SECTOR PLUIMVEE. Samenvatting Praktijkonderzoek 2010 i.o.v. PPE

SECTOR PLUIMVEE Samenvatting Praktijkonderzoek 2010 i.o.v. PPE

Januari 2011

Samenvatting Praktijkonderzoek PPE 2010

Inleiding

De voorliggende samenvatting geeft een overzicht van het in 2010 bij de Gezondheidsdienst voor Dieren uitgevoerde voortgezet onderzoek pluimvee. De onderwerpen zijn uit een groot aantal onderzoeksvoorstellen gekozen door de PPE-adviescommissie Pluimveegezondheidszorg na prioritering in besprekingen met de sector (NOP, NVP).

De samenvatting vermeldt per onderwerp het beoogde resultaat, de stand van zaken betreffende het onderzoek, resultaten en (voorlopige) conclusies.

januari 2011 blz. 1


Inhoudsopgave Onderwerp

Omschrijving onderzoek

Doel van het onderzoek

Pag

Mycoplasma

1. Effect stalvaccin

1. Effectiviteit van Mycoplasma vaccins

3

synoviae

2. PCR gewrichten validatie (vervolg)

2. Optimalisatie Ms PCR gewrichten

4

3. Verbeteren moleculaire epidemiologie

3. Vergelijk specificiteit PCR’s

5

4. Ms histologische testen ontw. vervolg

4. Ontwikkeling IHC en ISH

7

E. coli interventie strategie

Welk effect hebben vaccins op een challenge met een heterologe E. coli-stam

9

Enterococcus cecorum problematiek in de

Inzicht krijgen in de E. cecorum

10

vleessector

ziekteproblemen bij vleeskippen.

Ziekte

Het opzetten van een Marek challenge

Ontwikkeling van een vaccinatiescore en

van Marek

model voor de verdere ontwikkeling van

beschermingscore m.b.v. de PCR.

Escherichia coli Enterococcen

16

een vaccinatiecontrole m.b.v. de PCR Coccidiose

1. Onderzoek naar bewaaromstandig-

1. Controle op levensvatbaarheid van

heden van Eimeria stammen en isolaten

ingevroren stammen

20

(vervolg) 2. Ontwikkeling PCR interspecies

2. Verschillende Eimeria-species kunnen

22

onderscheiden èn gekwantificeren in poolmonsters Darm-

Ontwikkeling diagnostisch systeem m.b.v.

O.a. in een vroeg stadium dysbacteriose

Gezondheid

chip

kunnen diagnosticeren, om specifieke

24

maatregelen te treffen. Vaccinaties

Onderzoek naar de toedieningswijze van

Verbeteren van praktijk (IB-)vaccinaties

25

vaccins en invloed van water op vaccins Coryza

1. Ontwikkeling challenge-model

Inzicht krijgen of de vaccinatie met Coryza

2. Validatie diagnostische PCR

vaccins bescherming geeft tegen de

3. Testen effectiviteit Coryza vaccins

avibacterium paragallinarum stammen die

26

recentelijk problemen hebben veroorzaakt. Locomotie

Schouderafwijkingen bij

Is de schouderafwijking een sectoraal

vermeerderingsdieren

probleem?

27

blz. 2


Onderwerp: Mycoplasma synoviae (Ms) Projectleider: dr. A. Feberwee 1. Effect Ms stalvaccin

Beoogd resultaat In 2008 is aangetoond dat een niet geregistreerd commercieel Ms vaccin onder experimentele omstandigheden de productie van eieren met eipuntschaalafwijkingen (EPS) met 50% reduceerde en een positief effect had op de eiproductie. Omdat dit vaccin niet geregistreerd is in Nederland, is in 2009 verder onderzoek gedaan naar de potentie van Ms stalvaccins voor de preventie van EPS en de mogelijke kruisbescherming van een commercieel dood Mg vaccin.

Samenvatting onderzoek naar de potentie van een geïnactiveerd water-in-olie emulsie stalvaccin voor de preventie van de productie van eieren met EPS In een dierexperiment zijn dieren gevaccineerd met drie verschillende geïnactiveerde water-in-olie emulsie 5

vaccins: stalvaccin 1 op basis van Ms EPS stam (10 / dosis = 0.5 ml vaccin), stalvaccin 2 op basis van Ms 6

gewrichtsstam (10 /dosis = 0.5 ml vaccin) of een commercieel Mg vaccin. De geïnactiveerde olie-emulsie vaccins (2 x Ms stal vaccin en 1 Mg vaccin) zijn toegediend op 14 weken leeftijd. Vier weken later (18 weken) heeft een IBV 1466 challenge plaats gevonden en 5 dagen daarna een challenge met een Ms EPS stam. Een positieve controle groep (niet gevaccineerd maar wel besmet met IBV en gechallenged met de Ms EPS stam) was aan deze studie toegevoegd. Gedurende het experiment is de productie van eieren met EPS en de dagelijkse eiproductie vastgelegd.

Resultaten Tabel 1: Resultaten van de eiproductie, productie van eieren met EPS en eischaalsterkte per proefgroep

Periode na vaccinatie

NVNC

NVC

HomVC

HetVC

MgVC

(weken) Eiproductie en productie van eieren met EPS Totale eiproductie

W7-20

795

888

897

872

1046

Gemiddelde dagelijkse

W7-20

0.50

0.57

0.57

0.55

0.66

W7-20

0

38

0

105

67

% eieren met EPS

W7-20

0

4.2

0

12

6.3

Gemiddeld aantal eieren

W7-20

0.0

0.04

0.0

0.1

0.06

W20

44.9

39.5

39.7

42.5

41.6

W13-20

-

29.3

-

24.1

eiproductie/hen? Totale productie eieren met EPS

met EPS/hen/dag Eischaalsterkte (Newton) Eieren zonder EPS (n = 26-29 per groep) Eieren met EPS

C

C

C

25.7

(n = 24-76 per groep) Niet gevaccineerde groep (NVNC), niet gevaccineerd gechallengde groep (NVC), homoloog gevaccineerde en gechallengde groep (HomVC), heteroloog gevaccineerd en gechallengende groep (HetVC) en Mg gevaccineerd en gechallengde groep (MgVC). januari 2011 blz. 3


Proportion of eggs with EAA

35 30 25 20 15 10 5 0 1

3

5

7

9

11

13

Week

NVC

HomVC

HetVC

MgVC

Voorlopige conclusies •

In deze studie is een significant verschil in de productie van eieren met EPS vastgesteld, waarbij de dieren die homoloog gevaccineerd waren geen eieren met schaalafwijking produceerden. Het is een belangrijke indicatie dat een stalvaccin de productie van eieren met EPS kan voorkomen. Dit zal echter in een herhalingsexperiment bevestigd moeten worden.

•

Genoemd herhalingsexperiment loopt thans en wordt in 2011 afgerond.

•

In een vervolgtraject zal moeten worden onderzocht of deze bevindingen ook van toepassing zijn voor andere Ms stammen die EPS veroorzaken.

2. Verdere optimalisatie diagnostiek Ms PCR gewrichtsmateriaal.

Beoogd resultaat Omdat een eerder opgezette Ms PCR-test voor gewrichten (primers die ook gebruikt werden voor het testen van tracheaswab materiaal) onvoldoende specifiek bleek (kruisreacties met gewrichtsontstekingsvocht en met andere gewrichtspathogenen) is deze test verder aangepast gebruikmakend van ontwikkelingsonderzoek. In dit kader zijn een drietal nieuwe PCR-testen (2 commerciële van Adiagene en LSI plus een derde beschreven in de wetenschappelijke literatuur (Raviv & Kleven, 2008) en diverse opwerkingsmethoden met elkaar vergeleken.

Stand van zaken Op basis van de gegevens van het ontwikkelingsonderzoek is gekozen voor de PCR van Raviv & Kleven (2009) omdat die het beste voldoet voor het testen van gewrichtsmonsters op de aanwezigheid van Ms. De validatie van deze PCR is thans afgerond.

blz. 4


3. Verbeteren moleculaire epidemiologie

Beoogd resultaat Thans wordt voor de moleculaire epidemiologie van Ms de AFLP gebruikt. Hoewel deze techniek momenteel de beste keus is, kent deze methode een aantal tekortkomingen waaronder problemen met DNA digestie, is bewerkelijk, bij update apparatuur moeilijk gegevens te vergelijken met verleden, etc. Het doel van het onderzoek was om een recentelijk in het buitenland ontwikkelde DNA sequence methode (vlhA sequencing) voor de typering van Ms, op te zetten bij GD en toe te passen op 30 Nederlandse Ms isolaten om te onderzoeken of deze geschikt is voor de typering van Nederlandse Ms isolaten.

Samenvatting onderzoek Overzicht van de Mycoplasma synoviae isolaten gebruikt in deze studie. Isolaten zijn afkomstig van verschillende soorten en typen pluimvee, hebben verschillend weefsel tropisme en zijn verzameld over een periode van 15 jaar. M-nummer

Diersoort

M1995.02

Ch

1

Diertype BR

2

3

Tropisme

Land

R

NL

M2000.05

Ch

L

J

NL

M2001.27

Tu

?

R

USA

M2001.29

Ch

?

R

USA

M2002.02a

Tu

TM

J

NL

M2002.06

Ch

L

?

NL

M2002.17

Ch

L

O

NL

M2004.08

Ch

BR

R

GER

M2005.04

Ch

L

O

NL

M2005.09

Ch

BR

R

NL

M2005.09

Ch

BR

R

NL

M2005.09

Ch

BR

R

NL

M2005.09

Ch

BR

R

NL

M2005.26

Ch

L

J

NL

M2006.07

Ch

LR

R

NL

M2007.07

Ch

L

O

NL

M2007.17

Tu

TM

J

NL

M2007.20

Ch

L

J

NL

M2007.21

Tu

TR

J

GER

M2007.23

Ch

LR

J

NL

M2008.01

Ch

BR

J

NL

M2008.02

Ch

LR

O

NL

M2008.03

Ch

L

O

NL

M2008.13

Ch

L

O

FR

M2008.17

Ch

BR

R

NL

M2008.17

Ch

BR

R

NL

M2008.17

Ch

BR

R

NL

M2009.03

Ch

?

?

FR

januari 2011 blz. 5


M2009.05

Ch

BR

R

NL

M2010.09

Ch

BR

R

NL

M2010.09

Ch

BR

R

NL

M2010.09

Ch

BR

R

NL

M2010.10

Ch

L

J

NL

1

Diersoort: Chicken (Ch), Turkey (Tu)

2

Diertype: Broiler reproduction (BR), Layer (L), Turkey meat (TM), Layer reproduction (LR), Turkey reproduction (TR)

3

Tropisme: Respiratory tract (R), Joint (J), Oviduct (O)

Figuur 1. Clustering van M. synoviae isolaten (Broiler reproduction (BR), Layer (L), Turkey meat (TM), Layer reproduction (LR), Turkey reproduction (TR) Respiratory tract (R), Joint (J), Oviduct (O)

Voorlopige conclusies Moleculaire typering m.b.v. sequentieanalyse lijkt reproduceerbare resultaten op te leveren. Of het onderscheidende vermogen van deze techniek voldoende is, moet nog verder onderzocht worden. Clustering van isolaten van verschillende herkomst (jaar van isolatie, geografische locatie en weefseltropisme), toont een beperkte diversiteit aan en impliceert een clustering/verwantschap die er mogelijk niet is. Of de gevonden

blz. 6


diversiteit (of het ontbreken daarvan) representatief is voor de werkelijke diversiteit zal dan ook verder onderzocht moeten worden door meer isolaten te analyseren die geografisch en in tijd verschillend zijn. Verder is op basis van deze typering geen onderscheid te maken tussen stammen met verschillend weefseltropisme. Ook kan verder gekeken worden naar andere genen welke geschikte targets zouden zijn voor typering (16S-23S ISR, UcrV, tRNA enz). Met behulp van Next Generation Sequencing (NGS) is het mogelijk het volledige genoom te sequencen. Door diverse stammen te sequencen kan gezocht worden naar differentiërende markers. Deze nieuwe markers kunnen gebruikt worden bij typering ter ondersteuning van epidemiologische vraagstukken en bij het maken van onderscheid tussen stammen met verschillend weefseltropisme.

4. Ontwikkeling immuunhistochemie (IHC) en in situ hybridisatie (ISH)

Beoogd resultaat Deze testen kunnen een belangrijke bijdrage leveren bij het doen van onderzoek naar de pathogenese van Ms (hoe Ms infecties tot stand komen en welke organen in de tijd worden aangetast). .Tevens kunnen deze testen waarschijnlijk ook een bijdrage leveren bij onderzoek naar latente Ms infecties (infecties zonder klinische verschijnselen die met conventionele technieken niet worden gedetecteerd).

Samenvatting onderzoek De IHC is een techniek voor het aantonen voor de aanwezigheid van specifiek cel antigeen door antigen-antistofinteractie waarbij het complex van antigeen-antistof geïdentificeerd door een kleurlabel. De IHC Ms betreft een indirecte methode waarbij gebruik wordt gemaakt van een polyclonaal antiserum (konijn anti Ms die bindt aan het aanwezig Ms antigeen en vervolgens wordt door aanhechting van een polymeer met een kleurlabel de Ms antigeen-antiserum complexen zichtbaar gemaakt (rode kleur in de coupes).

Stand van zaken De test is verder gevalideerd en toegepast op eileiders afkomstig van kippen die eieren met EPS produceren.

Voorlopige conclusie Door middel van IHC is aangetoond dat Ms voornamelijk aanwezig is in het isthmus van hennen die eieren met EPS produceren. Het verklaart goed het ontstaan van de eischaalafwijkingen die het gevolg zijn van een abnormaal gevormd eimembranen waardoor de afzetting van calciet verstoord is. Genoemde eimembranen worden namelijk in het isthmus aangelegd en daar is de besmetting met Ms juist het hoogst.

januari 2011 blz. 7


afb. 1 IHC van isthmus weefsel afkomstig van een hen die eieren met EPS produceerde. De rode aankleuring vertegenwoordigd Ms.

In situ hybridisatie (ISH) ISH (in situ hybridisatie) is een methode voor de detectie van specifieke DNA- of RNA-sequenties in histo / cytologische preparaten. Deze techniek heeft een hoge specificiteit en sensitiviteit, het voordeel t.o.v. de IHC is dat er geen afhankelijkheid is van beschikbaar hyper-immuunserum.

Stand van zaken De ontwikkeling van de ISH is gestart. Onderzocht moet worden welke verdunningen van de probe gebruikt kunnen worden. Daarnaast moet nog onderzocht worden of het DNA de eventuele langere fixatietijden overleeft.

blz. 8


Onderwerp: E. coli Projectleider: dr. W.J.M. Landman Onderzoek naar de effectiviteit van Escherichia coli-stalvaccins op basis van water-in-olie emulsie ter voorkoming van peritonitis bij leghennen

Inleiding Escherichia coli-buikvliesontsteking is de belangrijkste doodsoorzaak bij leghennen. E. coli-buikvliesontsteking en -salpignitis leiden tot grote economische schade op legbedrijven. De GD beschikt op dit moment dus over een diermodel voor E. coli-buikvliesontsteking. Een dergelijk model kan een belangrijk instrument zijn om interventiestrategieën te evalueren. In het veld worden E. coli-uitbraken vaak behandeld met antibiotica, maar in veel gevallen is dat niet mogelijk, als b.v. de eieren voor consumptie bestemd zijn. Daarnaast blijkt het effect van een antibioticum behandeling vaak van korte duur te zijn. Het gevolg is dat bedrijven die veel last hebben van E. coli-uitbraken nieuwe koppels preventief vaccineren. Omdat er een grote variatie aan E. coli-stammen bestaat met geringe kruisbescherming, worden naast commerciële vaccins, regelmatig stalvaccins op basis van formaline gebruikt. In een diermodel wordt de effectiviteit van stalvaccins ter voorkoming E. coli-buikvliesontsteking onderzocht.

Beoogd resultaat In

een

voorafgaand

pilotonderzoek

wordt

eerst

ziektemakendvermogen heeft. Genoemde staam

onderzocht

vormt namelijk

of

een

heterologe

challengestam

een essentieel onderdeel van het

hoofdexperiment dat inzicht moet geven in de waarde van de verschillende vaccins om buikvliesontsteking door E. coli te voorkomen. Deze studie moet ook laten zien welk effect de vaccins hebben op een challenge met een heterologe E. coli-stam.

Resultaten Thans zitten de dieren in opfok en zijn alle vaccinaties afgerond. Het pilot experiment en de challenge van de gevaccineerde dieren wordt begin 2011 verricht.

januari 2011 blz. 9


Onderwerp: Enterococcen Projectleiders: Drs. M.J. Kense en dr. W.J.M. Landman Inleiding Bij de GD is halverwege de jaren negentig tot begin van deze eeuw veel onderzoek gedaan naar de pathogenese en moleculaire epidemiologie van Enterococcus faecalis arthritis en daaruit voortvloeiende gewrichtsamyloïdose, waarbij verontreiniging van Marek enstofsuspensies een belangrijke bron van infecties bleek te zijn. Eveneens is toen aangetoond dat de verticale overdracht van E. faecalis via zieke moederdieren mogelijk bleek te zijn en dat broederijlucht verontreinigd kon raken met E. faecalis varianten met ziektemakend vermogen die de eerder genoemde verontreiniging van Marek entstofsuspensies konden veroorzaken. De afgelopen paar jaar is vanuit het veld in toenemende mate gerapporteerd over het voorkomen van probleemkoppels in de vleessector (moederdieren en vleeskuikens) waar enterococcen een rol zouden spelen. Om de aard en oorzaak van de problemen goed in kaart te brengen is het project Enterococcenproblematiek in de vleessector bij GD gestart.

1. Onderzoek op bedrijven. Beoogd resultaat Enterococcen problemen in het veld goed definiëren (uitval, klinische verschijnselen, macroscopische en microscopische afwijkingen) en de betrokken Enterococcensoort identificeren.

Stand van zaken Na een eerste kleinschalige studie bij 5 probleemkoppels, is het onderzoek uitgebreid naar 10 vleeskuikenbedrijven. Tevens zijn de moederdieren van deze koppels betrokken bij het project. Op de bijbehorende broederijen zijn monsters genomen in de vorm van luchtmonsters uit uitkomstkasten en liggenblijvers. De laesies gevonden bij de vleeskuikens werden gekenmerkt door het voorkomen van afgebroken heupkopen, abcessen in wervellichaam van T6 en hartzakontsteking. Uit genoemde laesies is veelvuldig Enterococcus cecorum gekweekt. De bacterie is ook bij de moederdieren teruggevonden (in cloacaswabs en bij enkele dieren in het bloed en de eileider). Bij de onderzochte liggenblijvers van de hierboven genoemde moederdieren en de luchtmonsters hebben we echter geen E. cecorum kunnen aantonen. De geïsoleerde E. cecorum bacteriën van de moederdieren en hun nakomelingen zijn met elkaar vergeleken door middel van een DNA-fingerprint techniek (Pulsed-field Gel Electroforese) en bleken verschillend te zijn. Isolaten afkomstig van een uitbraak op één bedrijf bleken onderling ook verschillend te zijn (polyclonaal). Deze resultaten vormen een eerste aanwijzing voor het feit dat de bacterie niet verticaal wordt overgebracht van moederdieren naar vleeskuikens. Dit wordt ook ondersteund door het feit dat E. cecorum niet gevonden is in de luchtmonsters op de broederijen en bij liggenblijvers. Een groot deel van dit onderzoek is in 2009 uitgevoerd. De analyse van de resultaten en de typering van de stammen is uitgevoerd in 2010.

blz. 10


2. Infectieproeven 2a. Studie naar verschillende infectieroutes (inoculatie van vleeskuikens op dag 8) Beoogd resultaat Het vinden van de natuurlijke infectieroute van E. cecorum om vervolgens gericht onderzoek te kunnen doen naar interventiestrategieën.

Stand van zaken Zes groepen zijn intraveneus, oraal, intratracheaal, intradermaal, intramusculair of via een aërosol besmet met E. cecorum. Tevens is er een controle groep intraveneus met fysiologisch zout geïnjecteerd. Het bleek mogelijk te zijn om het ziektebeeld, zoals gerapporteerd uit het veld, op te wekken via de intraveneuze infectieroute, maar niet de overige inoculatieroutes. Wel is bij enkele kuikens de bacterie in de overige groepen aangetoond bij sectie. Een natuurlijke infectie route kon dus tijdens dit onderzoek niet worden aangetoond. Een overzicht van de proefopzet en resultaten staan in Tabel 1. Tabel 1: proefopzet en resultaten infectieproef. De getallen tussen haakjes geven de monsters aan waarbij E. cecorum gevonden is. De laatste kolom geeft aan hoe vaak E. cecorum is gevonden bij hoeveel kuikens.

Groep

Infectie dosis

Aantal

(CFU/kuiken)

kuikens

Macroscopische laesies

BO/ kuiken

Pericarditis**

HKN** Osteomyelitis T6**

8

40

0

0

0

0

8

40

15 (1)

5(4)

5(3)

8/7

8

40

2 (1)

1

1

1

Controle

0,3 ml10 /ml

I.V.*

0,3 ml 10 /ml

I.M.*

0,3 ml 10 /ml

3 hydrop 8

40

0 (1)

0

0

1

8

40

0 (4)

0

0

0/4

I.T.*

0,3 ml 10 /ml

Oraal

0,3 ml 10 /ml

5 coli Voetzool

8

0,2 ml10 /ml

40

1(2)

0 (1)

1

3/2 1 coli

Aërosol

8

50 ml 10 /ml

40

1 hydrop(2)

2(1)

0

3/3 2 coli

*I.V.: intraveneus, I.M.: intramusculair, I.T.: Intratracheaal. **Pericarditis: hartzakontsteking/hydropericard, HKN: heupkop necrose, Osteomyelitis T6: ontsteking van wervellichaam T6.

2b. Vergelijking ziektemakendvermogen drie verschillende veldisolaten Beoogd resultaat Inzicht krijgen in het ziektemakendvermogen van drie E. cecorum isolaten gevonden bij de veldstudie. Dit is van belang om bij vervolginfectieproeven gebruik te maken van een isolaat waarbij de kans op klinische verschijnselen het grootste is.

januari 2011 blz. 11


Stand van zaken Om bij verdere infectie proeven de kans op symptomen te maximaliseren zijn drie E. cecorum stammen van 3 verschillende bedrijven uit het onderzoek op bedrijven met elkaar vergeleken. Hierbij zijn kuikens uit het veld gebruikt in plaats van SPF kuikens. Hieruit is voortgekomen dat de stammen onderling sterk kunnen verschillen wat virulentie betreft. Dit kwam vooral naar voren in verschil in uitval. Ook de herkomst (wel of geen SPF) lijkt effect te hebben op de mate van ziekte. We hebben bij deze proef veel meer uitval gehad dan bij de infectieproef met SPF dieren die op dezelfde wijze zijn geïnfecteerd. Op basis van dit onderzoek is besloten om voor vervolgonderzoeken een andere E. cecorum stam te gebruiken en commerciële dieren.

2c. 2e Studie naar verschillende infectieroutes (inoculatie van vleeskuikens op dag 2) Beoogd resultaat Het vinden van de natuurlijke infectieroute om vervolgens gericht onderzoek te kunnen doen naar interventiestrategieën.

Stand van zaken Aangezien het bij de eerste infectieproef niet mogelijk bleek om de natuurlijke infectieroute aan te tonen en bij de vergelijking van stammen verschil in virulentie is aangetoond is gekozen om met een ander isolaat dieren op een jongere leeftijd te infecteren. Hierbij zijn de dieren op dag 2 intramusculair, oraal, intratracheaal, subcutaan of via aërosol besmet. De intraveneuze route is bij deze dieren niet uitgevoerd aangezien de kuikens hiervoor te klein zijn. Op deze leeftijd is de intramusculaire route vergelijkbaar aan de intraveneuze. Tevens is de voetzool route vervangen door een subcutane injectie. Deze dieren zijn tot 6 weken leeftijd vervolgd. Zoals bij de eerste infectieproef was het hier niet mogelijk om klinische verschijnselen via een natuurlijke infectie route op te wekken. De proefopzet en de resultaten van dit experiment zijn weergegeven in Tabel 2. e

Tabel 2: proefopzet en resultaten 2 infectieproef

Groep

Infectie dosis

Aantal

(CFU/kuiken)

kuikens

Macroscopische laesies

BO/ Kuiken

Pericarditis**

HKN** Osteomyelitis** T6

8

40

0

0

0

8

40

7(7)

0(2)

3

7/7

8

40

1 (1)

0

0

1/1

8

40

0

0

0

0

8

40

4(2)

0(1)

0

3/3

8

40

1(2)

0

0

2

Controle

0,3 ml10 /ml

I.M.*

0,3 ml 10 /ml

I.T.*

0,3 ml 10 /ml

Oraal

0,3 ml 10 /ml

Sub-

0,2 ml10 /ml

0 1 coli

cutaan* Aërosol

50 ml 10 /ml

*I.V.: intraveneus, I.M.: intramusculair, I.T.: Intratracheaal. **Pericarditis: hartzakontsteking/hydropericard, HKN: heupkop necrose, Osteomyelitis T6: ontsteking van wervellichaam T6.

blz. 12


3. Onderzoek naar de verticale transmissie E. cecorum en twee interventie mogelijkheden. Beoogd resultaat Inzicht krijgen in de mogelijke verticale transmissie van E. cecorum en het effect van een aantal interventie strategieën hierop.

Stand van zaken Proefopzet Ouderdieren (25 hennen en 3 hanen per groep) Groep 1. Controle groep Groep 2. Twee keer gevaccineerd met een autovaccin gevolgd door intraveneuze challenge met E. cecorum Groep 3. Alleen intraveneuze challenge met E. cecorum Groep 4. Antibiotica behandeling na intraveneuze challenge met E. cecorum Van deze moederdieren zijn de eieren uitgebroed, de liggenblijvers bacteriologisch onderzocht en de kuikens zijn 6 weken vervolgd. In totaal zijn er 4 partijen van ongeveer 480 kuikens uitgebroed (per partij 120 kuikens per moederdiergroep) en nog eens 3 partijen van 120 kuikens van de intraveneus besmette groep nadat deze in week 38 met antibiotica zijn behandeld.

Resultaten tot nu toe Moederdieren Tabel 3: E. cecorum positieve bloedkweken moederdieren

Week

Groep 1

Groep 2

Groep 3

Groep 4

Controle

Vaccinatie en IV*

IV*

IV* en antibiotica

24

0/5

0/5

0/5

0/5

25

0/5

1/5

1/5

0/5

28

0/5

0/5

1/5

0/5

31

0/5

0/5

0/5

0/5

35

0/5

1/5

1/5

0/5

38

1/5

41

3/5

44

0/5

*I.V.: intraveneus In Tabel 3 is te zien dat bij enkele dieren na infectie E. cecorum langere tijd in het bloed aan te tonen is (groep 2 en 3).



Tabel 4: Uitval, bacteriologisch onderzoek en voorkomen osteomyelitis bij de moederdieren

Groep

Uitval

Bacteriologie Osteomyelitis*** E. cecorum

T6

1 Controle

0

0

0

2 Vacc en IV*

3

1/2

1

3 IV*

8

4/8

4

4 IV* en Ab**

1

0

0

*I.V.: intraveneus, **Ab: antibiotica, ***Osteomyelitis T6: ontsteking van wervellichaam T6 Tijdens de proef is vooral bij de moederdieren in groep 2 en 3 uitval opgetreden waarbij tevens abcessen in het wervellichaam van thoracale wervel 6 zijn aangetroffen. Deze laesie is eerder zowel bij moederdieren als vleeskuikens ten gevolge van E. cecorum infecties beschreven is. Bovendien is bij de helft van de uitgevallen dieren E. cecorum aangetoond door middel van bacteriologisch onderzoek. Het feit dat er geen/minder uitval is opgetreden in de gevaccineerde en behandelde moederdieren lijkt erop te wijzen dat deze interventie strategieën (vaccineren of behandelen) bij moederdieren effect hebben. Tabel 5: Resultaten van het bacteriologisch onderzoek tijdens sectie van de hennen aan het einde van de studie

Bacteriologie E. cecorum Groep

Aantal

Oviduct

Beenmerg

Pericard

Cloaca

0/25

0/25

hennen 1 Controle

25

0/25

0/25

2 Vacc en IV*

22

1/22

0/22

0/22

0/22

3 IV*

17

0/17

0/17

0/17

7/17

4 IV* en Ab**

24

0/24

0/24

0/24

3/24

*I.V.: intraveneus, **Ab: antibiotica De moederdieren die niet zijn uitgevallen tijdens de proef, zijn op een leeftijd van 47 weken ter sectie aangeboden. In Tabel 5 zijn hiervan de gegevens weergegeven. Geen van de dieren hadden macroscopische afwijkingen. In groep 2,3 en 4 is E. cecorum aangetoond. In Groep 2 in het oviduct en in groep 3 en 4 uit cloacaswabs. Tabel 6: Resultaten van het bacteriologisch onderzoek tijdens sectie van de hanen aan het einde van de studie

Bacteriologie E. cecorum Groep

Aantal

Beenmerg

Pericard

Cloaca

hanen 1 Controle

3

0/3

0/3

0/3

2 Vacc en IV*

3

0/3

1/3

0/3

3 IV*

3

0/3

0/3

1/3

4 IV* en Ab**

3

0/3

0/3

0/3

*I.V.: intraveneus, **Ab: antibiotica Ook de hanen zijn op een leeftijd van 47 weken bij sectie bacteriologisch onderzocht. De hanen zijn niet geïnfecteerd. Het feit dat er een haan uit groep 2 positief is voor E. cecorum in een monster genomen uit het hartzakje is opvallend.

blz. 14


Vleeskuikens Tot nu toe is er op 5 groepen nakomelingen sectie verricht. In totaal zijn ongeveer 2000 dieren onderzocht. Van de laatste 2 groepen nakomelingen worden begin volgend jaar de resultaten bekend. Bij geen van de 5 vleeskuikengroepen die nu zijn onderzocht zijn verschijnselen gezien die passen bij een infectie met E. cecorum. Bovendien is tijdens bacteriologisch onderzoek bij geen enkel kuiken E. cecorum gedetecteerd. Bij de liggenblijvers en schouweieren die bacteriologisch zijn onderzocht is evenmin E. cecorum aangetroffen.

Verder onderzoek De zoektocht naar een natuurlijke infectieroute zal in 2011 worden voortgezet. Dit is van groot belang gezien het feit dat de verticale transmissie steeds onwaarschijnlijker lijkt (zie resultaten DNA-fingerprint en dierexperiment verticale transmissie).



Onderwerp: Ziekte van Marek Projectleiders: Dr. Ing. G. Wellenberg en dr. W.J.M. Landman Het opzetten van een Marek infectie en vaccinatie-challenge model voor de ontwikkeling van een vaccinatiescore en beschermingscore m.b.v. de PCR Inleiding De ziekte van Marek is de belangrijkste besmettelijke tumorziekte bij pluimvee en kan grote directe (door ziekte uitbraken) en indirecte (kosten preventieve vaccinatie) economische schade veroorzaken bij commerciële pluimveebedrijven. Er zijn verschillende commerciële vaccins tegen de ziekte van Marek beschikbaar voor toediening bij kuikens van legrassen. De vaccinatie vindt i.h.a. op de broederij plaats, voordat de dieren worden overgebracht naar het opfokbedrijf. In de praktijk blijken niet alle dieren afdoende beschermd te zijn, waarschijnlijk door onvolkomenheden in de vaccinatieprocedure. De GD heeft een tweetal real-time PCR testen ontwikkeld waarmee het percentage Rispens en/of HVT gevaccineerde dieren middels verenonderzoek bepaald kan worden. Met behulp van deze PCR testen kan de uitvoering van Marek vaccinaties gecontroleerd worden (“vaccinatiescore”). Op basis van de berekende vaccinatiescore kan een bedrijf maatregelen treffen om zodoende de procedures rond de uitvoering van de Marek vaccinaties te verbeteren. Echter op dit moment is niet bekend wat de waarde van deze real-time PCR testen zijn bij het bepalen van de bescherming na vaccinatie. M.a.w. wat is de waarde van deze testen bij het berekenen van een “beschermingsscore”?

Doel van het project en het beoogde resultaat Het primaire doel van dit project was; 1) het selecteren van verschillende Marek virussen voor het opzetten van een Marek infectiemodel, en 2) het opzetten en uitvoeren van een vaccinatie-challenge proef. Het vaccinatie-challengemodel was nodig om op basis van bloed- en verenonderzoek een beschermingsscore te ontwikkelen voor bedrijven die tegen Marek vaccineren. Na het opzetten van een infectiemodel werd aan de hand van het vaccinatie-challenge model bekeken of een koppel goed of slecht gevaccineerd was tegen Marek. Een betere controle op de naleving van Marek procedures rond het vaccineren, en daardoor een verbetering van de Marek vaccinaties, moeten leiden tot een reductie in onkosten t.g.v. het voorkomen van Marek uitbraken.

Materiaal en methoden 1: Selecteren en opkweken van Marek virussen voor het opzetten van een Marek infectiemodel Er werden drie verschillende Marek virussen geselecteerd voor het opzetten van een vaccinatie-challenge model, namelijk het Md5, JM en het RB1B Marek virus. 2: Vaccinatie-challenge model opzetten en uitvoeren van de proef Voor het opzetten van een vaccinatie-challenge model werd voor het model van Witter gekozen (Witter R.L. 1997. Increased virulence of Marek’s disease virus filed isolates. Avian Dis. 41: 149-163). Dit model is een internationaal geaccepteerd model. In totaal hebben we 9 diergroepen geselecteerd met elk 18 dieren per groep. Elke groep met zijn eigen behandeling/vaccinatie werd als een eenheid gezien (Tabel 1). Vaccinatie en challenge (met 3 verschillende Marek virussen) vond plaats via de intramusculaire route.

blz. 16


Tabel 1: Model van Witter met het vaccinatie – challenge schema voor leghennen

Groep

Groep 1

Vaccinatie

Vaccin dosis

Challenge virus

Aantal

(Dag 1)

(Rispens/HVT)

(Dag 6)

dieren

(Marek virus)

(n= )

Geen

-

vvMDV-1

18

Groep 2

Geen

-

vMDV-1

18

Groep 3

Geen

-

vvMDV-1

18

Groep 4

Rispens/HVT

Lage dosis

vvMDV-1

18

Groep 5

Rispens/HVT

Lage dosis

vMDV-1

18

Groep 6

Rispens/HVT

Lage dosis

vvMDV-1

18

Groep 7

Rispens/HVT

Hoge dosis

vvMDV-1

18

Groep 8

Rispens/HVT

Hoge dosis

vMDV-1

18

Groep 9

Rispens/HVT

Hoge dosis

vvMDV-1

18

Van 5 dieren per groep werden op de dagen 7, 14, 17 en 24 post-vaccinatie (pv) 0.5ml bloed getapt, en veren met veel pulpa (vleugels) werden verzameld op de dagen 20 (n=9 per groep) en 25 pv (n=9; van de 9 resterende kippen). Hiervoor werden 5-6 veren genomen die aan het eind van de vleugels zaten (snel groeiende veren met veel pulpa). De veren werden door middel van de PCR onderzocht op de aanwezigheid van Rispens vaccinvirus en Marek virus. Op 84 dagen leeftijd vond euthanasie plaats en werden de dieren onderzocht op Marek afwijkingen. Dieren die gedurende de proef stierven werden tevens onderzocht op Marek virus afwijkingen. 3: Voorbereiding opzetten Marek antilichaam ELISA Er werden voorbereidingen uitgevoerd voor het opzetten van een Marek virus antilichaam ELISA.

Projectresultaten 1: Marek virusstammen voor het opzetten van een Marek infectie model Er werden drie Marek virusstammen aangevraagd en deze stammen verschilden in virulentie. Eén stam behoort tot de “virulent Marek virussen” (vMDV1), en twee stammen behoren tot de “very virulent Marek virussen” (vvMDV1). Er werden in vitro virus batches opgekweekt en Marek virus stocks werden aangelegd voor het uitvoeren van de studie. De Marek virustiters werden bepaald evenals de vaccinvirustiters in het Rispens/HVT vaccin waarmee de vaccinatie-challenge proef werd uitgevoerd. Het bepalen van de virustiter was noodzakelijk om te weten met welke dosis de dieren geïnfecteerd moesten worden t.b.v. het verkrijgen van Marek verschijnselen. Er werd een groep SPF dieren geïnfecteerd om zodoende een Marek virusstam uit de VS te vermeerderen om Marek virus stocks aan te kunnen leggen. 2: Opzetten en uitvoeren van het Marek infectie en vaccinatie-challenge model Na het verkrijgen van het infectiemodel, werd het vaccinatie-challenge model geselecteerd (Model van Witter) en werd de vaccinatie-challenge proef uitgevoerd. De resultaten van deze proef worden weergegeven in Tabel 2. De resultaten in Tabel 2 geven aan dat het percentage gestorven dieren ten gevolge van Marek en het totale percentage dieren met Marek hoger is in de groepen geïnfecteerd met de “very virulent Marek virussen” MD5 en RB1B ten opzichte van de groep die geïnfecteerd was met het virulente JM Marek virus. Dit kwam overeen met de verwachtingen. januari 2011 blz. 17


Tabel 2: Resultaten van het infectiemodel en vaccinatie-challenge model.

Groep

Vaccinatie

Vaccin dosis

Challenge virus

Aantal

(Dag 1)

(Rispens/HVT)

(Dag 6)

dieren

(PFU)

(Marek virus)

(n= )

Percentage Percentage dieren dood tgv

met Marek

Marek

diagnose

(%)

(%)

Groep 1

Geen

0

MD5 (vvMDV-1)

18

67

89

Groep 2

Geen

0

JM (vMDV-1)

18

28

44

Groep 3

Geen

0

RB1B (vvMDV-1)

18

50

100

Groep 4

Rispens/HVT

89

MD5 (vvMDV-1)

18

0

0

Groep 5

Rispens/HVT

89

JM (vMDV-1)

18

0

6

Groep 6

Rispens/HVT

89

RB1B (vvMDV-1)

18

0

6

Groep 7

Rispens/HVT

1250

Md5 (vvMDV-1)

18

0

0

Groep 8

Rispens/HVT

1250

JM (vMDV-1)

18

0

0

Groep 9

Rispens/HVT

1250

RB1B (vvMDV-1)

18

0

0

PFU: plaque forming units vaccinvirus. In de groepen, die met een lage dosis Rispens/HVT gevaccineerd waren (groepen 4, 5 en 6; 89 PFU per dier), werden geen dode dieren t.g.v. Marek waargenomen. Bij histologisch onderzoek bleek dat enkele dieren van de groepen 5 en 6 lichte vormen van Marek hadden ontwikkeld in de periode tot dag 84 leeftijd. In Tabel 3 worden de resultaten weergegeven van de vaccinatiescores. De vaccinatiescores werden berekend op basis van het gemiddelde aan Marek virus en/of Rispens DNA kopieën in de veren, de standaarddeviatie over dit gemiddelde en het percentage Marek virus en/of Rispens DNA positieve dieren. Tabel 3: Resultaten van de vaccinatie-challende proef met de vaccinatiescores.

Groep

Vaccinatie

Vaccin

Challenge virus

(Dag 1)

dosis

(Dag 6)

Vaccinatiescores op Vaccinatiescores op basis van Rispens

basis van

(Rispens/H

en Marek virus pos

percentage Rispens

VT)

veren

pos veren

(PFU)

(Marek virus)

Groep 1

Geen

0

MD5 (vvMDV-1)

Nvt

Nvt

Groep 2

Geen

0

JM (vMDV-1)

Nvt

Nvt

Groep 3

Geen

0

RB1B (vvMDV-1)

Nvt

Nvt

Groep 4

Rispens/HVT

89

MD5 (vvMDV-1)

9.8

5.2

Groep 5

Rispens/HVT

89

JM (vMDV-1)

5.9

5.2

Groep 6

Rispens/HVT

89

RB1B (vvMDV-1)

9.1

7.6

Groep 7

Rispens/HVT

1250

Md5 (vvMDV-1)

8.2

3.6

Groep 8

Rispens/HVT

1250

JM (vMDV-1)

9.5

8.5

Groep 9

Rispens/HVT

1250

RB1B (vvMDV-1)

9.3

7.1

PFU: plaque forming units vaccinvirus.

blz. 18


3: Opzetten Marek antilichaam ELISA Ook werden monoclonalen (specifieke antilichamen) gericht tegen het Marek virus besteld en uitgetest (identificatie van Marek veldvirus en vaccinvirus). Met deze monoclonalen moet het in de toekomst mogelijk zijn een specifieke ELISA op te zetten voor het aantonen van Marek antilichamen in een zeer vroege fase na vaccinatie.

Samenvatting projectresultaten 1: Het selecteren en opkweken van 3 verschillende Marek virussen, die verschillen in virulentie, is succesvol uitgevoerd. Tevens is het opzetten en uitvoeren van een Marek infectiemodel gelukt. 2: Het invoeren van het vaccinatie-challenge model van Witter (1997), en het uitvoeren van dit vaccinatiechallenge model is succesvol verlopen. In veren van dieren die gevaccineerd en geïnfecteerd waren kon met behulp van de PCR het vaccinvirus en het Marek virus worden aangetoond. Op basis van de verkregen vaccinatiescores ín deze studie kon echter niet direct een beschermingsscore worden berekend. 3: Er zijn monoclonalen in huis gehaald en er zijn sera van de vaccinatie-challenge proef verzameld om een ELISA op te zetten voor de vroege detectie van Rispens antilichamen na vaccinatie.



Onderwerp: Coccidiose, bewaaromstandigheden Projectleider: Dr. H. Peek Vervolgonderzoek naar bewaaromstandigheden van Eimeria spp. lijnen in 2010 Inleiding De Gezondheidsdienst voor Dieren (GD) is in het bezit van drie Eimeria spp. referentie laboratorium lijnen. Deze lijnen zijn belangrijk voor het uitvoeren van coccidiose experimenten en worden daarom regelmatig (minimaal 2 x jaar) in coccidiose vrije kuikens vermeerderd (verjongd). Dit vergt inzet van materieel, proefdieren en personeel. Het is daarom belangrijk dat deze lijnen op een dusdanige wijze opgeslagen worden zodat er efficiënter mee gewerkt kan worden. In 2004 en in 2006 werden sporocysten van deze coccidiose referentie lijnen in de vloeibare stikstof ingevroren. Een eerste controle op levensvatbaarheid (overleving) van de in 2004 ingevroren sporocysten van de Eimeria spp. lijnen werd in 2005, een half jaar na het invriezen, uitgevoerd. Het resultaat was dat de ingevroren sporocysten van E. acervulina en E. tenella lijnen in staat waren om een coccidosis infectie op te wekken, echter bij E. maxima lijn lukte dit niet. Een tweede controle op levensvatbaarheid van E. tenella en E. maxima werd in 2005, een jaar na het invriezen, uitgevoerd. De sporocysten van E. tenella waren nog steeds in staat om een coccidosis infectie op te wekken, maar bij E. maxima lukte dit wederom niet. De gebruikte invriesmethodiek werd daarom in detail geanalyseerd en aangepast. Begin 2006 zijn met een herziene invriesmethodiek sporocysten van E. maxima lijn opnieuw sporocysten ingevroren. In eerste instantie werd bij de controle op levensvatbaarheid na een periode van 3 weken een positief resultaat behaald. Maar in 2008, ongeveer vier jaar na het invriezen van de eerste drie Eimeria spp. en 2,5 jaar na het opnieuw invriezen van de E. maxima lijn, werd wederom een controle uitgevoerd. De resultaten van de ingevroren E. maxima lijnen waren negatief. In 2009 werd daarom de procedure voor het ontdooien van de ingevroren suspensies herzien en aangepast. Het resultaat was dat alle ingevroren Eimeria spp. een positief resultaat opleverde. Mogelijk heeft aanpassing van de ontdooimethodiek tot dit resultaat geleid. In 2010 is wederom een controle uitgevoerd met de aangepaste ontdooitechniek voor bevestiging van het in 2009 behaalde positieve resultaat.

Materiaal en methode De inhoud van de ampullen werd direct vanuit de stikstof in lauw water (35-39 ºC) ontdooid en daarna overgebracht in een centrifugebuis en met PBS verdund tot een volume van ongeveer 5 ml (1:5). Vervolgens werden de ontdooide en met PBS verdunde suspensie zo snel mogelijk oraal aan acht dagen oude kuikens ingeven (± 1 ml/dier). Vanaf vier dagen na de inoculatie werd dagelijks een controle op aanwezigheid van oöcysten in vers verzamelde faecesmonsters uitgevoerd. Op zes en zeven dagen na de inoculatie werd op de met E. acervulina, E. tenella of E. maxima geïnfecteerde kuikens sectie uitgevoerd.

Resultaat, discussie en conclusie Een eerste controle op levensvatbaarheids (na drie weken) van de in 2006 ingevroren E. maxima lijn toonde aan dat deze nog in staat was om een coccidiose infectie te veroorzaken. Echter, bij de tweede controle na 29 maanden (± 2,5 jaar) in 2008 kon dit niet bevestigd worden. De E. acervulina en E. tenella lijnen bleken bij beide controlemomenten (in 2005 en in 2008) nog in staat te zijn om een klinische infectie op te wekken. De resultaten van de E. maxima lijnen waren hierbij negatief.

blz. 20


De controles op levensvatbaarheid die in 2009 uitgevoerd werden, waren allen positief. Het is zeer aannemelijk dat dit te maken heeft met de aangepaste procedure voor het ontdooien van de ingevroren suspensies. Controle op levensvatbaarheid in 2010 (28/10/10) toonde aan dat alle op 15/07/2004 ingevroren Eimeria spp. lijnen een positief resultaat te zien gaven. De E. maxima lijn die in 01/03/2006 met een iets veranderde invriesmethodiek (glasparels nr.8) ingevroren is, gaf echter een negatief resultaat. Conclusie: ampullen met sporocysten direct vanuit de stikstof in water van 35-39 ºC ontdooien. De inhoud daarna verdunnen met koude PBS en zo snel mogelijk oraal aan kuikens geven (± 1 ml/dier). In 2010 zijn drie nieuwe Eimeria spp. lijnen (t.w. E. praecox, E. necatrix en E. brunetti) door de industrie aangeleverd, bij GD vermeerdert en in de vloeibare stikstof ingevroren. In 2011 en de daaropvolgende jaren zal een controle op zuiverheid en levensvatbaarheid van deze ingevroren lijnen uitgevoerd worden. Voor een overzicht van behaalde resultaten zie Tabel 1: “Resultaten van controles op levensvatbaarheid van in de vloeibare stikstof ingevroren Eimeria spp. lijnen over een periode van maximaal zes jaar”. Tabel 1: Overzicht van bevindingen bij controles op levensvatbaarheid van in de vloeibare stikstof ingevroren Eimeria spp. lijnen over een periode van maximaal zes jaar

Eimeria

spp.

lijnen

Data

Eerste

ingevroren

controle

Periode

Tweede

na

controle

invriezen 21/01/05 1. HP CO 001-

Periode

Derde

na

controle

invriezen 07/07/05

Periode

Vierde

na

controle

invriezen 21/08/08

Periode

Vijfde

na

controle

invriezen 11/12/09

Periode na invriezen

28/10/10

17/07/04

+

6 mnd

n.g.

12 mnd

+

49 mnd

+

64 mnd

+

75 mnd

17/07/04

-

6 mnd

-

12 mnd

-

49 mnd

+

64 mnd

+

75 mnd

17/07/04

+

6 mnd

+

12 mnd

+

49 mnd

+

64 mnd

+

75 mnd

01 (E. ac Wey) 2. HP CO 00201

(E.

max

Wey) 3. HP CO 00301

(E.

ten

Hough)

27/03/06 4. HP CO 00401

(E.

01/03/06

+

21/08/08 3 wkn

-

11/12/09 29 mnd

+

28/10/10 44 mnd

-

55 mnd

max

Wey)

+ = positief, - = negatief, n.g. = niet gedaan

De nummers 1 t/m 3, respectievelijk E. acervulina, E. maxima en E. tenella zijn op 15/07/04 in de stikstof ingevroren. De eerste controle op levensvatbaarheid heeft plaatsgevonden op 21/01/05, de tweede controle op 07/07/05, de derde op 21/08/08, de vierde op 11/12/2009 en de vijfde controle op 28/10/10. Nummer 4, E. maxima (Weybridge) lijn is op 01/03/06 in de vloeibare stikstof ingevroren. Een eerste controle op levensvatbaarheid heeft plaatsgevonden op 27/03/06, de tweede controle op 21/08/08, de derde op 11/12/2009 en de vierde op 28/10/10.



Onderwerp: Ontwikkeling coccidiose PCR interspecies Projectleiders: Dr. H.M.J.F. v.d. Heijden en ing. R. Dijkman Beoogd resultaat Ten behoeve van onderzoek (bijv. werkzaamheid coccidostatica en alternatieve anti-coccidiosemiddelen, vaccinatie) en gezien de verwachte verandering in regelgeving voor de pluimveehouderij (verbod op coccidostatica als veevoederadditief) en daarmee gepaard gaande verandering in de preventie en bestrijding van coccidiose, is er behoefte aan een moleculair biologische methode waarmee direct in (gepoolde) mestmonsters de verschillende Eimeria-species kunnen worden onderscheiden èn gekwantificeerd.

Samenvatting onderzoek 1.

Validatie en optimalisatie van DNA extractie uit faeces. Hiertoe zullen een 3-tal methoden (Kaliumdichromaat, QiaAmp DNA Stool kit en MagMAX Total Nucleic Acid Isolation kit) met elkaar vergeleken worden.

2.

Validatie en optimalisatie van de PCR zoals die recent beschreven is door Morgan et al. Daarmee zouden de volgende Eimeria species kunnen worden gedifferentieerd (met 4 duplex-PCRs): E. maxima, E. tenella, E. acervulina, E. brunetti, E. mitis, E. necatrix en E. praecox. De condities voor de 4 duplex PCRs worden zo gekozen dat alle reacties tegelijkertijd in één run getest kunnen worden.

3.

Toevoegen van een interne controle moet remming door storende factoren uit de faeces aantonen. De interne controle mag echter zelf niet remmend werken op de PCR.

4.

Test valideren als kwantitatieve test.

Voorlopige resultaten DNA isolatie De QiaAmp DNA stoolkit met glasparel beatstap leverde de beste DNA extracten op en zal gebruikt worden bij verdere experimenten. Gevoeligheid PCR Voor een 3-tal species waarvan een schone oöcysten suspensie beschikbaar is werd de gevoeligheid van de PCR bepaald. Tabel 1: gevoeligheid van de PCR schone oöccystensuspensies

gespikte mest

(oöcysten/ml)

(oöcysten/g mest)

E.acervulina

24

240

E.maxima

78

78

E.tenella

125

125

species

Mengcultures en specificiteit Uit toevoegingexperimenten blijkt dat er mogelijk remming kan optreden wanneer zich in het monster mengsels van verschillende typen Eimeria bevinden (bv. E. maxima en E. acervulina).

blz. 22


Specificiteit van de PCR levert voor een aantal combinaties wat problemen op (E. necatrix met E. maxima en E. brunetti met E. praecox). Aanpassingen in het PCR protocol verminderen deze aspecificiteit, echter dit gaat ten koste van de gevoeligheid van de E. praecox en E. mitis PCR. Toevoegen van een interne controle (IC) Bij eerste experimenten bleek de interne controle remmend te werken op de PCR, vooral bij lage oöcystenconcentraties. Hierdoor zouden vals negatieve resultaten kunnen ontstaan. Door veranderingen in de procedure (verdunningen, enzymmix, oligoconcentraties) is deze remming veroorzaakt door IC toevoeging opgeheven. Kwantificering Door problemen met remming en aspecificiteit is betrouwbare kwantificering voor een aantal Eimeria species op dit moment niet mogelijk.

Voorlopige conclusie en vervolg -

QiaAmp DNA stool kit extractie optimale methode voor verkrijgen van DNA uit faeces.

-

Gevoeligheid PCR voor individuele Eimeria species goed.

-

Interne controle na aanpassingen goed bruikbaar.

-

Specificiteit levert voor een aantal species problemen op. Zeker wanneer verder gekeken gaat worden naar kwantificering. Een veelvoud aan aanpassingen en optimalisatie kon deze kruisreactiviteit helaas niet voorkomen.

-

Zeer recent een publicatie verschenen (Vrba et al. (2010) Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken. Veterinary Parasitology) waarbij voor een aantal ‘probleem’ PCR testen uit het artikel van Morgan et al. een verbeterde test wordt voorgesteld.

Eerste resultaten van een aantal experimenten waarbij gebruik is gemaakt van deze verbeterde testen (Vrba et al.) zijn veelbelovend. Gevoeligheid en specificiteit lijkt goed te zijn.



Onderwerp: Darmgezondheid Projectleider: drs. G.J. Boelm Ontwikkeling van een diagnostisch systeem voor het monitoren van de darmgezondheid Beoogd resultaat Bij alternatief gehuisveste leghennen wordt regelmatig chronische enteritis vastgesteld, waarbij vooral het duodenum ernstig en langdurig is ontstoken. Naast aantasting van dierenwelzijn, veroorzaakt de aandoening economische schade die kan oplopen tot

2,- per aanwezige hen per legronde. De oorzaak van chronische

enteritis bij de leghen is multifactorieel. Dysbacteriose speelt een sleutelrol in de etiologie van dit syndroom. Als dysbacteriose in een vroeg stadium kan worden gediagnosticeerd, dan kunnen specifieke maatregelen worden getroffen, waardoor het ontstaan van chronische enteritis wordt voorkomen. Tijdens een dierstudie wordt de flora in verschillende darmdelen van leghennen gekarakteriseerd door middel van een DNA chip, die door TNO is ontwikkeld. Via 4 modellen wordt dysbacteriose opgewekt. Daarbij wordt gekeken naar verschuiving in de flora van de darm en histologische afwijkingen van de darmwand.

Stand van zaken Er is een studie met 5 groepen commercieel verkrijgbare leghennen afgerond waarin onderzocht is hoe de samenstelling van de darmflora verschuift als deze hennen 1) worden gevoerd met voer dat dysbacteriose veroorzaakt; 2) ampicilline krijgen toegediend via het drinkwater gedurende 5 achtereenvolgende dagen; 3) Clostridium perfringens oraal krijgen toegediend na een periode van voeronthouding of 4) Brachyspira intermedia oraal krijgen toegediend gedurende 5 achtereenvolgende dagen. Bij klinisch en macroscopisch pathologisch onderzoek zijn er geen afwijkingen geconstateerd bij de hennen. De resultaten van verschuiving van de darmflora en de histologie van de darmwand worden in de eerste helft van 2011 bekend.

blz. 24


Onderwerp: Vaccinaties Projectleider: Dr. J.J. de Wit Inleiding Ondanks de vele vaccinaties tegen IBV en de hiermee gepaard gaande kosten, zijn er toch veel doorbraken van de ziekte. Er is weinig bekend over de stabiliteit van IBV vaccins in drinkwater. Drinkwater is veelal afkomstig uit eigen bronnen, maar ook leidingwater maakt een route door naar het uiteindelijke drinkpunt van de dieren. Afhankelijk van het gebied en de grondsoort varieert de watersamenstelling sterk. Indien meer bekend zou zijn over geschiktheid of juist ongeschiktheid van bepaalde ‘soorten’ water zou deze informatie gebruikt kunnen worden de effectiviteit van de IBV vaccinaties via drinkwaterenting te verbeteren bij vlees- en legdieren (dan wel om te kiezen voor een alternatieve goede spray of atomist-enting.

Beoogd resultaat Onderzoeken of de aanwezigheid van allerlei (natuurlijke) mineralen/zouten in het drinkwater afkomstig van eigen bron) dat gebruikt wordt voor de IBV vaccinaties bij kippen invloed heeft op de effectiviteit (gemeten via de immuunrespons, IgM) van de vaccins.

Stand van zaken De studie is op dit moment nog gaande waarbij in totaal 360 SPF vleeskuikens verdeeld over 12 isolatoren op diverse manieren en werkwijzen worden gevaccineerd. Resultaten en conclusies zullen in het voorjaar van 2011 bekend worden.



Onderwerp: Coryza Projectleider: Drs. T.H.F. Fabri Inleiding en achtergrond Infectieuze Coryza wordt veroorzaakt door een bacterie Avibacterium paragallinarum, vroeger ook Haemophilus paragallinarum genoemd. Van de bacterie zijn 3 serogroepen bekend: A, B en C. Binnen de groepen bestaan er verschillende serovarianten. De aandoening kan zich snel door het koppel verspreiden en de uitval kan oplopen tot meer dan 20%. De eiproductie kan binnen enkele dagen spectaculair dalen. Over het algemeen duren de ziekteverschijnselen 2 tot 3 weken. De ziekte kan echter terugkomen wanneer het koppel door een andere oorzaak verzwakt wordt. Tegen de Coryza bacterie zijn in Nederland 2 vaccins beschikbaar (Intervet Nobilis Coryza (saponine) en Merial Haemovax. Daarnaast bestaat er de theoretische mogelijkheid om met stalvaccins te werken. GD zou op basis van een op het bedrijf geïsoleerde bacterie een formolvaccin kunnen maken. De literatuur geeft aan dat een serotype in het vaccin en een vergelijkbaar serotype dat in de praktijk de problemen veroorzaakt nog geen garantie is voor een optimale bescherming. In de uitgebreide rapportage worden de resultaten beschreven van een vergelijkingsonderzoek tussen de beschikbare vaccins en een challenge met de in Nederland aanwezige Avibacterium paragallinarum stam. Hieronder volgt hiervan een korte samenvatting.

Samenvatting en conclusie In dit project is aan de hand van een dierexperimenteel onderzoek getracht een antwoord te geven of de commerciële vaccins (Nobilis Coryza (saponine) en HAEMOVAX) en een autovaccin op formaline basis bescherming bieden tegen de Avibacterium paragallinarum stam(men) die in 2009-2010 op de Veluwe problemen veroorzaakten. Hiervoor zijn groepen leghennen op 8 en 11 weken gevaccineerd en 3 weken na, zowel de eerste als de tweede vaccinatie, met Avibacterium paragallinarum gechallenged. Tevens werd vastgesteld of onder optimaal management de verschillende vaccinaties (Salmonella, Vlekziekte, Coryza en geïnactiveerd IB+NCD) invloed hadden op de gewichtsontwikkeling van de hennen. De preventieve vaccinatie tegen de Avibacterium paragallinarum stam(men) die in 2009-2010 op de Veluwe problemen veroorzaakten, met de commerciële vaccins is na een tweemalige vaccinatie voldoende beschermend om klinische problemen te voorkomen. De bescherming die opgewekt werd door het autovaccin bleek onvoldoende. De vaccinaties met de commerciële vaccins zijn op 8 weken leeftijd uit voeren in combinatie met de bacteriële vaccins tegen Salmonella en vlekziekte, en op 12 weken in combinatie met de bacteriële vaccins tegen Salmonella en vlekziekte en het geïnactiveerde IB +NCD vaccin. Deze combinaties hebben geen effect op de gewichtsontwikkeling van de dieren. De uitgebreide rapportage is in augustus van dit jaar aan de pluimveehouderij gepresenteerd.

blz. 26


Onderwerp: Locomotie: Schouderafwijkingen bij vermeerderingsdieren Projectleiders: Drs. T.H.F. Fabri en drs. N. de Bruijn

Inleiding De gewrichten zijn het verbindingspunt op de plaats waar twee afzonderlijke beenderen elkaar ontmoeten en maken het skelet bewegelijk. De uiteinden van de beenderen zijn voorzien van gewrichtskraakbeen. Een zacht maar zeer sterk weefsel bestaande uit kraakbeencellen, collageenvezels en een soort gel. Het bevindt zich aan de uiteinden van twee beenderen om het contact te verzachten en heeft de functie van een stevig elastisch kussen. Gewrichtskraakbeen heeft geen zenuwen en bloedvaten. Het kan dus niet via de bloedbaan van voedingsstoffen worden voorzien. Het onderliggende bot is echter wel voorzien van bloedvaten. Hiervandaan sijpelen voedingsstoffen uit naar het kraakbeen. De hoofdgewrichten van het lichaam bevinden zich aan de heup, schouders, ellebogen, knieën, polsen en enkels.

Gewrichtafwijkingen De belangrijkste afwijkingen in gewrichten zijn gewrichtsontstekingen veroorzaakt door de aanwezigheid van een ziektekiem in het gewricht, bijvoorbeeld door bacteriële infecties van E. coli, Staphylococcen en Enterococcen, maar ook door mycoplasma infecties en waarschijnlijk ook door virussen zoals Reo virussen. Daarnaast kunnen gewrichtsafwijkingen ontstaan door arthrose. Een aandoening waarbij de kwaliteit van het kraakbeen afneemt en de kraakbeen laag dunner wordt en tenslotte geheel kan verdwijnen. Hierdoor komen de tegenoverliggende botdelen tegen elkaar en ontstaat door de aanwezigheid van zenuwbanen in het bot een pijnreactie. GD bevindingen 2009 In 2009 is GD geconfronteerd met een aantal sectie inzendingen van vermeerderingsdieren, voornamelijk hanen, waarbij afwijkingen in het schoudergewricht werden waargenomen. Over het algemeen werd een verdikking van het gewrichtkapsel waargenomen en een oververvulling van het gewricht. Op de kop van het opperarmbeen werden afwijkingen waargenomen die varieerden van verdunning van het krakbeen, scheuren in het gewrichtskraakbeen tot het loslaten van delen van het gewrichtskraakbeen. In ernstige gevallen is zowel het kraakbeen van de kop van het opperarmbeen als de kom van het schouderblad losgelaten. Bij de geconstateerde schouderafwijkingen is bij de inzending geen melding gemaakt van locomotieproblemen en zijn de afwijkingen bij toeval geconstateerd. Echter gezien de ernst van de afwijkingen is het duidelijk dat de dieren de afwijkingen als pijnlijk moeten ervaren. Op basis van de huidige kennis kan gesteld worden dat het een progressief proces is dat start na de 20

e

levensweek. Met betrekking tot de oorzaak kan gesteld worden dat het geen infectieuze aandoening betreft . Bij een speculatie over een oorzaak komt een verminderde aanvoer van voedingstoffen door afwijkingen in de bloedaanvoer of een overmatige belasting in aanmerking. Gezien het feit dat de afwijkingen veel in hanen worden gevonden kunnen de schouderafwijkingen theoretisch voor een deel verantwoordelijk zijn voor de daling van het bevruchtingspercentage tijdens de productie periode van de vermeerderingsdieren.



afb.1 Losse kraakbeen fragment

afb. 3 Aangetast schoudergewricht waarbij een kraak-

afb. 2 Overvulling van het gesloten gewricht

afb. 4 Het kale bot is zichtbaar.

beenfragment los op de kop van het opperarmbeen ligt en vrij in de gewrichtholte komt.

Vraagstelling De huidige vraagstelling is of deze afwijkingen, die nu meerdere keren geconstateerd zijn, zo vaak voor komt binnen de vleesvermeerderingspopulatie, dat er sprake is van een sectoraal probleem. Tevens is de vraag gesteld of deze schouderafwijkingen een belangrijke oorzaak zou kunnen zijn van de verminderde bevruchtingspercentages in de vleeskuikensector. Gezien de kosten en de problemen die voortkomen uit het vervangen van de hanen een belangrijke vraagstelling.

Onderzoeksvoorstel Op verzoek van het PPE is een inventariserend onderzoek gestart naar de incidentie van deze schouderafwijkingen bij vleesvermeerderingshanen. De opzet was dat er van 40 bedrijven (20 Ross en 20 Cobb) 20 hanen onderzocht zouden worden. Alle Nederlandse vleeskuikenbroederijen hebben een brief ontvangen met het verzoek met hun vermeerderaars te overleggen of deze interesse hadden aan de vergelijking deel te nemen. Helaas zijn maar van 12 bedrijven hanen ontvangen, waardoor, een juiste inschatting van het probleem en een onderverdeling tussen de beide rassen niet mogelijk is. Toch hebben we gemeend een tussenrapportage te maken om de sector van het probleem op de hoogte te stellen. In deze rapportage worden alleen de

blz. 28


macroscopische bevindingen gerapporteerd. Aangezien nog niet alle gewenste koppels zijn beoordeeld is nog geen statistische analyse uitgevoerd en nog geen koppeling met de bevruchtigsdata van de koppels gemaakt. Ook zijn nog geen nadere laboratorium analyses uitgevoerd om aanwezigheid van bacteriën mbv 16S PCR en histologie aan te tonen.

Onderzoeksresultaten Tot eind 2010 zijn van 12 bedrijven 246 hanen ontvangen. Het gemiddelde gewicht van de selectie hanen was 4.357 kg. Waarbij tussen de bedrijven een maximaal verschil tussen de gemiddelde gewichten zat van meer dan 1.5kg. Het aantal hanen per inzending dat nog levende spermacellen produceerde varieerde tussen de 25 en 100%. Van alle aangeleverde hanen produceerde 75% nog levend sperma. Van de hanen die geen sperma meer produceerde was het gemiddelde lichaamsgewicht 4208 gram en het gemiddelde testikel gewicht 18.2 gram. De nog productieve hanen hadden een gemiddeld lichaamsgewicht van 4407 gram en een testikelgewicht van 36.4 gram. De relatie tussen de spermaproductie en het testikelgewicht is niet onlogisch: een productieve testikel is groter dan een testikel in rust.

hanen met actieve testikels 100,00% Percentage

80,00% 60,00% actieve testikels 40,00% 20,00% 0,00% 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

bedrijf

Het gemiddelde testikel gewicht was 31.76 gram. Er blijkt een duidelijke relatie te zitten tussen de het lichaamsgewicht en het testikel gewicht. Bij het toenemen van het lichaamsgewicht blijft het testikelgewicht gemiddeld genomen gelijk. Er zit echter wel een grote variatie tussen de testikelgewichten binnen de groepen en tussen de groepen.

gewicht (gr)

lichaamsgewicht en testikelgewicht 6000

50

5000

40

4000

30

3000

testikel-gewicht 20

2000

10

1000 0

0 5

7

4

10

2

12

6

bedrijf


lichaamsgewicht

8

3

11

9

Lineair (testikel-gewicht)


Overvulling schoudergewricht Bij 140 dieren (57%) is het gewricht gevuld met teveel veel gewrichtsvocht. In 35% was dit beiderzijds. Dit lijkt echter nog geen invloed te hebben op de sperma productie. Van de dieren met de overvulling produceerde 74% nog levend sperma terwijl dit bij de hanen zonder een overvuld schoudergewricht 76% was. Verdikking van het schoudergewrichtkapsel Bij 41% van de hanen was het gewrichtskapsel van de schouder verdikt. Dit geeft aan dat er reeds een actief proces aanwezig is. In 19% van de aangevoerde hanen was deze afwijking beiderzijds aanwezig. De aanwezigheid van een verdikt schouderkapsel heeft geen invloed op de spermaproductie. Verdunning van het schoudergewrichtkraakbeen Bij 113 hanen (46%) is een verdunning van het kraakbeen van het opperarmbeen waargenomen; hierbij is het kraakbeen nog wel intact maar zichtbaar te dun. In 63 gevallen (26%) was dit beiderzijds. Ook deze afwijking heeft geen invloed op de aanwezigheid van levend sperma in de testikels. Dieren met de verdunning bezitten nog in 74% van de gevallen actief sperma; de hanen zonder deze afwijking in 75% van de gevallen nog levende sperma cellen hebben. Arthrose in het schoudergewricht Daarnaast is 63 (26%) keer ernstige aantasting van het gewrichtskraakbeen van het opperarmbeen aangetroffen waarbij delen van het kraakbeen volledige verdwenen waren of waarbij scheuren in het kraakbeen zichtbaar waren, in 15 gevallen (6% van alle hanen) was dit beiderzijds. De verdeling van de afwijkingen bij linker en rechter schouder was gelijk; beide kwam in 10% van de ingestuurde hanen voor. Deze afwijking lijkt wel invloed te hebben op de aanwezigheid van levend spermacellen in de testikels. Van de dieren met ernstige schoudergewrichtafwijkingen had 35% testikels die geen sperma meer produceerde, terwijl de dieren zonder deze arthrose slechts bij 22% geen levens sperma in de testikels werd aangetroffen.

arthrose levend sperma

geen arthrose geen levend sperma

levend sperma

geen levend sperma

41/63

22/63

40/182

142/182

65%

35%

78%

22%

blz. 30


Aantal hanen

% verdunning kraakbeen

% oplossen kraakbeen (arthrose)

22

36

23

21

86

76

21

43

14

21

14

19

21

14

9

20

85

15

20

60

10

20

40

30

20

35

35

20

55

20

20

35

20

20

50

35

De onderlinge verschillen in de kraakbeenaantasting binnen de koppels was groot. In het ergste geval werd bij 85% van de dieren van de inzending verdunning van het kraakbeen waargenomen en het ergste geval van arthrose betrof 76%. De verdunning en de arthrose waren in veel gevallen gecombineerd aanwezig: 21% van de hanen hadden beide afwijkingen. Slechts een enkele keer werd geen verdunning vastgesteld maar wel een ernstige arthrose, in deze gevallen was de afwijking eenzijdig aanwezig waarbij door de ernst van de arthrose de verdunning niet meer zichtbaar was. Lichaamsgewicht Opvallend is dat de dieren die de arthrose bezitten gemiddeld zwaarder zijn dan de hanen die deze ernstige afwijking niet beztitten. Dieren zonder arthrose hebben een gemiddeld lichaamsgewicht respectievelijk filetgewicht van 4242 en 722 gram. Bij de dieren die de afwijking eenzijdig hebben zijn deze gewichten resp. 4650 en 763 gram. De hanen waar bij beide schoudergewrichten ernstig zijn aangetast hebben een gemiddeld lichaamsgewicht van 4803 gram en een borstspier gewicht van 797 gram. Voedingskanalen Gekeken is of er een relatie zit tussen een mogelijke afknelling van het bloedvat dat door de botschacht loopt door de daar aanwezige spieren. De opening van de ruimte waar het bloed doorloopt is met het blote oog beoordeeld. Bij 19% van de opperarmbenen leek een beperktere opening zichtbaar. Maar bij deze poten kwamen de gewrichtafwijkingen niet meer voor dan bij de groep waarbij de opening als normaal werd beoordeeld.

Voorlopige conclusie Op basis van de 12 onderzochte koppels lijkt het schouderprobleem aanwezig te zijn binnen een groot deel van de vleesvermeerderingssector, zowel bij de Ross hanen als bij de Cobb hanen. De lichte vorm van de aandoening, waarbij minder kraakbeen op de kop van het opperarmbeen aanwezig is, is gemiddeld bij 46% van januari 2011 blz. 31


de hanen aanwezig. De ernstige vorm, waarbij delen van het kraakbeen losgelaten komt bij een kwart van de hanen voor. De incidentie tussen de koppels kan sterk variëren; van 9 tot 76%. De relatie tussen de mogelijkheid om te bevruchten is direct gekoppeld aan de mogelijkheid om sperma te produceren. Bij de dieren met ernstige schoudergewrichtafwijkingen worden13% meer testikels aangetroffen die geen levende spermacellen meer produceren. De geringere afwijkingen lijken geen invloed te hebben op de spermaproductie. Hoewel geen afwijkingen in de opening van het voedingskanaal is aangetroffen zou een mogelijke oorzaak van de gewrichtafwijkingen toch een verminderde aanvoer van voedingstoffen kunnen zijn door een afklemming van de voedende bloedvaten in de borstspier. De zwaardere borstspieren van de dieren die deze aandoening hebben zou hier mogelijk op kunnen wijzen.

blz. 32

SECTOR PLUIMVEE. Samenvatting Praktijkonderzoek 2010 i.o.v. PPE

Recommend Documents