje povrchový plazmon, který se šíří podél rozhraní – navázání proteinu/DNA vede ke změně povrchového plazmonu a změně úhlu odraženého světla, které je detekováno
PRINCIP SPR - Resonantní oscilace vodivostních elektronů na rozhraní mezi materiálem s kladnou a zápornou permitivitou (resonance: přirozená frekvence oscilace elektronů = frekvence světla) - Stimulované světlem (elektromagnetické vlnění) - Povrchový plasmonový polariton = elektromagnetické vlnění které se šíří paralelně k rozhraní kov/dielektrikum (např. voda, vzduch) – senzitivní k tomu, co se děje na povrchu
Základní schéma zařízení
SPR – pro on-line stanovení kinetických konstant bioafinitních reakcí
SPR - paralelizace
Charakteristiky SPR –Výhody •Pracuje v reálném čase •Do určité míry standardizovaná metoda •Uživatelsky přátelské (komerční) systémy •Vhodné pro masivní použití •Metoda nevyužívající značení –Nevýhody •Vysoké investiční náklady (BIACORE 3000) •Vysoké provozní náklady – hranoly s kovovými vrstvami •Krátký prostorový dosah
Lokalizovaný povrchový plasmon (LSP) Uzavření povrchového plasmonu v nanočástici o velikosti odpovídající či menší než vlnová délka excitačního světla Efekty: 1. elektrické pole u povrchu částice je značně zesíleno (rychle klesá se vzdáleností od povrchu) 2. optické zhasnutí částice má maximum na frekvenci resonance plasmonu (pro kovové nanočástice ve viditelné oblasti = zesílení fluorescence)
Biosensing with plasmonic nanosensors, nature materials | VOL 7 | JUNE 2008 | www.nature.com/naturematerials
ELEKTROCHEMICKÉ BIOSENZORY
Elektrochemické senzory • Spojené s red-ox reakcí – přenos elektronů • Při detekci biologických molekul je v systému často zahrnut enzym katalyzující red-ox reakci – oxidoreduktáza (glukóza oxidáza, horseradish peroxidáza …) • Různé typy senzorů
– Ampérometrické (měření proudu za konstantního potenciálu) – Voltametrické (měření proudu za kontrolované změny potenciálu) – Potenciometrické (měření potenciálu elektrody při nulovém elektrickém proudu) – Vodivostní (měření vodivosti, pro enzymatické reakce – produkce nabitých složek nebo změna vodivosti na elektrodě v důsledku navázání biomolekuly) – kapacitní – Impedanční – Field-effect
Princip elektrochemických biosenzorů s enzymovou značkou
• Na elektrodě bývá umístěn polymerní (hydrofilní) film obsahující imobilizovanou oxidoreduktázu • Enzym katalyzuje přeměnu substrátu na produkty. • Polymerní film musí být elektricky vodivý – zprostředkovávat transfer elektronů mezi elektrodou a chemickou reakcí • Transfer elektronů je závislý na přítomnosti substrátu
Ampérometrický biosenzor – detekce DNA molekul Na elektrodu je vložen konstantní elektrický potenciál
Po navázání DNA s enzymem soybean peroxidázou v přítomnosti peroxidu vodíku dochází k redukci peroxidového aniontu a vzniku oxidované formy peroxidázy Redukovaná forma peroxidázy je obnovována pomocí přenašeče elektronů v hydrogelu – ionty osmia
Ionty osmia jsou redukovány elektrochemickou reakcí na povrchu elektrody Je zaznamenáván elektrický proud
Glukózový biosenzor: Leland C. Clark (1956): použil Pt elektrodu k detekci kyslíku - fyzikálně imobilizoval enzym glukózovou oxidázu (dialysis membrane) blízko Pt elektrody - Možné detekce: změna pH v důsledku vzniku glukonové kyseliny - Spotřeba O2: fluorophore detekce - Peroxid vodíku: elektrochemicky GOD
Glucose + O2 + H2O ------> Gluconic acid +H2O2 H2O2 -----> O2 + 2H+ + 2e- (proud na anodě) - Koncentrace glukózy se vyhodnocuje z měření - koncentrace kyslíku nebo peroxidu vodíku
- Amperometrická detekce: proud úměrný koncentraci glukózy
Ampérometrická detekce glukózy in-vivo
Možné implantování do těla pro kontinuální detekci hladiny cukru. Glukóza proniká selektivně propustnou membránou do senzoru. Glukóza je oxidována enzymem glukózooxidázou. Oxidovaná forma enzymu je obnovována elektronovým přenašečem, který odevzdává elektrony na elektrodě. Je vložen konstantní potenciál, je měřen elektrický proud.
Imunoanalýza na čipu spojená s elektrochemickou detekcí Na elektrodě jsou vázány receptory – protilátky. Je přiveden vzorek obsahující antigen a vzniká komplex Ab-Ag. Je přivedena sekundární protilátka obsahující enzym HRP. Je přiveden roztok obsahující peroxid vodíku a ortho-phenylenediamine - OPD. Peroxid vodíku vytváří s enzymem oxidovanou formu enzymu. Redukovaná forma se obnovuje oxidací OPD. Oxidovaná forma OPD se může redukovat příjmem elektronů z elektrody. Zaznamenáván je proud. K. Dill et al. / Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 736–742
Impedanční senzor – bezznačková elektrochemická metoda • Impedance – “zobecněný elektrický odpor“ – Odpor, který elektrický obvod klade průchodu elektrického proudu při vloženém napětí – Vkládán je obvykle harmonický AC signál – Vložen na obvod může být napěťový signál a měří se signál proudový nebo opačně
• Definice
𝑉 𝑡 𝑍= 𝐼 𝑡
– Impedance je obecně komplexní číslo – Zahrnuje v sobě informace o elektrickém odporu obvodu (například elektrická vodivost roztoku) a o kapacitanci kapacitorů v elektrickém obvodu (například charakter elektrických dvojvrstev u elektrod ponořených do elektrolytu)
Impedance • Elektrochemické impedanční senzory tvořených elektrodami ponořenými do roztoku elektrolytu/vzorku mohou sledovat: – změny v jádru elektrolytu • Při vysokých frekvencích se nestačí nabíjet elektrické dvojvrstvy u elektrod a obvod se chová jako klasický rezistor • Nulový fázový posun mezi napětím a proudem • Lze například stanovovat koncentrace v jádru elektrolytu či přítomnost makroskopických částic
– změny u povrchu elektrod • Při frekvencích nižších dochází k nabíjení elektrických dvojvrstev u povrchu elektrod • Fázový posun může dosáhnout až 90° • Změna u povrchu elektrod, například vazba biologické molekuly, může ovlivnit jak průchod elektrického proudu, tak i uchovávání elektrického náboje v EDL, což se projeví změnou impedance
Impedanční senzor – příklad • Na zlaté elektrodě jsou imobilizovány protilátky • Detekována je přítomnost Proteinu A ve vzorku (protein A se komplementárně váže k Fc doméně protilátky) • Sledovány jsou změny v impedančním spektru obvodu (závislost absolutní hodnoty impedance nebo reálné části impedance na frekvenci) • Pozorován je nárůst impedance („elektrického odporu“) s koncentrací proteinu A ve vzorku • Impedanční signál lze rovněž ovlivnit vazbou sekundárních značených protilátek, které ovlivňují elektrický odpor a kapacitanci v blízkosti elektrody
