SEJTES ELEMEK SZEREPE A TROMBUSKÉPZİDÉSBEN ÉS A TROMBOLÍZISBEN

SEJTES ELEMEK SZEREPE A TROMBUSKÉPZİDÉSBEN ÉS A TROMBOLÍZISBEN DOKTORI ÉRTEKEZÉS

DR. WOHNER NIKOLETT

SEMMELWEIS EGYETEM MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

Témavezetı: Dr. Kolev Kraszimir Hivatalos bírálók: Dr. Bodó Imre Dr. Prohászka Zoltán Szigorlati Bizottság elnöke: Dr. Rosivall László Szigorlati Bizottság tagjai: Dr. Kiss Róbert Dr. Kardon Tamás

Budapest 2011

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE…………………………………………………………..5 BEVEZETÉS…………..………………………………………………………………...6 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS……………………………….…………………………7 1.1. A véralvadás áttekintése……………………………………………………………...7 1.1.1. Az endotélsejt………………………………………………………………….7 1.1.2. A vérlemezke…………………………………………………………….…….8 1.1.3. A fehérvérsejt…………………………………………………….…………….9 1.1.4. A vörösvérsejt…….…………………………………………………………..10 1.1.5. A véralvadási kaszkád………….……………………………………………..10 1.1.6. A fibrinolízis………….………………………………………………………13 1.2. A VWF ……………………………………………………………………………...15 1.2.1. Szerkezet, szerep a hemosztázisban……….………………………………….15 1.2.2. VWF hasítása………………….……………………………………………...17 1.3. A mátrix metalloproteinázok szerkezete, funkciói………………………………….18 1.4. Az artériák struktúrája………………………………………………………………19 1.4.1. Tunica intima……………………….………………………………………...20 1.4.1.1. Kollagén…………….………………………………………………………20 1.4.1.2. Elasztin………….…………………………………………………………..21 1.4.1.3. Mikrofibrillumok…………………………….……………………………..22 1.4.1.4. Laminin……………….…………………………………………………….22 1.4.1.5. Glükózaminoglikánok……….……………………………………………...22 1.4.1.6. Fibronektin és trombospondin…………………….………………………..22 1.4.1.7. Vitronektin……………….………………………………………………..22 1.4.2. Tunica media…………………….……………………………………………23 1.4.3. Tunica adventitia………….…………………………………………………..23 2. CÉLKITŐZÉSEK………………………………………………..…………………..25 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK………………………………………..……………26 3.1. Humán a. iliaca keresztmetszet készítése…………………………………………...26 3.2. Áramlási kamra……………………………………………………………………...26

2

3.3. Az artéria keresztmetszetek elıkészítése perfúzió elıtt……………………………..28 3.4. Az érfalhoz kitapadt vérlemezkék láthatóvá tétele………………………………….28 3.5. Neutrofil granulocita preparátum készítése…………………………………………29 3.6. Vörösvérsejt preparátum készítése………………………………………………….29 3.7. Tisztított enzimek……………………………………………………………………30 3.8. Mikroszkópos technikák…………………………………………………………….31 3.8.1. Atomerı mikroszkóp…………………...…………………………………….31 3.8.2. Pásztázó elektronmikroszkóp………………………...……………………….32 3.8.3. Konfokális mikroszkóp……...………………………………………………..32 3.9. Az aggregométer mőködése…………………………………………………………33 3.10. Süllyedéses módszer a fibrinoldás vizsgálatára……………………………………35 3.11. Plazminogén aktivációs teszt………………………………………………………36 3.12. Ex vivo trombusminták vizsgálata…………………………………………………37 3.13. A fibrin morfológiai vizsgálata, statisztikai analízis……………………………….37 3.14. Western Blot analízis………………………………………………………………37 4. EREDMÉNYEK…………………………………..…………………………………39 4.1. Az érfal trombogenitásának változása hemosztatikus- illetve neutrofil granulocita eredető enzimek hatására………………………………………………………………...39 4.1.1. AFM és SEM vizsgálatok eredményei….……………………………………39 4.1.2. A perfúziós kísérletek eredményei………….………………………………...43 4.2. Vörösvértest-tartalmú fibrin lítikus rezisztenciája…………………………………..46 4.3. A VWF alternatív hasítása…………………………………………………………..57 4.3.1. A VWF proteolízise statikus körülmények között…………….……………...57 4.3.2. A VWF hasítása statikus körülmények között vérlemezkék jelenlétében.…...58 4.3.3. VWF proteolízise áramlási körülmények között……….…………………….58 4.3.4. A VWF funkciójának módosulása proteolízis hatására……………….……...59 5. MEGBESZÉLÉS.…………………..………………………………………………..64 5.1. Neutrofil granulocita eredető enzimek hatása a VWF-dependens vérlemezke adhézióra…………………………………………………………………………………64 5.2. Vörösvértestek hatása a fibrinolízisre……………………………………………….67 5.3. VWF hasítása hemosztatikus enzimek segítségével………………………………...70

3

6. AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA, KÖVETKEZTETÉSEK……....75 6.1. VWF-dependens vérlemezke adhézió humán a. iliaca falának morfológiája szempontjából……………………………………………………………………………75 6.2. Vörösvértest tartalmú fibrin lítikus rezisztenciája…………………………………..75 6.3. VWF méretének szabályozása hemosztatikus- és neutrofil granulocita eredető enzimeken keresztül……………………………………………………………………...76 ÖSSZEFOGLALÁS……………………...……………………………………………..77 SUMMARY……………………………………………………...……………………...78 IRODALOMJEGYZÉK…………….…………………………………………………79 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE………………………………………………..94 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS……………..…………………………………………...95

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

AFM

atomerı mikroszkóp

aPC

aktivált protein C

APMA

4-aminophenylmercuric-acetate

ECM

extracelluláris mátrix

fMLP

formyl-Met-Leu-Phe

GP

glikoprotein

ICAM

intracelluláris adhéziós molekulák

MMP

mátrix metalloproteináz

PAI-1

plazminogén-aktivátor inhibitor 1

PGI2

prosztaciklin

PSGL-1

P-szelektin glikoprotein ligand-1

SEM

pásztázó elektronmikroszkóp

TAFI

trombin-aktiválta fibrinolízis inhibitor

TF

szöveti faktor

TFPI

szöveti faktor útvonal inhibitor

TIMP

szöveti-típusú metalloproteináz inhibitor

tPA

szöveti-típusú plazminogén aktivátor

uPA

urokináz-típusú plazminogén aktivátor

VWF

von Willebrand faktor

5

BEVEZETÉS

Munkám során a sejtes elemek szerepére koncentráltam trombusképzıdés illetve trombolízis során. Régóta ismert tény, hogy a trombusok szerkezete nem homogén, nem csupán fibrinháló építi fel ıket, hanem igen sok más komponens is részt vesz a szerkezet kialakításában. Ezen komponensek között nagy szerep jut a vérbıl származó sejtes elemeknek, nevezetesen a vérlemezkéknek, vörösvérsejteknek és fehérvérsejteknek. A sejtek jelenléte nagyban befolyásolja a trombus szerkezetének kialakulását, illetve a trombus feloldását is, ezért jelenlétüket a hemosztatikus folyamatok leírása során nem lehet figyelmen kívül hagyni. Munkacsoportunk korábban már igen sok adatot szolgáltatott a trombus különbözı összetevıinek, úgy mint miozin, foszfolipidek, szabad zsírsavak, VWF, hemosztatikus enzimek trombusképzıdésre és fibrinolízisre kifejtett hatásáról, de a sejtes elemek hatásainak jellemzésére most került elsıízben sor. A trombus szerkezetének minél jobb megismerése jelentıs klinikai következményekkel jár, hiszen világviszonylatban a halálozások legnagyobb hányada atherotrombotikus betegségek kialakulásához köthetı.(1) A trombolítikus terápia optimalizálása érdekében elengedhetetlen a trombusok in vivo szerkezetének pontos feltérképezése és a fibrinolízis minél életszerőbb modellezése, hiszen az in vitro leírt fibrinolízis folyamatai igen komoly módosulásokon mennek keresztül in vivo körülmények között a trombus egyéb összetevıinek hatására. Dolgozatomban egyrészt sejtes elemek (elsısorban neutrofil granulociták) vérlemezke adhézióra és ezáltal a trombusképzıdésre kifejtett hatását, másrészt vörösvérsejtek fibrinolízisre, a trombus feloldására kifejtett hatását tárgyalom részletesen. A trombusképzıdés tárgyalásánál különös figyelmet szentelek a VWF-dependens vérlemezke adhéziónak, mely a kis artériákban, arteriolákban nagy nyírási sebességgel áramló vér sajátossága. Fontos szerep jut a VWF-nak, illetve annak, hogy szerkezetének megváltozása a trombusban keletkezı enzimek hatására hogyan változtatja meg a trombusképzıdés folyamatát.

6

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

1.1. A hemosztázis áttekintése

Az emberi véralvadási rendszer feladata, hogy a vért fiziológiás körülmények között folyékony állapotban tartsa, míg érsérülés esetén a megfelelı folyamatok beindulása következtében a vér megalvadjon. Amennyiben a hemosztázis finom szabályozási rendszere megbomlik, trombózishajlam vagy vérzékenység fejlıdik ki. A megnövekedett trombusképzési hajlammal járó betegségek egy nagyságrenddel gyakrabban fordulnak elı, mint a vérzékenységgel járó kórképek. A véralvadási rendszerben elkülöníthetünk celluláris és molekuláris elemeket, elıbbiek fı képviselıi az endotélsejtek, vérlemezkék, fehérvérsejtek, vörösvérsejtek; míg az utóbbiakhoz tartoznak a véralvadási és fibrinolítikus faktorok és ezen faktorok inhibitorai. Jelen fejezetben rövid áttekintést szeretnék nyújtani a fent említett komponensek véralvadásban betöltött szerepérıl.

1.1.1. Az endotélsejt

Az endotélsejt szerepet játszik a vér fluiditásának fenntartásában olyan anyagok szekrécióján keresztül, melyek gátolják a vérlemezkék illetve a véralvadási kaszkád aktivációját, ezenkívül védıréteget képeznek a vér és a szubendotheliális struktúrák között. Résztvesznek a bazális membrán és az extracelluláris mátrix létrehozásában. Véralvadást gátló komponensei között említhetjük a trombomodulint és a heparánszulfátot tartalmazó proteoglikánokat. A trombomodulin a trombin kötésével járul hozzá a trombin protein C rendszert aktiváló hatásához és a létrejövı aPC általi Va és VIIIa faktorok, ezáltal a véralvadási kaszkád inaktiválásához.(2,3) A heparán-szulfát proteoglikánok az endotélsejtek felszínén expresszálódnak és a trombin inaktiválását segítik elı. Fibrinolízist moduláló, endotélsejtbıl származó molekulák a tPA, uPA és PAI-1,(4) míg a vérlemezke aktivációt és aggregációt gátló molekulák a PGI2,(5) NO és az adenozin, mely utóbbit az endotélsejt a felszínén elhelyezkedı ekto-ADP-áz segítségével állít elı ADP-bıl,(6) a véralvadási kaszkád gátlására pedig a TFPI képes,

7

mely a VIIa és Xa faktorok inhibitora. Az endotélsejtek VWF szintézisére és tárolására is képesek a Weibel-Palade testeken belül, mely érsérülés esetén a vérbe kerül és résztvesz a vérlemezke-adhézióban.(7)

1.1.2. A vérlemezke

A vérlemezkék a csontvelıi megakariocitákból fragmentációval keletkeznek.(8) A keringésbe került vérlemezkék életideje körülbelül 10 nap, mely elteltével az elöregedett vérlemezkéket a lép szőri ki a keringésbıl. A vérlemezkék szerepe meghatározó a véralvadás folyamata során, hiszen ezen sejtek vesznek részt az elsı válasz kialakításában érsérülés esetén. Interakciójuk a szabaddá váló kollagénrostokkal indítja el az adhéziót és aggregációt, ami következtében trombocita-aggregátum jön létre, mely segít a vérzést csillapítani.(9) Ezen aggregátum létrehozásán kívül a vérlemezkék elengedhetetlen szereppel bírnak a véralvadási kaszkád mőködésében is, hiszen aktiváció során alakváltoztatással és a foszfolipid-mintázat megváltoztatásával foszfolipid felszínt szolgáltatnak bizonyos véralvadási faktorok számára, így elısegítik a véralvadási komplexek létrejöttét.(10) A vérlemezke adhézió különbözik alacsony és magas nyírási sebesség esetén. Alacsony nyírási sebességnél a vérlemezkék képesek közvetlen módon a kollagén rostokhoz kötıdni, ehhez a GP IaIIa illetve GP VI receptoraikat használják.(11) Magas nyírási sebesség esetén a trombocita nem képes direkt módon a kollagén rostokhoz kötıdni, szükség van egy adhéziós fehérjére a kollagén és a vérlemezke között, ezt a szerepet a VWF tölti be, melyet a vérlemezkék a GP Ib/IX/V komplex segítségével kötnek.(12) Az adhézió során a vérlemezkékben különbözı szignáltranszdukciós útvonalak aktiválódnak mely végül a vérlemezkék aktivációjához és aggregációjához vezet.(13) Az aggregáció a GP IIbIIIa vérlemezke-receptorokon keresztül mediált, az egyes vérlemezkék fibrinogénen vagy magas nyírási sebességnél VWF-on keresztül kötıdnek egymáshoz.(14) Aktiváció során a vérlemezkék különbözı molekulákat szecernálnak,

melyek

elısegítik

további

vérlemezkék

aktiválódását

illetve

a

vazokonstrikciót. Ezen anyagok vérlemezke-granulumokban találhatóak: a denz testek tartalmazzák az ATP-t, ADP-t, szerotonint, pirofoszfátot és kálciumot; az alfagranulumok pedig fibrinogént, VWF-t, V-ös faktort, HMWK-t és PDGF-t.(15)

8

1.1.3. A fehérvérsejtek

A fehérvérsejtek nyugalmi, adhézióra kevéssé képes állapotban keringenek a vérben, míg stimuláció hatására megindul ezen sejtek migrációja az endotélsejtek rétegén keresztül. A migrációnak több fázisát különböztethetjük meg, a kezdeti fázis a gördülés (rolling), aminek következtében a fehérvérsejtek lelassulnak. A gördülés szelektinek segítségével valósul meg, melyek az endotélsejtek felszínén expresszálódnak. Ezen szelektinek reagálnak a fehérvérsejt membránjában található PSGL-1-vel.(16) Mindeközben szignáltranszdukciós útvonalak aktiválódnak és a fehérvérsejtek adhézióra képes állapotba kerülnek. Ebben a folyamatban a β2-integrinek játsszák a legfontosabb szerepet, melyek ICAM molekulákat kötnek. Emellett a fehérvérsejtek PSGL-1-en keresztül vérlemezkéket és VWF-t is képesek kötni.(17) A következı fázisban a fehérvérsejtek a szubendoteliális mátrixba kerülnek, ahol az aktiváció hatására kiürítik granulumaikat. Munkánk során elsısorban a neutrofil granulociták trombusképzıdésre és trombolízisre kifejtett hatását vizsgáltuk. A neutrofil granulociták a fehérvérsejtek 50-70%-t teszik ki, felépítésüket tekintve szegmentált sejtmagot és többféle granulumot tartalmaznak. A neutrofil granulumokat hagyományosan peroxidáz-negatív (specifikus vagy szekunder), peroxidáz-pozitív (azurofil vagy primer) illetve tercier granulumokra oszthatjuk. A specifikus granulumokban MMP-8, az azurofil granulumokban elasztáz, katepszin G, proteináz-3, mieloperoxidáz, míg a tercier granulumokban zselatinázok, nevezetesen MMP-2 és -9 találhatóak.(18-20) A neutrofil granulociták mellett a monocyták is fontos szerepet játszanak a véralvadásban. A monocyták már a keringésben képesek komplexet képezni aktiválódott vérlemezkékkel. Ezek a komplexek megnövekedett adhéziós és migrációs kapacitással rendelkeznek a nem-komplexben lévı monocytákhoz képest. Ebben a kapcsolatban is Pselectin-PSGL-1 interakció játszik szerepet, és patológiás folyamatokban a monocytavérlemezke aggregátumok száma jól mutatja a vérlemezke-aktiváció mértékét.(21,22) A monocyták a kötıdés következtében gyulladásos mediátorokat illetve TF-t szekretálnak, amivel hozzájárulnak a trombusképzıdéshez.

9

1.1.4. A vörösvérsejt

A vörösvérsejtek nem csupán passzív résztvevıi a trombusképzésnek, hiszen a vérrög kialakulásakor jelentıs mennyiségő vörösvérsejt kerül a fibrinhálóba és ezen sejtek jelentıs befolyásoló tényezıként vesznek részt a késıbbiekben a trombus feloldásában. Régi megfigyelés, hogy a hematokrit emelkedésével nı a trombózisveszély, mely legegyszerőbb magyarázata a vér viszkozitásának növekedése, ám olyan egyéb funkciók is meghúzódhatnak a háttérben, mint a vörösvérsejtek vérlemezke aktivációt befolyásoló hatása, valamint hozzájárulásuk a foszfolipid felszín növekedéséhez.(23) Az a jelenség is jól ismert, hogy vérzékenységi problémák kezelhetıek a vörösvértest-szám emelésével, még akkor is, ha a vérlemezke-szám csökken vagy nem változik.(24-26) Korábban leírták, hogy a vörösvértestek megváltoztatják a fibrinháló szerkezetét,(27) de ennek ellenére kijelenthetı, hogy szerepük még nem tökéletesen tisztázott. A legfrissebb adatok szerint a vörösvérsejtek fibrinogénhez való kötıdése nem csupán nem-specifikus fehérjekötıdés a foszfolipid-membránhoz, hanem a sejtek rendelkeznek fibrinogén receptorral, mely egy a GP IIbIIIa vérlemezke receptorhoz nagyon hasonló integrin.(2830) Ez a kötıdés jól gátolható eptifibatiddal, amely egy specifikus GP IIbIIIa-inhibitor.

1.1.5. A véralvadási kaszkád

A véralvadási rendszert korábban intrinsic és extrinsic útvonalra volt szokás felosztani, ám annak fényében, hogy in vivo ilyen elkülönülés nem létezik, hiszen a TF-VIIa komplex a IX és X faktorokat is aktiválni képes, ez a felosztás csak in vitro szerencsés. A véralvadási kaszkád aktiválódásának feltétele az, hogy a TF, mely egy kofaktor szereppel bíró, a szöveti sejtek felszínén expresszálódó membránfehérje, érintkezésbe kerüljön a vér komponenseivel. Amennyiben ez megtörténik érsérülés során, a TF a VIIa faktorral aktiválja a IX faktort vagy a X faktort (az áramlási körülményektıl és a vérlemezke jelenlététıl függıen). A IXa szintén képes a továbbiakban a X faktor aktiválására, ám ez a lépés csak komplexben történhet meg, mely komplex kialakulásához szükség van a vérlemezkék által szolgáltatott foszfolipid felszínre,

10

kalciumra, valamint egy enzimatikus aktivitással nem rendelkezı kofaktorra, mely a VIIIa faktor. Ezen komplexet tenáz komplexnek nevezzük. A Xa szintén komplexben (foszfolipid, kalcium és Va faktor jelenlétében) aktiválja a protrombint trombinná. Ez utóbbi komplex a protrombináz komplex. A trombin felelıs a fibrinogén fibrinné alakításáért, melyet a fibrinogén molekula fibrinopeptid A és B részeinek lehasításával valósít meg. A két fibrinopeptid A a fibrinogén molekula két Aα láncának N-terminálisa, míg a két fibrinopeptid B a két Bβ lánc N-terminálisa. A fibrinopeptid A lehasításával fibrin monomer I jön létre, mely fibrin monomerek csak vég-vég kapcsolódásra képesek, így hosszú láncok alakulnak ki. Amint lehasad a fibrinopeptid B is, létrejön a fibrin monomer II, mely fibrin monomerek már oldal-oldal kapcsolódásra is képesek így a szélti növekedés következtében kialakul a fibrinháló.(31,32) A kialakult fibrinháló kezdetben instabil, stabilizálásához további trombin hatás szükséges, hiszen a trombin aktiválja a XIII faktort, mely egy transzglutamináz, és amely kovalens kötéseket alakít ki a fibrin monomerek között. A fibrinháló stabilizálásának elsı lépcsıfoka a kovalens keresztkötések kialakítása, míg egy késıbbi stádiumban a XIIIa faktor képes egy plazmin inhibitor, az α2-plazmin inhibitor kovalens módon fibrin monomerekhez való kötésére, oly módon, hogy az inhibitor aktív része reakcióképes marad, ezáltal növelve a fibrinháló stabilitását.(33) A trombin további prokoaguláns hatásokkal is rendelkezik, ezek közé tartozik a XI, VIII és V faktorok aktiválása és ezáltal a véralvadási kaszkád felerısítése. Mindemellett képes a vérlemezkéket aktiválni PAR-receptorokon keresztül, valamint aktiválja a TAFI-t, egy olyan karboxipeptidázt, mely lehasítja a fibrin C-terminális lizin oldalláncait, melyek kötıhelyként szolgálnak a plazmin, plazminogén és tPA számára, ezáltal gátolva a fibrinolízist.(34) A XII és XI faktorok tehát in vivo a kaszkád felerısítésében vesznek részt, a folyamat iniciálásában csak speciális esetekben, például gyulladás során polifoszfátok és RNS hatására. A XIa képes a XII és IX faktorok aktiválására, míg a továbbiakban a XIIa a XI faktort aktiválja, szemben az in vitro körülményekkel, ahol a kaszkád elkezdıdhet a XII faktor aktiválásával. Ezt a megközelítést támasztja alá, hogy XII faktor-hiányban nem

11

vérzékenység, hanem trombózis alakul ki, amiatt, hogy a XII faktor sokkal inkább a fibrinolízis, mint a trombusképzıdés aktiválásában játszik szerepet. A trombin résztvesz a kaszkád terminálásában is, negatív visszacsatolás révén. A negatív visszacsatolás a Protein C rendszer aktiválásában nyilvánul meg. A rendszer aktiválásához ép endotélsejtekre van szükség, melyek felszínükön trombomodulint expresszálnak. A trombin ilyen esetben a trombomodulinhoz kötıdik, elveszíti affinitását a korábban említett szubsztrátok iránt, és megnı az affinitása a Protein C iránt. A Protein C elhasításával aPC keletkezik, mely inaktiválja az Va és VIIIa faktorokat és ezáltal leállítja a véralvadást. A fentieken kívül a trombin szubsztrát-palettájához további eltérı funkciójú fehérjék is tartoznak. Ezek közé sorolható az ADAMTS-13 metalloproteináz, mely a VWF multimerek méretének szabályozásában vesz részt (lsd. késıbb). Bár a keringésben az enzim védett a trombin általi inaktiválástól a nagy mennyiségben jelenlévı plazma inhibitorok miatt, melyek a trombint inaktiválják, patológiás körülmények között nagy mennyiségő trombin-keletkezésnél érvényre juthat a trombin ADAMTS-13-ra kifejtett inaktiváló hatása.(35) A trombin alternatív szubsztrátjai között említhetı még a galectin8 és -9, melyek a galectin családba tartoznak.(36) A galectinek szénhidrát-komponenstkötı fehérjék, melyek szerepet játszanak gyulladásos és tumoros folyamatokban. Emellett a galectin-1 szénhidrát-kötı komponensein keresztül képes vérlemezkék kötésére, és az ADP-vel és trombinnal szinergista módon azok aktiválására, elısegíti a P-selectinek expresszióját, leukocita-trombocita aggregátumok létrejöttét, valamint a GP IIbIIIa receptor kifejezıdését a vérlemezkéken.(37) A galectin-8 az endoteliális-aktiváció során expresszálódik és a vérlemezke membránjához kötıdve elısegíti a kalcium-mobilizációt, fibrinogén-kötést, tromboxán-termelést, P-selectin expressziót, mindezeken keresztül pedig a a vérlemezke-aggregációt. A trombin általi aktiváció után a vérlemezkék maguk is expresszálnak galactin-8-t.(38)

12

1.1.6. A fibrinolízis

Fibrinolízis alatt a vízben oldhatatlan fibrinháló feloldását értjük. A trombolízis a trombus feloldását jelenti, mely nem azonos a fibrinolízissel a trombus egyéb összetevıi miatt, melyek befolyásolják az oldási folyamatot. A fibrinolízis alapvetıen két szakaszra osztható, az elsı a plazminogén átalakítása plazminná a plazminogén-aktivátorok segítségével, a második a fibrin lebontása fibrin degradációs termékekké. A plazminogén egyláncú glikoprotein, melynek 92 kDa a molekulatömege, a máj termeli és 2 µM koncentrációban van jelen a vérben. A plazminogén aktivátorok a plazminogén Arg561-Val562 kötést hasítják el, melynek következtében plazmin keletkezik, mely két láncot tartalmaz, diszulfid hidakkal összekötve. Szerkezetére öt kringle-domén (perec struktúra) jellemzı, illetve a Cterminális részen található aktív centrum, benne a szerin-proteázokra jellemzı katalítikus triáddal (Ser741, His603, Asp646).(39)

A plazminogén a fibrin lizil-oldalláncaihoz

kötıdik, legnagyobb affinitással a 5. kringle domén segítségével.(40) Emberben két endogén plazminogén-aktivátor fordul elı, ezek a szöveti- és urokináztípusú plazminogén aktivátorok (tPA és uPA). A tPA egyláncú glikoprotein 68 kDa molekulatömeggel, endotélsejtek szecernálják a vérbe, ahol 60 pM koncentrációban található meg, de ennek csupán 20 %-a van szabad formában, a többi a PAI-1-hez kötve kering. A tPA egy- és kétláncú formában fordul elı, az átmenetet a két forma között a plazmin, kallikrein vagy a XIIa faktor segíti elı. Mind az egy- mind a kétláncú forma rendelkezik enzimatikus aktivitással. A tPA szerkezetében szintén megtalálható a kringle struktúra, mely fontos a tPA-fibrin interakció szempontjából, ugyanis a maximális tPA aktivitás szempontjából esszenciális ezen plazminogén aktivátornak a fibrinhez, mint kofaktorhoz való kötıdése.(41) A tPA szerkezetében a 2. kringle kötıdik a fibrin szabaddá váló C-terminális lizinjeihez, míg a finger struktúra képes a natív fibrin kötésére is. Az uPA szintén egy- vagy kétláncú formában fordul elı, ám az egyláncú forma csupán proenzim, enzimatikus aktivitással nem rendelkezik. Az aktív szerkezet kialakításához plazminra van szükség (pozitív feedback szabályozás). Aktiváció után kialakul a kétláncú forma, mely már hatásos plazminogén-aktivátor. Az uPA-t elsısorban kötıszöveti sejtek,

13

epitél sejtek, makrofágok és endotélsejtek szintetizálják és szecernálják, a vérben 70 pM koncentrációban fordul elı.(42) A fibrinolízis folyamán kezdetben az alvadékban jelenlévı plazminogénbıl kis mennyiségő plazmin keletkezik, mely a fibrint lizin karboxil-csoportok mellett hasítja. A folyamat elırehaladtával a fibrinen egyre több C-terminális lizin válik szabaddá, ami a fibrinolízis fokozódásához vezet,(41) hiszen ezek további plazminogén és tPA-kötésre képes odalláncok, amelyeken a tPA-plazminogén-fibrin hármas komplex létrejötte pozitív-visszacsatolást jelent a plazmin-keletkezésre nézve. A fibrin monomer két szélti D és egy centrális E régióra osztható, a plazmin a D és E régiók között hasít. Amennyiben a XIIIa faktor által keresztkötött fibrinrıl van szó, a fibrinolízis során kovalensen egymáshoz kötött D alegységek szabadulnak fel, melyeket D-dimernek nevezünk és melyek koncentrációjából a trombin aktivitására és a fibrinolízis mértékére lehet következtetni.(43,44) A trombinhoz hasonlóan a plazmin is rendelkezik alternatív szubsztrátokkal. Ezek közé sorolható az Alzheimer-betegség patogenezisében résztvevı Aβ (neurotoxikus β-amyloid). Ha a plazmin keletkezése fokozódik ezekben a betegségekben (például a PAI-1 gátlása révén), az amyloid lebontásának mértéke az agyban megemelkedik.(45) A VEGF (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor) a fiziológiás és patológiás angiogenezis fı regulátora. A plazmin felelıs ezen növekedési faktor ECM-hez kötött formájának hasításáért és a diffúzibilis, biológiailag aktívabb forma felszabadításáért.(46) A plazmin szintén képes a PAR-1 (proteináz-aktiválta receptor-1, mely elsısorban trombin-receptorként volt ismert) hasítására és aktiválására. Mivel ez a receptor vérlemezkéken található, ezért a trombin mellett a plazmin is képes azok aktiválására.(47) A fibrinolízisnek van egy alternatív útvonala is, mely során a plazmin helyett (illetve mellett) a neutrofil elasztáz bontja a fibrinhálót. Fibrinolítikus hatása mellett képes különbözı véralvadási faktorok (VII, VIII, XI, XII, XIII faktorok, VWF) valamint plazmin inhibitorok hasítására is. Ezen felül a neutrofil elasztáz hasítja a plazminogént mini-plazminogénné (csak az 5. kringle struktúrát tartalmazza, az elsı négy eltávolításra kerül), mely mini-plazminogén könnyebben aktiválható mini-plazminná plazminogén aktivátorokkal, mint a plazminogén plazminná. A mini-plazmin hasonló hatékonysággal

14

bontja a fibrint, mint a plazmin, ráadásul a keresztkötött fibrin bontásában még a plazminnál is hatékonyabb.(48) A fibrinolízis lecsengéséért inhibitorok felelısek, melyek közül érdemes megemlíteni az α2-plazmin inhibitort és a PAI-1-t.(49) Az α2-plazmin inhibitor a serpin (szerin-proteáz inhibitor) családba tartozik, 70 kDa molekulatömegő, a máj termeli és 1 µM koncentrációban van jelen a vérben. Az elasztáz ezt az inhibitort is képes elhasítani, ami lassítja a plazmin inaktivációját, mint ahogy az is, ha a plazmin kötésben van a fibrinnel.(50,51) A plazminogén-aktivátor inhibitor 1 szintén a serpin családba tartozik, endotélsejtek és májsejtek termelik, legnagyobb mennyiségben vérlemezkékben található, aminek a szerepe abban áll, hogy megakadályozza a fibrinolízist a vérlemezke dugó kialakulása során.

1.2. A VWF

1.2.1. A VWF szerkezete, szerepe a hemosztázisban

A VWF glikoprotein, melyet a csontvelıi megakariociták és az endotélsejtek szintetizálnak, megtalálható a vérplazmában, a vérlemezkék α-granulumaiban, a WeibelPalade testekben és a szubendoteliális mátrixban.(52) A VWF a plazmában multimerek formájában kering, legkisebb mérető a dimer 540 kDa molekulatömeggel, míg a legnagyobb multimerek akár a 20000 kDa molekulatömeget is elérhetik. A VWF monomer 2050 aminosavból épül fel, a dimer kialakításakor az alegységek diszulfid hidakon keresztül kötıdnek egymáshoz. Az alegység különbözı doménjei a VWF más és más funkcióiért felelısek. Az A1 domén elsısorban a trombociták GP Ib receptorának kötéséért felelıs, de emellett található ezen a doménen VI-os típusú kollagén kötéséért felelıs szakasz, illetve heparinkötı szekvencia is.(53) Az A2 domén ún. „hot spot” a különbözı proteázok általi hasítási reakcióban, többek között ezen a helyen hasít az ADAMTS-13 nevő enzim is.(54) (a VWF hasításáról szóló részt lsd. késıbb)

15

Az A3 domén segítségével kötıdik a VWF az érfal I és III típusú kollagénjeihez. A C1 domén RGD (Arg-Gly-Asp) szekvenciát tartalmaz, mely vérlemezkék GP IIbIIIa receptorával való kapcsolatért felelıs. Ezen kötıdés segítségével képes a VWF vérlemezke aggregáció mediálására nagy nyírási sebesség esetén. A D’, D3 domének a VIII faktor szállításáért felelısek.(53) Elektronmikroszkópos

vizsgálatokkal

kimutatták,

hogy a

VWF

molekula két

konformációban fordul elı, egyik konformáció a feltekeredett forma, mely során a molekula átmérıje 200-300 nm, a másik pedig a filamentózus, 2-3 nm átmérıjő, akár 1300 nm hosszú forma, mely nyíróerık hatására alakul ki.(55) A nagy multimerek igen trombogén formák, mivel számos vérlemezke- és érfali komponens kötıhelyet tartalmaznak, ezen multimerek méretét proteázok csökkentik, melyek közül a legismertebb az ADAMTS-13. A VWF funkciói közé tartozik a vérlemezke-adhézió és -aggregáció elısegítése magas nyírási sebesség mellett, illetve a VIII faktor vérplazmában való szállítása. Magas nyírási sebesség figyelhetı meg a kis artériákban, arteriolákban, átlagértékét tekintve kb.1700 s-1, érszőkület esetén pedig akár 10000 s-1 nyírási sebesség is létrejöhet. In vitro eredmények alapján 800 s-1 nyírási sebesség felett a vérlemezkék adhéziója tökéletesen VWFdependens, míg alacsony nyírási sebesség esetén a vérlemezke adhézióhoz nem esszenciális a VWF jelenléte. A nyírási sebességet sebesség grádiensként lehet definiálni, mely a sebesség változása egységnyi távolságon belül (cm/s/cm=s-1), és amely az ér közepén nulla, az érfal mentén pedig maximális.(56) A vérlemezke-adhézió feltétele magas nyírási sebesség esetén a VWF kitekeredése és kollagén rostokhoz való kötıdése. Ez a konformáció-változás szabaddá teszi a VWF vérlemezkével történı interakciójáért felelıs fehérje szakaszait, és mintegy kihalássza a vérlemezkéket a vérkeringésbıl. Az A1 domén-GP Ib interakció átmenetileg elegendı arra, hogy a vérlemezkék indirekt módon az érfalhoz kötıdve maradjanak, és lehetıvé teszi stabilabb kötések kialakítását, valamint a vérlemezke aktiváció és aggregáció létrejöttét.(55) Az aggregáció trombocita aktivációt feltételez, ennek során a vérlemezkék GP IIbIIIa receptoraikhoz fibrinogént illetve VWF-t kötnek, és ezeken a hidakon keresztül kötik a további vérlemezkéket.(57) Alacsony nyírási sebesség esetén a fibrinogén önmagában

16

elegendı a vérlemezkék összetartásásra, míg nagy nyírási sebesség esetén ehhez VWF-ra is szükség van.

1.2.2. A VWF hasítása

A legnagyobb VWF multimerek a plazmában azonnal hasításra kerülnek. A hasításért egy metalloproteináz, az ADAMTS-13 felelıs elsısorban, ám leírtak más, alternatív VWF hasító enzimeket is.(54) A nagy multimerek ennek következtében csak a megakariociták, trombociták és endotélsejtek intracelluláris granulumaiban találhatóak meg. A nagy multimerek hasítása azért szükséges, mert ezen multimerek igen trombogének, a vérlemezkék megkötésével aggregátumokat hoznak létre. Ez történik TTP (trombotikus trombocitopéniás purpura) során is.(58) TTP-ben az ADAMTS-13 hiányzik vagy nem funkcióképes, emiatt a nagy VWF multimerek nem hasadnak el és vérlemezke aggregáció jön létre, ami vérlemezke-dugó kialakulását vonja maga után. A vérlemezke-dugó elzárja a kis ereket, aminek ischemia, a kialakuló patológiás áramlás miatt pedig hemolízis lesz a következménye. A vérlemezkék megnövekedett felhasználása trombocitopénia kialakulását okozza. Az ADAMTS-13 egy VWF-ra specifikus proteáz, mely az A2 régióban található Tyr1605-Met1606 peptidkötést hasítja el.(59) Konformációváltozás (filamentózus forma kialakulása) elısegíti a hasítás létrejöttét. Mivel az ADAMTS-13 aktivitás és a TTP súlyossága nem minden esetben korrelál, felmerült, hogy a VWF hasításásának létezik egy alternatív, ADAMTS-13-tól független útvonala is. A trombusképzésben résztvevı neutrofil granulociták, melyek a trombusban jelenlévı fehérvérsejtek 76%-át teszik ki,(60) aktiváció során különbözı enzimek szekréciójára képesek, ezek közé tartozik a neutrofil elasztáz, a katepszin G és a mátrix metalloproteinázok. Ezen enzimek képesek a VWF hasítására, a hasítási hely nemrégiben került leírásra, mely szintén az A2 régióban található.(54) Munkacsoportunk a hemosztatikus enzimek VWF-hasító képességével foglalkozott, mely során nem csupán statikus, hanem áramlási körülmények között is vizsgáltuk a jelenséget, trombogén felszín jelenlétében és távollétében. (Részleteket lsd. az Eredmények fejezetben).

17

1.3. A mátrix metalloproteinázok szerkezete, funkciói

A mátrix metalloproteinázok az ECM átalakításában résztvevı proteolítikus enzimek.(61) A metalloproteinázok cink-proteázok, mely azt jelenti, hogy az enzimek aktív centrumukban propeptid-,

Zn2+-iont

tartalmaznak.(62)

Szerkezetüket

tekintve

rendelkeznek

katalítikus-, kapcsoló- és hemopexin doménnel. Inaktív formában

szecernálódnak, általában nem tárolódnak (kivételt képeznek a neutrofil eredető MMPok) és a pro-MMP formában az aktív centrumban lévı cink komplexet képez egy ciszteinnel, mely zárként mőködik, és megakadályozza, hogy a cinkhez vízmolekula kötıdjön, mely a pro-MMP aktivációját jelentené.(63) Az aktiváció történhet extra- és intracellulárisan. A neutrofil granulocita eredető MMP-ok extracellulárisan aktiválódnak, mely enzimatikus úton történik (szerin-proteázok által), de in vitro kémiai úton (peroxinitrit, hipoklórsav vagy különbözı higanyvegyületek segítségével) is létrejöhet. Az aktiváció kétlépcsıs, mely során elıször az MMP csak részleges aktivitást nyer, a propeptid egy része még az MMP-hez kötve marad, és csak a második lépésben kerül eltávolításra általában autokatalítikus módon vagy egy másik MMP segítségével. Hat MMP-osztályt különíthetünk el, ezek a kollagenázok, zselatinázok, stromelizinek, matrilizinek, membrán-típusú matrix metalloproteinázok és a máshová be nem sorolható metalloproteinázok.(64) Az MMP-aktivitás szabályozásában MMP szöveti inhibitorok vesznek részt, melyeket TIMP-nek nevezünk. A munkánk során vizsgált neutrofil granulocita eredető mátrix metalloproteinázok granulumokban tárolódnak. A specifikus granulomok tartalmazzák az MMP-8-t, a tercier granulumok pedig az MMP-2-t és MMP-9-t. Ezen enzimek proenzim formában szintetizálódnak, így extracelluláris aktivációra van szükség. Az MMP-8 kollagenáz, mely képes I-, II-, III-típusú kollagének, proteoglikánok, laminin és elasztin hasítására, míg az MMP-2 (zselatináz A) IV-, V-, VII-, X- kollagéneket, laminint, elasztint hasít, az MMP-9 (zselatináz B) pedig IV-, V-, XI- kollagéneket , aggrekánt és elasztint bont.(65)

18

1.4. Az artériák struktúrája

Az érrendszerben a különbözı típusú erek falszerkezete eltér egymástól. 100 µm alatti érátmérı esetén mikro-, e feletti átmérınél makrovaszkulaturáról beszélünk. A mikrovaszkulaturához sorolhatóak a kapillárisok, melyek átmérıje kisebb, mint 7 µm. A makrovaszkulatura ereinek fala 3 fı részre osztható: tunica intima, tunica media és tunica adventitia. A belsı réteg, az intima egyrétegő endotélbıl és szubendotheliális zónából áll. A középsı, media rétegtıl a lamina elastica interna választja el. A media nagyrészt simaizomsejtekbıl épül fel. A középsı réteget a külsı, adventitia réteg felé a lamina elastica externa határolja. Az adventitián keresztül kapcsolódik az ér a környezı kötıszövethez, és ez a réteg játssza a legfontosabb szerepet a különbözı gyulladásos folyamatokban, illetve autoimmun betegségekben. A szívtıl a kapillárisok felé haladva az erek átmérıje csökken és ezzel együtt szerkezeti felépítésük is változik. Az intima réteg jól elkülönül a nagy artériákban, az átmérı csökkenésével azonban teljesen eltőnik, csak az egyrétegő endotélt és a bazális membránt hagyva maga után. Az artériákban még vastag media réteget figyelhetünk meg, ez az arteriolákban már csökkent, a kapillárisokban pedig teljesen eltőnik. Az úgynevezett elasztikus típusú artériákban, mint az aorta, a vastag tunica media sok elasztint tartalmaz. Ennek köszönhetıen képesek ezek az erek arra, hogy csökkentsék a szisztole és diasztole közötti

nyomáskülönbségbıl

adódó

energiaveszteséget.

Az

elasztikus

rostok

tönkremenetele dilatációhoz vezet. Szerkezetükbıl adódóan ezen artériák nem vesznek részt a hemosztázisban. A muszkuláris vagy izmos típusú artériák alkotják az artériás rendszer legnagyobb részét. Ezek csökkenı mennyiségő elasztikus elemet és növekvı mennyiségő simaizomsejtet és kollagént tartalmaznak. Ehhez a csoporthoz tartozik az a. carotis interna és externa, az a. femoralis, de kisebb artériák is, mint például a szív koronária erei. Ide tartozik az a. iliaca is, melyet kísérleteinkben használtunk. A kollagénrostok lefutása a mediában inkább körkörös, az adventitiában inkább hosszanti irányú. A kapillárisok felé az átmérı és falvastagság fokozatosan csökken, a vénás oldalon a szív felé pedig nı.

19

1.4.1. Tunica intima

Az ér lumene felé az endotélium néz. Az endotélsejtek egyetlen réteget formálnak a bazális membrán felett. Átmérıjük 40 µm, vastagságuk 3 µm. A sejtek három felszínnel rendelkeznek. A kohéziós felszín az endotélsejtek közötti kapcsolódást teszi lehetıvé. Ezen kapcsolódás az endotélium szervezetben való elhelyezkedésétıl függıen változik. Az adhéziós vagy abluminális felszín a szubendotéliális zóna kötıszövetével való kapcsolódást teszi lehetıvé. A nem-trombogenikus vagy luminális felszín az endotélsejtek tromborezisztens tulajdonságáért felelıs. A következı réteg a szubendotéliális zóna, mely tartalmaz kollagént, elasztint, fibronektint, laminint, mikrofibrillumokat, mukopoliszacharidokat, trombospondint, vitronektint és VWF-t.

1.4.1.1. Kollagén

A kollagének szerkezetére jellemzı, hogy három polipeptidláncból állnak, mindhárom alfa-lánc balmenetes hélixet alkot, melyek egymás köré tekeredve egy jobbmenetes szuperhélixet hoznak létre. Az aminosav szekvenciában minden harmadik aminosav glicin, mely nélkülözhetetlen a szuperhélix kialakulásához, mert csak a glicin rendelkezik elegendıen kis oldallánccal ahhoz, hogy a triplahélix tengelyébe beilleszkedjen. A különbözı kollagénekben (jelenleg 19 típus ismert) a triplahelikális domén különbözı hosszúságú, és helyenként non-helikális domének szakítják meg. Az ismétlıdı Gly-X-Y tripletet alkotó egyéb aminosavak kb. 20%-a prolin vagy hidroxiprolin. A hidroxiprolin hidroxil csoportja hidrogén-hidak kialakításában vesz részt, és stabilizálja a triplahélixet. A kollagén egyes helikális vagy non-helikális régióiban levı lizin és hidroxilizin oldalláncok a molekulák közötti kovalens keresztkötések kialakításában vesznek részt (szupramolekuláris szerkezetek kialakítása). A hidroxilizin/lizin arány a különbözı kollagéntípusokban eltérı. A klasszikus kollagéneket az ún. fibrilláris (rostképzı) kollagének képviselik. Ezen belül is az I-, II- és III-típusok dominálnak, ezek alkotják a szervezet teljes kollagén készletének 80-90 százalékát. Az I-es típus fı alkotója a csontok és inak kötıszövetének,

20

a II-es a porcszövetben, üvegtestben fordul elı nagyobb mennyiségben, a III-as pedig az I-es típussal együtt a bır és az erek kötıszövetére jellemzı. Ebbe a csoportba tartozik az V-ös és XI-es típusú kollagén is. A non-fibrilláris kollagéntípusok jellegzetes struktúrákat hoznak létre, a IV-es típus háromdimenziós hálózatot, a VI-os típus gyöngyfüzérszerő filamentumokat, a VII-es típus antiparallel dimereket, a VIII-as típus hexagonális hálókat. A szubendotéliális zónára leginkább a IV-es és V-ös típusú kollagén jellemzı, de megfigyeltek VIII-as típusú kollagént is. A IV-es típusú kollagén elısegíti az endotél sejt-adhéziót, a kemotaxist és a sejtproliferációt.(66)

1.4.1.2. Elasztin

Az elasztin vízben oldhatatlan, amorf, hidrofób és kiterjedten kovalensen keresztkötött fehérje, amely a szervek funkciójától függıen különbözı mennyiségben van jelen az ECM-ban. Az elasztin által alkotott háló nagy elaszticitása miatt jelentıs alakváltozásnak kitett szövetekben az ECM domináló komponense (nagy artériák, tüdı, bır). Az elasztin gén terméke a tropoelasztin, amely szintézise után egy védı dajkafehérjéhez (EBP, elastin binding protein) kötıdik. Ezen fehérje többek között megakadályozza az idı elıtti intracelluláris aggregációt. Az elasztin jelentıs hidrofób jellege ellenére sok vizet köt meg és vízmentes közegben elveszíti elaszticitását, mivel a víz-elasztin interakciók biztosítják a termodinamikai hajtóerıt a nyújtás utáni retrakcióhoz. Az elasztin lebontását metalloproteinázok és a neutrofil elasztáz végzik.(67)

1.4.1.3. Mikrofibrillumok

Az elasztin mikrofibrillumokkal van körülvéve, melyek az elasztin háló éréséhez nélkülözhetetlenek. Fı alkotóelemük a fibrillin-1- (350 kDa molekulatömegő glikoprotein) polimerekbıl álló rostok. Az elasztin hálóval tandemben mőködnek, fontos szerepet játszanak a szöveti elaszticitás fenntartásában.(67)

21

1.4.1.4. Laminin

A laminin 3 láncból álló glikoprotein (A, B1, B2), melyet szintén az endotélsejtek termelnek. IV-es típusú kollagénnel kolokalizálódik az extracelluláris mátrixban, növeli az endotélsejtek adhézióját, növekedését, valamint kemotaktikus tulajdonságokkal is rendelkezik. Az endotélsejtek különbözı integrin receptorokon keresztül kötıdnek hozzá.(68)

1.4.1.5. Glükózaminoglikánok

Az extracelluláris mátrixban dermatán-szulfát, kondroitin-szulfát és heparán-szulfát glükózaminoglikánok találhatóak. Ezzel szemben az endotélsejt felszínén csak heparánszulfát glükózaminoglikán van (az endotél antikoaguláns aktivitása részben ennek is köszönhetı).

1.4.1.6. Fibronectin és trombospondin

Mindkét protein adhéziós molekulaként szerepel a vérlemezkék számára. Szintézisüket a májban illetve a fibroblastokban több tényezı is serkenti, ilyen a gyulladás, az érfalsérülés és a hiperglikémia. Elısegítik az endotélsejtek adhézióját az extracelluláris mátrixhoz,

egymáshoz

és

V-ös

típusú

kollagénhez

kötıdnek.

VWF-val

kolokalizálnak.(69)

1.4.1.7. Vitronectin (S-protein)

Multifunkcionális adhéziós glikoprotein a szérumban és különbözı szövetekben, mely integrinek, kollagén, heparin és komplement komponensek számára rendelkezik kötıhelyekkel. Szerepet játszik a véralvadás, fibrinolízis és komplement kaszkádok szabályozásában, a sebgyógyulásban és a szöveti remodelingben. A PAI-1 (plazminogénaktivátor inhibitor 1) kötıdik hozzá.(70)

22

1.4.2. Tunica media

A tunica intimától a lamina elastica interna választja el, mely elasztikus rostokból áll. A media réteg fıleg simaizomsejtekbıl és kötıszövetbıl épül fel. Amennyiben a mediat kevesebb, mint 30 simaizomsejtréteg alkotja, táplálása kielégítı a lumen felıl az endotéliumon keresztül. Ha azonban több, mint 30 rétegbıl áll, a környezı kis erekbıl ún. vasa vasorum tör be az érfalon keresztül, és biztosítja a réteg megfelelı anyagcseréjét. Emellett autonóm beidegzést is kap, mely befolyásolja a vaszkuláris kontraktilitást. Fı alkotórészek: elasztin, mikrofibrillumok, kollagének, proteoglikánok. A mediában legnagyobb mennyiségben I-es és III-as típusú kollagén található, melyek aránya kb. 7:3 Kisebb mennyiségben jelen lehet még IV-es, V-ös, VI-os és VIII-as típus is. A tunica media legalább három különbözı típusú proteoglikánt tartalmaz. A proteoglikánok igen komplex makromolekulák, melyek egy core fehérjébıl és az ehhez kapcsolódó glükózaminoglikán (GAG) lánc(ok)ból állnak. A GAG-láncok ismétlıdı diszacharid egységekbıl épülnek fel, az egység lehet kondroitin-szulfát, dermatánszulfát, keratán-szulfát, heparán-szulfát vagy hialuronsav. A core proteinhez a GAGláncok kovalensen (O-glikozidos kötéssel) kötıdnek. Egy core proteinen általában egy GAG-lánc dominál. A GAG-láncokon kívül oligoszacharidok is kötıdhetnek a core proteinhez O-, vagy N-glikozidos kovalens kötéssel. Mind a core proteinek különbözısége, mind a GAG-láncok változatossága szerepet játszik a proteoglikánok sokféleségében, melyek komoly szereppel bírnak a sejtmigrációban, sejtproliferációban és sejtadhézióban, valamint újabb feltételezéseink szerint a vérlemezkék adhéziójában. A tunica mediaban a GAG láncok alapján elsısorban kondroitin-szulfát, dermatán-szulfát és heparán-szulfát tartalmú proteoglikán detektálható.

1.4.3. Tunica adventitia

Ez a külsı réteg inkább a vénákban kifejezett, és fıleg kötıszöveti elemekbıl áll. Többnyire hosszában futó kollagénrostokat, kisebb mértékben elasztikus rostokat (vénákban simaizomsejteket is) találunk benne, valamint a nagy erekben az érfal külsı

23

részét ellátó tápláló erek (vasa vasorum) és a simaizomsejteket beidegzı idegek (nervi vasculares) figyelhetıek meg. Az adventitia körülbelül kétszer annyi kollagénrostot tartalmaz, mint a media, de a mediával ellentétben az ECM elemeit nem simaizomsejtek, hanem fibroblastok termelik.

24

2. CÉLKITŐZÉSEK

1. Neutrofil granulocita eredető enzimek hogyan befolyásolják az érfal trombogenitását elsısorban a VWF-dependens vérlemezke adhézió megváltoztatásán keresztül?

2. Hemosztatikus enzimek, közöttük neutrofil granulocitákból származóak, képesek-e a VWF hasítására, és ha igen, akkor ezen hasítást milyen mértékben befolyásolják a különbözı áramlási körülmények illetve a trombogén felszín és trombociták jelenléte?

3. Milyen hatással vannak a trombusban jelenlévı vörösvérsejtek a fibrinháló feloldására, a fibrinolízisre, és milyen mechanizmus révén fejtik ki ezt a hatást?

25

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

3.1. Humán a. iliaca keresztmetszet készítése

A módszer minden lépésében megfelel a regionális etikai elıírásoknak. Az arteria iliaca elhalálozott egészséges donorokból került eltávolításra, azonnal szárazjégben lévı 2metilbutánba helyeztük, a késıbbiekben pedig -70ºC-on tároltuk. A 6 µm vastag metszetek fagyasztva metszéssel készültek melyeket poli-L-lizin borítású tárgylemezekre helyeztünk. Használat elıtt 1-3 napig -20ºC-on tároltuk a metszeteket.

3.2. Áramlási kamra

Az alkalmazott tárgylemezeken perfúziós kamrát hoztunk létre a következıképpen: egy mindkét oldalán tapadó ragasztószalagba 0.3x1.5cm-es áramlási kamrát vágtunk, melynek falát maga a ragasztószalag alkotta, aminek vastagsága 64 µm. A kamra tetejét egy mőanyag fedılap segítségével hoztuk létre, mely be-és kimenetet is tartalmazott. Ezeken a csöveken keresztül áramoltattuk a vért a kamrán át 3350 s-1 nyírási sebességgel. A nyírási sebességet lamináris áramlást feltételezve a következı képlet segítségével számítottuk ki: 1.03*6Q/(w*h2), ahol Q az áramlási sebesség ml/s mértékegységben, w és h a kamra szélessége és magassága cm-ben (1. ábra A). Az áramlási kamrán citráttal antikoagulált teljes vért, más kísérletekben izolált VWF oldatot áramoltattunk (1. ábra B).

26

1. ábra

Az áramlási kamra sémája. Az áramlási kamra alján található a fagyasztva metszéssel készült artéria keresztmetszet polilizinnel borított tárgylemezre rögzítve. A kamra oldalait egy mindkét oldalán tapadó ragasztószalagba vájt téglalap oldalai alkotják. A kamra teteje egy mőanyag lap, melyben 2 rés található. Ezekbe a résekbe mőanyag csöveket illesztünk (A). Ezeken a mőanyag csöveken keresztül áramoltatunk teljes vért vagy izolált VWF oldatot nagy nyírási sebességgel (3350s-1) az érkeresztmetszet felszínén keresztül.

Perfúzió elıtt az artéria keresztmetszetet blokkoltuk 2 % BSA 0,05 M TRIS, 0,1 M NaCl, 0,02 w/v % NaN3 pH 7,4 (TBS) pufferrel 45 percen keresztül, megakadályozva ezzel a vérlemezkék nem specifikus kötıdését. A 90 s hosszú perfúziót 30 s mosás követi 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4 137 mM NaCl 2,7 mM KCl pH 7,4 (PBS) pufferrel melyhez 13 mM Na-citrátot adtunk. Perfúzió után a metszeteket 4ºC-os acetonban fixáltuk 10 percen keresztül.

27

3.3. Az artéria keresztmetszetek elıkészítése perfúzió elıtt

Perfúzió elıtt az artéria keresztmetszeteket néhány esetben enzimatikus elıkezelésnek vetettük alá. Proteázokkal, izolált aktivált neutrofil granulocitákkal vagy ezek felülúszójával 30 percen keresztül inkubáltuk az érkeresztmetszetet. A granulociták aktiválása 10 percen keresztül történt 1 µM fMLP alkalmazásával. Az fMLP egy bakteriális eredető peptid, mely alkalmas neutrofil granulociták aktivációjának modellezésére. A 30 perces inkubáció után háromszori mosás következett, 5 percen keresztül egyenként, PBS pufferrel. Alkalmazott enzimkoncentrációk: 10 nM trombin (Serva Electrophoresis Gmbh Heidelberg, Germany), 20 nM neutrofil elasztáz (Serva Electrophoresis Gmbh, Heidelberg, Germany), 17 nM MMP-8, 10 nM MMP-9 (R&D Systems, Abingdon, England). Neutrofil granulociták esetében a sejtszámot 6000/µl-re álítottuk be, mely megfelel a vérben található fiziológiás fehérvérsejt számnak. A sejtek PBS-ben voltak szuszpendálva, mely 5 mM glükózt tartalmazott (PBS-glükóz). A sejtek által szecernált MMP-ok aktiválására APMA-t (Sigma-Aldrich Kft, Budapest, Hungary) használtunk, mely egy mátrix-metalloproteinázok aktiválására alkalmas higanyvegyület, 1 mM koncentrációban, 30 percig 37ºC-on.

3.4. Az érfalhoz kitapadt vérlemezkék láthatóvá tétele

A vérlemezkéket a perfúziós kísérletet követıen indirekt immunfluoreszcencia segítségével tettük láthatóvá. A metszeteket 2 % BSA/TBS pufferrel blokkoltuk 30 percen keresztül, ezt követte 5 perc mosás TBS-vel. A továbbiakban a metszeteket antihumán CD41 GP IIbIIIa egér monoklonális antitesttel (Biodesign International, Saco, ME, USA) inkubáltuk 60 percig 4 µg/ml koncentrációban BSA/TBS-ben hígítva. Ezután 3x5 perc mosás következett TBS-vel, majd hozzáadásra került a 2 µg/ml koncentrációjú Alexa Fluor 488 kecske-anti-egér IgG másodlagos antitest (Invitrogen, Budapest, Hungary), amivel 30 percen keresztül inkubáltuk a metszeteket. Ezután ismét 3x5 perc mosás következett, majd a metszetek üveg fedılemezzel lefedésre kerültek egy csepp glicerol/TBS 1:1 arányú keverékének segítségével.

28

A metszetekrıl konfokális mikroszkóppal (Zeiss LSM 510) készítettünk felvételeket, melyeket szoftveres képelemzésnek vetettük alá (Scion Image). A képelemzés során egy terület vérlemezkék általi lefedettségét az adott terület képpontjainak és a vérlemezkék által fedett terület képpontjainak százalékos arányaként adtuk meg. A vérlemezkék képpontjainak detektálására a jel/zaj határt úgy választottuk meg,

hogy

az

érfali

struktúrák

(pl.

lamina

elastica

externa

és

interna)

autofluoreszcenciájából adódó képpontok ne kerüljenek beszámításra.

3.5. Neutrofil granulocita preparátum készítése

Neutrofil granulocitákat humán vér buffy coat frakciójából preparáltunk,(71) melyet összekevertünk 2 % dextránnal és 5 percen keresztül centrifugáltuk 150 g-vel. A vérlemezke-dús felülúszó (PRP) eltávolításra került. Ezek után újra összekevertük az oldatot 2 % dextránnal és 45 percen keresztül ülepítettük a vörösvérsejteket. A felülúszót azonos térfogatú PBS-glükózzal elegyítettük és 3 percig 400g-n centrifugáltuk. A sejttörmeléket még egyszer centrifugáltuk 3 percig 400g-n PBS-glükóz hozzáadása után, azért, hogy a dextránt eltávolítsuk. A neutrofil granulocita-gazdag frakciót azonos térfogatú 90 % Percoll-ra rétegeztük és 5 percig 400g-n centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, majd újra centrifugáltunk, ezúttal 15 percig 800g-n. A neutrofil granulocita-gazdag sejttörmeléket kétszer mostuk PBS-glükózzal, majd centrifugáltuk 3 percig 400g-n. A neutrofil granulociták 1 mM CaCl2-t tartalmazó PBS-glükózban kerültek felvételre. Sejtszámolást követıen a neutrofil granulocitákat 1 µM fMLP-vel aktiváltuk. Az MMP-felszabadulást ELISA technikával határoztuk meg a gyártó (GE Healthcare Bio-Sciences) utasításai alapján.

3.6. Vörösvérsejt preparátum készítése

Vörösvértesteket citráttal antikoagulált teljes vérbıl preparáltunk, melyet egészséges önkéntesektıl vettünk véna punkcióval. 1 órán belül a vérvételt követıen a vérlemezkedús plazma (PRP) eltávolításra került a 150g-n 10 percig tartó centrifugálást követıen és a sejt pellet további centrifugálásra került 2000g-n 10 percig a vörösvértestek kiülepítése

29

céljából. A vörösvérsejt pelletet háromszor mostuk 10 térfogatnyi 5 mM glükózt tartlamazó PBS-vel, reszuszpendálással és centrifugálással 1200g-n 5 percig. A vörösvérsejtek számolása Abacus Junior B készülékkel (Diatron GmbH, Vienna, Austria). történt és a hematokritet 0.8-re állítottuk be PBS-vel. A sejtek maximum 2 órán keresztül szobahımérsékleten voltak tárolva felhasználásig. A konfokális mikroszkóppal történı mérésekhez a sejteket fluoreszcens festékkel jelöltük (Vybrant DiD-Invitrogen Life Technologies, Budapest, Hungary). Ehhez 5 ml 0,016 hematokrittel rendelkezı vörösvérsejt szuszpenziót 25 µl Vybrant DiD festékkel összekevertünk és 30 percen keresztül

inkubáltuk,

majd

PBS-vel

mostuk

a

sejteket

háromszor

(reszuszpendálás/centrifugálás 1200g-n, 5 percig). A Vybrant-jelölt vörösvérsejt oldat hematokrit értéke is 0,8-re lett beállítva.

3.7. Tisztított enzimek

Humán neutrofil elasztáz aktív koncentrációjának meghatározása korábban publikált módon történt.(72) Rekombináns MMP-8 és MMP-9 enzimek 1 mM APMA-val kerültek aktiválásra 37ºC-on 1h illetve 24h inkubációval. Az enzimek aktivitását zselatin zimográfiával határoztuk meg.(73) Kondroitináz ABC a megadott aktivitás szerint került felhasználásra. Szarvasmarha trombin ion-cserélı kromatográfiával lett tisztítva, mely során 2100 IU mg-1 specifikus aktivitást nyertünk,(74) a trombin inaktiválásához rekombináns hirudint (Sigma-Aldrich Kft, Budapest, Hungary) alkalmaztunk. MMP-2/MMP-9 Inhibitor I-t használtunk az MMP-9 inaktiválására, míg MMP Inhibitor I-t az MMP-8 inaktiválására (Calbiochem, LaJolla, CA, USA), melyeket kombinációban, 5 µM koncentrációban alkalmaztunk. A szerin-proteázok gátlására Pefabloc-ot (aminoethyl-benzenesulfonylfluoride; Serva Electrophoresis Gmbh) használtunk 100 µM koncentrációban.

30

3.8. Mikroszkópos technikák

3.8.1. Atomerı mikroszkóp (AFM)

Az atomerı mikroszkóp a pásztázószondás mikroszkópok közé tartozik, melyek közös jellemzıje, hogy egy mechanikus rendszer egy hegyes tővel pásztázza végig a minta felszínét és eközben érzékeli a minta és tő között fellépı kölcsönhatást. Az érzékelt jelet a jelfeldolgozó rendszer a pásztázott kétdimenziós felület harmadik dimenziójaként jeleníti meg. A tő mozgását piezokristályok teszik lehetıvé. Az érzékelı tő egy laprugó egyik végéhez rögzített, mely elmozdul a tő-minta kölcsönhatások során. Ezt az elmozdulást tudjuk detektálni egy lézersugár segítségével, mely visszaverıdését egy fotódióda érzékeli. Az atomerı mikroszkópot két alapvetı módban használhatjuk, az egyik a statikus vagy kontakt, mely fıleg sima felszíneknél alkalmazható, mert a tő könnyen beleragadhat a mintába, a másik a dinamikus vagy nem-kontakt mód, mely során a tő adott frekvenciával rezeg. Az atomerı mikroszkóppal végzett vizsgálatok elınye, hogy a minta fixálása nem szükséges, így natív állapotban vizsgálható. Vizsgálataink során használt mőszer a Nanoscope IIIa scanning probe microscope (Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA). Atomerı mikroszkóp mőködésének sémája. A folyamat során egy mechanikus rendszer egy hegyes tővel pásztázza végig a minta felszínét és eközben érzékeli a minta és tő között fellépı kölcsönhatást. Az érzékelt jelet a jelfeldolgozó rendszer a pásztázott kétdimenziós

felület

harmadik

dimenziójaként jeleníti meg. A tő mozgását piezokristályok teszik lehetıvé. Az érzékelı tő egy laprugó egyik végéhez rögzített, mely elmozdul a tő-minta kölcsönhatások során. Ezt az elmozdulást tudjuk detektálni egy

2. ábra

lézersugár

segítségével,

visszaverıdését egy fotódióda érzékeli.

31

mely

3.8.2. Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM)

Pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatnál a minta felszínét egy elektronsugárral pásztázzuk végig (egy katód és anód között létrejövı, vákuumban felgyorsított elektronsugár), a kölcsönhatásból származó jeleket (szekunder elektronokat) egy erre alkalmas detektor érzékeli, elektromos jellé majd képi információvá alakítja. A mikroszkóp sajátossága, hogy a mintákról nagy felbontású és nagyítású, valamint nagy mélységélességő képet tud alkotni. A mintákat a SEM vizsgálat elıtt fixálni szükséges. Ennek menete a következı: a mintát 100 mM Na-kakodilát pH 7,2 oldattal mossuk, majd 10 percig 1% glutáraldehid 100 mM Na-kakodilátban pH 7,2 oldattal fixáljuk. Mosás után a minták szárítása következik, ennek során 5-5-percre 20-40-60-100%-os acetonba, aceton-hexametil-diszilán 1:1 arányú keverékébe, majd 100% hexametil-diszilánba mártjuk a metszeteket.(75) A vizsgálat kezdetéig a mintákat szobahın tároljuk. Amennyiben a proteoglikánokat is láthatóvá kívánjuk tenni, szárítás elıtt egy éjszakán keresztül inkubáljuk a metszeteket 0,05 % Cupromeronic Blue 0,025 M Na-acetate pH 5,8 oldattal, mely 2,5 % glutáraldehidet és 0,3 M MgCl2-t tartalmaz. A Cupromeronic Blue egy kationos festék, mely speciálisan elektronmikroszkópos vizsgálatokra lett kifejlesztve,

ami

során

negatív

töltéső

proteoglikánokhoz

és

szulfatált

glükózaminoglikánokhoz kötıdik.(76) A vizsgálatokhoz használt mőszer az EVO40 (Carl Zeiss Gmbh, Jena, Germany).

3.8.3. Konfokális mikroszkóp

A konfokális mikroszkóp fluoreszcensen jelölt minták vizsgálatára alkalmas. Jobb felbontású képeket ad, mint a hagyományos fluoreszcens mikroszkópok, és képes "optikai szeletelésre", vagyis képet alkotni a minta egyetlen szeletérıl. A kapott digitális kép számítógéppel kezelhetı és elemezhetõ. A konfokális képalkotás lényege, hogy a rendszer csak a fókuszsíkból jövı fényt detektálja. A hagyományos mikroszkópokkal szemben, ahol a minta egy területét éri a megvilágítás, a konfokális mikroszkópnál egyszerre csak a minta egy pontját világítják meg. A lézer fényforrás fényét az objektív

32

lencse a minta egy pontjára fókuszálja (ez esetben az objektív játssza a kondenzor szerepét is), majd a mintából eredı fluoreszcens illetve visszavert fényt ugyancsak az objektív győjti össze. A minta egy adott síkjából jövõ fény az optikai rendszeren való áthaladás után egy adott fókuszpontban összpontosul, majd a detektorba jut. Mivel egyszerre csak a minta egyetlen pontját világítja meg, a konfokális elrendezés önmagában nem ad képet. Ahhoz, hogy képet kapjunk, sorra végig kell pásztázzuk a vizsgálandó terület minden egyes pontját. Kísérleteinkben konfokális mikroszkópot használtunk a fibrinolízis nyomon követésére. Ehhez a fibrinogén 1 %-át Alexa Fluor® 546-jelölt fibrinogénnel helyettesítettük, 16 nM trombinnal 30 perc alatt megalvasztottuk egy 0,5-mm magas kamrában, melyet üvegbıl készült fedılemezek segítségével hoztunk létre. Ezek után 60 nM tPA-GFP-t (mely rekombináns humán tPA-medúza zöld fluoreszcens protein (GFP), amit egy baculovírus rendszerben expresszáltuk. A mővelet során pEGFP plazmidból (Clonetech, Mountain View, CA, USA) izolált EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) fúziója történik a tPA C-terminálisával egy már korábban leírt módon(77,78)) injektáltunk a fibrinalvadék szélére, és a fluoreszcenciát (excitáció 488 nm-en, emisszió 525 nm-en a tPA-GFP detektálásához; excitáció 543 nm-en, emisszió 575 nm-en az Alexa546-fibrinogén detektálásához; excitáció 633 nm-en, emisszió 650 nm-en a Vybrant-jelölt vörösvértestek detektálásához) konfokális pásztázó mikroszkóppal (Confocal Laser Scanning System LSM510 (Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany)) követtük nyomon.

3.9. Az aggregométer mőködése

Az aggregométer a vérlemezke aggregáció kísérletes meghatározására szolgáló eszköz. A mőszer tulajdonképpen egy fotométer, amivel egy oldat fényáteresztı-képességét tudjuk mérni. A mérés során vérbıl centrifugálással (10 perc 150 g) vérlemezke-dús plazmát állítunk elı (PRP), ezt leszívjuk és további centrifugálással (10 perc 2000 g) vérlemezke szegény plazmát kapunk (PPP). A PPP oldat transzparenciáját (fényáteresztı képességét) a mőszeren 100 %-nak állítjuk be, míg a PRP transzparenciája 0 % lesz. Az aggregációt vérlemezke-agonistával indítjuk meg, aminek hatására a PRP-ben megindul a vérlemezkék aggregációja. Ezzel a folyamattal párhuzamosan nı a fényáteresztı

33

képesség, ami közelít a PPP által reprezentált 100 %-hoz. Az aggregációs válasz jellemzésére a görbe meredeksége és a maximális aggregáció értéke szolgál. Vérlemezke-agonista a trombin, ADP, tromboxán, kollagén, adrenalin. Kísérleteinkben szintén vizsgáltuk a ristocetin-indukálta vérlemezke agglutinációt (RIPA). Ezekhez a vizsgálatokhoz liofilizált (fixált) vérlemezkéket használtunk, melyek ugyan képesek GP Ib receptoron keresztül egymáshoz kötıdni, ám aktivációra és aggregációra nem képesek. Emiatt nevezik az összecsapzódásukat aggregáció helyett agglutinációnak. Az agglutináció kiváltásához VWF-ra és ristocetinre van szükség. A jelenség során a VWF összetekeredett konformációban marad, nem nyúlik ki, mint áramlási körülmények között. Emiatt tekintettük ezeket a körülményeket statikusnak a VWF hasításának vizsgálataiban. A ristocetint korábban antibiotikumként használták, ám épp vérlemezkeagglutináló hatása miatt manapság már nem használatos. Ezen antibiotikum a VWF-hoz kötıdik és ezáltal megváltoztatja a VWF-vérlemezke (GP Ib) interakciót. A liofilizált vérlemezkéket 50 mM TRIS 150 mM NaCl pH 7,4 pufferben szuszpendáltuk, mosás után fugáltuk 4x 10 percig 80000g-n, a mérésekhez izolált VWF-t alkalmaztunk 10 µg/ml koncentrációban. Az aggregométer mőködése. Az aggregométer

egy

olyan

fotométer, mely segítségével egy oldat

fényáteresztı-képességét

tudjuk vizsgálni. Centrifugálással PRP-t (trombocita-dús plazma) és PPP-t

(trombocita-szegény

plazma) állítunk elı. A PPP segítségével

állítjuk

be

a

mőszeren a 100 % fényáteresztıképességet,

míg

a

transzparenciája 0 % lesz. 3. ábra

34

PRP

4. ábra

Az aggregációt vérlemezke-agonistával indítjuk be, mely folyamat elırehaladtával az oldat fényáteresztı-képessége megközelíti a 100 %-t. A legmagasabb mért transzparencia felel meg a maximális aggregációnak.

3.10. Süllyedéses módszer a fibrinoldás vizsgálatára

Ezzel a módszerrel a fibrinháló feloldását tudjuk követni egy fémgolyó segítségével, melyet az alvadt fibrin felszínére helyezünk és meghatározzuk a golyó csı aljára való süllyedésének idıtartamát. A trombus fibrinogén tartalmát állandó szinten tartottuk, ezt kétféleképpen értük el. Az elsı kísérleti összeállításban emelkedı extracelluláris fibrinogén koncentrációkkal dolgoztunk (7,4-12,4 µM fibrinogén), a vörösvértestek egyre növekvı térfogatát kompenzálandó (0-40 %), az össztérfogat ebben az esetben végig 2 ml maradt. A másik összeállításban állandó 7,4 µM-os extracelluláris fibrinogén koncentrációval dolgoztunk, de ebben az esetben a térfogat 0,8 ml volt vörösvértestmentes környezetben és 1,35 ml-ig emelkedett, 40 % vörösvértesttartalom mellett. A vörösvértest-fibrinogén keverékhez különbözı mennyiségő humán plazmából izolált plazminogént, CaCl2-t és bizonyos esetekben eptifibatidot (GlaxoSmithKline Kft.,

35

Budapest, Hungary) adtunk. A végsı koncentrációk minden esetben 0,1 µM plazminogén, 1 mM CaCl2 és 20 µM eptifibatid voltak. Trombint, melyet szulfopropilSephadex ioncserélı kromatográfiával tisztítottunk, amely során 2100 U/mg specifikus aktivitást nyertünk,(74) ahol 1 IU/ml megfelelt 10,7 nM koncentrációnak az aktív hely titrálása alapján,(79) alkalmaztunk a fibrinogén alvasztására. Az alvasztást és a fibrinolízist egyszerre indítottuk 0,8 cm átmérıjő csövekben úgy, hogy a vörösvérsejtfibrinogén szuszpenziót összekevertük trombint és tPA-t tartalmazó PBS-vel. A végsı trombin koncentráció 85 nM, a végsı tPA koncentráció 1 nM volt. 15 másodperc elteltével egy 0,13 g tömegő acélgolyót helyeztünk el az alvadék felszínére és azt az idıt mértük (lízisidı), mely alatt a golyó elérte a csı alját.

3.11. Plazminogén aktivációs teszt

A plazminogén aktivációs teszthez vörösvérsejt-fibrinogén szuszpenziót, mely 0,5 µM végkoncentrációjú plazminogént tartalmazott, megalvasztottunk 16 nM trombinnal úgy, hogy az össztérfogat 75 µl legyen, egy 96 lyukat tartalmazó microplateben, 30 percig. Ezek után 150 µl 15 nM koncentrációjú tPA került az alvadékok felszínére és további 30 perc elteltével a folyékony-fázis 0°C csövekbe eltávolításra került, melyeket 2000g-n 10 percig 4°C–on centrifugáltunk a sejttörmelék eltávolítása céljából. A felülúszóból meghatároztuk a plazmin-aktivitást oly módon, hogy 100 µl felülúszót összekevertünk 100

µl

0,2

mM

Spectrozyme-PL-vel

(H-D-norleucyl-hexahydrotyrosyl-lysine-p-

nitroanilide, American Diagnostica, Pfungstadt, Germany), mely a plazmin szintetikus szubsztrátja és az abszorbanciát 405 nm-en mértük (az aktivitást ∆A405/perc-ben határoztuk meg). Az eptifibatid plazminogén aktivációra fibrin távollétében kifejtett hatásának meghatározására egy kétlépcsıs aktivációs tesztet használtunk.(80) Röviden, 3 µM plazminogént, mely nem tartalmazott eptifibatidot vagy 20 µM eptifibatidot tartalmazott, összekevertünk 70 nM tPA-val és bizonyos idıközönként mintákat vettünk a plazmin amidolítikus aktivitásának meghatározása céljából. 10 µl plazmint 200 µl 0,1 mM Spectrozyme-PL-hez adtunk és az abszorbancia változását mértük 405 nm-en.

36

3.12. Ex vivo trombus minták vizsgálata

Különbözı

mennyiségő

vörösvértestet

tartalmazó

trombusok

illusztrálására

33

trombusból két extrém esetet választottunk ki (alacsony és magas vörösvértest tartalomra). A trombusok nagy artériákból sebészi módszerekkel kerültek eltávolításra, mindkét kiválasztott minta graft érbıl származott. A donorok minden egyes laboratóriumi lelete normális variánsnak felelt meg, az egyik donor enyhe anémiájától eltekintve (hematokrit 0,29; hemoglobin 9,1 g/dl). Nem volt kimutatható egyik donornál sem öröklött vagy szerzett trombofília, a trombektómia alatt a betegek heparin kezelésben részesültek. A trombusok felhasználása a betegek beleegyezésével és tájékoztatásával, a regionális etikai elıírásoknak megfelelıen történt.

3.13. A fibrin morfológiai vizsgálata, statisztikai analízis

Trombusok és mesterséges fibrinhálók pásztázó elekronmikroszkóppal készült felvételeit vizsgálatnak vetettük alá a fibrinszálak átmérıjének meghatározása céljából. Ehhez a folyamathoz saját készítéső programokat használtunk, melyek Image Processing Toolbox v. 7.0 of Matlab 7.10.0.499 alatt futottak. Az átmérı-méréshez a felvételre egy négyzethálót helyezünk, melyen 10-15 egymástól azonos távolságra lévı vízszintes vonal fut keresztül. Azokat a szálakat, melyek keresztezik a vonalakat, a szál lefutására merılegesen mérjük (ez lesz a szál átmérıje). Egy képen 300 fibrinszál átmérıjét határozzuk meg manuálisan. Az elméleti eloszlást a nyert adatok és Kuiper valamint Monte Carlo szimuláció alapján határoztuk meg. A statisztikai elemzés KolmogorovSmimov teszt alapján történt (Matlab Statistical Toolbox 7.3).(81)

3.14. Western Blot analízis

A VWF és hasítási termékeinek detektálására Western Blot analízist végeztünk. Ennek során a mintákhoz mintakezelı puffert adtunk, mely összetevıi 100 mM TRIS, 100 mM NaCl, 5 % SDS, 5 % β-mercapto-ethanol pH 8,2; 1:4 arányban (puffer:minta) és 3 percig 95 °C-on kezeltük ıket. A fehérjéket gélelektroforézis segítségével választottuk el

37

egymástól, majd átvittük ıket egy nitrocellulóz membránra. A nitrocellulóz membránt elıször poliklonális nyúl-humán-VWF-ellenes IgG antitesttel majd kecske-nyúl-ellenes peroxidáz jelölt IgG antitesttel (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hungary) inkubáltuk. A másodlagos antitesteket, így a VWF hasítási termékeket ECL Western Blot analízis rendszer segítségével detektáltuk (GE Healthcare, Uppsala, Sweden).

38

4. EREDMÉNYEK

4.1. Az érfal trombogenitásának változása hemosztatikus- illetve neutrofil granulocita eredető enzimek hatására

4.1.1. AFM és SEM vizsgálatok eredményei

Az érfal szerkezetének változásait enzimatikus kezelés hatására AFM és SEM technikával követtük. Az AFM szubmolekuláris felbontásra képes, elıször corneában használták ezt a módszert a kollagénrost-proteoglikán kapcsolat feltérképezésére.(82,83) Natív metszetek AFM-mel készült felvételein a media rétegben kompakt érstruktúrát láthatunk, melyben a kollagénrostok homogén amorf alapállománnyal borítottak, míg az adventitiában a kollagénrostok jellegzetes csíkozata jól felismerhetı (5. ábra A-C). Enzimatikus vagy neutrofil granulocitákkal történt kezelés után a media réteg kollagénrostjai is láthatóvá váltak (5. ábra D-H). SEM vizsgálat során a natív felvételek mellett egy speciális proteoglikán-festést is alkalmaztunk (Cupromeronic Blue). A Cupromeronic Blue egy kationos festék, mely negatív töltéső proteoglikánokhoz és szulfatált glükózaminoglikánokhoz kötıdik és láthatóvá teszi ıket pásztázó elektronmikroszkópos felvételeken.(84) Natív felvételeken kontraszt figyelhetı meg a media és adventitia réteg szerkezete között. Az adventitiában jól látható kollagénszálak dominálnak, míg a media szerkezete kompakt, kollagénrostok nem felismerhetıek (6. ábra A-C).

Cupromeronic Blue-val festett metszeteken a

proteoglikánok jól láthatóvá válnak a kollagénrostok felszínén elsısorban a media rétegben, kevésbé az adventitiában (6. ábra D-F). A festés specificitását proteoglikánokra kondroitináz ABC kezeléssel igazoltuk, melyrıl tudni lehet, hogy proteoglikánok glükózaminoglikán-láncait távolítja el. Az enzimatikus kezelés következtében a proteoglikán-kötegek eltőntek a media felszínérıl (7. ábra A). Neutrofil granulocitákkal, neutrofil-eredető enzimekkel (neutrofil elasztáz, MMP-8 és -9) és trombinnal történt kezelés hatására szintén eltőnik a proteoglikán nyalábok összessége, így Cupromeronic Blue festés során nem detektálhatóak a kollagénrostok felszínén (7. ábra B-F).

39

5. ábra

Humán arteria iliaca AFM vizsgálata kontakt módban. Az érkeresztmetszetek elıkészítése és vizsgálata a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtak szerint történt. A-C natív, nem fixált, nem kezelt adventitia és media rétegek. D–H media réteg elıkezelve 30 percig a következı enzimekkel illetve sejtekkel: 4 nM kondroitináz ABC (D); 20 nM neutrofil elasztáz (E); 10 nM trombin (F); 6000/µl neutrofil granulocita 1 µM fMLP-vel és 1 mM

40

APMA-val aktiválva 10 percen keresztül az érfal inkubálásának kezdete elıtt (G); 10 nM MMP-9 (H). Méretarány: 1 µm. A képek legalább öt metszetet reprezentálnak.

6. ábra

Humán arteria iliaca SEM leképezése. A metszetek elıkészítése a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtak szerint történt. Natív, nem kezelt keresztmetszetek A-C, Cupromeronic Blue proteoglikán festéssel készült metszetek D-F. Minden kép legalább 5

41

metszetet, egy metszeten belül legalább 6 random módon kiválasztott területrıl három különbözı nagyítással (1000x, 5000x, 10000x) készült felvételt reprezentál.

7. ábra

Humán arteria iliaca elıkezelt media rétegérıl készült SEM felvételek. Cupromeronic Blue-val történı festés elıtt a metszeteket 30 percen keresztül elıkezeltük a következı enzimekkel: 4 nM kondroitináz ABC (A), 20 nM neutrofil elasztáz (B), 10 nM trombin (C), 6000/µl neutrofil granulocita 1 µM fMLP-vel és 1mM APMA-val elızetesen

42

aktiválva 10 percen keresztül az érfal inkubációját megelızve (D), 17 nM MMP-8 (E), 10 nM MMP-9 (F). Mértékarány: 10 µm. Minden kép legalább 5 metszetet, egy metszeten belül legalább 6 random módon kiválasztott területrıl három különbözı nagyítással (1000x, 5000x, 10000x) készült felvételt reprezentál.

4.1.2. A perfúziós kísérletek eredményei

Amikor arteria iliaca keresztmetszetek felszínén citráttal antikoagulált teljes vért áramoltatunk, a vérlemezkék elsısorban az érfal adventitia rétegéhez tapadnak VWFdependens módon, a media réteghez nem (8. ábra A). A modellben a vérlemezkék érfalhoz való kötıdése gátolható anti-VWF antitesttel, mely a VWF kollagén-kötését gátolja,(85) bizonyítva az adhézió VWF-dependens voltát. Natív metszeteken perfúzió után az adventitia 23,39 ± 1,39 %-a, míg a mediának csupán 1,57 ± 0,25 %-a borított vérlemezkékkel. Amennyiben a metszeteket szerin-proteázokkal elıkezeljük, a media réteghez szignifikánsan több vérlemezke kötıdik nagy nyírási sebesség esetén, amit a media

réteg

trombogenitás-fokozódásának

tekintünk.

A

metszetek

elıkezelése

fiziológiásan releváns koncentrációkkal történik, ami alatt kb. 10 nM trombint vagy 20 nM neutrofil elasztázt értünk, mely mennyiség bizonyítottan keletkezik érsérülés esetén.(86-89) A metszeteken lévı enzimmaradványok a vérlemezkék funkcióit nem befolyásolják köszönhetıen a vérben mikromoláris mennyiségben jelenlévı plazma inhibitoroknak. A vérlemezkére gyakorolt maradvány enzimhatás szerepét kizárja az a tény is, hogy amennyiben a trombint a 30 perces inkubáció után hirudinnal gátoljuk és ezt követıen végezzük el a perfúziót, ugyanazt az eredményt kapjuk, mint gátlás nélkül. Az enzimatikus elıkezelés az adventitia trombogenitását nem befolyásolja. Izolált és fMLP-aktivált neutrofil granulocitákkal történı elıkezelés hatására a media vérlemezkékkel való fedettsége 18,11 ± 0,27 %-ra növekszik, ha a kísérletet ezen sejtek felülúszójával végezzük el, szintén hasonló eredményt kapunk (nincs ábrázolva). Ha a sejt-szuszpenzióhoz MMP-aktivátor APMA-t is adunk, a neutrofil granulociták trombogenitást fokozó hatása még tovább növekszik (21,77 ± 0,61 % borítottság a media rétegben). MMP inhibitorok izolált granulocitákhoz való adása (MMP-8 és -9 ellen)

43

szignifikánsan csökkenti a media réteg vérlemezkékkel való borítottságát (9,77 ± 0,56 %). Széles spektrumú szerin-proteáz inhibitor alkalmazásával (Pefabloc) hasonló hatás érhetı el (8,49 ± 0,47 %). Ha az MMP inhibitorokat és a Pefablocot kombinációban adjuk a neutrofil granulocitákhoz, a media réteg vérrel történı perfúzió utáni vérlemezkeborítottsága a natív metszetének megfelelı értékre csökken (1,61 ± 0,07 %). fMLP-vel nem aktivált sejtek nem befolyásolták szignifikánsan a media trombogenitását (2,43 ± 0,27 %). A neutrofil granulociták MMP-9 szekrécióját meghatároztuk a degranuláció bizonyítása érdekében. fMLP aktiváció hatására egy neutrofil granulocita 0,075 pg MMP-9-t szekretál. Ennek megfelelı koncentrációkat alkalmazva izolált enzimekkel is reprodukáltuk a neutrofil granulocita-hatásokat. Ezen kísérletek során az elıinkubációhoz 17 nM MMP-8-t, 10 nM MMP-9-t és 20 nM neutrofil elasztázt alkalmaztunk.

44

8. ábra

Vérlemezkék adhéziója az érfal media rétegéhez. Humán arteria iliaca keresztmetszetet inkubáltunk 30 percig PBS-vel (A) vagy PMN + fMLP + APMA-val (B). Ezutóbbi a (C) és (D) panelben listázott kezelések illusztrációjára szolgál. Kezelés után a metszeten

45

keresztül perfundáltunk citráttal antikoagulált teljes vért 3350 s-1 nyírási sebességgel 1,5 percig egy áramlási kamrában, melynek szerkezete a Módszerek és anyagok c. fejezetben ismertetésre került. A vérlemezkéket indirekt immunfluoreszcencia segítségével tettük láthatóvá. A (C) és (D) panelekben a media réteg vérlemezkékkel való százalékos borítottsága látható az összterülethez viszonyítva (átlag ± SEM, n = 5–32). A kísérleti összeállításokban a metszeteket 30 percen keresztül elıinkubáltuk a következı anyagokkal a vérrel való perfúziót megelızıen: (A ’trombin
hirudin’-val jelölt összeállításban a trombinnal történt inkubációt követte a hirudin hozzáadása és nem a trombinnal egyidıben alkalmaztuk a hirudint) PMN, 6000/µl neutrofil granulocita PBSglükózban; fMLP, 10 perc aktiváció 1 µM fMLP-vel az érkeresztmetszetek inkubációja elıtt; APMA, 1 mM APMA; Pefa, 100 µM Pefabloc; MMP-I, 5 µM MMP2/MMP-9 inhibitor I és 5 µM MMP inhibitor I keveréke. Csillaggal jelöljük, ha a különbség szignifikanciája p < 0,001.

4.2. Vörösvértest-tartalmú fibrin lítikus rezisztenciája

A nagy artériákban hasonló reológiai körülmények között, in vivo keletkezı trombusok vörösvértest tartalmában meglehetısen nagy különbség mutatkozik (10. ábra). Még egy trombuson belül is megfigyelhetıek eltérések a vörösvértest-tartalom tekintetében az ér geometriája, illetve az áramlási sajátosságok függvényében. A vörösvérsejtek fibrinolízisre kifejtett hatásának pontosabb megértése érdekében vörösvérsejt-tartalmú fibrin oldását tisztított fibrinogén és mosott vörösvérsejtek alkalmazásával vizsgáltuk. Két modellt állítottunk össze (9. ábra), az egyikben a növekvı vörösvértestszám mellett az össztérfogat állandó maradt, következésképpen az extracelluláris fibrinkoncentráció nıtt (1. modell), míg a másik modellben a vörösvérsejtszám növekedésével az össztérfogat is nıtt, így az extracelluláris fibrinkoncentráció állandó maradt (2. modell).

46

9. ábra

A fibrinolízis vizsgálatánál alkalmazott modellek szemléltetı ábrája. Modell 1: Állandó össztérfogat (Vt) mellett növekvı vörösvértest-tartalom, ennek következtében csökkenı extracelluláris térfogat (Vec) és emelkedı extracelluláris fibrinogén koncentráció([Fg] ec). Modell 2: Növekvı össztérfogat mellett állandó extracelluláris térfogat és állandó extracelluláris fibrinogén koncentráció.

Az ilyen körülmények között létrejött fibrinhálók a 11. ábrán (A, C) láthatóak. A fibrindús területek között megfigyelhetı néhány vörösvérsejt-mikroaggregátum, ahol a fibrinszerkezet jelentıs változást mutat a sejtmentes fibrinhálóhoz képest azonos fibrinkoncentráció esetén (11. ábra B). Minden esetben az intercelluláris fibrinhálóban vékonyabb fibrinszálakat és kisebb pórusokat találunk, ami tömöttebb hálót eredményez a sejt-mentes fibrinhez képest.

47

10. ábra

Artériás trombusok fibrin-struktúrája. A trombus eltávolítását követıen a trombusokat mostuk, fixáltuk és dehidráltuk, ahogyan az a Módszerek és anyagok c. részben leírásra került. BOM: ileo-femoralis bypass homograftból eltávolításra került trombus, JJ: femoro-popliteális bypass Dacron graftból eltávolításra került trombus. A képeken látható sejtes elemek elsısorban vörösvérsejtek.

Az integrin-dependens vörösvértest-fibrinogén kölcsönhatás fibrin-szerkezetre gyakorolt hatását az integrin-blokkoló eptifibatid adásával vizsgáltuk (12. ábra A). Az eptifibatidot olyan koncentrációban alkalmaztuk, melynél bizonyított a vörösvértestek fibrinogén kötésének gátlása.(28) A fibrin szerkezetében bekövetkezı változások közül a szálátmérı módosulása volt a leglátványosabb a vörösvértestek és eptifibatid hatására, így ezt a paramétert kvantitatív módon értékeltük fibrin-morfometriás módszerrel (12. ábra B). Minden esetben a vörösvértestek számának növekedése a trombusban a szálátmérı csökkenését vonta maga után (1. táblázat). Ez a hatás a modell 1-ben volt a legkifejezettebb (növekvı extracelluláris fibrinogén koncentráció mellett), ahol a 40 %-os vörösvérsejt-tartalom több, mint kétszeres csökkenést hozott a fibrinszálak átmérıjében.

48

A trombus vörösvérsejt-tartalma (teljes térfogat %-ban kifejezve)

11. ábra

Fibrinogénbıl vörösvérsejtek jelenlétében in vitro képzıdött fibrinháló. Fibrinogén 7,4 µM koncentrációban a trombus teljes térfogatában (A) vagy az extracelluláris térben (C) 16 nM trombinnal lett megalvasztva az ábrán látható vörösvérsejt-térfogat jelenlétében 1 órán keresztül inkubálva, 37ºC-on. Fixálást és dehidrálást követıen készültek a SEM felvételek, a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtak szerint. A (B) sorban látható fibrinhálók vörösvérsejtek távollétében készültek 8,2, 9,1 és 12,4 µM fibrinogén koncentrációk alkalmazásával (balról jobbra), ami megfelel az (A) sorban látható extracelluláris fibrinogén koncentrációknak a vörösvértestek térkitöltése miatt.

49

12. ábra

Eptifibatid és vörösvérsejtek jelenléte következtében kialakuló fibrin-szerkezetbeli változások. A fibrin minták a 11. ábránál leírtak alapján készültek vörösvérsejtek és eptifibatid jelenlétében (A). A szálak vastagságát a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtak szerint határoztuk meg (B).

50

Ha plazminogén tartalmú fibrinogént trombinnal és tPA-val összekeverünk, az alvadást követıen a plazminogén aktivátor egyenletesen oszlik el a trombusban, a plazminogén aktiválódik és a keletkezı plazmin feloldja a fibrinhálót. Az oldódás hatására a fibrinháló elveszíti a stabilitását, aminek következtében az alvadék tetejére helyezett acélgolyó a csı aljára süllyed. A plazminogén aktiváció sebességétıl, illetve a keletkezı plazmin katalítikus hatékonyságától függıen a golyónak különbözı idıtartamokra van szüksége a csı aljának eléréséhez. A módszerrel jól követhetı a fibrin mechanikai stabilitásának változása. A teszt során a lízis-idıt határozzuk meg végpontos méréssel, mely a golyó csı aljára való érkezésének pillanata. A két modellben a fibrinkoncentrációk különbözıek, ám mindkét esetben elmondható, hogy 10 és 40 % vörösvérsejttartalom az alvadékban lelassítja az intrinsic tPA-indukálta fibrinolízist, míg az eptifibatid teljesen vagy részlegesen kiküszöbölte a vörösvértestek hatását (13. ábra). 20 % vörösvértesttartalomnál ellentmondásos eredményt kaptunk, a lízisidı megnyúlása ebben az esetben nem volt szignifikáns a kontroll lízishez képest, ezért ezen komplex fibrinolítikus tesztet két lépésre bontottuk és így vizsgáltuk a vörösvérsejtek lehetséges szerepét, hiszen korábbi adatok is mutatják, hogy a fibrin szerkezet eltérı hatást fejthet ki a plazminogén aktivációra és a fibrin feloldására.(77) Ha tPA-t olyan fibrinfelszínre adagoljuk, mely növekvı számú vörösvértestet tartalmaz, akkor a plazmin csökkenı felülető és változó struktúrájú fibrinfelszínen képzıdik, mert a határvonalat részben vörösvértestek foglalják el (1. táblázat). Ez a jelenség szintén befolyásolja a plazminogén-aktivációt.(77) A Modell 1 körülményei között 30-perces aktiváció után 36,6; 44,6 és 25,6 %-val több plazmin keletkezett a 10, 20 és 40% vörösvértestet tartalmazó fibrinalvadék felszínén (13. ábra A). Mindazonáltal a sejtmentes fibrinalvadék felszínén a Modell 1-re jellemzı extracelluláris fibrinogénkoncentrációk mellett a plazmintermelés csökkent a növekvı fibrinogénkoncentrációkkal párhuzamosan (12,4 µM fibrinogén-koncentráció mellett 22,2 %-val kevesebb plazmin keletkezett, mint 7,4 µM fibrinogén mellett, adat nem került ábrázolásra).

51

1. táblázat. A

fibrinszál-átmérı

értékei

különbözı

mennyiségő

vörösvértestet

tartalmazó

alvadékokban. Az átmérı eloszlásához tartozó medián és interkvartilis értékek (zárójelben) nm mértékegységben vannak megadva. A kontroll értékek sejtmentes fibrinre vonatkoznak,

mely

a

Modell

1-ben

megfigyelhetı

fibrinogén

koncentrációk

alkalmazásával készült (extracelluláris fibrinogén koncentráció, mely a fibrinogén sejtek általi kizárásából kifolyólag változik). A Modell 2-ben az extracelluláris fibrinogénkoncentráció állandó (7,4 µM), így a kontroll érték 155,0 (71,1) nm eptifibatid távollétében, illetve 162,3 (82,6) nm 20 µM eptifibatid jelenlétében. A szálátmérıkben detektálható különbségek vörösvérsejtek jelenlétében szignifikánsak a megfelelı kontroll értékekhez képest (p<0,001).

Fibrinszál-átmérı (nm) különbözı mennyiségő vörösvérsejtet tartalmazó alvadékokban nincs eptifibatid Modell 1

20 µM eptifibatid

Modell 2

Modell 1

Modell 2

térfogat

+VVT

kontroll

+VVT

+VVT

kontroll

+VVT

10 %

110,5†

169,5†

158,4†

136,3†

170,3†

166,3

(29,3)

(91,2)

(89,9)

(69,6)

(85,6)

(82,7)

89,8*

172,6

101,6*

164,5*

180,0

179,2*

(26,1)

(98,6)

(49,8)

(94,6)

(86,1)

(88,2)

95,8*

204,2*

92,2*

140,8*

213,7*

168,7

(30,6)

(104,2)

(33,1)

(86,7)

(114,9)

(86,4)

20 %

40 %

1. táblázat

A Modell 1-ben, növekvı vörösvértestszám mellett megfigyelhetı plazminogén-aktiváció harang-alakú eloszlásával szemben lineáris csökkenés mutatkozik a keletkezı plazmin mennyiségében növekvı vvt-sejtszám és állandó extracelluláris fibrinogén-koncentráció mellett (13. ábra B).

52

13. ábra

Az alvadékban eloszlatott tPA-indukálta fibrinolízis vörösvértestek jelenlétében. Fibrinogén 7,4 µM koncentrációban az alvadék teljes térfogatában (A) vagy az extracelluláris térben (B) 85 nM trombinnal megalvasztva a jelzett mennyiségő vörösvérsejt (%) jelenlétében. Az extracelluláris térben minden alvadék 0,1 µM plazminogént és 1 nM tPA-t tartalmazott, valamint a jelzett esetekben 20 µM eptifibatidot is. A teljes térfogat az (A) táblán jelzett esetekben 2 ml, a (B) táblán jelzett esetekben 0,8; 0,9; 1,0 és 1,35 ml a 0, 10, 20 és 40 % vörösvértestre vonatkoztatva, így az alvadékokban a fibrin mennyisége megegyezı volt. 15 másodperc alvasztás után az alvadék felszínére acélgolyót helyeztünk és mértük az idıt, mely alatt a golyó a csı aljára süllyed eptifibatid távollétében (fekete oszlopok) és jelenlétében (szürke oszlopok). Az adatok átlagát és a standard deviációt (n=4) ábrázoltuk, csillaggal jelöltük a szignifikáns különbséget

53

(p<0,05) a sejtmentes fibrintıl, és kereszttel a szignifikáns különbséget (p<0,05) az eptifibatid-mentes

és

eptifibatid-kezelt

fibrinektıl,

melyek

azonos

vörösvértest-

tartalommal rendelkeztek, a p értékek Kolmogorov-Smirnov teszttel lettek meghatározva.

14. ábra

Plazminogén aktiváció vörösvértest-tartalmú fibrin-felszínen, ahol a fibrinogén koncentráció 7,4 µM az alvadék teljes térfogatában (A) vagy az extracelluláris térben (B). Az alvasztás 16 nM trombinnal történt a jelzett mennyiségő vörösvértest jelenlétében 30 percig, 37ºC-on (Az (A) ábrán lévı adatokhoz, ahol minden csıben a növekvı sejtszámnak köszönhetıen növekvı extracelluláris fibrinogén koncentrációk találhatóak, szükséges minden mintához egy sejt-mentes kontroll, de csak a 9,1 µM fibrinogént tartalmazó kontroll került bemutatásra, mely a 20 % vörösvértest-tartalomhoz tartozik).

54

A plazminogén koncentráció 0,5 µM volt az extracelluláris térben. A mérések eptifibatid távollétében (fekete oszlopok) vagy 20 µM eptifibatid jelenlétében (szürke oszlopok) történtek. Mindezek után 15 nM tPA-t pipettáztunk az alvadék felszínére 30 perc 37ºC-on történı inkubáció után, majd a folyadék fázisban plazmin aktivitást mértünk a Módszerek és anyagok címő fejezetben leírtak szerint. Az adatok átlagát és a standard deviációt (n=4) ábrázoltuk, csillaggal jelöltük a szignifikáns különbséget (p<0,05) a sejtmentes fibrintıl, és kereszttel a szignifikáns különbséget (p<0,05) az eptifibatid-mentes és eptifibatid-kezelt fibrinektıl, melyek azonos vörösvértest-tartalommal rendelkeztek, a p értékek Kolmogorov-Smirnov teszttel lettek meghatározva.

Mivel mindkét modellben az aktiválási határfelületet elfoglaló vörösvértestek mennyisége

megegyezik,

a

plazmin

keletkezésében

megfigyelhetı

különbség

valószínőleg a fibrinszerkezet eltéréseibıl adódik. Ezzel párhuzamosan 20 µM eptifibatid mérsékelte a legmagasabb vörösvértest-számok hatását a fibrin-dependens plazminogén aktivációra mindkét modellben (fibrin távollétében az eptifibatid stimulálta a tPA-általi plazminogén aktivációt, mely következtében 20 %-val több plazmin keletkezett 30 perc elteltével, adat nem került bemutatásra). Az alvadék folyadék fázisában lejátszódó fibrin, tPA és a vörösvérsejtek közötti kölcsönhatást konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. A vizsgálat során megfigyeltük a tPA-GFP behatolását az alvadékba, a lítikus határvonal haladását a fluoreszcensen jelölt fibrinben és a szintén fluoreszcensen-jelölt vörösvérsejtek felszabadulását az alvadékból. Saját és más eredmények alapján is kimondható,(77,90) hogy a tPA-GFP hozzáadását követıen 10 perccel már megfigyelhetı egy intenzív tPA-feldúsulás a sejtmentes fibrin felszínén, mely intenzív határvonal formájában rajzolódik ki (15. ábra A, B). Amennyiben a fibrinháló vörösvérsejteket is tartalmaz a tPA feldúsulása elmarad (15. ábra A, B). A fibrin oldását a határréteg mozgásának detektálásával tudtuk követni (15. ábra C). 20-40 % vörösvérsejt-tartalom szignifikánsan csökkentette a fibrin feloldását 25 perc tPA-expozíció után, a legnagyobb különbséget 30 percnél elérve (3,5x csökkenés a lítikus front által megtett útban). Ezt követıen némileg felgyorsult az oldás, de a

55

különbség 55 perc után is majdnem 2x maradt. A vörösvérsejtek felszabadulása az alvadékból a lízissel párhuzamosan történt (15. ábra B).

15. ábra

Vörösvérsejtek hatása a felszíni tPA-indukálta fibrinolízisre. A fibrin alvadékok 80 nM Alexa546-jelölt fibrinogént tartalmazó 7,4 µM koncentrációjú fibrinogénbıl, Vybrant

56

DiD-jelölt vörösvértestekbıl, 0,5 µM plazminogénbıl készültek 16 nM trombin hozzáadásával. Ezek után 60 nM tPA-GFP került a fibrin felszínére és a fibrin-folyadék határréteg mozgását konfokális mikroszkóppal követtük három különbözı hullámhosszon. Az (A) ábrán látható felvételek 5 perccel, míg a (B) ábrán láthatóak 40 perccel a tPAGFP hozzáadása után készültek (a tPA-jel zöld, a fibrin piros és a vörösvértestek fehérek). A (C) ábrán látható a fibrin-folyadék határréteg által megtett útvonal a lízisidı függvényében (átlag és SD 3 mérésbıl számolva). A görbék melletti számok az alvadék vörösvértest tartalmát jelzik (%). Bizonyos mérések során 20 µM eptifibatidot is adtunk a rendszerhez (szaggatott vonal).

4.3. A VWF alternatív hasítása

4.3.1. A VWF proteolízise statikus körülmények között

A VWF hasítását fiziológiás proteáz-koncentrációk alkalmazásával vizsgáltuk. A plazmin 5 nM koncentrációban, mely koncentráció elegendı arra, hogy a plazmin teljesen feloldja a fibrint (elsıdleges intravaszkuláris szubsztrátját) 30 perc alatt,(60) azonos inkubációs idı alatt VWF hasítási termékeket hozott létre (16. ábra A). Trombolítikus terápia során keletkezı plazminkoncentrációval (100 nM felett)(91) majdnem teljesen lebontotta az intakt VWF monomereket 30 perc alatt és a kezdeti hasítási termékek már 1,5 perc után detektálhatóak voltak (16. ábra B). Bár a neutrofil elasztáz eltérı hasítási termékeket állított elı (17. ábra A), hatékonysága a VWF hasításában hasonló a plazminéhoz identikus koncentrációk alkalmazásával (17. ábra B). Az elasztáz és plazmin hatásával szemben az MMP-9 és MMP-8 20 nM koncentrációban alkalmazva, mely mennyiséget neutrofil granulocita szuszpenzióban mérhetünk fiziológiás sejtszámot feltételezve,(60) a VWF-t csak nagyon lassan hasították, hasítási terméket csak 24 órás inkubáció után tudtunk detektálni. A trombin hasítási képessége a mátrix metalloproteinázokhoz hasonlóan igen alacsony volt, hasítási termék még 30 perces 100 nM trombinnal történt inkubáció után sem volt detektálható. Ez a trombin koncentráció tízszer magasabb, mint a vérben alvadáskor megfigyelhetı.(60)

57

4.3.2. A VWF hasítása statikus körülmények között vérlemezkék jelenlétében

A vérlemezkék hatását a VWF-proteolízisre két módszerrel is vizsgáltuk: az egyik a risztocetin indukálta vérlemezke agglutináció (RIPA) aggregométer segítségével, a másik pedig immunoblot a VWF hasítási termékek detektálására (18. ábra). A kísérletek során mosott vérlemezkéket alkalmaztunk. A mosás során az esetlegesen elıforduló enzim inhibitorok eltávolításra kerültek. A plazmin csökkentette a vérlemezkék maximális aggregációját, majd a késıbbiekben az aggregátumok szét is estek (18. ábra) Az ezen vizsgálattal párhuzamosan végzett immunoblot segítségével VWF hasítási termékeket tudtunk detektálni (18. ábra Inset), de a megjelenésük szignifikánsan késıbb következett be, mint a vérlemezkék távollétében végzett kísérletek során (18. ábra összevetve a 16. ábra B-vel). A ristocetin önmagában nem gátolta a VWF hasítását (ábra nem került bemutatásra). A többi vizsgált proteáz (neutrofil elasztáz, trombin, MMP-8 és -9) nem hozott létre hasítási termékeket vérlemezkék jelenlétében és nem csökkentette a maximális aggregációt sem RIPA során (az adatok nem kerültek ábrázolásra). Az eredményekbıl levonhatjuk azt a következtetést, hogy a vérlemezkék protektív hatást fejtenek ki a VWF-ra különbözı proteázok hasításával szemben.

4.3.3. VWF proteolízise áramlási körülmények között

A VWF proteolízisét áramlási körülmények között áramlási kamra segítségével vizsgáltuk. Ennek során izolált VWF oldatot vagy VWF-oldat és liofilizált vérlemezke keveréket áramoltattunk trombogén felszín felett nagy nyírási sebességgel (3350 s-1) 1,5 percig, melyet proteáz oldattal történı perfúzió követett (19. ábra). Az eredmények alapján úgy tőnik, hogy a nyíróerık érzékenyítik a VWF-t proteázok hatásával szemben. Az 1,5 perces perfúzió kifejezettebb hasítást eredményezett a plazmin, neutrofil elasztáz és trombin által, mint statikus körülmények között hasonló enzimkoncentrációk alkalmazásával (19. ábra a 16. ábrával összevetve). A korábban említett fiziológiás MMP-8 és -9 koncentrációkkal (20 nM) sem sikerült hasítási termékeket generálni, áramlási körülmények között sem (az adatok nem kerültek bemutatásra). A statikus rendszerrel szemben, a perfúziós kamrában a neutrofil elasztáz és trombin hatásától a

58

vérlemezkék nem tudták megvédeni a VWF-t, ám a plazmin aktivitást képesek voltak fokozni (19. ábra).

4.3.4. A VWF funkciójának módosulása proteolízis hatására

A VWF-dependens vérlemezke adhéziót artificiális kollagén-felszínen vagy arteria iliaca keresztmetszeten vizsgáltuk. A vérrel történı kezdeti perfúziót követı proteáz-mentes pufferrel történı áramoltatás nem oldotta le a kitapadt vérlemezkéket a trombogén felszínrıl (20. ábra A), míg a proteáz oldatokkal történı perfúzió esetén szignifikáns csökkenés volt detektálható a trombogén felszínhez tapadt vérlemezkék számában, amennyiben a proteáz oldat plazmin, neutrofil elasztáz vagy trombin volt, míg a mátrix metalloproteinázok esetében ilyen hatást nem figyelhettünk meg (20. ábra B).

VWF hasítása plazminnal statikus körülmények humán

között.

VWF-t

Tisztított

(10

µg/ml)

inkubáltunk plazminnal a jelzett koncentrációk alkalmazásával 30 percen keresztül (A) vagy 100 nM plazminnal

változó

inkubációs

idıket alkalmazva (B) 37ºC-on. A proteolízis következtében keletkezı hasítási termékeket Western Blottal detektáltuk a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtak szerint.

16. ábra

59

17. ábra

VWF hasítása neutrofil elasztázzal statikus körülmények között. Izolált humán VWF-t (10 µg/ml)

neutrofil

elasztázzal

inkubáltunk

30

percen

keresztül

a

jelzett

enzimkoncentrációkkal (A) vagy 50 nM elasztázzal különbözı inkubációs idıket alkalmazva (B) 37ºC-on. VWF hasítási termékeket Western Blot analzissel detektáltuk.

VWF

proteolízise

statikus

körülmények között vérlemezkék jelenlétében.

Az

agglutináció

létrehozásához

ristocetint

alkalmaztunk

1,5

mg/ml

koncentrációban, amit 200000/µl vérlemezkét és 10 µg/ml izolált VWF-t

tartalmazó

oldathoz

adtunk. A reakció során az oldat transzparenciáját aggregométer

detektáltuk

segítségével.

A

jelzett esetekben a ristocetin hozzáadása elıtt plazmint adtunk az oldathoz. Az aggregációs görbék 5 mérést reprezentálnak.

18. ábra

60

19. ábra

VWF hasítása plazminnal, neutrofil elasztázzal és trombinnal áramlási körülmények között. 10 µg/ml VWF-t vagy 10 µg/ml VWF és 200000/µl liofilizált vérlemezke keverékét (A, B, C ’vérlemezkével’) perfundáltuk 3350 s-1 nyírási sebességgel kollagén felszín felett a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtaknak megfelelıen. Ezek után plazmint (A), neutrofil elasztázt (B) vagy trombint (C) perfundáltunk a trombogén felszín felett azonos nyírási sebességgel. Az átáramló folyadékból VWF hasítási termékeket detektáltunk Western Blot analízissel.

61

20. ábra

Trombogén felszín vérlemezkékkel való borítottsága. Kollagén vagy humán a. iliaca felszín felett citráttal antikoagulált teljes vért áramoltattunk 3350 s-1 nyírási sebességgel áramlási kamrában 1,5 percen keresztül a Módszerek és anyagok c. fejezetben leírtaknak megfelelıen. A vérrel való perfúziót egy PBS-vel (kontroll) vagy 10 nM plazminnal végzett perfúzió követte. A vérlemezkéket indirekt immunfluoreszcenciával tettük láthatóvá, a felvételek vérlemezkével való borítottságát pedig meghatároztuk mind a kontroll, mind az enzim oldattal történt perfúzió után (10 nM plazmin, 10 nM neutrofil elasztáz, 100 nM trombin, 20 nM MMP-8, 20 nM MMP-9). A (B) ábrán a trombogén

62

felszín vérlemezkével való százalékos borítottsága van ábrázolva a teljes területhez viszonyítva (átlag ± SEM, n=5, * p<0,01).

63

5. MEGBESZÉLÉS

5.1. Neutrofil granulocita eredető enzimek hatása a VWF-dependens vérlemezke adhézióra

Kísérleteinkben áramlási kamrát használtunk a VWF-dependens vérlemezke adhézió modellezésére,

melyben

trombogén

felszínen

keresztül

áramoltattunk

citráttal

antikoagulált teljes vért, és a vérlemezke adhézió trombin-independens fázisát vizsgáltuk, melyet el tudtunk így különíteni a trombin-dependens fázistól, mely a vérlemezkék aktivációjával jár, ez a mi rendszerünkben nem történhetett meg a citrát jelenléte miatt. A perfúziós kamrában a vér az érfal mindhárom rétegével kapcsolatba kerül, mely incíziós sérülést vagy ateroszklerotikus léziót(92) modellez, és lehetıvé teszi mindhárom érfalréteg trombogenitásának vizsgálatát. Az artéria keresztmetszetek alkalmazása azt is lehetıvé teszi, hogy az érfalat természetes körülmények között vizsgáljuk, hiszen nem alakul ki olyan jellegő mechanikai perturbáció, mint például azon modellekben, melyekben az intima eltávolításra kerül.(93) A vérlemezke adhézió VWF-dependens voltát anti-VWF antitesttel verifikáltuk, mely megakadályozta a vérlemezkék kötıdését a natív adventitia réteghez, valamint a kondroitináz ABC- és ecetsav-kezelt mediához is.(85) Kétlépcsıs kísérleti összeállításunk lehetıvé teszi, hogy elkülönülten történjen az érfal kezelése neutrofil granulocitákkal, és a vérlemezkék adhéziója az érfalhoz, aminek következtében elkerülhetı a neutrofil granulociták és vérlemezkék közötti közvetlen kölcsönhatás, ami elısegíthetné a vérlemezke adhéziót. Az artéria keresztmetszeten keresztüláramoltatott vérben található nagy mennyiségő proteáz inhibitor pedig semlegesíti az esetlegesen az érfalhoz kötıdött enzimmaradványokat, így azok biztosan nem befolyásolják a vérlemezkék funkcióit. Ezen megfontolások következtében tehát biztosra vehetı, hogy a vérlemezkék adhéziójában megfigyelhetı változás a keresztmetszetek elızetes enzimatikus kezelésének köszönhetı. Jelen eredményeink és korábbi közlemények alapján kimondható, hogy nagy nyírási sebesség mellett a vérlemezkék a natív arteriális media réteghez igen kis mértékben kötıdnek, adhéziójuk elsısorban az adventitia rétegre lokalizálódik (8. ábra A).(85,92) Ez a jelenség az incíziós sérülés vagy ruptúrált ateroszklerotikus lézió helyén gyengíti a

64

trombusképzıdést, és lehetséges, hogy egy más, ellensúlyozó hatás felelıs a megfelelı vérlemezke-dugó kialakulásáért. Tekintve, hogy a neutrofil granulociták a trombus komponensei, melyek befolyásolják mind a trombusképzıdést, mind a trombolízist,(48) új szerepet feltételeztünk ezen sejteknek a trombusképzıdés iniciációjában. A sejtek és az érfal kölcsönhatása a media réteg szerkezetének megváltozását eredményezi, aminek következtében az trombogénné válik. Az érfal rövid (30 perces) expozíciója ezen sejtek számára már létrehozza a fent említett hatást, melyet mátrix metalloproteináz inhibitorok és szerin-proteáz inhibitorok alkalmazásával fel lehet függeszteni. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a neutrofil granulocitákból származó enzimek proteolítikus hatása felelıs a media szerkezetének megváltoztatásáért (8. ábra C és D). A neutrofil granulociták elsısorban mátrix metalloproteinázokat (MMP-8 és -9) valamint szerin-proteázokat (neutrofil elasztáz, katepszin G) szecernálnak. Ezen enzimek nagyrésze a sejtek membránjához kötve marad,(94,95) mely lehetıvé teszi azt, hogy a sejtek, melyek igen szoros kötıdésre képesek, létrehozzanak egy olyan mikrokörnyezetet, melybıl a különbözı proteáz inhibitorok kizárásra kerülnek, így olyan magas enzimkoncentráció érhetı el, mely a helyi védekezı mechanizmusok kapacitását felülmúlja. Az azurofil granulumokban lévı elasztáz koncentráció millimoláris nagyságrendő, és a helyi inhibitor koncentrációnál két nagyságrenddel magasabb érték, így szekréciója következtében egy proteolítikusan igen aktív pericelluláris zóna keletkezik.(87,88) A mátrix metalloproteinázok szerepe a trombin-indukálta vérlemezkeneutrofil granulocita kölcsönhatásban statikus körülmények között jól ismert,(96) ám keveset lehet tudni szerepükrıl az érfal-vér találkozási felületen a trombusképzıdésnek azon szakaszában, mely a véralvadást megelızi. Eredményeink azt mutatják, hogy az artéria keresztmetszetek részleges proteolízise a neutrofil granulocitákból származó proteázok bármelyikével csökkenti a media réteg tromborezisztenciáját (8. ábra C). A proteáz inhibitorok hatása a neutrofil granulociták által kiváltott vérlemezke adhéziónövekedésre, valamint az, hogy a neutrofil granulociták által közvetített hatásokat reprodukálni tudtunk izolált enzimek alkalmazásával, a hatás proteolítikus hátterét megerısíti. Egy korábbi tanulmány,(85) amely a kísérleti összeállításunkban került kivitelezésre, a vérlemezke adhézió VWF-dependens jellegét igazolja. Mivel a reaktív mátrix

65

összetételének szerepe a vérlemezke adhézióban jól definiált,(97) ezért a vérlemezke adhézió különbségeinek okait az érfal media és adventitia rétegének szerkezeti különbségei felıl próbáltuk megközelíteni, mely vizsgálatokhoz atomerı mikroszkópot (AFM) és pásztázó elektronmikroszkópot (SEM) használtunk. A vizsgálatok során a reaktív mátrix elrendezıdését és elérhetıségét tanulmányoztuk a natív adventitia és media rétegben, valamint a proteolítikusan elıkezelt media rétegben. Az extracelluláris mátrix általunk detektált alapállapota (5. és 6. ábra) megfelel a humán artériák falstruktúrájáról

korábban

megjelent

közelmények

SEM

és

AFM

vizsgálatai

leírásának.(98) Mindkét vizsgálattal megerısítettük, hogy a kollagénrostok az adventitiában igen jól elérhetıek (5. ábra A és B; 6. ábra A és C), ami megmagyarázza ezen réteg képességét a vérlemezkék kötésére (8. ábra A). Ezzel szemben a media rétegben a kollagénszálak szerkezete nem felismerhetı AFM technikával annak ellenére, hogy ez a réteg is bıségesen tartalmaz kollagénrostokat (5. ábra C). Az AFM technikával nem tudtunk további információt nyerni a media szerkezetérıl, lehetséges, hogy az AFM tő és a kollagénrostok közötti amorf alapállomány között fellépı adhézió miatt. A további lépéseket SEM segítségével tettük meg. Az érfal festése Cupromeronic Blue festéssel láthatóvá teszi a fent említett amorf alapállományt, elsısorban a negatív töltéssel rendelkezı proteoglikánokat (ezt kondroitináz ABC kezeléssel erısítettük meg, amely eltávolította a detektált extracelluláris mátrix komponenseket 7. ábra A), melyek a kollagénrostok felszínén illetve a rostok között elhelyezkedı vaskos kötegek (6. ábra E, F). Az érmetszetek enzimatikus vagy neutrofil granulocitákkal történt elıkezelése a kondroitináz ABC kezeléshez hasonlóan eltávolította a kollagénrostok felszínérıl az említett proteoglikán kötegeket a SEM felvételeken (7. ábra B-F), és láthatóvá tette a kollagénrostok jellegzetes harántcsíkolt mintáját az AFM felvételeken (5. ábra E-H). Ezek az eredmények megmagyarázzák az artériák media rétegének tromborezisztenciáját és annak eltőnését proteolízis hatására. A proteoglikánok nagy valószínőséggel a kollagénrostok azon részeirıl kerülnek eltávolításra, mely részek a VWF kötéséért felelısek. A kollagénrostok háromdimenziós struktúrája igen bonyolult, ezért a VWF kötıhelyek elhelyezkedésérıl olyan szintetikus tripla-helikális peptidek segítségével lehetett csak információt nyerni, melyek humán III-as kollagén D2 régiójához kötıdnek.(99) A natív kollagén szerkezetének molekuláris megjelenítésére vonatkozó

66

modellekben tisztán látható, hogy proteolítikus hasítással elérhetıvé válnak különbözı ligand- vagy enzim-kötı régiók a kollagén szerkezetében.(100,101) Mindezek fényében valószínősíthetı, hogy a kollagénhez asszociált proteoglikánok maszkírozzák a VWFkötı helyeket az arteriák media rétegében, mely proteolízis során szabaddá válik és lehetıvé teszi a vérlemezkék adhézióját az érfal ezen rétegéhez is. A trombogenitásfokozódásához nem szükséges a proteoglikánok teljes mértékő eltávolítása, melyet jól jelez a trombin esetében tapasztalható jelenség is, miszerint a trombin csak részleges proteoglikán-eltávolításra képes (5. ábra F), ám ez elegendı egy igen nagymértékő vérlemezke-adhézió-fokozódáshoz (8. ábra C). Az érfal szerkezetének megváltoztatása a trombin véralvadásban betöltött szerepének egy új aspektusára hívja fel a figyelmet, hiszen a trombin vérlemezke-aktiváló hatása részletesen jellemzett,(102) ám az érfal struktúrájára gyakorolt hatásáról ezidáig nem volt elérhetı információ.

5.2. Vörösvértestek hatása a fibrinolízisre

A vérben a hemosztatikus homeosztázis fenntartása érdekében kényes egyensúly jött létre az alvadási folyamatok és a fibrinolízis között, mely egyensúlyt a vörösvértestek befolyásolják. Súlyosan anémiás betegek vérzékenységi problémákkal küzdenek, melyek orvosolhatóak mosott vörösvértestek transzfúziójával,(103) ezzel szemben polycythemia veraban szenvedı betegek magas vörösvérsejtszámmal rendelkeznek, mely gyakran jár együtt (a betegek több, mint egyharmadában) trombotikus komplikációkkal.(104) Mindazonáltal a trombus vörösvértest-tartalma nem feltétlenül korrelál a szisztémás vörösvértest-számmal, mert egyéb faktorok, mint például az áramlási körülmények, a geometriai sajátosságok, különösen szőkületekben, befolyásolják a sejtek eloszlását az erek lumenén belül.(105) Mindezek fényében nem meglepı, hogy eltérı mennyiségő vörösvértest detektálható akár ugyanarról a helyrıl származó, sebészileg eltávolított trombusokban is (10. ábra). Kísérleteink során arra törekedtünk, hogy meghatározzuk a vörösvértestek szerepét a trombus stabilitásában a fibrinolízis szempontjából, hiszen az már ismert, hogy az alvadást képesek ezen sejtek befolyásolni, például negatív töltéső foszfolipidek

által

létrehozott

felszín

szolgáltatásával

számára.(106)

67

a

véralvadási

reakciók

Annak

érdekében,

hogy

a

plazma

inhibitorok

kísérletet

befolyásoló

hatását

kiküszöböljük, az alvadékokat tisztított fibrinogénbıl és mosott vörösvértestek felhasználásával készítettük. A fibrinháló feloldását pontosan ismert koncentrációjú plazminogénnel és tPA-val indítottuk, így igen kevés változóval kellett számolnunk. Az oldást két kísérleti összeállításban vizsgáltuk, az egyik az „alvadékban eloszlatott tPA” modell, mely során a tPA egyenletesen el van oszlatva a vörösvértest-fibrin alvadékban 1 nM koncentrációban, mely a humán artériás trombusokban mért tPA mennyiségnek felel meg.(107) Ez az összeállítás azt a szituációt modellezi, amikor az érsérülés helyén az alvadás és a fibrinolízis egyszerre indul meg. A másik összeállítás az „felszínre adagolt tPA” modell, amely során a tPA a már létrejött fibrin-vörösvértest alvadék felszínére kerül 60 nM koncentrációban, mely megfelel a vérben mérhetı tPA koncentrációnak enzimatikus trombolízis során,(108) modellezve a terápiás szisztémás plazminogén aktivátor adagolást. Bár a kísérleti összeállítások különböztek, a vörösvértestek hatása ugyanolyan volt mindkét esetben: a trombus növekvı vörösvértest-tartalmával párhuzamosan nıtt az alvadék rezisztenciája a lízissel szemben (13. ábra és 15. ábra C). A vörösvérsejtek fibrinolízist-gátló hatása, mely már fiziológiás sejtszám mellett is kifejezésre jut, az alvadás-fibrinolízis közötti egyensúlyt az alvadás irányába tolja és ezáltal képes lehet a trombus idı elıtti feloldásának gátlására, valamint hozzájárulhat a polycythemia

veraban

megfigyelhetı

trombotikus

komplikációk

kialakulásához.

Mindezek mellett a trombusokban megfigyelhetı eltérı vörösvértestszám (10. ábra) lehet az egyik oka a trombusok eltérı érzékenységének a trombolízissel szemben trombolítikus terápia során szívinfarktus vagy agyvérzés után. A vörösvérsejtek által okozott fibrinolítikus rezisztenciát ultrastruktúrális és kinetikus módszerekkel közelítettük meg. SEM felvételeken jól látszik, hogy a vörösvértesttartalmú fibrinhálóban a fibrinszálak vékonyabbak a vvt-dús területeken (12. ábra). A mérések két kísérleti összeállításban történtek: a fibrinkoncentráció állandó szinten tartásával, melynél a növekvı vvt-tartalom mellett az extracelluláris fibrinkoncentráció értelemszerően folyamatosan növekedett vagy az extracelluláris fibrinkoncentráció állandó szinten tartásával a növekvı sejttérfogat mellett. Az utóbbi összeállításban a fibrinszálak átmérıje folyamatosan csökkent a sejttérfogat növekedése mellett (1. táblázat), míg az elsı összeállításban az átmérı csökkenése mellett a szálak sőrősége

68

növekedett a növekvı fibrinkoncentráció miatt (1. táblázat, 12. ábra). A süllyedéses módszerrel mért lízis idı a fibrin szálátmérı változásaival fordítottan arányos és nem közvetlenül az alvadékban mérhetı vvt-térfogattal (13. ábra). Ha eptifibatidot adunk a rendszerhez, amely a vörösvértestek fibrinogén receptorának gátlószere, akkor az megfordítja a vörösvértestek hatását a szálak szerkezetére (12. ábra, 1. táblázat) és a sejtek gátló hatását a fibrinolízisre is (13. ábra). Ezek szerint a vörösvértestek lítikus rezisztenciát kialakító hatásának legfıbb oka a fibrin struktúrájának megváltoztatása. Ez az eredmény egybeesik azon korábbi megfigyelésekkel, miszerint ha a fibrinszálak átmérıje különbözı hatások miatt csökken, akkor a fibrinoldás sebessége is alacsonyabb lesz mind az „alvadékban eloszlatott tPA”,(77,109) mind a „felszínre adagolt tPA”(110) modellekben. Mivel a lízis idı mérése során komplex reakciót vizsgálunk (plazminogén aktiváció és a fibrin proteolízise), melynek csak a végkimenetelét detektáljuk, ezért a két fázist megpróbáltuk egymástól elkülöníteni kinetikus és konfokális mikroszkópos mérésekkel, mely során a vörösvértestek a különbözı fázisokra kifejtett hatásait térképeztük fel. A plazminogén aktiváció során keletkezı plazmin mennyisége az alvadék felszínén a 1-es modellben nıtt vörösvértestek jelenlétében (14. ábra A), ami igen meglepı annak fényében, hogy ilyen esetben a fibrinoldás sebessége csökken. Mindemellett a 2-es modellben a plazminogén aktiváció folytonosan csökken a vörösvértestek számának növekedésével (14. ábra B). Ezen ellentmondásos adatokat magyarázhatjuk azzal, hogy két faktor egymással ellentétes hatásáról van szó, hiszen a magasabb vvt-szám vékonyabb fibrin szálátmérıvel jár (1. táblázat), amik jobb kofaktorok a tPA-katalizálta plazminogén aktiváció számára.(77) Másrészrıl viszont a növekvı vvt-szám több sejtet jelent az alvadék felszínén is, ami viszont csökkenti a plazminogén elérhetıségét. Így a fibrinszálak kofaktor hatása dominál a növekvı fibrinkoncentráció és vékony szálak esetén (14. ábra A), míg az állandó fibrinkoncentráció alkalmazásánál a sejtek növekvı térfogata és felszíne csökkenti a plazminogén aktivációt a vékonyabb szálak ellenére (14. ábra B). A plazmin keletkezésének sebességétıl függetlenül mindkét összeállításban a vörösvértestek csökkentik a fibrin oldásának sebességét (13. ábra), ami azt suggalja, hogy a plazmin által katalizált proteolítikus szakasz dominál a fibrinolízis lefolyásának szabályozásában növekvı térfogatú rendszer esetén. Konfokális mikroszkóppal készített

69

felvételeken

egyértelmő,

hogy

a

tPA-GFP

felhalmozódása

a

fibrin-folyadék

határrétegben késleltetett vörösvértestek jelenlétében (15. ábra A, B). Eptifibatid alkalmazásával megerısíthettük a megfigyeléseinket, miszerint a plazminogén aktiváció nehezített vvt-fibrin alvadékok felszínén (14. ábra). Ezen vörösvértest fibrinogén receptorának inhibitora növeli a szálak átmérıjét (1. táblázat), így megszünteti a vvt-közvetítette kofaktor hatásait a fibrinszálaknak, mely a plazminogén aktivációt stimulálná,(77) ennek következtében csak az ellentétes hatás marad, mely a plazminogén aktivációt gátolja. Fibrin távollétében az eptifibatid stimulálja a plazminogén aktivációt (adat nem került bemutatásra) és ez a hatás megtartott akkor is, ha az aktiváció sejtmentes fibrin felszínen történik (vastagabb szálak 8,2 µM vagy magasabb fibrinogén koncentrációnál (14. ábra A)), de nem történik meg vékonyabb szálak esetén, amikor a kofaktor-funkció is jobb a tPA-katalizálta plazminogén aktiváció során (14. ábra B). A bemutatott eredmények alapján elmondható a vörösvértestek jelenlétében történı plazmin-keletkezésrıl, hogy a sejtek fibrinogén receptorának gátlószere megszünteti a sejtek hatását a plazminogén aktivációra. Az eptifibatid plazminogén aktivációra és fibrinolízisre kifejtett hatásaira vonatkozó adatok azt sugallják, hogy a vörösvérsejtek fibrinogén receptora felelıs – legalábbis részben- a vörösvérsejtekhez asszociált fibrinolítikus rezisztenciáért.

5.3. VWF hasítása hemosztatikus enzimek segítségével

A bemutatott eredmények alapján elmondhatjuk, hogy a trombus feloldásában fontos szerepet betöltı enzimek (plazmin, neutrofil elasztáz) hatékonyan képesek a VWF hasítására (16. és 17. ábra), fibrinolítikusan aktív koncentrációk alkalmazásával,(111) mely segítségével új mechanizmussal bıvíthetı a hemosztatikus vagy patológiás trombusokban létrejövı átmeneti kompartmentekrıl szóló elmélet.(73) Ezekben a kompartmentekben a fibrin megvédi az enzimeket a bıségesen jelenlévı plazma inhibitoroktól,(72) így azok nem csak a fibrinháló feloldásán keresztül járulnak hozzá a trombus lebontásához, hanem a vérlemezkék és az érfal közötti, VWF multimerek által létrehozott adhezív kapcsolatok megszüntetése révén is. Ezt a feltételezett új szerepet támasztják alá eredményeink, melyeket áramlásos modellünkkel végzett kísérletek során

70

nyertünk, és amely modellben korábban leírt módon a vérlemezke adhézió artéria keresztmetszethez vagy kollagénfelszínhez VWF-dependens módon zajlik.(93) A jelen kísérletekben

ugyanezen

proteázok

elválasztják

a

kollagénfelszínhez

tapadt

vérlemezkéket az érfaltól olyan koncentrációk alkalmazásával, melyek hatékonyak a VWF emésztésében (20. ábra). A trombusokban jelenlévı leukociták hozzájárulnak a proteolítikus hatékonysághoz a trombus feloldásában. A neutrofil granulocitákból felszabaduló enzimek többsége a sejtek membránjához kötve marad(94,95) magas lokális enzimkoncentrációt létrehozva, mely jól definiált hatékonysággal rendelkezik in vivo.(112) Fontos megjegyezni, hogy nem minden neutrofil granulocita eredető proteáz vesz részt a folyamatban, hiszen az MMP-8 és -9 nem volt képes a VWF hasítására 20 nM koncentrációban, annak ellenére, hogy ilyen koncentrációban ezek az enzimek már képesek voltak az artériák falszerkezetének módosítására, aminek következtében megváltoztatták az artéria fal trombogenitását.(113) Ezen eredmények szinkronban vannak azon korábbi adatokkal,(54) melyek szerint az MMP-9 statikus körülmények között nem képes a VWF emésztésére, míg nyíróerık hatására és magas enzimkoncentrációk alkalmazása mellett (50 nM vagy efelett) is csak részleges emésztés figyelhetı meg. Mindezek alapján, az MMP-8 és -9 elısegítik a vérlemezkék adhézióját az artéria falszerkezetének megváltoztatásán keresztül,(113) és nem bontják el a VWF-t az

elasztázzal

szemben,

mely

ugyan

szintén

növeli

az

artériák

falának

trombogenitását,(113) ám a késıbbiek során a vérlemezkék kollagénrostokról való leválását (20. ábra) is elısegíti a VWF bontása révén (17. és 19. ábra). Az érsérülés helyén az endotélsejtekbıl(114) és vérlemezkékbıl(115) ultra-nagy mérető VWF multimerek szabadulnak fel (ez több, mint 40 monomer összekapcsolódását jelenti). Ezek hiperreaktivitása(116) esszenciális a nagy nyírási sebességnél létrejövı vérlemezke aggregáció és a gyors vérlemezke-dugó kialakulása szempontjából. Mindazonáltal ezen nagy multimerek hosszas jelenléte a szisztémás keringésben protrombotikus állapotot hoz létre, mint ahogyan az megfigyelhetı TTP-ben is.(117) Ezt az állapotot úgy elızzük meg, hogy az ADAMTS-13 nevő metalloproteináz elhasítja a VWF-t az endotélsejtek(118) és vérlemezkék(119) felszínén. Bár az ADAMTS-13 gén mutációi TTP-t eredményezhetnek,(120) nem figyelhetı meg szigorú korreláció az ADAMTS-13 aktivitás és a betegség súlyossága(91,121) illetve a keringésben jelenlévı

71

VWF multimerek száma(122) között, ami alapján járulékos mechanizmusokat feltételezhetünk

a

VWF

méretének

szabályozásában.

Eredményeink

alternatív

mechanizmusokat írnak le a VWF funkció és ezáltal a vérlemezke adhézió és aggregáció szabályozásában. A vérlemezkék alapvetıen prokoaguláns mechanizmusokat segítenek elı,(123) mely következtében a trombin fibrinné alakítja a fibrinogént. A véralvadás kezdetén a trombin koncentrációja 10 nM,(89) amely segítségével további vérlemezke adhézió elısegítésére is képes az artériák falszerkezetének módosításán keresztül,(113) de nem hasítja a VWF-t megırizve annak adhezív tulajdonságait. A teljes vér alvadásának késıbbi stádiumaiban a trombin koncentráció elérheti a néhány száz nM-t, ami ebben a tartományban maradhat akár egy órán keresztül is.(89) Ilyen nagyságrendő koncentrációban a trombin már képes a VWF hasítására áramlási körülmények között (19. ábra), amely reakcióval a trombin csökkenti a hiperreaktív VWF forma elérhetıségét felszabadulása helyszínén. Ezzel a mechanizmussal a trombin hozzájárulhat az ADAMTS-13 által kifejtett hatáshoz, és megakadályozza az endotélsejtekbıl és vérlemezkékbıl érsérülés során felszabaduló hiperreaktív VWF-forma terjedését az érrendszeren belül. Ez a hatás kompenzálja az ADAMTS-13 trombin katalizálta inaktivációját,(124) ami jelentıséggel bírhat a plazmától elzárt kompartmentekben, mert plazma-környezetben ez az inaktiváció eléggé alacsony hatékonyságú.(35) A klasszikus (plazminogén-dependens) és alternatív (leukocita-dependens)(48) fibrinolítikus útvonalak aktiválódásakor a plazmin és neutrofil-elasztáz koncentráció megnı, mely enzimek a VWF multimerek méretét is befolyásolják. Az, hogy ezek az enzimek milyen hatékonysággal képesek a VWF hasítására igen különbözı, mivel a trombin, plazmin és neutrofil elasztáz aktivitása multifaktoriális aktivációs mechanizmusoktól és a sejtek szekréciójától függ.(73) A lokális proteolízis variabilitása magyarázhatja a különbözı TTP kórlefolyásokat ADAMTS-13 deficiencia esetén. Nyíróerık(54,55)és a ristocetin(125) megváltoztatják a VWF konformációját, amely így képes lesz a vérlemezkék GP Ib receptorához kötni és vérlemezke-agglutinációt létrehozni. Áramlási körülmények között (19. ábra) a VWF plazmin, neutrofil elasztáz és trombin általi parciális proteolízise fokozódik, ami azt sugallja, hogy a konformációs változás növeli a VWF proteolítikus érzékenységét az ADAMTS-13 enzim esetében leírtakhoz hasonlóan.(121) Vérlemezkék jelenléte tovább érzékenyíti a VWF-t a plazmin

72

katalizálta hasításra áramlási körülmények között (19. ábra) ami hozzájárulhat trombocita-dús trombusok széteséséhez magas nyírási sebesség esetén. Ez a jelenség hangsúlyozza a plazmin hatását gátló faktorok fontosságát a vérrög keletkezésének kezdeti stádiumában, valamint magyarázza a PAI-1 deficienciában szenvedı betegek sérülést követı vérzékenységi hajlamát.(126) Az áramlási körülményekkel szemben, statikus körülmények között a vérlemezkék gátolják a VWF proteolízisét, részben a plazmin (18. ábra), illetve egészen a neutrofil elasztáz (adat nem került bemutatásra) esetében. Bár a VWF nem tölt be nélkülözhetetlen szerepet alacsony nyírási sebességnél a vérlemezkék érfalhoz kötésében, ám ezeken a területeken is képes növelni a trombus stabilitását. A VWF épségének megırzésében a vérlemezkék, VWF és plazmin összjátéka hasonló a fibrinogén nemrégiben publikált VWF-dependens védelméhez a plazmin hasításával szemben.(127) Az eredmények alapján feltételezhetı, hogy a vérlemezkék gátolják a VWF emésztését, ami a késıbbiek során megvédi a fibrinogént a plazmin általi lebontástól,(127) így mindkét vérlemezkék közötti hídként szolgáló molekula(9) megırzi épségét és a jelenség növeli a trombus stabilitását. A kísérletek során megvizsgáltuk, hogy a VWF alternatív proteolízise milyen funkcionális következményekkel jár a vérlemezke-adhézió tekintetében magas nyírási sebesség esetén. Elsıként mutattuk be, hogy a plazmin, neutrofil elasztáz és trombin képes VWFdependens módon a vérlemezkék leválasztására a kollagénfelszínrıl vagy az érfalról (20. ábra). Mivel kísérleti körülményeink között a GP Ib és GP IIbIIIa vérlemezke receptorok védettek a plazmin általi proteolízis ellen,(128) ezért az adhéziót megszüntetı hatás a VWF degradációjának tudható be, melyet jól demonstrálnak az immunobloton megjelenı VWF-degradációs termékek is (19. ábra). Ezen eredmények szinkronban vannak korábbi megfigyelésekkel a plazmin nyíróerık mellett létrejövı vérlemezke-aggregációra kifejtett hatásával kapcsolatban.(129) Statikus kísérleti körülmények között csak a plazmin volt képes csökkenteni a ristocetin-indukálta vérlemezke agglutinációt a VWF-degradációval párhuzamosan (18. ábra Inset). A többi proteáz (neutrofil elasztáz, trombin), melyek nem emésztik a VWF-t vérlemezkék jelenlétében, nem csökkentették a ristocetin-aktiválta vérlemezke agglutinációt sem. Ez az eredmény is a fent említett következtetést támasztja alá, miszerint a nyírófeszültség alatti VWF-lebontás felelıs a trombogén felszínhez kitapadt trombociták leválásáért.

73

Összefoglalva elmondható, hogy hemosztatikus enzimek fiziológiásan releváns koncentrációban képesek a VWF trombocita adhéziót elısegítı hatásának módosítására magas nyírási sebesség esetén. Ez az alternatív út nagy valószínőséggel szigorúan a trombus területére lokalizált, ahol a proteázok relatíve védettek plazma inhibitoraikkal szemben.

74

6. AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA, KÖVETKEZTETÉSEK

6.1. VWF-dependens vérlemezke adhézió és az artériák falának morfológiája

•

Nagy nyírási sebesség esetén a VWF-dependens vérlemezke adhézió az érfal

adventitia rétegére lokalizálódik, a media rétegre alig vagy egyáltalán nem, míg hemosztatikus enzimek (plazmin, trombin) valamint neutrofil granulocita eredető enzimek (neutrofil elasztáz, katepszin G, mátrix metalloproteináz-8 és -9) elısegítik a vérlemezkék adhézióját az érfal media rétegéhez.

•

A kollagén rostok szerkezetét és elérhetıségét befolyásoló proteoglikánok

eloszlása az érfal különbözı rétegeiben nem egyenletes. AFM és SEM vizsgálatok alapján kijelenthetı, hogy ezen eltérı proteoglikán eloszlás tehetı felelıssé az adventitia és media eltérı trombogenitásáért.

6.2. Vörösvértest tartalmú fibrin lítikus rezisztenciája

•

A trombus növekvı vörösvérsejt-tartalmával párhuzamosan nı az alvadék

fibrinolízissel szembeni rezisztenciája. A vörösvértestek lítikus rezisztenciát kialakító hatásának legfıbb oka a fibrin szerkezetének megváltozása valamint a csökkent plazminogén-aktiváció.

•

A vörösvértestek fibrinogén receptorának gátlószere, az eptifibatid visszafordítja

a vörösvértestek fibrinszerkezetre kifejtett hatását és ezáltal csökkenti a vörösvértesttartalmú fibrinháló lítikus rezisztenciáját.

75

6.3. VWF méretének szabályozása hemosztatikus- és neutrofil granulocita eredető enzimeken keresztül

•

A plazmin és neutrofil elasztáz statikus körülmények között hatékonyan képesek a

VWF hasítására fibrinolítikusan aktív koncentrációban, míg a vérlemezkék jelenléte ilyen körülmények között gátolja a VWF hasítását plazmin esetén részben, neutrofil elasztáz esetében pedig teljes mértékben.

•

Áramlási körülmények és vérlemezkék jelenléte elısegíti a VWF hasítását

plazmin, neutrofil elasztáz és trombin által, de az MMP-8 és -9 általi hasításra nem gyakorol hatást.

76

ÖSSZEFOGLALÁS

A trombotikus betegségek, mint a szívinfarktus vagy agyvérzés, a vezetı halálokok közé tartoznak világszerte. Az ezen a területen folytatott kutatások különös fontossággal bírnak, hiszen a trombusképzıdés és trombolízis során lezajló folyamatok megértése új utakat nyithat a trombolítikus terápiában. Bár ezen folyamatok patomechanizmusa már feltérképezett, a finom szabályozási mechanizmusok még mindig nem teljesen tisztázottak. Munkám során ezen moduláló mechanizmusok hemosztázisra kifejtett hatásait vizsgáltam, különös tekintettel a sejtes elemek szerepére. Hemosztatikus enzimek (plazmin, trombin) illetve neutrofil granulocita eredető enzimek (neutrofil elasztáz, mátrix metalloproteináz-8 és -9) érfalszerkezetre gyakorolt hatását vizsgáltuk. Magas nyírási sebesség esetén, kis artériákban, arteriolákban, ahol a vérlemezke-adhézió VWF-dependens, a vérlemezkék elsısorban a külsı, adventitia réteghez kötıdnek, míg a középsı, media réteg rezisztens a vérlemezkékkel szemben. Eredményeink alapján hemosztatikus és neutrofil granulocita eredető enzimek oly módon változtatják meg az érfal szerkezetét, hogy a trombociták a media réteghez is képesek kötıdni VWF-on keresztül. Ez a hatás proteoglikánok proteolítikus eltávolításának eredménye, mely során a kollagénrostok szabaddá válnak a VWF és vérlemezkék számára. A VWF fent említett enzimek általi degradációját is vizsgáltuk. A VWF limitált proteolízise befolyásolja a vérlemezke-kollagén interakciót a VWF-multimerek méretének szabályozásán keresztül. Statikus körülmények között a vérlemezkék jelenléte gátolta, áramlási körülmények között serkentette a VWF proteolítikus érzékenységét. Proteolízis történt a plazmin, trombin és neutrofil elasztáz által, ám nem zajlott le a mátrix metalloproteináz-8 és -9 hatása révén. A vörösvértestek jelenléte a fibrinhálóban alapvetıen befolyásolja a trombus fibrinolítikus érzékenységét. Növekvı vörösvértest-szám fokozta a trombus fibrinolítikus rezisztenciáját, mely hatás visszafordítható volt, legalábbis részben, a sejtek integrin típusú fibrinogén receptorának gátlásával (eptifibatid).

77

SUMMARY

Diseases related to thrombosis and haemostasis such as ischemic heart disease and stroke are leading causes of death around the world. Research in this field is especially important, as understanding the way thrombi develop and finding new ways of thrombolysis could improve the therapy of these illnesses. Although the main pathomechanism of thrombus formation and lysis is well established, fine regulatory mechanisms are still being explored. My research focused on the role of cellular elements in haemostasis. The first aspect of the reported work is the effect of haemostatic (plasmin, thrombin)- and neutrophil granulocyte-derived (neutrophil elastase, matrix metalloproteinase-8 and -9) enzymes on the arterial wall structure and the von Willebrand factor (VWF)-dependent platelet adhesion which takes place at high shear rate in small arteries and arterioles. According to our findings leukocytes promote platelet adhesion to the injured vessel wall, especially to the media layer through removing proteoglycans by proteolysis and increasing the availablity of collagen fibres for VWF and platelets. The second aspect of our studies was the degradation of VWF by the enzymes mentioned above. Limited proteolysis of VWF may influence platelet-collagen interaction in thrombi by regulating the size of VWF multimers. Under static conditions the presence of platelets inhibited, while under flow conditions it increased the proteolytic sensitivity of VWF. VWF can be effectively degraded by plasmin, neutrophil elastase and thrombin, but not by matrix metalloproteinases-8 and -9 originating from neutrophil granulocytes. Cellular elements are also important components of thrombi. Red blood cells, leukocytes and platelets are entrapped within the fibrin meshwork in the course of thrombus formation. Our measurements on the rate of fibrinolysis in artificial thrombi containing different amount of red blood cells showed that increasing number of these cells causes fibrinolytic resistance that can be partially reversed by an integrin receptor inhibitor (eptifibatide) that abolishes red blood cell-fibrinogen interactions.

78

Irodalomjegyzék

1. Anon. The World Health Report WHO http://www.who.int/whr/2004/annex/en/ Statistical Annex pp: 120-125. 2004.

2. Esmon NL, Owen WG, Esmon CT. Isolation of a membrane-bound cofactor for thrombin-catalyzed activation of protein C. J Biol Chem 1982; 257: 859-64. 3. Fukudome K, Esmon CT. Identification, cloning, and regulation of a novel endothelial cell protein C/activated protein C receptor. J Biol Chem 1994; 269: 26486-91. 4. Wiman B, Chmielewska J, Ranby M. Inactivation of tissue plasminogen activator in plasma. Demonstration of a complex with a new rapid inhibitor. J Biol Chem 1984; 259: 3644-7. 5. Moncada S, Vane JR. The role of prostacyclin in vascular tissue. Fed Proc 1979; 38: 66-71. 6. Marcus AJ, Safier LB, Hajjar KA, Ullman HL, Islam N, Broekman MJ, Eiroa AM. Inhibition of platelet function by an aspirin-insensitive endothelial cell ADPase. Thromboregulation by endothelial cells. J Clin Invest 1991; 88: 1690-6. 7. Sporn LA, Marder VJ, Wagner DD. Inducible secretion of large, biologically potent von Willebrand factor multimers. Cell 1986; 46: 185-90. 8. De Botton S, Sabri S, Daugas E, Zermati Y, Guidotti JE, Hermine O, Kroemer G, Vainchenker W, Debili N. Platelet formation is the consequence of caspase activation within megakaryocytes. Blood 2002; 100: 1310-7. 9. Ruggeri ZM, Dent JA, Saldivar E. Contribution of distinct adhesive interactions to platelet aggregation in flowing blood. Blood 1999; 94: 172-8. 10. White JG. Platelet membrane ultrastructure and its changes during platelet activation. Prog Clin Biol Res 1988; 283: 1-32. 79

11. Staatz WD, Rajpara SM, Wayner EA, Carter WG, Santoro SA. The membrane glycoprotein Ia-IIa (VLA-2) complex mediates the Mg++-dependent adhesion of platelets to collagen. J Cell Biol 1989; 108: 1917-24. 12. Weiss HJ, Turitto VT, Baumgartner HR. Effect of shear rate on platelet interaction with subendothelium in citrated and native blood. I. Shear rate-dependent decrease of adhesion in von Willebrand's disease and the BernardSoulier syndrome. J Lab Clin Med 1978; 92: 750-64. 13. Kasirer-Friede A, Cozzi MR, Mazzucato M, De Marco L, Ruggeri ZM, Shattil SJ. Signaling through GP Ib-IX-V activates alpha IIb beta 3 independently of other receptors. Blood 2004; 103: 3403-11. 14. Bennett JS, Vilaire G. Exposure of platelet fibrinogen receptors by ADP and epinephrine. J Clin Invest 1979; 64: 1393-401. 15. Hirsh J, Marder V, Salzman E. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Platelet secretion and energy metabolism. 1993. Philadelphia, PA, JB Lippincott Co.

16. Borregaard N, Kjeldsen L, Sengelov H, Diamond MS, Springer TA, Anderson HC, Kishimoto TK, Bainton DF. Changes in subcellular localization and surface expression of L-selectin, alkaline phosphatase, and Mac-1 in human neutrophils during stimulation with inflammatory mediators. J Leukoc Biol 1994; 56: 80-7. 17. Pendu R, Terraube V, Christophe OD, Gahmberg CG, de Groot PG, Lenting PJ, Denis CV. P-selectin glycoprotein ligand 1 and beta2-integrins cooperate in the adhesion of leukocytes to von Willebrand factor. Blood 2006; 108: 3746-52. 18. Bainton DF, Farquhar MG. Differences in enzyme content of azurophil and specific granules of polymorphonuclear leukocytes. II. Cytochemistry and electron microscopy of bone marrow cells. J Cell Biol 1968; 39: 299-317.

80

19. Bainton DF, Farquhar MG. Differences in enzyme content of azurophil and specific granules of polymorphonuclear leukocytes. I. Histochemical staining of bone marrow smears. J Cell Biol 1968; 39: 286-98. 20. Borregaard N, Kjeldsen L, Rygaard K, Bastholm L, Nielsen MH, Sengelov H, Bjerrum OW, Johnsen AH. Stimulus-dependent secretion of plasma proteins from human neutrophils. J Clin Invest 1992; 90: 86-96. 21. Lippi G, Montagnana M, Salvagno GL, Cicorella N, Degan M, Minuz P, Lechi C, Guidi GC. Risk stratification of patients with acute myocardial infarction by quantification of circulating monocyte-platelet aggregates. Int J Cardiol 2007; 115: 101-2. 22. McCabe DJ, Harrison P, Mackie IJ, Sidhu PS, Purdy G, Lawrie AS, Watt H, Brown MM, Machin SJ. Platelet degranulation and monocyte-platelet complex formation are increased in the acute and convalescent phases after ischaemic stroke or transient ischaemic attack. Br J Haematol 2004; 125: 777-87. 23. Zwaal RF, Schroit AJ. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells. Blood 1997; 89: 1121-32. 24. Livio M, Gotti E, Marchesi D, Mecca G, Remuzzi G, de Gaetano G. Uraemic bleeding: role of anaemia and beneficial effect of red cell transfusions. Lancet 1982; 2: 1013-5. 25. Weiss HJ, Lages B, Hoffmann T, Turitto VT. Correction of the platelet adhesion defect in delta-storage pool deficiency at elevated hematocrit--possible role of adenosine diphosphate. Blood 1996; 87: 4214-22. 26. Zwaginga JJ, IJsseldijk MJ, de Groot PG, Kooistra M, Vos J, van Es A, Koomans HA, Struyvenberg A, Sixma JJ. Treatment of uremic anemia with recombinant erythropoietin also reduces the defects in platelet adhesion and aggregation caused by uremic plasma. Thromb Haemost 1991; 66: 638-47.

81

27. Carr ME, Jr., Hardin CL. Fibrin has larger pores when formed in the presence of erythrocytes. Am J Physiol 1987; 253: H1069-H1073. 28. Carvalho FA, Connell S, Miltenberger-Miltenyi G, Pereira SV, Tavares A, Ariens RA, Santos NC. Atomic force microscopy-based molecular recognition of a fibrinogen receptor on human erythrocytes. ACS Nano 2010; 4: 4609-20. 29. Lominadze D, Dean WL. Involvement of fibrinogen specific binding in erythrocyte aggregation. FEBS Lett 2002; 517: 41-4. 30. Maeda N, Seike M, Kume S, Takaku T, Shiga T. Fibrinogen-induced erythrocyte aggregation: erythrocyte-binding site in the fibrinogen molecule. Biochim Biophys Acta 1987; 904: 81-91. 31. Blomback B, Blomback M. The molecular structure of fibrinogen. Ann N Y Acad Sci 1972; 202: 77-97. 32. FERRY JD. The Mechanism of Polymerization of Fibrinogen. Proc Natl Acad Sci U S A 1952; 38: 566-9. 33. Schwartz ML, Pizzo SV, Hill RL, McKee PA. Human Factor XIII from plasma and platelets. Molecular weights, subunit structures, proteolytic activation, and cross-linking of fibrinogen and fibrin. J Biol Chem 1973; 248: 1395-407. 34. Bouma BN, Meijers JC. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U). J Thromb Haemost 2003; 1: 1566-74. 35. Lam JK, Chion CK, Zanardelli S, Lane DA, Crawley JT. Further characterization of ADAMTS-13 inactivation by thrombin. J Thromb Haemost 2007; 5: 1010-8. 36. Nishi N, Itoh A, Shoji H, Miyanaka H, Nakamura T. Galectin-8 and galectin-9 are novel substrates for thrombin. Glycobiology 2006; 16: 15C-20C.

82

37. Pacienza N, Pozner RG, Bianco GA, D'Atri LP, Croci DO, Negrotto S, Malaver E, Gomez RM, Rabinovich GA, Schattner M. The immunoregulatory glycanbinding protein galectin-1 triggers human platelet activation. FASEB J 2008; 22: 1113-23. 38. Romaniuk MA, Tribulatti MV, Cattaneo V, Lapponi MJ, Molinas FC, Campetella O, Schattner M. Human platelets express and are activated by galectin-8. Biochem J 2010; 432: 535-47. 39. Petersen TE, Martzen MR, Ichinose A, Davie EW. Characterization of the gene for human plasminogen, a key proenzyme in the fibrinolytic system. J Biol Chem 1990; 265: 6104-11. 40. Wu HL, Chang BI, Wu DH, Chang LC, Gong CC, Lou KL, Shi GY. Interaction of plasminogen and fibrin in plasminogen activation. J Biol Chem 1990; 265: 19658-64. 41. Hoylaerts M, Rijken DC, Lijnen HR, Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator. Role of fibrin. J Biol Chem 1982; 257: 2912-9. 42. Lijnen HR, Zamarron C, Blaber M, Winkler ME, Collen D. Activation of plasminogen by pro-urokinase. I. Mechanism. J Biol Chem 1986; 261: 1253-8. 43. Fancher TL, White RH, Kravitz RL. Combined use of rapid D-dimer testing and estimation of clinical probability in the diagnosis of deep vein thrombosis: systematic review. BMJ 2004; 329: 821. 44. Wells PS, Anderson DR, Rodger M, Forgie M, Kearon C, Dreyer J, Kovacs G, Mitchell M, Lewandowski B, Kovacs MJ. Evaluation of D-dimer in the diagnosis of suspected deep-vein thrombosis. N Engl J Med 2003; 349: 1227-35. 45. Jacobsen JS, Comery TA, Martone RL, Elokdah H, Crandall DL, Oganesian A, Aschmies S, Kirksey Y, Gonzales C, Xu J, Zhou H, Atchison K, Wagner E, Zaleska MM, Das I, Arias RL, Bard J, Riddell D, Gardell SJ, Abou-Gharbia M, 83

Robichaud A, Magolda R, Vlasuk GP, Bjornsson T, Reinhart PH, Pangalos MN. Enhanced clearance of Abeta in brain by sustaining the plasmin proteolysis cascade. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 8754-9. 46. Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara N. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992; 267: 26031-7. 47. Kuliopulos A, Covic L, Seeley SK, Sheridan PJ, Helin J, Costello CE. Plasmin desensitization of the PAR1 thrombin receptor: kinetics, sites of truncation, and implications for thrombolytic therapy. Biochemistry 1999; 38: 4572-85. 48. Machovich R, Owen WG. The elastase-mediated pathway of fibrinolysis. Blood Coagul Fibrinolysis 1990; 1: 79-90. 49. Pannekoek H, Veerman H, Lambers H, Diergaarde P, Verweij CL, van Zonneveld AJ, van Mourik JA. Endothelial plasminogen activator inhibitor (PAI): a new member of the Serpin gene family. EMBO J 1986; 5: 2539-44. 50. Holmes WE, Nelles L, Lijnen HR, Collen D. Primary structure of human alpha 2antiplasmin, a serine protease inhibitor (serpin). J Biol Chem 1987; 262: 1659-64. 51. Loskutoff DJ, Schleef RR. Plasminogen activators and their inhibitors. Methods Enzymol 1988; 163: 293-302. 52. Ruggeri ZM. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost 2003; 1: 1335-42. 53. Ruggeri ZM, Ware J. The structure and function of von Willebrand factor. Thromb Haemost 1992; 67: 594-9. 54. Raife TJ, Cao W, Atkinson BS, Bedell B, Montgomery RR, Lentz SR, Johnson GF, Zheng XL. Leukocyte proteases cleave von Willebrand factor at or near the ADAMTS13 cleavage site. Blood 2009; 114: 1666-74.

84

55. Siedlecki CA, Lestini BJ, Kottke-Marchant KK, Eppell SJ, Wilson DL, Marchant RE. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood 1996; 88: 2939-50. 56. Tangelder GJ, Slaaf DW, Arts T, Reneman RS. Wall shear rate in arterioles in vivo: least estimates from platelet velocity profiles. Am J Physiol 1988; 254: H1059-H1064. 57. Savage B, Shattil SJ, Ruggeri ZM. Modulation of platelet function through adhesion receptors. A dual role for glycoprotein IIb-IIIa (integrin alpha IIb beta 3) mediated by fibrinogen and glycoprotein Ib-von Willebrand factor. J Biol Chem 1992; 267: 11300-6. 58. Moschcowitz E. An acute febrile pleiochromic anemia with hyaline thrombosis of the terminal arterioles and capillaries: an undescribed disease. 1925. Mt Sinai J Med 2003; 70: 352-5. 59. Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood 2001; 98: 1662-6. 60. Kirchhofer D, Riederer MA, Baumgartner HR. Specific accumulation of circulating monocytes and polymorphonuclear leukocytes on platelet thrombi in a vascular injury model. Blood 1997; 89: 1270-8. 61. Brinckerhoff CE, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3: 207-14. 62. Rudolph-Owen LA, Hulboy DL, Wilson CL, Mudgett J, Matrisian LM. Coordinate expression of matrix metalloproteinase family members in the uterus of normal, matrilysin-deficient, and stromelysin-1-deficient mice. Endocrinology 1997; 138: 4902-11. 63. Maskos K. Crystal structures of MMPs in complex with physiological and pharmacological inhibitors. Biochimie 2005; 87: 249-63. 85

64. Nagase H, Woessner JF, Jr. Matrix metalloproteinases. J Biol Chem 1999; 274: 21491-4. 65. Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res 2003; 92: 82739. 66. Hulmes DJ. The collagen superfamily--diverse structures and assemblies. Essays Biochem 1992; 27: 49-67. 67. Kielty CM, Sherratt MJ, Shuttleworth CA. Elastic fibres. J Cell Sci 2002; 115: 2817-28. 68. Timpl R, Rohde H, Robey PG, Rennard SI, Foidart JM, Martin GR. Laminin--a glycoprotein from basement membranes. J Biol Chem 1979; 254: 9933-7. 69. Pankov R, Yamada KM. Fibronectin at a glance. J Cell Sci 2002; 115: 3861-3. 70. Zhou A, Huntington JA, Pannu NS, Carrell RW, Read RJ. How vitronectin binds PAI-1 to modulate fibrinolysis and cell migration. Nat Struct Biol 2003; 10: 5414. 71. Racz Z, Baroti C. Technical aspects of buffy coat removal from whole blood and those of platelet production from single buffy coat units. Biomed Tech (Berl) 1993; 38: 266-9. 72. Kolev K, Lerant I, Tenekejiev K, Machovich R. Regulation of fibrinolytic activity of neutrophil leukocyte elastase, plasmin, and miniplasmin by plasma protease inhibitors. J Biol Chem 1994; 269: 17030-4. 73. Kolev K, Skopal J, Simon L, Csonka E, Machovich R, Nagy Z. Matrix metalloproteinase-9 expression in post-hypoxic human brain capillary endothelial cells: H2O2 as a trigger and NF-kappaB as a signal transducer. Thromb Haemost 2003; 90: 528-37.

86

74. Lundblad RL, Kingdon HS, Mann KG. Thrombin. Methods Enzymol 1976; 45: 156-76. 75. Nation JL. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technol 1983; 58: 347-51. 76. Haigh M, Scott JE. A method of processing tissue sections for staining with cupromeronic blue and other dyes, using CEC techniques, for light and electron microscopy. Basic Appl Histochem 1986; 30: 479-86. 77. Longstaff C, Thelwell C, Williams SC, Silva MM, Szabo L, Kolev K. The interplay between tissue plasminogen activator domains and fibrin structures in the regulation of fibrinolysis: kinetic and microscopic studies. Blood 2011; 117: 661-8. 78. Thelwell C, Longstaff C. The regulation by fibrinogen and fibrin of tissue plasminogen activator kinetics and inhibition by plasminogen activator inhibitor 1. J Thromb Haemost 2007; 5: 804-11. 79. Longstaff C, Wong MY, Gaffney PJ. An international collaborative study to investigate standardisation of hirudin potency. Thromb Haemost 1993; 69: 430-5. 80. Kolev K, Owen WG, Machovich R. Dual effect of synthetic plasmin substrates on plasminogen activation. Biochim Biophys Acta 1995; 1247: 239-45. 81. Varju I, Sotonyi P, Machovich R, Szabo L, Tenekedjiev K, Silva MM, Longstaff C, Kolev K. Hindered dissolution of fibrin formed under mechanical stress. J Thromb Haemost 2011. 82. Meek KM, Fullwood NJ. Corneal and scleral collagens--a microscopist's perspective. Micron 2001; 32: 261-72. 83. Miyagawa A, Kobayashi M, Fujita Y, Hamdy O, Hirano K, Nakamura M, Miyake Y. Surface ultrastructure of collagen fibrils and their association with

87

proteoglycans in human cornea and sclera by atomic force microscopy and energy-filtering transmission electron microscopy. Cornea 2001; 20: 651-6. 84. Scott JE. Collagen--proteoglycan interactions. Localization of proteoglycans in tendon by electron microscopy. Biochem J 1980; 187: 887-91. 85. Komorowic E, McBane RD, Charlesworth J, Fass DN. Reduced high shear platelet adhesion to the vascular media: defective von Willebrand factor binding to the interstitial collagen. Thromb Haemost 2002; 87: 763-70. 86. Liou TG, Campbell EJ. Nonisotropic enzyme--inhibitor interactions: a novel nonoxidative mechanism for quantum proteolysis by human neutrophils. Biochemistry 1995; 34: 16171-7. 87. Liou TG, Campbell EJ. Quantum proteolysis resulting from release of single granules by human neutrophils: a novel, nonoxidative mechanism of extracellular proteolytic activity. J Immunol 1996; 157: 2624-31. 88. Owen CA, Campbell EJ. The cell biology of leukocyte-mediated proteolysis. J Leukoc Biol 1999; 65: 137-50. 89. Rand MD, Lock JB, van't Veer C, Gaffney DP, Mann KG. Blood clotting in minimally altered whole blood. Blood 1996; 88: 3432-45. 90. Sakharov DV, Nagelkerke JF, Rijken DC. Rearrangements of the fibrin network and spatial distribution of fibrinolytic components during plasma clot lysis. Study with confocal microscopy. J Biol Chem 1996; 271: 2133-8. 91. Zheng XL, Kaufman RM, Goodnough LT, Sadler JE. Effect of plasma exchange on plasma ADAMTS13 metalloprotease activity, inhibitor level, and clinical outcome in patients with idiopathic and nonidiopathic thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood 2004; 103: 4043-9.

88

92. van Zanten GH, de Graaf S, Slootweg PJ, Heijnen HF, Connolly TM, de Groot PG, Sixma JJ. Increased platelet deposition on atherosclerotic coronary arteries. J Clin Invest 1994; 93: 615-32. 93. Komorowicz E, McBane RD, Fass DN. Physical and enzymatic perturbation of the architecture of the Tunica media destroys its inherent thromboresistance. Thromb Haemost 2002; 88: 827-33. 94. Cepinskas G, Sandig M, Kvietys PR. PAF-induced elastase-dependent neutrophil transendothelial migration is associated with the mobilization of elastase to the neutrophil surface and localization to the migrating front. J Cell Sci 1999; 112 ( Pt 12): 1937-45. 95. Gaudin P, Berthier S, Barro C, Zaoui P, Morel F. Proteolytic potential of human neutrophil membranes. Eur J Cell Biol 1997; 72: 345-51. 96. Chung AW, Radomski A, Alonso-Escolano D, Jurasz P, Stewart MW, Malinski T, Radomski MW. Platelet-leukocyte aggregation induced by PAR agonists: regulation by nitric oxide and matrix metalloproteinases. Br J Pharmacol 2004; 143: 845-55. 97. Maxwell MJ, Westein E, Nesbitt WS, Giuliano S, Dopheide SM, Jackson SP. Identification of a 2-stage platelet aggregation process mediating shear-dependent thrombus formation. Blood 2007; 109: 566-76. 98. Raspanti M, Protasoni M, Manelli A, Guizzardi S, Mantovani V, Sala A. The extracellular matrix of the human aortic wall: ultrastructural observations by FEG-SEM and by tapping-mode AFM. Micron 2006; 37: 81-6. 99. Lisman T, Raynal N, Groeneveld D, Maddox B, Peachey AR, Huizinga EG, de Groot PG, Farndale RW. A single high-affinity binding site for von Willebrand factor in collagen III, identified using synthetic triple-helical peptides. Blood 2006; 108: 3753-6.

89

100. Herr AB, Farndale RW. Structural insights into the interactions between platelet receptors and fibrillar collagen. J Biol Chem 2009; 284: 19781-5. 101. Perumal S, Antipova O, Orgel JP. Collagen fibril architecture, domain organization, and triple-helical conformation govern its proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 2824-9. 102. Jennings LK. Mechanisms of platelet activation: need for new strategies to protect against platelet-mediated atherothrombosis. Thromb Haemost 2009; 102: 248-57. 103. HELLEM AJ, BORCHGREVINK CF, AMES SB. The role of red cells in haemostasis: the relation between haematocrit, bleeding time and platelet adhesiveness. Br J Haematol 1961; 7: 42-50. 104. Wehmeier A, Daum I, Jamin H, Schneider W. Incidence and clinical risk factors for bleeding and thrombotic complications in myeloproliferative disorders. A retrospective analysis of 260 patients. Ann Hematol 1991; 63: 101-6. 105. Goldsmith HL, Turitto VT. Rheological aspects of thrombosis and haemostasis: basic principles and applications. ICTH-Report--Subcommittee on Rheology of the International Committee on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost 1986; 55: 415-35. 106. Wautier MP, Heron E, Picot J, Colin Y, Hermine O, Wautier JL. Red blood cell phosphatidylserine exposure is responsible for increased erythrocyte adhesion to endothelium in central retinal vein occlusion. J Thromb Haemost 2011. 107. Robbie LA, Bennett B, Croll AM, Brown PA, Booth NA. Proteins of the fibrinolytic system in human thrombi. Thromb Haemost 1996; 75: 127-33. 108. Tebbe U, Tanswell P, Seifried E, Feuerer W, Scholz KH, Herrmann KS. Singlebolus injection of recombinant tissue-type plasminogen activator in acute myocardial infarction. Am J Cardiol 1989; 64: 448-53.

90

109. Collet JP, Lesty C, Montalescot G, Weisel JW. Dynamic changes of fibrin architecture during fibrin formation and intrinsic fibrinolysis of fibrin-rich clots. J Biol Chem 2003; 278: 21331-5. 110. Collet JP, Park D, Lesty C, Soria J, Soria C, Montalescot G, Weisel JW. Influence of fibrin network conformation and fibrin fiber diameter on fibrinolysis speed: dynamic and structural approaches by confocal microscopy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20: 1354-61. 111. Kolev K, Komorowicz E, Owen WG, Machovich R. Quantitative comparison of fibrin degradation with plasmin, miniplasmin, neurophil leukocyte elastase and cathepsin G. Thromb Haemost 1996; 75: 140-6. 112. Rabai G, Szilagyi N, Sotonyi P, Kovalszky I, Szabo L, Machovich R, Kolev K. Contribution of neutrophil elastase to the lysis of obliterative thrombi in the context of their platelet and fibrin content. Thromb Res 2010; 126: e94-101. 113. Wohner N, Keresztes Z, Sotonyi P, Szabo L, Komorowicz E, Machovich R, Kolev K. Neutrophil granulocyte-dependent proteolysis enhances platelet adhesion to the arterial wall under high-shear flow. J Thromb Haemost 2010; 8: 1624-31. 114. Moake JL, Turner NA, Stathopoulos NA, Nolasco LH, Hellums JD. Involvement of large plasma von Willebrand factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest 1986; 78: 1456-61. 115. Moake JL, Turner NA, Stathopoulos NA, Nolasco L, Hellums JD. Shear-induced platelet aggregation can be mediated by vWF released from platelets, as well as by exogenous large or unusually large vWF multimers, requires adenosine diphosphate, and is resistant to aspirin. Blood 1988; 71: 1366-74. 116. Arya M, Anvari B, Romo GM, Cruz MA, Dong JF, McIntire LV, Moake JL, Lopez JA. Ultralarge multimers of von Willebrand factor form spontaneous high-

91

strength bonds with the platelet glycoprotein Ib-IX complex: studies using optical tweezers. Blood 2002; 99: 3971-7. 117. Moake JL, Rudy CK, Troll JH, Weinstein MJ, Colannino NM, Azocar J, Seder RH, Hong SL, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med 1982; 307: 1432-5. 118. Dong JF, Moake JL, Nolasco L, Bernardo A, Arceneaux W, Shrimpton CN, Schade AJ, McIntire LV, Fujikawa K, Lopez JA. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood 2002; 100: 4033-9. 119. Liu L, Choi H, Bernardo A, Bergeron AL, Nolasco L, Ruan C, Moake JL, Dong JF. Platelet-derived VWF-cleaving metalloprotease ADAMTS-13. J Thromb Haemost 2005; 3: 2536-44. 120. Levy GG, Nichols WC, Lian EC, Foroud T, McClintick JN, McGee BM, Yang AY, Siemieniak DR, Stark KR, Gruppo R, Sarode R, Shurin SB, Chandrasekaran V, Stabler SP, Sabio H, Bouhassira EE, Upshaw JD, Jr., Ginsburg D, Tsai HM. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature 2001; 413: 488-94. 121. Furlan M, Robles R, Galbusera M, Remuzzi G, Kyrle PA, Brenner B, Krause M, Scharrer I, Aumann V, Mittler U, Solenthaler M, Lammle B. von Willebrand factor-cleaving protease in thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic-uremic syndrome. N Engl J Med 1998; 339: 1578-84. 122. Ono T, Mimuro J, Madoiwa S, Soejima K, Kashiwakura Y, Ishiwata A, Takano K, Ohmori T, Sakata Y. Severe secondary deficiency of von Willebrand factorcleaving protease (ADAMTS13) in patients with sepsis-induced disseminated intravascular coagulation: its correlation with development of renal failure. Blood 2006; 107: 528-34.

92

123. Monroe DM, Hoffman M. What does it take to make the perfect clot? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006; 26: 41-8. 124. Crawley JT, Lam JK, Rance JB, Mollica LR, O'Donnell JS, Lane DA. Proteolytic inactivation of ADAMTS13 by thrombin and plasmin. Blood 2005; 105: 1085-93. 125. Rosborough TK. Von Willebrand factor, polycations, and platelet agglutination. Thromb Res 1980; 17: 481-90. 126. Fay WP, Shapiro AD, Shih JL, Schleef RR, Ginsburg D. Brief report: complete deficiency of plasminogen-activator inhibitor type 1 due to a frame-shift mutation. N Engl J Med 1992; 327: 1729-33. 127. Tanka-Salamon A, Kolev K, Machovich R, Komorowicz E. Proteolytic resistance conferred to fibrinogen by von Willebrand factor. Thromb Haemost 2010; 103: 291-8. 128. Winters KJ, Eisenberg PR, Jaffe AS, Santoro SA. Dependence of plasminmediated degradation of platelet adhesive receptors on temperature and Ca2+. Blood 1990; 76: 1546-57. 129. Kamat SG, Michelson AD, Benoit SE, Moake JL, Rajasekhar D, Hellums JD, Kroll MH, Schafer AI. Fibrinolysis inhibits shear stress-induced platelet aggregation. Circulation 1995; 92: 1399-407.

93

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK:

N. Wohner, Z. Keresztes, P. Sótonyi, L. Szabó, E. Komorowicz, R. Machovich, K. Kolev: Neutrophil granulocyte-dependent proteolysis enhances platelet adhesion to the arterial wall under high-shear flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2010; 8: 1624–1631

N. Wohner, P. Sótonyi, R. Machovich, L. Szabó, K. Tenekedjiev, M. Silva, C. Longstaff, K. Kolev: Lytic resistance of fibrin containing red blood cells Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011 Jul 7. [Epub ahead of print]

N. Wohner: Role of cellular elements in thrombus formation and dissolution. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. 2008; 6(3):224-8

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÉZIRATOK:

N. Wohner, A. Kovács, R. Machovich, K. Kolev: Modulation of the von Willebrand factor-dependent platelet adhesion through alternative proteolytic pathways

94

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetemet szeretném kifejezni Prof. Ádám Veronikának, amiért intézetében dolgozhattam, témavezetımnek, Dr. Kolev Kraszimirnek, hogy munkámat irányította, Prof. Machovich Raymundnak, amiért laborjába fogadott, valamint Dr. Komorowicz Erzsébetnek, Oravecz Györgyinek és Magyarné Holti Krisztinának, akik munkámat segítették.

95