Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií

Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1

Lokalizace jaderné DNA

2

http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html

DNA 

deoxyribonukleová kyselina



komplementární



antiparalelní 5´– 3´ a 3´– 5´



nese genetickou informaci



uložena převážně v chromozomech



tvořena dusíkatými bázemi:

A – adenin,T - tymin,C – cytosin,G – guanin 

pořadí 3 bází kóduje aminokyselinu v polypeptidovém řetězci

http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:ADN_animation.gif

4

Chromozomy   

v jádře buňky viditelné při dělení buňky uvnitř stočená DNA

http://www.tiricosuave.com/images/chromosome.jpg

5

mtDNA  

16 – 20 kb 37 genů  



rRNA tRNA

geny  „CO“ (c-oxidáza)  ND1 – ND6 (NADHdehydrogenáza)  geny pro ATPázy aj.

6

???   

 

z čeho izolujeme z krve z mléka z chlupu cena rutina

7

Metody pro izolaci nukleových kyselin 

Metody využívající rozdílné rozpustnosti  fenolová extrakce a etanolová nebo izopropanolová precipitace (srážení)  obecně rozšířené, široké aplikace  vhodné pro vysokomolekulární genomové NK



Centrifugace v hustotním gradientu  izopyknické centrifugace v gradientu CsCl  vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu  možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech



Metody adsorpční  DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky  vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malých fragmentů DNA 8

Fenol-chloroformová extrakce fenol – extrakce NK, denaturace proteinů do organické fáze chloroform – zlepšuje účinnost fenolové deproteinizace; organické rozpouštědlo – nemísí se s vodným roztokem buněčného lyzátu; dvě fáze – horní vodní, dolní organická) Postup: lyzace vzorku ve směsi guanidinu thiokyanátu a fenolu přidání chloroformu centrifugace rozdělení do fází precipitace izopropanolem peleta odmytí solí etanolem komerční roztoky:TRIzol, TRIReagent, RNAzol, RNABlue 9

Horní vodní fáze – RNA Střední fáze – prstenec DNA a proteinů Spodní organická fáze – DNA a proteiny

Centrifugace

11

Adsorpční metody   

rychlá metoda vysoký výtěžek (malé fragmenty) vysoká čistota 

Oxid křemičitý (kolonky) 



 





guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid



jodid sodný

Síla vazby závisí na 



chaotropní soli

typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) iontové síle pH roztoku

Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O 12

Mechanismus interakce DNA s „kolonkou“

13

Princip kolonové izolace 

lýze buněk



vysrážení DNA etanolem a navázání na křemíkovou membránu kolony



promývání navázané DNA



eluce – uvolnění promyté DNA z kolony do zkumavky 15

Stabilizace a uložení NK 

DNA   



dny při 4 °C týdny – měsíce při -20 °C roky při -70 °C

vzorky krve určené k izolaci DNA (RNA) 

odebrat do chelatačních roztoků (EDTA – kyselina etylendiaminotetraoctová)

  

skladovat obvykle 1-5 dní při 4-8 °C (DNA) dlouhodobě lze odběry skladovat při -20 °C vzorky určené k izolaci RNA zpracovat optimálně do 4 hodin 16

Stanovení koncentrace a kvality NK

Spektrofotometrické



nejzákladnější a nejméně informativní



nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm



stupeň čistoty NK se stanovuje z poměru abs. 260/280 nm

18

Real-time PCR 

PCR amplifikace v reálném čase



se zvyšujícím se množstvím amplifikovaného produktu narůstá signál porovnáváno se standardem





detekujeme množství NK v původním vzorku 19

Elektroforéza 

separace NK dle mobility v agarózových nebo polyakrylamidových gelech působením stejnosměrného elektrického pole



DNA (- náboj) migruje k anodě (+ náboj)

20

Agarózová elektroforéza 

horizontální



povaření agarózy v pufru (0,5 – 6%), „obarvení“ EtBr (např.)



ztuhnutí – gel



nanesení vzorků do jamek



elektroforéza 21

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/AMG1.12.gif

Nanášení vzorků

http://biotrek.rdrake.org/img/gallery/33electrophoresis1_training.jpg

23

Vizualizace 

např. fluorescenčně po ozáření UV světlem (312 nm)



Ethidium bromid



GoldStar



Sybr Green

http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg

24

NanoDrop 

analýza 0,5 – 2 µl vzorku

http://www.nanodrop.com/HowItWorks.aspx

25

NanoDrop 

analýza DNA, RNA i proteinů



velmi rychlá metoda



stanovení koncentrace, čistoty,

26

NanoDrop 

vzorek je napipetován na konec optického kabelu (přijímající vlákno)



pomocí druhého optického kabelu (zdrojové vlákno) se pak vytvoří kontakt se vzorkem



měření při vzálenosti 1 mm a 0,2 mm



zdrojem světla je pulsní xenonová lampa



je analyzováno světlo procházející vzorkem,



CCD detektor http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.7-users-manual-8.5x11.pdf

27

28

29

Izolační automaty -Automatizace

30

Renčín

Děkuji Vám za pozornost