SBORNÍK PŘEDNÁŠEK Květen 2014

SBORNÍK PŘEDNÁŠEK

Květen 2014

1

2

Best servis Ústí nad Labem Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno UNESCO laboratoř elektrochemie životního prostředí, Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze

Sborník přednášek mezinárodní odborné konference

XXXIV. Moderní Elektrochemické Metody Jetřichovice 19. – 23. května 2014

Uspořádali: Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav a Karolina Pecková

ISBN 978-80-905221-2-1 1

Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací.

Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je možný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní potřebu).

Název: Vydal: Autor: Počet stran: Náklad: Vydání Formát: ISBN:

XXXIV. Moderní Elektrochemické Metody Srsenová Lenka - Best servis Ústí nad Labem kolektiv autorů 254 85 1. A5 978-80-905221-2-1

2

Best servis Ústí nad Labem J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Prague Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Brno UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, Prague

Collection of Conference Proceedings International Conference

Modern Electrochemical Methods

XXXIV

Jetřichovice, Czech Republic May 19th - May 23rd, 2014

Editors: Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav, and Karolina Pecková

ISBN 978-80-905221-2-1

3

4

Obsah

Str.

Lenka Bandžuchová, Renáta Šelešovská, Ľubomír Švorc, and Jaromíra Chýlková Voltammetric Analysis of Herbicide Picloram on Solid Electrodes

9

Dmytro Bavol, Jiri Zima, Jiri Barek, and Hana Dejmkova Voltammetric Determination of Cymoxanil on Carbon-based Electrodes

14

Lenka Benešová, Petr Hammer, Jana Vosáhlová, Jaroslava Zavázalová, and Karolina Pecková Electrochemical Behavior of Oxygen-Terminated Boron-Doped Diamond Electrodes in Different Electrolyte Media

19

Renáta Šelešovská and Lenka Bandžuchová Voltammetric Behavior of Herbicide Metamitron using Silver Solid Amalgam Electrode

23

Wolfgang Burgstaller, Gabriela Schimo, Sarah Walkner, and Achim Walter Hassel Scanning Kelvin Probe – System and Applications

28

Ales Danhel, Zuzana Trosanova, Jana Balintova, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Searching for Electrochemical Reduction Mechanism of Azidophenyl DNA Labels

31

Zuzana Ferenčíková, Aleš Daňhel, Jan Reidl, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Voltammetric Behavior of 4-Aminophthalimide Label using Hanging Mercury Drop Electrode

36

Miroslav Gál, Ján Krahulec, Kristína Jiríčková, Romana Sokolová, and Ján Híveš Electrochemistry as a Tool for an Enzyme Characterization

40

Mihaela Georgieva, Maria Petrova, Ekaterina Dobreva, Dimitar Stoychev, and Veselina Chakarova Electroless Formation of Cu/D and Cu/cBN Composite Materials for Fabrication of Abrasive Tools

44

Libor Gurecký and Libuše Trnková Electrochemical and Spectral Analysis of Cytosine and Guanine Homooligodeoxynucleotides

49

Martina Hafner, Jan Phillip Kollender, and Achim Walter Hassel Multichannel Scanning Droplet Cell Microscopy for Surface Patterning with Subsequent Corrosion Studies and Downstream Analytics

53

Luděk Havran, Jana Balintová, Pavlína Vidláková, Hana Macíčková-Cahová, Hana Pivoňková, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Redox DNA Labeling – from Simple DNA Detection by Osmium Tetroxide Complexes Modification to Ratiometric Sequence Analysis

57

Eva Horáková, Jiří Barek, and Vlastimil Vyskočil Determination of Methylviolet 2B Using Polarographic and Voltammetric Methods at Mercury Electrodes

60

Romana Jarošová, Jiří Zima, Jiří Barek, and Hana Dejmková Chronopotentiometric Determination of Organic Pollutants Using Reticulated Vitreous Carbon Electrode

65

5

Bohdan Josypčuk, Jiří Barek, and Oksana Josypčuk Electrochemical Biosensors Based on Enzymatic Reactor with Amalgam Powder

70

Mahmoud Khodari, Ali Abdel-Fatah, Ekram Rabie, and Nada Nabil Electroanalytical Determination of Dihydroxybenzene Isomers Using Glassy Carbon Electrode

75

Jan Krejčí, Iva Ventrubová, and Lucie Brožová Efficiency Wall-Jet Cell FC2

80

Alan Liška and Jiří Ludvík Electrochemical Reduction of 1,3-Alt-tetranitrothiacalix[4]arenes

85

Jan Mika, Jiří Barek, Jiří Zima, and Hana Dejmková Utilization of High Conversion Degree Detector with Renewable Working Material for the HPLC Determination of Sulfamethizole

90

Tomáš Mikysek, František Josefík, and Jiří Ludvík Electrochemical Study of Triazaborine Chromophores

95

Rudolf Navratil, Dominika Motlova, Frantisek Jelen, and Libuse Trnkova Use of Monovalent Copper for Sensitive Detection of Methyl Derivatives of Xanthine

99

Tomáš Navrátil, Sergey Zakharov, Daniela Pelclová, and Karolina Mrazová 104 Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012 – Almost Two Years Later Kateřina Nováková, Tomáš Navrátil, Vojtěch Hrdlička, Vlastimil Vyskočil, Jiří Barek, and Jaromíra Chýlková Use of the Silver Solid Amalgam Electrode for Determination of 5-Nitroindazole

109

Kateřina Nováková, Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, Jan Langmaier, Michael Heyrovsky, Brigita Zámečníková, and Hana Vodičková Isolation and Characterization of Protoplasts and their Utilization for Model Membrane Preparation

114

Ladislav Novotný, Renáta Petráňková, and Abraham Kabutey The Influence of Dissolved Air on Potentiometry Using Silver/Silver Ions or Colloids Interfaces

118

Václav Pavlíček, Petr Tůma, and Eva Samcová New Electrophoretic Approach to the Rapid Determination of Creatinine and Uric acid 121 in Human Urine Using a Coupled Capillary Hana Pivoňková, Vlastimil Tichý, Petr Orság, Peter Šebest, and Miroslav Fojta Electrochemical Detection of p53 Protein Interactions with Plasmid DNAs Modified with Cisplatin Using Immunoprecipitation at Magnetic Microbeads

126

Medard Plucnara, Eçe Ecsin, Arzum Erdem, and Miroslav Fojta Detection of Single Nucleotide Polymorphisms Using Selective Incorporation of Biotin 131 in DNA Strand and Subsequent Enzymatic Detection at Pencil Electrode Lenka Portychová and Aleš Horna Usage of Electrochemistry Coupled to LC and MS for the Prediction of Metabolism, Toxicity and Stability of Substances

6

135

Lenka Portychová, Zora Nývltová, Alice Brabcová Vránková, Michal Bartoš, Michaela Pilařová, Ivan Vermousek, Miroslav Antal, and Aleš Horna 139 Plasma Free Metanephrines as Diagnostic Markers of Pheochromocytoma Vít Prchal, Anita Ottenschlägerová, Vlastimil Vyskočil, and Jiří Barek Voltammetric Determination of Genotoxic Pollutant 5-Nitroindazole Using a Bismuth Bulk Electrode

143

Michaela Pyszkova, Martina Zatloukalova, David Biedermann, Vladimir Kren, Jitka Ulrichova, Sarka Ramesova, Romana Sokolova, and Jan Vacek Electrochemistry of Flavonolignans and their Interactions with DNA and Proteins

148

Kamila Rosecká, Tomáš Mikysek, and Ivan Švancara Electrochemical Determination of Myristicin Using a Carbon Paste Electrode

153

Barry R. Silver, Karel Holub, and Vladimír Mareček The Detection of Electroosmotic Flow and its Estimation in a Simple, Polarized Microcapillary System

157

Romana Sokolova, Jana Kocabova, Jan Fiedler, Jan Vacek, Petr Marhol, Eva Vavříková, and Vladimir Kren Electrochemistry of Flavonolignans in Acetonitrile and Dimethylsulfoxide

161

Hanna Sopha and Ivan Švancara Application of the Ex-Situ Prepared Bismuth-Film Electrode for the Determination of Trinitrotoluene

166

Matěj Stočes and Ivan Švancara Insight into the Determination of Ascorbic Acid at Polyaniline Modified Carbon Paste Electrode

171

Milan Sýs, Radovan Metelka, Michael Skoupý, Milan Vlček, and Karel Vytřas Determination of Total Phenolic Content in Selected Wines Using Amperometric Tyrosinase Biosensor Based on Carbon Nanotubes

176

Katarzyna Szuszkiewicz, Radovan Metelka, Martin Bartoš, and Pavel Klein Effect of Working Electrodes Design on Current Response in Continuous Monitoring of Presence of Redox Species

181

Renáta Šelešovská, Lenka Bandžuchová, Michaela Kadubcová, and Michaela Štěpánková Voltammetric Behavior of Insecticides Pymetrozine and Imidacloprid using Silver Solid Amalgam Electrode

185

Ivana Šestáková, Kateřina Nováková, Bohdan Josypčuk, and Tomáš Navrátil Transport of Phytochelatin PC2 across Model Phospholipid Membrane

190

Jan Špaček, Martin Ženka, Lucia Haroníková, Luděk Havran, and Miroslav Fojta Enzymatic Incorporation of Biotin into DNA for DNA Hybridization Analysis and for Sensitive Detection of PCR-Amplified DNA

193

Ľubomír Švorc and Kurt Kalcher Simultaneous Determination of Purine DNA Bases Using a Novel Electrochemical Approach

197

7

Chiara Tiribilli, Stefania Giannarelli, Romana Sokolová, and Michal Valášek Oxidation Mechanisms of Diflunisal on Glassy Carbon Electrode

202

Markéta Tomášková and Jaromíra Chýlková Simultaneous Determination of TBHQ and BHT in Petroleum Products using Linear Scan Voltammetry with a Gold Disc Electrode

207

Petr Tůma, Jana Fauknerová Matějčková, Vlastimil Jurka, and Eva Samcová Rapid and Sensitive Determination of Metformin in Human Urine and Serum by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection

212

Jan Vacek, Jan Hrbac, Pavel Matejka, and Jan Storch Application of Cyclopentenediones for Preparation of Permselective Layers

216

Jan Vacek, Jiří Vrba, Martin Kubala, and Martina Zatloukalová Ionic Liquids and Protein Electroanalysis

221

Pavlína Vidláková, Jana Balintová, Luděk Havran, Michal Hocek and Miroslav Fojta Voltammetric Analysis of Anthraquinone-labeled Nucleotide Triphosphates and Oligonucleotides at Gold Electrodes

225

Lada Vítová, Luděk Havran, Miroslav Fojta, Ondrej Šedo, Zbyněk Zdráhal, and Radim Vespalec A Preliminary Study of Modification of 7-Deazaadenine with a Complex of Osmium Tetroxide with 2,2’-Bipyridine

228

Blanka Vochyánová, František Opekar, and Petr Tůma Simultaneous Determination of Caffeine and Taurine in Energy Drinks by Micellar Electrokinetic Chromatography in Short Separation Capillary

232

Martina Zatloukalova, Martin Modriansky, and Jan Vacek Electroanalysis of Uncoupling Protein UcP1

237

Jaroslava Zavázalová, Kateřina Procházková, Michaela Nezbedová, and Karolina Pecková Voltammetric Determination of Benzophenone-3 at Boron-Doped Diamond Electrode

242

Magda Zlámalová, Pavel Janda, and Karel Nesměrák Electropolymerization of Methylene Blue on Highly Oriented Pyrolytic Graphite and Characterization of Deposited Film

246

8

Voltammetric Analysis of Herbicide Picloram on Solid Electrodes (Voltametrická analýza herbicidu picloramu s využitím pevných elektrod) Lenka Bandžuchová a, Renáta Šelešovská a, Ľubomír Švorc b, and Jaromíra Chýlková a University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 537, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Slovak University of Technology in Bratislava, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic, E-mail: [email protected] a

Abstract Voltammetric behaviour of pyridine herbicide picloram (PCR) was investigated using two types of relatively new and perspective electrode materials: silver solid amalgam and borondoped diamond. Various methods like cyclic voltammetry, linear sweep voltammetry and differential pulse voltammetry were examined. It was found, that PCR provided only one signal measurable on both tested working electrodes in an acidic medium. Its electrochemical reduction could be recorded on mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode and different oxidation signal was measured on bare boron-doped diamond film electrode. Parameters of differential pulse voltammetry were optimized and the low limits of detection (LD(m-AgSAE) = 3.5×10-8 mol L-1 and LD(BDDFE) = 7.0×10-8 mol L-1) were reached. Key words: Herbicide, Picloram, Silver solid amalgam electrode, Boron-doped diamond electrode, Voltammetry. Introduction Picloram (PCR, Fig. 1) is the most persistent member of pyridine herbicide family, which acts as an auxin mimic substance. Its application leads to uncontrolled and disorganized growth in the susceptible plants 1. Its half-life in soils varies from one month to three years 1. This compound is very good water soluble and thus mobile in soils, which could lead to contamination of the natural and ground waters 1-7. The Maximum Contaminant Limit (MCL) of PCR for natural and tap waters, respectively, is defined by EPA (The US Environmental Protection Agency) as 0.5 mg L-1 (2 µmol L-1). Therefore, the sensitive and rapid determination of PCR is still highly current. Various analytical methods like chromatography e.g. 8-10, spectrophotometry 11, fluorescence 12or immunoassay 13 in various modifications have been already utilized as effective tools for determination of this herbicide. Electrochemical methods represent suitable alternative to the above mentioned techniques, owing to relatively low costs of instrumentation, possibility of miniaturization and fast and sensitive performance of analysis. Particularly, voltammetric methods in combination with mercury electrodes have been applied for analysis of PCR. Dropping mercury electrode (DME) was applied in combination with pulse polarography for voltammetric determination of PCR 14,15. Static mercury drop electrode (SMDE) and square wave voltammetry (SWV) was utilized as an effective tool for electroanalytical analysis of this herbicide as well 16 and sequential injection SWV with hanging mercury drop electrode (HMDE) as a sensor was also applied as a tool for determination of PCR 17. PCR provided one 14 or two reduction signals 1517 on the mercury electrodes in an acidic medium, any oxidation peak was not observed 14-17. The first reduction peak at about -0.9 V (vs. Ag/AgCl) 16 was found as a suitable analytical signal and it was achieved low limits of detection (LD) varied from 44 nmol L-1 ref. 16 to 149 nmol L-1 ref. 17. Electrochemical reduction of PCR and clopyralid on a mercury pool electrode was investigated by Mellado et al. 18 and the same authors also dealt with adsorption-desorption processes on mercury 19 and carbon electrodes 20.

9

Fig.1 The chemical structure of PCR. This paper deals with application of solid working electrodes, which could replace mercury electrodes, in voltammetric analysis of PCR. Two types of relatively new electrode materials were investigated. Silver solid amalgam was used in the form of mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) 21,22 and boron-doped diamond was applied as an unmodified boron-doped diamond film electrode (BDDFE) 23,24. Both working electrodes have been already utilized as sensitive voltammetric sensors for analysis of pesticides, e.g. mAgSAE was used for analysis of herbicides triasulfuron 25, 2-methyl-4,6-dinitrophenol 26 orpendimethalin27and BDDFE was applied for voltammetric analysis of herbicide atrazine 28, carbamate pesticides 29 or insecticide carbaryl30. The voltammetric behaviour of PCR was investigated on m-AgSAE and BDDFE in the present paper. It was found, that PCR provided one reduction (cathodic) signal on m-AgSAE, which corresponds to voltammetric signals measured on mercury electrodes and it was described in the literature 14-17. On the other hand, one oxidation (anodic) signal measured at very positive potential was recorded using BDDFE. Both registered signals were found to be suitable for analytical purposes. Parameters of differential pulse voltammetry (DPV) were optimized and this voltammetric technique in combination with m-AgSAE and BDDFE, respectively, as a working electrode was used for analysis of model solutions and spiked samples of waters and urine, respectively. Experimental All chemicals used for preparation of supporting electrolytes, standard solutions and other solutions were of p.a. purity. All solutions were prepared in distilled water. The particular amount of the PCR powder (Sigma Aldrich) was dissolved in the 50% acetonitrile (Lach-ner, Czech Republic) and the stock solution was stored in the glass flask in a refrigerator. Working solutions of PCR were prepared daily by dilution of the stock solution. Various supporting electrolytes such as nitric acid, hydrochloric acid and sulfuric acid were purchased from Lachema Brno, Czech Republic. The Britton-Robinson buffers (BR) were prepared by mixing of the alkaline component consisting of 0.2 mol L-1 NaOH (Lachema, Brno, Czech Republic) with the acidic component which consisted of H3PO4, H3BO3 and CH3COOH (all p.a., Lachema, Brno, Czech Republic) of the same concentration (0.04 mol L-1).The solution of 2 mol L-1 KCl, which was used for an activation process of m-AgSAE, was prepared by dissolution of the appropriate amount of KCl (Lachema, Brno, Czech Republic). The tap water was sampled from the water supply in Pardubice, Czech Republic (m-AgSAE) and in Bratislava, Slovak republic (BDDFE), respectively. The samples of natural waters were obtained from the river Elbe in Pardubice, Czech Republic (m-AgSAE, BDDFE), from the river Danube in Bratislava, Slovak Republic (BDDFE), from the dam Oplatil in Pardubice region, Czech Republic (m-AgSAE) and from the nameless brook, which is closed to the agricultural area in Kameničany, Slovak Republic (BDDFE). The human urine sample was obtained from non-smoker female volunteer of the age of 28 (BDDFE). All samples were analyzed directly, without any further pretreatment, only after simple dilution.

10

All voltammetric measurements with m-AgSAE as a working electrode were carried out with the computer controlled Eco-Tribo Polarograph PC-ETP (Eco Trend Plus, Prague, Czech Republic) which was equipped by software POLAR.PRO (version 5.1) for Windows XP. Measurements with BDDFE were performed with AUTOLAB PGSTAT 302N (Metrohm Autolab B.V., The Netherlands) potentiostat/galvanostat controlled by software NOVA version 1.7. All measurements were provided in a 3-electrodes set up, where m-AgSAE (Eco Trend Plus, Prague, Czech Republic) or BDDFE (Windsor Scientific Ltd., United Kingdom) served as the working electrode, silver/silver chloride/ KCl (Ag/AgCl/KCl) as the reference and platinum wire as the auxiliary electrode (both Monokrystaly, Turnov, Czech Republic). Current densities were calculated as a current response divided by an area of the working surface due to the different working areas of the used working electrodes (0.36 mm2 (mAgSAE) and 7.07 mm2 (BDDFE), respectively). In case of monitoring of the electrochemical reduction of PCR on m-AgSAE, the air oxygen was removed by bubbling with nitrogen (purity class 4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for 5 minutes before every analysis. CV (cyclic voltammetry) was used for investigation of dependence between voltammetric response of PCR and pH of supporting electrolyte. LSV (linear sweep voltammetry) was utilized for studying the effect of a scan rate on the voltammetric response of PCR. DPV was used for the rest of analysis. All the measurements were carried out at laboratory temperature. The limit of detection (LD) was calculated as a three times the standard deviation for the blank solution and divided by the slope of the calibration curve. The parameters of calibration curves (e.g., slope, intercept) were calculated using software Excel 2010 (Microsoft, USA) and OriginPro 7.5 (OriginLab Corporation, USA). Results and discussion Firstly, the effect of various supporting electrolytes on the voltammetric response of PCR on both used working electrodes was investigated. It was found, that PCR provided only one well-developed reduction (cathodic) signal about potential -0.8 V in an acidic media on mAgSAE. The peak decreased with increasing pH value and the highest current response was recorded in 0.1 mol L-1 sulphuric acid, which was used for all further measurements. On the other hand, only one anodic signal, which corresponded to electrochemical oxidation of PCR, was recorded on BDDFE at very positive potential (Ep = +1.5 V). This response could be measured only in a strongly acidic medium and with increasing pH significantly decreased. Thus, 1 mol L-1 sulphuric acid was chosen as a supporting electrolyte for all next analysis on BDDFE. The effect of scan rate was also investigated and it was found that signals recorded on both working electrodes linearly increased with the square root of the scan rate and the diffusion-controlled process could be supposed from these dependences. DPV was found to be suitable for monitoring of electrochemical reduction (m-AgSAE) and oxidation (BDDFE), respectively. Therefore, its working parameters were optimized and are summarized in Table I. One more step - regeneration of the working surface of m-AgSAE was incorporated directly in the measuring procedure and it was performed in the analysed solution before every measurement on m-AgSAE. Optimal surface regeneration was found as 30 cycles between 0 and -1 V, where the limiting potentials were kept for 0.3 s. An efficiency of the regeneration process was confirmed by repeated measurements and calculation of relative standard deviation of 11 repeated measurements (RSDM(11) = 1.6 % for c(PCR) = 5×10-6 mol L-1). This value was comparable with that obtained for repeated measurements on BDDFE (RSDM(11) = 2.6 % for c(PCR) = 1×10-5 mol L-1), which confirms good repeatability and minimal adsorption of PCR oxidation products on the working surface without need of any regeneration. Various concentration dependences were measured under optimized DPV

11

conditions and examples are shown in Fig. 2A (m-AgSAE) and 2B (BDDFE). The peak height increased linearly in the concentration range from 5×10-7 to 9×10-6 mol L-1 (mAgSAE) and from 5×10-7 to 4.9×10-5 mol L-1(BDDFE). The limits of detection were considered to be LD(m-AgSAE) = 3.5×10-8 mol L-1 and LD(BDDE) = 7.0×10-8 mol L-1 and these low values confirm high sensitivity of proposed methods. Table I

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3 5

690.0

590.0 490.0

-5 -10 4

6

0

-15

-10

-20

-20

-25

-30

-30

500

300

100 0

290.0

0

10

20

30

40 50 c [µmol L-1]

190.0 90.0

j [nA mm-2]

jp [nA mm-2]

2

600

200

390.0

0

700

400

0

c [µmol L-1] 8 10

jp [nA mm-2]

E [V] -0.9

j [nA mm-2]

Optimized paramaters of DPV for determination of PCR on m-AgSAE and BDDFE. m-AgSAE BDDFE Initial potential (Ein), V -0.3 +0.6 Final potential (Efin), V -1.0 +2.0 Scan rate (v), mV s-1 20 20 Modulation amplitude, mV -50 +75 Modulation time, ms 80 25

-10.0

0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 A B E [V] -35 Fig. 1. DP voltammograms of various PCR concentrations measured on m-AgSAE (A) and BDDFE (B), respectively. Parameters are summarized in Table I. Curves are presented after baseline correction. Insets: Dependence of current density of PCR peak (jp) on its concentration (c). -40

The applicability of proposed methods was verified by analysis of spiked samples of tap water, natural waters (rivers Danube and Elbe, dam and brook) and human urine. Each determination was 5 times repeated and it was found, that obtained results well corresponded with added amounts of PCR. Calculated relative standard deviations of 5 repeated determinations (RSDD(5)) were lower than 4.5 % in case of BDDFE and 8.5 % in case of mAgSAE, respectively, which confirm high reproducibility of the determinations. Conclusion Two electrode materials were tested for voltammetric analysis and possibility of sensitive determination of pyridine herbicide PCR. It was proved, that both tested working electrode are suitable for recording signal provided by electrochemical reduction (m-AgSAE) and oxidation (BDDFE), respectively, and this signal was appropriate for further analytical application. Parameters of DPV were optimized and proposed methods were found sensitive, rapid and reliable for PCR determination using solid electrodes, which could be good alternative to mercury electrodes. Acknowledgements This work was supported by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project No. CZ.1.07/2.3.00/30.0021 “Strengthening of R&D Teams at the 12

University of Pardubice”), the Grant Agency VEGA of the Slovak Republic (grant No. 1/0051/13) and the Slovak Research and Development Agency under the Contract No.APVV0797-11. References 1. Tu M., Hurd C., Randall J.M.: Weed Control Methods Handbook: Tools and Techniques for Use in Natural Areas. The Nature Conservacy, http://www.invasive.org/gist/handbook.html, Downloaded March 4th, 2014. 2. Scifres C.J., Hahn R.R., Diaz-Colon J., Merkle M.G.: Weed Sci. 19, 381 (1971). 3. Johnsen T.N.: J. Environ. Qual. 9, 601 (1980). 4. Canadian water quality guidelines for protection of aquatic life: Picloram. Canadian Council of Ministers of the Environment. Winipeg 1999. 5. Britt C., Mole A., Kirkham F., Terry A., Arnold D., Clarke J., McLaren R., Gundrey A., McMillan S.: The Herbicide Handbook. English Nature in assoc with FACT. Wetherby 2003. 6. Kolpin D.W., Barbash J.E., Gillion R.J.: Groundwater 38, 858 (2000). 7. Baur J.R., Bovey R.W., Merkle M.G.: Weed Sci. 20, 309 (1972). 8. Tan L.K., Humpries D., Yeung P.Y.P., Florence L.Z.: J. Agric. Food Chem. 44, 1135 (1996). 9. Rieger A.W., Muir D.C., Hendzel M.R.: J. Assoc Off. Anal. Chem. 68, 59, 1985. 10. Zhao P., Wang L., Cehn L., Pan C.: Bull. Environ. Contam. Toxicol. 86, 78 (2011). 11. Abramović B.F., Anderluh V.B., Gaál F.F., Šojić D.V.: J. Serb. Chem. Soc. 72, 809 (2007). 12. Zhang Y., Zeng G.-M., Tang L., Niu C.-G., Pang Y., Chen L.-J., Feng C.-L., Hunag G.H.: Talanta 83, 210 (2010). 13. Yau K.Y.F., Groves M.A.T., Li S., Sheedy C., Lee H., Tanha J., MacKenzie C.R., Jermutus L., Hall J.C.: J. Immunol. Methods 281, 161 (2003). 14. Gilbert D.D., Mann J.M.: Int. J. Environ. Anal. Chem. 2, 221 (1973). 15. Whittaker J.W., Osteryoung J.: J. Agric. Food Chem. 28, 89 (1980). 16. Massaropi M.R.C., Machado S.A.S., Avaca L.A.: J. Braz. Chem. Soc. 14, 113 (2003). 17. Dos Santos L.B.O., Masini J.C.: Talanta17, 979 (2005). 18. Mellado J.M.R., Corredor, Pospíšil L., Hromadová M.: Electroanalysis17, 979 (2005). 19. Mellado J.M.R., Corredor, Montoya M.R., Pospíšil L., Hromadová M.: J. Electrochem. Soc. 152, E379 (2005). 20. Mellado J.M.R., Pintado S., Montoya R.M.: Helv. Chim. Acta 91, 1443 (2008). 21. Novotný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000). 22. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 23. Kraft A.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 355 (2007). 24. Pecková K., Musilová J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009). 25. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochim. Acta 113, 1 (2013). 26. Fisher J., Barek J., Yosypchuk B., Navrátil T.: Electroanalysis 18, 127 (2006). 27. Vaňková L., Maixnerová L., Čížek K., Fischer J., Barek J., Navrátil T., Yosypchuk B.: Chem. Listy 100, 1105 (2006). 28. Švorc Ľ., Rievaj M., Bustin D.: Sensor. Actuator B 181, 294 (2013). 29. Rao T.N., Loo B.H., Sarada B.V., Terashima C., Fujishima A.: Anal. Chem. 74, 1578 (2002). 30. Codognoto L., Tanimoto S.T., Pedrosa V.A., Suffredini H.B., Machado S.A.S., Avaca L.A.: Electroanalysis 18, 253 (2006).

13

Voltammetric Determination of Cymoxanil on Carbon-based Electrodes (Voltametrické stanovení cymoxanilu na uhlíkových elektrodách) Dmytro Bavol, Jiří Zima, Jiří Barek, and Hana Dejmková Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, University Research Centre Supramolecular Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic. E-mail: [email protected] Abstract Differential pulse voltammetry using a carbon fibre rod electrode, a glassy carbon electrode and a capillary carbon paste electrode have been used for the determination of cymoxanil. Cymoxanil shows in methanol – B-R buffer (1:9) media single peak, whose position and height depends on the pH. Under the optimal conditions, repeatability in cathodic potential range was verified. Under the optimum conditions, calibration curves of cymoxanil on CFRE and GCE were measured and practical applicability of these newly developed method was verified on model samples of river water and soil. Key words: Cymoxanil, Differential pulse voltammetry, Carbon fibre rod electrode, Glassy carbon electrode, Capillary carbon paste electrode. Úvod Cymoxanil (obr. 1) se používá jako preventivní i kurativní kontaktní fungicid na povrch list , stonk a řapíku list . V Evrop je prodáván pro použití proti plísním, vyskytujících se na hroznech vinné révy, bramborech, rajčatech, okurkách, chmelu, v cukrové řep a na jiných rostlinných plodinách 1. Zásadn se používá v kombinaci s dalšími kontaktními fungicidy, které prodlužují jeho reziduální p sobení. Je široce používán především na houby patřící do řádu Peronosporales: Phytophthora, Plasmopara a Peronospora 2. Cymoxanil byl spolu s dalšími pesticidy stanoven v ovoci a zelenin pomocí kapalinové a plynové 3,4 chromatografie . Cymoxanil obsahuje dv elektroaktivní funkční skupiny, redukční keto- a nitrilo- skupinu. V této práci byla provedena elektrochemická stanovení cymoxanilu na r zných typech uhlíkových elektrod. Uhlíkové elektrody jsou b žn používané v moderních elektroanalytických metodách ke stanovení jak organických, tak anorganických analyt ve vodných i nevodných prostředích 5. Převážnou v tšinu uhlíkových elektrod je možné používat v pozitivních a negativních potenciálových oblastech 6. Pořizovací cena uhlíkových elektrod je nízká a jsou komerčn dostupné. Jsou málo náchylné k oxidaci povrchu, chemicky netečné a vykazují dlouhou životnost. Avšak uvedené výhody t chto elektrod kompenzují u dále zmiňovaných elektrod i jejich nevýhody, mezi které patří především problémy zp sobené časovými zm nami kvality jejich povrchu. Nejb žn ji používanou uhlíkovou elektrodou je elektroda ze skelného uhlíku (GCE). Skelný uhlík má výborné mechanické a elektrické vlastnosti je chemicky inertní a má široké potenciálové okno 7. Jejich značnou nevýhodou oproti ostatním uhlíkovým elektrodám m že být jejich vyšší cena. Povrch GCE elektrody se dá vyleštit do zrcadlového lesku, např. za pomocí vodní suspenze aluminy, čímž je její povrch dobře definovaný 8. Další uhlíková elektroda, která byla použitá pro stanovení cymoxanilu, je tuhá kompozitní elektroda z uhlíkových vláken (CFRE). Jejich značnou výhodou oproti ostatním uhlíkovým elektrodám je jejich nižší pořizovací cena. Nevýhodou jsou efekty stárnutí elektrody a tedy

14

jejich omezená životnost. Pro dodržení dostatečné reprodukovatelnosti výsledk elektrodu lze leštit na brusném papíru (zrnitost 1600) nebo rovn ž na podložce se suspenzí oxidu hlinitého 9. Třetí elektroda, která byla použita pro stanovení cymoxanilu byla uhlíková pastová elektroda (CPE). Uhlíkové pastové elektrody nacházejí v současné dob široké využití v elektroanalýze, zejména z d vodu svého širokého potenciálového okna v oxidační oblasti ve v tšin elektrolyt , nízkého pozadí proudu a nízkých cen 10. U CPE lze potenciálový limit ovlivnit jak úpravou uhlíkového prášku, tak typem použité pastové kapaliny 5,10. Nevýhodou je jejich zdlouhavá příprava, omezené použití v organických rozpoušt dlech 11 a omezené využití v oblasti záporných potenciál z d vodu přítomnosti kyslíku rozpušt ného v past . Snadnou obnovou povrchu u kapilární CPE, uříznutím malé části m řícího konce elektrody, je zajišt no pom rn jednoduché obnovování aktivního povrchu elektrody a dodržení dostatečné reprodukovatelnosti 12. Tato práce je zam řena na hledání optimálních podmínek pro stanovení cymoxanilu ve vodném prostředí technikou diferenční pulsní voltametrie (DPV) s využitím kompozitní elektrody z uhlíkových vláken (CFRE), elektrody ze skelného uhlíku (GCE) a kapilární uhlíková pastové elektrody (CPE) jako pracovních elektrod a ov řit jejich použitelnost na modelových vzorcích říční vody a p dy.

Obr. 1 Struktura cymoxanilu. Experimentální část Materiál Pro studium elektrochemického chování cymoxanilu byl připraven zásobní roztok o koncentraci 1·10−3 mol·dm−3. Roztoky o nižších koncentracích byly připraveny přesným řed ním tohoto zásobního roztokuu Brittonovým-Robinsonovým pufrem (BR pufrem) nebo methanolem dle použití. Tlumivé roztoky BR pufru o příslušném pH byly připraveny smísením roztoku obsahujícího kyselinu boritou (p.a., Lachema Brno), kyselinu fosforečnou (85 %, p.a., Lachema Brno) a kyselinu octovou (99,8 %, p.a., Lach-Ner, Neratovice), každou o koncentraci 0,04 mol·dm−3, s vodným roztokem hydroxidu sodného (p.a., Lach-Ner, Neratovice) o koncentraci 0,02 mol·dm−3. Další použité chemikálie byly methanol (p.a., Lach-Ner, Neratovice), deionizovaná voda (Milli- plus, systém, Millipore, USA), aceton (99 %, ρ = 0,79 g/ml, p.a., Lach-Ner, Neratovice) a suspenze oxidu hlinitého (velikost částic 1,1 μm). Aparatura Pro m ření technikou DPV byl používán potenciostat PalmSens s programem PSTrace verze 3.0 (Palm Instruments, Nizozemí) pracující v prostředí in P (Microsoft Corporation). M ření bylo provád no v tříelektrodovém systému, kdy pracovní elektrodou byly uhlíkový kompozitní prut (Midwest Products Co., USA) nebo elektroda ze skelného uhlíku (Metrohm, Switzerland). Pr m r aktivní plochy elektrod byl 2 mm. Jako třetí varianta pracovní elektrody 15

byla použita kapilární uhlíková pastová elektroda s pr m rem aktivní plochy elektrody 0,5 mm. Uhlíková pasta byla připravena smícháním 250 mg mikrokuliček ze skelného uhlíku o pr m ru 0,4 – 12 μm (Alpha Aesar, USA) se 100 μl minerálního oleje (Fluka Biochemika, Švýcarsko). b složky byly d kladn zhomogenizovány. Jako referentní elektroda byla zvolena argentchloridová elektroda s roztokem chloridu draselného o koncentraci 3 mol·dm−3 (ETP CZ R 008-05, EcoTrendPlus). Platinová drátková elektroda (ETP CZ P 16, EcoTrendPlus) byla použita jako elektroda pomocná. Výsledky a diskuse Vliv pH a opakovatelnost měření Vlivu pH na voltametrické stanovení cymoxanilu bylo sledováno v prostředí BR pufr – methanol (9:1) v rozmezí jednotek pH 2 až 12. Vybrané voltametrické křivky jsou uvedeny na obr. 2. Jako optimální pH pro stanovení cymoxanilu při m ření na CFRE bylo zvoleno pH 4, při použití GCE bylo zvoleno pH 7. Při t chto pH cymoxanil poskytuje vysoké signály a zároveň signály leží v dostatečné vzdálenosti od konce potenciálového okna. Z d vodu překryvu píku cymoxanilu s píkem kyslíku, který se nedal odstranit z pasty v CPE elektrod , nebylo možné m ření vyhodnotit ani určit optimální pH a tato elektroda již dále nebyla pro m ření používána. Ve zvoleném optimálním prostředí byla ov řena opakovatelnost m ření (viz. Tab. I).

(B)

(A)

(C) Obr. 2 DP voltamogramy cymoxanilu (c = 1·10−4 mol·dm−3) na CFRE (A), na GCE (B) (c = 1·10−5 mol·dm−3) a na CPE (C) (c = 1·10−5 mol·dm−3); v prostředí BR pufr – methanol (9:1) o pH v rozmezí 2 až 12; čísla křivek odpovídají danému pH.

16

Kalibrační závislosti ptimální podmínky zjišt né z prom ření cymoxanilu na CFRE a GCE byly využity k prom ření kalibrační křivky. Vybrané voltametrické křivky jsou uvedeny na obr. 3. Parametry kalibračních přímek pro stanovení cymoxanilu shrnuje tab. I.

(A) (B) Obr. 3 DP voltamogramy cymoxanilu m řené technikou DPV na CFRE (A) v prostředí BR pufr o pH 4 – methanol (9:1). Koncentrace cymoxanilu 1·10−5 (1), 8·10−6 (2), 6·10−6 (3), 4·10−6 (4), 2·10−6 (5), 1·10−6 (6), 8·10−7 (7) a 6·10−7 (8) mol·dm−3. DP voltamogramy cymoxanilu m řené technikou DPV na GCE (B) v prostředí BR pufr o pH 7 – methanol (9:1). Koncentrace cymoxanilu 1·10−5 (1), 8·10−6 (2), 6·10−6 (3), 4·10−6 (4), 2·10−6 (5), 1·10−6 (6), 8·10−7 (7), 6·10−7 (8) a 4·10−7 (9) mol·dm−3. Tabulka I. pakovatelnost m ření a parametry kalibrační přímky pro stanovení cymoxanilu metodou DPV v prostředí BR pufr – methanol (9:1). Sm rnice Koncentrační L RSD (%), −1 Elektroda μA·mol ·dm− R2 –1 rozsah mol L–1 mol L pro 10 m ření 3 GCE

1·10–5 – 4·10–7

– 0,168·105

0,9921

5,6·10–7

0,68 (c = 10 μmol L–1)

CFRE

1·10–5 – 6·10–7

– 0,279·105

0,9715

5,9·10–7

1,36 (c = 100 μmol L–1)

Modelové vzorky Nov vypracovaná voltametrická metoda pro stanovení cymoxanilu na CFRE byla ov řena i na modelových vzorcích říční vody a p dy. M ření bylo provád no v říční vod s roztokem BR pufru (9:1) o optimálním pH pro danou elektrodu, tedy pH 4. Při m ření reálného vzorku p dy na CFRE bylo postupováno následujícím zp sobem: do 2 g p dy, bylo automatickou pipetou odpipetováno příslušné množství roztoku studované látky. Po zamíchání a vysušení bylo do p dy přidáno 10 ml acetonu a tato sm s byla protřepána po dobu n kolika minut. Po usazení pevných částic byla část roztoku odebrána a odpařena do sucha při 50°C. dparek byl rozpušt n v 1 ml sm si methanol a pufr pH 4 v pom ru 1:9. Výt žnost m ření při koncentraci cymoxanilu 2 mg·kg–1 m ření činí 83%. ptimální podmínky zjišt né z prom ření cymoxanilu na CFRE byly využity k prom ření kalibrační křivky v říční vod a p d . Parametry kalibrační závislosti pro cymoxanil jsou uvedeny v Tab. II.

17

Tabulka II. Parametry kalibrační přímky pro stanovení cymoxanilu v říční vod a p d metodou DPV. Koncentrační rozsah Sm rnice L Elektroda Matrice mol L–1 μA·mol−1·dm−3 R2 mol L–1 mg kg–1 μA·mg−1·kg−1 mg kg–1 CFRE

Říční voda

1·10–5 – 2·10–6

– 0,0159·106

0,9963

1,3·10–6

CFRE

P da

2 – 0,2

– 0,1215·106

0,9580

0,3

Závěr V rámci této práce byly provedeny studie, které m ly za cíl nalézt optimální podmínky pro stanovení cymoxanilu ve vodném roztoku a vyvinout metodu vhodnou ke stanovení studované látky v říční vod a p d . Všechna m ření byla provedena metodou diferenční pulsní voltametrie s využitím CFRE, GCE a CPE jako pracovních elektrod. Z výsledk m ření pH závislosti vyplývá, že nejvhodn jší hodnota pH BR pufru pro cymoxanil stanovený na CFRE je pH 4 a pH 7 na GCE. Dále práce zahrnuje opakovatelnosti m ření a kalibračních závislostí cymoxanilu, přičemž každá z elektrod poskytla stanovení v jiném koncentračním rozmezí a pro každou z elektrod byla vypočtena odlišná mez stanovitelnosti (viz Tab. I). Nižší meze stanovitelnosti bylo dosaženo při m ření s GCE elektrodou. Pro m ření v reálných vzorcích byla jako zajímav jší elektrodový materiál zvolena CFRE. Optimální podmínky zjišt né z prom ření cymoxanilu ve vodném roztoku, byly použity pro stanovení studované látky na modelových vzorcích říční vody a p dy (viz Tab. II). Poděkování Tato práce byla vypracována v rámci Specifického vysokoškolského výzkumu (SVV260084) a byla finančn podpořena Grantovou agenturou České Republiky (projekt P206/12/G151). Literatura 1. Kristin L.M., John G.C.: Technical Information Bulletin for Curzate., p. 12, Biochemicals Department, City of Wilmington, Delaware, 1983. 2. U.S. Environmental Protection Agency: Cymoxanil; Pesticide Tolerances for Emergency Exemptions, Federal Register Document 75, 97 (1997). 3. Paola F., Carmen D.G., Serenella S., Patrizia M.: Biomed. Chromatogr. 19, 766 (2005). 4. Foods of plant origin - Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LCMS/MS following acetonitrile extraction/partitioning and clean-up by dispersive SPE. CEN (European Committee for Standardization), 2008. 5. Švancara I.; Vytřas K.; Barek J.; Zima J.: Carbon Paste Electrodes in Modern Electroanalysis. Crit. Rev. Anal. Chem. 31, 311 (2001). 6. Barek J., Fischer J., Navratil T.; Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 22, 2032 (2007). 7. Wang J.: Analytical electrochemistry, Second edition. Wiley-VCH, New York 2000. 8. Adams R. N.; Justice J. B.: Voltammetry in the Neurosciences. The Humana Press, Clifton 1987. 9. Bavol D.: akalářská práce, PřF UK, Praha 2011. 10. Vytřas K.; Švancara I.: emické Listy , 405 (1994). 11. Švancara I., Hvízdalová M., Vytřas K., Kalcher K., Novotný R.: Electroanalysis 8, 61 (1996). 12. Bavol D.: iplomová práce. Univerzita Karlova v Praze, Praha 2013.

18

Electrochemical Behavior of Oxygen-Terminated Boron-Doped Diamond Electrodes in Different Electrolyte Media (Elektrochemické chování anodicky oxidovaných bórem dopovaných diamantových elektrod v roztocích různých základních elektrolytů) Lenka Benešová, Petr Hammer, Jana Vosáhlová, Jaroslava Zavázalová, and Karolina Pecková Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre "Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, CZ-128 43, Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Electrochemical behavior of oxygen-terminated BDD electrodes was investigated using cyclic voltammetry in different aqueous and mixed aqueous-organic media. The influence of boron concentration, pH and composition of the electrolyte on the width of the potential window was investigated. It is inversely dependent on the doping level. Further, addition of methanol causes significant narrowing of the potential window at the anodic side, contrary to addition of acetonitrile. These results demonstrate that for electroanalytical purposes, proper choice of BDD electrode and supporting electrolyte is important especially when considering detection of analytes undergoing electro oxidation or reduction at high anodic or cathodic potentials. Key words: Boron-doped diamond, Electrolyte, Boron concetration, Voltammetry. Introduction In recent years boron-doped diamond (BDD) electrodes have gained deserved popularity in three major application fields: electroanalysis, waste water treatment, and electrosynthesis. Their useful properties include low and stable background current, wide potential window in both aqueous and non-aqueous solvents, mechanical and corrosion resistance, and good electroactivity towards certain organic species which deactivate the surface of other conventional electrodes 1-4. These properties are significantly influenced by morphology of the BDD films, boron concentration, and content of non-diamond (sp2 carbon) impurities, which are significantly affected by the type, conditions and operation procedures during the production of BDD thin film by a chemical vapor deposition procedure 5, 6. In these processes, a carbon containing gas, most frequently methane is energetically activated to decompose the molecules into methyl-radicals and atomic hydrogen and deposited on a suitable substrate 7. The boron content is usually given by the B/C ratio in the gas phase, typical values range from 500 ppm to 15 000 ppm resulting in boron carrier concentration in the final film 1·1018 cm−3 − 1·1021 cm−3 (boron concentration 1·1020 cm−3 corresponds to 1 boron atom per 1000 carbon atoms) 5. Further, surface termination (H, O) is among the factors influencing the electrochemical properties of BDD films 8, 9: The as-deposited diamond surface is hydrogenterminated, because the films are grown under hydrogen plasma or in a hydrogen atmosphere. The oxygen-terminated surface can easily be formed by exposing the surface to oxygen plasma, boiling in strong acid or electrochemical exposure to the high anodic potential in the region of water decomposition 2. This decomposition (Eq. (1)) is enabled by the high oxygen overvoltage at BDD surface and is extremely important for the three application fields listed above: H 2 O(BDD)  HO (BDD)  H   e  (1) The hydroxyl radicals are confined to the BDD surface and as powerful oxidizing agents are capable of oxidation of a wide range of organic compounds 10. This imparts not only potential organic analytes in electroanalysis, oxidizable at BDD electrodes by this indirect mechanism, but also organic solvents in electrolyte media. Thus, the width of potential window at BDD electrodes depends largely at the composition of the electrolyte.

19

In this study, the electrochemical behavior of oxygen-terminated BDD electrodes was investigated in different aqueous and mixed aqueous-organic solvent systems. The emphasis was put on boron concentration in nanocrystalline BDD films, and pH and composition of the electrolyte. Experimental The following aqueous solutions were prepared in deionized water (Milli-Qplus system, Millipore, USA): 1 mol L−1 KCl, 0.1 mol L−1 HClO4, 0.1 mol L−1 HNO3, 0.1 mol L−1 H2SO4, 0.075 mol L−1 phosphate buffer pH 3.0, 0.1 mol L−1 acetate buffer pH 4.0, 0.1 mol L−1 phosphate buffer pH 7.0, and 0.05 mol L−1 borate buffer pH 9.0. All chemicals for their preparation were of gradient grade purity (Lach-Ner, Neratovice, CZ). For measurements in aqueous – organic systems methanol and acetonitrile (analytical grade purity, both Merck, Prague, CZ) were used. Measurements were carried out using a computer driven Eco-Tribo Polarograph with PolarPro software, version 5.1 (both Polaro-Sensors, Prague). For experiments in aqueous media, BDD electrodes from Department of Functional Materials, Institute of Physics of the ASCR, v.v.i. were used. They were prepared using microwave plasma-assisted chemical vapor deposition (System Seki ASTeX 5010, Woburn, MA, USA) on silicon wafers (resistivity of ca 0.005 Ω·cm, thickness of wafer 300 μm, N Semiconductor, Rožnov pod Radhošt m) of mixtures containing 99.0% H2/1.0% CH4 and trimethylboron gas with variable B/C ratio in the gas phase 500, 1000, 2000, 4000, and 8000 ppm. The wafers with deposited BDD film of 1 μm thickness were placed in Teflon electrode body with disk diameter of 2.7 mm, i.e. geometric electrode area A = 5.7 mm2 (ref. 11). For experiments in mixed media, commercial BDD (3 mm diameter, Windsor Scientific, UK) was used. BDD electrodes were activated at the

beginning of each working day in 0.1 mol L–1 H2SO4 by applying the potential of +2.4 V for 60 s.

Three electrode arrangement with BDD electrodes as indicator electrodes and platinum wire auxiliary electrode and silver / silver chloride (3M KCl) reference electrode was used. pH was measured using Conductivity & pH meter Jenway 4330 (Jenway, England). Cyclic voltammograms were recorded at the scan rate of 100 mV s−1. Results and Discussion The electrochemical processes in aqueous media were firstly investigated for a set of BDD electrodes with boron concentration 500 ppm – 8000 ppm. Several supporting electrolytes commonly used in electroanalysis and representing the wide range of pH values were used: 1 mol L−1 KCl, 0.1 mol L−1 HClO4, 0.1 mol L−1 acetate buffer pH 4.0, 0.1 mol L−1 phosphate buffer pH 7.0, and 0.05 mol L−1 borate buffer pH 9.0. The anodic and cathodic potential limit was defined as the potential, where the anodic/cathodic current passed the current ± 5 A. Figure 1 (A+B) depicts the potential window calculated as difference of these potential limits Elim and cyclic voltammograms for the extreme B/C ratios 500 ppm and 8000 ppm for all investigated media. It is obvious from figure 1B that in general the width of the potential window decreases with increasing boron doping level; the narrowing is more significant for the 500 ppm – 2000 ppm electrodes and is more extreme at the cathodic side. The widest potential window exhibit for all doping levels acidic solutions, i.e. perchloric acid and acetate buffer, the latter with the maximum of ~3600 mV for 500 ppm electrode. On the other hand, minimized potential windows (Elim ˂ 2400 mV) were observed for 8000 ppm electrode in neutral and base media.

20

A

Elim(mV)

I (nA)

Potential window in aqueous media is related to water decomposition reaction, where oxygen and hydrogen evolution reactions take places at high anodic and cathodic potentials, respectively. These processes require the presence of catalytic sites on the electrode surface. Obviously, their availability decreases with decreasing boron content leading to extended potential window. Thus, it can be concluded that electrochemically active sites are largely dependent on boron doping level, in agreement with other studies at BDD films with different boron doping level 8, 9 and theoretical calculations concluding that hydrogen bonding to boron is energetically favorable in diamond 12.

500 ppm 8000 ppm

10000

B

borate buffer pH 9.0 phosphate buffer pH 7.0 KCl acetate buffer pH 4.0 perchloric acid

3200 5000 0

2800

-5000 borate buffer pH9.0 phosphate buffer pH7.0 KCl acetate buffer pH4.0 perchloric acid

-10000 -15000

2400

2000 -1500

0

1500

0

E (mV)

2000

4000

6000 B/C ratio (ppm)

Fig. 1. (A) Cyclic voltammograms of 0.05 mol L−1 borate buffer pH 9.0, 0.1 mol L−1 phosphate buffer pH 7.0, 1 mol L−1 KCl, (E), 0.1 mol L−1 acetate buffer pH 4.0, and 0.1 mol L−1 HClO4 measured at BDD electrode deposited using B/C ratio 500 ppm (full lines) and 8000 ppm (dotted lines). (B) Dependence of the width of the potential window Elim at B/C ratio; anodic and cathodic potential limit measured for the current ± 5 A. Scan rate 100 mV s−1, values calculated and cyclic voltammograms presented for the third cycle. Further, the effect of composition of the electrolyte was investigated for the supporting electrolytes mentioned above and also for 0.075 mol L−1 phosphate buffer pH 3.0, 0.1 mol L−1 sulfuric, nitric and perchloric acid. These acidic media are favourable in determination of organic compounds using anodic oxidation at BDD electrodes due to most extended potential window. These aqueous solitions were mixed with common organic solvents (methanol, acetonitrile) and cyclic voltammograms of prepared electrolyte media containing 1 % - 99 % of organic phase were recorded at commercial BDD electrode. For the mixture of phosphate buffer pH 3.0 with methanol and acetonitrile these are depicted at Fig. 2A and 2B, respectively. Obviously, while a minimal addition of methanol leads to shift of the anodic potential limit to less positive potential, for acetonitrile opposite trend can be traced. This is a consequence of BDD-mediated oxidation of methanol by hydroxyl radicals produced according to Eq. (1), unfeasible for acetonitrile. In the cathodic region analogous behavior for electrolytes containing methanol and acetonitrile was observed, i.e. shift of the cathodic potential limit to more negative values after addition of methanol and acetonitrile, respectively.

21

Conclusions Cyclic voltammograms were recorded at BDD electrodes in common acidic, neutral and base electrolyte media with and without addition of methanol and acetonitrile. The width of the potential window is inversely dependent on the doping level. Further, addition of methanol causes significant narrowing of the potential window at the anodic side, in contrast to addition of acetonitrile. These results demonstrate that for electroanalytical purposes, proper choice of BDD electrode and supporting electrolyte is important especially when considering detection of analytes undergoing electro oxidation and reduction at high anodic or cathodic potentials.

Fig. 2. Cyclic voltammograms of the mixture of 0.075 mol L−1 phosphate buffer pH 3.0 with methanol (A) and acetonitrile (B) in the ratio (v/v): 100:0 (0), 99:1 (1), 90:10 (2), 50:50 (3), 10:90 (4), and 95:5 (5). Scan rate 100 mV s−1, the tenths cycle is presented. Acknowledgements This research was carried out within the framework of Specific University Research (SVV 260084). The research was financially supported by the Grant Agency of the Charles University in Prague (Project GAUK 684213).

References 1. 2.

Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009). Fujishima A., Einaga Y., Rao T. N., Tryk D. A.: Diamond Electrochemistry. Elsevier, Amsterdam 2005. 3. Musilova J., Barek J., Peckova K.: Chem. Listy 103, 469 (2009). 4. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 5. Zivcova Z. V., Frank O., Petrak V., Tarabkova H., Vacik J., Nesladek M., Kavan L.: Electrochim. Acta 87, 518 (2013). 6. Matsushima J. T., Silva W. M., Azevedo A. F., Baldan M. R., Ferreira N. G.: Appl. Surf. Sci. 256, 757 (2009). 7. Schwander M., Partes K.: Diam. Relat. Mater. 20, 1287 (2011). 8. Salazar-Banda G. R., de Carvalho A. E., Andrade L. S., Rocha R. C., Avaca L. A.: J. Appl. Electrochem. 40, 1817 (2010). 9. Hutton L. A., Iacobini J. G., Bitziou E., Channon R. B., Newton M. E., MacPherson J. V.: Anal. Chem. 85, 7230 (2013). 10. Enache T. A., Chiorcea-Paquim A. M., Fatibello O., Oliveira-Brett A. M.: Electrochem. Commun. 11, 1342 (2009). 11. Maixnerova L., Barek J., Peckova K.: Electroanalysis 24, 649 (2012). 12. Lombardi E. B., Mainwood A., Osuch K.: Phys. Rev. B 70 (2004).

22

Voltammetric Behavior of Herbicide Metamitron using Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické chování herbicidu metamitronu s využitím stříbrné pevné amalgámové elektrody) Renáta Šelešovská and Lenka Bandžuchová Institute of Environmental and Chemical Engineering, University of Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Possibility of application of the mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) has been investigated for voltammetric analysis of herbicide metamitron (MM). Cyclic voltammetry (CV) and direct current voltammetry (DCV) has been used for study of the voltammetric behavior of analyzed substance depending on pH of supporting electrolyte and scan rate. Differential pulse voltammetry (DPV) has been applied for herbicide determination. Finally, the proposed method has been successfully used in the analysis of spiked river water. All obtained results were compared with those achieved using hanging mercury drop electrode (HMDE). Key words: Metamitron, Herbicide, Silver solid amalgam electrode, Voltammetric determination. Úvod Metamitron (MM, C10H10N4O, 4-amino-4,5-dihydro-3-methyl-6-fenyl-1,2,4-triazin-5-on, CAS: 41 394-05-2) patří do skupiny triazinonových herbicid . Jeho strukturní vzorec je uveden na obrázku 1. Tento herbicid se používá k ochran plodin, jako jsou krmná, cukrová a červená řepa, trávy i okrasné rostliny. Hubí dvoud ložní a lipnicovité plevele, výdrol řepky, oset, pcháč a pýr. MM je selektivním a systémovým herbicidem pro první i pozdní stádium vznikajícího plevele. Aplikuje se na listy i kořeny rostlin, odkud je velice dobře absorbován. MM je slabým inhibitorem fotosyntézy, který získal na významu díky své vysoké toleranci. Pro člov ka není MM toxický, ovšem pro včely je škodlivý a nejnebezpečn jší je pro vodní organismy 1.

Obr. 1. Strukturní vzorec metamitronu. V literatuře byly publikovány práce zam řené na studium voltametrického chování a stanovení MM na rtuťových elektrodách 2-4. Popsány byly i metody využívající pevných pracovních elektrod 5-8. Tato práce je zam řena na stanovení MM s využitím m-AgSAE, která patří mezi nové netradiční elektrodové materiály 9. Tato elektroda představuje mezikrok mezi rtuťovými a pevnými pracovními elektrodami a kombinuje výhody obou uvedených typ , zejména vysoké vodíkové přep tí a dobrou elektrochemickou regeneraci povrchu srovnatelnou s HMDE a současn dobrou mechanickou odolnost a netoxický elektrodový materiál pevných pracovních elektrod. Do dnešní doby byla již m-AgSAE úsp šn využita při stanovení mnoha anorganických 10-12 i organických 13-19 látek stejn jako při analýze peptid 20 a DNA 21-23.

23

Experimentální část Všechny chemikálie použité k příprav roztok byly čistoty p.a. a byly dodány firmou SigmaAldrich. Jako elektrolyt byl použit Britton v-Robinson v (B-R) pufr o pH 2-12, který byl připraven z alkalické a kyselé složky. Alkalickou tvořil 0,2 mol L-1 Na H, kyselá složka se skládala z 0,04 mol L-1 H3BO3, H3PO4 a CH3C H. Při aktivaci m-AgSAE byl použit roztok 0,2 mol L-1 KCl. Standard MM byl dodán op t firmou Sigma-Aldrich a deklarovaná čistota byla  99,5 %. Roztok MM o koncentraci 1×10-3 mol L-1 byl připravován rozpušt ním vhodné navážky v destilované vod za p sobení ultrazvuku a byl uchováván v lednici. Voltametrická m ření byla provád na s využitím počítačem řízeného Eco-Tribo Polarografu (Eco-Trend Plus s.r.o., Praha) se softwarem POLAR-PR , verze 5.1. Bylo využíváno tříelektrodového zapojení. Jako pracovní elektrody sloužily HMDE a m-AgSAE (ob EcoTrend Plus s.r.o., Praha), jako referentní elektroda byla použita argentchloridová elektroda (Ag/AgCl/KCl, nasycená) a jako pomocná elektroda platinový drátek (ob Monokrystaly s.r.o., Turnov). M ření probíhala při laboratorní teplot (232 °C) a kyslík byl odstraňován dusíkem (Linde Gas a.s., Praha). K m ření pH byl používán pH-metr Hanna 221 (Hanna Instruments, Inc., USA) s kombinovanou sklen nou elektrodou. Při příprav roztok MM byl použit ultrazvuk Bandelin Sonorex (Schalltec GmbH, N mecko). Pro studium voltametrického chování metamitronu byla použita metoda CV (počáteční potenciál (Epoč) 0 mV, potenciál obratu -1200 mV, rychlost polarizace (v) 50 mV s-1). Pro studium elektrodové reakce sloužila DC voltametrie (Epoč = 100 mV, Ekon (konečný potenciál) = 1200 mV, v = 50-500 mV.s-1). Pro stanovení MM byly optimalizovány podmínky DPV (Ein = 250 mV, Ekon = -700 mV, v = 20 mV s-1, výška pulzu = -50 mV, šířka pulzu = 80 ms). Pro vyhodnocení byl použit program Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, USA) a pro výpočet statistických parametr program ADSTAT 1.2524. Povrch nové AgSAE byl vylešt n pomocí leštící sady tvořené podložkou, suspenzí aluminy (Al2O3) a jemným práškem (Elektrochemické detektory s.r.o., Turnov, Česká Republika). Na vylešt ný povrch byl ponořením do lahvičky se rtutí vytvořen rtuťový meniskus. Meniskus byl obnovován op tovným ponořením do rtuti obvykle jednou týdn . Vždy na začátku dne nebo po přestávce v m ření delší než 0,5 hodiny byla m-AgSAE aktivována v roztoku 0,2 mol L-1 KCl za míchání po dobu 5 minut při potenciálu -2200 mV. Regenerace povrchu spočívala ve skokovém střídání dvou hodnot regeneračních potenciál vkládaných na elektrodu, a to přímo v analyzovaném roztoku. Bylo použito 30 cykl mezi potenciály Ereg1 = -1200 mV a Ereg2 = 200 mV, které byly udržovány po dobu treg1,2 0,3 s. Praktickým vzorkem byla říční voda s přídavkem MM. Pocházela z řeky Chrudimky v Pardubicích. Nebylo třeba ji před analýzou nijak upravovat. Roztok MM byl přidán tak, že výsledná koncentrace ve vzorku byla 1×10-6 mol L-1. K analýze bylo do nádobky odpipetováno 9 mL vzorku a přidán 1 mL B-R pufru o pH 3. Koncentrace MM byla stanovena metodou standardního přídavku. Postup byl stejný pro HMDE i m-AgSAE. Výsledky a diskuse Z cyklického voltamogramu zm řeného na m-AgSAE v prostředí B-R pufru o pH 3, který je uvedený na obrázku 2 vyplývá, že MM poskytuje dv redukční vlny kolem potenciálu -435 a -970 mV. Tyto výsledky byly v souladu s poznatky publikovanými pro HMDE 2-4. Voltametrické chování MM na m-AgSAE bylo studováno v širokém rozsahu pH (2-12). Pozornost byla zam řena na první redukční vlnu, protože byla výrazn vyšší a lépe vyhodnotitelná. Pr b h této závislosti pro koncentraci MM v roztoku 1×10-5 mol L-1 je uveden na obrázku 3. Nejvýrazn jší proudová odezva byla pozorována při pH 3. S rostoucí hodnotou pH výška píku postupn klesala a docházelo k posunu píku sm rem k negativním

24

potenciál m. Vzhledem k dosaženým výsledk m bylo pro další m ření na m-AgSAE zvoleno prostředí B-R pufru o hodnot pH 2. Pro HMDE bylo vhodn jší pH 3. -180

I [nA]

I [nA]

-340

HMDE

m-AgSAE

-150

-280 -120

-220

-90

-60

-160

-30 0

-100

0

-200

-400

-600

-800

-1000

-1200 E [mV]

-40 20

0

-200

-400

-600

-800

-1000

-1200 E [mV]

Obr. 2. Cyklický voltamogram MM nam řený na m-AgSAE v prostředí B-R pufru o pH 3. Epoč = 0 mV, Ekon = -1200 mV, v = 50 mV s-1, cMM = 1×10-5 mol L-1. Dalším studovaným parametrem na m-AgSAE byla rychlost polarizace. Výška píku s rostoucí rychlostí polarizace rostla, ale ze závislosti Ip na v vyplynulo, že tento nár st není lineární. Pro určení řídícího d je byly vyneseny také závislosti Ip na v1/2 a log(Ip) na log(v). První uvedená závislost byla lineární, což sv dčí o difuzn řízené elektrodové reakci. Hodnota sm rnice (0.544) získaná z rovnice přímky (1) zmín né logaritmické závislosti potvrzuje záv r, že se v případ prvního redukčního kroku MM jedná o difuzn řízenou reakci s možným nepatrným vlivem adsorpce. Stejný výsledek byl získán rovn ž pro HMDE (rovnice (2)). logI p nA  0,554  log v mVs 1  0,112; R 2  0,987 (1)

  logI nA  0,523  logvmVs   0,986; R 1

2

p

-100

 0,998

(2)

Ep [mV]

Ip [nA]

-1200

A

-80

B

-900

-60

-40

-600

-20

0

-300 14 2 4 6 8 10 12 14 pH pH Obr. 3. Závislost výšky píku (A) a potenciálu píku (B) na pH získaná na m-AgSAE. DCV, BR pufr (pH 2-13), Epoč = 100 mV, Ekon = -1800 mV, v = 50 mV s-1, cMM = 1×10-5 mol L-1. 0

2

4

6

8

10

12

Pro stanovení MM byly optimalizovány parametry DPV, a to Epoč, výška a šířka pulzu a v. Pro m-AgSAE byly navíc testovány parametry regenerace povrchu. Byly rovn ž ov řovány možnosti akumulace MM na povrchu obou pracovních elektrod. V souladu s výsledky studií

25

závislosti na rychlosti polarizace bylo zjišt no, že MM se neadsorbuje a citlivost stanovení tedy nem že být zvýšena zařazením adsorptivní rozpoušt cí voltametrie. Při navržených podmínkách byla prom řena řada koncentračních závislostí pro MM na m-AgSAE i HMDE. Příklad koncentrační závislosti nam řené na amalgámové elektrod je uveden na obrázku 4. pakovatelnost stanovení MM s využitím DPV v kombinaci s ob ma pracovními elektrodami byla ov řena na modelových roztocích se známým obsahem analytu. Byla provedena opakovaná stanovení při r zných koncentracích metodou standardního přídavku a byly vypočteny pr m rné koncentrace MM a hodnoty relativní sm rodatné odchylky opakovaného stanovení (RSDS). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. Statistické parametry nových metod stanovení jsou uvedeny v tabulce 2. Na záv r byly analyzovány vzorky vody z řeky Chrudimky, které byly obohaceny přídavkem roztoku MM na koncentraci 1×10-6 mol L-1. Výsledky t chto analýz byly správné a velmi dobře reprodukovatelné. Tabulka I. Výsledky opakovaného stanovení MM na m-AgSAE a HMDE DPV dáno [mol L-1] stanoveno [mol L-1] RSDn [%] -8 HMDE 5,0×10-8 1,05 (5,000,04)×10 -8 -8 1,0×10 4,22 (1,030,03)×10 -7 -9 5,0×10 1,83 (4,990,06) ×10 -6 m-AgSAE 5,0×10-6 2,19 (4,970,11)×10 -6 -6 1,0×10 3,05 (1,020,03)×10 -7 -7 5,0×10 1,73 (5,010,09)×10

N 5 9 11 5 5 5

-15 Ip [nA]

I [nA]

-7 -5

-12 -3 -1

-9

0

2

4

6

8 c [µmol l-1 ]

-6 -200

-400

-600

-800 E [mV]

Obr. 4. Koncentrační závislost MM nam řená na m-AgSAE. DPV, B-R pufr (pH 2), Epoč = 100 mV, Ekon = -1200 mV, v = 50 mV s-1, cMM = 1×10-5 mol L-1. Tabulka II. Statistické parametry navržených metod pro m-AgSAE a HMDE HMDE m-AgSAE DCV DPV DCV DPV -1 -8 -10 -8 LOC [mol L ] 1,0×10 7,1×10 5,6×10 1,9×10-8 -1 -8 -9 -7 LOD [mol L ] 2,0×10 1,4×10 1,1×10 3,5×10-8 -1 -8 -9 -7 LOQ [mol L ] 7,3×10 3,8×10 2,9×10 5,2×10-8

26

Závěr Na záv r je možné říci, že voltametrické chování MM na m-AgSAE odpovídá výsledk m popsaným v literatuře2-4 pro rtuťové elektrody. Amalgámová elektroda m že být použita pro stanovení MM a navržená metoda je vhodná pro analýzu přírodních vod i pesticidních přípravk . Poděkování Tato práce byla financována Ministerstvem školství, mládeže a t lovýchovy České republiky (projekt č. CZ.1.07/2.3.00/30.0021) a Univerzitou Pardubice (projekt č. SGFChT06/2014). Literatura 31. Cox L., Hermosin M.C., Cornejo J.: Chemosphere 32, 1391 (1996). 32. Goicolea M.A., Arranz J.F., Barrio R.J., de Balugera Z.G.: Fresenius J. Anal. Chem. 339, 166 (1991). 33. Ludvík J., Riedel F., Liška F., Zuman P.: J. Electroanal. Chem. 457, 177 (1998). 34. Ludvík J., Zuman P.: Microchem. J. 64, 15 (2000). 35. Farzinnejad N., Beigi A.A.M., Fotouhi L., Torkestani K., Ghadirian H.A.: J Electroanal. Chem. 580, 245 (2005). 36. Arranz A., de Betono S.F., Moreda J.M., Cid A., Arranz J.F.: Microchim. Acta 127, 273 (1997). 37. Arranz A., Villaba M.F., de Betono S.F., Moreda J.M., Arranz J.F.: Fresenius J. Anal. Chem. 357, 768 (1997). 38. Arribas A.S., Bermecho E., Chicharro M., Zapardiel A.: Electroanalysis 18, 2331 (2006). 39. Barek J., Fischer J., Navratil T., Pecková K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 40. Novoný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000). 41. Yosypchuk B., Novotný L.: Chem. Listy 96, 756 (2002). 42. Yosypchuk B., Novotný L.: Talanta 56, 971 (2002). 43. Čížková P., Navrátil T., Šestáková I., Yosypchuk B.: Electroanalysis19, 161 (2007). 44. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B.: Sensors 6, 445 (2006). 45. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 60, 375 (2012). 46. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 47. Bandžuchová L., Šelešovská R.: Acta Chim. Slov. 58, 776 (2011). 48. Šelešovská-Fadrná R., Navrátil T., Vlček M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007). 49. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navrátil T.: Electroanalysis 23, 177 (2011). 50. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007). 51. Fadrná R., Yosypchuk B., Fojta M., Navrátil T., Novotný L.: Anal. Let. 37, 65 (2004). 52. Fadrná R. Cahová-Kuchaříková K., Havran L., Yosypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis 17, 452 (2005). 53. Yosypchuk B., Fojta M., Havran L., Heyrovský M., Paleček E.: Electroanalysis 18, 186 (2006). 54. Meloun M., Militky J., Forina M.: Linear Regression Models. Chemometrics for Analytical Chemistry. PC-Aided Regression and Related Methods. Ellis Horwod, Chichester, 1992.

27

Scanning Kelvin Probe – System and Applications Wolfgang Burgstaller a, Gabriela Schimo b,c, Sarah Walkner b,c, and Achim Walter Hassel a,b,c a Christian Doppler Laboratory for Combinatorial Oxide Chemistry COMBOX, at the Institute for Chemical Technology of Inorganic Materials, Johannes Kepler University Linz, Altenberger Str.69, 4040 Linz, E-mail: Austria [email protected] b Institute for Chemical Technology of Inorganic Materials, Johannes Kepler University Linz, Altenberger Str.69, 4040 Linz, Austria c CEST, Competence Centre for Electrochemical Surface Technology, Viktor-Kaplan Str. 2, 2700 Wiener Neustadt, Austria Abstract The Scanning Kelvin Probe (SKP) is a device to very sensitively determine the surface potential of conducting or semi-conducting samples. It is suitable for examination of samples that require a non-destructive and non-contact analysis and is used to determine surface defects or to study delamination processes at polymer-metal interfaces. Having a stable reference material, the SKP offers the possibility to indirectly measure the relative work function of a material. Due to the sensitivity of the instrument there are several environmental conditions influencing the measured potential for example temperature, humidity or atmosphere. The importance to establish stable conditions for a reliable operation of the system and characterize the device properties like lateral resolution and influence of the tipsample distance on the measurement is shown. Key words: Scanning Kelvin Probe, Contact potential difference, Applications, Environmental conditions. Introduction The measurement of the Volta potential difference, or contact potential difference, by the Kelvin probe technique is used for the investigation of conductive or semi-conductive surfaces. It is a non-contact, non-destructive method to determine fluctuations in the surface potential by probing the outermost layers of a material. It was first describe by Lord Kelvin in 1898 1 and consequently improved 2-3 to be used not only in many scientific fields like surface physics or electrochemistry but also for industrial applications, e.g. investigation of coatings for automotive industry. The CPD is defined by equation (1) where Φ is the work function of the material (A and B) and e is the elementary charge. (1) When two different conducting materials are brought in close vicinity to each other and connected via an external circuit, their Fermi levels equalize. This creates an electron flow from the metal with the smaller work function to the one with the higher work function leading to oppositely charged surfaces. The setup can be seen as a parallel plate capacitor. The electric field formed between the two metals compensates for their difference in work function. Vibrating one of the plates (the probe) leads to charging and discharging of the capacitor with the frequency of the vibration. The resulting current becomes zero as soon as an external voltage (baking potential, Vb) is applied which is varied until a zero field state is reached. The baking potential is equal to the CPD 4-5.

28

The reading of the device is very sensitive to processes occurring at the surface of the sample but also to the medium between the capacitor plates (capacity equation). Furthermore the chemical potential itself and the SKP electronics are temperature dependent. Experimental As described above, the environmental conditions have a severe impact on the measurement quality. Several steps have been taken to stabilize the operation setup to achieve a reasonable measurement range. First a proper chamber made of a conducting material (stainless steel) housing the scan head and the sample has to be designed forming a Faraday-cage to avoid any charging nearby the position to be investigated. Temperature control was realized by an air handling unit enhanced by isolated housing for the whole system. All transparent parts are implemented as ITO covered glass. The first approach to stabilize the humidity in the chamber was achieved via statured salt solutions, which establish, depending on the salt, a constant humidity. Various reference material surfaces known to have a constant work function were tested. A Cu/CuSO4 system was set up to measure the potential at a liquidgaseous interface. Results and discussion Some test measurements on various materials have been done to show the stability of the system and the dependence of the CPD on the humidity and temperature in the measurement chamber. Two possible applications are shown in figure 1. Figure 1a shows a time resolved point measurement on an iron sheet (250 µm thick) which is covered with a Pd layer (about 50 nm). Therefore a specially designed flow cell is used. On the lower side of the specimen hydrogen is formed electrochemically for 150 seconds. Due to the use of a completely closed cell the hydrogen permeates through the material and finally is detected on the top surface. The potential drop (275 mV) is recorded. Using the Nernst equation a quantification of the hydrogen can be done because the electrode potential of the Pd:H electrode depends on the hydrogen content in the Pd 6. Figure 1b shows a surface potential mapping on a coated steel sheet. The measurement is done prior to exposing the sample to a condensation test (CT) to investigate blister formation. The results of the mapping are compared to the sample after the test. It is investigated where blisters are formed and if there is a correlation to a potential drop at this position. The aim is to predict and analyze positions on the steel sheet where blisters will be formed. The lateral resolution of the SKP is mainly defined by the diameter of the probe tip and the distance between probe and specimen. Several linescans have been performed to determine the influence of the two factors described above. Two different tip diameters, 300 µm and 100 µm, were compared. Decreasing the distance between tip and sample improves the signal to noise ratio and therefore the accuracy of the potential reading.

29

Fig. 1. a) Measurement of hydrogen permeation through a Pd covered iron sheet (250 µm). Time resolved detection of the electrochemically produced hydrogen shows a potential drop of about 275 mV. The inlet shows the total recorded time of 16 hours. b) Surface mapping of a coated steel sheet prior to exposing the sample to a CT-Test. Conclusions The Scanning Kelvin Probe is a sensitive tool to measure processes on the surface of various conducting and semi-conducting materials. The CPD of a sample surface can be imaged without physical contact between the SKP and the material to be investigated. The key factor for reliable and reproducible results is stabilizing the environmental conditions in which the system is working and to minimize influences like charging of either the sample or other components inside the chamber. For controlled conditions measurements with a lateral resolution of about 100 µm, depending on the tip diameter and a potential precision of ±6 mV is achievable. Possible applications of this measurement technique can be found in basic research as well as in industry. Acknowledgements The financial support by the Austrian Federal Ministry of Economy, Family and Youth and the National Foundation for Research, Technology and Development is gratefully acknowledged! Furthermore the financial support of the Austrian Research Promotion Agency (FFG) within the COMET framework and financial support of Lower Austria is appreciated. References 1. Kelvin L.: Phil. Mag. 5, 298 (1898). 2. Zissmann W.A.: Rev. Sci. Instrum. 3, 367 (1932). 3. Besoke K., Berger S.: Rev. Sci. Instrum. 47, 840 (1976). 4. Baumgärtner H., Liess H. D.: Rev. Sci. Instrum. 59, 802 (1988). 5. Baiki I. D., Estrup P. J.: Rev. Sci. Instrum. 69, 3902 (1998). 6. Evers S., Rohwerder M.: Electrochem. Commun. 24, 85 (2012).

30

Searching for Electrochemical Reduction Mechanism of Azidophenyl DNA Labels (Po stopách mechanismu elektrochemické redukce “azidofenylových” DNA značek) Ales Danhel a, Zuzana Trosanova a, Jana Balintova b, Michal Hocek b,c, and Miroslav Fojta a,d a Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Kralovopolska 135, CZ-61265 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Flemingovo nam. 2, CZ-16610 Prague 6, Czech Republic c Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, Charles University in Prague, Hlavova 8, CZ-12843 Prague 2, Czech Republic d Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 753/5, CZ-62500 Brno, Czech Republic Abstract This contribution brings new information to sporadic scientific results concerned to electrochemical reduction of aromatic azides. Selected compounds used as perspective DNA labels or their structural constituents such as, 4-azidophenyltrifluoroboronic acid, 4-azidophenyl modified deoxycytidine and next probable analogous compounds and/or products of their reduction, were voltammetrically studied and compared to each other in order to reveal a mechanism of their electrochemical reduction at mercury electrodes in aqueous media. Preliminary results obtained by cyclic voltammetry at mercury and carbon based electrodes and by mass spectrometry of the products isolated from batch electrolysis on mercury pool by preparative chromatography are discussed. Key words: Aromatic azides, DNA labels, Mercury electrode, Reduction mechanism, Voltammetry. Introduction Redox labeling of the DNA by enzymatic incorporation of thus labeled nucleotides pertain to the one of the main current task in DNA sensing and development of variable (bio)sensors and/or (bio)arrays 1,2. Organic azides are recently widely used for synthesis of diverse palette of compounds thanks to their miscellaneous reactivity 3,4. “Click-reactions” represent a part of their possible utilization offering wide range of application possibilities including DNA and/or electrode surface modification 5. Thanks to low demands required by the Click reactions (laboratory temperature), relatively high speed (less than 1 h) and simplicity (e.g. presence of Cu(I)), analogous approaches become promising in bio-sensing, too. Electrochemical redox processes of azide ions has already been studied at Hg 6, Au, Pt 7, glassy carbon and boron-doped diamond electrodes 8,9. Due to their explosive hazard and toxicity, inorganic metal azides have already been analyzed by polarography during 60’ and 70’s 10-13. In all these published contributions, two inorganic azide ions decompose into the three molecules of gaseous nitrogen. Great attention has also been paid to thermal and light induced decomposition of organic azides releasing molecule of nitrogen together with production of corresponding amines 14-20. Comparable results were also obtained during their electrochemical reduction 21,22. However according to our recent results, electrochemical reduction of aromatic azides at mercury based electrodes in aqueous media seems to be much more complicated. Therefore we have expended an effort to reveal this task and current results are discussed here, even the mechanism has not been clarified jet.

31

Experimental Dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich, Czech Republic) stock solutions of 5 mmoll-1 4-azidophenyltrifluoroboronic acid (resp. its potassium salt, FABA), 5 mmoll-1 5-(4-azidophenyl)deoxycytidine (dCAZP) and 5-(4-azidophenyl)deoxyadenosine (dAAZP, all synthesized by Balintova, unpublished results, Fig. 1), 5 mmoll-1 dCPA and dAPA (both synthesized by Cahova 23), both researchers from Hocek collaborative research group 1, and ethanolic (p.a., Penta, Czech Republic) stock solutions of selected azo dyes (Methylorange (MO), Orange G (OG) and Congo red (CG), all p.a., Lachema, Czech Republic) were used in this study. Britton-Robinson buffer (BR, pH 2 – 12) and 0.3 moll-1 ammonium formate/phosphate buffer (AFP buffer) pH 6.95 were used during all voltammetric measurements as supporting electrolytes (all components were of ACS grade, Sigma-Aldrich, Germany). Deionised water produced by Milli-Q plus system (Merck-Millipore, Germany), argon (99.998 %, Air Products, Czech Republic), for removing of the oxygen from the electrochemically studied solutions by their 5 min deaeration, and metal mercury (99.999 % Polarografie Praha, Czech republic) were used during all experiments in this work. N3 NH2

N3

N N3 F K

a)

F

O HO

B

O

NH2 N

N

N HO

N

O

F

b)

c) OH OH Fig. 1. Structure formulae of studied: a) potassium salt of azidophenyltrifluorboronic acid (FABA), b) 5-(4-azidophenyl)deoxycytidine (dCAZP) and c) 5-(4-azidophenyl)deoxyadenosine (dAAZP). Voltammetric measurements were carried out by Trosanova and Danhel using electrochemical workstation composed of 663 VA Stand (Metrohm, Switzerland) and potentiostat PGSTAT302N operated by program Nova 1.10 (both, Metrohm-Autolab, Netherlands) utilizing a three electrode system: i) hanging mercury drop working electrode (HMDE, drop surface area 0.424±0.021 mm2) or mercury pool (in case of electrolysis, surface area ~200 mm2) and/or glassy carbon electrode (GCE, surface area 4.148±0.022 mm2 , ii) glassy carbon rod or paltinum wire (in case of electrolysis) auxiliary electrode, and iii) silver chloride reference electrode (Ag/AgCl/3 moll-1 KCl, all Metrohm, Switzerland). Semi-preparative separation of nucleos(t)ides was performed by Balintova using HPLC on a column packed with reversed-phase 10 mm C18 (Phenomenex, Luna C18 (2)). Mass spectra were measured by research-service group at Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic, using ESI in positive mode. Results and discussion Cyclic voltammetry. Basic electrochemical characterization of selected compounds: FABA, dCAZP and dAAZP was studied by cyclic voltammetry using HMDE. As most of us would expect, only one redox signal caused by reduction of azido group to amine accompanied by nitrogen molecule decomposition should be observed on CVs of studied compounds in

32

aqueous media within pH range 2 – 12 (for FABA see Fig. 2), next to the reduction signals of nucleobases (adenine and cytosine) at dCAZP and dAAZP. However, when CVs showed more than one signal apparently related to azide group, new question rose: “ hat is the real reduction mechanism of the azide group in this system?” Expected mechanism (reduction of azides to amines) obviously fit just at pH 2, where only one reduction peak (I+II) was observed for all three compounds and none consecutive anodic signals appeared. CVs of FABA measured in pH 3 – 4 offered one anodic (III) and one cathodic (V) peak related to quasireversible oxidation of azide-reduction product and its backwards reduction, respectively. Within pH range 6 – 10, signal I+II was divided to two individual peaks I and II at pH 10 and next anodic signal IV occurred. Even if the increasing pH caused linear increasing value of peak potentials (Ep), their slopes differentiated from theoretical value 0.059 for signals I, I+II, II, III and V, what means that there is not equal number of involved electrons and protons in the reduction processes. Only redox process caused signal IV obviously involves same number of electrons and protons. I+II

25 nA

-1000

2.0

I+II III

V

IV IV

IV

V IV

0.0 ca

I

III

I

III

9.0

II

12.0

-1.0

V

0

III

-0.5

III

-250

10.0

II

I

-500

8.0

II

I

III

V

7.0

II

I

III

V

IV

I+II

-750

6.0

I+II

Ep/mV

V

II

4.0

250

-1.5

E, V vs. Ag/AgCl 3M KCl

IV 2

4

6

pH

8

10

12

Fig. 2. Cyclic voltammograms of FABA (100 µmoll-1) (left) and evaluated peak potentials (Ep, right) in dependence on pH of BR buffer at HMDE, scan rate 100 mVs-1. Analogous measurements of dAAZP and dCAZP offered comparable results, but azide group was reduced at potentials about 140 and 110 mV more positive, respectively, than FABA with Ep -700 mV, all in BR pH 2. However, analogous split of the peak I+II at FABA in BR pH 10 was observed at pH 7 for both labeled nucleosides. Then the peak I stayed at the same potential -780 and 740 mV (dAAZP and dCAZP, resp.) with increasing pH up to 12, what apparently means that the reduction process I does not involve protons, but it does for FABA at least partially. Registered CVs within narrower potential windows confirmed that consecutive anodic and cathodic peaks (III-V) are related to products of the azide group reduction. CVs recording only signal I showed formation of another anodic peak at potential closed to 0 mV (dAAZP) and -60 mV (dCAZP). However slopes of linear dependences of signal potential II on pH showed values close to 0.059, what means that equal number of electrons and protons could be involved in the reduction processes of dAAZP and dCAZP reduction. From the ratios of slopes of concentration dependences of studied compounds, a number of involved electrons could be predicted, but due to unknown efficiency of the individual redox processes, it was not possible to use it. Warrier proposed mechanism of photocatalytic reduction of aromatic azides to amines using CdS and CdSe nanoparticles 24, but it is not within a good agreement with our results, because it does not answer the question of noticeable anodic signals. To disprove connection between anodic peak III and oxidation of amine, analogous CVs of aminophenyl labeled nucleosides were measured at HMDE in BR pH 7, none of signals were shown, as it was expected.

33

Another reduction mechanism of p-nitrophenylazide in acetonitrile and/or DMSO expects possibility of dimerization of short-lived nitrenium ion into the corresponding diazo compound 25. Due to this fact, CVs of selected azo dyes (Methylorange (MO), Orange G (OG) and Congo red (CR)) were registered at HMDE in BR pH 7, with expectation according to 26, to obtain relevant hydrazo compounds for MO and CR and amines for OG. However none expectable reversible systems (anodic signals of reversible oxidation of given hydrazo compounds) were observed for MO and CR, but it does for OG. So, is the CV anodic signal of OG analogous to the signal III of FABA at HMDE in BR pH 7? And, what would happen, in case of incorporation of the azidophenyl nucleoside triphosphates into the structure of DNA, where individual azides are separately fixed and they cannot form the dimers, while anodic signal is presented. Potential of incorporated azidophenyl (single peak) in the DNA was found at -890 mV, while potential of peak II take occurred at -850, -860 and -830 mV for FABA, dAAZP and dCAZP, respectively and azide in DNA also offer anodic signal at -130mV in comparison with -140 mV (dAAZP), -180 mV (dCAZP), -165 mV (FABA) and +50 mV (OG). Electrolysis Exhaustive electrolysis of studied compounds and azo dyes may help to determine number of exchanged electrons and to analyze given products by different electrode materials with specific potential windows and to compare them with signals of expected products. However electrolysis of FABA, dCAZP and OG was problematic, due to obviously fast passivation of the electrode surface by produced polymer films and overly complex reduction mechanism made calculation impossible. Only dAAZP has been successfully electrolyzed (two involved electrons were calculated). Obtained products were further separated, isolated by preparative chromatography and finally analyzed by mass spectrometry. Chromatography and mass spectrometry Three different products, A, B and C, were isolated using preparative gradient chromatography with yields 50, 30 and 20 %, respectively. ESI mass spectra then showed molar weight of M+Na+ ions of individual products. Only product B and C could be certainly characterized as corresponding expected amine and default dAAZP. What is the main product A? According to our suggestion based on value of M+Na+ ion, it could be tetrazen, but its regular characterization and overall reduction mechanism of the azides will be the scope of further research, focused on repeated successful and exhausted electrolysis and measurements of the products by high resolution mass spectrometry. Conclusion Results discussed in this contribution showed complexity of the electrochemical reduction mechanism of studied azidophenyl derivatives. Different than amino compound was found in the mixture of products obtained by electrolysis of studied dAAZP, but characterization of its prevailing product and overall proposition of the reduction mechanism will be the scope of further research. Acknowledgment Financial support from project OPVK CZ.1.07/2.3.00/30.0019, Czech Science Foundation (project P206/12/G151) and the institutional financing by the Academy of Sciences of the Czech Republic (RVO 61388963) is gratefully acknowledged.

References

34

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26.

Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936 (2011). Meldal M., Tornoe C. W.: Chem. Rev. 108, 2952 (2008). Brase S., Gil C., Knepper K., Zimmermann V.: Angew. Chem., Int. Ed. 44, 5188 (2005). El-Sagheer A. H., Brown T.: Chem. Soc. Rev. 39, 1388 (2010). Kovaleva S. V., Gladyshev V. P., Dubrovka A. M.: J. Anal. Chem. 61, 258 (2006). Dalmia A., Savinell R. F., Liu C. C.: J. Electrochem. Soc. 143, 1827 (1996). Xu J. Z., Swain G. M.: Anal. Chem. 70, 1502 (1998). Plzak V., Wendt H.: Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem. 83, 481 (1979). Rao A. L. J., Puri B. K.: Fresen. Z. Anal. Chem. 254, 362 (1971). Senise P., De Almeida Neves E. F.: Anal. Chim. Acta 48, 177 (1969). Senise P., Neves E.: J. Am. Chem. Soc. 83, 4146 (1961). Bryant J. I., Kemp M. D.: Anal. Chem. 32, 758 (1960). Iddon B., Meth-Cohn O., Scriven E. F. V., Suschitzky H., Gallager P. T.: Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 18, 900 (1979). Delaive P. J., Sullivan B. P., Meyer T. J., Whitten D. G.: J. Am. Chem. Soc. 101, 4007 (1979). Fraser R. T. M., Paul N. C., Bagley M. J.: Org. Mass Spectrom. 7, 83 (1973). Abramovitch R. A., Kyba E. P., Scriven E. F. V.: J. Org. Chem. 36, 3796 (1971). Labbe G.: Chem. Rev. 69, 345 (1969). Reiser A., Marley R.: Trans. Faraday Soc. 64, 1806 (1968). Doering W. v. E., Odum R. A.: Tetrahedron 22, 81 (1966). Benati L., Bencivenni G., Leardini R., Minozzi M., Nanni D., Scialpi R., Spagnolo P., Zanardi G.: J. Org. Chem. 71, 5822 (2006). Kononenk L. V., Yurre T. A., Dmitriev V. N., Efros L. S., Bezuglyi V. D.: Zh. Obshch. Khim. 40, 1359 (1970). Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem., Int. Ed. 47, 2059 (2008). Warrier M., Lo M. K. F., Monbouquette H., Garcia-Garibay M. A.: Photochem. Photobiol. Sci. 3, 859 (2004). Herbranson D. E., Hawley M. D.: J. Org. Chem. 55, 4297 (1990). Cabral J. D., Turner H. A.: J. Soc. Dyers Colour. 72, 158 (1956).

35

Voltammetric Behavior of 4-Aminophthalimide Label using Hanging Mercury Drop Electrode Zuzana Ferenčíková a, Aleš Daňhel b, Jan Reidl c, Michal Hocek c, and Miroslav Fojta a,b Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 753/5, 625 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic c Institute of rganic Chemistry and Biochemistry, AS ČR, v.v.i., Flemingovo nám. 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic a

Abstract 4-aminophthalimide (API), covalently attached to nucleotide (dCTP or dATP) has recently beendesigned as a fluorescent label for the detection of DNA-protein interaction. However API is electrochemically reducible and therefore it is possible to use alternatively the APImodified nuclotides as DNA redox labels. The electrochemical behavior of labeled nucleotides and labeled DNA was studied using cyclic voltammetry and transfer stripping cyclic voltammetry at hanging mercury drop electrode. Observed CVs showed irreversible reduction signals of 4-aminophthalimide label without production of consequently oxidizable/reducible species. Key words: Labeled nucleotide, 4-aminophthalimide, Primer extension, DNA, Hanging mercury drop electrode, Voltammetry. Introduction Labeling of nucleic acids using electroactive moities 1-5 is an attractive topic in contemporary DNA studies. These DNA labels contain reducible groups convenient for their electrochemical detection. Electrochemically active labeled nucleic acids can be used for determination of DNA hybridization, identification of single nucleotide polymorphism (SNPs), determination of DNA-protein interaction 6-7, etc.

Fig. 1: Deoxycytidine triphosphate labeled by 4-aminophthalimide via propargyl linker (dCAPITP). Preparation of labeled DNA can advantageously be performed via DNA polymerasecatalyzed incorporation of one or more electrochemical labels into DNA strand using primer extension reaction (PEX), using corresponding modified deoxynucleoside triphosphates (dNTP) as monomer substrates. Thus labeled DNA containing various numbers of labels may be further analyzed using electrochemical methods. Correlation between label peak intensity and numbers of labeled nucleotides in DNA sequence can be used to detect changes in the representation of individual bases in chosen DNA sequence. The 4-aminophthalimide label (API) was designed as a promising flurescent tag. Presence of redox centers predetermines API for electrochemical determination, too. Electrochemical

36

behavior of two API-labeled nucleotides (dCAPITP, Fig. 1 and dAAPITP) was studied using cyclic voltammetry (CV) and transfer stripping cyclic voltammetry (TSCV) at hanging mercury drop electrode (HDME). Experimental The labeled dNTPs (dCAPITP and dAAPITP) prepared by the Hocek group 8 were dissolved in DMSO and used as stock solutions for electrochemical studies and incorporation into the DNA. The electrochemical studies (cyclic voltammetry (CV) and transfer stripping voltammetry (TSCV)) were carried out by an Autolab analyzer PGSTAT302N (Eco Chemie, The Netherlands) in connection with electrochemical workstation VA Stand 663 (Metrohm, Switzerland) using a three-electrode system consisted of HMDE working electrode, glassy carbon rod auxiliary electrode and silver chloride reference electrode (Ag/AgCl/3M KCl) at the room temperature. The voltammetric measurements were carried out in supporting electrolytes, Britton-Robinson buffer (BR) pH 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 and 0.3M ammonium formate/phosphate buffer (AFP) pH 6.95. Prepared electrolytes were 5 min deaerated by Argon (X50S Tech, Air Products, Czech Republic) to remove the oxygen prior each measurement. The CV method was used at the scan rates 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 V·s-1 and different potential windows. NaOH solution of pH 7.0, 8.0 and 9.0, 0.2 M NaCl and 10 mM Tris.Cl pH 8.5 were used as a transfer environment for TSCV. The TSCV method was used at the scan rate 1 V·s-1, potential window 0.0 to -1.8 V, time of adsorption 10, 20, 30, 60, 90, 120, 240 and 320s. The enzymatic incorporation of labeled nucleotides (dCAPITP and dAAPITP) into the DNA was carried out using Primer Extension Reaction (PE ). The reaction mixture (30µl) contained DNA polymerase (KOD XL, 0.2U), primer (15nt), (biotinilated) template (31nt), natural/labeled dNTPs (dATP/ dAAPITP, dCTP/ dCAPITP, dGTP, dTTP), buffer and deionized water. The reaction mixture was incubated for 40 min at 60 °C in thermomixer Comfort (Eppendorf, USA). Prepared ss/dsDNA was purified using magnetoseparation by streptavidine couated dynabeads (Invitrogen, USA) or using centrifuge filtration columns ( IAgen, Germany) and eluated into or by 30 µl of deionized water and/or 10 mM Tris.Cl pH 8.0, respectively. Results and Discussion Labeled nucleotides Electrochemical study of dCAPITP was made using CV and TSCV. CVs of API (Fig. 2) shows one reduction peak of API and one reduction peak of C. Dependence of the CVs on pH (Fig. 2a) shows negative shift of the API peak to more negative potential with increasing pH. The influence of potential window (Fig. 2b) shows that the reduction of API is an irreversible process without formation of consequently oxidizable/reducible products. 0.3 M AFP buffer pH 6.95 and scan rate 1 Vs-1 were chosen for next experiments as optimum conditons for measurements of both API and C peak. The dependency of peak height (Ip) on the applied scan rate (v) testifies about adsorption and diffusion controlled process of the ongoing electrode reaction. Several solutions from which the dNTPs were adsorbed (NaOH pH 7.0, 8.0, 9.0 and 0.2 M NaCl) and adsorption times (tac = 10, 30, 60, 90, 120, 240 and 320 s) were tested for optimalization of TSCV measurement. The best signal resolution was observed using 0.2 M NaCl and tac of 60 s. The limit of detection (LOD) was calculated for both methods, CV and TSCV, using influence of concentration on the peak height. The LOD (dCAPITP) is 0.1 M using CV and 0.01 M using TSCV.

37

a

b

Fig. 2 a) Influence of pH on CVs of 10 M dCAPITP, CV at HMDE, BR buffer pH 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 and 9.0, 0.3 M AFP pH 6.95, 1 Vs-1, b) Influence of potential window on CVs of 10 M dCAPITP, CV at HMDE, BR buffer pH 7.0, 1 Vs-1. Labeled DNA API labeled cytosine nucleotide (dCAPI) was incorporated into the DNA using the PEX reaction. Successful incorporation of dCAPITP into the DNA structure was proven using TSCV at HDME in 0.3M AFP buffer pH 6.95, transferred from 10mM Tris.Cl pH 8.5, scan rate 1 V.s-1 (Fig. 3a).

Fig. 3 a) CVs of labeled and unlabeled ssDNA with comparison of primer, b) Influence of API-DNA concentration on CVs of API labeled dsDNA; TSCV at HDME in 0.3M AFP buffer pH 6.95, transferred from 0.2M NaCl, scan rate 1 V.s-1, tac = 60 s. Labeled DNA with 1 to 4 dCAPI (plus unmodified control DNA) were prepared using five different templates (3A0C3T, 3A1C3T, 1A2C3T, 2A3C1T and 4A4C4T where numbers indicate number of corresponding nucleotides in the PEX-synthesized DNA stretch) to study the influence of number of labels in DNA structure on intensity of the API electrochemical reduction signal. Two different methods of DNA separation [magnetoseparation (to prepare ssDNA) and nucleotide removal kit (to prepare dsDNA)] were tested. The results show that the magnetoseparation is better for this purpose because of the better resulting API/G ratio (where G stands for a signal due to guanine residues in the DNA molecule). This can be explained by different degree of purity of the labeled DNA resulting from the given procedure: the sample prepared using magnetoseparation contains only the modified ssDNA strand. On the other hand, sample obtained from separation using nucleotide removal kit contains dsDNA in a mixture with possible residues of the primer and template. That is why API peak height and area corresponds to the number of labeled nucleotide incorporated better

38

using magnetoseparation (y = -610-9x - 410-9 (91.6%) for height and y = 310-10x + 310-10 (90.4%) for area) than using nucleotide removal kit (y = -810-9x - 310-8 (84.1%) for height and y = 410-10x + 210-9 (82.3%) for area). Conclusion Studied API was originally designed as a fluorescent label. We were able to use this moiety as a redox label for electrochemical detection. The basic electrochemical study was made using CV at HDME at different buffers, pH and scan rates. The best results were obtained using 0.3M AFP buffer pH 6.95 and scan rate 1 Vs-1. Next step was TSCV measurement because CV method requires large amount of sample. We tested several adsorption mediums and adsorption times. The best adsorption medium for dCAPITP is 0.2 M NaCl and adsorption time of 60 s. The electrochemical reduction of API at HMDE shows single irreversible peak at 1.11 V. We were able to successfully incorporate this label into the DNA structure. Acknowledgments This work was realized thanks the project Postdoc II: Employment of Best Young Scientists for International Cooperation Empowerment, reg. number CZ.1.07/2.3.00/30.0037 cofinanced by the European Social Fund and the state budget of the Czech Republic. This work was supported by the Czech Science Foundation P206/12/G151. References 1. Fojta M., Havran L., Kizek R., Billová S., Paleček E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004). 2. Vrábel M., Horáková P., Pivoňková H., Kalachová L., Černocká H., Cahová H., Pohl R., Šebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem. - Eur. J 15, 1144 (2009). 3. Cahová H., Havran L., Brázdilová P., Pivoňková H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Edit 47, 2059 (2008). 4. Horaková P., Macíčková-Cahová H., Pivoňková H., Špaček J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011). 5. Balintová J., Plucnara M., Vidláková P., Pohl R., Havran L., Fojta M., Hocek M.: Chem. – Eur. J. 19, 12720 (2013). 6. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). 7. Fojta M., Havran L., Pivoňková H., Horáková P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936 (2011). 8. Riedl J., Pohl R., Ernsting N. P., rság P., Fojta M., Hocek M.: Chem. Sci. 3, 2797 (2012).

39

Electrochemistry as a Tool for an Enzyme Characterization (Elektrochémia ako metóda na chakterizáciu enzýmov) Miroslav Gál a, Ján Krahulec b, Kristína Jiríčková b, Romana Sokolová c, and Ján Híveš a Institute of Inorganic Chemistry, Technology and Materials, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovakia, E-mail: [email protected] b Comenius University in Bratislava, Faculty of Natural Sciences, Department of Molecular biology, Mlynská dolina, 842 15 Bratislava 4, Slovakia c J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic

a

Abstract Basic biochemical properties such as Michaelis constant (KM) and turnover number (kcat) of enzyme enteropeptidase was measured by electrochemical impedance spectroscopy. Both values determined by impedance measurements are in good agreement with those obtained by traditional spectroscopic techniques. Therefore one can suppose that electrochemical methods might be successful for such measurements also in the case where usual ones (UV-Vis, fluorescence spectroscopy) are not able to determine these enzyme characteristics. Key words: Enterokinase, Electrochemistry, Impedance spectroscopy, Catalytical activity, Conductivity, Turnover number, Michaelis constant. Introduction Many proteins of a potential therapeutic importance are produced in a form of precursor protein, which is submitted to a complex process of maturation, making the use of the recombinant DNA technology rather difficult. One of the most basic processes during the protein maturation is proteolytic processing 1. The intensive study of a broad spectrum of protein macromolecular process pathways led to deeper understanding of processes and molecules involved and also to understanding of structural relationship between molecules assisting processing and those being processed. In most cases, specific proteases act as assisting molecules during proteolytic cleavage by recognizing specific sequence of amino acids and then hydrolytically breaking peptide bond in the recognition site or outside of it. Currently, a large number of such proteases are used during the production of recombinant proteins in molecular biology, exploiting their specificity for the purpose of separation of a target molecule from an assisting molecule, whose role is to streamline the steps leading to production of target molecule. The properties of assisting molecule, in molecular biology referred to as fusion partner, can increase the level of expression and subsequently the yield of a target protein in relation to a unit of a biomass. It can also be used as an effective mean during purification, help correct folding of a target protein etc. If these proteases are to be used in the process of recombinant protein production, properties of the protease must be known – recognition sequence, hydrolytic cleavage site and optimal reaction conditions and last, but not the least, is the availability of the protease, therefore its adequate source. Protease, known for its application in cleavage of fusion partners in molecular biology is Enterokinase. Enterokinase (EC 3.4.21.9) is a serine protease produced found in the intestinal brush border membrane of the duodenum, which activates trypsinogen by the cleavage of the N-terminal peptide, followed by the conserved sequence of four aspartic acids and one lysine. This is the exact sequence of five amino acids highly specifically recognized by Enteropeptidase, which cleaves N-terminal part from C-terminal, immediately after these amino acids. Native Enteropeptidase dimer had been isolated from porcine 2, bovine 3 and

40

human 4 intestine. In all cases, enteropeptidase seemed to be heterodimeric, stabilized by disulphide bonds. Its precursor is a single chain polypeptide composed of heavy (82-140 kDa) and light (35-82 kDa) chain. Heavy chain containing N-terminal membrane domain has only minor influence on the cleavage site recognition of small peptides, but significantly influences macromolecular substrate recognition and the inhibitor specificity. Light chain is the catalytic subunit of Enteropeptidase and contains domain similar to one of the serine protease chymotrypsine. Enterokinase’s high specificity rate makes it the enzyme of choice for cleavage of fusion proteins produced in bacteria 5-7. Basic biochemical characteristics, such as maximum reaction rate (Vmax), Michaelis constant (KM) and turnover number (kcat) determined by electrochemical methods 8-13, especially by electrochemical impedance spectroscopy will be described 14-29. These findings will add to determination of optimal reaction conditions. Comparison between electrochemical results and traditional ones will be also made. Experimental Enzyme enterokinase was expressed in Pichia pastoris and purified by several chromatographic methodods 7. The synthetic peptide substrate Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamine was obtained from Sigma. Electrochemical measurements were performed using Solartron SI 1287 electrochemical interface together with Solartron 1260 impedance/gain-phase analyzer (Solartron, UK). Impedance data were collected in the range 1 Hz to 30 kHz. Each impedance curve consisted of 60 measured points. An electrochemical data from EIS measurements were analyzed using Zsim 3.21 software. A three-electrode electrochemical cell was used. Quasi-reference electrode (RE) was a silver wire covered with AgCl. The working electrode (WE) was a valve-operated static mercury electrode (SMDE2, Laboratorní Přístroje, Prague) with an area of 4.85 × 10 -3 cm2. The counter electrode (CE) was platinum foil with area approximately 400 times higher than area of WE. Total volume of the measured solution was 300 μl. All measurements were carried out in the solution consisting of 10 mM CaCl2 (p.a., Ubichem), 10% DMSO (p.a., Sigma) and 25 mM TRIS (p.a., Serva) at 37 ± 1°C. Results and discussion In general, UV-Vis and/or fluorescence spectroscopy are the methods of choice in the characterization of basic biochemical properties of enzymes, such as maximum reaction rate (Vmax), Michaelis constant (KM) and turnover number (kcat). However, in the case of some type of substrates (e.g. fusion proteins) no characteristic UV-Vis or fluorescent spectrum is obtained. Therefore, electrochemical methods might be helpful for biochemical enzyme characterization. To prove the suitability of electrochemical methods for the characterization of enteropeptidase basic biochemical properties electrochemical impedance spectroscopy was used. The solution resistance (Rs) was the main parameter that was studied. One can suppose that after the proteolytic cleavage the conductivity of the solution will change. Therefore, it will be possible to determine the basic biochemical properties of enteropeptidase from the dependence of the conductivity of the solution on the time after the cleavage. In Fig. 1 the dependence of the cleavage velocity on the substrate concentration is plotted.

41

v / M min-1

3x10-7

2x10-7

1x10-7 0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

[substrate] / mM Fig. 1. Dependence of the cleavage velocity on the substrate GD4K-na concentration. From the Fig. 1 one can see that cleavage velocity exponentially depends on the substrate concentration. Exponential growth of the cleavage velocity can be expressed as follows: -[substrate]

-7

v= 3.2497×10

-3.1064×10-7 e2.3028×10-4

(1)

From this equation KM =149.2±17.7 μM was determined. Another important biochemical enteropeptidase characteristic kcat =121.2±10.9 s-1 was obtained from double reciprocal Lineweaver–Burk plot. Both these values are quite close to those determined by fluorescence spectroscopy KM =0.16 mM and kcat =115 s-1 by Gasparian et al. 5 and kcat =90.5 s-1 and KM =0.07 mM by us, respectively. Conclusion One can conclude that electrochemical impedance spectroscopy is very suitable for characterization of basic electrochemical properties of enterokinase enzyme. Both characteristics found by EIS measurements are in good agreement with those obtained by traditional spectroscopic techniques. Therefore one can suppose that electrochemical methods might be successful for such measurements also in the case where usual ones (UV-Vis, fluorescence spectroscopy) are not able to determine these enzyme characteristics. Acknowledgment This research was supported by the Slovak Research and Development Agency under the contract No. APVV–0119–12. Literature 1. Kalafatis M., Egan J. O., van't Veer C., Cawthern K. M., Mann K. G.: Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression 7, 241 (1997). 2. Baratti J., Maroux S., Louvard D., Desnuelle P.: Bioch. Biophys. Acta 315, 147 (1973). 3. Anderson L. E., Walsh K. A., Neurath H.: Biochemistry 16, 3354 (1977). 4. Magee A. I., Grant D. A., Taylor J. H.: Clin. Chim. Acta 115, 241 (1981).

42

5. Gasparian M. E., Ostapchenko V. G., Schulga A. A., Dolgikh D. A., Kirpichnikov M. P.: Protein Express. Purif. 31, 133 (2003). 6. Lu D. S., Yuan X., Zheng X. L., Sadler J. E.: J. Biol. Chem. 272, 31293 (1997). 7. Pepeliaev S., Krahulec J., Cerny Z., Jilkova J., Tlusta M., Dostalova J.: J. Biotechnol. 156, 67 (2011). 8. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal.-Warsaw. 52, 911 (2007). 9. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 10. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 11. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 12. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 13. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 14. Ramesova S., Sokolova R., Degano I., Bulickova J., Zabka J., Gal M.: Anal. Bioanal. Chem. 402, 975 (2012). 15. Gal M., Hromadova M., Pospisil L., Hives J., Sokolova R., Kolivoska V., Bulickova J.: Bioelectrochemistry 78, 118 (2010). 16. Pospisil L., Hromadova M., Gal M., Bulickova J., Sokolova R., Filippone S., Yang J., Guan Z., Rassat A., Zhang Y. M.: Carbon 48, 153 (2010). 17. Gal M., Hives J., Sokolova R., Hromadova M., Kolivoska V., Pospisil L.: Collect. Czech. Chem. C. 74, 1571 (2009). 18. Pospisil L., Hromadova M., Gal M., Valasek M., Fanelli N., Kolivoska V.: Collect. Czech. Chem. C. 74, 1559 (2009). 19. Sokolova R., Ramesova S., Degano I., Hromadova M., Gal M., Zabka J.: Chem. Commun. 48, 3433 (2012). 20. Pospisil L., Hromadova M., Gal M., Bulickova J., Sokolova R., Fanelli N.: Electrochim. Acta 53, 7445 (2008). 21. Sokolova R., Degano I., Ramesova S., Bulickova J., Hromadova M., Gal M., Fiedler J., Valasek M.: Electrochim. Acta 56, 7421 (2011). 22. Pospisil L., Fiedler J., Hromadova M., Gal M., Valasek M., Pecka J., Michl J.: J. Electrochem. Soc. 153, E179 (2006). 23. Pospisil L., Gal M., Hromadova M., Bulickova J., Kolivoska V., Cvacka J., Novakova K., Kavan L., Zukalova M., Dunsch L.: Phys. Chem. Chem. Phys. 12, 14095 (2010). 24. Kolivoska V., Gal M., Pospisil L., Valasek M., Hromadova M.: Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 11422 (2011). 25. Petelska A. D., NaumowiCz M., Figaszewski Z. A.: Bioelectrochemistry 70, 28 (2007). 26. Naumowicz M., Figaszewski Z. A.: Biophys. J. 89, 3174 (2005). 27. Naumowicz M., Petelska A. D., Figaszewski Z. A.: Cell. Mol. Biol. Lett. 8, 383 (2003). 28. Naumowicz M., Petelska A. D., Figaszewski Z. A.: Electrochim. Acta 54, 1089 (2009). 29. Naumowicz M., Kotynska J., Petelska A., Figaszewski Z.: Eur. Biophys. J. Biophy. 35, 239 (2006).

43

Electroless Formation of Cu/D and Cu/cBN Composite Materials for Fabrication of Abrasive Tools Mihaela Georgieva a, Maria Petrova a, Ekaterina Dobreva b, Dimitar Stoychev a, and Veselina Chakarova a a Institute of Physical Chemistry - Bulgarian Academy of Sciences, Acad. G. Bonchev Str., Bl. 11, 1113 Sofia, Bulgaria, E-mail: [email protected] b Technical University of Sofia, 8 St. K. Ohridski Blvd., 1000 Sofia, Bulgaria Abstract Electroless metal deposition’ is based on an autocatalytic reduction of metal ions to the metal on the catalytically active surface, by the action of a reducing agent that is added to the working solution. It has wide practical application in contemporary technologies in the industry, especially in the production of: new materials for electronics, energy, fine mechanics, optics, wear and corrosion resistant materials, printed boards with plated holes, etc. In recent years, along with electroless copper plating on metal substrates, progress has been made the obtaining of metal layers on the polymer (textile) substrates. In order to fabricate abrasive tools of different granularity, copper composite coatings were deposited chemically onto PET substrates with two types co-deposited disperse particles – diamond (D) and cubic boron nitride (cBN), which were characterized tribologically. Key words: Chemical deposition, Composite Cu/D and Cu/cBN layers, Tribological investigations. Introduction Composite materials obtained on the basis of diamond particles as synthetic powders are used for improving the physical and mechanical properties of various materials and surfaces. Compared to other hard abrasive and wear-resistant materials, diamond features one of the highest micro-hardness, which gives diamond dispersed composites (tools covered by these composites) considerable wear and abrasive resistance. A basic characteristic of these composites is that diamond particles are incorporated into the base deposition metal matrix, thus forming the second phase. Most often, electroless nickel and cobalt alloys are used as a matrix material for diamond composites. On the basis of the literature survey one can state that the composite coatings based on a matrix of the so called ”soft metals” (Cu, Zn, Cd, Ag) have not been studied extensively. At the same time, the copper composite coatings, especially those containing diamond powder, can be utilized for the finishing treatment of hard materials (corundum, hard alloys, etc.), as in the soft copper matrix, in the course of operation of the instrument, the small particles of the processed material are being included and in this way they do not damage its surface. Cubic beta-BN, designated as сBN, is also known under the names “borazone”, ”cubonite”. In the form of grains sized from 40 to 500 m, it is incorporated in metal matrices for fabrication of tools for grinding and polishing metal products to a high class of roughness. So far, there is no information in the literature of obtained copper composite coatings with co-deposited сBN in them, deposited onto flexible polymer substrates. The aim of the investigations in the presented work was to obtain under laboratory conditions of grinding disks, whose working surfaces are made of electroless composite Cu/D or Cu/cBN layers, deposited on flexible substrates of polyethylene therephtalate (PET). The disks thus were obtained subjected to tribilogical tests in order to determine their polishing effect.

44

Experimental Disks of flexible PET with a diameter of 7 cm2 were used as substrates for electroless deposition of the composite copper coatings. They were subjected to preliminary treatment by the following technological scheme: etching in an alkaline solution; pre-activation in 3М НСl; activation in a colloidal solution of PdCl2; acceleration in an alkaline solution. The so treated samples-supports were immersed in a solution for electroless copper plating, which is investigated in detail in Ref. 1. The main components of the solution are copper sulphate (10.0 g/l) and formaldehyde as a reducing agent (10.0 g/l). Na2-EDTA (40.0 g/l) is used as a complex-forming agent, and also used are different stabilizers, buffering substances, etc. To this basic solution, various type of high-hardness disperse particles of diamond (D) or cubic boron nitride (cBN), with grain size in the range 7-125 µm, in concentration of 5.0 g/l, were added. The experiments were conducted with a working solution with рН = 12.8÷13.0, Т = 45 С, deposition time 5 h, and in a hydrodynamic regime, corresponding to 2 min air stirring of the solution with an air flow – 100 ml/min/250 ml electrolyte followed by 10 min of rest. The disperse particles were wetted beforehand in 0.01 g/l sodium laurylsulphonate (SLS) solution. The mass (Δm) of the deposited coating was determined gravimetrically – based on the difference in the mass of the samples before (M0) and after metallization (М), i.е. Δm = M – M0. Since the PET samples have a well developed (not adequately defined) surface, for the subsequent calculation of the thickness of the obtained composite films the term “conditional thickness” (δ, µm) of the coating was used. The morphology and structure of the coatings and the distribution of the co-deposited particles over their surface were investigated by means of scanning electron microscopy (SEM) with an electron microscope JSM 6390 (Japan). The average number of co-deposited disperse particles per square centimeter (N/сm2) was determined by visually counting their number on the SEM micro-photographs of the composite coating (counting was made in at least three randomly selected zones at magnification of х200, and then the average of the obtained values was taken). The tribological investigation of the obtained composite layers were conducted on a homemade device on which the samples subject to grinding (limestone and two types of marble with cylindrical shape and dimensions Ø = 25 mm and L = 25 mm) were fixed (flatparallel to the surface of the prepared by us polishing disk), which made possible calibration of the desired pressure of the disk on the treatment object. The polishing effect of the investigated disks was determined on the basis of measurements with a Perthen profilographprofilemeter of the values of the coefficients, characterizing the change in the surface smoothness of the polished specimens: Ra (polishing effect) and Rz (change in roughness of the substrate/coating system), in accordance with a technique, described in Ref. 2. Results and discussion Electroless copper composite coatings The composite copper coatings containing diamond particles of various sizes: D 7/10 µm, D 14/20 µm and D 63/75 µm were obtained and investigated.

45

a

b

c d Fig. 2. SEM-micrographs of the surface of the composite copper coatings in which are included: a) non metallized in advance D 7/10 µm; b) non metallized in advance D 14/20 µm; c) non metallized in advance D 63/75 µm; d) metallized in advance D 63/75 µm. From the SEM-micrographs (Fig. 2a, b, c) and the data summarized in Table I it is seen that the number of co-deposited particles decreases with the increase in the size of the particles. In our previous investigations 1, 3 we found out that the number of co-deposited particles at a size of the diamond particles D 14/20 µm, can meets the requirements for the manufacturing of abrasive tools. Table I. Influence of the size of diamond particle on the conditional thickness of the composite coating and number of the co-deposited in it particles. D 7/10 μm D 14/20 µm D 63/75 µm non D 63/75 µm metalized in metalized in advance advance Δm, g 0.0496 0.0471 0.0799 0.1354 (δ, µm) (6.33) (6.01) (10.20) (17.29) 2 N/cm > 220 000 58 000 5 900 > 100 000 (~ 90 %) When the size of the disperse particles was above 63/75 µm, to ensure their better codeposition in the composite coating, they had to be metalized beforehand prior to their addition to the working solution. The technological scheme included the following operations: wetting in aqueous solution of SLS; treatment with 3М НСl; activation in a colloidal solution of РdCl2; chemical metallization – the electrolytes’ conditions and composition are similar to the obtaining of composite Cu/D and Cu/cBN coatings on РЕТ. The SEM-micrographs (Fig. 2 c-d) are shown that with a greater dispersoid size a considerably greater number of co-deposited particles are observed in the composite coatings, when they are metalized in advance. The next step of our investigations continued with obtaining and investigation of composite copper coatings with included in them particles of cubic boron nitride, characterized with sizes: cBN 50/63 µm and cBN 100/125 µm. The results obtained in Ref. metalized in advance.

4

give grounds to conduct the investigations only with cBN

46

a b Fig. 3. SEM-micrographs of the surface of the composite copper coatings with metalized in advance: a) cBN 50/63 μm; b) cBN 100/125 μm. The results from the SEM-micrographs (Fig. 3) and the data summarized in Table II show that the thickness and number of co-deposited particles decrease with increasing the size of cBN. Thus, the data obtained for the two sizes of the dispersoid can meet the requirements for the manufacturing of abrasive tools. The tribological investigation of the obtained composite coatings During the tribological tests, measurements were carried out on the values of Ra and Rz of samples of limestone “Vratchanski”, marble “Illinden” and marble “Strandja” polished with polishing disks (composite coatings Cu/non-metalized D and Cu/metalized cBN), with pressure on the polishing disk of 0.35 kg/cm2 and rotation speed of the disk of 1000 min-1, and successive change of the disks in the direction of decreasing the size of the particles of the codeposited dispersoid. The polishing time with every disk was 8 min. Table II. Influence of the size of metalized in advance particle of cBN on the conditional thickness of the composite coating and the number of co-deposited in it particles. cBN 50/63 μm cBN 100/125 μm Δm, g 0.2877 0.2082 (δ, µm) (36.74) (26.59) N/cm2 > 150 000 (~ 100 %) > 100 000 (~ 90 %) The histograms (Fig. 4) are shown the results regarding the polishing effect, after polishing the selected samples with the obtained disks. The achieved values of the coefficients Ra and Rz fully meet the requirements of industrial practice for final surface processing of similar materials. Conclusions The obtained copper coatings was seen fine-grained morphology, which favours the good capture of the disperse particles during the obtaining of the composite coatings. From the conducted investigations it was found that preliminary metallization of the disperse particles, increases their number co-deposited in the composite coating, irrespective of their type, in comparison with the case when they are not metalized in advance. The data about the polishing effect of polishing disks, obtained experimentally, on samples of limestone and two types of marble show that the values of the coefficients, characterizing the change in the surface smoothness, Ra and Rz, meet the requirements of industrial practice for final surface processing of similar materials.

47

Fig. 4. Results from tribological investigation of the obtained composite copper coatings. Acknowledgements The authors are grateful for the financial help of Project BG051PO001-3.3.06-0038 funded by OP Human Resources Development 2007-2013 of EU Structural Funds. References 1. Georgieva M., Petrova M., Dobrev D., Velkоva E., Stoychev D.: Mater. Plast. 48, 269 (2011). 2. Stoychev D., Dobreva E., Razkazov N., Stoycheva M., Koteva N.: Bulg. Chem. Commun. 46, 73 (2014). 3. Georgieva M., Petrova M., Dobrev D., Velkоva E., Stoychev D.: Materiale Plastice 49, 41 (2012). 4. Georgieva M., Razkazov N., Petrova M., Avdeev G., Dobrev D.: Journ. Trans. Instit. Met. Fin. 91, 96 (2013).

48

Electrochemical and Spectral Analysis of Cytosine and Guanine Homooligodeoxynucleotides (Elektrochemická a spektrální analýza cytosinových a guaninových homooligodeoxynukleotidů) a

Libor Gurecký a, and Libuše Trnková a,b Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, 625 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Central European Institute of Technology – CEITEC, University of Technology, Technicka 10, 616 00 Brno, Czech Republic, [email protected]

Abstract Oligodeoxynucleotides (ODNs) with repetitive cytosine (C) or guanine (G) sequences are observed in the promoter region of the oncogenes and of human telomeric DNA. Here we present electrochemical and spectral studies of short C or G homo-ODNs in solutions with different pH. Electrochemistry was represented by linear sweep or cyclic voltammetry in connection with a hanging mercury drop electrode (HMDE). As a spectral method circular dichroism was used. It was found that cytosine ODNs form stable structures, the so-called imotifs and guanine ODN structures form tetraplex via a G-quartet. Both structures are dependent on pH and the ODN chain length. Key words: Oligodeoxynucleotides (ODNs), Homo-ODN, Cytosin (C), Guanin (G), Cyclic Voltammetry (CV), Linear Sweep Voltammetry (LSV), Elimination Voltammetric procedure (EVP), Circular Dichroism (CD). Úvod DNA, jakožto nositelka genetické informace, zaujímá zpravidla strukturu pravotočivé dvoušroubovice, nicmén její opakující se sekvence mohou za určitých podmínek vytvořit struktury levotočivé Z-formy, podmín né například multiplexy, i-motivem, G-kvartetem. Je obecn známo, že oligodeoxynukleotidy ( DN) bohaté na cytosin, mohou ve slab kyselých roztocích vytvářet strukturu tzv. i-motivu, jež obsahuje střídající se hemiprotonované C – C+ párování bazí (Hoogsteenovo párování). Bylo prokázáno, že zejména kyselé pH a přítomnost iont podporuje tvorbu i-motiv 1-3. Doposud bylo navrženo, že formace t chto struktur se vyskytuje jak v centromerických tak telomerických oblastech lidských chromozom a objevily se i spekulace, že jejich přítomnost koreluje s expanzí opakujících se tripletových sekvencí, jež jsou spojovány s neurologickými poruchami (syndrom fragilního chromozomu X, Huntingtonova choroba). Tyto sekvence jsou přítomny v regulačních oblastech u více než 40% všech gen , včetn známých onkogen , a proto jsou biologicky opravdu velmi d ležité 4-7. Výzkum je orientován na metody spektrální (UV-Vis, CD, NMR), rentgenostrukturní a molekulov dynamické, ale v poslední dob je tento výzkum, s návazností na vývoj biosenzor , úsp šn doplňován metodami elektrochemickými. Ty vyžadují elektroaktivitu zkoumaného materiálu, což znamená, že podléhá redukčním, oxidačním a adsorpčním zm nám. Redoxní chování DN obsahující r zné počty cytosin bylo studováno pomocí lineární sweep voltametrie (LSV), kde ve slab kyselých pufrovaných roztocích na visící rtuťové kapkové elektrod (HMDE) cytosin (C) poskytuje redukční signál. Tyto signály nejsou siln závislé pouze na pH, ale i na iontové síle a jist i na počtu cytosin v oligonukleotidovém řet zci. Pro studium redoxního chování guaninu byla využita cyklická voltametrie, kdy guanin poskytuje na HMDE charakteristický oxidační signál (tzv. G pík), korespondující s oxidací redukovaného produktu guaninu (7,8 – dihydrogenguanin) probíhající při velmi negativních potenciálech (vyšší než -1,6 V) a překrývající se s procesem vylučování vodíku 8. Cílem práce byla studie krátkých cytosinových a guaninových homo-

49

ODN obsahujících r zný počet cytosin (x = 3, 4, 5, 6, 9) a guanin (y = 3, 6, 9) v závislosti na pH pufrovaného roztoku pomocí voltametrických a spektrálních metod. Dále byly výsledky obou dvou metod porovnány a ukázaly rozdíly v chování DN v homogenním prostředí (roztoku) a heterogenním prostředí (nabité fázové rozhraní elektroda/elektrolyt). Součástí předkládané práce je i zjišťování zm n terciární struktury uvedených homo-ODN v d sledku zm ny pH roztoku, popřípad iontové síly. Detailní studie jejich elektrochemických vlastností bude podkladem pro vývoj správného biosenzoru, umožňujícího citlivou detekci uvedených homo-ODN 9-13. Experimentální část emikálie Krátké syntetické DN: dC3,4,5 – Thermo Fisher Scientific (Ulm, Germany); dC6,9 ; dG3,6,9 – Integrated DNA Technologies (Inc. USA); kyselina fosforečná – Penta Chrudim, 85 %; kyseliny octová – ledová, Sigma Aldrich s.r.o., St. Louis, USA, 100 %; hydroxid sodný – Sigma Aldrich s.r.o., St. Louis, USA, ACS ≥ 99,0 %; MILLIPORE (MiliQ) voda (18,2 MΩ.cm). Aparatura Všechna m ření byla provedena na potenciostatu Autolab PGSTAT30 (Metrohm Czech Republic) propojeného s VA Stand 663 spojeného s PC s nainstalovaným softwarem GPES 4.9. Experimenty byly provedeny při pokojové teplot (23oC). pH acetofosfátových pufr bylo stanoveno Hamilton Single Pore Glass elektrodou spojenou s pH metrem CyberScan PC5500 (Eutech Instruments). Ke kalibraci pH elektrody bylo použito Hamilton Duracal pufr (4.01 ± 0.01 a 7.00 ± 0.01) z Hamilton Bonaduz AG, Switzerland. HMDE s efektivní plochou 0,3 mm2 sloužila jako pracovní elektroda; UV/Vis Spektrometr UNICAM UV 4 s propojením na software Vision; Chirascan CD spektrometr (applied photopfysics, United Kingdom) Výsledky a diskuze Voltametrickou analýzou oligonukleotid na HMDE byly nalezeny redukční a oxidační píky jednotlivých DN, které m nily svou hodnotu v závislosti na pH pufru a rychlosti polarizace. Pozornost byla soustřed na především na elektrochemické a spektrální charakteristiky dCx a dGy v závislosti na pH. Ze závislosti DN dCx při pH 3,51, kdy doba akumulace ODN na povrchu elektrody byla 2 sekundy a rychlost polarizace byla 400 mV/s (Obr.1A), lze díky vyšší kyselosti pufru (vyšší koncentrace H+ iont protonující řet zec) odvodit, že vyšší DN (vyjma dC3) tvoří strukturu s i-motivem a nápadná je i podobnost sudých a lichých derivát . Je tedy možné, že sudý/lichý počet C zaručuje podobné elektrochemické vlastnosti a uspořádání terciární struktury s i-motivem. U ODN dC3 byla pozorována odlišnost v podob vyšších redukčních signál , navzdory nepřítomnosti i-motivu a nízkému počtu C, kterou lze vysv tlit úplnou redukcí řet zce. Zachováním všech podmínek a zvýšením pH pufru na hodnotu 5,4, jsme pozorovali zm nu vlastností jednotlivých vzork (Obr. 1B). Výška redukčního píku u dC3 se tém ř zdvojnásobila, dC9 vykázala výrazný pokles redukčního píku, jež byla zp sobena konformační zm nou struktury (snížení pH) do mnohem uzavřen jší formy, která nepodléhá redukci tak snadno. Při zm n pH pufru na 6,8 DN dC3 ztrácí zcela své redukční vlastnosti, dC9 se dostává do svého maxima a u dC5 se redukují již jen struktury bez i-motiv . Idea, že se zm na struktury DN projeví i v hodnotách difúzních koeficient , byla realizována a bylo potvrzeno, že pH pufru indukující tvorbu i-motiv , výrazn ovlivňuje difúzní schopnosti DN. Při nízkých hodnotách pH difúze kopíruje hodnoty molekulových hmotností, naopak při vyšších pH tento trend nebyl prokázán a difúze se řídí terciární

50

strukturou a nábojem zkoumaných DN. Pomocí CD spektroskopie byly určeny tranzitní body, kdy DN přecházejí ze struktur s i-motivem do struktur jiných, mén uspořádaných.

Obr. 1. A LSV ODN dCx, pH 3,51; polarizační rychlost 400 mV/s. B. LSV ODN dCx pH 6,8. Pro m ření DN na rtuťové elektrod (HMDE) pomocí cyklické voltametrie jsme použili trojici oligonukleotid : dG3, dG6, dG9. Výsledky pokus nám m ly poskytnout informaci o kvadruplexových strukturách, které ODN je tvoří a jaká je jejich stabilita při r zných pH a rychlostech polarizace. Z porovnání DN v pufru o pH 5,87 a rychlosti polarizace 400 mV/s (Obr.2A) je evidentní, že elektrochemické vlastnosti jednotlivých DN se liší a délka řet zce je ovlivňuje výrazným zp sobem. U dG9 byl pozorován dvojpík, který u kratších řet zc není příliš výrazný, dG3 preferuje negativn jší pík (snadn jší oxidace) a dG6 preferuje pozitivn jší pík náročn jší oxidace. Zvýšením pH na 6,62 byla pozorována zm na u dG9 vymizením druhého píku a zvýšením potenciálového rozsahu signálu. U DN dG3 a dG6 došlo ke zm nám hodnot potenciál (Obr.2B). Výsledky CD spekter prokázaly, že v námi m řeném rozsahu pH hodnot (4,3-7,0) by nem lo k žádným zm nám terciární struktury docházet. Rozdílné vlastnosti C a G DN při r zných pH mohou pomoci k vývoji biosenzor zam řených na tyto sekvence. Z našich m ření se zdají být zatím vhodn jšími kandidáty DN bohaté na C, jelikož rozdílnost elektrochemických a spektrálních vlastností v m řeném pH rozsahu je mnohem rozmanit jší, tudíž selektivita biosenzoru m že být mnohem vyšší.

B

A

Obr. 2A CV ODN pH 5,87; rychlost polarizace 400 mV/s. Obr. 2B CV ODN dGy pH 6,62 Závěr Při studiu cytosinových DN jsme zjistili, že nar stající počet C v řet zci umožňuje tvorbu stabiln jších komplex , které jsou schopny udržet si redukční vlastnosti i při tém ř neutrálním pH a že samotné pH velmi ovlivňuje formaci t chto struktur. Při studii guaninových DN bylo zjišt na schopnost tvorby multiplex všech tří studovaných vzork ODN a jejich stabilita 51

je stejná v našem aplikovaném pH rozmezí, což potvrdily i m ření pomocí CD spektroskopie. Záv rem lze konstatovat, že výsledky této studie: (a) pomáhají hloub ji pochopit rozdílné chování cytosinových a guaninových homo-oligodeoxynukleotid v roztoku a na nabitém fázovém rozhraní elektroda/elektrolyt, (b) dávají podn ty pro studium dalších ODN a (c) poskytují pomoc při návrhu biosenzoru citlivého na ODN. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu: CEITEC - Central European Institute of Technology Project CZ. 1.05/1.1.00/02.0068, a projekt : MUNI/A/0972/2013 a LH 13053 KONTAKT II od MŠMT České republiky. Literatura 1. Rosypal S.: Úvod do molekulární biologie, První díl. Brno, 1996 2. Batchelor-McAuley Ch., Wildgoose G. G., Compton R. G.: Biosensors and Bielectronics 24, 3183 (2009). 3. Žídek L.: Strukturní bioc emie, Brno, Masarykova univerzita, 2010. 4. Leroy J-L., Guéron M., Mergny J-L., Hélène C.: Nucleic Acid Research 22, 1600, (1994). 5. Choi J., Kim S., Tachikawa T., Fujitsuka M., Majima T.: J. Am. Chem. Soc. 133, 16146 (2011). 6. Kypr J., Kejnovská I., Renčiuk D., Vorlíčková M.: Nucleic Acid Research 37, 1713 (2009). 7. Vorlíčková M., Kejnovská I., Bednářová K., Renčuik D., Kypr J.: Chirality 24, 691 (2012). 8. Studničková M., Trnková L., Zet k J.:Biochem. & Bioenerg. 21, 83 (1989). 9. Dryhurst G.: Electrochemistry of Biological Molecules, Academic Press, Inc, New York, 1977. 10. Paleček E., Jelen F., Trnková L.: Gen. Physiol. Biophys. 5, 315 (1986). 11. Jelen F., Paleček E.: Biophys. Chem. 24, 285 (1986). 12. Fisher A.C.: Electrode dynamics, Oxford University Press, 1996. 13. Oldham K. B., Myland J. C.: Fundamentals of Electrochemical Science, Academic press, San Diego, California, 1994.

52

Multichannel Scanning Droplet Cell Microscopy for Surface Patterning with Subsequent Corrosion Studies and Downstream Analytics Martina Hafner a, Jan Phillip Kollender b, and Achim Walter Hassel a,b Christian Doppler Laboratory for Combinatorial Oxide Chemistry at the Institute for Chemical Technology of Inorganic Materials, Johannes Kepler University Linz, Altenberger Str. 69, 4040 Linz, Austria, E-mail: [email protected] b Institute for Chemical Technology of Inorganic Materials, Johannes Kepler University Linz, Altenberger Str. 69, 4040 Linz, Austria a

Abstract A special type of scanning droplet cell microscopy (SDCM) is presented, which allows electrochemical deposition as well as chemical and/or electrochemical dissolution and corrosion studies coupled with downstream analytics. The multichannel SDCM addresses small areas on the sample surface where the desired reactions take place. This SDCM is either been used for homogeneous substrates which are probed by the multichannel providing different reaction conditions or for combinatorial material libraries which can be scanned by the multichannel SCDM setup for high throughput analysis. Furthermore the used electrolyte is analyzed by downstream analytics like UV-Vis spectroscopy, atomic absorption spectrometry or inductively coupled plasma mass spectrometry. Key words: Thin film, SDCM, Electrochemical deposition, Corrosion study, High throughput. Introduction Efficiency and speed are the driving forces for high throughput analysis which received an increased interest in many scientific fields for example electrochemical investigations like corrosion studies, electrocatalysis or sensing. Methods and instruments are in a steady process of development to improve the performance ability 1. In order to study thin film libraries by a combinatorial approach, scanning instruments or methods are successfully used for example the scanning droplet cell microscopy (SDCM). This method was introduced by Hassel and Lohrengel and presents a suitable technic for various local electrochemical measurements like cyclic voltammetry, anodization or corrosion monitoring 2. Investigations on the sample surface are an important aspect in order to characterize new materials. Dissolution experiments are a helpful tool to test the chemical and/or the electrochemical stability of the investigated material. Analyzing the dissolved species or the corrosion product may help to understand the underlying mechanism of the corrosion process of the material. Furthermore, such studies can also be used for investigating new coating methods or barrier layers. A benefit of flow cells coupled with downstream analytics is the option to study the time dependency of chemical reactions which can be observed when the sample surface is in contact with the flowing electrolyte 3. Experimental Using a 3D printing technique, a multichannel flow profile was obtained in a polymer block allowing the electrolyte to contact the sample surface on an area with a length of 18 mm. Each channel can be individually addressed by separated fittings for micro fluidics and electrodes. The cell is pressed on the sample while a laser cut rubber pad with exact recesses is used for sealing. A peristaltic pump was used to transport the electrolyte with a constant flow rate into

53

the cell and further into the analysing unit while the own pump of the AAS (HITACHI Z8230 polarized Zeeman atomic spectrophotometer with background correction) or the ICP-MS (ThermoFisher Scientific, iCAP-Q with quadrupole mass analyser) was used as an additional suction supporter. For electrochemical investigation any potentiostat can be used. The time resolved measurements were recorded by the corresponding software of the analyser used. Thin film libraries were produced by vapour phase deposition using a self-developed thermal co-evaporation system. In the formation process, the material is first electrically heated up until its evaporation point is reached. Due to the condensation of the evaporated material on the substrate, a thin film is prepared. The simultaneous use of two (or more) evaporation sources and the independent control of the applied electrical power of the evaporation sources ensure the formation of compositional spreads (Fig. 1). The formation was done on two borosilicate glass substrates (microscope slides, 26 × 76 mm, VWR International GmbH) in order to obtain two identical thin film samples. The evaporation process was performed in vacuum (10-5 Pa). Electrical power and pressure indication as well as thickness monitoring by high resolution crystal quartz micro-balances (QCM) was done to ensure a controlled evaporation process 4.

Fig. 1. Schematic sketch of the thermal co-evaporation process. Raw materials used as source for the thin film deposition were high purity metals (>99.95 %). Chemicals used for electrolyte and sample preparation were p.A. grade. Reference and counter electrode made of Au and Ag wires (99.999 %, Wielandt Dentaltechnick, Germany) where prepared in borosilicate glass capillary 5. Results and discussion A fully automatic computer controlled setup is used to move the multichannel SDCM along all three axes which allows a precise positioning of the measuring head. The electrolyte is pumped into the cell and touches the sample surface along the elongated flow channel (Fig. 2). In- and outlet as well as the flow channel are precisely aligned in order to avoid any flow rate losses. Due to the elongated flow channels possible occurring turbulences or asymmetric flow characteristics will be prevented and a homogeneous laminar flow pattern can be achieved.

54

Fig. 2. Schematic sketch of the multichannel SDCM. The performance of the multichannel-SDCM was tested on thermally evaporated thin film libraries. Figure 3 shows an EDX analysis of an Al-Cu combinatorial thin film. Measurements were done along the entire compositional spread in order to obtain a stoichiometric map of the sample. The compositional gradient for Al and Cu was approximately 46 at.% which corresponds to a resolution of 0.6 at.% per mm.

Fig. 3. EDX results of Al-Cu thin film. Local stability tests as well as electrochemical investigations were performed using the multichannel SDCM. In order to quantify the dissolved specie, the system was coupled with downstream analytics like UV-Vis spectroscopy, AAS or ICP-MS. Conclusions A novel type of SDCM is introduced, which can be used for surface patterning by electrochemical deposition as well as chemical or electrochemical dissolution experiments 55

and corrosion studies. The system is coupled with downstream analytics to study the influence of the electrolyte used or the dissolved specie. The elongated shaped low channels benefit a homogeneous laminar flow pattern which provides best conditions for both the transport of electrolyte as well as dissolved material. Acknowledgements The financial support by the Federal Ministry of Economy, Family and Youth and the National Foundation for Research, Technology and Development is gratefully acknowledged. References 1. Maradre A. I., Hassel A. W., Rev. Sci. Instr. 80, 046106 (2009). 2. Hassel A. W., Lohrengel M. M.: Electrochim. Acta 42, 3327 (1997). 3. Volovitch P., A. Allely, K. Ogle: Corros. Sci. 51, 1251 (2009). 4. Hafner M., Mardare A. I., Hassel A. W.: Phys. Status Solidi A 210, 1006 (2013). 5. Klemm S. O., Kollender J. P., Hassel A. W.: Corros. Sci. 53, 1 (2011).

56

Redox DNA Labeling – from Simple DNA Detection by Osmium Tetroxide Complexes Modification to Ratiometric Sequence Analysis (Redox značení DNA – od jednoduché detekce DNA pomocí modifikace komplexy oxidu osmičelého k ratiometrické analýze sekvencí) Lud k Havran a, Jana Balintová b, Pavlína Vidláková a, Hana Macíčková-Cahová b Hana Pivoňková a, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics ASCR v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, Email: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR v.v.i., Flemingovo nám. 2, 16610 Prague 6, Czech Republic Abstract DNA is electroactive molecule producing analytically useful intrinsic voltammetric signals. For some applications is a useful use redox active tag to improve specificity of the analysis. One from approaches how to prepare DNA bearing redox label is its modification by complexes of osmium tetroxide with nitrogen ligands. This method find wide used in highly sensitive DNA detection and in development of electrochemical DNA hybridization sensors. Another possibility for preparation of redox labeled DNA is incorporation of redox tags modified deoxynucleotide triphosphates by DNA polymerases. In this contribution will be demonstrated application of various redox labels in electrochemical analysis of DNA. Key words: DNA electrochemical analysis, Chemically modified DNA, DNA sensors, Redox labels. Úvod Elektrochemické metody našly široké uplatn ní jak v analýze DNA a studiu jejích interakcí s r znými látkami, tak i při vývoji senzor pro detekci hybridizace DNA. DNA je přirozen elektroaktivní molekula, která poskytuje na r zných typech pracovních elektrod řadu analyticky využitelných elektrochemických signál 1. Pro n které typy analýz, zvlášt pak při vývoji DNA hybridizačních senzor , se osv dčilo užití redox aktivních značek 2. Jedním ze zp sob jak zavést do DNA elektroaktivní značku je její modifikace pomocí komplex oxidu osmičelého s dusíkatými ligandy ( s,L). Vznikající adukty poskytují na rtuťových i uhlíkových elektrodách elektrochemické signály v d sledku redukce/oxidace atomu osmia v molekule aduktu 3. Tato metoda značení DNA našla uplatn ní ve vysoce citlivé analýze DNA 4 a také v analýze nukleotidových sekvencí 5. Další z metod pro přípravu redox značené DNA je enzymatická inkorporace značených deoxyribonukleotid trifosfát (dNTP) pomocí DNA polymeráz. Značené dNTP lze připravit jednoduchou cross-coupling reakcí ve vodném prostředí 6. V tomto přísp vku bude demonstrována aplikace r zných redox aktivních značek v elektrochemické analýze DNA. Experimentální část Modifikační reakce DNA pomocí s,L probíhala ve vodných pufrovaných roztocích. V případ analýzy na visící rtuťové kapkové elektrod (HMDE) byl nezreagovaný s,L odstran n dialýzou. Užití elektrody z pyrolytického grafitu (PGE) umožňovalo přímou analýzu reakčních sm sí, kdy byl nezreagovaný s,L extrahován z povrchu pracovní elektrody organickým rozpoušt dlem 7. Značené dNTP byly syntetizovány pomocí přímé jednokrokové cross-coupling reakce halogenidovaných dNTP ve vodné fázi. Značená DNA pak byla připravována inkorporací modifikovaných dNTP pomocí metody prodlužování primeru (primer extension method (PE )) za použití t chto DNA polymeráz (Klenow (exo-) DNA polymerase fragment, DyNAzyme, Vent(exo-), Pwo - New England Biolabs (UK),

57

PE LAB (SRN), Finnzymes (Finland)). Pr b h PE byl kontrolován elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Produkty PE byly separovány pomocí kitu iagen Nucleotide Removal nebo pomocí magnetických kuliček pokrytých streptavidinem (Dynabeads® M-270 Streptavidin, Dynal A.S. Norsko) - v tomto případ byl oligonukleotid sloužící jako templát na konci modifikován biotinem, který se specificky váže na streptavidin. Všechna voltametrická m ření byla provád na za použití potenciostatu/galvanostatu Autolab (Ecochemie, Holandsko) v kombinaci s elektrodovým systémem VA-stand 663 (Metrohm, Herisau, Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita PGE nebo HMDE, referenční elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. Analýza produkt PE a adukt DNA s s,L byla provád na adsorptivní přenosovou rozpoušt cí voltametrií s vnuceným pravoúhlým nap tím (AdTS S V). Značené dNTP byly analyzovány pomocí konvenční S V a cyklické voltametrie (CV). Všechna m ření byla provád na při laboratorní teplot . N které typy m ření byly provád ny za nepřítomnosti kyslíku, který byl odstran n vybubláváním argonem. Výsledky a diskuse DNA s s,L poskytují kovalentní adukty, které jsou elektroaktivní. V DNA reagují především thyminové zbytky v jednořet zcové DNA. Na rtuťových i uhlíkových elektrodách poskytují elektrochemické signály v d sledku redukce/oxidace atomu osmia v molekule aduktu. Na HMDE vzniká také signál spojený s katalytickým vylučováním vodíku v d sledku přítomnosti aduktu na povrchu elektrody. Ten byl v minulosti využit pro velmi citlivé stanovení modifikované DNA. Hlavní výhodou aplikace PGE v analýze adukt DNA s Os,L (především v případ použití 2,2’bipyridinu (bipy)) je možnost přímé analýzy reakčních sm sí pomocí extrakce nenavázaného s,L z povrchu elektrody organickým rozpoušt dlem. Při vývoji elektrochemických senzor DNA hybridizace bylo s,L použito zejména ke značení signální sond (krátkých DN nesoucích sekvenci komplementární k sekvenci hledané v cílové DNA a oligo T úsek, který je cílem modifikační reakce). Značení pomocí s,bipy bylo také použito k detekci poškození DNA 8. Cross-coupling reakcí byly připraveny dNTP značené nitro nebo amino skupinou 9, antrachinonem 10 a benzofurazanem 11 (Obr. 1). Jejich elektrochemické chování bylo studováno pomocí elektrochemických metod na HMDE a PGE. Tyto dNTP pak byly inkorporovány do molekul DNA pomocí PE . Připravené značené oligonukleotidy byly analyzovány na uhlíkových a rtuťových elektrodách. Kombinace dvou r zných redox aktivních značek (nitroskupiny a benzofurazanu) umožňuje ratiometrickou analýzu nukleotidových sekvencí DNA, kdy normalizované plochy voltametrických pík přesn odpovídají zastoupení komplementárních bází v DNA templátu 11. Tento typ analýzy umožňuje například detekci mutací v DNA včetn analýzy bodových mutací – zám n jednoho nukleotidu. Závěr Redox značení DNA reakcí s komplexy oxidu osmičelého a pomocí enzymatické inkorporace značených dNTP do DNA za užití DNA polymeráz bylo úsp šn použito v r zných oblastech elektrochemické analýzy DNA včetn vývoje senzor hybridizace DNA. Kombinace dvou r zných redox aktivních značek umožňuje radiometrickou analýzy nukleotidových sekvencí.

58

Obr. 1 dNTP značené: nitroskupinou (A), aminoskupinou (B), antrachinonem (C), benzofurazanem (D). Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu GAČR (P206/12/2378) a projektu Ministerstva školství, mládeže a t lovýchovy CZ 1.07/2.3.00/30.0019. Literatura 1. Paleček E., Bartošík M.: Chem. Rev. 112, 3427 (2012). 2. Fojta M., Havran L., Pivoňková H., Horáková P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936 (2011). 3. Fojta M., Kostečka P., Pivoňková H., Horáková P., Havran L.: Curr. Anal. Chem. 7, 35 (2011). 4. Paleček E., Hung M. A.: Anal. Biochem. 132, 236 (1983). 5. Fojta M., Havran L., Kizek R., Billová S., Paleček E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004). 6. Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 6, 2233 (2008). 7. Fojta M., Havran L., Kizek R., Billova S., Talanta 56, 867 (2002). 8. Havran L., Vacek J., Cahová K., Fojta M.: Anal. Bioanal. Chem. 391, 1751 (2008). 9. Cahová H., Havran L., Brázdilová P., Pivoňková H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Edit. 47, 2059 (2008). 10. Balintová J., Pohl R., Horáková P., Vidláková P., Havran L., Fojta M., Hocek M.: Chem. Eur. J. 17, 14063 (2011). 11. Balintová J., Plucnara M., Vidláková P., Pohl R., Havran L., Fojta M., Hocek M.: Chem. Eur. J. 19, 12720 (2013).

59

Determination of Methylviolet 2B Using Polarographic and Voltammetric Methods at Mercury Electrodes (Polarografické a voltametrické stanovení methylové violeti 2B na rtuťových elektrodách) Eva Horáková, Jiří Barek, and Vlastimil Vyskočil Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE "Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract DC tast polarography and differential pulse polarography at a dropping mercury electrode and DC voltammetry, differential pulse voltammetry and adsorptive stripping differential pulse voltammetry (AdSDPV) at a hanging mercury drop electrode (HMDE) were used for determination of methylviolet 2B (MV) in Britton-Robinson buffer pH 4.0. The lowest limit of quantification of MV, LQ = 13 nmol L−1, was obtained using AdSDPV at HMDE. Key words: Methylviolet 2B, DC tast polarography, Differential pulse polarography, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Adsorptive stripping differential pulse voltammetry, Mercury electrodes. Introduction There is an ever increasing the demand for determination and monitoring of trace amounts of hazardous compounds in the environmental and clinical samples. Many sensitive chromatographic methods for the determination of hazardous compounds in air, water and biological matrices have been developed 1,2, but polarographic and voltammetric methods offer less expensive and competitive alternatives 3,4. Methyl violet (MV) (Fig. 1) belongs to the group of triphenylmethane dyes. They are used in paper dyeing, as inks and pH indicators 5. For their bactericidal and fungicidal effects, they are used in medical sciences 6. They are potentially harmful for humans, and they and their metabolites may also accumulate in fish 7,8. Because of many other negative effects 9-11, the use of some of them is limited by laws. Therefore, study of their biological effects 12,13, and monitoring of the occurrence in biological matrices 7,14 and environment 15 is important. Triphenylmethane dyes are electrochemically reducible 11,16, so it is possible to determine them using polarographic and voltammetric methods.

Fig. 1. Structure formula of methylviolet 2B. Experimental The stock solution of MV (c = 1 mmol L–1) was prepared by dissolving 0.3940 g of MV (Merck, Darmstadt, Germany) in 500 mL of deionized water. The stability of the stock solution was monitored by UV-Vis spectrophotometry. Britton-Robinson (BR) buffers

60

(c = 0.04 mol L–1) were prepared in a usual way. Deionized water produced by a Milli-Q Plus system (Millipore, Billerica, MA, USA) was used. All solutions were stored in glass bottles in the dark at the laboratory temperature. Polarographic and voltammetric measurements were carried out with the computer-controlled Eco-Tribo Polarograph driven by Polar Pro 5.1 (both Eco-Trend Plus, Prague, Czech Republic) in a three-electrode system with a Ag|AgCl (1M KCl) reference electrode, a platinum wire auxiliary electrode (both Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) and the appropriate working mercury electrode. All potentials were referred to the above-mentioned reference Ag|AgCl electrode. For DC tast polarography (DCTP) and differential pulse polarography (DPP), a dropping mercury electrode (DME) was used. The electronically controlled mercury drop lifetime was 880 ms and the flow rate of mercury through the capillary was 4.30 mg s−1, measured in 0.1 M KCl at a zero potential. The scan rate was 4 mV s–1. For DC voltammetry (DCV), differential pulse voltammetry (DPV) and adsorptive stripping DPV (AdSDPV), a hanging mercury drop electrode (HMDE, Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic) was used. The valve opening time was 400 ms, the mercury drop surface was 1.37 mm2, and the flow rate of mercury through the capillary was 5.13 mg s–1. The scan rate was 20 mV s–1. For DPP, DPV and AdSDPV, the pulse amplitude –50 mV and the pulse width 100 ms (with current sampling for the last 20 ms) were used. Measurements of pH were carried out using the pH meter Jenway 4330 (Jenway, Chelmsford, UK) with a combined glass electrode of the same producer. For spectrophotometric measurements, the spectrophotometer Agilent 8453 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) driven by UV-Visible ChemStation 9.01 was used. Measurements were carried out in quartz cuvettes of 1 cm optical path length. All polarograms and voltammograms were measured three times, and the limiting (Ilim) and peak current (Ip) values for the construction of calibration curves were calculated as arithmetic averages. All figures and mathematical operations were carried out using Origin Pro 8.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). The limit of quantification (LQ) was calculated using the equation: LQ = 10s/b, where s is the standard deviation of the lowest measurable concentration of 10 repetitive measurements and b is the slope of the calibration curve 17. Results and Discussion DC Tast Polarography and Differential Pulse Polarography at a Dropping Mercury Electrode The influence of the pH on the electrochemical behavior of MV (c = 0.1 mmol L−1) was studied using DCTP and DPP in BR buffers pH 2.0 – 12.0 (see Fig. 2A and 2B). At pH from 2.0 to 7.0, one well-developed wave was obtained and from pH 8.0, the second wave at more negative potentials was formed. For analytical purposes, only the first wave is useful. In spite of the highest peak current at pH 2.0, the optimum pH was chosen to be 4.0 because of the time decrease of the peak current of MV at pH ≤ 3.0. Decrease of Ip may be connected with the protonation of nitrogen atoms 16. The repeatability of the determination (RSD of 15 repeated determinations) of MV (c = 0.1 mmol L−1) using DCTP at DME was 0.56 %. The optimum medium BR buffer pH 4.0 was used for the determination of MV in the concentration range 1 – 100 μmol L−1; the current dependences on the concentration were linear in the whole calibration range. Analogous study was conducted using DPP at DME.

61

The optimum pH for the determination of MV using DPP at DME was found to be the same as for DCTP at DME, i.e., pH 4.0. RSD of the determination of MV at the concentration 0.1 mmol L−1 was 0.43 %. Under the optimum conditions (BR buffer pH 4.0), linear calibration curves were observed in the concentration range 0.1 – 100 μmol L−1. For DP polarograms of the lowest concentration range, see Fig. 3A. The attained LQ were 1.7 μmol L−1 for DCTP and 0.16 μmol L−1 for DPP. Parameters of all calibration curves are given in Table I.

-600

-1000

A

I [nA]

I [nA]

DC Voltammetry and Differential Pulse Voltammetry at a Hanging Mercury Drop Electrode With DCV MV (c = 0.1 mmol L−1) gave one or two peaks in the dependence on the pH (studied from 2.0 to 12.0). Using both DCV and DPV, for pH values from 2.0 to 5.0, two peaks were observed. For pH ≥ 6.0, they merged into one peak (see Fig. 2C and 2D). The calibration dependences were evaluated from the second peak of MV in BR buffer pH 4.0 using both DCV and DPV at HMDE. RSD of the determination of MV (c = 0.1 mmol L−1) was 0.56 % and 0.57 % for DCV and DPV, respectively. For both DCV and DPV, the calibration curves were linear in the concentration range 0.1 – 100 μmol L−1. For DP voltammograms of the lowest concentration range, see Fig. 3B. The attained LQs were 65 nmol L−1 for DCV and 45 nmol L−1 for DPV. Parameters of the calibration lines are given in Table I.

B

-800

pH 2 3 4 5

-600 -400

6

pH 2 3 4 5 6 7

8 12

-200

-600

C

-800

-1000

pH 2

-400

0

-1200 E mV

I [nA]

I [nA]

-200

[8-12]

-400 -600

7

-400

-800

-400

D

-600

-1000 -1200 -1400 E mV

pH 2

-600

3

-800

3

-400 456

-200

7

4

5

-200

0

-200

-400

-600

-800

0

-1000 -1200 E mV

62

-200

-400

-600

-800

-1000 -1200 E mV

-20

A

7 5

-70

I [nA]

-10

Ip [nA]

I [nA]

-75

6

B

7

-15

-5

-65

-650

-5

5 -10

0 0.0

0 -500

-750 -800 E [mV]

0.5 -1 1.0 c [mol L ]

3 2 1

-5

-700

0 0.0

4

0.5 1.0 -1 c [mol L ]

1

-60

-10

6

4 3

Ip [nA]

Fig. 2. DCT (A) and DP (B) polarograms at DME and DC (C) and DP (D) voltammograms at HMDE of MV (c = 0.1 mmol L−1) observed in BR buffer at different pH values. The bold lines indicate the chosen optimum pH.

-600

-700

E [mV]

-800

Fig. 3. DP polarograms at DME (A) and DP voltammograms at HMDE (B) of MV in BR buffer pH 4.0 in the lowest attainable concentration range. c (MV): 0 (1), 0.1 (2), 0.2 (3), 0.4 (4), 0.6 (5), 0.8 (6) and 1.0 (7) μmol L−1. Insets: the dependences of the peak current of MV on its concentration. Adsorptive Stripping Differential Pulse Voltammetry at a Hanging Mercury Drop Electrode To achieve a lower LQ of MV in BR buffer pH 4.0, the application of AdSDPV at HMDE was investigated. Firstly, the influence of the accumulation potential (Eacc) was tested; Eacc was changed from −100 to −600 mV, and the accumulation time (tacc) was 60 s (Fig. 4A). The best developed and the highest peak was observed at Eacc = −500 mV. The optimum tacc at Eacc = −500 mV was found to be 10 min (Fig. 4B). The calibration curve was linear in the concentration range 20 – 100 nmol L−1 (for voltammograms, see Fig. 4C). Using AdSDPV at HMDE, LQ was 13 nmol L−1. Parameters of the calibration curve are given in Table I.

B

I [nA]

-60

-20

C

6

Ip [nA]

-35

A

Ip [nA]

Ip [nA]

-20

-30 -10

5

-40

-25

4

-10

0 0

-20

50 100 -1 c [nmol L ]

3

-20

2 -15

1

0

0

0

-200 -400 -600 Eacc [mV]

0

500 1000 tacc [s]

-600

-650

-700

-750

-800 -850 E [mV]

Fig. 4. Dependences of the peak current of MV (c = 0.2 μmol L−1) in BR buffer pH 4.0 on (A) the accumulation potential Eacc when tacc = 60 s, (B) the accumulation time tacc when Eacc = −500 mV and (C) analyte concentration, Eacc = −500 mV, tacc = 600 s; c (MV): 0 (1), 20 (2), 40 (3), 60 (4), 80 (5) and 100 (6) nmol L−1. Inset for (C): the dependence of the peak current of MV on its concentration. All measured using AdSDPV at HMDE.

63

Table I. Parameters of the calibration curves for the determination of MV using polarographic and voltammetric techniques in BR buffer pH 4.0. Concentration Slope Intercept LQ Technique R2 −1 –1 [mol L ] [mA mol L] [nA] [mol L−1] DCTP at DME (2 – 10) × 10−5 −1.70 −11.5 0.9904 −6 (1 – 10) × 10 −0.71 0.05 0.9939 1.7 × 10−6 DPP at DME (2 – 10) × 10−5 −0.58 −35.3 0.9979 −6 (2 – 10) × 10 −0.66 2.99 0.9949 (1 – 10) × 10−7 −0.76 −1.16 0.9966 1.6 × 10−7 −6 DCV at HMDE (2 – 10) × 10 −0.90 −1.18 0.9983 (2 – 10) × 10−7 −0.95 −0.08 0.9989 6.5 × 10−8 −6 DPV at HMDE (2 – 10) × 10 −1.26 −1.74 0.9971 −7 (1 – 10) × 10 −1.24 0.21 0.9949 4.5 × 10−8 AdSDPV at HMDE (2 – 10) × 10−8 −1.69 −0.12 0.9953 1.3 × 10−8 Conclusion The optimum medium for the determination of MV using DCTP and DPP at DME and DCV, DPV, and AdSDPV at HMDE is BR buffer pH 4.0. The obtained limits of quantification of MV are mostly in the concentration order of 10−8 mol L−1. AdSDPV at HMDE (Eacc = −500 mV, tacc = 600 s) gave the lowest LQ = 13 nmol L−1. Acknowledgements This research was carried out within the framework of the Specific University Research (SVV260084). Financial support from the Grant Agency of the Czech Republic (Project P206/12/G151) is gratefully acknowledged. References 1. Cvacka J., Barek J., Zima J., G. Fogg A., C. Moreira J.: Analyst 123, 9R (1998). 2. Stokvis E., Rosing H., Beijnen J. H.: Mass. Spectrom. Rev. 24, 887 (2005). 3. Barek J., Fogg A. G., Muck A., Zima J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 31, 291 (2001). 4. Barek J., Moreira J. C., Zima J.: Sensors 5, 148 (2005). 5. Sabnis R. W.: Handbook of Acid-Base Indicators. CRC Press. Boca Raton 2007. 6. Balabanova M., Popova L., Tchipeva R.: Clin. Dermatol. 21, 2 (2003). 7. Andersen W. C., Turnipseed S. B., Karbiwnyk C. M., Lee R. H., Clark S. B., Rowe W. D., Madson M. R., Miller K. E.: Anal. Chim. Acta 637, 279 (2009). 8. Shen Y. D., Deng X. F., Xu Z. L., Wang Y., Lei H. T., Wang H., Yang J. Y., Xiao Z. L., Sun Y. M.: Anal. Chim. Acta 707, 148 (2011). 9. Littlefield N. A., Blackwell B. N., Hewitt C. C., Gaylor D. W.: Fund. Appl. Toxicol. 5, 902 (1985). 10. Sklenar Z.: Pediatrie pro praxi 11, 232 (2010). 11. Vachalkova A., Novotny L., Blesova M.: Neoplasma 43, 113 (1996). 12. Srivastava S., Sinha R., Roy D.: Aquat. Toxicol. 66, 319 (2004). 13. Oplatowska M., Donnelly R. F., Majithiya R. J., Glenn Kennedy D., Elliott C. T.: Food and Chemical Toxicology 49, 1870 (2011). 14. Sagar K. A., Smyth M. R., Rodriguez M., Blanco P. T.: Talanta 42, 235 (1995). 15. Sanroman M. A., Pazos M., Ricart M. T., Cameselle C.: Chemosphere 57, 233 (2004). 16. Kaye R. C., Stonehill H. I.: J. Chem. Soc. 3231 (1952). 17. Inczedy J., Lengyel T., Ure A. M.: Compendium of Analytical Nomenclature. International Union of Pure and Applied Chemistry. Zürich 1998.

64

Chronopotentiometric Determination of Organic Pollutants Using Reticulated Vitreous Carbon Electrode (Chronopotenciometrické stanovení organických polutantů s využitím síťované skelné uhlíkové elektrody) Romana Jarošová, Jiří Zima, Jiří Barek, and Hana Dejmková Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE “Supramolecular Electrochemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESC Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The utilization of electroanalytical method chronopotentiometry was tested for the determination of organic pollutants based on their oxidation and/or reduction by a constant current on a reticulated vitreous carbon electrode. Experimental parameters of chronopotentiometric measurement, such an optimal pH of Britton-Robinson buffer and oxidation/reduction current were investigated. Key words: Electrochemistry, Chronopotentiometry, Reticulated vitreous carbon electrode, Organic pollutants, Hydrazine Sulfate, 2-Nitrophenol. Úvod Chronopotenciometrie (CP) patří mezi nejstarší elektrochemické metody používané pro zkoumání vlastností látek 1, 2. d počátku minulého století se dočkala mnoha vývojových a konstrukčních zm n, což výrazn přisp lo ke snížení detekčních limit . Přestože byla chronopotenciometrie na čas vytlačena např. polarografií a voltampérometrickými metodami, patří stále mezi využívané techniky elektroanalytické chemie. Cílem této práce bylo ov řit možnost využití chronopotenciometrie pro stanovení oxidovatelných a redukovatelných organických polutant . Studovanými látkami se staly síran hydrazinia a 2-nitrofenol. První zmín ná látka, síran hydrazinia, byla vybrána jako zástupce oxidovatelných organických polutant , které při elektrochemické reakci netvoří polymerní produkty a nezp sobují tedy pasivaci elektrody. Jedná se o látku b žn používanou v pr myslu, např. při výrob raketového paliva či jako součást insekticid . Ačkoliv je síran hydrazinia genotoxický 3, 4, je používán také jako alternativní zp sob léčby rakoviny tlustého střeva, prostaty, plic, či mozku 5, 6. Síran hydrazinia je vyráb n pr myslov , avšak m že se vyskytovat v n kterých rostlinách či houbách. 2-Nitrofenol byl pro tuto studii vybrán jako zástupce látek schopných elektrochemické oxidace i redukce. 2-Nitrofenol, jakožto člen skupiny aromatických nitrosloučenin, patří k intenzivn sledovaným organickým polutant m životního prostředí; expozice této skupin látek totiž výrazn zvyšuje riziko výskytu nádorových onemocn ní 7. Jedná se o člov kem um le produkovanou látku, která se v přírod b žn nevyskytuje, avšak dostává se do ní například používáním n kterých pesticidních přípravk a rostlinných r stových stimulátor 8. Významný vliv na pr b h experiment m lo použití porézního skelného uhlíku (RVC), jakožto stavebního materiálu pracovní elektrody. RVC elektroda je pevná porézní elektroda s velkým elektrodovým povrchem a mimořádn vysokým objemem pór , složená ze skelného uhlíku. Jedná se o materiál s nízkou hustotou a tepelnou roztaživostí, odolný proti korozi,

65

s vysokou tepelnou a elektrickou vodivostí. Je užitečná hlavn v případech, kde jsou vyžadovány vlastnosti jako vysoká proudová hustota, nízký elektrický a hydrodynamický odpor 9, 10. Experimentální část Zásobní roztoky síranu hydrazinia (CAS Reg. č. 10034-93-2, Sigma-Aldrich) a 2-nitrofenolu (CAS Reg. č. 88-78-5, Riedel-de-Haën) o koncentracích 1·10-3 mol L-1 byly připraveny rozpušt ním přesn odváženého množství látky v deionizované vod . Roztoky o nižších koncentracích byly připravovány přesným řed ním zásobních roztok BrittonovýmRobinsonovým pufrem o daném pH. Všechny používané roztoky byly uchovávány v temnu v chladničce při konstantní teplot 5°C. Další použité chemikálie (kyselina octová (99%), kyselina fosforečná (85%), kyselina boritá a hydroxid sodný) byly získány od Lachema Brno, ČR. Britton v-Robinson v pufr byl připraven smísením vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 2·10-1 mol L-1 s vodným roztokem obsahujícím kyselinu boritou, fosforečnou a octovou, všechny o koncentraci 4·10-2 mol L-1. Přesná hodnota pH byla m řena digitálním pH metrem (Jenway, Essex, UK) s kombinovanou sklen nou elektrodou. K příprav vodných roztok byla použita deionizovaná voda (Millipore -plus Systém, USA). Všechna m ření byla provedena nejmén třikrát, pokud není zmín no jinak. Získané závislosti byly zpracovány metodou lineární regrese. Mez detekce (LD) byla vypočítána podle vzorce 10s/a, kde s je sm rodatná odchylka signálu pro 10 paralelních stanovení sledované látky, a je sm rnice kalibrační přímky v nejnižším koncentračním rozmezí 11. Výsledky a diskuse Oxidační stanovení síranu ydrazinia Prvním optimalizačním krokem pro stanovení síranu hydrazinia technikou chronopotenciometrie s využitím RVC elektrody bylo nalezení optimálního pH BrittonovaRobinsonova pufru. M řeno bylo pH v rozmezí 2 – 12. Zároveň s tímto optimalizačním krokem byla studována také opakovatelnost m ření při jednotlivých hodnotách pH, resp. trendy v nár stu či poklesu velikosti pík , dále jejich poloha a využitelná šířka potenciálového okna. Pro všechna optimalizační m ření bylo využito roztoku síranu hydrazinia o koncentraci 1·10-4 mol L-1. Chronopotenciogramy roztoku síranu hydrazinia v závislosti na zm n pH jsou vyobrazeny na br. 1; je z n j patrné, že testované parametry jsou zm nou pH výrazn ovlivňovány. Ačkoliv bylo nejvyššího signálu dosaženo v prostředí BR pufru o pH 4, poloha píku byla v tomto případ příliš blízká úniku základního elektrolytu. B hem zmín ných optimalizačních krok bylo také zjišt no, že v závislosti na pH prostředí dochází k výrazným zm nám v opakovatelnosti m ření; nejhorší opakovatelnosti (pro n = 20) bylo dosaženo při použití BR pufru pH 7, a to 7,21 %, naopak nejlepší opakovatelnost byla dosažena při pH 6, a to 2,44 %. Všechny zmín né skutečnosti byly brány v potaz při nalezení optimální hodnoty pH prostředí; jako optimální byla zvolena hodnota pH 5, tedy takové pH, kdy má pík jednu z nejvyšších hodnot výšky signálu, nachází se v dostatečné vzdálenosti před koncem potenciálového okna a m ření jsou dobře opakovatelná.

66

dT/dE (s/V)

600

4

5 6 8

400 10 12

200

2

0 0,4

0,6

0,8

1,0

E (V)

1,2

Obr. 1. Chronopotenciogramy síranu hydrazinia (c = 1·10-4 mol L-1), m řeno na RVC elektrod v prostředí BR pufru o pH odpovídajícím číslu křivky.

dT/dE (s/V)

Dalším studovaným parametrem při optimalizaci m ření síranu hydrazinia bylo nalezení optimálního oxidačního proudu. S využitím již nalezeného optimálního prostředí byly prom řeny hodnoty od 90 do 500 μA, přičemž při horní hraniční hodnot již nebylo možné pík vyhodnotit. Z chronopotenciometrických záznam ( br. 2) lze pozorovat, že výška pík exponenciáln klesá s nar stajícím oxidačním proudem; jako optimální byl tak zvolen proud 90 μA, kdy byla zaznamenána nejvyšší hodnota výšky píku. 800 1

600

2 3

400

4 5 6

200

7

8 9 10

0 0,8

1,0

1,2

E (V)

1,4

Obr. 2. Chronopotenciogramy síranu hydrazinia (c = 1·10-4 mol L-1), m řeno na RVC elektrod v prostředí BR o pH 5. xidační proud 90 (1), 100 (2), 125 (3), 150 (4), 175 (5), 200 (6), 250 (7), 300 (8), 400 (9) a 500 (10) μA. Nalezené optimální podmínky, tj. prostředí BR pufru o pH 5 a oxidační proud 90 μA, byly následn použity při prom ření kalibračních závislostí, a to v rozmezí 2·10−6−1·10−4 mol L-1; pro nižší koncentrace již nebylo možné získané chronopotenciogramy vyhodnotit. Parametry této závislosti (Tab. I) naznačují, že získaná kalibrační závislost je lineární v celém sledovaném rozsahu. Získaná mez detekce byla 2,1·10-6 mol L-1.

67

Tabulka I. Parametry kalibračních závislosti pro chronopotenciometrická stanovení sledovaných látek s využitím RVC elektrody. Lineární dynamický rozsah Sm rnice Úsek LD Analyt R -1 -1 -1 -1 (mol L-1) (mol L ) (s mV mol L) (s mV ) Síran hydrazinia 2·10-6 – 1·10-4 0,79 -0,57 0,9949 2,1·10-6 -7 -5 2-Nitrofenol 8·10 – 2·10 0,20 0,01 0,9995 6,9·10−7 Redukční stanovení 2-nitrofenolu Vliv pH na chování 2-nitrofenolu (c = 1·10−4 mol L−1) při chronopotenciometrii na RVC elektrod byl studován v BR pufru v rozmezí pH 2−12. Záznam chronopotenciometrických křivek ( br. 3) ukazuje, že potenciál píku se se stoupajícím pH posouvá k negativn jším hodnotám, při siln bazickém prostředí (pH 12) pak pík tém ř vymizí. Nejvyšší proud píku a nejlépe vyhodnotitelné chronopotenciogramy byly získány v prostředí BR pufru o pH 8. Závislost výšky píku na redukčním proudu byla v tomto prostředí prom řena v rozmezí 180−500 μA; jako optimální se ukázal proud 200 μA. K odstran ní kyslíku bylo použito CP skenu; ukázalo se však, že ačkoliv je potenciál pík dostatečn odlišný a m ření je opakovatelné, kalibrační závislosti jsou výrazn nelineární, zřejm v d sledku probíhající boční reakce. Kalibrační závislosti získané v roztocích, ze kterých byl kyslík odstran n probubláním dusíkem, tímto problémem netrpí (viz Tabulka I). Mez detekce pro redukční stanovení 2-nitrofenolu byla 6,9·10−7 mol L-1. dT/dE (s/V)

1200 8 10 6

800 2

4

400

12

0 -0,3

-0,5

-0,7

E (V)

-0,9

Obr. 3. Chronopotenciogramy 2-nitrofenolu (c = 1·10-4 mol L-1), m řeno na RVC elektrod v prostředí BR pufru o pH odpovídajícím číslu křivky. Oxidační stanovení 2-nitrofenolu Při prom řování optimálních podmínek pro stanovení 2-nitrofenolu přímou oxidací byla pozorována silná pasivace elektrodového povrchu; b hem 7 po sob jdoucích m ření došlo k tém ř úplnému vymizení signálu a nepodařilo se nalézt vyhovující podmínky elektrochemické či mechanické regenerace elektrody. Z tohoto d vodu bylo od této metody upušt no. Závěr V předložené práci byly nalezeny optimální podmínky pro CP stanovení síranu hydrazinia přímou oxidací na RVC elektrod (BR pufr pH 5, oxidační proud 90 μA), jež umožnily dosažení meze detekce 2,1·10-6 mol L-1. Jako optimální podmínky pro redukční stanovení

68

2-nitrofenolu se ukázal BR pufr pH 8 v kombinaci s redukčním proudem 200 μA; s využitím t chto podmínek bylo dosaženo meze detekce 6,9·10−7 mol L-1. B hem m ření v redukční oblasti se ukázala nutnost odstraňovat kyslík z m řeného roztoku nezávisle, přestože chronopotenciometrické záznamy roztoku 2-nitrofenolu naznačují dostatečné odd lení kyslíku od studovaného analytu. Při studiu oxidace téže látky bylo zjišt no, že dochází k silné pasivaci elektrodového povrchu. Chronopotenciometrie s využitím síťované skelné uhlíkové elektrody se ukázala jako vhodná metoda pro elektrochemické stanovení organických polutant , konkrétn síranu hydrazinia a 2-nitrofenolu. Přestože meze detekce t chto metod zdaleka nedosahují hodnot LD získaných pomocí citliv jších elektrochemických metod, pro stanovení v mikromolárním m řítku se chronopotenciometrie s využitím RVC elektrody jeví jako dostatečná. Poděkování Za podporu této studie d kují autoři projektu SVV260084 a Grantové Agentuře Univerzity Karlovy (projekt č. 84213). Literatura 1. Sand H. J. S.: Z. Phys. Chem. 35, 641 (1900). 2. Sand H. J. S.: Philos. Mag. 1, 45 (1901). 3. Douglas G. R., Gingerich J. D., Soper L. M.: Carcinogenesis 16, 801 (1995). 4. Leakakos T., Shank R. C.: Toxicol. Appl. Pharm. 126, 295 (1994). 5. Johnson D. C., Freudenberg M. A., Jia F. L., Gonzalez J. C., Galanos C., Morrison D. C., Silverstein R.: Circul. Shock 43, 1 (1994). 6. Kamradt J. M., Pienta K. J.: Oncol. Rep. 5, 919 (1998). 7. Perrini G., Tomasello M., Librando V., Minniti Z.: Ann. Chim., 95, 567 (2005). 8. Harrison M. A. J., Barra S., Borghesi D., Vione D., Arsene C., Olariu R. L.: Atmos. Environ. 39, 231 (2005). 9. Friedrich J. M., Ponce-De-Leon C., Reade G. W., Walsh F. C.: J. Electroanal. Chem. 561, 203 (2004). 10. Tentorino A., Casolo-Ginelli U.: J. Appl. Elctrochem. 8, 195 (1978). 11. Hayashi Y., Matsuda R., Ito K., Nishimura W., Imai K., Maeda M.: Anal. Sci. 21, 167 (2005).

69

Electrochemical Biosensors Based on Enzymatic Reactor with Amalgam Powder (Elektrochemické enzymatické biosenzory na základě reaktoru s práškovým amalgámem) Bohdan Josypčuk a, Jiří Barek b, and ksana Josypčuk a, b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Department of Biophysical Chemistry, Dolejskova 3, Prague, Czech Republic; E-mail: [email protected] b Charles University in Prague, Faculty of Science, University research center UNCE “Supramolecular chemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESC Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic Abstract Enzymatic reactor based on the powder of silver solid amalgam was suggested as the main part of biosensors in flow systems for the first time. 4-aminothiophenol, glutaraldehyde and enzyme were gradually bonded to the amalgam surface. Large surface of the fine amalgam particles maintains a big quantity of enzyme molecules. Biosensors were tested with enzymes ascorbate oxidase, glucose oxidase, catalase, tyrosinase and laccase. Electrochemical detection of the oxygen concentration change (for the first 3 enzymes) or the quinones concentration (tyrosinase and laccase) in the measured solution was done amperometrically by means of the tubular detector of silver solid amalgam. The current response of each biosensor was optimized with respect to the detection potential, the flow rate of the mobile phase, the injection volume and the enzymatic reactor volume. Under the found optimum conditions, concentration dependence and some statistical parameters of repeated measurements (relative standard deviation (RSD) for the studied enzymes was in the range 0.81 – 2.1 %) were measured. Biosensor with the ascorbate oxidase reactor was used for determination of ascorbic acid in the vitamin tablet Celaskon®. Results of the analysis were in good agreement with the contents of ascorbic acid declared by manufacturer and the RSD of these analyses was 2.0 %. Key words: Electrochemical biosensors, Flow analysis, Amperometry, Solid amalgam, Powdered enzymatic reactor. Úvod Vysoká selektivita a citlivost jsou hlavními přednostmi biosenzor s elektrochemickou detekcí (ED) v pr tokových systémech 1-5. V závislosti na vlastnostech analytu a podmínkách m ření musí být zvolena detekční (pracovní) elektroda z vhodného materiálu. Nejlepší možnosti pro redukční procesy ve vodných roztocích, zvlášť při vysokých negativních potenciálech, poskytují rtuťové a amalgámové elektrody. Vysoké přep tí vodíku na t chto elektrodách umožňuje pracovat až do –2000 mV 6, 7. Pevné 6, 8-10 a pastové 7, 11, 12 amalgámové elektrody se konstrukčn neliší od elektrod z jiných materiál a jsou vhodné pro r zné varianty pr tokových systém (wall-jet 13, 14, thin-layer 13 a uspořádání s tubulárním detektorem TD 15-17). Amalgámy, stejn jako rtuť, mají vysokou afinitu k síře. Thiosloučeniny spontánn tvoří na jejich povrchu monovrstevní film, a to rychleji než na jiných kovech (30– 60 min) 18, 19. Pokud thiol navázaný na amalgám obsahuje amino-skupinu, lze pomoci glutaraldehydu (GA) kovalentn spojit –NH2 skupinu thiolu a –NH2 skupinu bioaktivní látky (enzym, avidin, streptavidin, protilátka apod.). Citlivost enzymatického biosenzoru záleží na ploše, která je pokrytá enzymem. Detekční elektrody mají relativn malou plochu a jedním ze zp sob jejího zv tšení je použití enzymatického reaktoru. Aktivní povrch enzymatického reaktoru je mnohonásobn v tší než u detekční elektrody a tento reaktor se umísťuje v pr tokovém systému před detektorem. Detektor potom zaznamenává buď koncentraci produktu enzymatické rekce, nebo např. zm nu koncentrace kyslíku v roztoku. Velkou plochu

70

enzymatických reaktor mohou zajišťovat porézní nebo práškové materiály 20-22. My jsme poprvé použili jemný prášek stříbrného pevného amalgámu s kovalentn navázanými enzymy a cílem této práce bylo prozkoumat vlastnosti a možnosti biosenzor obsahujících zmín né reaktory. Experimentální část Amperometrická m ření byla provád na s využitím počítačového analyzátoru řízeného softwarem MultiElchem v. 3.0 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.) a elektrochemického stojánku (Polaro-Sensors, Praha). Tubulární detektor ze stříbrného pevného amalgámu 15 byl použit jako pracovní elektroda. Jako referentní sloužila nasycená kalomelová elektroda připravená na základ stříbrného pastového amalgámu 7, 23. Pomocnou elektrodu tvořil Pt drátek o pr m ru 1,0 mm a délce 15 mm. M ření byla provád na při laboratorní teplot . Pro přípravu roztok byla použita voda redestilovaná v křemenné aparatuře. Všechny použité chemikálie byly čistoty p. a. nebo lepší. Výsledky a diskuse Pro testování navržených práškových amalgámových reaktor bylo zvoleno 5 r zných enzym : askorbát oxidáza (Asc x), glukóza oxidáza (G x), kataláza (Cat), tyrozináza (Tyr) a lakáza (laccase, Lac). B hem enzymatických reakcí za účasti G x a Asc x se spotřebovává kyslík rozpušt ný v roztocích. Snížení koncentrace 2 se na amperometrickém záznamu projevuje jako pík nasm rovaný dolu ( br. 1, křivky 1 a 2). Proud tohoto píku je úm rný koncentraci substrátu. Mechanizmus redukce kyslíku se liší na r zných elektrodách. Na rtuťových a amalgámových elektrodách je to dvoustupňový proces, přičemž v každém kroku se přenášejí 2 elektrony 24, 25. P lvlnové potenciály t chto redukčních vln na rtuťových elektrodách jsou kolem –100 a –900 mV (proti nasycené kalomelové elektrod ) 25. Velmi podobné hodnoty potenciál redukce kyslíku jsou i na amalgámových elektrodách. Výhodou použitého detektoru ze stříbrného amalgámu je skutečnost, že kv li vysokému přep tí vodíku lze na tomto materiálu provád t 4-elektronovou redukci kyslíku. Kataláza eliminuje H2O2 a převádí ho na vodu a kyslík. Je to opačná reakce k prvnímu kroku redukce 2. Jestliže použitý potenciál detekce je menší než potenciál redukce H2O2, pak zvýšení koncentrace O2 vyvolané enzymatickou reakcí v roztoku zp sobí zv tšení proudu a na záznamu se objeví pík ( br. 1, křivka 3). Na rozdíl od zmín ných enzym G x, Asc x a Cat, které velmi selektivn reagují jenom s určitými substráty, tyrozináza a lakáza katalyzují oxidaci velkého počtu fenol (dopamin, katechol, pyrogalol, ap.). V tomto případ se b hem enzymatické reakce spotřebovává kyslík a substrát se oxiduje na jemu odpovídající chinon. Chinony jsou redukovatelné látky a této vlastnosti se často využívá pro jejich elektrochemické stanovení ( br. 1, křivka 4). Navržený reaktor se podobá námi popsanému 16 reaktoru z porézního stříbrného amalgámu. Ve zmín ném článku byl porézní reaktor testován s glukózo oxidázou. Již v předb žných pokusech s biosenzorem na základ amalgámového prášku bylo zjišt no, že je 2–3 krát citliv jší, než senzor s porézním amalgámem. Tato skutečnost byla rozhodující pro zahájení detailního zkoumání práškového reaktoru. Pro zjišt ní vlastnosti a možnosti biosenzor na základ reaktoru s práškem stříbrného amalgámu pokrytého enzymem byly provedeny nezbytné optimalizační experimenty.

71

Obr. 1. Amperometrická odezva biosenzor s r znými enzymy. Experimentální podmínky: MF [0,10 mol L1 AcB; 0,001 mol L1 Na2EDTA; pH 6,5]; Vinj = 50 µL. Levá Y–osa: křivky 1, 2, 3; pravá Y–osa: křivka 4. AscOx–reaktor (křivka 1): Edet = –1300 mV; v = 0,20 mL min1; c(NaAsc) = 5,0104 mol L1; GOx–reaktor (křivka 2): Edet = –1100 mV; v = 0,10 mL min1; c(glukóza) = 5,0104 mol L1; Cat–reaktor (křivka 3): Edet = –900 mV; v = 0,10 mL min1; c(H2O2) = 2,0104 mol L1; Lac–reaktor (křivka 4): Edet = –50 mV; v = 0,10 mL min1; c(katechol) = 2,0105 mol L1. Pro zvolení optimálního složení mobilní fáze byly testovány r zné roztoky a nejlepší se ukázal být 0,1 mol L1 acetátový pufr (AcB) o pH 6,5. Toto pH je kompromisní pro všechny testované enzymy. Kationty stříbra a rtuti jsou inhibitory pro mnoho enzym , a proto byl do mobilní fáze přidán silný komplexon Na2EDTA. Mobilní fáze [0,1 mol L1 AcB; 1 mmol L1 Na2EDTA; pH 6,5] byla použitá pro další m ření. Vliv potenciálu detekce Ed na proudovou odezvu Ip biosenzoru. Nejvyšší odezva biosenzor s glukóza oxidázou a askorbát oxidázou by m la být při potenciálech negativn jších než – 1000 mV, kde na amalgámovém detektoru probíhá 4–elektronová redukce 2. Vzhledem k tomu, že reaktory s t mito enzymy jsou odd leny od detektoru a detektor zaznamenává jenom snížení koncentrace 2, m ly by být i závislosti ip–Ed pro Asc x a G x podobné. Uvedený předpoklad se potvrdil při porovnání zkoumané závislosti pro G x–porézní reaktor popsané v našem předchozím článku 16 se závislostí pro Asc –práškový reaktor získané v této práci. Proud píku roste se zvýšením potenciálu do –1300 mV a potom se prakticky nem ní do –1500 mV. Při ješt negativn jších potenciálech se pík zmenšuje a zhoršuje se jeho reprodukovatelnost zřejm kv li vylučování vodíku. U reaktoru s katalázou bylo d ležité najít potenciál, při kterém by v použité MF byla maximální odezva prvního kroku redukce kyslíku O2→H2O2, ale aby peroxid(y) se ješt nemohl redukovat. Potenciál detekce Edet = –900 mV byl zvolen jako optimální a použit pro další m ření s Cat–reaktorem. Podobným postupem byl zjišt n optimální Ed pro biosenzory s reaktory, které obsahovaly tyrozinázu a lakázu. Pro redukci chinon vzniklých b hem enzymatické reakce je optimální potenciál –50 mV. Při tomto potenciálu je proud pozadí mnohem menší a křivky mnohem hladší než v předchozích experimentech s jinými reaktory hlavn kv li tomu, že za t chto podmínek se kyslík redukuje ve velmi malé míře ( br. 1, křivka 4). 72

Vliv průtokové ryc losti vflow na proudovou odezvu Ip biosenzoru. Rychlost pohybu mobilní fázi ovlivňuje účinnost enzymatického reaktoru a odezvu detektoru. ptimální hodnota tohoto parametru pro zkoumané enzymy byla v rozmezí 0,1–0,2 mL min–1. Vliv objemu dávkovací smyčky Vinj na proudovou odezvu Ip biosenzoru. Při malých objemech dávkování proud píku roste tém ř úm rn s injektovaným objemem Vinj, ale od objemu 100 µL se linearita ztrácí. Zv tšení hodnoty Vinj vyvolává rozšíření píku, a proto i časové prodloužení délky záznamu. Pokud se pro hodnocení vlivu dávkovacího objemu místo proudu píku použije plocha píku, tak se pro celý rozsah zkoumaných smyček pozoruje lineární závislost (R = 0,996). V našich experimentech jsme používali smyčku o objemu 50 µL jako kompromisní hodnotu pro dosažení dostačující citlivosti při úsporné spotřeb vzorku, standard a mobilní fáze. Koncentrační závislost. Pro analytické použití biosenzor je d ležité v d t v jakém koncentračním rozsahu analytu se pozoruje zm na odezvy biosenzoru. Nejvhodn jší je, když tato závislost je lineární. V tomto případ pro hodnocení výsledk analýzy lze v lineárním úseku použit krom metody kalibrační křivky i metodu standardního přídavku nebo metodu srovnání se standardním roztokem. Vzhledem k tomu, že odezva biosenzoru záleží na aktivit enzymu, která se postupn zmenšuje, není použití kalibrační křivky racionální a výhodn jší jsou dv poslední zmín né metody hodnocení. Koncentrační závislost Asc–biosenzoru byla zm řena v rozsahu 0,02 – 1,00 mmol L–1, ale lineární byla jen od 0,02 do 0,60 mmol L–1. Tento lineární úsek byl použit jako základní informace pro přípravu roztoku vitaminových tablet Celaskon®, ve kterých se pak stanovoval obsah vitaminu C. Stanovení obsa u kyseliny askorbové v tabletác elaskon®. Jedna tableta vitaminu byla dána do 10 mL H2 a roztok se intenzivn míchal 1–2 minuty. Po krátké centrifugaci bylo přeneseno 0,050 mL roztoku vzorku do 9,950 mL mobilní fáze. Tímto zp sobem bylo připraveno dev t vzork a zanalyzováno FIA-ED s AscOx–biosenzorem. Byl stanoven obsah kys. askorbové v jedné tablet 104.9 ± 2.2 mg (N = 9; SD = 2,9 mg; RSD = 2,8 %). Získané výsledky analýzy jsou ve shod s obsahem deklarovaným výrobcem (95–105 mg kys. askorbové v 1 tablet ). Závěr Byl navržen a otestován mikroreaktor zapln ný amalgámovým práškem s navázaným enzymem. Pro testování biosenzor byly použity enzymy askorbát oxidáza, glukóza oxidáza, kataláza, tyrozináza a lakáza. Byla provedena optimalizace parametr m ření biosenzor s t mito enzymy a na příkladu askorbát oxidázy i detailn popsána. Statistické zpracování výsledk paralelních m ření modelových roztok r zných analyt se všemi zkoumanými biosenzory ukazuje vysokou přesnost a citlivost m ření. Rozd lení bioaktivní (reaktor) a detekční (tubulární detektor) části biosenzoru se ukázalo být jako uživatelsky výhodné řešení. Reaktor s jiným amalgámovým práškem s navázaným enzymem se dá vym nit b hem n kolika sekund a lze hned začít m řit jiný analyt. Zapojení do pr tokového systému tubulárního amalgámového detektoru dovolilo používat vysoké negativní potenciály, což podstatn zvýšilo proudovou odezvu a následn i citlivost m ření. Jako příklad praktického použití navrženého typu biosenzor byla vypracována metodika stanovení kyseliny askorbové v tabletách Celaskon®. Získané výsledky analýzy jsou ve shod s obsahem deklarovaným výrobcem. Postup přípravy biosenzoru je sjednocený a hodí se pro kovalentní navázání látek obsahujících skupinu –NH2 na povrch amalgámových částic.

73

Poděkování Autoři d kují za finanční podporu GA ČR (projekty čís. P206/11/1638 a P208/12/1645), GA Univerzity Karlovy v Praze (projekt 282111/2001/B-Ch/PrF) a Univerzity Karlovy v Praze (projekt SVV260084). Literatura 1. Scognamiglio V.: Biosensors and Bioelectronics 47, 12 (2013). 2. Tessema M., Ruzgas T., Gorton L., Ikeda T.: Anal. Chim. Acta 310, 161 (1995). 3. Chi Q., Dong S.: Anal. Chim. Acta 278, 17 (1993). 4. Hasebe Y., Takamori K., Uchiyama S.: Anal. Chim. Acta 282, 363 (1993). 5. Choi B. G., Im J., Kim H. S., Park H.: Electrochim. Acta 56, 9721 (2011). 6. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 7. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 8. Yosypchuk B., Fojta M., Barek J.: Electroanalysis 22, 1967 (2010). 9. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003). 10. Čížková P., Navrátil T., Šestáková I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 11. Danhel A., Yosypchuk B., Vyskocil V., Zima J., Barek J.: J. Electroanal. Chem. 656, 218 (2011). 12. Niaz A., Fischer J., Barek J., Yosypchuk B., Sirajuddin, Bhanger M. I.: Electroanalysis 21, 1786 (2009). 13. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 14. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 15. Yosypchuk O., Barek J., Yosypchuk B.: Electroanalysis 24, 2230 (2012). 16. Josypčuk B., Barek J., Josypčuk .: Anal. Chim. Acta 778, 24 (2013). 17. Josypčuk ., Barek J., Josypčuk B.: Electroanalysis 26, 306 (2014). 18. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011). 19. Josypčuk B., Fojta M., Yosypchuk .: J. Electroanal. Chem. 694, 84 (2013). 20. Wang Y., Hasebe Y.: Materials Science and Engineering C 32, 432 (2012). 21. Ducey Jr. M. W., Meyerhof M. E.: Electroanalysis 10, 157 (1998). 22. Curey T. E., Salazar M. A., Oliveira P., Javier J., Dennis P. J., Rao P., Shear J. B.: Analytical Biochemistry 303, 42 (2002). 23. Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011). 24. Kolthoff I. M., Lingane J. J.: Polarography Interscience Publishers, New York 1946. 25. Wang J.: Analytical electrochemistry VCH Publishers, Inc., New York 1994.

74

Electroanalytical Determination of Dihydroxybenzene Isomers Using Glassy Carbon Electrode a

Mahmoud Khodari.a, Ali Abdel-Fatah a, Ekram Rabie a, and Nada Nabil a Chemistry Department, Faculty of Science, South Valley University, Qena, Egypt, E-mail: [email protected]

Abstract Phenolic compounds are widely distributed in natural and waste water due to occurrence from many industrial processes. In this study, the electrochemical behavior of Catechol (CT), Hydroquinone (HQ), and Resorcinol (RS) was investigated using cyclic and linear sweep voltammetric techniques at glassy carbon electrode (GCE). Phenolic compounds Cyclic voltammetric measurements showed of the studied compounds showed well defined oxidation and reduction peaks for CT and HQ while an only one oxidation peak was observed for RS. The obtained peaks were used to determine the mentioned compounds using linear sweep voltammetric measurements. These isomers were determined in their binary or tertiary mixtures. The calibration curves for CT, HQ and RS were in the range 5 x 10 -6 to 1 x 10-4 mol dm-3 for CT and 5 x 10-6 to 1 x 10-5 mol dm-3 for HQ and from 1 x 10-5 to 5 x 10-4 mol dm-3 for RS. The collected results showed a detection limit of 1 x 10-7 mol dm-3 for HQ, 9 x10-6 mol dm-3 for RS and 9 x10-7 mol dm-3 for CT. The effect different interferences were studied. Key words: Catechol, Hydroquinone, Resorcinol, Glassy carbon electrode, Voltammetry. Introduction Phenolic compounds are widely distributed in natural and wastewater due to occurrence from many industrial processes of plastics, paints, drugs, pesticides, resins, antioxidants, paper and cellulose 1. Besides, they are also originating from the natural degradation of humic and lignocellulosic substances 2. Due to their pronounced toxicity and effects upon aquatic organisms including bioaccumulation in fish, the Environmental Protection Agency (EPA) has identified more than one hundred compounds as organic pollutants 3. Catechol (CT), resorcinol (RS) and hydroquinone (HQ) are three di hydroxy benzene isomers, which are widely used in cosmetics, tanning, pesticides, flavoring agents, medicines, antioxidants, dye and photography chemicals. During the manufacturing and application process of catechol (CT), resorcinol (RS) and hydroquinone (HQ), some of them may inadvertently release into the environment to contaminate rivers and ground waters. Thus, it is easy for them to enter the environments, and appears in industrial effluents and sanitary wastewater. Moreover, these isomers are often coexisting in environmental samples. The allowable emission of phenolic compounds in the national standard of China (GB 8978-1996) is 0.5 mg L-1 (for dihydroxybenzene, 4.54×10−3 mol L−1) 4, 5. Research in the simultaneous determination of isomers at the same electrode by voltammetry is a challenging subject because electro-active isomers contain the same electro-active groups. It is generally recognized that conventional electrodes only possesses a single function of electron transfer. Therefore, the electro-active isomers are difficult to be identified at an electrode by electrochemical technique 6.

75

Experimental Pure grade catechol, hydroquinone and resorcinol were obtained from Aldrich laboratory chemicals. All supporting electrolyte solutions were prepared using analytical grade reagents. Cyclic voltammetry (CV) and linear voltammetry were carried out on a computer-aided electrochemistry system used in the voltammetric studies consists of potentiostat model 263(EG&GPARC) Princeton applied corporation (made in USA) and electroanalytical software model 270/250 version 4.0 (PARC) which control the potentiostate via IEEE 488GPIB using IBM compatible 386 with VGA monitor and HP Laser Jet 4L printer. The characteristic of the analyzer potentiostat controls working electrode, which minimize errors from the cell resistance. This is accomplished with a three-electrode system, the working electrode, the reference electrode and a counter one. Results and discussion The cyclic voltammetric measurements of both HQ and CT showed two define peaks. HQ showed the cathodic peak at 208.3 mV and the anodic peak at 386.7 mV while catechol showed the reduction peak at 324.4 mV and the oxidation peak at 394.05 mV. The cyclic voltammetric measurements of resorcinol showed one defined oxidation peak at 979.6 mV confirming the irreversibility of the electrochemical reaction under the investigated conditions. Optimization of the Electrochemical Parameters To optimize the condition of determination of the mentioned compound, the peak current response was examined with respect to different parameters. The influence of supporting electrolyte on the reduction peak of HQ and CT and the oxidation peak of RS were examined using different supporting electrolytes including, sodium chloride, phosphate buffer, sodium acetate, sodium citrate, Britton-Robinson buffer and acetate buffers. The peak height and shape were taken into consideration in choosing the suitable supporting electrolyte. The highest peak current and the best peak shape were obtained in presence of sodium acetate 0.05 mol L-1 for HQ, sodium acetate 0.01 mol L-1 for CT and NaNO3 1N for RS. The effect of pH of sodium acetate solution and sodium nitrate solution on the peak current of HQ, CT and RS was examined over the range from 2 to 12. The best response was observed at (pH 4) for HQ, (pH 5) for CT and (pH 2) for RS. The effect of accumulation potential was studied in which different potentials from (-0.6 to 0.6 V) were applied to the determination of 5x10-5 mol l-1 HQ. The highest peak current was observed at 0.0 V. For CT different potentials ranged from -0.4 to 0.5 V were applied in sodium acetate solution 0.01 mol L-1 pH 5. The highest peak current was observed that at 0.0 V. The effect of deposition potential on the peak current of RS was studied over the range from 0.0 V to 1.2 V, the highest peak current was observed at 0.4 V. The effect of scan rate showed that, the peak current was increased by increasing the scan rate from 5 to 125 mV s-1. A scan rate more than 125 mV s-1 results in peak shape distortion, so a scan rate of 50 mV s-1 was selected for further work. The influence of accumulation time on the peak height was studied at different times over the range (zero-150 s). At different deposition times (zero- 30- 60- 90), the peak current increased with increasing the deposition time to the value 30 s then it started to decrease.

76

Study of interferences Different concentrations of some metal ions, organic compounds, amino acids and other different types of interfering species were investigated. Some of them increased while the others decreased the peak current. The effect was ranged between plus and mince 6%.

Determination of the studied compounds in one run It is known that the determination of isomers at the same electrode by voltammetry is a challenging subject because electro active isomers contain the same electro active groups. One major difficulty is that voltammetric peaks corresponding to the oxidation/reduction of the isomers are largely overlapped in many cases. Under the experimental conditions in this work the peaks of HQ and CT became well resolved and separated by about 100 mV, Fig. 3 shows the determination of the three isomers in their mixture (a concentration of 1x10-4 M of each of them) in the presence of sodium acetate 0.05 M (pH 4), 0.0 V accumulation potential, deposition time 60s and scan rate 50 mV s-1. Analytical Application By applying the optimum conditions selected above, dihydroxybenzene isomers has been determined in different water samples, such as industrial waste water sample, Nile water sample, tap water, outlet filters sample and inlet filters sample. To determine them in each sample, voltammograms were recorded after addition of 1 ml of the sample to 9 ml supporting electrolyte. The sample did not show any peaks even at addition a large amount of it to the cell. So, the standard addition method was used in which different concentrations of HQ, CT and RS were added to a voltammetric cell containing 10 ml from the water sample and 10 ml supporting electrolyte then cyclic voltammograms were recorded at the same conditions mentioned above. The collected results are indicated in Table I.

1500

1 1000

2 3

Ip(nA)

500 0 -500 -1000 -1500 -2000 800

600

400

200

0

-200

E (m V )

Fig. 1. Repetitive cycle voltammograms of 5x10-5 mol l-1 HQ at GCE in 0.05 M sodium acetate (pH 4) and scan rate 50 mV s-1.

77

10.0

9.8

9.6

Ip(µA)

9.4

9.2

9.0

8.8

8.6 -0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

Acc. potential (V)

Fig. 2. Voltammograms for 1x10-5 mol L-1 of CT, HQ in 0.05 mol L-1 sodium acetate (pH 4) 50 mV s-1 scan rate, 0.0 V deposition potential and 60 s deposition time using glassy carbon electrode.

4

HQ CT

2 0

Ip(µA)

-2 -4

RS -6 -8 -10 1400

1200

1000

800

600

400

200

0

-200

-400

Ep(mV)

Fig. 3. Voltammograms for 1x10-4 mol L-1 of CT, HQ, RS in 0.05 M sodium acetate (pH 4), 50 mV s-1 scan rate, 0.0 V deposition potential and 60 s deposition time using glassy carbon electrode. 78

Table I. Recovery of concentrations in spiked different water samples. Sample Added HQ RS x10-5 M Found Recovery Found Recovery x10-5 M % x10-5 M % Industrial 5 5.17 103.5 5.1 102 Waste 10 10.1 101 10.5 105 Water Nile 5 5.08 101.7 5.12 102.4 water 10 9.98 99.8 10.2 102 Tap water 5 5.89 117.9 4.78 95.6 10 10.9 109 9.99 99.9 Inlet filter 5 5.44 108.9 5.31 106.2 water 10 9.96 99.6 10.8 108 Outlet 5 5.26 105.3 4.99 99.8 filter 10 10.3 103 10.7 107 water

CT Found Recovery x10-5 M % 5.24 104.8 10.02

100.2

5.1 10.37 5.21 10.8 4.94 10.24 5.02 10.32

102 103.7 104.2 108 98.8 102.4 100.4 103.2

References 1. Nielson A. H., Allard A. S., Hynning P. A., Rememberger M.: J. Environ. Tox. Chem. 30, 3 (1991). 2. Sotomayor M. D. T., Tanaka A. A., Kubota L. T.: Anal. Chim. Acta 455, 215 (2002). 3. Rodriguez I. N., Leyva J. A. M., deCisneros J. L. H. H.: Analyst 122, 601 (1997). 4. Cui H., He C. X., Zhao G. W.: J. Chromatogr. A 855, 171 (1999). 5. Ding Y. P., Liu W. L., Wu Q. S., Wang X. G.: J. Electroanal. Chem. 575, 275 (2005). 6. Wang Z. H., Li S. J., Lv Q. Z.: Sensor. Actuat. B-Chem. 127, 420 (2007).

79

Efficiency Wall-Jet Cell FC2 (Účinnost cely Wall-Jet FC2) Jan Krejčí, Iva Ventrubová, and Lucie Brožová BVT Technologies, a.s., Hudcova 78c, 612 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Wall-Jet electrochemical cells FC2 have been characterized by measurement of [Fe (CN)6]3/[Fe(CN)6]4-. Measurements were performed in the range of Reynolds numbers 21,3 to 0,067 for flow 32 – 0,1 mL/hr. Efficiency of the cells were in the range of 0,06 – 5,3%. Efficiency satisfies the equation = a · Qb (a = 0,8547, b = - 0,746 [Q] =mL/hr) with R = 0,999. The difference between the three cells can be characterized by SD of a and b (8,2 % and 5,2 % respectively). The current [nA] satisfies the same equation with a = 2294,2 and b = 0,255 (SD = 8,2 % and 14,7 % respectively). FC2 cell with Wall-Jet hydrodynamics provides reproducible electrochemical measurements with well-defined efficiency and current flow dependence. Key words: Wall-Jet, Electrochemical cell, Efficiency, Flow analysis. Introduction Matsuda H. and Yamada J. 1, 2 like first defined and characterized flow cell with wall-jet arrangement (WJ). Many applications of WJ were published since first publication appeared. Lexa (1994) used WJ arrangement in potentiometric measurement of Cl- 3. Comparison of WJ with RDE (rotated disk electrode) was made by Lindgren in study of direct e- kinetics in HPR (horse radish peroxidase) 4. WJ arrangement was used for lead detection in blood by Jaenicke 5 . Comprehensive analysis of flow electroanalytical method including J was made by Štulík 6 . Kuritaa R. published an example of description of the WJ cell preparation with interdigitated electrodes 7. WJ arrangement was also combined with other methods. Bart used the electrochemical detection on electrodes with WJ arrangement together surface plasmon resonance for example 8. An important parameter of the flow cell is the current efficiency. It specifies the ratio between current, which is measured and current, which would arise, if the electrode reaction involved all substances that entered in the cell. The knowledge of WJ cell efficiency and current flow dependency simplifies the experiment design 9. The reproducibility between cells is an important parameter which enables their practical use. Specification of these parameters for FC2 cell is a goal of this work. Experimental The cell FC2 (BVT Technologies, www.bvt.cz, Brno, CZ) was connected directly to a linear pump Technic I (AMV, http://www.amvtechnics.cz, Brno, CZ) using plastic capillaries. The sensor was inserted into the cell and locked. The cell is optimized that there is no accumulation of air bubbles. The cell is connected using the USB Bioanalyzer (BVT Technologies, www.bvt.cz, Brno, CZ) to computer. For the experiment it was used a solution of 10 mM ferri-ferro cyanide and sensor AC1.W2.R1 (BVT Technologies, www.bvt.cz, Brno, CZ) with a platinum working electrode and a reference electrode Ag/AgCl. Data were recorded in program of Bioanalyzer and analysed using the Excel. Characterization of flow

80

Reynolds number Re was calculated by using the hydraulic diameter of the tube d, the mean flow velocity in the cross section vs and kinematic viscosity ν: Re = vs · d/ν Reynolds number ranged from 21,3 to 0,067 for flow rates from 32 – 0,1 mL/hr. These values prove that the measurement was done in laminar flow regimen. Results and discussion Principle of the flow cell measurement Schematic chart of the cell with dimensions is in fig. 1.A. The photography of the cell is in Fig. 1. The cell is designed for the standard screen printed electrodes AC1 or CC1 (BVT Technologies, www.bvt.cz, Brno, CZ). It enables simple exchange of the electrodes and their effective use.

B A Fig.1. A: Arrangenent of flow cell FC2 wall jet. (Cell dimensions are given in milimetres.). B. FC2 wall jet foto. The current [nA] satisfies the power law with a = 2294,2 and b = 0,255 (standard deviation is 8,2 % and 14,7 % respectively). Average values of three cell currents are shown in the Fig. 2. The values a and b are in agreement with data published by Kurita (2000).

Fig. 2. Dependency of cell current on flow (log scale axis). Reproducibility

81

The key factor is the stability and precision of the flow. When the properties of the cells were characterized, the best of them was used to characterize the stability of the pump flow.

Properties and stability of pump flow Stability of flow the pump depends on the chosen syringe. In Fig. 3 are shown real flow rates.

Noise due to irregular piston movement.

Instability of flow due to drop fall.

Fig. 3. Real flow rate in time PUMP AVM Technic I.

Fig. 4. Stabilization of the flow when flow is decreased to a half. The flow is expressed as percentage of nominal flow 32 – 1 mL/hr. The pump AMV (AMV, http://www.amvtechnics.cz, Brno, CZ) gives good flow stability after 100 s of stabilisation (Fig. 4) at extremely low flow rates the flow rate is influenced by piston movement and by instability caused by the drops of liquid which fall at the end of output tubing. (Fig. 3) The stabilization at low flow rates increases to 200 s.

82

Efficiency The maximum current which can be created on in WJ electrode arrangement is determined as quantity excluded electrons per second form the mass flow of the inputted elelctroactive compound. It was determined as the product flow in the cell Q, concentration of the substance c and Faraday constant F (F = 9.6485 • 104 C/mol). I0= · c · F The efficiency of the cell was determined by calculating the proportion of the measured current I to the current I0 corresponding to full conversion. η = I/I0 Capillary of WJ has a diameter 0.3 mm. The efficiency decreases with the increased flow. For higher flow rates the majority of electro active compound is not affected by electrode to react and exclude electrons. The average results are in Fig. 5. Efficiency of the cells are in the range of 0,06 – 5,3%. Efficiency satisfies the equation η = a · Qb (a = 0,8547, b = - 0,746 [Q] =mL/hr) with R = 0,999. The difference between the three cells can be characterized as standard deviation of a and b (8,2 % and 5,2 % respectively). It is interesting that the SD of current decreases with flow and SD of efficiency decreases with flow. It induces the explanation that the electrode is quite reproducible but the source of variability is hydrodynamics.

Fig. 5. Efficiency at different flow rates (log scale axis). Conclusion It was proven that electrochemical cells with WJ arrangement have good reproducibility between among different randomly chosen pieces which make them good electrochemical tool. The cell is small robust and it enable to use screen printed electrodes AC1 for classical electrochemical measurement or CC1 electrodes with interdigitated structures (BVT Technologies, www.bvt.cz, Brno, CZ). The cell FC2 (BVT Technologies, www.bvt.cz, Brno, CZ) has sufficient reproducibility and stability which enables in case of uses of stable 83

electrochemical reaction to use it as highly precise flowmeter to measure extremely small flows. The current dependency is described by equation: I = 2294 · 0,255 The knowledge of flow dependency enables to carry out the measurement of diffusion coefficient and the kinetic studies. The dependency of efficiency on the flow enables to simply optimize the experiment with respect the used flow and analyte concentrations. This dependency is described by equation: η = 0.8547 Q -0.746 Acknowledgments This work was supported by the Ministry of Industry and Trade FR-TI1/118. We would like to thank Lenka Klusáková from BVT Technologies, a.s. for help with text corrections. References 1. Matsuda H.: J. Electroanal. Chem. 15, 109 (1967). 2. Yamada J., Matsuda H.: J. Electroanal. Chem. 44, 189 (1973). 3. Lexa J., Stulik K.: Talanta 4, 301 (1994). 4. Lindgren A., Munteanu F.D., Gazarya I., Ruzgas T.,Gorton L.: J. Electroanal. Chem. 458, 113 (1998). 5. Jaenicke S., Sabarathinam R.M., Fleet B., Gunasingham H.: Talanta 45, 703 (1998). 6. Štulík, K., Pacáková, V. Elektroanalytická měření v proudícíc kapalinác . Vyd. 1. Praha: SNTL - Nakladatelství technické literatury, 1989, p. 305 s. 7. Kuritaa, R., Tabeib, H., Liuc, Z., Horiuchic, T., Niwa, O., Sensor. Actuat. B-Chem. 71, 82 (2000). 8. Bart M., van Os P.J.H.J., Kamp B., Bult A., van Bennekom W.P.: Sensor. Actuat. B-Chem. 84, 129 (2002). 9. Sejnohova R., Hanak V., Krejci, J.: Screen printed electrodes improve mass transferr. In: New perspectives in biosensors technology and applications (Serra P.A., Ed.), InTech, Rijeka, Croatia 2011.

84

Electrochemical Reduction of 1,3-Alt-tetranitrothiacalix[4]arenes a

Alan Liška a,b, Jiří Ludvík a Department of Molecular Electrochemistry, J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry AS CR , Dolejškova 2155/3,182 23, Prague 8, Czech Republic E-mail: [email protected]; [email protected] b Department of Inorganic Chemistry, Charles University of Prague, Faculty of Science, Albertov 6, 128 43, Prague 2, Czech Republic

Introduction Calixarenes are organic molecules which contain several aromatic units (in this work four) connected by methylene („calixarenes“) or sulfur („thiacalixarenes“) bridges. Calix[4]arenes can exist in four defined conformations: cone-, partial cone-, 1,2- and 1,3-alternating (Fig. 1). The conformational stability of a (thia)calix[4]arene is controlled by the size of the substituents on the upper or the lower rim, or by other interactions (e.g. hydrogen bonds). These compounds are very attractive for supramolecular chemists, since they have the shape of a cavity, being able to exhibit host-guest interaction according to the substitution 1,2.

Fig. 1. Possible conformations of a calix[4]arene. The calixarene skeleton itself is not reducible. Therefore it´s necessary to introduce a suitable redox probe in the calixarene frame in order to use electrochemical methods for investigations of calixarene properties. For the purpose of this study the nitro group was chosen because its electrochemical reduction proceeds easily in a well-defined way. Materials and methods All the electrochemical experiments were performed under aprotic conditions in anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF). The solution of supporting electrolyte contained 0.1M tetrabutylammonium hexafluorophosphate (TBAHFP), dissolved oxygen was removed by argon purge. For voltammetric and DC-polarographic experiments the three electrode system was used (W: dropping mercury electrode/hanging mercury drop, R: SCE, A: platinum wire).

85

Results and discussion Polarographic reduction of recently studied cone-tetranitrocalixarenes (Fig. 2) occurs in three steps (Fig. 3): the first two represent two electron reversible waves during which a stable biradical dianion and tetraradical tetraanion are formed. The fact that the seemingly centrosymetric molecule is reduced in two separated processes (each step by two electrons) refers about the presence of two different couples of equivalent nitrogroups. In combination with quantum chemical calculations and X-ray structure analysis it was found that even in the solution the calixarene has a pinched shape, where the first two electrons are reducing the two opposite more distant nitro groups and the second couple of electrons reduced the two close, nearly parallel nitrophenyl nuclei. The remaining broad twelve electron process leads to formation of the final tetrakis(hydroxylamino) product.

Fig. 2. The cone-tetranitrocalix[4]arene.

Fig. 3. Scheme of the polarographic reduction of a cone-tetranitrocalix[4]arene. For better understanding of the conformation influence on the electrochemiccal response, two newly synthesized "trans" dinitrocalixarene conformers (Fig. 4) were compared. The coneconformer has similar reduction pattern to the previously described tetranitroderivative: there are three processes, first two reversible, and according to the magnitude of limiting current, they involve one electron each, the third irreversible broad wave corresponds to six electrons. The reason, why the two equivalent nitro groups are reduced in two different steps can be explained by the fact, that the cone calixarenes in fact are not fixed, but they are "pumping" between two pinched forms. In this situation, statistically, the cone-conformer exists in solution in two nearly equally distributed forms: one with two nitrogroups on the most distant benzene rings, and second with them on the nearest blocks. Each of them has different energy, and as a consequence, is reduced at different potential by two electrons. Due to only half concentration of each form in any moment, the observed limiting current is in both cases only

86

one half of theoretical value. It follows from the previous investigations that the first (less negative) potential corresponds to reduction of the form with more distant nitro groups. The situation is different for the 1,3-alt-derivative. Only one single two electron process was observed as the first reduction step. The only explanation consistent with the previous investigation is, that this conformer doesn´t undergo such dynamical processes in solution which could result in estabilishment of two spatially different constellations. This result is connecting the stereochemical and electrochemical point of view („stereoelectrochemistry“), moreover in a dynamic way. In the Table 1, the measured potentials for both isomers are listed. From the comparison with the tetranitroderivative it is evident that even in the cone-dinitroderivative the first reduction corresponds to the distant position of nitro groups and the second step involves their close position. It´s apparent that the potential of the first wave of K8 is close (the difference is only 40 mV) to the first potential of K2B, suggesting that even in the 1,3-alt-derivative the calixarene is pinched and the nitro-units are fixed in the distant position.

Fig. 4. Differences in polarographic reduction of two dinitrocalix[4]arene conformers. Table I. Electrochemical data for two dinitrocalix[4]arene conformers (Fig. 4) and for the tetranitro derivative. Compound E1 / V E2 / V E3 / V Ratio of currents E1:E2:E3 −1.25 −1.43 −2.53 (a broad wave) 1:1:6 K2B −1.29 − −2.21 (a broad wave) 2:0:6 K8 −1.22 −1.48 −2.60 (a broad wave) 2:2:12 tetranitro-

87

Fig. 5. The series of studied 1,3-alt-tetranitrothiacalix[4]arenes The new presented series of 1,3-alt-tetranitrothiacalix[4]arenes (Fig. 5) differs from the recently published cone-tetranitrocalix[4]arenes in two significant factors (conformation and type of bridges connecting the aromatic building blocks). The factor concerning the cone – 1,3-alt difference was discussed in the previous section. Here the attention is given to the thiabridging units. The series of investigated 1,3-alt-tetranitrothiacalix[4]arenes involves eight derivatives which differed in the substitution on the lower rim. From data in the Table 2 it is evident that the reduction pattern of these compounds is very similar to the formerly mentioned conetetranitrocalix[4]arenes. First two, two electron waves are slightly broader but their separation remains still about 200 mV. The absolute values of both reduction potentials are shifted approximately by 300 mV positively in comparison with the "classic" tetranitrocalixarenes. This is most probably due to the presence of sulfur bridges instead of methylene groups. The last reduction step is also a twelve electron broad irreversible wave. Thus, the interpretation seems to be similar: the first two electrons reduce the two most distant nitro groups that have a different energy than the other two ones which are reduced more negatively also in a single step. The variation of substituents on the lower rim has almost no effect on potential shifts what demonstrates the suppressive effect of the oxygen atom on inductive effect of the substituents

88

(change of electron donating to electron withdrawing group doesn´t affect the reduction potential). Table II Electrochemical data for 1,3-alt-tetranitrothiacalix[4]arenes (Fig. 5). Compound Lower rim E1 / V E2 / V E3 / V ***)

Ratio of currents E1:E2:E3 4× − CH3 −0.95 −1.13 −2.18 2:2:12 S1 *) *) 4× − C H −0.96 −1.15 −2.33 2:2:12 S2 3 7 4× − C4H9 −1.00 −1.18 −2.37 2:2:12 S3 4× − C5H11 −1.01 −1.19 −2.41 2:2:12 S4 4× − C6H13 −1.00 −1.20 −2.39 2:2:12 S5 −0.98 −1.14 −2.25 2:2:12 S6 4× − C CH **) 4× − CH2C6H5 −1.03 −1.22 −2.27 2:2:(3:9)**) S7 4× − CH2CH(CH3)C2H5 −0.98 −1.19 −2.18 2:2:12 S8 *) **) Badly resoluted waves. The third process occurred in two separated steps. ***)A broad wave Conclusions In the study it was showed that the reduction of 1,3-alt-tetranitrothiacalix[4]arenes has a similar pattern like for the cone-tetranitrocalix[4]arenes: first two more distant nitro groups are reduced first by two electrons what leads to formation of a biradical dianion. This undergoes a subsequent reduction of next two less distant nitro groups to form a tetraradical tetraanion. The last reduction step is a broad twelve electron wave which corresponds to formation of the final product – tetrakis(hydroxylamino) derivative. The substituents on the lower rim do not have any significant effect on the values of reduction potentials. The change of cone- into 1,3-alt-conformation results in a shift of the first reduction potential about 40 mV negatively while the change of methylene to sulfur bridges shifts the reduction potential by approximately 300 mV towards less negative values. Whereas the cone conformers exhibit the dynamic "pinching", the 1,3-alt derivatives are most probably fixed in the more energetically profitable pinched shape with the nitrogroups in distant position 3. This "stereoelectrochemical" approach to the calixarene macrocycles will be further developed 4. References 1. Gutsche C.D.: Calixarenes Revisited (Monographs in Supramolecular Chemistry). The Royal Society of Chemistry, Cambridge 1998. 2. Gutsche C.D.: Calixarenes, An Introduction (2nd Edition). The Royal Society of Chemistry, Cambridge 2008. 3. Liška A., Vojtíšek P., Fry A.J., Ludvík J.: J. Org. Chem. 78, 10621 (2013). 4. Liška A., Rosenkranz M., Klíma J., Dunsch L., Lhoták P., Ludvík J.: Electrochim. Acta. Submitted.

89

Utilization of High Conversion Degree Detector with Renewable Working Material for the HPLC Determination of Sulfamethizole (Využití detektoru s vysokým stupněm konverze s obnovitelným pracovním materiálem pro stanovení sulfamethizole metodou HPLC) Jan Mika a, Jiří Barek a, Jiří Zima a, and Hana Dejmková a Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre „Supramolecular Chemistry“,Department of Analytical Chemistry, UNESC Laboratory of Enviromental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] a

Abstract Sulfamethizole is sulfamid antibiotic used commonly in fast therapy of urinary tract and it is component of many pharmaceutical preparations. Therefore, there is need for its fast and sensitive determination. HPLC with newly developed coulometric detector with renewable working material was used for this purpose. Optimal conditions of determination were found. Calibration dependence was linear in the range from 100 µmol L–1 to its quantification limit, namely 0.04 µmol L–1. Newly developed method was used for determination of sulfamethizole concentration in tablets of Micturol® Sedante Fuerte. Key words: Coulometry, Glassy carbon microparticles, HPLC, Sulfamethizole. Introduction Measurements in flow arrangement, particularly HPLC, are nowadays one of the most common methods in modern analytical laboratories 1. Naturally, there are great requirements on their detection systems. Detectors should be sensitive, selective, inexpensive and with fast response. Electrochemical detectors meet many of these demands well and thus they are suitable candidates for detection in these systems 2. Amperometry and coulometry are most frequent electrochemical detection techniques in flow arrangement and they differ mainly in electrochemical conversion degree3. Coulometry works with conversion degree reaching 100% and thus working electrode must have high active surface. Tubular or planar detectors with high surface can be used for detection in flow arrangement, but they have also high volume of detection cells, which causes widening of HPLC peaks. Working material with low volume of cell and high active surface is therefore mainly porous or based on microparticles (such as for example crushed vitreous carbon or glassy carbon beads) 4, 5. Generally, one of the weaknesses of electrochemical detection is passivation. This problem is even more serious in the case of porous detectors, as the working material cannot be polished 6. The only possibility of electrode surface renewal is cleaning by electrochemical pulses, but this procedure has low efficiency and it is ineffective for some products of electrochemical reactions. Passivated working material have to be replaced, but this procedure is time consuming and expensive. One way how to fix this problem was introduced earlier: coulometric flow-through detector filled by microbeads of glassy carbon, which are held in detector with filtration paper 7. This paper attempts to developed new electrochemical method for sulfamethizole determination in pharmaceutical preparation using newly developed detector and tested the applicability of the detector with HPLC. Sulfamethizole is sulfonamide antibiotic used mainly

90

against grampozitive and gramnegative bacteria and commonly applied as fast therapy of urinary tract, especially against Escheria coli 8, 9. Experimental Chemicals Appropriate amount of sulfamethizole (Fig. 1, 99%, Sigma-Aldrich,USA) was dissolved in methanol (≥ 99.9%, Merck, Germany) to prepare stock solutions of concentration 1 10 –3 mol L–1; solutions of lower concentrations were obtained by their dilution with mobile phase, which consist of methanol and ten times diluted B-R buffer. Alkaline component of B-R buffer was prepared from sodium hydroxide (98%, Lach-Ner, Czech Republic) and acidic component from phosphoric acid (85%, Lach-Ner, Czech Republic), boric acid (99,5%, LachNer, Czech Republic), and acetic acid (99%, Lach-Ner, Czech Republic). Millipore Q-plus System (Millipore, USA) was used for the preparation of deionised water for all aqueous solutions.

Fig. 1. Chemical structure of sulfamethizole. Apparatus HPLC system was composed of HPP 5001 high pressure pump with ADLC2 detector (both Laboratorni pristroje Praha, Czech Republic), 6-port injection valve (injected volume 20 μL, Rheodyne, USA) and column Lichrospher® RP-18, 100 (5 μm), 125×4 mm (LichroCART, Merck, Germany). Electrochemical detector worked in three-electrode arrangement, consisting of working high conversion degree detector with renewable working material, platinum auxiliary electrode with large surface and Ag/AgCl (3 M KCl) reference electrode (both Monokrystaly Turnov, Czech Republic). Detector with renewable working material was filled by HPP 4001 high pressure pump (Laboratorni pristroje Praha, Czech Republic). Procedure Detector was filled by the suspension of 10 mg of glassy carbon spherical microparticles (size 10 – 20 µm, Alfa Aesar, Germany) in 3 mL of nitromethane (POCH, Gliwice, Poland). This mixture was filled into the detector by methanol. ne tablet of real sample was dissolved in 100 mL of methanol and 50 μL of the solution was dissolved to total volume 10 mL by mobile phase. Concentration of sulfamethizole in the tablet was determined by standard addition method. Two 250 µL additions of the stock solution were used. All the measurements were made in triplicate, unless stated otherwise. Concentration dependences were evaluated by least squares linear regression method. Limits of quantification were calculated as ten times the standard derivation (α = 0.05), calculated from ten repeated measurements of the lowest concentration of the determined analyte, divided by slope of calibration dependence 10.

91

Results and discussion Optimization procedures In the case of HPLC with electrochemical detection, optimization of mobile phase and flow rate affect both detector signal and separation procedure. The choice of the optimal mobile phase was based on separation parameters; ten times diluted B-R buffer pH 3 and methanol (70:30, v/v) was used 11. Optimal flow rate was than tested in this mobile phase; flow rate range from 0.4 to 1.2 mL min–1 was used. Higher flow rates leads to higher working pressures of the detector than its construction allowed. A value of 0.8 mL min–1 was set as optimal, because the retention time of sulfamethizole was lower and peak height was bigger than in the case of lower flow rates. From 0.9 mL min–1 the peak area decreased with increasing flow rates. Detection potential was determined from hydrodynamic voltammogram to a value of +1.6 V (Fig. 2A). Maximum peak area was obtained for this potential, while background current was still low.

Fig. 2. Hydrodynamic voltammogram (A) and chromatograms of 5 consecutive injection of sample (B); sulfamethizole (100 µmol L–1) in methanol and ten times diluted B-R buffer pH 3 (30:70, v/v), column Lichrospher® RP-18, 100 (5 μm), Edet=+1.6 V and flow rate 0.8 mL min–1. Repeatability of measurements The electrode response of sulfamethizole drops rapidly when using the same electrode material; the drop of the peak height was about 20% for five sample injections (Fig. 2B). It was probably caused by passivation of working material by products of electrochemical reaction. Therefore, the working material had to be changed periodically after each three injection of sample. The relative standard derivation (RSD) of peak area of six exchanges of the working material was 6.3%, which is usual value for electrochemical detection.

Calibration dependences and limit of detection Linear dynamic range and quantification limit were determined from measurements of calibration dependence under the optimal conditions. Detector response was stable from 100 μmol L–1 to the quantification limit, namely 0.04 μmol L–1. The parameters of calibration

92

dependence are summarized in Table 1 and characteristic peaks of calibration dependence are shown in Fig. 3A. Table I. Parameters of calibration dependence and values of quantification limit (LOQ) of HPLC-ED determination of sulfamethizole.

Dynamic linear range (µmol L–1) 0.1 – 100

Slope (μA s mol–1L)

Intercept (μA s)

Correlation coefficient

L (μmol L–1)

3.59

–1.1

0.9987

0.04

Real sample of pharmaceutical preparation Newly developed method was used for determination of sulfamethizole concentration in tablets of pharmaceutical preparation Micturol® Sedante Fuerte. Three tablets of one batch were determined under the optimal condition using standard addition method. All results are summarized in Table 2 and selected chromatograms are shown in Fig 3B. Results from electrochemical detection were consistent with producers declared quantities and with HPLC with spectrophotometric detection, which was used as comparative method.

Fig. 3. Chromatograms of sulfamethizole of concentration 100, 80, 60, 20, 10, 8, 6, 4, 2 and 1 µmol L-1 (A) and of sulfamethizole in Micturol Sedante (B, standard additions of 0 (0), 20 (1) and 40 (2) µL of stock solution); mobile phase methanol and ten times diluted B-R buffer pH 3 (30:70, v/v), column Lichrospher® RP-18, 100 (5 μm), Edet=+1.6 V and flow rate 0.8 mL min–1. Table II. Content of sulfamethizole in Micturol Sedante tablets determined by HPLC-ED, manufacturer declared quantities and quantities determined by HPLC-UV; uncertainty presented by confidence limit (α=0.05). Determined quantity Declared quantity HPLC-UV Sample (mg tab–1) (mg tab–1) (mg tab–1) Micturol® Sedante 255.5±18.6 250 249.9±8.1

93

Conclusion Compatibility of newly developed coulometric detector with HPLC was successfully tested during determination of sulfamethizole in pharmaceutical preparation. Optimal conditions of its determination were as follows: mobile phase consisted of ten-time diluted B-R buffer pH 3 and methanol (70:30, v/v), flow rate 0.8 mL min–1 and detection potential +1.6 V Sulfamethizole strongly passivated carbon based working material during optimization measurements, so working material had to be replaced periodically after each three injection of sample. Obtained quantification limit was 0.04 μmol L–1, which is three times lower than value 0.14 μmol L–1 previously reached using CPE in wall-jet arrangement11. Newly developed method was used for determination of sulfamethizole content in Micturol® Sedante – results were in good consistency with producer declared quantities and with HPLCUV, which was used as comparative method. Acknowledgements This work was performed in the framework of Specific university research (SVV260084). Financial support from the Grant Agency of the Czech Republic (project no. P206/12/G151) is gratefully acknowledged. References 1. Bond A.M.: Anal. Chim. Acta, 400, 333 (1999). 2. Toth K., Stulik K., Kutner W., Feher Z., Lindner E.: Pure Appl. Chem. 76, 1119 (2004). 3. Stulik K., Pacakova V.: Electroanalytical measurements in flowing liquids, E. Horwood, 1987. 4. Beinrohr E., Nemeth M., Tschopel P., Tolg G.: Fresenius. J. Anal. Chem. 343, 566 (1992). 5. Wang J., Dewald H.D.: J. Electrochem. Soc. 130, 1814 (1983). 6. Schieffer G. W.: Anal. Chem. 52, 1994 (1980). 7. Mika J., Barek J., Zima J., Dejmková H.: Proc. XXXIII. Modern Electrochemical Methods, Collection of Conference Proceedings International Conference, Jetřichovice, Czech Republic, 2013. 8. Kerrn M.B., Frimodt-Moller N., Espersen F.: Antimicrob. Agents Chemother. 47, 1002 (2003). 9. Kerrn M.B., Frimodt-Moller N., Espersen F. : Clin. Microbiol. Infec. 10, 54 (2004). 10. Inczédy J., Lengyel T., Ure A.M.: I.U.o. Pure, A. Chemistry, Compendium of Analytical Nonmenclature: Definitive Rules 1997, Blackwell Science, 1998. 11. Dejmková H., Mikeš M., Barek J., Zima J.: Electroanalysis 25, 189 (2013).

94

Electrochemical Study of Triazaborine Chromophores (Elektrochemická studie triazaborinových chromoforů) Tomáš Mikysek a, František Josefík b, and Jiří Ludvík c University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department ofAnalytical Chemistry, Studentská 573, 53210 Pardubice,Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Technology, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Pardubice, Studentská 573, CZ-53210, Czech Republic c J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, CZ-182 23 Prague 8, Czech Republic. a

Abstract This contribution describes a basic electrochemical behaviour of a series of newly synthesized chromophores based on triazaborine core. The main attention has been paid to the investigation of the first oxidation and first reduction process of such compounds using cyclic voltammetry, rotating disk voltammetry and polarography. The oxidation is mostly a twoelectron irreversible process, whereas the first reduction is in most cases revesible, involving one-electron. For better understanding of the relationship between the structure and redox properties, the Linear Free Energy relationship (LFER) approach using sigma (para) constants of Hammett type was applied, the oxidation and reduction centers were localized, the difference between E(ox) and E(red) was correlated with the HOMO-LUMO gap and the anomalous cases were elucidated. Keywords: Triazaborines, Chromophore, Square-wave voltammetry, Determination. Úvod Nové organické sloučeniny jsou, v současné dob , v popředí zájmu materiálových chemik , kteří se snaží najít vhodné materiály pro moderní technologie 1. Žádané jsou především „charge-transfer“ chromofory vykazující fluorescenci v pevném stavu, dobrou propustnost sv tla, rozpustnost, tepelnou stabilitu nebo jsou biologicky aktivní 2,3. Historie heterocyklických sloučenin bóru se datuje od roku 1958, kdy M. J. S. Dewar publikoval práci týkající se 9-aza-10-borafenanthrenu a jeho derivát 4. Tyto sloučeniny vykazovaly vysokou stabilitu a odolávaly především vroucím louh m i kyselin chlorovodíkové. Pozd ji se v literatuře objevila zmínka o bórových derivátech purinu a chinazolinu, avšak byly oproti předchozím sloučeninám mén stabilní. Tyto látky byly p vodn plánovány pro využití v záchytné netronové terapii (angl. Boron Neutron Capture therapy) 5,6. Začátkem nového milénia byly představeny bórové heterocykly, kde je bór koordinován mezi dv ma heteroatomy – převážn mezi dusíkem a kyslíkem a substituován dv ma fenylovými skupinami nebo dv ma atomy fluoru. Toto uspořádání se nazývá „superakceptor“ D vodem je to, že sloučeniny takového typu mají na dusíkovém atomu, díky koordinaci bóru, deficit elektron , který je zesílen přítomností elektron-akceptorních skupin na bórovém atomu. Nár st publikací byl zaznamenán na počátku roku 2000, kdy nastal masivní rozvoj moderních technologií a vydané práce se tedy více zam řovaly na popis fyzikáln chemických vlastností syntetizovaných látek, které byly testovány na přítomnost: fotoluminiscence, elektroluminiscence, vlastností pro nelineární optiku 7-10. N které z nich pak našly uplatn ní při vývoji „organic-light emitting devices“ ( LED).

95

Tento přísp vek navazuje na předchozí publikované práce oxazaborin a triazaborin (Obr. 1).

11,12

týkající se syntézy nových

X -

B N

+

N

N

H3C

O

Obr. 1. Struktura triazaborinových derivát . Substituenty: -Br, -COOEt, -CN, -NO2.

= -NEt2, -OCH3, -CH3, -H,

Experimentální část emikálie. Deriváty triazaborin byly syntetizovány na Ústavu organické chemie a technologie Univerzity Pardubice. Pro elektrochemické studium bylo jako základního elektrolytu použito Bu4NBF4 o koncentraci 0,1 M rozpušt ného v bezvodém N,N–dimethylformamidu (DMF), který byl přečišt n nejdříve azeotropickou destilací za normálního tlaku s přídavkem 5% benzenu a 5% vody a následnou vakuovou frakcionací 13. Instrumentace Všechna elektrochemická m ření byla provád na na přístroji AUT LAB (model "PGSTAT128"; Metrohm - Autolab B.V., Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla připojena m řicí cela s tří-elektrodovým systémem obsahujícím rtuťovou kapkovou, případn platinovou diskovou (pr m r 2 mm) pracovní elektrodu, dále pak kalomelovou referentní elektrodu Hg|Hg2Cl2|sat. KCl odd lenou m stkem obsahujícím roztok základního elektrolytu v DMF a pomocnou elektrodu (platinový plíšek). Postupy Cyklická voltametrie ( V) Tyto experimenty byly provád ny v roztoku výše uvedeného elektrolytu, obsahujícího přibližn 5.10-4 M příslušného derivátu triazaborinu. U v tšiny experiment byly použity následující podmínky: na Pt elektrod probíhaly experimenty v rozsahu potenciál od 0,0V do +1,5V (oxidace) a od 0,0V do -2,0V (redukce), na visící rtuťové kapkové elektrod (HMDE) od 0,0V do -2,8V (sm r a rychlost polarizace byly m n ny podle potřeby). Voltametrie s rotující diskovou elektrodou (R V) byla provád na při dvou rychlostech 500 a 1500 ot.min-1 op t v rozsahu potenciál od nuly do +1,5V, resp. do -2,0V. K polarografickým měřením byla jako pracovní použita kapající rtuťová kapková elektroda (DME) s dobou kapky 2 s a s rychlostí zm ny polarizačního nap tí 5 mV.s-1. Počáteční potenciál byl 0,0 V a koncový potenciál až -2,8 V. Výsledky a diskuse V této práci bylo studováno základní elektrochemické chování nov syntetizovaných triazaborin substituovaných r znými skupinami a byl přitom sledován vliv substituent a struktury na oxidační a redukční vlastnosti t chto látek ve výše uvedeném rozpoušt dle (N,N-dimethylformamidu). Pozornost byla zam řena zejména na první oxidační a první redukční potenciál a na rozdíl mezi nimi.

96

Redukce Potenciál prvního redukčního kroku všech studovaných látek se pohyboval v rozmezí od -1,0 V do -1,55 V (vs. SCE), jednalo se o difúzí řízený jednoelektronový reverzibilní proces (obr.2) s rozdílem katodického a anodického píku 60-75mV, přičemž pom r jejich proud se blížil jednotce. Formální redox potenciál ani p lvlnový potenciál nebyl závislý na zm n rychlosti polarizačního nap tí ani na rychlosti rotace elektrody u RDV techniky. Zároveň bylo zjišt no, že výsledky nezávisí ani na použitém elektrodovém materiálu, kde pro v tšinu CV experiment byla použita platina a pro polarografická m ření a CV s HMDE rtuť jako elektrodový materiál. Jedná se zde zřejm o redukci centrálního heterocyklu s motivem N=C-C=N v konjugaci s karbonylovou skupinou za vzniku stabilního a částečn delokalizovaného radikálového aniontu. V serii látek s r znými substituenty se vyskytla jedna anomálie a to konkrétn u triazaborinu substituovaného nitro skupinou. Při sestavení závislosti prvních redukčních potenciál na Hamettovských konstantách sigma (para), bylo zjišt no, že práv tato látka se liší od ostatních a je tedy redukována jiným mechanismem. Bylo potvrzeno, že v tomto případ se primárn redukuje nitroskupina, a to v souladu s literaturou napřed na radikálový anion, pak při negativn jších potenciálech na příslušný hydroxylaminový derivát. Oxidace Potenciál prvního oxidačního procesu se pohyboval v rozmezí od +0,65 V do +1,65 V, u látky substituované ethylesterem karboxylové kyseliny se oxidační proces pohyboval patrn mimo potenciálové okno použité elektrody a rozpoušt dla. Při porovnání velikosti limitního proudu redukce, která je jednoelektronová s limitním proudem oxidace, je ze záznamu RDV patrná přibližn dvakrát v tší hodnota (Obr.2). Z toho se dá usoudit na dvou-elektronovou oxidaci, která je podle experiment CV ireverzibilní a zřejm probíhá mechanismem ECE. xidačním centrem je v tomto případ negativn nabitý borový atom a sousední vazby. I v případ oxidací se ve studované sérii nachází látka, která se vymyká trendu vycházejícího op t ze závislosti prvních oxidačních potenciál na Hamettovských sigma (para) konstantách. Jedná se o substituent diethylamino, který vykazuje v CV reverzibilní jedno-elektronový reverzibilní redox proces ukazující na přednostní reverzibilní oxidaci dimethylanilinu.

Obr. 2. Reprezentativní záznamy triazaborinu substituovaného methoxy skupinou. Vlevo: cyklická voltametrie, zm na polarizačního nap tí v = 100 mV/s; vpravo: Pt-RDV, rychlost rotace elektrody 500 a 1500 ot.min-1; koncentrace látky 0,5 mM.

97

Dalším d ležitým parametrem je rozdíl potenciálu první oxidace a první redukce. Tato hodnota koreluje s rozdílem energetických hladin H M a LUM a je zejména d ležitá pro materiálový výzkum navrhující r zná zařízení. U série studovaných látek se tato hodnota pohybuje v rozmezí od 2,54 do 2,80 (nejnižší 2,54 je pro látku se substituentem diethylamino). Závěr Tato práce se zabývá základní elektrochemickou charakterizací série nov připravených chromofor – derivát triazaborinu. Jejich elektrochemické chování v nevodném prostředí N,N-dimethylformamidu bylo zkoumáno pomocí cyklické voltametrie, voltametrie s rotující diskovou elektrodou a polarografie. Hlavní pozornost byla soustřed na na první oxidační a první redukční proces. Z experiment a následného vyhodnocení výsledk vyplynulo, že všechny látky, s výjimkou dvou derivát , se oxidují stejným mechanismem a zároveň mají i stejný mechanismus redukce. Prvním derivátem vymykajícími se svým chováním ostatním je v případ mechanismu oxidace triazaborin substituovaný dimethylamino skupinou, která podléhá oxidaci snadn ji než triazaborinové jádro. Navíc tato oxidace je jednoelektronová a reverzibilní oproti zbytku série, která vykazuje dvou-elektronovou ireverzibilní oxidaci. Druhým derivátem je v případ redukce triazaborin substituovaný nitroskupinou, která se op t redukuje dříve než triazaborinové jádro. Tyto základní elektrochemické charakterizace budou východiskem pro praktické testy a mohou pomoci k optimalizaci struktury případn k vytvoření další generace látek s novými vlastnostmi, které mohou být přínosem k moderní materiálové chemii. Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a t lovýchovy České Republiky projektu CZ.1.07/2.3.00/30.0021 "Posílení excelentních tým výzkumu a vývoje na Univerzit Pardubice". Literatura 1. Du D., Chen S., Cai J., Tao Y., Tu H., Zhang A.: Electrochim. Acta 53, 6589 (2008). 2. Li D., Zhang H.Y., Wang Y.: Chem. Soc. Rev. 42, 8416 (2013). 3. McClary C.A., Taylor M.S.: Carbohydrate Research 381, 112 (2013). 4. Dewar M.J.S., Kubba V.P., Pettit R.: J. Am. Chem. Soc. 3073 (1958). 5. Chissick S.S., Dewar M.J.S., Maitlis P.M.: J. Am. Chem. Soc. 83, 2708 (1961). 6. Pozzi E.C.C., Trivillin V.A., Colombo L.L., Hughes A.M., Thorp S.I., Cardoso J.E., Garabalino M.A., Molinari A.J., Heber E.M., Curotto P., Miller M., Itoiz M.E., Aromando R.F., Nigg D.W., Schwint A.E.: Rad. Environ. Biophys. 52, 481 (2013). 7. Chen H.Y., Chi Y., Liu C.S., Yu J.K., Cheng Y.M., Chen K.S., Chou P.T., Peng S.M., Lee G.H., Carty A.J., Yeh S.J., Chen C.T.: Adv. Func. Mat. 15, 567 (2005). 8. Khan T.K., Rao M.R., Ravikanth M.: Eur. J. Org. Chem. 2010, 2314 (2010). 9. Yakubovskyi V.P., Shandura M.P., Kovtun Y.P.: Eur. J. Org. Chem. 2009, 3237 (2009). 10. del Rey B., Keller U., Torres T., Rojo G., Agulló-López F., Nonell S., Martí C., Brasselet S., Ledoux I., Zyss J.: J. Am. Chem. Soc. 120, 12808 (1998). 11. Josefík F., Svobodová M., Bertolasi V., Šim nek P.: Beilstein J. rg. Chem. 9, 1463 (2013). 12. Josefík F., Svobodová M., Bertolasi V., Šim nek P., Macháček V., Almonasy N., Černošková E.: J. rganometal. Chem. 699, 75 (2012). 13. Liška A., Vojtíšek P., Fry, A.J., Ludvík, J.: J. rg. Chem. 78, 10621 (2013).

98

Use of Monovalent Copper for Sensitive Detection of Methyl Derivatives of Xanthine (Využití jednomocné mědi pro citlivé stanovení methyl derivátů xanthinu) a

Rudolf Navratil a, Dominika Motlova a, Frantisek Jelen c, and Libuse Trnkova a, c Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, CZ–625 00 Brno, Czech Republic, European Union, E-mail: [email protected] b Institute of Biophysics of the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Kralovopolska 135, CZ–612 65 Brno, Czech Republic, European Union, [email protected] c CEITEC, Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ–616 00 Brno, Czech Republic, European Union

Abstract This work is concerned with the electroanalysis of xanthine (Xan) and its methylated derivatives (1-, 3-, 7-, and 9-mXan) on a pencil graphite electrode in the presence of copper ions. The main idea of using copper consists in the in situ formation of the complex Cu(I)mXan on the electrode surface and improvement of oxidative signals of the corresponding mXan during the detection. Linear sweep voltammetry (LSV) in connection with adsorption stripping techniques was used for the determination of mXan. To enhance the oxidation signals the elimination voltammetric procedure (EVP) was applied. Key words: Oxidation of methylxanthines; Copper complexes; Pencil graphite electrode (PeGE); Biosensing; Linear sweep voltammetry; Elimination voltammetric procedure (EVP). Úvod anthin a jeho methyl deriváty jsou biologicky významné látky, které lze jako produkty purinového katabolismu najít v krvi, moči a dalších fyziologických tekutinách. Jejich koncentrace, zejména v moči, m že být jedním z vhodných indikátor r zných typ onemocn ní 1. Dřív jší práce zabývající se oxidačním studiem methylxanthin na uhlíkových elektrodách ukázaly, že oxidace t chto látek zahrnuje elektronovou vým nu na C8 a N7 při vyšších potenciálech. N které práce se v nují vlivu methyl skupiny na oxidační mechanismus xanthinu 2,3. Bylo zjišt no, že při fyziologickém pH methyl skupina zvyšuje elektronovou hustotu na N7 a hlavním produktem oxidace je 5-hydroxyhydantoinový derivát, když jsou methyl skupiny vázané na pyrimidinovém kruhu a alantoin v případ vazby methylu na imidazolovém kruhu 3. Existuje n kolik prací pojednávajících o stanovení purinových derivát v přítomnosti m di na pevných elektrodách, kdy m dnaté ionty Cu(II) jsou elektrochemicky redukovány na Cu(I) při potenciálu 0.15 V/s vs. Ag/AgCl/3M KCl. Jednomocná m ď podporuje tvorbu komplexu Cu(I)-purin (ICu,Com), který poskytuje při voltametrických m řeních (LSV – Linear sweep voltammetry) anodickou odezvu v oblasti okolo 0,4 V a zároveň dochází k současnému zvýšení oxidačního signálu odpovídajícího purinu (ICu,Ox) v pr b hu detekce 4,5. Pro jednoduchou, citlivou a rychlou elektrochemickou detekci methylxanthin na pencil grafitových elektrodách (PeGE) v přítomnosti m di jsme využili adsorptivní rozpoušt cí techniky (adsorptive stripping) ve spojení s eliminační voltametrickou procedurou 6. Tyto techniky se prokázaly jako vhodné pro studium oxidačních proces jednak kv li jejich jednoduché instrumentaci a jednak proto, že spotřeba sledovaných látek je malá 7.

99

Eliminační voltametrická procedura (EVP) byla vyvinuta za účelem eliminace vybraných (nežádoucích) proudových složek z celkového voltametrického proudu. Při sledování vým ny náboje odehrávajícím se u částic v adsorbovaném stavu bylo zjišt no, že eliminační signál má specifický tvar (potvrzeno i teoreticky) a že tento signál zvyšuje proudovou citlivost až o jeden řád. EVP je založena na matematické transformaci voltametrických křivek m řených při r zné rychlosti polarizace a využívá faktu, že voltametrický proud se skládá z jednotlivých parciálních proudových složek (kinetické, nabíjecí, difúzní), které lze díky rozdílné závislosti na rychlosti polarizace eliminovat nebo zachovat. Pro r zné typy eliminací byla vytvořena celá řada eliminačních funkcí a nejvíce se z hlediska citlivosti obstála EVP E4, která eliminuje kapacitní a kinetický proud a zachovává proud difúzní. Celá eliminační procedura byla podrobn popsána v n kolika dřív jších pracích 8-10. Aplikace EVP umožňuje nejen zvýšení citlivosti detekce, ale zlepšuje i rozlišení překrývajících se pík . Mezi dalšími výhodami EVP je rozšíření potenciálového okna a také to, že není nutné provád t korekci na základní linii (baseline correction) 8-10. V této práci bylo studováno redoxní chování N-methylovaných derivát xanthinu na pencil grafitové elektrod (PeGE) v přítomnosti iont m di. Byly interpretovány elektrochemické procesy purin na povrchu elektrody při formování komplex Cu(I)-methylxanthin a vliv methylderivátu na redoxní chování purinového skeletu. Byl také sledován vliv pH, složení roztoku, akumulační potenciál, scan rate a vliv aktivace elektrody na voltametrická stanovení. Dosažených poznatk bylo využito pro návrh procedury pro kvalitativní a kvantitativní analýzu t chto látek a následn pak pro její využití v medicín a farmacii, tj., postupu, který kombinuje in situ formování purinového komplexu s ionty jednomocné m di na povrchu PeGE a adsorptivní rozpoušt cí techniku spolu s eliminační procedurou. Experimentální část Aparatura Všechna m ření byla provedena na potenciostatu Autolab PGSTAT30 (Metrohm Czech Republic) spojeného s PC s nainstalovaným softwarem GPES 4.9. Experimenty byly provedeny při pokojové teplot (23oC) s využitím tříelektrodového systému s pomocnou platinovou elektrodou, referenční Ag/AgCl/KCl (3 M) elektrodou a pencil grafitovou elektrodou (PeGE, pr m r 0.5 mm, plocha povrchu 16 mm2) od firmy Tombow (Japan) jako pracovní elektrodou. pH pufr bylo stanoveno Hamilton Single Pore Glass elektrodou spojenou s pH metrem CyberScan PC5500 (Eutech Instruments). Ke kalibraci pH elektrody bylo použito Hamilton Duracal pufr (4.01±0.01 a 7.00±0.01) z Hamilton Bonaduz AG, Switzerland. emikálie a procedura Použité chemikálie, včetn xanthinu ( an) a jeho methyl derivát (1-mXan, 3-mXan, 7-mXan, 9-mXan), byly zakoupeny ze Sigma-Aldrich. Pro přípravu roztok bylo využito MILLIP RE (MILLI ) vody (18,2 MΩ.cm). Před m řením byly všechny tuhy aktivovány po ponoření do základního elektrolytu 0,1 M acetát-fosfátového pufru pH 5,1 pomocí 30 sekundového vkládání pulz na potenciálu 1,4 V. LSV křivky byly zaznamenány pro 0.1 M acetát-fosfátový pufr. Potenciál byl snímán od -0,1 V do 1,4 V proti referenční argentchloridové elektrod při rychlostech polarizace 200, 400 a 800 mV/s. Akumulační potenciál a akumulační čas pro adsorptivní stripping proceduru založenou na redukci Cu(II) na Cu(I) byl -0,15 V a 120 s. Nam řené křivky byly vyhlazeny Savitzky-Golay filtrem (level 2), který je součástí GPES 4.9. Poté byla LSV data exportována do programu Microsoft Excel. K výpočtu eliminační funkce E4 ( f ( I ) , rovnice 1) byly použity pr m rné hodnoty proud ze tří nezávislých LSV m ření. Více informací lze nalézt v předchozí publikaci 7.

100

f ( I )   11.657 I vref / 2  17.485I vref  5.8284I 2vref

(1)

kde I vref je LSV křivka snímaná při referenční rychlosti polarizace, I vref / 2 a I 2vref při její poloviční a dvojnásobné hodnot . Výsledky a diskuze anthiny jako ligandy pro komplex s jednomocnou m dí Pro zkoumání tvorby komplexu na PeGE povrchu byl proveden experiment, při kterém byla koncentrace Cu(II) konstantní (20 μM) a k tomuto roztoku byl postupn přidáván ligand v rozmezí 0.5 μM do 40 μM. dpovídající LSV křivky v případ 1-m an jsou zaznamenány na Obr. 1. ICu,Ox

ICu,Co m

Obr. 1. Koncentrační závislost 1-m an v roztoku s konstantní koncentrací m di cCu = 20 µM pro referenční rychlost polarizace 400 mV/s; 0,1 M acetátový pufr pH 5,1. Voltamterické m ření byly provedeny v stripping módu. Povrch PeGE byl modifikován Cu(I) s využitím in situ redukce Cu(II) při potenciálu -0.15 V a akumulačním čase 120s. Zatímco v nepřítomnosti ligandu byl detekován pouze jeden pík v oblasti 0.1 V, po přídavku ligandu byly detekovány další dva píky v oblasti 0.4 V a 0.8 V. První signál (ICu) odpovídá Cu(I) oxidaci na Cu(II) a snižuje se s přídavkem ligandu; druhý signál (ICu,Com) roste s koncentrací 1-m an a indikuje nár st oxidačního proudu Cu(I) vázané v komplexu Cu(I)-1-m an. Třetí signál (ICu,Ox) patří 1-m an a zvyšuje se taktéž s přídavky ligandu. Vložený graf znázorňuje závislost ICu,Com a ICu,Ox na koncentraci 1-mXan a ukazuje lineární pr b h do koncentrace 7,5 μM 1-m an. Při vyšších koncentracích je dosaženo limitní hodnoty proudu, což odpovídá plnému nasycení povrchu elektrody komplexem ligandu s jednomocnou m dí. Zde popsaný experiment poskytuje d kaz, že zvyšující koncentrace ligandu vede ke zvýšení obou signál a

101

to ICu,Com i ICu,Ox a že komplex mezi Cu(I) a ligandem je vytvořen na povrchu elektrody při odpovídajících potenciálech. Eliminační voltametrická procedura met ylxant inů bez a v přítomnosti mědi Typický záznam eliminační procedury má formu f(I) vs. E funkce zobrazené na br. 2. Eliminační funkce E4 (rovnice 1) eliminuje kapacitní a kinetickou proudovou složku a zachovává difúzní proudovou složku8-10. Jakmile elektroaktivní látka poskytne nebo přijme elektron v adsorbovaném stavu, pozorujeme specifický signál ve form píku-protipíku. 800 20μM Xan 20μM Xan + 20μM Cu Xan without Cu reference Xan with Cu reference

600 400

f(I)

200 0 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

-200 -400 -600 E[V]

br. 2. Eliminační (EVP E4) křivky 20 µM bez 20 µM Cu(II) a v přítomnosti 20 µM Cu(II) iont ; referenční scan rate 0.4 V/s. V porovnání s LSV poskytuje eliminační procedura významné zvýšení signál pro stanovení bez přítomnosti i v přítomnosti Cu(II). Teoretický pom r Ip/(Ip+Icp) = 0.409 indikuje ireverzibilní elektrodový proces pro adsorbovanou elektroaktivní částici bez předřadné chemické reakce 8-10. Pom ry pík-protipík vypočítané pro analyzované xanthiny jsou v rozsahu 0,4 až 0,5, což se shoduje s teorií. Vzhledem ke svým výhodám se eliminační procedura stává užitečným nástrojem pro voltametrické analýzy. Závěr Byla provedena elektrochemická analýza xanthinu a jeho methyl derivát (m an) na pencil grafitových elektrodách (PeGE) v přítomnosti iont m di s využitím voltametrie s lineárním scanem (LSV) v kombinaci s adsorpční rozpoušt cí technikou a eliminační voltametrickou procedurou (EVP) pro zvýšení citlivosti detekce. Analýza m an je založena na elektrochemické modifikaci povrchu PeGE jednomocnou m dí, tvorb komplexu Cu(I)-mXan a aplikaci EVP. Signály pík-protipík vzniklé po využití eliminační procedury vypovídají v souladu s teorií o tom, že proces přenosu náboje je zprostředkován částicemi v adsorbovaném stavu a navíc dochází díky EVP ke značnému zvýšení citlivosti detekce a snížení detekčních limit oproti LSV (nanomolární koncentrace). Námi navržená analýza s využitím jednomocné m di tvořené in situ redukcí iont m di Cu(II) před anodickou polarizací PeGE umožňuje stanovení všech studovaných methylxanthin . Z analytického hlediska se nabízí možnost použití Cu(I)-purinových komplex také k detekci a stanovení m di. 102

Poděkování Tento výzkum byl podporován t mito projekty: LH 13053 K NTAKT II, MUNI/A/0972/2013 MŠMT ČR a CEITEC – Central European Institute of Technology Project CZ. 1.05/1.1.00/02.0068.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

7. 8. 9. 10.

Literatura Scheindlin S.: Mol. Intervent. 7, 236 (2007). Goyal R.N., Rastogi A.: Croatica Chemica Acta. 73, 495 (2000). Goyal R.N., Thankachan P.P., Kumar N., Sangal A.: Indian J. Chem. 39, 953 (2000). Ibrahim M.S., Temerk Y.M., Kamal M.M., Ahmed G.A.W., Ibrahim H.S.M.: Microchim. Acta. 144, 249 (2004). Aladag N., Trnkova L., Kourilova A., Ozsoz M., Jelen F.: Electroanalysis. 22, 1675 (2010). Jelen F., Hason S., Trnkova L., v knize: Utilizing of Bio-Electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research (Adam V., Kizek R., ed.), kap. 8. Research Signpost, Kerala, India, 2007. Navratil R., Pilarova I., Jelen F., Trnkova L.: Int. J. Electrochem. Sci. 7, 4397 (2013). Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis. 12, 905 (2000). Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). Trnkova L., v knize: Utilizing of Bio-Electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research (Adam V., Kizek R., ed.), kap. 4. Research Signpost, Kerala, India, 2007.

103

Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012 – Almost Two Years Later Tomáš Navrátil a,b, Sergey Zakharov c, Daniela Pelclová c, and Karolina Mrazová c a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Charles University in Prague, First Faculty of Medicine, Institute of Medical Biochemistry and Laboratory Diagnostics and General University Hospital in Prague, Kateřinská 32, 128 00 Prague 2, Czech Republic c Charles University in Prague, First Faculty of Medicine, Department of Occupational Medicine, Czech Toxicological Information Centre and General University Hospital in Prague, Na Bojišti 1, 128 00 Prague 2, Czech Republic Abstract Almost two years ago, in autumn 2012, a large methanol outbreak was registered in the Czech Republic (CR). The first case was registered in September 2012 in Moravian city Havířov. The source was connected with illegal production and sale of adulterated spirits. About 50 dead and more than 150 cases of methanol intoxications have been reported since September 2012. Some cases of intoxications, connected with old methanol sources distributed in 2012, have been registered up to now. Not all of total amount of prepared methanolic drinks has been found and hundreds liters of toxic methanol have remained in stores or in households. n the other hand, many people intoxicated during this outbreak and classified as “fully recovered” by their hospital discharge, have suffered by sequels of their intoxication at present (visual and nervous system disturbances) and their number has been increasing. Key words: Methanol, Formate, Outbreak, Intoxication, Outcomes, Czech Republic, Sequels. Introduction Methanol intoxications are relatively rare in developed countries. Similar situation was typical for Czech Republic (and former Czechoslovakia). Utilization of this substance had been strongly limited by our national standards till 2010, because methanol minimum lethal dose 1 is estimated as about 1 g/kg-1. In 2010, EU legislative 2 approved that the windscreen washer system shall be filled and fully primed with a low-temperature windscreen washer fluid consisting of a 50 % solution of methanol, or alternatively of isopropyl alcohol, in water with hardness not exceeding 205 mg/l (Ca). Till 2010, the distribution of pure methanol among people was relatively limited and methanol intoxication was connected with improper (mostly homemade) distillation process by production of alcoholic beverages or it was mostly related to occasional ingestions of methanol in laboratories where it was used, e.g., in spectrometry35 , chromatography 6, voltammetry 4, 7-15. The last mass methanol poisoning occurred in CR in 1945. During the last 65 years, methanol intoxications were only episodic. Yearly the Czech Toxicological Information Centre (TIC) received only about 3-4 inquiries regarding methanol ingestions. Therefore, massive methanol intoxication outbreak was surprising not only for public, but for physicians and toxicologist too. The first phone inquiry about the case of acute methanol poisoning to the TIC was recorded by the toxicologist on duty on September 6th, 2012, and it was the case from the hospital in Havířov 16. It was the second similar poisoning in the same city within a week. Number of intoxicated persons increased very fast. Because it could be supposed that a relatively high amount of contaminated alcohol was distributed among consumers, Czech Hygienic Stations and some universities repeatedly tested the alcoholic beverages brought by people. Partial prohibition (sale of beverages with declared alcohol concentration above 20%)

104

was declared on September 27th, 2012 in CR and some neighboring countries limited import of alcoholic beverages from CR. On the contrary to the theoretical preparedness, earlier unsolved toxicological problems etc. pointed to some weak points of laboratories, In spite of the fact that mass methanol poisonings occur rather frequently in the world (mostly in developing countries), reports of larger outbreaks where both the complete admission clinical and laboratory data, including serum-methanol and serum-formate, when medical treatment protocols and short-term outcomes were accurately documented and analyzed, are rare 17. This is one of the main reasons of the continuous discussion about the clinical and laboratory prognostic signs of the treatment outcome and long-term sequels in methanol poisoned patients 18. Furthermore, these reports are necessary for collecting lacking appropriate clinical evidence of efficiency of different antidotes, methods of enhanced elimination, folates substitution, etc. Some aspects of treatment and its sequels will be mentioned in this contribution. Experimental part Determined species and parameters Many parameters and clinical features were evaluated to confirm the diagnosis (because in most cases the intoxicated persons did not know about drinking methanol) and to characterize the severity of methanol intoxication, e.g., levels of serum methanol, serum ethanol, serum formate, serum creatinine, serum glucose, urine methanol, urine ethanol, pH, pCO2, HCO3-, base deficit, level of lactic acid, anion gap, osmolality, and osmolal gap, applied treatment (first aid), history of chronic alcohol abuse (alcoholism), time interval from ingestion, etc. Venous blood for methanol and formate analysis is commonly sampled on admission, at the start of HD, each 2-4 hours during and at the end of HD. Blood samples must be spun, serum separated and frozen until analyses. Analytical methods The wide spectrum of analytical methods, used for determination of parameters mentioned in the paragraph above, was described in our contribution presented in the Proceeding of this conference in the year 2013 16. As it was mentioned, the laboratories in some small hospitals were not able to analyze the serum methanol and formate; some hospitals did not have in stock a sterile solution of ethyl alcohol for intravenous application. Methanol (and similarly ethanol) in the serum can be measured by headspace gas chromatographic method with flame ionization detection and a headspace injector 19. However, formate must be derivatized in hot sulfuric acid by ethanol to ethyl formate. Therefore, for formate determination a new, but already published, method 20, based on enzymatic decomposition of formate in presence of formate dehydrogenase and NAD+, was introduced. Formate is decomposed to CO2 and the simultaneously formed NADH+ can be spectrophotometrically detected at 340 nm. New electrochemical method for serum formate determination was developed in Brno in 2013 21. This method is based on electrophoresis and should be fast, simple and reliable. Statistical methods It was proved that the particular parameters cannot characterize the state of the patient completely. Therefore simple or more sophisticated statistical methods have been applied. The laboratory data in the different groups were compared group by group using Two-Sample Assuming Unequal Variances (Equal Means), two-sample F-Test for Variances, Bias test, two-sample Kolmogorov-Smirnov test, and χ2-test. Normality of statistical distributions was verified. Data were characterized by their medians, arithmetic means with either range or standard deviation or confidence interval (significance level α=0.05), as appropriate. For

105

comparison of achieved results, the common statistical tests have been utilized (t-Test: TwoSample Assuming Equal Variances, t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances (Equal Means), Two-sample F-Test for Variances, Bias test, ANOVA test, etc.). Further, the time trend lines of various parameters have been evaluated retrospectively. In close cooperation with specialists in biostatistics we implemented the multivariate regression analysis of variables 22. Data collection The data on the intoxications were collected by Czech TIC in Prague (e.g. 23-29), which was involved from the beginning in solving this methanol outbreak. TIC has been responsible for distribution of antidotes and for consultations and centralization of the professional help to physicians, to toxicologists, to laboratory, and laymen as well 16, 22. Therefore, TIC specialists can collect relatively easily the discharge reports from hospitals. Following, the survived intoxicated persons have been invited to the TIC, where they are examined some time interval after recovering and their health conditions have been considered and the results compared with those registered after their original recovering. Results and Discussion The research aims can be divided into a few groups, e.g., process of patients recovering until reaching physiologic limits, effect of antidotes and some other substances on the detoxication process, course of health conditions of intoxicated persons in time, etc. Of course, it is not possible to separate the particular aspects of patients recovering and it is necessary to see the problem complex. Process of patients recovering until reaching physiologic limits These investigations have been dealing with the first phase of the methanol outbreak, when it was necessary to remove toxic methanol and its metabolites from intoxicated persons. The investigators retrospectively evaluated e.g., methanol or formate elimination half-life during treatment. There were compared intermittent haemodialysis vs. continuous haemodialysis/haemodiafiltration. Data were obtained from a prospective observational study of 24 patients: IHD (11 persons), and CVVHD/HDF (13 persons). The groups were comparable by all parameters, with the CVVHD/HDF group being slightly more acidotic than the IHD group. The mean elimination half-life of methanol and formate on IHD were compared with those on CVVHD/HDF. About 55% reduction in methanol and in formate elimination half-life during IHD resulted from the higher blood and dialysate flow rates 22. The influence of blood, of dialysate flow on the CVVHD/HDF and of some other parameters and limitations were investigated too. Finally, some recommendations for hemodialysis processes were concluded. Application of hemodialysis is closely connected with proper coordination of antidotes and supporting compounds (e.g., folates, glucose) applications. Therefore, this aspect has been investigated too. Effect of antidotes and of some other substances on the detoxication process Two antidotes have been used in case of methanol or ethylene glycol intoxication: traditional ethanol and fomepizole (active compound: 4-methylpyrazol). Ethanol does not block the liver enzyme activity directly, its activity is based on competitive inhibition (ethanol is processed contemporarily with methanol). In the year 2012, fomepizole was not registered in the Czech Republic and its application was allowed in the framework of “specific treatment program”.

106

Nevertheless, its application was legal within many countries in the EU, and therefore it was not necessary to start the complete approving process from the beginning 16, 19. Following, the influence of folates application on visual sequels in the acute methanol poisoning has been investigated. The groups of patients were comparable by age, time to diagnosis, laboratory data and clinical symptoms on admission, and treatment measures. 76% patients with folic/folinic acid administration and 50% without folates therapy were treated with hemodialysis. The difference in the number of patients with visual sequels has been evaluated between the groups treated with folinic or folic acid, and between the groups with and without folates administration. The relationships between visual sequels and pH, HCO3-, base deficit, anion gap, serum methanol, ethanol, osmolal gap, formate, pCO2, lactate level, formate level, and especially glucose level have been investigated. Conclusion 50 people (about 30 of them in North Moravian region) died due to methanol poisonings from September 2012 to April 2014 in the CR (41 in the year 2012). The last victim was a man, who died on March 6th, 2014. More than 130 people (121 in 2012) were intoxicated. Huge amount of alcoholic beverages has been analyzed since the start of mass methanol outbreak in CR 2012. Due to this measure hundreds of contaminated samples were identified at the end of 2012. It was found that 15 000 L of methanol were distributed. Nevertheless, up to now about 10-20 % have not been found and it is possible that they can be stored in household stocks of “private drinkers”, by the distributors or producers. So it cannot be excluded that methanol poisonings will continue. Moreover, the health state of people, who were discharged from hospitals or classified as fully “recovered”, can deteriorate in following months and years (e.g., 26% of examined persons had visual disturbances at discharge, now 44% of them, damage of the nervous system had 14%, now 40% of them). More detailed studies involving number of intoxicated persons as high as possible will be published in future. Acknowledgements This work was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic – GA CR (Project P206/11/1638 and Project P208/12/1645). References 1. Roe O.: CRC Crit. Rev. Toxicol. 10, 275 (1982). 2. European_Commission: No. 1008/2010 concerning type-approval requirements for windscreen wiper and washer systems of certain motor vehicles and implementing Regulation (EC) No 661/2009 of the European Parliament and of the Council concerning type-approval requirements for the general safety of motor vehicles, their trailers and systems, components and separate technical units intended therefor (2010). 3. Ramesova S., Sokolova R., Degano I., Bulickova J., Zabka J., Gal M.: Anal. Bioanal. Chem. 402, 975 (2012). 4. Sokolova R., Degano I., Hromadova M., Bulickova J., Gal M., Valasek M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 75, 1097 (2010). 5. Ramesova S., Sokolova R., Tarabek J., Degano I.: Electrochim. Acta 110, 646 (2013). 6. Bulickova J., Sokolova R., Giannarelli S., Muscatello B.: Electroanalysis 25, 303 (2013). 7. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011).

107

8. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 9. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009). 10. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 11. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 12. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal.-Warsaw 52, 911 (2007). 13. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 14. Sokolova R., Ramesova S., Degano I., Hromadova M., Gal M., Zabka J.: Chem. Commun. 48, 3433 (2012). 15. Sokolova R., Kolivoska V., Gal M.: J. Electroanal. Chem. 710, 36 (2013). 16. Navratil T., Zakharov S., Pelclova D., Mrazova K.: Modern Electrochemical Methods XXXIII: Short Information on Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Peckova K., Eds.), www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody13.pdf, Best servis, Jetrichovice 2014, p. 123. 17. Hovda K. E., Hunderi O. H., Tafjord A. B., Dunlop O., Rudberg N., Jacobsen D.: J. Intern. Med. 258, 181 (2005). 18. Hassanian-Moghaddam H., Pajoumand A., Dadgar S. M., Shadnia S.: Hum. Exp. Toxicol. 26, 583 (2007). 19. TIC: Methanol. http://www.tis-cz.cz/index.php/informace-pro-odborniky/methylalkohol, Downloaded: 4.4.2013. 20. Hovda K. E., Urdal P., Jacobsen D., v knize: Methanol poisoning: Clinical features, diagnosis, treatment and prognosis.; (Hovda K. E., ed. Faculty of Medicine, University of Oslo, Oslo, 2005. 21. http://www.novinky.cz/domaci/294663-vedci-objevili-novou-metodu-pro-rychloudiagnozu-otravy-metanolem.html, Downloaded: 6.4.2013. 22. Zakharov S., Pelclova D., Navratil T., Belacek J., Kurcova I., Komzak O., Salek T., Latta J., Turek R., Bocek R., Kucera C., Hubacek J. A., Fenclova Z., Petrik V., Cermak M., Hovda K. E.: Kidney Int., Accepted (2014). 23. Mrazova K., Navratil T., Pelclova D.: Subst. Use Misuse 46, 460 (2011). 24. Zakharov S., Navratil T., Pelclova D.: Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 110, 427 (2012). 25. Zakharov S., Navratil T., Pelclova D.: Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. (2013). 26. Krenova M., Pelclova D., Navratil T.: Hum. Exp. Toxicol. 26, 955 (2007). 27. Krenova M., Pelclova D., Navratil T., Merta M.: Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 149, 473 (2005). 28. Pelclova D., Fenclova Z., Kacer P., Kuzma M., Navratil T., Lebedova J.: Ind. Health. 46, 484 (2008). 29. Pelclova D., Fenclova Z., Kacer P., Navratil T., Kuzma M., Lebedova J., Klusackova P.: Ind. Health. 45, 766 (2007).

108

Use of the Silver Solid Amalgam Electrode for Determination of 5-Nitroindazole Kateřina Nováková a,b, Tomáš Navrátil a, Vojt ch Hrdlička c, Vlastimil Vyskočil c, Jiří Barek c, and Jaromíra Chýlková b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering. Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic c Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE “Supramolecular Chemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic Abstract The voltammetric behavior of 5- nitroindazole (5-NI) has been investigated using mercury meniscus modified (m-AgSAE) silver solid amalgam electrode (inner diameter 0.5 mm). Differential pulse voltammetry (DPV) and cyclic voltammetry (CV) were used for study of electrochemical behavior of 5-NI. Britton-Robinson buffer was found to be the best available supporting electrolyte for 5-NI determination. The reaction mechanism was investigated by CV and by elimination voltammetry with linear scan (EVLS). DPV with optimized working parameters was applied for analysis of model solutions containing 5-NI. The limit of detection was calculated as 0.14 mol L for m-AgSAE. Proposed method was successfully tested for analysis of real water samples spiked by 5-NI. Key words: 5-nitroindazole, Silver solid amalgam electrode, Voltammetry, Elimination voltammetry with linear scan. Introduction 5-nitroindazole (5-NI, Fig. 1) is the indazole derivative (nitro groups is located in the position 5 on the ring). It is commonly used, e.g., as anti-fog agent in the preparation of thin metal surfaces for electronics and a part of the fixative solution in photographs. 5-NI is harmful after inhalation and ingestion, also is irritating the skin and eyes mucous membranes. It is also a proven mutagen 1. Compounds containing nitro group are very interesting and have been investigated by electrochemistry for a long time. Reduction of nitro group(s) at the aromatic or heterocyclic ring is especially utilized for determination of these compounds 2. Mercury proved to be the best electrode material for electroanalytical determination of these compounds, but we have used solid amalgam electrode 3-5 for these purposes. Significant advantage of this type of working electrode is low amount of mercury, because the use of mercury is currently considerably reduced and in several European countries the use of liquid mercury is completely prohibited. This type of electrode was used because it represents an intermediate step between mercury and solid working electrode 2, 6-10. The used silver solid amalgam electrode (AgSAE) was formed from silver amalgam which was prepared by mixing metallic powder with liquid mercury. AgSAEs can be classified according to the modification of their surfaces, as polished(p-AgSAE), film modified (MF-AgSAE), and mercury meniscus modified (m-AgSAE). The last mentioned one was utilized in our study 11, 12. Amalgam electrodes have advantages such as high hydrogen overvoltage and wide range of working potentials. They are also mechanically stable and easily handled with the possibility of electrochemical regeneration of the working surface 11, 12.

109

Our goal was to develop a method for determination of 5-NI. This method was based on cathodic voltammetric responses provided by the reduction of nitro-group of 5-NI and practical applicability was verified on model samples of real river water.

Fig. 1. Structure of 5-NI Experimental The stock solution of 5-NI (Sigma-Aldrich, Czech Republic, 10 mmol L-1) was prepared by dissolving 4.5 mg in 250 mL of deionized water and then stored in dark and cold. Britton– Robinson (BR) buffers of pH values from 2 to 12 were prepared by mixing the proper amounts of alkaline component of 0.2 mol L-1 NaOH (Lachema, Czech Republic) and of acidic components consisting of 0.04 mol L-1 H3PO4, 0.04 mol L-1 H3BO3 and 0.04 mol L-1 CH3COOH (all Lachema, Czech Republic). All the other chemicals used were of analytical grade purity. For all the measurements, deionized water from Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic (conductivity < 0.05 µS cm-1) was used. Voltammetric measurements were performed with the computer controlled Eco-Tribo Polarograph (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic), equipped by MultiElChem 3.1 software for indows P (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Czech Republic). The mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode was used as a working electrode (m-AgSAE) 6, 13. Ag/AgCl/3M KCl was used as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode (both from Elektrochemicke detektory, Turnov, Czech Republic). The measurements were performed at laboratory temperature (25  2 °C). xygen was removed from the measured solutions by bubbling with nitrogen (purity class 4.6; Messer Technogas, Prague, Czech Republic) for 5 minutes. The values of pH were measured using pH-meter Jenway 3505 (Bibby Scientific Limited, UK) equipped with glass electrode. The electrode consisted of drawn-out glass tube, the bore of which near the tip was filled with silver solid amalgam which was connected to an electrical contact. A freshly prepared silver solid amalgam electrode was first ground on a soft emery paper and then polished on polishing polyurethane pad, using polishing kit (Electrochemical Detectors, Turnov, Czech Republic), consisting of Al2O3 suspension (particle size 1.1 mm) and soft polishing Al2O3 powder (particle size 0.3 mm). After finishing of this step, the p-AgSAE was ready for its following use. Usually, the electrode surface should be polished once a week in case of daily measurements. m-AgSAE was prepared by its immersion into a small volume of liquid mercury and by agitation for 15 seconds, during which the mercury meniscus, covering solid silver amalgam surface, was created. Before starting the work as well as after every pause longer than one hour, the electrode surfaces of both amalgam electrodes were activated in the solution of 0.2 mol L-1 KCl by applying -2200 mV vs. Ag/AgCl/3M KCl electrode for 300 s while the solution was intensively stirred. The regeneration step of the electrode surface was inserted into the “design” utility of particular measuring methods used in the computer software MultiElChem 2.3. The regeneration was realized directly in the supporting electrolyte 9.

110

Cyclic voltammetry (CV) and direct current voltammetry (DCV) were applied for the first set of studies of voltammetric behavior of 5-NI at m-AgSAE. Dependences of the obtained signals on pH and on the scan rate have been studied. Differential pulse voltammetry (DPV) with pulse width of 80 ms, pulse height of -50 mV for cathodic scans and with scan rate of 10 mV s-1, was used for determination of the tested compound using these working electrodes. The optimum pH of BR buffer, used as the supporting electrolyte, was found to be 8. DPV was applied for measurements with m-AgSAE with the initial potential Ein = +100 mV and with final potential Efin = -1200 mV. Purified nitrogen was passed through the sample for a period of 5 min before each measurement and then nitrogen atmosphere was maintained above the solution in the cell during the measurement. The minimum number of standard additions was 5. Each measurement of the current signals was implemented in cycles composed of 5 times repeated records under the same conditions. The achieved results were statistically evaluated 14 using QC Expert software (Trilobyte, Czech Republic) and Excel (Microsoft Inc., Czech Republic). The limits of decision (LC), detection (LD) and quantification (LQ) and the parameters of the calibration curves (e.g., slope, intercept) were calculated as described in 10, 14. Results and discussion The dependence of voltammetric behavior of 5-NI on pH was investigated using DCV at m-AgSAE. Firstly, the most suitable pH of the supporting electrolyte (BR buffer) had to be found. The tested pH range was from pH 2 to pH 12. Only cathodic way of polarization was investigated. Two well-developed peaks were observed in the whole range of pH at m-AgSAE. The first (more positive) peak corresponded to the irreversible four electron reduction of the nitro group to the hydroxylamino group. In acidic solutions the more negative peak belonged to the two electron reduction of the hydroxylamino derivative to the amino compound. Mechanism is different in alkaline solutions. First peak represents a nitro radical anion formation. Second peak (more negative) corresponds to the slow three electron irreversible reduction 2, 15, 16. The reproducibility of the recorded signals was very poor in strongly acidic and strongly alkaline solutions. The current signals were better developed and the reproducibility of current records was better in pH range from 6 to 8. The best developed and the best reproducible cathodic signal corresponding to nitro-group reduction was registered at pH 8. The dependences of peak heights of reduction peaks of 5-NI on the scan rate were studied using DCV. The peak height of the more positively situated peak (corresponding to the fourelectron reduction of the nitro group to the hydroxylamino group) registered at m-AgSAE increased linearly with square root of the scan rate in the range from 0 to 160 mV s-1. Therefore, it is possible to conclude that the above mentioned cathodic four-electron reduction electrode processes at m-AgSAE are controlled by diffusion. EVLS was used for elucidation of electrode processes occurring at the surface of the electrode. The elimination curves were calculated according to the Eqs. (3)-(9) in Ref. 17. At m-AgSAE at any scan rate set at pH 8 both recorded voltammetric peaks corresponded to the diffusion controlled processes. Any significant influence of adsorption had not been confirmed. This indicates that application of adsorptive accumulation cannot improve the signal intensity.

111

DPV was applied for 5-NI determination in model solutions. Effect of the initial potential changes was studied. The best reproducible and the best developed peak was obtained using Ein +100 mV. The influence of accumulation potential and accumulation time on the peak height of the cathodic peak was tested too. However, no significant effect was found in the case of m-AgSAE. The optimum scan rate 10 mV s-1 was applied for all measurements. Some chemometric parameters were calculated using direct method of signal according to the IUPAC 14: limit of decision (CC): 0.07 mol L-1, limit of detection (LD) 0.14 mol L-1, and limit of quantification (LQ) 0.2 mol L-1. These parameters were achieved without application of accumulation time. It is possible to suppose that these chemometric parameters in model samples are sufficient for 5-NI determination in real samples (e.g., real water samples, soil extract solutions, etc.). Applying DPV with optimized parameters, 5-NI was also determined in real samples. The spiked content of 5-NI in analyzed solutions (4 mol L-1) was compared with obtained results. The standard addition method was used for the determination of 5-NI, and 3 standard additions were added at least for each determination. Every determination was 5 times repeated and particular RSD(5) were calculated. It is evident that the found amounts of 5-NI are consistent with its expected content. Conclusions The voltammetric behavior of 5-nitroindazole was studied using modifications of silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). It was found that it provided two cathodic signals in a wide range of pH. This reduction response was dependent on the pH value and the highest peak of 5-NI was observed in slightly alkaline medium. BR of pH 8 was utilized for determination of this nitro compound using DPV under the found optimal working conditions. Some chemometric parameters were calculated (LD = 0.14 mol L-1). The applicability of the proposed method was verified by determination of 5-NI in the real sample of river water. It was proved that the results achieved with the tested working amalgam electrode were consistent with the spiked content of 5-NI. Therefore, it can be concluded that we developed a reliable and a simple method for determination of 5-NI in various environmental matrices using m-AgSAE. Acknowledgments K. Nováková thanks for the support of University of Pardubice (grant No. SGSFCHT/2014006), and T. Navrátil thanks for the support of the Czech Science Foundation (project GA ČR No. P208/12/1645). References 1. Rosenfeld R. J., Garcin E. D., Panda K., Andersson G., Aberg A., Wallace A. V., Morris G. M., Olson A. J., Stuehr D. J., Tainer J. A., Getzoff E. D.: Biochemistry 41, 13915 (2002). 2. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009). 3. Novotny L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000). 4. Novotny L., Havran L., Josypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis 12, 960 (2000). 5. Mikkelsen O., Schroder K.: Anal. Lett. 33, 3253 (2000). 6. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 7. Fadrna R., Yosypchuk B., Fojta M., Navratil T., Novotny L.: Anal. Lett. 37, 399 (2004).

112

8.

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

Navratil T., Svancara I., Mrazova K., Novakova K., Sestakova I., Heyrovsky M., Pelclova D., v knize: Sensing in Electroanalysis Vol. 6.; (Kalcher K., Metelka R., Svancara I., Vytras K., Eds.),sv.Vol. 6 University Press Centre, Pardubice, 2012. Novakova K., Navratil T., Jaklova Dytrtova J., Chylkova J.: International Journal of Electrochemical Sciences 8, 1 (2013). Nováková K., Navrátil T., Dytrtová J., Chýlková J.: J. Solid State Electrochem., 1 (2013). De Souza D., de Toledo R. A., Mazo L. H., Machado S. A. S.: Electroanalysis 17, 2090 (2005). De Souza D., de Toledo R. A., Suffredini H. B., Mazo L. H., Machado S. A. S.: Electroanalysis 18, 605 (2006). Yosypchuk B., Novotny L.: Talanta 56, 971 (2002). Miller J. N., Miller J. C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. Pearson Education, Harlow 2005. Peckova K., Barek J., Zima J.: Chem. Listy 95, 709 (2001). Laviron E., Meunierprest R., Mathieu E.: J. Electroanal. Chem. 371, 251 (1994). Skopalova J., Navratil T.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 961 (2007).

113

Isolation and Characterization of Protoplasts and their Utilization for Model Membrane Preparation (Izolace a charakterizace protoplastů a jejich využití pro tvorbu modelových membrán) Kateřina Nováková a, Tomáš Navrátil a, Ivana Šestáková a, Jan Langmaier a, Michael Heyrovsky a, Brigita Zámečníková b, and Hana Vodičková b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Czech University of Life Sciences, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Kamýcká 129, 165 21 Prague 6, Czech Republic Abstract Protoplasts are prepared form plant cells by removing their cell walls, which are usually destroyed mechanically or by enzymes. Protoplasts exhibit the spherical shape after removing of their cell walls. They can be isolated from a range of plant tissues: leaves, stems, roots, anthers, and even pollen. Plasmatic membranes surrounding protoplasts can be used as a source of model membranes. Therefore, some parts of plasmatic membranes or subcellular organelle membranes, which contain specific transport systems, can be isolated and integrated to model phospholipid membranes. State of such model membranes can be characterized by electrochemical impedance spectrometry (EIS) and the transported species can be determined with the use of voltammetric methods. Key words: Protoplasts, Cells, Model membrane, Electrochemical impedance spectrometry (EIS), Voltammetry. Úvod Rostlinné buňky, které jsou zbavené bun čné st ny a jsou obklopeny pouze cytoplazmatickou membránou, se nazývají protoplasty ( br. 1). Jsou potencionáln schopni regenerovat bun čnou st nu, r st a d lit se. Živé protoplasty jsou totipotentní, takže z jediného protoplastu lze získat zp t celou rostlinu. Poprvé byly protoplasty izolovány na konci 19. Století, a to pomocí mechanické izolace. Tento zp sob vedl k nízkému výt žku o nízké kvalit , a z toho d vodu se hledali další možné cesty izolace. V roce 1960 bylo zjišt no 1, že neporušené protoplasty mohou být získány inkubací rostlinného pletiva v roztoku celulázy 2. Takto získané protoplasty byly životaschopné a funkčn aktivní a jejich výt žek byl velký. V současné dob se stala izolace protoplast z rostlinného pletiva jednoduchou metodou, a to především díky komerční dostupnosti enzym , které št pí bun čnou st nu 3, 4. Celuláza a pektináza jsou hydrolytické enzymy, které jsou nejčast ji využívané. Pektináza (např. macerozym R-10, Maceráza, pektolyáza) nejprve rozšt pí střední lamelu, což umožní rozpad pletiva na jednotlivé buňky, a následn celuláza (např. nozuka R-10, Driselase, Cellulysin) rozruší vlastní bun čnou st nu. Použití enzym je však omezeno na parenchymatické buňky, které mají bun čnou st nu nelignifikovamou. Lignin je totiž v či zmín ným enzym m odolný. Nezbytnou složkou roztoku, který se používá při odstraňování bun čné st ny, je osmotikum například manitol, který zp sobuje odčerpání vody z cytoplazmy bun k. smotikum zabraňuje popraskání protoplast . Tím v podstat nahrazuje funkci bun čné st ny. Uvoln ní protoplast ovlivňuje celá řada faktor , jako je typ zdrojového materiálu, rostlinný druh, teplota, doba inkubace enzymu, pH a výše zmín né osmotikum. Rostlinný materiál je inkubován v enzymatickém roztoku a po uvoln ní z pletiva a bun čné st ny jsou protoplasty odd leny filtrací, centrifugací a promýváním a umíst ny do kultivačního média, které obsahuje makroelementy, mikroelementy, vitamíny, n které aminokyseliny, sacharidy a fytohormony. Bez mechanické ochrany, kterou představovala

114

bun čná st na, by v nevhodných osmotických podmínkách byly protoplasty poškozeny a zničeny. Z toho d vodu se do enzymové sm si (a také do všech dalších roztok ) přidávají osmoticky aktivní látky (manitol, sorbitol, glukóza, sacharóza) či případn odpovídající koncentrace solí (např. médium 5). Stabiln jší jsou protoplasty ve slab hypotonickém prostředí než v izotonickém. Po vlastní izolaci protoplast následuje stanovení životnosti. Nejčast ji se využívá fluorescein diacetát, který proniká do bun k a v živých buňkách je s pomocí bun čných esteráz přem n n na zelen fluoreskující produkt, který již nem že proniknout přes cytoplazmatickou membránu ven z bun k a kumuluje se tedy pouze v nepoškozených buňkách. Dále se m že využít barvení Evansovou modří nebo trypanovou modří, neutrální červení nebo Calcofluorem hite M2R. Ke stanovení výt žku protoplast se využívá Bürkerova kom rka. Protoplasty mají celou řadu využití, především při studiu individuálních fyziologických vlastností rostlinných bun k či při genetických operacích (zvýšení cytogenetické variability pomocí somatické hybridizace, genetické transformace nebo samoklonální variability). Dále pak především v případech, kdy je bun čná st na na překážku (např. přenos organel, cizorodé DNA, vnášení mikroorganism ). Protoplasty lze využít též při studiu základních fyziologických a biochemických pochod v buňkách a jako modelové systémy pro studium transportu látek přes membránu 5-7, či k izolaci částí plazmatické membrány a bun čných organel 8.

Obr. 1. Mikroskopický snímek protoplast izolovaných z listu brambor za pomoci inverzního mikroskopu I 54 a CCD kamery DP71 (obojí lympus, Česká Republika). Elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS) je často používanou technikou pro objasn ní vlastností biologických membrán. Ukázala se být užitečnou a d ležitou metodou pro studium tohoto velice komplikovaného systému. EIS slouží k detailnímu popisu strukturních a funkčních vlastností zvoleného systému. Experimentální část Jako základní elektrolyt byl v našich experimentech použit 0,1M KCl (KCl, suprapur, Merck, Praha, Česká republika). Rozpoušt dla, použitá k rozpušt ní fosfolipidu, byla o čistot p.a. (ethanol – 99,88 %, n-heptan – 99 %), Penta-Švec, Česká republika. Využívaný fosfolipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, lecitin (16:0/16:0)) byl pořízen od Avanti, Polar lipids, USA. Všechny ostatní použité chemikálie byly čistoty p.a.. Pro všechna m ření

115

byla použita deionizovaná voda připravená v zařízení Milli-Q-Gradient, Millipore, Česká republika (konduktivita < 0,05 μS cm-1). Pro izolaci protoplast z brambor kultivovaných in vitro se používala sm s enzym v osmotickém roztoku 5 (NaCl, KCl, CaCl2 a glycin (Sigma-Aldrich, Česká Republika). Dále byla využita sacharóza (Penta-Švec, Česká Republika). Použité enzymy byly celuláza Onozuka R-10 a Macerozym (obojí SERVA v distribuci BioTech, Česká republika). Izolace a čišt ní protoplast probíhaly za sterilních podmínek. Listy rostlin brambor p stovaných in vitro byly rozřezány skalpelem na malé segmenty, které byly ponořeny do roztoku 5 s přidanými enzymy (5 ml) v Petriho miskách (pr m r 55 mm). Pro rozrušení bun čných st n byly ponechány segmenty ve tm při teplot 25 °C po dobu 18 hodin. Poté se sm s roztoku enzym opatrn zfiltrovala přes síto 70-90 µm. Filtrát byl opatrn pipetou přenesen do sklen né centrifugační zkumavky a odstřed n (5 minut při 100 g). Supernatant byl odpipetován a sediment resuspendován v roztoku 5. Následn byl roztok op t centrifugován po dobu 5 minut při 100 g. Supernatant byl odpipetován a sediment resuspendován ve 20% roztoku sacharózy a překryt roztokem W5 tak, aby se vytvořily dv vrstvy. p t byla provedena centrifugace po dobu 5-10 minut při 100 g. Ve vrstv roztoku 5 se nacházela vrstva protoplast , které byly mikropipetou opatrn převedeny do centrifugační čisté zkumavky a resuspendovány v roztoku 5. dstřeďování bylo opakováno do dosažení požadované hustoty protoplast v 1 ml média (zjišt ní pomocí Bürkerovy kom rky). Po celou dobu se pracovalo velmi opatrn , bez náraz a náhlých pohyb , aby nedošlo k rozbití protoplast , které již nebyly chrán ny bun čnými st nami. Pro EIS experimenty byla použita tzv. “Sklen ná” cela, která byla vyvinuta pro realizaci transportu iont a komplex přes modelové fosfolipidové membrány v naší laboratoři 5. Cela je složena ze dvou sklen ných částí (každá má objem 3 ml), reprezentující vnitřní a vn jší prostředí buňky. Ty jsou vzájemn odd leny pomocí dvou teflonových částí s otvorem o velikosti 0,07 cm2, mezi n ž je umisťován polykarbonátový nosič. Elektrody jsou umíst ny v otvorech na vrchní stran sklen ných součástí (dv elektrody argentochloridové a jedna elektroda platinová). Do obou částí cely je dávkován základní elektrolyt (např. 0,1M KCl). Připravené neporušené protoplasty se nanášely na polykarbonátový hydrofilní nosič s póry o velikosti 0,05 μm (Nuclepore Track-Etch Membrane, hatman, USA) buď samostatn , nebo s přím sí fosfolipid pro zpevn ní. Pro studium transportních mechanism se protoplasty rozrušovaly za pomocí ultrazvukové lázn (ELMA CLEAN B , P-LAB, Česká republika) a třepačky (Lab Dancer, IKA, Česká republika). Rozrušené části protoplast se přimíchávaly do roztoku fosfolipidu a nanášely se na polykarbonátový nosič. Pokud byl použit fosfolipid pro přípravu membrány, tak modelové membrány byly vytvářeny postupem, který byl popsán v publikacích 5, 6, 9, 10. Lecitin byl rozpušt n v ethanolu a n-heptanu. K této sm si byly přidány zcentrifugované protoplasty a následn bylo 20 μl této sm si naneseno na jednu stranu polykarbonátového nosiče. Rozpoušt dlo bylo odpařeno a poté byl stejný objem sm si nanesen na druhou stranu nosiče. b pokryté strany byly po zvolený čas stabilizace ponechány na vzduchu a poté byly zavodn ny nosným elektrolytem. Pro m ření za použití EIS byl použit potenciostat PGSTAT302N + FRA2 modul, řízený softwarem Nova 1.10 (vše Metrohm, Česká republika). M ření byla provád na pomocí dvou Ag/AgCl elektrod (stříbrný drátek o pr m ru 1 mm) elektrolyticky potažených vrstvou AgCl a ponořených v základním elektrolytu, které sloužily jako pracovní a referentní elektroda. Platinový drátek (pr m ru 1 mm) byl použit jako pomocná elektroda. Systém pracoval

116

v tříelektrodovém zapojení. Systém poskytoval spolehlivé výsledky v rozmezí frekvencí od 0,1 Hz do 1 MHz při amplitud 0,005 V. Při všech m řeních bylo vkládáno na elektrody nap tí -0,1 V. Tato hodnota je blízká membránovému potenciálu v reálných biologických systémech. Všechna m ření byla provád na za laboratorní teploty (25,0 ± 0,5 °C). Výsledky a diskuze Protoplasty byly úsp šn izolovány z rostlinného pletiva a charakterizovány za pomocí mikroskopických technik (stanovení velikosti protoplast , životnosti a výnosu). Nanášení protoplast na polykarbonátový nosič a jejich zachycení na n m neprob hlo úsp šn bez přítomnosti lecitinu. Protoplasty po aplikaci základního elektrolytu byly odplaveny, jak nám potvrdila EIS m ření. Pokud byly protoplasty přidány k lecitinu a poté naneseny na polykarbonátový nosič, došlo k vytvoření jejich souvislé vrstvy, která překryla póry nosiče, v d sledku čehož došlo ke zvýšení hodnot impedančních charakteristik, a přes takto vzniklou membránu, která v sob obsahuje reálné části rostlinné membrány, byl testován transport látek významných v životním prostředí (např. iont t žkých kov ). Závěr Úsp šn se podařilo připravit protoplasty z rostlinných bun k a ve sm si s modelovým fosfolipidem (lecitinem) byla vytvořena sm sná fosfolipidová membrána. Díky získaným poznatk m se budeme moci v budoucnu zam řit na izolaci konkrétních membránových struktur (jak z cytoplazmatické membrány, tak z membrán subcelulárních organel) za využití například metody patch-clamp či ultracentrifugace v sacharózovém poli a jejich aplikaci při studiu transportu biologicky významných látek přes n . Poděkování Autoři d kují za podporu Grantové agentuře ČR (GA ČR P208/12/1645). References 1. Cocking E. C.: Nature 187, 962 (1960). 2. Protivánková I., Palacký University lomouc, lomouc, 2010. 3. Cocking E. C.: International Review of Cytology-a Survey of Cell Biology, 1 (1983). 4. Rao K. S., Prakash A. H.: J. Biosci. 20, 645 (1995). 5. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 27 (2013). 6. Novakova K., Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Chylkova J.: Modern electrochemical Methods XXXIII: Characterization of Electrochemical Behavior of Lecihin-Cholesterol Mixture in Formation of Model Phospholipid Membranes, Jetrichovice, Czech Republic, (Navratil T., Fojta M., Peckova K., Eds.), Best servis Usti nad Labem, Jetrichovice, Czech Republic 2013, p. 128. 7. Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX: Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes, Jetrichovice, (Barek J., Navratil T., Eds.), http://www.bestservis.eu/upload/file/Sbornik_metody10.pdf, BEST Servis, Jetrichovice 2010, p. 119. 8. Liu S. H., Huang X. H., Liu C. L., Cong B. L., Han G. A.: J. Appl. Phycol. 20, 29 (2008). 9. Nováková K., Navratil T., Šestáková I., Mareček V., Chýlková J.: Chem. Listy 109 (2014). 10. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011).

117

The Influence of Dissolved Air on Potentiometry Using Silver/Silver Ions or Colloids Interfaces (Vliv rozpuštěného vzduchu na potenciometrii využívající rozhraní stříbro/stříbrné ionty nebo koloidy) Ladislav Novotný, Renáta Petráňková, and Abraham Kabutey University Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The influence of dissolved air on potentiometry using silver/silver ions (or colloids) interphases was tested. Potentiometric measurements in aqueous solutions containing silver ions, saturated by nitrogen or by air were carried out. Sensitivity and reproducibility of the applied technique was much better by using the nitrogen atmosphere. Adding of colloid silver particles into the solution caused a worsening of sensitivity and repeatability of the obtained concentration dependences. Repeatability of steady data (measurements) at constant silver concentrations was better than ± 0.5 %. Key words: Potentiometry, Free silver ions, Silver colloid (nano) particles. Úvod V posledních letech roste zájem mj. o sledování stříbrných iont ve vodných roztocích. Mezi jejich hlavní zdroje patří při tom pr myslové využití stříbra nebo jeho slitin, dentální a laboratorní centra a prostředky na bázi koloidního stříbra až nanostříbra pro zdravotní (dezinfekční ad.) účely 1,2. Problematika koloidního stříbra a nanostříbra zahrnuje při tom množství dosud neobjasn ných otázek, spojených např. s jeho toxicitou, s časovou, teplotní či fotosensitivní stabilitou apod. R zné typy produkt , které stříbrné ionty v interakci s okolím vytvářejí, ovlivňují zp tn koncentraci volných Ag+. U roztok účelov využívaných v oblasti zdravotnictví nebo pr myslu je obsah volných iont Ag+ ovlivňován i stabilizátory, jako jsou sacharidy 3 nebo r zné biomolekuly 4. Z hlediska životního prostředí i r zných aplikací má význam sledování koncentrace volných iont Ag+, i kdyby jen na orientační úrovni. V dobře vybavených analytických laboratořích se k tomu účelu využívají např. 5 atomová absorpční spektroskopie, vhodné varianty optické emisní popř. hmotnostní spektrometrie (ICP- ES popř. MS). Pro b žnou provozní praxi by však m ly velký význam i jiné metody, mezi jejichž přednosti by patřila relativní jednoduchost aplikace a široká dostupnost, i když za cenu nižší citlivosti, přesnosti, mezi stanovitelnosti apod. V rámci vyhledávacího výzkumu byly předb žn testovány možnosti potenciometrických m ření pro orientační stanovení Ag+. Experimentální část Pro potenciometrická m ření bylo využito uspořádání zahrnující potenciometrický blok polarografu PA4 (Laboratorní přístroje, Praha) s laboratorn upravenou impedancí. Jako referentní sloužila upravená referentní elektroda Ag/AgCl (Elektrochemické detektory, Turnov), vnitřní roztok elektrody obsahoval 0,1 M KNO3. Pro přípravu roztok byla použita demineralizovaná voda, připravená s použitím elektroosmózy. Použité chemikálie (AgN 3, KNO3 ad.) byly čistoty p.a. Součástí m ření bylo i experimentální uspořádání s nádobkou a stojanem Eco-Tribo polarografu (ECO-TREND PLUS, Praha). Pro m ření v nepřítomnosti vzdušného kyslíku bylo aplikováno bublání žárovkovým dusíkem čistoty 99,99 % po dobu

118

cca 6 minut. Pro orientační testovací m ření byly použity i roztoky obsahující koloidní stříbro, p vodn připravené modifikovaným Tollensovým procesem 3 z chemikálií čistoty p.a. Výsledky a diskuse Vlastní m ření a použité uspořádání vycházelo z předb žných poznatk uvedených v 6-8. Detekční část pracovní elektrody byla stříbrná a byla zafixována v obalu elektrody ve tvaru hrotu. V rámci předb žného ov ření funkce byl obal vytvořen buď z m kkého tavného skla nebo z inertního plastu. Vzhledem k tomu, že nebyly pozorovány rozdíly v chování mezi t mito provedeními, byla v tšina dalších výsledk získána s plastovým uspořádáním. Po vylešt ní povrchu elektrody a nakontaktování byl elektrodový systém včetn upravené referentní argentchloridové elektrody zasunut do m řeného roztoku obsahujícího přidávané stříbrné ionty o r zné koncentraci. Za střídavého vysouvání a zasouvání elektrody byla ov řena velmi dobrá opakovatelnost m ření lepší než ± 0,5 %. Poté byl určován potenciál m rné elektrody při r zných koncentracích Ag+ v roztoku po vybublání N2 ( ). Následn byl proveden test vlivu rozpušt ného vzduchu (resp. vzdušného kyslíku) tak, že bylo m ření U opakováno za b žného přístupu vzduchu, přičemž byla získána data . Po op tovném vybublání roztoku N2 byl obdobn získán sloupec hodnot potenciál (Tabulka I), který m l za cíl ilustrovat míru vratnosti stavu na povrchu m rné elektrody po opakovaném vybublání N2. Získané orientační hodnoty jsou shrnuty v Tabulce I. Tabulka I. Zm ny potenciálu pracovní elektrody s koncentrací Ag+ ( , ) a na vzduchu ( . Koncentrace Ag+, g-ion/l ,V 0,00003 0,33 0,0003 0,40 0,003 0,45 0,03 0,50 0,17

v roztoku po jeho vybublání N2 ,V 0,40 0,43 0,46 0,49 0,09

,V 0,45 0,45 0,46 0,48 0,03

Zm ny odpovídající sloupc m s bubláním a bez n j ukázaly, že citlivost m ření byla přibližn dvojnásobná v případ práce pod atmosférou N2 proti vzdušné atmosféře. Z grafických pr b h ( br. 1) vyplývá, že zm ny s koncentrací jsou při provád ní série m ření nejvýrazn jší po prvním vybublání roztoku dusíkem. Při střídavé práci pod dusíkem a na vzduchu se systém spontánn nevracel do výchozího analyticky využitelného stavu (pod dusíkem), nebo se do n ho vracel jen pomalu, v řádu hodin. Při opakování m ření za dané koncentrace Ag (např. 50 µg-ekv/l, čili 50 µM) poté, co byla m rná elektroda z roztoku vysunuta a zp t zasunuta, lišily se vzájemn ustálené hodnoty potenciál v rozmezí cca ±25 mV. bdobn tomu bylo i v případ roztoku koloidního Ag. V tomto případ se však zhoršila i citlivost m ření, patrn v d sledku adsorpce koloidních částic na povrchu elektrody.

119

Obr. 1. Pr b h závislosti potenciálu m rné elektrody na koncentraci stříbrných iont po vybublání roztoku dusíkem ( , ) a na vzduchu . Závěr Provedená potenciometrická m ření potvrdila výrazný vzájemný rozdíl mezi výsledky získanými v roztoku obsahujícím rozpušt ný vzduch a rozpušt ný dusík. Citlivost m ření pod atmosférou dusíku byla přitom více než dvakrát vyšší. Lepší byla i opakovatelnost m ření v ustáleném stavu. V prostředí koloidního stříbra vedla přítomnost koloidních částic Ag ke zhoršení citlivosti m ření i ke zhoršení jejich opakovatelnosti. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu č. MSM č. 0021627502. Literatura 1. Lara H. H., Ayala-Nunez N. V., Turrent L. D. I., Padilla C. R.: World J. Microbiol. Biotechnol. 26, 615 (2010). 2. Lee S. M., Song K. C., Lee B. S.: Korean J. Chem. Eng. 27, 688 (2010). 3. Tolaymat T. M., El Badawy A. M., Genaidy A., Scheckel K. G., Luxton T. P., Suidan M.: Sci. Total Environ. 408, 999 (2010). 4. Asharani P. V., Wu Y. L., Gong Z. Y., Valiyaveettil S.: Nanotechnology 19 (2008). 5. pršal J., Knotek P., Pouzar M., Palarčík J., Novotný L.: Chem. Listy 107, 386 (2013). 6. Novotný L.: Disertační práce. AV ČR, Praha 1998. 7. Novotný L.: Chem. Listy 103, s269 (2009). 8. Novotný L., Petráňková R., Kabutey A..: ChemZi 9, 231 (2013).

120

New Electrophoretic Approach to the Rapid Determination of Creatinine and Uric Acid in Human Urine Using a Coupled Capillary (Nový elektroforetický přístup k rychlému stanovení kreatininu a kyseliny močové v lidské moči pomocí spojené kapiláry) Václav Pavlíček, Petr T ma and Eva Samcová Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Electrophoretic separations were performed in a capillary formed by connecting a 9.7 cm long separation capillary with an inner diameter 25 µm and an auxiliary 22.9 cm long capillary with inner diameter 100 µm. A coupled capillary was tested for electrophoretic separation at high electric field and in the short-end injection mode with diode-array detection for determination of creatinine and uric acid in human urine samples. The developed methods are characterized by a separation time around 10 s and limits of detection 2.4 mg.L-1 for creatinine and 0.9 mg.L-1 for uric acid. Key words: Capillary electrophoresis, Coupled capillary, Creatinine, Diode-array detector, Uric acid Úvod Kapilární elektroforéza (CE) je účinná a instrumentáln jednoduchá separační technika, která používá malé objemy činidel a vzork . Doba separace se u v tšiny CE analýz pohybuje v rozmezí 5 až 40 min. Tato doba je příliš dlouhá pro provád ní analýz na rozsáhlých souborech vzork , pro sledování kinetiky chemických reakcí i pro analýzu málo stabilních látek. Migrační čas (tM) je v CE definován jako: Ltot Lef tM  (1-1) U ( el  eof ) kde Ltot a Lef jsou celková a efektivní délka kapiláry, U je separační nap tí a µel a µeof jsou elektroforetická a elektroosmotická mobilita. Ze vztahu je patrné, že cílené redukce migračního času lze dosáhnout n kolika zp soby 1: (a) zkrácením efektivní nebo celkové délky kapiláry, (b) zvýšením separačního nap tí, (c) zvýšením rychlosti elektroosmotického toku (E F) pomocí modifikátor E F nebo provád ním analýz při vysokém pH, (d) provád ním analýz za zvýšené teploty. V tomto přísp vku nov navržený zp sob snížení tM spočívá v kombinaci krátké separační dráhy a vysoké intenzity separačního pole. Na krátké separační dráze je redukováno rozmývání pík vlivem difúze, elektrodisperze i adsorpce, což v konečném d sledku vede ke snížení limitu detekce. Princip nové techniky je založen na spojení dvou kapilár o r zném vnitřním pr m ru (d). Intenzita elektrického pole (E) v sériovém spojení dvou kapilár závisí na 1/d2. Pro spojení separačních kapilár o d 25 a 100 m pak platí, že 25 m separační kapilára klade pr chodu elektrického proudu 16krát vyšší odpor na jednotku délky, než je tomu u 100 m kapiláry. Z toho lze usoudit, že intenzita elektrického pole, E, je v části 25 m kapiláry 2 16krát vyšší a řídí se vztahem:

121

E

U d  L25  L100 /  25   d100 

2



U d  L25  ( L  L25 ) /  25   d100 

2

(1-2)

E [kV/cm]

kde U je separační nap tí, L25, L100, jsou délky jednotlivých částí kapiláry, d25 a d100 jsou jejich vnitřní pr m ry a L je celková délka spojené kapiláry. Ze vztahu je zřejmé, že intenzita elektrického pole v separační části kapiláry se s rostoucí délkou kapiláry hyperbolicky snižuje, jak je ukázáno na br. 1. 3,2 2,8 2,4 2,0 1,6 1,2 0,8 5

10

15

20

25

30

35

l [cm]

Obr. 1. Závislost intenzity elektrického pole v 25 µm části kapiláry na délce této části pro celkovou délku kapiláry 32,5 cm. Modelováno pomocí programu Mathcad. Pro dosažení vysoké intenzity elektrického pole je nezbytné používat minimální celkovou délku kapiláry, která u komerčního přístroje CE (HP3D CE, Agilent Technologies) činí 32,5 cm. Při používání techniky dávkování vzorku do krátkého konce kapiláry je minimální délka 25 µm části kapiláry (vlastní analytická část) 9,7 cm. Při použití maximálního separačního nap tí 30 kV je za t chto podmínek dosaženo intenzity elektrického pole v analytické části kapiláry 2,9 kV/cm. Tato hodnota je 2,8krát vyšší než maximální elektrická intenzita v b žné kapiláře s jednotným vnitřním pr m rem. Spojená kapilára byla testována pro stanovení kreatininu a kyseliny močové v lidské moči. Kreatinin je využíván v humánní medicín jako indikátor správné funkce ledvin a je vedlejším produktem energetického metabolismu svalu a z t la je vylučován ledvinami 3. Kyselina močová je u člov ka konečným produktem metabolismu purin a z t la je vylučována močí v podob solí urát , především urátu sodného a amonného 4. Pro stanovení t chto dvou látek v moči a krvi jsou používány nejr zn jší analytické techniky. Experimentální část Separace byly provedeny v laboratorn sestavené kapiláře vytvořené spojením dvou standardních křemenných kapilár o vn jším pr m ru 363 µm (Composite Metal Services, UK). Separační kapilára, vnitřní pr m r 25 μm, délka 9,7 cm, a pomocná kapilára, vnitřní pr m r 100 μm, délka 22,9 cm, byly spojeny pomocí 9 mm dlouhé PTFE kapiláry pro HPLC (od 1/16´, id 0,25 mm, Watrex), viz Obr. 2. Trubička byla zahřáta pomocí horkovzdušné pistole nad teplotu tání PTFE, která je 330 °C (na horkovzdušné pistoli byla nastavena teplota 420 °C). hřátá a zm klá PTFE trubička byla přetažena přes konce obou rovn zaříznutých kapilár. Po vychladnutí (cca 60 s) vznikne hydrodynamicky t sné a mechanicky pevné spojení elektroforetických kapilár s minimálním mrtvým objemem. V dalším kroku je 8,4 mm od injekčního konce 25 µm kapiláry vytvořeno detekční okénko a kapilára je použitelná pro CE m ření. Tento technicky nenáročný postup spojení dvou kapilár o r zném d trvá cca 15 min 5.

122

1

3

2

Obr. 2. Detail spojení dvou kapilár: (1) 25 m analytická kapilára, (2) 100 m pomocná kapilára a (3) PTFE trubička. Takto připravená kapilára byla vložena do kazety elektroforetického přístroje (HP3D CE, Agilent Technologies) a separace byly provád ny při dávkování z krátkého konce kapiláry. Vzdálenost injekčního konce kapiláry k diode-array detektoru byla 8,4 cm. Před použitím byla nová kapilára aktivována promytím 0,1 M roztokem Na H po dobu 15 min, poté 10 min deionizovanou vodou a na záv r 10 min separačním elektrolytem. Mezi jednotlivými analýzami modelových vzork i upravené moče byla kapilára promývána pouze separačním elektrolytem po dobu 2 min. Vzorek byl do vstupu 25 µm kapiláry dávkován tlakem 50 mbar po dobu 5 s, což odpovídá délce zóny vzorku 4 mm. Separace probíhaly v kationtovém módu při nap tí +25 kV a odpovídající intenzit elektrického pole v separační části kapiláry 2,3 kV/cm. Tlak nutný pro promytí kapiláry a pro nadávkování vzorku je nutné aplikovat z konce pomocné kapiláry (d 100 µm), což vede k účinnému odstran ní vzduchových bublin, které by zp sobily přerušení separace. Separace probíhaly při konstantní teplot 25 °C. Veškeré použité chemikálie m ly analytický stupeň čistoty. Separační pufry (BGE) o složení 20 mM MES + 10 mM NaOH (pH 6,0) pro stanovení kyseliny močové a 20 mM kyselina citronová + 9 mM Na H (pH 3,0) pro stanovení kreatininu byly připravovány každý den čerstvé. pH bylo m řeno laboratorním pH metrem pM 3000 T (N mecko). Vzorky ranní moče získané od 7 zdravých dobrovolník byly filtrovány přes centrifugační filtry (Amicon 0.45 µm, Millipore, USA) při 14 100 otáčkách/min po dobu 3 minuty. Zfiltrované vzorky moče byly uchovávány v plastových uzavíratelných zkumavkách při teplot 4 °C, až do vlastního stanovení, které bylo provedeno tentýž nebo druhý den po odb ru. Před elektroforetickou separací byly vzorky temperovány na laboratorní teplotu, poté zpracovány dle následující metodiky: Pro stanovení kreatininu bylo k 20 l vzorku moče přidáno 20 l 1 mg.ml-1 imidazolu (interní standard) a 960 l 1 mM HCl. Pro stanovení kyseliny močové v moči bylo 20 l vzorku smícháno s 20 l 1 mg.ml-1 roztoku kyseliny paminosalicylové (PAS, interní standard) a 960 l 1 mM Na H. Tímto postupem je získán 50krát zřed ný vzorek moče. Výsledné koncentrace vnitřního standardu imidazolu i PAS v obou vzorcích dosahují 20 mg.L-1. Hladina kreatininu a kyseliny močové byla pro kontrolu ov řena pomocí komerčních kolorimetrických kit b žn používaných v klinických laboratořích; Bio-test (Creatinine liquid 500, Lachema, CR) a Bio-test (Uric acid liquid 500, Lachema, ČR). Veškerá spektrofotometrická m ření byla provedena v 1 cm kyvet na spektrofotometrickém přístroji Boeco (Model S-22, Germany). Pro statistické zpracování dat byl použit program rigin 8.0 ( riginLab Corporation, USA). Výsledky a diskuze Kreatinin je dusíkatý heterocyklus s hodnotou pKa 4,8. V kyselém BGE o složení 20 mM kyselina citronová + 9 mM Na H (pH 3,0) migruje kreatinin jako kationt. Při pH 3,0 je elektroosmotický tok potlačen a pozice neutrálního markeru nebyla registrována do 60 s. Jako vnitřní standard byl použit imidazol, který vykazuje obdobnou kationtovou pohyblivost a přirozen se nevyskytuje v lidské moči. Za takto nastavených experimentálních podmínek je dosaženo krátkého migračního času, 12,2 s pro kreatinin a 8,5 s pro imidazol, s hodnotou rozlišení obou látek 8,5. Na elektroferogramu, 50násobn řed né lidské moči je patrný výrazný, dobře kvantifikovatelný pík kreatininu zaznamenaný při vlnové délce 214 nm, viz Obr. 3. 123

kreatinin

5

imidazol

Signal (mAU), 214 nm

6

4 3 2 1 0 6

7

8

9

10

11

12

13

čas (s)

Obr. 3. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči. Experimentální podmínky; separační elektrolyt: 20 mM kyselina citronová + 9 mM Na H (pH 3,0), hydrodynamické dávkování 250 mbar.s, nap tí +25 kV, UV detekce při 214 nm.

7 6 5 4

PAS

kyselina močová

Signal (mAU), 292 nm

Kyselina močová je slabá dvojsytná kyselina s hodnotou první disociační konstanty pKa 5,4. Pro CE stanovení kyseliny močové byl použit optimalizovaný separační elektrolyt o složení: 20 mM MES + 10 mM NaOH (pH 6,0) a separace byla provedena v kationtovém módu při nap tí +25 kV. Za t chto podmínek migruje kyselina močová jako aniont proti elektroosmotickému toku, který je při pH 6,0 rychlý a strhne kyselinu močovou do detektoru. Rychlost E F je při pH 6 vyšší než elektroforetická pohyblivost kyseliny močové. Proto pík kyseliny močové (tM 8,5 s) je zaznamenán pozd ji než pozice E F. Jako interní standard byla použita PAS (pKA 3,6), která vykazuje vyšší elektroforetickou pohyblivost a při pohybu proti sm ru E F dosáhne detektoru pozd ji (tM pro PAS je 10,5 s, s rozlišením obou látek 9,7). PAS op t nepatří mezi látky přirozen se vyskytující v moči. Elektroferogram 50násobn řed né lidské moči s přídavkem interního standardu PAS, registrovaný při vlnové délce 292 nm, je znázorn n na Obr. 4.

3 2 1 0 6

7

8

9

10

11

12

13

čas (s)

Obr. 4. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči. Experimentální podmínky; separační elektrolyt: 20 mM MES + 10 mM NaOH (pH 6,0), hydrodynamické dávkování 250 mbar.s, nap tí +25 kV, UV detekce při 292 nm. Stanovené hodnoty kreatininu pomocí CE se v 7 vzorcích lidské moče pohybovaly v koncentračním rozmezí 221 – 1394 mg.L-1 pro kreatinin a 87 – 556 mg.L-1 pro kyselinu močovou. Stanovení kreatininu i kyseliny močové bylo současn provedeno pomocí standardních metod používaných v klinických laboratořích; Jaffého kolorimetrickou metodou pro stanovení kreatininu a enzymatickou metodou s urikázou pro stanovení kyseliny močové. Získané hodnoty byly ve velmi dobré shod s CE stanovením; porovnání metod je shrnuto v Tabulce I.

124

Tabulka I. Výsledky stanovení kreatininu a kyseliny močové v lidské moči pomocí CE a referenčních metod. kreatinin, mg.L-1 kyselina močová, mg.L-1 Vzorek moči enzymatický test CE Jaffého test CE - urikáza 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

1320 1394 931 221 1085 1245 840

1128 1407 981 272 1125 1436 975

556 382 269 87 501 356 278

558 339 326 82 495 305 298

Vyvinutá metodika poskytuje pro oba sledované analyty velmi krátké migrační časy kolem 10 s, s limitem detekce 2,4 mg.L-1 pro kreatinin a 0,9 mg.L-1 pro kyselinu močovou. Pro deset po sob se opakujících CE analýz jednoho vzorku moče jsou hodnoty relativní sm rodatné odchylky (RSD) pro migrační čas a plochu píku kreatininu 0,3 a 4,1 % a 1,8 a 5,7 % pro kyselinu močovou. Počet teoretických pater (N) se pohybuje kolem 120 tisíc na metr délky kapiláry pro kreatinin a 345 tisíc pater/m pro kyselinu močovou. Vyšší hodnota N pro kyselinu močovou je dána kratším migračním časem a nižším vlivem elektrodisperze na rozmytí píku. Pro velmi rychlé separace je vhodn jší vyjádřit separační účinnost jako N za jednotku času (N/tM), která lépe vystihuje rychlost separačního procesu 6. Pro kreatinin bylo dosaženo hodnoty 830 pater/s a pro kyselinu močovou 3400 pater/s. Experimentáln určená hodnota mobility pro kreatinin (u 35,3·10-9 m2s-1V-1) za podmínek vysoké intenzity elektrického pole a short-end injection módu dobře koresponduje s teoretickou hodnotou mobility vypočtenou pomocí programu Peak-Master 5.3 (u 33,4·10-9 m2s-1V-1). Tato shoda ukazuje, že i za použití vysoké intenzity elektrického pole je odvod Jouleova tepla z kapiláry dostatečný a separace probíhá obdobn jako při nízkých hodnotách E. Závěr Spojením dvou kapilár o r zných vnitřních pr m rech se podařilo zvýšit hodnotu intenzity elektrického pole v kapiláře na 2,3 kV/cm. Za t chto podmínek jsou dosažené migrační časy pro kreatinin a kyselinu močovou cca 10 s. Nová metodika velmi rychlého stanovení obou analyt je dostatečn citlivá pro jejich monitorování v lidské moči. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury ČR, grant č. P206/11/0707. Grantové agentury Univerzity Karlovy, grant č. 389111 a UNCE 204015. Literatura 1. Glatz Z.: Electrophoresis. 34, 631 (2013). 2. T ma, P., pekar, F., Samcová, E.: Electrophoresis. 34, 522 (2013). 3. Čermáková M., Št pánová I.: Klinická bioc emie, 1. díl, NC NZ . Brno 2003. 4. Racek J., et al.: Klinická bioc emie, Galén. Praha 2006. 5. Pavlíček V., T ma P., Mat jčková J., Samcová E.: Electrophoresis 35, 956 (2014). 6. Monnig, C. A., Jorgensen, J. W.: Anal. Chem. 63, 802 (1991).

125

Electrochemical Detection of p53 Protein Interactions with Plasmid DNAs Modified with Cisplatin Using Immunoprecipitation at Magnetic Microbeads (Elektrochemická detekce interakcí proteinu p53 s plasmidovými DNA modifikovanými cisplatinou pomocí imunoprecipitace na magnetických mikročásticích) Hana Pivoňková, Vlastimil Tichý, Petr rság, Peter Šebest and Miroslav Fojta Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic E-mail: [email protected] Abstract Antineoplastic drug [cis-diamminedichloroplatinum(II)] (cisplatin) forms covalent adducts with DNA. Cisplatin-modified DNA can be determined sensitively using square-wave voltammetry at mercury electrodes. Tumor suppressor protein p53 binds to DNA in different modes, including sequence- and structure- specific ones and these interactions are influenced by modification of the DNA with cisplatin. In this contribution we present a simple immunoprecipitation technique with magnetic beads, followed by voltammetric determination of recovered cisplatinated DNA, for the evaluation of p53 protein binding to DNAs containing various target sites differing in their proneness to being internally modified with the platinum complex. Key words: Electrochemistry, Cisplatin, DNA, p53 protein, Magnetic beads, Protein-DNA interaction. Introduction Cisplatin [cis-diamminedichloroplatinum(II)] is an antineoplastic metallodrug used for the treatment of various malignancies. It forms several kinds of covalent DNA adducts. The most frequent are intrastrand crosslinks (IAC) between neighboring purine residues: 65 % of 1,2GG IAC and 25 % of 1,2-AG IAC. Another 6-10 % belong to 1,3-GNG IAC and interstrand crosslinks, and 2-3 % of various monofunctional adducts 1. Modification of DNA with cisplatin or its analogues has been studied, besides other analytical techniques, using electrochemical methods. Several authors focused their attention to changes in the guanine oxidation response at various types of carbon electrodes to develop techniques suitable for monitoring DNA modification with the platinum complexes and/or biosensors for the platinum drugs using DNA as the recognition layer 2. Other approaches to electrochemical analysis of DNA modified with platinum or other metal complexes rely in measurements of the changes of intrinsic structure-selective DNA signals 3. Differential pulse polarography has been used for indirect determination of the extent of global DNA platination via determination of the residual unbound platinum complex 4. Recently we applied 5 cyclic or square-wave voltammetry at the mercury-based electrodes for sensitive determination of DNA modification with cisplatin using catalytic hydrogen evolution that accompanies redox processes of the cisplatin-DNA adducts. This technique proved useful for the determination of relatively low levels of DNA cisplatination, relevant for biochemical studies of the effects of cisplatin DNA adducts on sequence-specific DNA recognition by proteins such as restrictases or transcription factors. Tumor suppressor protein p53 is a stress-induced transcription factor involved in protecting cells from malignant transformation that binds DNA in several modes. The protein can bind DNA sequence-specifically via its core domain (recognizing p53 consensus sequences, p53CON 6) or structure-selectively via a basic segment in the protein C-terminus (C-terminal DNA binding site, CTDBS) 7. It has been shown that the p53 protein can bind with a

126

remarkable preference to DNA globally modified with cisplatin 8. On the other hand, presence of cisplatin adducts within the p53CON results in inhibition of the sequence-specific DNA binding 9. Different DNA binding activities of the p53 protein are modulated by the protein posttranslational modification or via interference of monoclonal antibodies mapping to the p53 CTDBS 7. In this contribution we show that voltammetric determination of cisplatin-modified DNA, in combination with a magnetic beads-based immunoprecipitation (MBIP) assay 10, can be used as a facile technique of monitoring of p53 protein binding to various cisplatin modified DNA targets differing in reactivity of their p53 binding sites towards the platinum drug. Experimental Material Plasmid DNAs were produced in E. coli cells, isolated using Qiagen Plasmid Purification Kit and linearized by SmaI restrictase (Takara). Anti-p53 monoclonal antibody Bp53-10.1 (aa 375–379 in C-terminus) was provided by Dr. Bořivoj Vojt šek from Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno. Human wild type p53 protein was expressed in Escherichia coli BL21/DE3 cells and purified as described previously 7. Cisplatin was obtained from Sigma. All other chemicals were of analytical grade. DNA modification with cisplatin. DNA samples were incubated with cisplatin in 0.1 M NaCl 4 at 37 °C overnight in the dark. DNA concentration in the reaction mixture was 20 g.ml-1; cisplatin/nucleotide ratio was 0.06. Magnetic beads-based immunoprecipitation (MBIP) assay for p53-DNA binding The p53 protein was mixed with the Bp53-10.1 antibody a molar ratio of 8:1 in binding buffer (50mM KCl, 5mM Tris and 0.01% Triton X-100, pH 7.6) in a total volume of 20 l, followed by a 20-min incubation. Then, the plasmid DNA (see below for details) was added at p53 tetramer/DNA molar ratio 2.5:1 and incubated in the binding buffer for 30 min on ice. Meanwhile, magnetic beads (12.5 L of the stock suspension per sample) coated with protein G (DBG, Dynal/Invitrogen), were washed three times with 100 L of the binding buffer. The beads were separated from the supernatant using magnetic particle concentrator. Then the binding reaction mixture was added and incubated with the beads for 30 min at 10 °C whilst shaking mildly. Finally, after triplicate washing with the binding buffer, the DNA was released from the beads by heating to 65 °C in 0.5 M NaCl and analyzed electrochemically. Voltammetric measurements. Voltammetric responses of all DNAs samples were measured using the adsorptive transfer stripping (AdTS) procedure. Hanging mercury drop electrode (HMDE) was immersed in a 5l aliquot of the sample. After a 60-s accumulation at open current circuit, the electrode was subsequently washed by deionized water and by background electrolyte and placed in a voltammetric cell. All measurements were performed at room temperature with an Autolab analyzer (Eco Chemie, Utrecht, The Netherlands) connected to VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) in three-electrode setup (Ag/AgCl/3 M KCl electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode), under argon. Square-wave voltammetry (SWV) at HMDE: background electrolyte 0.3 M ammonium formate, 0.05 M sodium phosphate, pH 6.9 initial potential -1.85 V, end potential 0.0 V, quiescent time 2 s, frequency 200 Hz, amplitude 50 mV, potential step 5 mV.

127

Results and Discussion In SWV under conditions specified in Experimental section, cisplatin-modified DNA produces a distinct peak around -1.25 V which can be used for a sensitive determination of the cisplatinated DNA and for distinguishing it from natural unmodified DNA that produces no such signal (Fig. 1) 5. Both cisplatinated and unmodified DNA yield peak G due to guanine 5 around -0.3 V which is useful for estimation of the total DNA concentration in the sample.

Pt

Pt

Pt

Pt

Pt

peak P due to cisplatin-DNA adducts

Pt Pt

cisplatinated DNA

unmodified DNA

Pt Pt

Pt

Pt

Pt Pt

Pt

Pt

Pt

Pt Pt

Pt Pt

Pt

Pt

Pt

Pt Pt

Pt Pt

Pt

Pt

Pt Pt

Pt

pPGM1

pBSK

pPGM4

peak G (due to guanine)

Fig. 1. Square-wave voltammograms of unmodified and cisplatinated pPGM1 plasmid DNA. Inset, scheme of cisplatinated plasmid DNAs pBSK, pPGM1 and pPGM4. Boxes indicate the p53 binding sequence which is absent in pBSK, contains cisplatin adducts in pPGM1 but remains unmodified in pPGM4. We prepared the cisplatin-modified plasmid DNAs pBSK (not containing any specific p53 binding site, inset in Fig. 1) and its derivatives pPGM1 (containing a p53 binding site AGACATGCCTAGACATGCCT; bold letters indicate sequence motifs forming bifunctional cisplatin aducts, bold italics indicate these sites in the complementary strand) and pPGM4 (AAACATGTTTAAACATGTTT, not containing sequence motifs forming bifunctional cisplatin adducts) and applied them in the MBIP procedure with p53 protein and Bp53-10.1 antibody. Analogous experiments were performed with the same but unmodified plasmids. After release of the DNA from the beads, all cisplatinated samples gave in the AdTS SWV well developed peak P and peak G while unmodified DNAs the peak G only (not shown). If the p53 protein was omitted, no voltammetric signals were obtained after MBIP, confirming that under the given conditions the DNAs were bound by the immunoprecipitated p53 protein and not non-specifically adsorbed at the beads surface. The fact that all DNA samples, regardless of presence or absence of the specific p53 binding site or DNA modification with cisplatin, were bound by the p53 protein, is not surprising with respect to the protein ability to bound the DNA non-specifically. To evaluate relative affinities of the p53 protein to different cisplatinated plasmids, we used a competition assay in which unmodified pPGM1 DNA was used as a specific competitor at two molar ratios to the cisplatinated DNA substrates. Intensities of the peak P normalized to

128

total DNA amount (i.e., ratios of peak P/peak G heights expressed as per cent of values obtained in the absence of the competitor) resulting from these experiments are displayed in Fig. 2. For cisplatinated pBSK and pPGM1 DNAs, addition of the unmodified pPGM1 competitor caused a steep drop of the peak P intensity to 25 – 15 %. Strikingly different behavior was observed with the cisplatinated pPGM4 DNA which displayed less steep, gradual decrease with additions of the competitor DNA and exhibited 75 and 60 % of the value obtained in the non-competition mode for equimolar amount and two-fold excess of the competitor DNA, respectively.

pPGM1 : cisplatin-pBSK pPGM1 : cisplatin-pPGM1 pPGM1 : cisplatin-pPGM4

Standardized value of Pt peak (%)

100

80

60

40

20

0 0:1

1:1

2:1

Molar ratio of DNA

Fig. 2. Histograms showing relative intensities of the peak P resulting from the MBIP binding assay with p53 protein and cisplatinated pBSK, pPGM1 and pPGM4 plasmid DNAs. Unmodified pPGM1 was always used as competitor DNA and molar ratios to the cisplatinated plasmids 1:1 and 2:1. Differences between pPGM1 and pPGM4 accord well with properties of p53 binding sites within these two plasmids. While the pPGM1 site contains numerous sequence motifs for formation of the stable cisplatin crosslinks, the pPGM4 site is resistant towards modification with the drug 9. Presence of the cisplatin adducts within the pPGM1 site makes it unrecognizable by the p53 protein. Thus the cisplatinated pPGM1 behaves as the pBSK DNA, offering the p53 protein only non-specific binding which is much weaker than binding of the protein to the unmodified pPGM1 competitor, resulting in strong decrease of the cisplatin signal. On the contrary, the pPGM4 site remains unmodified and it is bound sequence specifically even in the cisplatinated pPGM4 plasmid (which is modified elsewhere but not within the p53 binding site). The strong specific binding is reflected in an intense peak P resulting from competitive MBIP assay with the modified pPGM4 plasmid. Conclusions We present a simple immunoprecipitation technique with magnetic beads combined with voltammetric determination of cisplatinated DNA to evaluate interactions of p53 protein with DNAs containing various target sites differing in their proneness to being internally modified with the cisplatin. Cisplatin adducts in long plasmid DNA molecules serve as electroactive labels allowing specific detection of the cisplatin-modified DNA bound by the p53 protein. At the same time, using a competition approach, a DNA target sequence internally modified with

129

the drug can easily be distinguished from a non-reactive target site within globally modified plasmid DNA. Acknowledgements This work was supported by Czech Science Foundation (P301/11/2076, P206/11/1638) and by OPVK project reg. number CZ.1.07/2.3.00/30.0019. References 1. Jamieson E.R., Lippard S.J.: Chem. Rev. 99, 2467 (1999). 2. Brabec V.: Electrochim. Acta 45, 2929 (2000). 3. Brabec V., Vetterl V., Vrana O., Electroanalysis of Biomacromolecules., in: V. Brabec, D. Walz, G. Milazzo (Eds.), Experimental Techniques in Bioelectrochemistry, Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland, 1996, pp. 287. 4. Kim S.D., Vrána ., Kleinwächter V., Niki K., Brabec V.: Anal. Letters 23, 1505 (1990). 5. Horakova P., Tesnohlidkova L., Havran L., Vidlakova P., Pivonkova H., Fojta M.: Anal. Chem. 82, 2969 (2010). 6. Menendez D., Inga A., Resnick M.A.: Nat. Rev. Cancer 9, 724 (2009). 7. Fojta M., Pivonkova H., Brazdova M., Nemcova K., Palecek J., Vojtesek B.: Eur. J. Biochem. 271, 3865 (2004). 8. Pivonkova H., Brazdova M., Kasparkova J., Brabec V., Fojta M.: Biochem. Biophys. Res. Com. 339, 477 (2006). 9. Pivonkova H., Pecinka P., Ceskova P., Fojta M.: FEBS J. 273, 4693 (2006). 10. Pivonkova H., Sebest P., Pecinka P., Ticha O., Nemcova K., Brazdova M., Jagelska E.B., Brazda V., Fojta M.: Biochem. Biophys. Res. Com. 393, 894 (2010).

130

Detection of Single Nucleotide Polymorphisms Using Selective Incorporation of Biotin in DNA Strand and Subsequent Enzymatic Detection at Pencil Electrode (Detekce jednonukleotidových polymorfismů s využitím selektivní inkorporace biotinu do řetězce DNA s následnou enzymatickou detekcí na pentilkové elektrodě) Medard Plucnara a, Eçe Ecsin b, Arzum Erdem b, and Miroslav Fojta a Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic E-mail: [email protected] b Ege University, Faculty of Pharmacy, Analytical Chemistry Department, 35100 Bornova, Izmir, Turkey

a

Abstract Enzyme-linked electrochemical assay using DNA labeling by biotin followed by binding of enzyme-streptavidin conjugates has been found to be a potent tool for DNA diagnostic. This approach brings a special advantage of signal amplification due to the fact, that only very small number of enzymatic labels can produce a number of molecules of an electrochemically detectable product from an inactive substrate to obtain sufficiently strong signal. A new way of using of this technique combined with selective primer extension reaction designed for the detection of single nucleotide polymorphism is presented here. The assay was combined with measurements at a pencil graphite electrode, which is a very practical tool for potential clinical applications due to its cheapness and disposability. Key words: Single nucleotide polymorphism, Enzymatic labeling, Pencil graphite electrode. Úvod Byla dosud popsána celá řada zp sob analýzy sekvence nukleových kyselin zahrnujících enzymatické značení. Zde prezentovaná metoda zahrnuje v prvé řad modifikaci DNA řet zc biotinem, kterou lze provést r znými zp soby. N které metody k detekci přítomnosti cílové DNA ve vzorku využívají hybridizaci biotinem značené sondy nesoucí komplementární sekvenci1-3, jiné zahrnují např. inkorporaci nukleotid nesoucích biotin pomocí DNA polymeráz4. Poté následuje vazba enzymu, schopného konvertovat elektrochemicky neaktivní substrát na elektrochemicky aktivní produkt. Enzymy se používají mj. ve form konjugát například se streptavidinem, který se velmi siln a specificky váže práv na biotin. Jedním z nejpoužívan jších enzym pro tento zp sob značení je alkalická fosfatáza (ALP), která katalyzuje hydrolytické odšt pení fosfátu, přičemž má širokou substrátovou specifitu. Vhodným substrátem pro elektrochemické analýzy je v tomto případ 1-naftylfosfát, který je enzymovou reakcí přem n n na 1-naftol. Signál elektrochemické oxidace 1-naftolu m že být pozorován např. při lineární voltametrii na uhlíkových elektrodách v alkalickém prostředí při hodnot potenciálu kolem 0,35 V. Experimentální část Podstatou zde použitého zp sobu detekce je selektivní prodlužování primeru sm sí biotinylovaných a nemodifikovaných nukleotidtrifosfát , kdy díky využití speciáln navržených primer dochází k syntéze řet zc nesoucích biotin pouze v případ jedné vybrané varianty polymorfizmu. Primery jsou navrženy tak, aby se vzájemn lišily v 3´koncovém nukleotidu překrývajícím se s místem polymorfizmu (obr. 1) a jejich prodlužování DNA polymerázou se provádí v teplotních cyklech. Zásadní je optimáln zvolit tzv. „stringenci“ reakce (dostatečn vysoká teplota pro nasedání primeru), aby syntéza řet zce (inkorporace biotinu) probíhala pouze v případ plné komplementarity primeru, tj. v případ přítomnosti odpovídající varianty polymorfizmu v templátu. Jako templát byl použit PCR

131

produkt připravený amplifikací 110 nukleotid dlouhého úseku mitochondriální DNA z lidské genomové DNA obsahující „wild type“ variantu polymorfismu (G) v pozici 12345. Reakční sm s pro lineární cyklickou amplifikaci obsahovala templát - 8 ng/l, diagnostický primer (primC-12345, resp. primT-12345) - 1 Vent polymerázu(mutant bez exonukleázové aktivity 3´ → 5´) - 0,05 U/l, reakční pufr - 1 x koncentrovaný a sm s trifosfát - 100 dATP, dGTP a dTTP, 25 dCTP a 75  dCTP-14-bio v celkovém objemu 30 l. Následn bylo provedeno 45 reakčních cykl – 15 s denaturace při 95 °C, 20 s nasedání primeru při 55 °C (resp. teplotní gradient – viz. obr. 1), 45 s a elongace při 72 °C. Před reakčními cykly prob hla denaturace po dobu 3 min. při 95 °C a po posledním cyklu terminální elongace po dobu 5 min. při 72 °C Sm s byla dále purifikována pomocí sady „PCR purification kit“ ( uiagen) a DNA byla v posledním kroku eluována do vody s pH upraveným na hodnotu v rozmezí 7 – 8. Následovala enzymatická detekce, jejíž schéma je ukázáno na Obr. 2. Před adsorpcí řet zc na povrch elektrody byl do vzorku přidán NaCl do koncentrace 0,2 M. Adsorpce byla provedena ponořením elektrody do vzorku na dobu 5 min (schéma na obr. 1B). Dalším krokem bylo zablokování povrchu elektrody roztokem 5 % mléka ve fosfátovém pufru (PBS), což bylo provedeno ponořením elektrody do roztoku na dobu 1 min. Následovala inkubace s konjugátem alkalické fosfatázy se streptavidinem (SALP) v roztoku 5 % mléka v PBS po dobu 1 min. Po adsorpci, blokaci a inkubaci se SALP vždy následovalo opláchnutí elektrody ve PBS. Elektroda byla ponořena do 0,5 mM roztoku naftylfosfátu v uhličitanovém pufru a před samotným m řením byla provedena inkubace se substrátem po dobu 5 min. K m ření byla použita metoda lineární voltametrie (LSV), rozsah m ření byl od -0,3 V do 1,4 V, krokový potenciál 5 mV, skenovací rychlost 1 V/s.

Obr. 1. Schéma selektivní syntézy biotinylovaných řet zc diagnostických primer (primT12345 a primC12345).

s využitím dvou r zných

Výsledky a diskuze br. 3 ukazuje porovnání elongace r zných diagnostických primer na 15 % polyakrylamidovém denaturačním gelu po 45 cyklech při r zných teplotách pro nasedání primeru. Je vid t, že od 55 °C nahoru syntéza s primerem s nekomplementárním 3´koncovým nukleotidem prakticky neprobíhá.

132

Obr.2. Schéma procedury adsorpce řet zc enzymatickou detekcí pomocí SALP.

na pentilkovou elektrodu s následnou

Obr. 3. Analýza syntézy řet zc a porovnání pro r zné diagnostické primery při teplotním gradientu pro nasedání primeru na 15 % denaturační PAGE. C – primC12345 – komplementární k templátu, T – primT12345 – nekomplementární k templátu. 25.00 primC-12345

20.00

I (A)

primT-12345 15.00 10.00 5.00 0.00 neředěno

5x zř.

10x zř.

15x zř.

25x zř.

50x zř.

ředění

Obr. 4. Rozdíly intenzity signál oxidace 1-naftolu (výška pík ) pro r zné diagnostické primery při r zném stupni zřed ní před adsorpcí DNA na elektrodu. Po purifikaci přes „PCR purification kit“ byly zm řeny koncentrace neřed ného vzorku - primC-12345 – 15 ng/l, primerT – 9 ng/l.

133

Na základ výsledk analýzy syntézy řet zc pomocí PAGE byla pro další experimenty, zahrnující enzymatickou detekci zvolena teplota pro nasedání primeru 55 °C. Při adsorpci z neřed ného vzorku jsme pozorovali výrazný signál oxidace 1 – naftolu v případ obou diagnostických primer ( br.4). Při zvolených podmínkách reakce docházelo zřejm ve v tší míře k syntéze biotinylovaných řet zc i přes nekomplementární 3´-koncový nukleotid. Je také možné, že při adsorpci ze vzorku o uvedené koncentraci (neřed ný vzorek) došlo k vysokému stupni pokrytí povrchu elektrody, tzn., nacházeli jsme se v oblasti adsorpční izotermy, kde už nemá tato křivka lineární charakter a rozdíly v intenzit signál pro jednotlivé diagnostické primery neodpovídají rozdíl m koncentrace biotinylovaných produkt ve sm si. Proto jsme se pokusili najít optimální rozlišení pomocí gradientu řed ní vzork před adsorpcí. Při 50-tinásobném zřed ní už nebyl pozorován žádný signál v případ nekomplementarity primeru na 3´-konci (Obr. 5.).

Obr. 5. Porovnání signál oxidace 1-naftolu při m ření lineární voltametrii pro r zné diagnostické primery po 50-tinásobném zřed ní před adsorpcí DNA na elektrodu Závěr Cyklické selektivní prodlužování diagnostických primer lišících se 3´-koncovým nukleotidem, překrývajícím se s místem polymorfizmu, se v kombinaci s enzymatickou detekcí ukázala jako velmi jednoduchý zp sob detekce jednonukleotidových polymorfizm . Je zde však řada parametr , které je vždy třeba optimalizovat k získání ideálního rozlišení pro r zné varianty polymorfizmu. bzvlášt je třeba zvolit dostatečnou stringenci pro nasedání diagnostických primer , dále koncentraci DNA pro adsorpci na elektrodu a v neposlední řad vhodnou koncentraci substrátu. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grantu GA ČR (P206/12/G151). Literatura 1. Paleček E., Fojta M.: Talanta 74, 276 (2007). 2. Wang J., Liu G. D., Jan M. R.: J. Am. Chem. Soc. 126, 3010 (2004). 3. Paleček E., Kízek R., Havran L., Billová S., Fojta M.: Anal. Chim. Acta 469, 73 (2002). 4. Horáková P., Šimková E., Vychodilová Z., Brázdová M., Fojta M.: Electroanalysis 21, 1723 (2009).

134

Usage of Electrochemistry Coupled to LC and MS for the Prediction of Metabolism, Toxicity and Stability of Substances (Využití elektrochemie ve spojení s LC a MS pro predikci metabolismu, toxicity a stability látek) Lenka Portychová and Aleš Horna Institute of Nutrition and Diagnostics, RADANAL Ltd., kružní 613, 530 03 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Many substances entering (from food, drugs, environment etc.) into a human body aren't toxic but they can be metabolized to compounds which are dangerous for people and which can cause serious diseases. A prediction of toxicity and metabolism of xenobiotics in a human body is very important for determining of harmfulness of compounds which affect us or substances that we intentionally accept thinking that they aren't toxic. A suitable tool for mimicking the xenobiotics metabolism in a human body is high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry and electrochemistry (LC/EC/MS). Key words: LC/EC/MS, Xenobiotics, Cytochromes P450, Oxidation, Glutathione, Methanol, Paracetamol, Polychlorinated Biphenyls, Resveratrol. Úvod Všechny organizmy jsou ve svém životním prostředí vystaveny p sobení mnoha r zných látek a sloučenin. V poslední dob , mj. díky rozvoji chemického pr myslu, se navíc často jedná o expozici látkám um lým, jež jsou organizm m cizí a s nimiž se b hem evoluce ješt nesetkaly (např. léčiva, toxiny, pr myslové chemikálie). Takové látky jsou označovány jako xenobiotika, je jich v současnosti přes 200 000 a v tšinou mají lipofilní povahu 1, 2. Do organizmu vstupují (obvykle z potravy, vody či vzduchu) trávicím ústrojím, respiračním systémem nebo skrz pokožku. V t le interagují s proteiny (zejména s albuminem), které tyto látky transportují do orgán , tkání a následn až do jednotlivých t lních bun k. V tšina xenobiotik navíc není biologicky odbouratelná, p sobí toxicky a akumuluje se v tukových vrstvách organizmu. To má často za následek vznik vážných onemocn ní (rakovina, diabetes, reprodukční problémy apod.), která nezřídka vedou až ke smrti organizmu 2, 3. Metabolizmus xenobiotik v organizmu Každý živý organizmus má vlastní obranný systém, pomocí n hož se brání proti cizorodým látkám, které ho ohrožují. V první fázi metabolizmu cizorodých látek prob hne v tšinou oxidační reakce (enzymaticky katalyzovaná), b hem níž je atom kyslíku zaveden do molekuly xenobiotika, čímž dojde ke zvýšení jeho polarity. Současn vznikne funkční skupina, která se účastní druhé fáze, v níž konjuguje s glutathionem, cysteinem, lysinem a dalšími endogenními látkami. Zvýší se tak polarita celé molekuly a usnadní se její vyloučení z organizmu (močí, žlučí, potem, vydechovanou vodní parou atp.). Konjugace metabolit xenobiotik s glutathionem představuje hlavní detoxikační cestu látek toxických pro organizmus. Problém nastane, je-li tento tripeptid vyčerpán. Reaktivní metabolity se mohou kovalentn navázat na makromolekuly a zp sobit poškození bun k, mutace, nádory či imunologická poškození 4-7. xidační reakce v první fázi metabolizmu xenobiotik jsou katalyzovány enzymy, které jsou u savc lokalizovány v tšinou v játrech. Nejznám jší skupinou enzym (konkrétn monooxygenáz) je cytochrom P450 (CYP) – pigment, který po redukci hemového železa

135

oxidem uhelnatým absorbuje při vlnové délce 450 nm. Tyto enzymy mají schopnost vázat a aktivovat kyslíkový atom, přičemž využívají koenzym nikotinamid adenin dinukleotid fosfát (NADPH). Aktivním meziproduktem je elektrofilní Fe4+ /porfyrinový radikál (analog oxidované formy peroxidázy). CYP (u člov ka zejména CYP3A4) se podílí na biotransformaci v tšiny cizorodých látek, které vstupují do organizmu 5, 7-9. Existuje n kolik typ oxidačních reakcí, které zp sobují metabolickou přem nu xenobiotik. Tyto reakce probíhají v tšinou v játrech. Nejb žn jší z nich je hydroxylace (vznik alkohol či fenol ), dalšími jsou epoxidace (vznik epoxid ), N-oxidace (vznik hydroxylamin , oxim nebo N-oxid ), dealkylace (vznik aldehyd a amin , thiol nebo fenol ), deaminace (vznik aldehyd či keton ) a hydrolýza (vznik kyselin a zásad). Často dochází ke vzniku látek toxičt jších, než byly látky p vodní, které do organizmu vstoupily 4-7. Toxicita a metabolizmus vybraných xenobiotik Látky mající neblahý vliv na lidské zdraví pochází z mnoha r zných zdroj , lidských činností a pr myslových oblastí. Znalost metabolických drah a biotransformace xenobiotik přijímaných lidským organizmem je velmi d ležitá pro objasn ní degradace t chto látek a posouzení toxicity vzniklých metabolit . Jedním z nejznám jších případ , kdy do t la vstupuje netoxická látka, která se v organizmu metabolizuje na látky toxické, je požití methanolu. Ten se v lidském t le oxiduje alkoholdehydrogenázou na formaldehyd a poté na kyselinu mravenčí. Tuto biotransformaci lze potlačit podáním ethanolu, který je metabolizován stejným enzymem jako methanol, k n muž má ovšem asi 20krát vyšší afinitu. V tomto případ je methanol vyloučen z t la (obvykle močí) v nezm n né form 10, 11. Dalším z příklad toxického p sobení zdánliv netoxické látky je léčivo paracetamol (acetaminofen). becn je rozšířen názor, že užívání tohoto analgetika a antipyretika je efektivní a bezpečné. Tato potenciáln hepatotoxicky p sobící látka je však zodpov dná až za polovinu veškerých případ akutního selhání jater. Majoritní část paracetamolu je konjugována na glukuronid a síran a vyloučena v podob netoxických metabolit . Ale 2-10 % je v přítomnosti CYP oxidováno na 3-hydroxyparacetamol a na toxický metabolit N-acetyl-pbenzochinonimin (NAP I), přičemž alkohol zde p sobí jako induktor (zvyšuje koncentraci NAP I). Tento chinonimin je v tšinou detoxikován glutathionem a vyloučen. Avšak není-li množství glutathionu dostačující (u akutních intoxikací paracetamolem, u chronických alkoholik atp.), NAP I reaguje s makromolekulami tkání, váže se na hepatocyty a vyvolává jejich nekrózu. Velmi rizikovým se ukazuje být časté podávání paracetamolu d tem. V České republice lze toto léčivo zakoupit bez lékařského předpisu pod názvy Paralen, Panadol, Febrisan, Coldrex atd. 12-18. Polychlorované bifenyly (PCB) jsou skupinou perzistentních látek vznikajících chlorací bifenyl . Masov se začaly používat ve 30. letech 20. století v USA, odkud se postupn rozšířily do celého sv ta. Využívaly se zejména jako aditiva v barvách a lacích. Tvořily též nápln transformátor , kondenzátor a dalších zařízení. V 60. letech se však začaly objevovat první náznaky, že PCB nejsou tak neškodné, jak se myslelo. Byly stále čast ji diagnostikovány např. v mléce a mase hospodářských zvířat. Tyto látky byly mj. součástí nát rových hmot v kravínech i silech. Podrobný toxikologický výzkum postupn odhalil, že velmi rizikovým je chronické vystavení nízkým dávkám polychlorovaných bifenyl , vzhledem k jejich schopnosti perzistence a bioakumulace. PCB jsou dle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny (International Agency for Research on Cancer, IARC)

136

pravd podobn karcinogenní pro člov ka (spadají do skupiny 2A). Mohou zp sobit rakovinu jater či slinivky břišní, negativn ovlivňují imunitní systém a snižují plodnost 2, 19, 20. Toxické metabolity ale mohou vznikat i z látek přírodních. Antioxidanty v potravinách jsou obecn přijímány odbornou veřejností jako zdraví prosp šné látky. Velká pozornost je v nována antioxidační aktivit , málo se však mluví o produktech, které vznikají oxidací antioxidant . Jako příklad lze uvést resveratrol. Tento fytoalexin se nachází v hroznech vinné révy, v n kterých druzích zeleniny, v arašídech atp. Bylo zjišt no, že oxidací resveratrolu (za pomoci 4-hydroxystilbenperoxidáz) vznikají toxické dimery (δ- a ε-viniferin), trimery (α-viniferin) a další vysoce polymerované oligomery 21, 22. Elektrochemie ve spojení s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií Použití elektrochemie (EC) v kombinaci s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií (HPLC/MS) představuje pom rn novou, slibnou a moderní analytickou techniku použitelnou pro studium metabolizmu r zných (např. potenciáln toxických) sloučenin 5, 23, 24. V posledních letech celosv tov roste zájem o využití LC/EC/MS v r zných oblastech. Tato technika je prakticky neomezen kompatibilní s gradientovou elucí, díky čemu lze separační proces velmi snadno a cílen optimalizovat Vše je navíc možné provést bez použití standard . V elektrochemické cele je možné napodobit n které typy oxidačních reakcí (katalyzovaných cytochromem P450) první fáze metabolizmu xenobiotik v lidském t le a díky MS charakterizovat, případn identifikovat výsledné produkty. Cenné informace m žeme získat už jen tím, že pomocí elektrochemických cel zjistíme citlivost látek k oxidaci. Další výhodou je možnost nastříknutí glutathionu přímo do přístroje a sledovat tak konjugace metabolit xenobiotik s tímto tripeptidem 7, 25-30. Tato rychlá a pom rn jednoduchá technika m že být velmi vhodným nástrojem pro objasn ní elektrochemických reakcí velkého množství sloučenin a pro predikci toxicity a metabolizmu léčiv, polutant životního prostředí a dalších látek v lidském organizmu 5, 31. Závěr Konkurenceschopný člov k, který má možnost usp t v dnešní dob a splnit nároky, které jsou na n j kladeny, je pouze člov k zdravý. Predikce toxicity a metabolizmu xenobiotik v lidském organizmu je velmi d ležitá pro zjišt ní škodlivosti látek, které vstupují do lidského t la a které v současnosti nemusí být považovány za toxické a zdraví ohrožující. Vhodnou technikou, která dokáže simulovat metabolizmus cizorodých látek v lidském organizmu, je LC/EC/MS. Institut Nutrice a Diagnostiky firmy RADANAL s.r.o. se řadí mezi malé množství pracovišť v Evrop , která touto technikou disponují a ve kterých je aktivn využívána. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu FR-TI4/331 Ministerstva pr myslu a obchodu a za podpory programu OPPI v rámci programu Inovace a projektu Inovace izolace standardu bioaktivních látek z přírodních zdroj (č. projektu 4.1 IN04/1739).

137

Literatura 1. Saha D., Tamrakar A.: Asian J. Res. Pharm. Sci. 1, 36 (2011). 2. Stiborova M., v knize: Metabolism of Drugs and Other Xenobiotics (Anzenbacher P., Zanger U. M., ed.), kap. 23. Wiley-VCH, Weinheim 2012. 3. Knejzlík Z., Káš J., Ruml T.: Chem. Listy 94, 913 (2000). 4. Zuber R., Anzenbacherová E., Anzenbacher P.: J. Cell. Mol. Med. 6, 189 (2002). 5. Jurva U.: Electrochemistry on-line with mass spectrometry: Instrumental methods for in vitro generation and detection of drug metabolites. Mediagruppen Intercopy, Göteborg 2004. 6. Horák J., Linhart I., Klusoň P.: Úvod do toxikologie a ekologie pro c emiky. VŠCHT Praha, Praha 2004. 7. Lohmann W., Karst U.: Anal. Bioanal. Chem. 391, 79 (2008). 8. Guengerich F. P., v knize: Metabolism of Drugs and Other Xenobiotics (Anzenbacher P., Zanger U. M., ed.), kap. 2. Wiley-VCH, Weinheim 2012. 9. Anzenbacher P., Anzenbacherová E.: Cell. Mol. Life Sci. 58, 737 (2001). 10. Liesivuori J., Savolainen H.: Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 69, 157 (1991). 11. Gonzales E. R., Mota-Lima A., v knize: Direct Alcohol Fuel Cells (Corti H. R., Gonzales E. R., ed.), kap. 2. Springer eBooks 2014. 12. Somogyi A. A., Coller J. K.: v knize: Metabolism of Drugs and Other Xenobiotics (Anzenbacher P., Zanger U. M., ed.), kap. 15. Wiley-VCH, Weinheim 2012. 13. Slíva J.: Med. praxi 10, 26 (2013). 14. Hladík M., losová A., Jourová I., Zaoral T., Bakhtary A., Čuřík R., Rucki Š.: Pediatrie pro praxi 4, 212 (2005). 15. Jjemba P. K.: Pharma-Ecology: The Occurrence and Fate of Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken 2008. 16. Xu J. J., Hendriks B. S., Zhao J., de Graaf. D.: FEBS Letters 582, 1276 (2008). 17. Lohmann W., Karst U.: Anal. Bioanal. Chem. 386, 1701 (2006). 18. Getek T. A., Korfmacher W. A., McRae T. A., Hinson J. A.: J. Chromatogr. A 474, 245 (1989). 19. World Health Organization, International Agency for Research on Cancer: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans Overall Evaluations of Carcinogenicity: An Updating of IARC Monographs, Supplement 7, 1998. 20. Faroon O. M., Keith L. S., Smith-Simon C., De Rosa C. T.: Polychlorinated Biphenyls: Human Health Aspects. World Health Organization, Geneva 2003. 21. Pezet R., Gindro K., Viret O., Spring J.-L.: Physiol. Mol. Plant P. 65, 297 (2004). 22. Pezet R., Perret C., Jean-Denis J. B., Tabacchi R., Gindro K., Viret O.: J. Agric. Food Chem. 51, 5488 (2003). 23. Karady M., Novák ., Horna A., Strnad M., Doležal K.: Electroanalysis 23, 2898, (2011). 24. Acworth I., Waraska J., Gamache P., Price D.: J. Biomol. Tech. 21, 40 (2010). 25. Permentier H. P., Bruins A. P., Bischoff R.: Mini Rev. Med. Chem. 8, 46 (2008). 26. Karst U.: ElCheMS 2011 – Internetional Workshop on Electrochemistry/Mass Spectrometry, Münster, 15-16 September 2011, Programme (bez editora), str. 6. 27. Nouri-Nigjeh E.: ElCheMS 2011 – Internetional Workshop on Electrochemistry/Mass Spectrometry, Münster, 15-16 September 2011, Programme (bez editora), str. 14. 28. Horna A.: ElCheMS 2013 – Internetional Workshop on Electrochemistry/Mass Spectrometry, Münster, 23-24 May 2013, Programme (bez editora), str. 31 (resp. Poster no. P5). 29. Kraj A.: ElCheMS 2013 – Internetional Workshop on Electrochemistry/Mass Spectrometry, Münster, 23-24 May 2013, Programme (bez editora), str. 38 (resp. Poster no. P9). 30. Baumann A., Lohmann W., Rose T., Ahn K. C., Hammock B. D., Karst U., Schebb N. H.: Drug Metab. Dispos. 38, 2130 (2010). 31. Gamache P. H., Meyer D. F., Granger M. C., Acworth I. N.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1717 (2004).

138

Plasma Free Metanephrines as Diagnostic Markers of Pheochromocytoma (Volné plazmatické metanefriny jako diagnostické markery feochromocytomu) Lenka Portychová a, Zora Nývltová b, Alice Brabcová Vránková c, Michal Bartoš b, Michaela Pilařová a, Ivan Vermousek a, Miroslav Antal b, and Aleš Horna a a Institute of Nutrition and Diagnostics, RADANAL Ltd., kružní 613, 530 03 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Research Institute for Organic Synthesis Inc., Rybitvi, Czech Republic, E-mail: [email protected] c rd 3 Internal Department, 1st Faculty of Medicine and General Teaching Hospital, Charles University in Prague, Czech Republic Abstract Quantitative determination of catecholamines and their metabolites plays an important role in the diagnosis of pheochromocytoma – adrenal medulla tumour. This kind of tumour synthesizes, stocks, metabolizes and mostly secretes catecholamines. For this reason it is possible to use elevated concentrations of catecholamines and their metabolic products as diagnostic markers of this tumour. The determination of metanephrines is preferred against the determination of catecholamines because tumour cells produce free metanephrines continuously and irrespective of the release of catecholamines. The project aims to develop a new kit for the determination of plasma metanephrines. Solid phase extraction (SPE) was used for the pre-treatment of plasma samples. The determination was performed by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED). Key words: Pheochromocytoma, Catecholamines, Metanephrines, Plasma, Solid Phase Extraction, Liquid Chromatography, Coulochem. Úvod Katecholaminy jsou organické látky odvozené od aminokyseliny tyrozinu 1. Ten vzniká v lidském t le hydroxylací fenylalaninu za účasti enzymu fenylalaninhydroxylázy nebo m že být organizmem přijat konzumací stravy 2. Metabolizmus tyrozinu je znázorn n na Obrázku 1. Katecholaminy p sobí v lidském organizmu jako neurotransmitery nebo hormony. Jsou uvolňovány z centrálního nervového systému nebo z dřen nadledvin. Ve zdravém lidském t le jsou tyto látky a jejich metabolity přítomny ve velmi nízkých koncentracích (v řádech pmol/l) 3,4. Vyšší hladiny katecholamin a jejich metabolit (metanefrin ) v t le jsou zp sobeny stresem, fyzickou námahou, bolestí, emocionálním rozrušením atp. Extrémn vysoké hladiny katecholamin i metanefrin jsou zp sobeny přítomností neuroendokrinních nádor , mezi n ž patří např. feochromocytom (FE ) 5.

Obr. 1. Metabolizmus fenylalaninu (DOPA = dihydroxyfenylalanin). FEO má schopnost syntetizovat, shromažďovat, metabolizovat a uvolňovat katecholaminy. Tyto látky a jejich metabolity jsou proto používány jako diagnostické markery tohoto tumoru. 4 Stanovení metanefrin , zejména normetanefrinu (NMN), metanefrinu (MN)

139

a 3-methoxytyraminu (3-MT), je pro diagnostiku feochromocytomu často upřednostňováno před stanovením katecholamin . A to z toho d vodu, že nádorové buňky produkují volné metanefriny kontinuáln a nezávisle na uvolňování katecholamin 5,6. 3-MT navíc indikuje metastatický FE 7. Experimentální část Všechny chemikálie, standardy a použitá činidla byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Používaná demineralizovaná voda byla čišt na systémem Select Neptune Ultimate (Purite, xon, UK). Mobilní fáze pro HPLC byla vytvořena smísením připravených roztok A a B (v pom ru 1:1). Ke sm si byl přidán acetonitril a pH bylo upraveno na 2,94. Na záv r byl pufr přefiltrován přes nylonový filtr s velikostí pór 0,22 µm (Membrane Solutions, North Bend, H, USA). Kyselost mobilní fáze byla m řena pH metrem T 526/538 ( issenschaftlich-Technische erkstätten, eilheim, N mecko) s nasazenou chloridovou elektrodou SCH TT (pH 0...14/ -5 ..+80 °C/Gel, SCH TT AG, Mainz, N mecko). Extrakce metanefrin tuhou fází ze vzork plazmy byla provedena na zařízení Visiprep SPE Vacuum Manifold (Supelco, Bellefonte, USA) za pomoci vakuové pumpy. Pro odpařování vzork byla sestavena jednoduchá aparatura z tlakové lahve se stlačeným dusíkem, zařízení pro redukci a kontrolu tlaku plynu na tlakové lahvi a systému pro čišt ní dusíku od případných nečistot pomocí aktivního uhlí. Vzorky byly pro urychlení odpařování umíst ny do termobloku Multi-Blok Heater (Lab-Line Instruments, Inc., Bombaj, Indie). Pro separaci metanefrin byl využíván kapalinový chromatograf UltiMate 3000 Series s autosamplerem UltiMate 3000 Series ACC-3000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA) a analytická kolona Kinetex XB-C18 100 x 4,6 mm (5 µm) (Phenomenex, Torrance, USA) s předkolonou UHPLC C18 4,6 mm ID Column (Phenomenex). Pro detekci separovaných analyt byl použit detektor Coulochem III (ESA, Inc., Chelmsford, USA) obsahující jednu kondicionační celu (Model 5021A) a jednu analytickou celu (Model 5011A). Sorbent kolonky byl kondicionován 2 x 2,5 ml roztoku hydroxidu amonného v methanolu, následovalo promytí 2 ml fosfátového pufru o pH 7 a 2 ml demineralizované vody. Vše za vakua -15 mm Hg. Na mokrý sorbent byl aplikován 1 ml vzorku plazmy s vnitřním standardem 4-hydroxy-3-methoxybenzylaminem (HMBA). Kolonka byla následn promyta 2 ml fosfátového pufru o pH 7, 2 ml demineralizované vody a 2 ml methanolu. Sorbent byl poté sušen za vakua -20 mm Hg po dobu cca 2 minut. Na záv r byla provedena eluce metanefrin 2 ml roztoku hydroxidu amonného v methanolu. Získaný eluát byl odpařen při teplot cca 60 °C v proudu dusíku do sucha a poté rekonstituován 220 µl mobilní fáze. Nástřik vzorku na chromatografickou kolonu, která byla vyhřívána na 28 °C, byl nastaven na 150 µl. Teplota autosampleru byla nastavena na 8,5 °C a pr tok mobilní fáze na 0,7 ml/min. Na kondicionační celu detektoru byl vložen potenciál +400 mV, na analytickou celu +100 mV (na první elektrodu) a -350 mV (na druhou elektrodu). Citlivost detekce byla nastavena na 50 nA.

140

Výsledky a diskuse V pr b hu vývoje kitu byla postupn optimalizována celá metoda. Předúpravou vzork plazmy a izolací metanefrin počínaje a složením mobilní fáze a analytickými podmínkami konče. Byla testována centrifugace plazmy s přídavkem r zných činidel i bez nich. Zkoušen byl acetonitril, ethanol, methanol, 2-propanol a r zn koncentrované kyseliny (chloristá, octová, trifluoroctová, metafosforečná, chlorovodíková a mravenčí). Byly testovány r zné přídavky t chto činidel k plazm a r zná nastavení centrifugy (teplota, počet otáček za minutu a délka trvání odstřeďování). Žádný z postup se však (zejména kv li nízkým výt žnostem sledovaných látek) neosv dčil. Metanefriny tedy byly izolovány pomocí SPE z námi předem nijak neupravovaných vzork plazmy. V rámci extrakce tuhou fází bylo testováno velké množství komerčn dostupných SPE kolonek a n kolik typ sorbent založených na iontové vým n , které byly použity pro pln ní prázdných kolonek o objemu 3 ml. ptimální typ sorbentu, v optimálním množství a pom ru katexu a anexu je využíván pro validaci metody. Pro dosažení nejvyšších možných výt žností MN, NMN a 3-MT byl též optimalizován samotný postup SPE. Byly odzkoušeny r zné promývací roztoky v r zných koncentracích a r zném pořadí. ptimalizovaný postup, který zahrnuje i filtraci vzorku, je v současnosti využíván pro validaci metody. Jako mobilní fáze byly testovány r zné typy pufr a r zné pom ry jednotlivých složek t chto pufr . Pro validaci je používán sm sný pufr (obsahující acetonitril) o pH 2,94. Nejvhodn jší vodou k příprav mobilní fáze pro analýzy na HPLC/Coulochem III byla na základ našeho testování zvolena voda čišt ná systémem Select Neptune Ultimate. Metanefriny byly separovány na r zných typech kolon s cílem dosáhnout optimálního rozlišení jednotlivých pík a co nejnižší hodnoty meze detekce. Testovány byly: LiChroCART RP-18 125 x 4 mm (5 µm) (Merck, Darmstadt, N mecko); Poroshell 120 SB-C18 150 x 4,6 mm (2,7 µm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); Poroshell 120 SB-C18 100 x 4,6 mm (2,7 µm) (Agilent); Kinetex XB-C18 100 x 4,6 mm (5 µm) (Phenomenex) a Kinetex Phenyl-Hexyl 150 x 4,6 mm (5 µm) (Phenomenex). Analytická kolona Kinetex XB-C18 100 x 4,6 mm (5 µm) byla vyhodnocena jako nejvíce vhodná pro naše účely. Nejvyšší odezva metanefrin sice byla zaznamenána na kolon Kinetex Phenyl-Hexyl 150 x 4,6 mm (5 µm), ale vnitřní standard HMBA eluoval příliš blízko píku metanefrinu. Analýza by tak musela trvat alespoň 35 min, aby byly tyto dva píky dostatečn odd leny. Řešením by mohlo být použití jiného vnitřního standardu, např. 3,4-dihydroxybenzylaminu. Pík této sloučeniny by však byl na chromatogramu příliš vzdálen od píku 3-MT a mohlo by tak docházet k chybným vyhodnocením. Kolona byla při analýzách vyhřívána na 28 °C, aby byla metoda dostatečn i v teplých letních dnech. Pr tok mobilní fáze byl nastaven na 0,7 ml/min.

robustní

Z d vodu optimalizace potenciál na celách detektoru byl prom řen hydrodynamický voltamogram MN, NMN, 3-MT a HMBA. Po jeho vyhodnocení byly vkládány na cely potenciály, při nichž bylo dosaženo nejvyšší odezvy sledovaných látek: na kondicionační celu +400 mV, na analytickou +100 mV (na první elektrodu) a -350 mV (na druhou elektrodu).

141

ptimalizovanou metodou byly analyzovány vzorky plazmy, které byly na pracovišti 3. interní kliniky 1. lékařské fakulty (LF) Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze vyhodnoceny jako pozitivní (se zvýšenou hladinou metanefrin ). Srovnání výsledk analýz provedených na našem pracovišti s výsledky analýz provedených na pracovišti 3. interní kliniky 1. LF jsou uvedeny v Tabulce I. Tabulka I. Srovnání výsledk analýz vzork plazmy s pozitivním nálezem zvýšené hladiny metanefrinu (MN) či normetanefrinu (NMN) zjišt ných na našem pracovišti a na pracovišti 3. interní kliniky 1. lékařské fakulty (LF) Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Výsledky z 1. LF Univerzity Karlovy Naše výsledky Vzorek č. NMN (pg/ml) MN (pg/ml) NMN (pg/ml) MN (pg/ml) 328 46 317 54 364 368 977 710 1011 623 410 2901 72 2855 92 432 187 41 187 45 449 168 53 179 58 464 1139 284 1153 263 Fyziologická hodnota metanefrinu pro člov ka je nejvýše 100 pg/ml plazmy a fyziologická hodnota normetanefrinu nejvýše 160 pg/ml plazmy. Alespoň jeden z analyt (MN, NMN) v testovaných vzorcích plazmy (Tabulka I) tyto limitní hodnoty převyšuje, je tudíž zřejmé, že šlo o vzorky s pozitivním nálezem zvýšené hladiny metanefrin . Závěr Vyvinutá metoda m že být použita pro stanovení plazmatických metanefrin v řádech desítek pg/ml a tedy pro včasnou diagnózu nádoru nadledvinek – feochromocytomu. Celkový čas analýzy metanefrinu, normetanefrinu a 3-methoxytyraminu ve vzorcích plazmy metodou HPLC/Coulochem III činí 22 min. V současnosti je metoda validována, projekt končí s koncem letošního roku (2014). Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu FR-TI4/331 Ministerstva pr myslu a obchodu. Literatura 1. Purves D., Augustine G. J., Fitzpatrick D., Hall W. C., LaMantia A. S., McNamara J. O., White L. E.: Neuroscience. Sinauer Associates Inc., Sunderland 2007. 2. Joh T. H., Hwang O.: Ann. N.Y. Acad. Sci. 493, 342 (1987). 3. Raggi M. A., Sabbioni C. Casamenti G., Gerra G., Calonghi N., Masotti L.: J. Chromatogr. B 730, 201 (1999). 4. Kršek M.: Endokrinologie. Galén, Praha 2011. 5. Pacák K.: Feochromocytom. Galén, Praha 2008. 6. http://neuroendokrinni-nadory.cz/downloads/diagnostika-nen-vysetreni.pdf, staženo 13. března 2013 7. Eisenhofer G., Lenders J. W. M., Siegert G., Bornstein S. R., Friberg P., Milosevic D., Mannelli M., Linehan W. M., Adams K., Timmers H. J., Pacák K.: Eur. J. Cancer 48, 1739 (2012).

142

Voltammetric Determination of Genotoxic Pollutant 5-Nitroindazole Using a Bismuth Bulk Electrode (Voltametrické stanovení genotoxického polutantu 5-nitroindazolu na pevné bismutové elektrodě) Vít Prchal a, Anita ttenschlägerová b, Vlastimil Vyskočil a, and Jiří Barek a Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE “Supramolecular Chemistry”, Department of Analytical Chemistry, UNESC Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 8, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic E-mail: [email protected] b Nicholas Square High School in Pilsen, Nicholas Square 23, CZ-326 00 Pilsen, Czech Republic a

Abstract 5-Nitroindazole (5-NI) is a derivative of indazole, substance largely used as a reactant for the synthesis of various organic substances. 5-NI shows high toxicity against parasites from the Trypanosomatidae family, and it is a proven mutagen for bacterial cultures. A differential pulse voltammetric method with a bismuth bulk working electrode was developed for its determination, and a Britton-Robinson buffer of pH 8.0 was chosen as an optimal medium. The calibration curve was measured in the concentration range from 2 to 100 μmol L-1 (R = -0.9989) with the limits of detection and quantification of 0.46 and 1.54 μmol L-1, respectively (RSD = 8.3% for n = 20). Key words: 5-Nitroindazole, Bismuth bulk electrode, Differential pulse voltammetry, Electrochemistry. Introduction 5-Nitroindazole (5-NI) is a nitro derivative of indazole, which is widely used in chemical industry as a precursor for the synthesis of various organic compounds such as antibiotics. Derivatives on indazole, including 5-nitroindazole, show high toxicity against parasites form the Trypanosomatidae family, which are responsible for many diseases in animals and humans. 5-NI has been proven to be a strong mutagen against bacterial cultures 1. For these reasons, the development of new, cheap, and easy to perform methods for the determination of this genotoxic mutagen is more than desirable. Recently, 5-nitroindazole has been determined by polarographic and voltammetric techniques using mercury-based electrodes 2. However, rising concerns about toxicity of liquid mercury from various governmental agencies caused researchers to search for a suitable mercury replacement. One possibility is a bismuth-based electrode, since bismuth offers similar electrochemical behavior compared to mercury, but at much lower toxicity. In the last 15 years, a lot of research has been done in the field of bismuth based electrodes, and the progress has been summarized in several reviews 3-5. Bismuth-based electrodes were widely used for determinations of various inorganic ions, however, determinations of organic compounds are rather scarce (e.g., picric acid 6, parathion 7, or 2-amino-6-nitrobenzothiazole 8). In this work, a newly prepared bismuth bulk electrode (BiBE) was used for the development of a method for the determination of genotoxic pollutant 5-nitroindazole. Experimental A stock solution of 1 mmol L-1 5-nitroindazole (5-NI, CAS No. 5401-94-5; 99%, Aldrich, Germany) was prepared in methanol (>99.9%, Merck, Germany). All other concentrations needed were prepared by exact dilution of the stock solution with methanol. A supporting

143

electrolyte always consisted of 1 mL of methanol and 9 mL of a Britton-Robinson (BR) buffer solution (prepared from analytical grade reagents, Lach-Ner, Neratovice) to adjust the pH of the solution as needed. For measurement of the calibration curve, appropriate amounts of 5-NI were spiked into the supporting electrolyte. All measurements were performed using an Autolab PGSTAT10 potentiostat/galvanostat connected to a Metrohm 663 VA Stand (both Metrohm Autolab, Switzerland) with the BiBE (prepared in our laboratory) as a working electrode, a Ag|AgCl (3 mol L-1 KCl) reference electrode (Elektrochemické Detektory, Czech Republic), and a platinum wire auxiliary electrode. The potentiostat was controlled by the NOVA 1.10 software (Metrohm Autolab, Switzerland). Parameters of differential pulse voltammetry (DPV): modulation amplitude -50 mV, modulation time 80 ms, scan rate 25 mV s-1. Before each voltammetric measurement, oxygen was removed from measured solutions by bubbling with nitrogen (purity 4.0, Linde, Czech Republic) for 5 min. For optimization purposes, DPV scans were performed in the whole available potential window of the BiBE. At optimal conditions for the determination of 5-NI, DP voltammograms were recorded from -0.35 to -0.80 V. The BiBE was prepared in our laboratory. The electrode body consisted of a glass Pasteur pipette tip, into which a copper contact wire was inserted. Crystalline bismuth (99%, Neomag.cz, Czech Republic) was then melted using a soldering gun under the constant stream of nitrogen gas (purity 4.0, Linde, Czech Republic) to avoid the oxidation of the molten metal. A syringe was attached to the top of the Pasteur pipette tip, and, then, it was submerged in the molten bismuth. Afterwards, by gently pulling the piston of the syringe, a liquid metal was sucked in the pipette tip until the contact wire was immersed. After cooling down, the syringe was removed, and the electrode surface was treated using a emery paper with a decreasing grain size (800 – 2000) until the surface showed satisfactory smoothness. At the beginning of the daily measurements, the BiBE was polished using an alumina slurry (grain size 0.5 μm) and activated by performing 25 cyclic voltammetry scans from 0 to -1.2 V at a polarization speed of 100 mV s-1 in BR buffer (pH 4.0). Results and Discussion First of all, the optimal pH of the supporting electrolyte (BR buffer) had to be found. The pH range from 2.0 to 12.0 was investigated, and pH 8.0 was found to be the most convenient. The DPV peak was the best developed, and the peak current recorded was the highest. See Fig. 1 for reference; DP voltammograms recorded at the odd pH values are omitted for the sake of the simplicity. Under the optimal conditions found, calibration dependence of 5-NI was measured in the concentration range from 2 to 100 μmol L-1. All measurements were performed 5 times, only the measurement at a concentration of 2 μmol L-1 was performed 20 consecutive times to calculate the repeatability of the measurement (expressed in terms of relative standard deviation (RSD)). Afterwards, the calibration dependence was fitted. Fig. 2 shows the DP voltammograms of 5-NI measured in the above-mentioned concentration range and the corresponding calibration curves.

144

I (nA)

-300

-200

-100

pH 2 pH 4 pH 6 pH 8 pH 10 pH 12

0.00

-0.25

-0.50 E (V)

-0.75

Fig. 1. DP voltammograms of 5-NI (c = 100 μmol L-1) measured at the BiBE at even-numbered pH values; pH 8.0 selected as optimal with the peak parameters: Ep = -0.587 V; Ip = -284 nA. For the lower concentration range (2 to 10 μmol L-1), the current of the blank experiment had to be subtracted from the peak current of the given concentration because when the standard linear baseline was used, the calibration dependence in the lower concentration range showed a different slope than at higher concentrations. This was probably caused by the position of the peak of 5-NI at less negative potentials, where the proximity of the bismuth oxidation potential somehow affected the precision of the measurements in the lower concentration range. It can be well observed in Fig. 2B. The limits of detection (LD) and quantification (LQ) were calculated as three and ten times standard deviation of the peak current of the lowest concentration, respectively, divided by the slope of the calibration straight line. Table I shows the obtained results. Table I. Parameters of the calibration straight line of 5-NI determined using DPV at the BiBE in the BR buffer of pH 8.0 in the concentration range from 2 to 100 μmol L-1. Slope (nA μmol-1 L)

Intercept (nA)

Correlation Coefficient

LD (μmol L-1)

LQ (μmol L-1)

RSD (n = 20) (%)

-2.92

0.27

-0.9989

0.46

1.54

8.3

145

-400

100 80

-300

60

A

I (nA)

-200 20

6

-90

4

-80

-100

2

Blank

-0.4

-0.5 -0.6 E (V)

B

8

-100

40

I (nA)

10

-110

Blank

-0.7

-0.8

-70 -0.4

-0.5

-0.6

-0.7

E (V)

-300

C

-200

I (nA)

I (nA)

-30

-100

-15 0

0

5 10 c (mol L-1)

0 0

20

40

60 c (mol L-1)

80

100

Fig. 2. DP voltammograms of 5-NI measured at the BiBE in the BR buffer of pH 8.0 in the concentration range of 20 – 100 μmol L-1 (A) and 2 – 10 μmol L-1 (B); numbers next to curves correspond to actual concentration of 5-NI in μmol L-1. (C) Corresponding concentration dependence of 5-NI; the inset shows the lower concentration range (2 – 10 μmol L-1) in detail; parameters of the calibration straight line are given in Table I; the error bars were constructed for the significance level α = 0.05 (n = 5). Conclusions A voltammetric method for the determination of genotoxic pollutant 5-nitroindazole (5-NI) at a bismuth bulk working electrode (BiBE) was developed. The limit of quantification (LQ) reached using differential pulse voltammetry in the Britton-Robinson buffer of pH 8.0 was 1.5 μmol L-1, which is only one order of magnitude higher than that reached using the same technique at a hanging mercury drop electrode (LQ ≈ 0.2 μmol L-1) 2. Therefore, it can be concluded that the BiBE can be successfully used for the determination of trace amounts of 5-NI as a suitable non-toxic and environmentally friendly alternative to mercury electrodes. Moreover, a very cheap, quick, and easy to perform method of the preparation of the BiBE was developed in this work. Acknowledgements This work was performed in the framework of the Specific University Research (project SVV260084). Financial support from the Academy of Sciences of the Czech Republic (project Open Science III – Reg. No. CZ.1.07/2.3.00/35.0023) and the Grant Agency of the Czech Republic (project P206/12/G151) is gratefully acknowledged.

146

References 1. Vance W. A., Okamoto H. S., Wang Y. Y.: Mutat. Res. 173, 169 (1986). 2. N mcová V., Šim nková P., Barek J., V. Vyskočil, Zima J., 15. Österreic isc e Chemietage, Graz, Sep 23rd – Sep 26th, 2013, Poster PO-10. 3. Švancara I., Prior C., Hočevar S. B., ang J.: Electroanalysis 22, 1405 (2010). 4. Lezi N., Economou A., Barek J., Prodromidis M.: Electroanalysis, in press (2014). 5. Lezi N., Vyskočil V., Economou A., Barek J., in Sensing in Electroanalysis, Vol. 7 (Eds.: Kalcher K., Metelka R., Švancara I., Vytřas K.), University Press Centre, Pardubice, 2012, pp. 71-78. 6. Prchal V., Vyskočil V., Barek J., 15. Österreic isc e emietage, Graz, Sep 23rd – Sep 26th, 2013, Poster PO-29. 7. El Tall O., Beh D., Jaffrezic-Renault N., Vittori O.: Int. J. Environ. Anal. Chem. 90, 40 (2010). 8. Deylová D., Vyskočil V., Barek, J., Economou A.: Talanta 102, 68 (2012).

147

Electrochemistry of Flavonolignans and their Interactions with DNA and Proteins (Elektrochemie flavonolignanů a jejich interakce s DNA a proteiny) Michaela Pyszkova a, Martina Zatloukalova a, David Biedermann b, Vladimir Kren b, Jitka Ulrichova a, Sarka Ramesova c, Romana Sokolova c and Jan Vacek a a Department of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University, Hnevotinska 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Microbiology of the AS CR, v.v.i., Videnska 1083, 142 20 Prague, Czech Republic c J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Dolejskova 3, 18223 Prague, Czech Republic Abstract Electrochemical oxidation of flavonolignans silybin, silydianin, silychristin and their 2,3dehydroderivatives, was studied using ex situ and in situ cyclic and square wave voltammetry at pyrolytic graphite electrode. The pilot results presented here could be used for further investigation of mechanism of oxidation and reactivity of flavonolignans to DNA and proteins. Key words: Flavonolignan, Silymarin, Oxidation, Nucleic acids, Proteins, Free radicals. Introduction The protective effects of polyphenols are due to the scavenging of a wide range of reactive oxygen, nitrogen, and chlorine species; metal chelating properties as well as the modulation of activity of enzymes involved in the oxidative stress. However, the prooxidant effects of polyphenols have also been described under certain experimental conditions. Recent data showed that in general the equilibrium of antioxidant and prooxidant effects plays an important role in the biological activity of polyphenols 1. Several methods for the study the redox properties and reactivity of polyphenols have been reported. Electrochemical techniques, namely cyclic, differential pulse, square wave voltammetry and amperometry are commonly used 2. In particular, understanding of the oxidation mechanisms provides insight into the behavior of polyphenolic compounds in physiological milieu and it is of fundamental importance for evaluation of their antioxidant/prooxidant activities. The aim of this work was to analyze bioactive flavonolignans of silymarin complex, the extract that is derived from the milk thistle plant 3. Namely silybin (SB), dehydrosilybin (DHSB), silydianin (SD), dehydrosilydianin (DHSD), silychristin (SCH) and dehydrosilychristin (DHSCH) were studied (Fig. 1). We have applied cyclic and square wave voltammetry for the analysis of reactivity, i.e. evaluation of antioxidant/prooxidant properties, of the flavonolignans and for the study of their interactions with DNA and proteins. Experimental SB was kindly provided by J. Cvak (Teva Galena, Opava, CR), SD and SCH were prepared as described in our recent paper 4. 2,3-Dehydroderivatives were prepared by oxidation with oxygen in hot (80 °C) pyridine in mediocre yield. The metal/flavonolignan complexes were prepared by mixing CuCl2/FeCl3 with the flavonolignans in 0.2 M NaCl solution (pH 6.5) for 15 min at 25 °C. Calf-thymus DNA and bovine serum albumin were purchased from SigmaAldrich and single-stranded DNA (CCGCGCGCCACGCTGGGGGACCTCGGGGCC) was

148

prepared synthetically (VBC Biotech, AT). All sample preparations, reactions and analyses were performed under aerobic conditions. Electrochemical measurements were performed using Autolab III analyzer (EcoChemie, NL) in a three-electrode setup (Ag/AgCl/3M KCl electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode). Individual settings for CV and SWV are given in the figure legends. Stock solutions of 1 mg/mL were prepared in methanol. PGE was placed in the electrochemical cell containing supporting electrolyte Britton-Robinson buffer pH 7.4 and studied sample for in situ analysis. The electrochemical measurements were performed after an accumulation period. For ex situ analysis, the compounds were firstly accumulated onto the PGE surface from 0.2 M acetate buffer pH 5.0. After accumulation period and rinsing the electrode, the PGE was placed in the electrochemical cell containing pure supporting electrolyte and electrochemical measurements were performed. OH

O HO A

C

OH

O

O

2

E

3

20

OH

5

SB

OH

D

B

O

O CH3 O

HO

CH3

OH

O OH

OH

SCH

O

OH

OH

O

O OH O HO

O O OH

SD

OH

O

CH3

OH

Fig. 1. Chemical structures of SB, SD and SCH. The corresponding dehydroderivatives contain 2,3-double bonds at ring C. Mixtures of diastereoisomers A and B, ca. 1:1, were analyzed in this study. Table I Oxidation potentials (Ep) of the flavonolignans at pH 7.4. The values (Ep/V vs. Ag/AgCl/3 M KCl) were estimated by ex situ CV and SWV. Compound CV SWV Ep1´ Ep1 Ep1´ Ep1 0.518 0.527 SB 0.364 0.509 0.339 0.537 DHSB 0.417 0.402 SD 0.464 0.435 DHSD 0.496 0.479 SCH 0.357 0.490 0.320 0.493 DHSCH

149

Results and Discussion The electrochemical behavior of SB and its congeners (Fig. 1) was studied by ex situ (adsorptive transfer) and in situ CV and SWV according to previously published procedure 5. For SB two well-developed oxidation peaks at Ep1 ~ +0.55 V and Ep2 ~ +0.87 V were observed (Fig. 2, full line). The first peak can be ascribed to oxidation of C-20 hydroxyl group at ring E. Second oxidation step is connected to the oxidation of resorcinol moiety (ring A), most probably C-5 hydroxyl group is involved in the anodic reaction 5-7. Besides abovementioned, the oxidation of C-3 hydroxyl group (ring C) in DHSB was found at less positive potential, Ep1’ ~ +0.37 V (Fig. 2, dashed line). Oxidation potentials for other compounds investigated by CV and SWV at pH 7.4 can be found in Tab. I. Taking account the fact that waves in cyclic voltammograms are not well resolved, SWV at pH 5 was used in consecutive experiments. SW voltammograms of SB and DHSB are shown in Figs. 3A and 3B. The anodic peak 1 of SCH (Fig. 3C) and SD (Fig. 3E) occurred around +0.6 V can probably be ascribed to oxidation of hydroxyl group at methoxyl group containing ring E (Fig. 1). A peak 1’ was observed for dehydroderivatives of both compounds, DHSCH and DHSD (Figs. 3D and 3F). The oxidation mechanism of hydroxy-compounds is often influenced by pH of solution 8. The peak potentials for all compounds, determined by SWV at pH 5, 7 and 9, are presented in Tab. II. The oxidation potential Ep1 decreases with increasing pH of solution. 80

SB DHSB Electrolyte

I / µA

60 40

2

20 1´

1

0 0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

E/V

Fig. 2. Ex situ cyclic voltammograms of SB. Experimental conditions: time of accumulation 30 s, concentration of the compounds 50 µM, supporting electrolyte Britton-Robinson buffer (pH 7.4), initial potential (0 V), first vertex potential (+ 1.5 V), second vertex potential (0 V), scan rate 1 V/s. The reactivity and antioxidant capacity of the studied compounds can be deduced from the potential of the first oxidation peak (wave) in the first anodic scan, where the antioxidant capacity of the oxidized compounds is negatively associated with their oxidation potential 7. This indicates that dehydroderivatives are more easily oxidized, more reactive and better antioxidants in comparison to parent compounds, SB, SCH and SD. This statement is in a good agreement with the results of biological studies on flavonolignans, which often indicate facilitated biological activity (higher reactivity) for the dehydroderivatives 3. Moreover, we focused on the study of prooxidant effects of the flavonolignans and their interactions with DNA and proteins. Flavonolignan/metal (Cu or Fe) complexes 9,10 were used as prooxidant species. After the incubation of the complexes with DNA in presence/absence of H2O2, DNA damage was analyzed using SWV at PGE. Decrease in DNA peaks Gox and Aox was observed, which indicated the prooxidant action of the flavonolignan/metal complexes. The results demonstrate that prooxidant complexes can involve DNA 150

fragmentation and oxidative modification under ex vivo conditions where presence of serum albumin in the samples strictly suppresses the DNA damaging effects. Electrochemical data were supported by electrophoretic methods. For more details see ref. 10. 35

30

25

25

20

20

1

I / µA

I / µA

30

35

A

15 10

DHSB

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E/V

35

C

30

1

20 15 10

15

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E/V

35

E

30

25

25

20

20

I / µA

I / µA

1´

20

DHSCH

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

10

1

5

SCH

15

D

10

5

30

E/V

25

I / µA

I / µA

25

35

15

5

SB

30

1 1´

10

5

35

B

1

E/V

F

15

1´ 1

10

5

5

SD

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E/V

DHSD

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E/V

Fig. 3. In situ SW voltammograms of silybin (A), dehydrosilybin (B), silychristin (C), dehydrosilychristin (D), silydianin (E) and dehydrosilydianin (F). Experimental conditions: time of accumulation 30 s, concentration of the compounds 5 µM, supporting electrolyte Britton-Robinson buffer (pH 5), initial (0 V) and end (+ 1.5 V) potential, frequency 200 Hz.

151

Table II Oxidation potentials (Ep) of the flavonolignans. The values (Ep/V vs. Ag/AgCl/3 M KCl) were estimated by in situ SWV. Britton-Robinson buffer was used as a supporting electrolyte. Compound pH 5 pH 7 pH 9 Ep1´ Ep1 Ep1´ Ep1 Ep1´ Ep1 0.665 SB 0.576 0.375 0.567 0.708 DHSB 0.376 0.584 0.315 0.461 0.585 SD 0.477 0.345 0.566 DHSD 0.475 0.350 0.557 SCH 0.488 0.371 0.504 0.660 DHSCH 0.391 0.553 0.239 0.448 Conclusion This work provides new insights into the oxidation mechanisms and the antioxidant vs. prooxidant effects of silymarin flavonolignans (silybin, silychristin, silydianin and their 2,3dehydroderivatives) at the molecular level under ex vivo conditions. This work affords a robust guideline for further investigations of reactivity of the flavonolignans to biomacromolecules which extended our previously published results 10. Our conclusions can be extrapolated and adopted to compounds with structural similarity to the flavonolignans and flavonolignan metabolites that would target DNA and proteins under physiological conditions. Acknowledgment This work was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, project No. LD14033 (COST Action EU-ROS, BM1203). References 1. Heinrich J., Valentova K., Vacek J., Palikova I., Zatloukalova M., Kosina P., Ulrichova J., Vrbkova J., Simanek V., : J. Agric. Food Chem. 61, 4526 (2013). 2. Jakubec P., Bancirova M, Halouzka V., Lojek A., Ciz M., Denev P., Cibicek N., Vacek J., Vostalova J., Ulrichova J., Hrbac J.: J. Agric. Food Chem. 60, 7836 (2012). 3. Gazak R., Walterova D., Kren V., Curr. Med. Chem. 14, 315 (2007). 4. Krenek K., Marhol P., Peikerova Z., Kren V., Biedermann D.: Food Res. Int. (2014) in press, http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2014.02.001. 5. Zatloukalova M., Kren V., Gazak R., Kubala M., Trouillas P., Ulrichova J., Vacek J.: Bioelectrochemistry 82, 117 (2011). 6. Ulrichova J., Zatloukalova M., Kren V., Vacek J.: Planta Med. 77, 1269 (2011). 7. Zatloukalova M., Enache T. A., Kren V., Ulrichova J., Vacek J., Oliveira-Brett A. M.: Electroanalysis 25, 1621 (2013). 8. Sokolova R., Ramesova S., Degano I., Hromadova M., Gal M., Zabka J.: Chem. Commun. 48, 3433 (2012). 9. Sokolova R., Kubala M., Vavrikova E., Ulrichova J., Kren V., Vacek J., 13th Workshop of Physical Chemists and Electrochemists 2013, Czech Republic, Book of Abstracts (ISBN 978-80-7375-757-1), p. 161. 10. Vacek J., Zatloukalova M., Desmier T., Nezhodova V., Hrbac J., Kubala M., Kren V., Ulrichova J., Trouillas P.: Chem. Biol. Interact. 205, 173 (2013).

152

Electrochemical Determination of Myristicin Using a Carbon Paste Electrode (Elektrochemické stanovení myristicinu na uhlíkové pastové elektrodě) Kamila Rosecká, Tomáš Mikysek, and Ivan Švancara University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, 53210 Pardubice,Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract This study describes an electrochemical behaviour of myristicin and offers a method for its determination using a carbon paste electrode. Myristicin undergoes the oxidation showing one irreversible process at about +1,1 V vs. ref. involving two electrons. The effect of various electrolytes as well as pH dependence is described herein. Within the study, square-wave voltammetry was used as the technique of choice for the myristicin determination, which has been verified by analysis of real sample – a nutmeg. The respective result(s) were compared to those obtained by GC-MS reference determination, showing good agreement. Key-words: carbon paste electrode, square-wave voltammetry, myristicin, determination. Úvod Myristicin (viz také br.1) je hlavní složkou muškátového oříšku, pocházejícího ze stromu muškátovníku pravého (Myristica fragrans). Je obsažen v esenciálním oleji muškátového oříšku a kv tech (červený voskový obal oříšku), dále je v malém množství v petrželi a kopru. Myristicin je antagonisticky p sobící látka na receptor serotoninu a má halucinogenní účinky; v lidských buňkách p sobí neurotoxicky. trava m že vést k mnoha zdravotním problém m, jako jsou křeče, bušení srdce, nevolnost, případn dehydratace a také vyvolává t lesnou bolest. Jeho koncentrace v oleji z muškátového oříšku dosahuje často i 15 % 1,2.

Obr. 1. Struktura myristicinu. V posledních letech bylo hlášeno mnoho otrav zp sobených požitím nadlimitního množství muškátového oříšku. Také se zvyšuje používání myristicinu jako levné halucinogenní drogy, protože se biotransformací přem ňuje na MMDA (3-methoxy-4,5-methylendioxyamfetamin) 3, proto se klade čím dál v tší d raz na vypracování nových metod pro stanovení myristicinu v potravinách. Ke klasickým metodám, používaným ke stanovení myristicinu patří nejčast ji separační techniky (např. ve spojení s hmotnostní spektrometrií), jako HPLC 4,5, GC–MS 2,6, MS 7 a HPTLC 8. Alternativou k t mto technikám m že být elektroanalýza, a to díky nízkým náklad m na analýzu a vysoké citlivosti. V tomto přísp vku je prezentována základní elektrochemická a elektroanalytická charakterizace s ukázkou stanovení přírodní látky, myristicinu, pomocí cyklické voltametrie a squarewave voltametrie na uhlíkových pastových elektrodách. Výsledky popisují chování výše uvedené látky v r zných typech základních elektrolyt a zároveň funkčnost příslušné metody po základní optimalizaci experimentálních podmínek ke stanovení myristicinu.

153

Experimentální část emikálie. Myristicin – 3-methoxy,4,5-methylendioxy-allylbenzen (Sigma-Aldrich, Česká republika), jeho standardní roztok byl připraven rozpušt ním 11,4 mg myristicinu v 10 ml ethanolu. Pro přípravu základních elektrolyt v podob 0,1 mol/l roztok (HCl, HCl 4, H2SO4, KCl, amonný pufr a Na H) a k příprav série Britton-Robinsonových pufr bylo použito b žných laboratorních chemikálií. Všechny potřebné roztoky byly připraveny z deionizované vody získané pomocí systému Milli-Q od firmy Millipore. Instrumentace. Všechna elektrochemická m ření byla provád na na přístroji AUT LAB (model "PGSTAT-128"; Metrohm - Autolab B.V., Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla připojena m řicí cela s tří-elektrodovým systémem obsahujícím uhlíkovou pastovou elektrodu z uhlíkového prášku ,,CR-5” (Maziva Týn, CZ) a parafínového oleje (Merck; CZ) a pro srovnávací m ření elektrodu ze skelného uhlíku dále pak referentní elektrodu Ag | AgCl | 3 M KCl a pomocnou elektrodu (Pt). Postupy Square-wave Voltametrie (SWV). Tyto experimenty byly provád ny v roztoku výše uvedených elektrolyt , obsahujících r zné koncentrace myristicinu, připraveného z jeho ethanolického zásobního roztoku o koncentraci 1,14 mg/ml. U v tšiny experiment byly použity následující podmínky: počáteční potenciál 0,0 V, koncový potenciál 1,4 V vs. ref. frekvence 25 Hz, amplituda pulsu 50 mV, rychlost zm ny polarizačního nap tí 50 mV/s, doba kondicionace 30 s při potenciálu 0 V. Příprava reálné o vzorku. Muškátový oříšek, b žn dostupný v obchod , byl nastrouhán a následn jeho navážka 0,5 g převedena do kádinky s 10 ml ethanolu. Vzniklá suspenze byla ponechána v ultrazvuku po dobu 10 minut při 60 °C, poté přefiltrována, filtrát byl převeden do odm rné baňky, která byla dopln na ethanolem na objem 10 ml. Výsledky a diskuse V této práci bylo studováno elektrochemické chování myristicinu v r zných elektrolytech na r zných typech uhlíkových elektrod. Z cyklické voltametrie ( br.2) vyplývá, že k oxidaci myristicinu dochází při potenciálu cca +1,1 V vs. ref.. Tato oxidace je ireverzibilní a s nejv tší pravd podobností dvouelektronová. Při použití elektrody ze skelného uhlíku bylo pozorováno podobné chování a navíc byla pozorována adsorpce studované látky na povrch elektrody. Dalším krokem bylo testování r zných základních elektrolyt , kde bylo zjišt no, že myristicin je elektroaktivní ve všech studovaných elektrolytech o koncentraci 0,1 mol/l (HCl, HClO4, H2SO4, KCl, amonný pufr a Na H). Již v úvodních experimentech se ukázalo, že lipofilní charakter myristicinu bude hrát významnou roli při optimalizaci jeho stanovení. Myristicin se totiž extrahuje do uhlíkové pasty a při opakovaných m řeních dochází k nár stu signálu. I když se extrakce analytu do pasty v n kterých případech úsp šn využívá ke zvýšení citlivosti m ření 9, v našem případ bylo nutné zařadit kondicionační krok a pokusit se o zajišt ní stability signálu. Toto řešení pomohlo jen částečn a bylo nutné přikročit k obnov povrchu před každým m řením. Zvýšení opakovatelnosti lze zajistit i nanesením Nafionu® na povrch a tím ho ochránit před výrazn jší extrakcí. ptimální koncentrace Nafionu byla okolo 1%, při vyšší koncentraci byl povrch příliš blokován a docházelo již ke snižování pík . Při m ření závislosti signálu na pH pomocí série Britton - Robinsonových pufr bylo zjišt no, že myristicin poskytuje signál v celém rozsahu pH. Nejvyšší a zároveň nejstabiln jší odezva byla zjišt na u pufru s pH 7, který byl použit i pro další m ření.

154

Obr. 2. Cyklická voltametrie myristicinu na CPE ve fosfátovém pufru o pH 7, koncentrace 2,87·10-4 mol/l, rychlost skenu 10 mV/s. Dalším krokem bylo prom ření kalibrační řady (viz. br.3), kdy výslednou křivku lze popsat rovnicí y = 358,5x + 0,130, jež byla následn použita, spolu s vícenásobným standardním přídavkem, pro vyhodnocení analýzy reálného vzorku.

Obr. 3. Kalibrační řada myristicinu v B-R pufru o koncentraci 1 až 84 g/ml. Další podmínky viz experimentální část. Optimalizace navržené metody byla ov řena modelovou analýzou reálného vzorku b žn dostupného muškátového oříšku a provedeno pouze jedno m ření. Jeho prostřednictvím byl zjišt n obsah 0,585 mg/ml, což odpovídá 1,17% myristicinu v muškátovém oříšku. Analýza stejn připraveného vzorku byla provedena i nezávislou metodou s využitím GC-MS, kde

155

koncentrace analytu byla stanovena na 0,561 mg/ml (tj. 1,12% myristicinu v muškátovém oříšku). Literatura uvádí, že obsah myristicinu v muškátovém oříšku se pohybuje do 1,5 % 10. Závěr Práce se zabývá stanovením myristicinu a zároveň popisem jeho elektrochemického chování. Mytisticin je oxidován dv ma elektrony, a poskytuje ireverzibilní elektrodovou reakci při potenciálu cca +1,1 V. Jeho lipofilní charakter pon kud komplikuje stanovení kv li významné extrakci této látky do elektrodového materiálu, kterým byla uhlíková pasta, a pro níž je tato schopnost typická.9 Ani v případ použití jiné elektrody  jmenovit ze skelného uhlíku  nebyl tento problém odstran n; zde pro zm nu docházelo k adsorpci této látky na povrch elektrody, a tomuto nešlo zabránit ani zařazením kondicionačního kroku. Pro vlastní stanovení se jeví jako nevhodn jší elektrolyt Britton-Robinson v pufr o pH 7. Výše uvedená analýza ukázala, že navržená metoda je vhodná ke stanovení myristicinu v reálném vzorku muškátového oříšku. Výsledek voltametrického stanovení byl v dobré shod s použitou referenční metodou pomocí GC-MS. Na záv r lze tedy konstatovat, že vyvinutý postup na bázi CPE a S V nabízí vhodnou a úspornou alternativu k již zavedeným, vesm s chromato-grafickým metodám. Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a t lovýchovy České Republiky projektu CZ.1.07/2.3.00/30.0021 "Posílení excelentních tým výzkumu a vývoje na Univerzit Pardubice". Literatura 1. Lee B. K., Kim J. H., Jung J. W., Choi J. W., Han E. S., Lee S. H., Ko K. H., Ryu J. H.: Toxicol. Lett. 157, 49 (2005). 2. Dawidowicz A. L., Dybowski M. P.: Food Chem. Tox. 50, 2362 (2012). 3. Stein U.,Greyer H., Hentschel H.: Forensic Sci. Int. 118, 87 (2001). 4. Wulf L. W., Nagel C.W., Branen A. L.: J. Chromatography A 161, 271 (1978). 5. Archer A.W.: Journal of Chromatography 438, 117 (1988). 6. Raffo A., D'Aloise A., Magri A. L., Leclercq C.: Food Chem. Tox. 59, 626 (2013). 7. Benevides P. J. C., Sartorelli P., Kato M. J.: Phytochemistry 52, 339 (1999). 8. Naikodi M. A. R., Waheed M. A ., Shareef M. A., Ahmad M., Nagaiah K.: Pharm. Methods 2, 76 (2011). 9. Švancara I., Kalcher K., alcarius A., Vytřas K.: Electroanalysis with Carbon Paste Electrodes. CRC Press, 2012. 10. Shulgin A.T., Sargent T., Naranjo C.: Psychopharm. Bull. 4, 13 (1967).

156

The Detection of Electroosmotic Flow and its Estimation in a Simple, Polarized Microcapillary System Barry R. Silver, Karel Holub, and Vladimír Mareček J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v. v. i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract A simple electrochemical methodology enabling both estimation and detection of electroosmotic flow in a glass microcapillary system is herein described. The methodology is based on the application of a potentiostatically-controlled composite electrical signal (combined AC and DC polarization). Subsequent analysis of the current time response is used to estimate the magnitude of electroosmotic flow. The methodology is demonstrated using a microcapillary. Key words: ion transport, electroosmotic flow, AC impedance, pseudo-inductive, capillary. Introduction Recently, we demonstrated a facile methodology which enables the manufacture of robust and reusable glass capillaries with orifices sizes of nano- and micro-scale dimension 1. Additionally, we found using electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the presence of a curious low frequency pseudo-inductive loop on capillaries exhibiting non-ohmic current– potential dependence 1,2. It was previously suggested that the low frequency pseudo-inductive behavior may have originated from ion transport which occurs parallel to that found conventionally in bulk 1. It was further suggested that potential-dependent surface conductivity effects, in conjunction with negatively charged glass walls, seemed a likely candidate for our proposed ‘walleffect’[1]. Such phenomena can be caused by longitudinal polarization of the electric doublelayer formed between the charged glass surface and adjacent electrolyte cations. Herein, we further investigate the low frequency pseudo-inductive behavior 1,2. In an attempt to circumvent possible errors in phase angle measurement, using conventional EIS (with larger than conventionally used signal amplitudes), we utilize a novel yet analogous experimental arrangement. Using the new experimental arrangement, we measure only the amplitude of the current response to a composite electrical signal/perturbation, which comprises both an AC and a DC component. In this way, we are able to analyse the dynamic electrochemical behavior of the microcapillary system. Importantly, this novel methodology enables the rapid detection of electroosmotic effects in polarized glass microcapillary systems and its estimation in a simple manner. We find that the low frequency pseudo-inductive loop behavior, observed in previous studies 1,2, is not an experimental artifact and is linked to charge injection into the capillary tip region via electroosmosis. Experimental LiCl (Fluka, Biochemika, 62476, >99% purity) was dissolved in deionised water (conductance: <0.1 S cm-1, Goro, Czech Republic) and was used in a concentration of 10 mM throughout. A three electrode cell with two Ag/AgCl reference electrodes was used (one electrode was located inside the capillary) throughout. A plain silver wire served as a counter electrode in the bulk solution. The entire electrochemical cell was placed within a grounded Faraday cage. Positive potentials refer to the positive polarization of the Ag/AgCl electrode located inside the capillary. The capillary (diameter of the orifice is <1 µm) was manufactured

157

in the same manner as previously described 1. Conventional EIS and linear sweep voltammetry experiments were conducted using a CHI 660c Electrochemical Workstation (CHI instruments, USA). The current response of the electrochemical cell to a composite perturbation signal was measured in a separate experiment. Specifically, a low frequency AC signal (0.1 to 20 Hz, 0.2 V peak-peak amplitude) was generated with a function generator DS340 (Stanford Research System). The AC signal was superimposed onto a DC signal which was generated with a PAR 263A (EG&G Princeton Scientific Research). The composite signal was then applied to the electrochemical cell. AC currents (mean peak magnitudes and mean peak values) thus produced, were monitored and averaged using a LeCroy LT322 Waverunner oscilloscope (Teledyne LeCroy) over the course of a 3 minute polarization cycle. The electrochemical system was then “left to rest”, at open-circuit, for a further 3 minutes prior to initiating another polarization cycle at a different frequency. Polarization cycles began at 20 Hz and proceeded towards lower frequencies in a sequential manner. Results and Discussion The capillary tip resistance (Rc = 58.1 MΩ) under essentially unpolarized conditions was derived from an impedance spectrum recorded at 0V DC polarization (20 mV amplitude, 10 kHz to 0.1 Hz, not shown) 1. The derived tip resistance has been used to construct the ‘ohmic’ I-V behavior of the capillary (line b, Figure 1A). This theoretical curve provides useful comparison to the ‘non-ohmic’ experimental data recorded at the scan rate 2 mV s-1, starting at 0 V (line a in Figure 1A). 17.0

B

20

A

15

16.5

b

10

16.0 a

15.5

- I / nA

I / nA

5 0 -5 -10

15.0

B

14.5

1.8 nA 4.6 nA

-15

14.0

-20

a -1.0

13.5 -0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

1.0

E/V

1

2

3

4

5

t1/2/ s

Fig. 1. (A): a - experimental I-V curve (2 mV/s, 10 mM LiCl), b - ‘ohmic I-V’ curve plotted using a single resistance value R = 5.8x107 Ω; (B): The current peak maxima plotted vs. halfcycle time of the perturbation signal, (■) experimental data, (●) fitting procedure using v = 16 µm s-1 and the concentration increase in the first section 8.6 mol m-3. The current enhancement exhibited by the experimental I-V curve, above that of the theoretical ‘ohmic’ curve at -0.7 V, is 1.8 nA (Figure 1A). This is an enhancement of approximately 15 % in current. The cell resistance has thus decreased from 58.1 MΩ (unpolarized conditions) to 50.5 MΩ under a DC polarization of -0.7 V. Conversely, at positive potentials, the measured current decreases with increasing polarization, (cf. curve a, Figure 1A). Non-ohmic I-V behavior (Figure 1, curve a) indicates that changes in resistance (and hence concentration) inside the capillary tip region have occurred. These concentration changes can be explained by charge injection into the small volume tip region via an electroosmotic

158

mechanism. The electroosmotic flow is driven by longitudinal polarization of the electric double-layer on the glass surface. The non-symmetrical diffusion space found in the capillary tip region can, in this way, produce either an enhancement (or depletion) of the electrolyte concentration in the tip region. The ‘enhancing’ or ‘depleting’ behavior is a product of the direction of electroosmotic flow. Longitudinal polarization of the negatively charged glass surface is caused by the passed current (ohmic polarization). The magnitude of the current enhancement is indicative of the resistance change. Thus one can use the extent of the current enhancement to obtain an estimate of the magnitude of the electroosmotic flow. The capillary was polarized using a composite signal consisting of a combined AC perturbation (± 0.2 V peak-peak amplitude , 20 Hz to 0.1 Hz frequency range) superimposed onto a DC signal (bias of -0.7 V). Average peak current amplitudes (over 3 minute polarization cycles) in response to the composite perturbation signal were recorded. Average peak current maxima when plotted against the half cycle time of the composite signal (Figure 1B), indicate two distinct regions. In particular, at low frequency, average peak current maxima tend towards constant value whilst at higher frequencies average peak current maxima are linearly proportional to frequency. A simple model is proposed which allows one to fit the experimental data, and thereby extract an estimate for the rate of the electroosmotic flow and the concentration change in the capillary tip region. The model makes use of a geometry which is described as a truncated cone (Figure 2A). The truncated cone is divided into sections (vide infra) and represents a typical geometry of the tip region for our particular capillary design. 17.0

A

B 16.5 16.0

- I / nA

15.5 15.0 14.5 14.0 13.5 0

5

10

15

20

f / Hz

Fig. 2. (A): Model of the capillary tip region; (B): The current peak maxima as a function of perturbation frequency, (■) experimental data, (●) fitting procedure using v = 16 µm s-1 and the concentration change in the first section 8.6 mol m-3. The velocity term v (along the capillary wall) is expressed in µm/s. This term is used to evaluate the distance li from the orifice, at which the concentration of the tip region changes due to electroosmotic flow. With decreasing frequency (or increasing half-cycle time), distance li from the orifice increases (distance defined by the velocity of the electroosmotic flow and the half-cycle time).

159

From the difference in half-cycle time between consecutive frequencies, one can evaluate a ‘new section’ element volume Vi and thereby derive the change of concentration in the new section with respect to the first ‘section’ volume V1. The resistance of each section is then recalculated using the original concentration c = 10 mol m-3 as a base-line, taking into account any changes in resistance due to electroosmotic electrolyte flow. The velocity term v and the concentration change c1 in the first section volume are the fitting parameters. The results of this type of analysis are featured in Figure 1B and Figure 2B. The current response dependency on half-cycle time is indicated in Figure 1B. In Figure 2B, the current is plotted as a function of perturbation frequency. The fit is very good and yields a value of 16 µm s-1 for the electroosmotic flow velocity. The concentration increase in the first section is 8.6 mol m-3 above the base-line concentration. The truncated cone geometry used for calculation purposes consists of base radius r1 = 0.37 µm, highest section radius 7.7 µm and cone length 100 µm. It should be noted that the sum of the capillary section resistances do not represent the resistance of the entire system. The first section volume V1 is 1.855x10-19 m3, which corresponds to a half-cycle time of 0.025 s (at 20 Hz). The concentration change is 8.6 mol m-3 above base-line. This yields 4x10-20 mol s-1 injection rate into the capillary tip volume via electroosmosis at 20 Hz. Conclusions Our experimental arrangement, analogous to that of a conventional EIS experiment, demonstrates that low frequency pseudo-inductive loops (observed on the Nyquist plot) under unusually high amplitude perturbations are not experimental artefacts. The low frequency pseudo-inductive loop, as previously suggested, is caused by the injection of electrolyte into the capillary tip-region via electroosmosis. The proposed experimental arrangement allows one to easily detect and to estimate the magnitude of electroosmosis and the rate of electrolyte injection into the capillary tip region. Acknowledgements We gratefully acknowledge funding from the Czech Science Foundation (project number 13-04630S). References 1. Silver B.R., Holub K., Mareček V.: Electrochim. Acta 110, 801 (2013). 2. Feng J., Liu J., Wu B., Wang G.: Anal. Chem. 82, 4520 (2010).

160

Electrochemistry of Flavonolignans in Acetonitrile and Dimethylsulfoxide Romana Sokolova a, Jana Kocabova a, Jan Fiedler a, Jan Vacek b, Petr Marhol c, Eva Vavříková c, and Vladimir Kren c a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Department of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University, Hnevotinska 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic c Institute of Microbiology, Academy of Science of the Czech Republic, Videnska 1083, 142 20 Prague, Czech Republic Abstract This study is focused on investigation of oxidation pathways of silybin and 2,3dehydrosilybin in nonaqueous solutions. The oxidation mechanism of both flavonolignans differs and depends strongly on their chemical structure. The cyclic voltammetry, UV/Vis and IR spectroelectrochemistry were used for identification of electrooxidation (semiquinone) intermediates. HPLC with diode array detection was applied for identification of oxidation and degradation products. Molecular orbital calculations supported the experimental findings. Key words: Silybin, 2,3-Dehydrosilybin, Electron transfer, Oxidation, Spectroelectrochemistry. Introduction Silybin 1 and 2,3-dehydrosilybin 2 (Scheme 1) belong to the group of flavonolignans. Presence of silybin in nature was confirmed in the plant Silybum marianum (L.) Gaertner 1. Its antioxidant and hepatoprotective properties were reported during the last two decades 2-4. Silybin is used as an additive in drug products and food supplements, for ex. H-Protect Enzyme (Pharma Future Ltd., UK). Both compounds, 1 and 2, contain in their chemical structure several hydroxyl groups. The electrochemical oxidation of polyphenols depends on the presence of protons in the solvent 5. The electrochemical oxidation of 1 and 2 in buffered aqueous solution was reported by Zatloukalova et al. 6. Authors found a strong dependence of the oxidation potential on pH. The oxidation products of 1 and 2 are not known. The electrochemistry of (poly)phenols in nonaqueous environment often involves formation of a semiquinone intermediate 7-9. The coupled chemical reactions such as dissociation or subsequent hydroxylation or dimerization can be involved in the overall oxidation mechanism 10-13. The aim of this study is the investigation of the basic electrochemical oxidation mechanism of silybin and 2,3-dehydrosilybin in nonaqueous solution, which has not yet been attempted. Experimental Reagents Silybin, (1, (2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-[(2R,3R)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2(hydroxy-methyl)-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl]chroman-4-one) as a mixture of diastereoisomers A and B (ca. 1:1), was isolated from commercial silymarin. 2,3Dehydrosilybin (2, (2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-[(2R,3R)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2(hydroxymethyl)-2,3-dihydrobenzo[b] [1,4]dioxin-6-yl]chromen-4-one) was prepared by oxidation with oxygen under base catalysis 14. Benzofuranone was prepared from diastereomeric mixture of 2,3-dehydrosilybin in accordance with literature 15, the product was purified by gel filtration using Sephadex LH 20 column, 140 × 1.8 cm (eluent 100% MeOH).

161

Tetrabutylammonium hexafluorophosphate (TBAPF6), which was used as the supporting electrolyte, was obtained from Sigma Aldrich and dried before use. Acetonitrile, anhydrous, 99.8%, and dimethylsulfoxide, anhydrous, 99.9%, were purchased from Sigma Aldrich (Germany) and were used as received. All reagents and chemicals were used without any further purification.

Scheme 1. Calculated molecular structure of 1 and 2 with respective HOMO distribution. Methods Electrochemical measurements were done in 0.1 M TBAPF6 in acetonitrile and dimethylsulfoxide using the electrochemical system of cyclic voltammetry. It consisted of a fast rise-time potentiostat interfaced to a personal computer via an IEEE–interface card (AdvanTech, model PCL–848) and a data acquisition card (PCL–818) using 12 bit precision. A three-electrode electrochemical cell was used with an Ag|AgCl|1M LiCl reference electrode separated from the test solution by a salt bridge. The working electrode was a glassy carbon microelectrode (diameter 0.7 mm). The auxiliary electrode was a platinum net. Oxygen was removed from the solution by passing a stream of argon. The oxidation products of 1 and 2 were prepared by exhaustive electrolysis on the carbon paste electrode in the concentration range from 2×10-4 M – 2×10–3 M. The exhaustive electrolysis and cyclic voltammetry before and after electrolysis were performed using a PGSTAT 12 AUTOLAB potentiostat (Ecochemie, Netherlands). Spectroelectrochemistry was performed using an optically transparent thin-layer electrode (OTTLE) cell 16 with a three-electrode system (platinum working and auxiliary electrode, silver quasi reference electrode) mounted in a thin layer (thickness 1.7 mm) between optical windows. The experimental setup is described in reference 17. The 1.0 cm quartz cuvettes were used for recording the absorption spectra. HPLC-DAD analyses were carried out using a Shimadzu Prominence UFLC analytical system consisting of two Shimadzu LC-20AD binary HPLC pumps, a Shimadzu SIL-20AC cooling auto-sampler, a Shimadzu CTO-10AS column oven and a Shimadzu SPD-20MA diode array detector (Shimadzu, Kyoto, Japan). A Chromolith Performance RP-18e monolithic column, (100 × 3 mm, Merck, DE) was used under isocratic or binary elution conditions. Mobile phases (A): CH3CN/CH3OH/H2O/HCOOH, 2:37:61:0.1, v/v/v/v, and (B): acetonitrile were used. Gradient I (used for sample of 2,3-dehydrosilybin AB after electrolysis) was: 0-2 min 100% A; 2-10 min 0-60% B; 10-15 min 60% B; 15-16 min 60-0% B. Gradient II (used for samples of silybin AB after electrolysis) was: 0-4 min 100% A; 4-9 min 0-40% B; 9-11 min 40% B; 11-12 min 40-0% B. Flow rate was 1.2 mL/min for all gradient elution techniques. 162

The PDA data were acquired in the 200-450 nm range. HPLC-DAD analyses during the electrolysis (Fig. 2) were carried out using a HPLC Agilent 1200 Series HPLC Systems with a G1311A Quaternary Gradient Pump, G1322A degasser equipped with a G1329A autosampler and a G1315B diode array detector (Agilent Technologies). The chromatographic separation was performed on analytical reverse phase C8 column (HyPurity C8, 150x3 mm, 5 µm, Thermo Scientific, Dubuque, USA) connected to C18 pre-column (HyPurity C18, 10x3 mm, 5 µm, Thermo Scientific, Dubuque, USA). Column temperature was 20 ºC. The gradient elution program used eluents (A): aqueous solution of 0.1% H3PO4 and (B): acetonitrile. The gradient III was: 0 - 2 min, 95% A; 2 – 30 min, linear gradient to 40% A; 30 – 35 min, linear gradient to 0% A and 100% B; 35 – 40 min, 100% B. The flow rate was 0.2 mL min-1, the injection volume was 40 µl. DAD acquisition parameters were: acquisition range 190-800 nm, 2 nm step. Results and Discussion Cyclic voltammetry of sylibin 1 in 0.1 M TBAPF6 in acetonitrile on glassy carbon electrode shows two oxidation irreversible waves up to the potential 1.9 V labelled as II and III (Fig. 1A). A cathodic wave at 0.6 V of an oxidation product formed in the first oxidation wave appears in the reverse scan (dotted curve in Fig. 1A). The height of this reduction wave increases with the increasing scan rate. From the linear dependence of the peak current on the square root of the scan rate it was found that the oxidation process at the potential of both oxidation waves, II and III, is diffusion controlled. The electrochemical indications show that a chemical reaction follows the electron transfer (EC mechanism). Different methods were used for determination of the number of transferred electrons. The logarithmic analysis of semiintegrated currents of II gives the slope of 75 mV/ decade. It is consistent with one electron irreversible process. The consumption of one-electron was also confirmed coulometrically.

Fig. 1. Cyclic voltammogram of A) 0.54 mM silybin and B) 0.5 mM 2,3-dehydrosilybin in 0.1 M TBAPF6 in acetonitrile on glassy carbon microelectrode. The scan rate was 0.25 V/s. The dotted and dashed lines represent cyclic voltammogram, when the polarity was changed behind the first and second oxidation peak, respectively.

163

Cyclic voltammogram of 2,3-dehydrosilybin 2 is shown in Fig. 1B. Compound 2 yields three oxidation irreversible waves labelled as I. - III. A cathodic wave at 0.43 V appears as in the reverse scan, when the polarity was changed behind the second oxidation peak II. In the case of 2 the apparent one electron process at the potential of the first oxidation wave yields current-voltage shapes with two-electron characteristics. The logarithmic analysis of semiintegrated currents of I and II gives the slope of 38 mV/decade and 80 mV/decade, respectively. It is consistent with two electron and one electron irreversible processes, respectively. However, a one-electron process was confirmed by comparison of the height of the oxidation wave I of 2,3-dehydrosilybin with the height of oxidation wave of ferrocene under the same conditions and compound 1 (see Fig. 1A). In the literature one can find cases of “father-son” reaction as a chemical reaction taking part in the overall redox mechanism. It is likely that the resulting quinone derivative formed by two-electron oxidation reacts with the starting molecule of 2. Thus, the overall electron stoichiometry is unity, due to the comproportionation reaction. This “father-son” reaction is known in the literature for the reduction of hydroxyimines 18 and reductive cleavage of carbon-halide bond 19-21. In these cases the proton transfer plays an important role and an autoprotonation occurs. In the case of flavonoid luteolin, this “father-son” reaction can be called as an autooxidation, even if it does not require the presence of oxygen 22.

Fig. 2. Chromatogram of 1 in dimethylsulfoxide (A) before and (B) during the electrolysis at the potential of the first oxidation wave. (C) Chromatogram of 2 in dimethylsulfoxide. The nature of oxidation products and short-lived intermediates was investigated by in situ spectroelectrochemistry in the OTTLE cell and oxidation products were identified by HPLCDAD. It was confirmed that 2,3-dehydrosilybin is not the oxidation product of silybin (Fig. 2). A benzofuranon derivative was identified as the one of the final oxidation products of 2,3-dehydrosilybin. This finding is in agreement with our previous results dealing with

164

oxidation of quercetin 17, where a benzofuranon derivative was found as the main oxidation product. Conclusion The presence of double bond in the chemical structure of 2,3-dehydrosilybin comparing to silybin plays an important role in the oxidation mechanism. One-electron oxidation of silybin leads to its cation radical and involves hydroxyl group at position C20. On the contrary, oxidation mechanism of 2,3-dehydrosilybin results in formation of a benzofuranon derivative and involves C3-OH hydroxyl group. The results were supported by molecular orbital calculations. Acknowledgements This work was supported by the Academy of Sciences of the Czech Republic (M200401201) and by the Czech Science Foundation grant P301/11/0629. References 1. Gažák R., alterová D., Křen V.: Curr. Med. Chem. 14, 315 (2007). 2. Das S. K., Vasudevan D. M.: Indian J. Biochem. Biophys. 43, 306 (2006). 3. Naik S. R., Panda V. S.: Liver Int. 27, 393 (2007). 4. Burczynski F. J., Yan J., Gong Y., Nguyen D., Wang G., Burczynski S. D., Smith H. J., Gong Y.: Nat. Prod. Chem. Res. 3, 1 (2013). 5. Sokolova R., Ramesova S., Degano I., Hromadova M., Gal M., Zabka J.: Chem. Commun. 48, 3433 (2012). 6. Zatloukalova M., Kren V., Gazak R., Kubala M., Trouillas P., Ulrichova J., Vacek J.: Bioelectrochemistry 82, 117 (2011). 7. Hapiot P., Neudeck A., Pinson J., Fulcrand H., Neta P., Rolando, C.: J. Electroanal. Chem. 405, 169 (1996). 8. Eggins B. R., Chambers J. Q.: Chem. Commun. 232 (1969). 9. Petrucci R., Astolfi P., Greci L., Firuzi O., Saso L., Marrosu G.: Electrochim. Acta 52, 2461 (2007). 10. Eggins B. R., Chambers J. Q: J. Electrochem.Soc. 117, 186 (1970). 11. Giovanelli D., Buzzeo M. C., Lawrence N. S., Hardacre C., Seddon, K. R., Compton R. G.: Talanta 62, 904 (2004). 12. Astudillo P. D., Tiburcio J., Gonzales F. J.: J. Electroanal. Chem. 604, 57 (2007). 13. Astudillo P. D., Valencia D.P., Gonzáles-Fuentes M. A., Díaz-Sánchez B. R., Frontana C., Gonzáles F. J.: Electrochim. Acta 81, 197 (2012). 14. Gažák R., Trouillas P., Biedermann D., Fuksová K., Marhol P., Kuzma M., Křen V.: Tetrahedron Lett. 54, 315 (2013). 15. Kubo I., Nichei K., Shimizu K.: Bioorg. Med. Chem. 12, 5343 (2004). 16. Krejčik, M., Danek, M., Hartl, F.: J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. 317, 179 (1991). 17. Sokolová R., Degano I., Bulíčková J., Ramešová Š., Hromadová M., Gál M., Fiedler J., Valášek M.: Electrochim. Acta 56, 7421 (2011). 18. Isse A. A., Abdurahman A. M., Vianello E.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 597 (1996). 19. Amatore C., Capobianco G., Farnia G., Sandona G., Savéant J.-M., Severin M.G., Vianello E.: J. Am. Chem. Soc. 107, 1815 (1985). 20. Sokolová R., Hromadová M., Ludvík J., Pospíšil L., Giannarelli S.: Electrochim. Acta 55, 8336 (2010). 21. Sokolová R., Gál M., Valášek M.: J. Electroanal. Chem. 685 33 (2012). 22. Ramešová Š., Sokolová R., Tarábek J., Degano I.: Electrochim. Acta 110, 646 (2013).

165

Application of the Ex-Situ Prepared Bismuth-Film Electrode for the Determination of Trinitrotoluene (Využití elektrody s předem vyloučeným povlakem bismutu ke stanovení trinitrotoleunu) Hanna Sopha and Ivan Švancara Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The ex-situ plated bismuth film on a glassy carbon paste substrate (BiF-GCPE) is introduced and used to determine trinitrotoluene (TNT) in conjunction with adsorptive cathodic stripping voltammetry (AdSV). After optimization of principal working conditions, the measurements were carried out in Britton-Robinson buffer (pH 9) using an accumulation at -0.3 V vs. Ag/AgCl and for a period depending on the concentration of TNT. Fairly linear calibration curves were obtained in the concentration range of 0.5-5.0 ppm TNT, when accumulating for 60 s (R2= 0.9999), and within 0.1-1.5 ppm TNT after deposition for 120 s (R2 = 0.9983). A detection limit (LOD) at BiF-GCPE was estimated to be 7 ppb after accumulation for 240 s and the repeatability of the signal of interest 2.3 % [n = 10, c(TNT) = 0.5 ppm]. Also, initial studies have shown the possibility to determine TNT in the presence of nitrobenzene. Key words: Carbon paste electrodes, (Ex-situ operated) bismuth film electrodes, Squarewave adsorptive stripping voltammetry, Trinitrotoluene, Determination. Introduction Although the so-called electrochemical stripping analysis (ESA) was introduced to the electroanalytical practice almost 70 years ago, it still belong to the most effective instrumental techniques due to their high sensitivity, portability, and relatively low-priced equipment. For a long time, the most popular electrode material was mercury due to its unique physicochemical and electrochemical properties; especially, ultimately smooth surface and unusually high hydrogen overpotential 1. However, this prominent position of mercury based electrodes is over and, nowadays, there is high demand for less toxic mercury alternatives. In the year 2000, bismuth was introduced in electrochemical stripping analysis 2 and the following decade has shown clearly that it represents the most successful attempt to replace mercury 3. Similar to mercury, bismuth exhibits a wide potential window applicable in the negative potential range; moreover, this metal offers also some advantages over mercury, such as reliable performance in the presence of dissolved oxygen and mainly, its recognition as the non-toxic, "environmentally friendly" or, by newer epithet, "green" element 4,5. By now, bismuth based electrodes have been applied in many laboratories worldwide 3 in a variety of different modifications, including in- and ex-situ prepared bismuth film electrodes (BiFEs 6), in combination with different substrates; namely: glassy carbon electrode (GCE 2), carbon paste electrode (CPE 7), carbon fibers 8, screen-printed inks 9 or boron-doped diamond electrodes (BDDE 10) for the determination of heavy metal ions 11-13 or even selected organic compounds 14,15. Additionally, there are reports on the modification of carbon paste electrodes with bismuth powder (Bi-CPE) 16, and bismuth precursors (e.g., bismuth oxide (Bi2O3-CPE) 17 and ammonium tetrafluorobismuthate (BiF4-CPE) 18) and on the bismuth bulk electrode 19. However, there are very few articles dealing with adsorptive stripping voltammetry of organic compounds on bismuth based electrodes, e.g. the determination of Daunomycin 20 at the BiBE and Sildenafil citrate (i.e. Viagra) at the BiFE 21, while most organic compounds were measured directly without their accumulation on the electrode surface.

166

(Poly)nitro aromatic compounds, such as 2,4,6-trinitrotoluene (TNT), are notoriously known for mutagenic and toxic effects on humans and the environment as such 22; nevertheless, they are still widely used as the secondary explosives in the army and mine industry. This, among others, may result in severe ground water contamination 23,24 and therefore, a fast, precise, as well as sensitive detection of TNT is highly desirable. In the last decade, electroanalytical measurements of TNT have been performed with different types of electrodes, such as (the above-mentioned and now unwanted) mercury electrodes, carbon nanotube modified glassy carbon electrodes or carbon fiber electrodes 25-29. In this article, an ex-situ prepared bismuth film electrode is reported and for the first time as the electrode of choice to determine TNT at low concentration levels in combination with adsorptive stripping voltammetry. As shown in the following sections, three well-developed stripping signals define the sequential electrode reduction of TNT and can subsequently be utilized for its determination, too, including model mixtures with nitrobenzene. Experimental Voltammetric and potentiometric (stripping) measurements were performed using a modular electrochemical system (Autolab, Eco Chemie, The Netherlands), equipped with a potentiostat “PGSTAT30” and driven by Nova 1.10 software (Metrohm Autolab B.V.). For all experiments a three electrode system was employed using an ex-situ prepared bismuth film electrode on a (glassy) carbon paste substrate (d = 3 mm) as the working electrodes, an Ag/AgCl(satd. KCl) as the reference, and a Pt-rod as the counter electrode. All measurements were carried out in a 20 ml voltammetric cell equipped with a computer controlled magnetic stirrer (rotated at ca. 300 rpm) and at room temperature (23 ± 2 °C). All chemicals were of analytical purity grade and used as received. A stock solution of 1000 mg L-1 2,4,6-trinitrotoluene was prepared by dissolving the appropriate amount of this substance in pure acetonitrile. Water used for solution preparation was doubly distilled. The mixtures of carbon paste electrodes and glassy carbon paste electrodes were prepared by hand mixing of fine carbon powder (chemically purified natural graphite, "CR-5" type; Maziva Týn, Czech Republic) with 30 % (m/m) paraffin oil (Merck) or the glassy carbon powder (with specially treated surface, "Sigradur-G" type; HTW Maintingen, Germany) with 20 % (m/m) paraffin oil, respectively. Both mixtures were thoroughly homogenized using a pestle and mortar and then, immediately packed into two identical piston driven electrode holders to obtain the resultant CPE and GCPE configuration. Prior to each set of measurements, the carbon paste surface was renewed by its extruding ca. 0.5 mm out of the holder with subsequent smoothing with a wet filter paper. The bismuth film was prepared ex-situ and if not stated otherwise, the film was deposited from a 0.1 M acetate buffer containing 5 mg L-1 Bi(III) by applying a potential of -1.0 V vs. ref. for 60 s. Before film preparation, the electrode surface was cleaned / renewed electrochemically by its holding at a potential of +0.3 V for 30 s. Results and discussion Preliminary experiments for the determination of TNT were carried in Britton-Robinson buffer with pH 7 by employing four different electrodes; namely: the (i) bare carbon paste electrode (CPE), (ii) bare glassy carbon paste electrode (GCPE) and then, the (iii) CPE with ex-situ plated bismuth film ("BiF-CPE") or similar configuration of (iv) "BiF-GCPE" type.

167

In all cases, three reduction peaks for TNT (further denoted as "P1", "P2", and "P3") were obtained with the respective responses being positioned at approximately EP(1) = -0.45 V, EP(2) = -0.60 V, and EP(3) = -0.75 V vs. ref. As the most favorable results were obtained with the GCPE and BiF-GCPE, the relevant criterion for the definitive choice was slightly higher repeatability of the latter, i.e., the BiF-GCPE. To achieve the best performance of the selected electrode, some key parameters had to be optimized, including pH of the supporting media and the accumulation time. (The potential for accumulation was not further optimized due to the fact that the most positive reduction signal of TNT had appeared at a potential of ca. -0.45 V vs. ref., which was already beyond the dissolution signal of bismuth film (-0.3 V.) and exactly this limit value was also set as the accumulation potential of choice. Next, the dependence of all three stripping signals of TNT upon pH was carried out in Britton-Robinson buffers in a range of pH 4-9 and the corresponding current intensities of these stripping signals are plotted in Fig. 1. As can be seen, the current intensities increase with a decrease of the acidity; moreover, the respective peak potentials are shifted towards more negative values with the increased pH (not shown). Such a behavior suggests us a reduction mechanism involving protons. Since the most developed peaks and the highest current intensities were achieved in the Britton-Robinson buffer with pH 9.0, this solution was chosen as the optimum in all the following experiments.

Fig. 1: The actual intensity of the three stripping peaks vs. pH for 2 ppm TNT at ex-situ prepared BiF-GCPE by square-wave adsorptive stripping voltammetry (SWAdSV). Supporting electrolyte: Britton-Robinson buffer (various pHs); accumulation potential, E ACC = -0.3 V vs. ref.; accumulation time, tACC = 60 s; equilibration time, tEQ = 10 s; Square-wave potential ramp: frequency, fSW = 25 Hz; step potential, ESW = 4 mV; pulse height, ΔESW = 50 mV. The dependence of the accumulation time on the stripping signals showed a markedly increase of the current intensities of all three signals up to an accumulation time of 45 s. For accumulation times between 45 s and 90 s the peak currents increase less strongly. Applying even longer accumulation times the signal "P1" still slightly increases, while the curves for the other two stripping signals level off, indicating the starting saturation of the electrode surface. Thus, according to the concentration level in the sample, the accumulation time tACC = 60 s, 120s, or even 240 s was used in further measurements; always, together with proper specification. The BiF-GCPE offered well-defined dependence of the peak current on the concentration in a range of 0.5-5 mg L-1 TNT (see Fig. 2) and after accumulation for 60 s, one could obtain an excellent correlation for the signal "P1" (R2 = 0.9999) and "P3" (R2 = 0.9970).

168

A higher concentration range 100–1500 µg L-1 could be satisfactorily calibrated as well (not shown), in this case, in combination with an accumulation time of 120 s and with R2 within 0.9913- 0.9983 for all three peaks. The limit of detection (L D, 3σ) could be estimated as low as 7 µg L-1 for the stripping signal "P1", when using the response of 200 µg L-1 TNT recorded after accumulation fro 240 s. By evaluating the stripping signals "P2" and "P3", the LOD estimates were somewhat higher; namely: 83 µg L-1 and 56 µg L-1, respectively. Finally, ten consecutive replicates in a solution containing 0.5 mg L-1 TNT at tACC = 60 s have resulted in a set of voltammograms that could be characterized by the relative standard deviations, RSDs, of 2.3 % for "P1", 7.3 % for "P2", and 6.4 % for "P3".

Fig. 2: SWAdSV for successive additions of 0.5 mg L-1 in the range of 0.5-5 mg L-1 TNT at the ex-situ prepared BiF-GCPE. Supporting electrolyte: Britton-Robinson buffer, pH 9.0; for other conditions: see Fig. 1. Note: The inset shows the corresponding calibrations. In prospect, the determination of TNT in the presence of nitrobenzene (NB) or even their simultaneous detection seems to be feasible as well. As shown very recently 30, NB gives rise to a single stripping signal (at ca. -0.7 V vs. Ag/AgCl), appearing at the same position as the smallest peak of TNT ("P3"). This opens possibilities to determine TNT in the presence of NB via the signals "P1" and "P2" and their proper evaluation; for details  including a model experiment  see again cit. 30. Conclusions In this contribution, the applicability of the ex-situ prepared bismuth film electrode was demonstrated on fine measurements of TNT in Britton-Robinson buffer (pH 9.0) when using adsorptive stripping voltammetry. Highly linear responses were obtained in the concentration ranges of 0.5-5 ppm and of 0.1-1.5 ppm TNT by applying accumulation periods for 60 s and 120 s, respectively. Moreover, an eventuality to determine TNT in the presence of NB or even these two related compounds together is also outlined.

169

Acknowledgements The financial support from the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic (Project CZ.1.07/2.3.00/30.0021 “Enhancement of R&D Pools of Excellence at the University of Pardubice“) is gratefully acknowledged. Literature 1. Wang J.: Analytical Electrochemistry, 3rd ed., Wiley-VCH, Hoboken, New York 2006. 2. Wang J., Lu J., Hocevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 3. Švancara I., Prior C., Hočevar S.B., ang J.: Electroanalysis 22, 1405 (2010). 4. Wang J.: Acc. Chem. Res. 35, 811 (2002). 5. Yáñez-Sedeño P., Pingarrón J.M., Hernández L.; in: Handbook of Green Analytical Chemistry (De la Guardia, M., Garrigues S., Eds.), pp. 262-268 and 282-284. Wiley, New York 2012. 6. Korolczuk M., Surmacz W., Tyszczuk K.: Electroanalysis 19, 2217 (2007). 7. Królicka A., Pauliukaitė R., Švancara I., Metelka R., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher K., Vytřas K.: Electrochem. Commun. 4, 193 (2002). 8. Hutton E.A., Hočevar S.B., gorevc B.: Anal. Chim. Acta 537, 285 (2005). 9. Kadara R.O., Tothill I.E.: Talanta 66, 1089 (2005). 10. Toghill K.E., Wildgoose G.G., Moshar A., Mulcahy C., Compton R.G.: Electroanalysis 20, 1731, (2008). 11. ang J., Lu J., Kirgöz Ü.A., Hočevar S.B., gorevc B.: Anal. Chim. Acta 434, 29 (2001). 12. Baldrianová L., Švancara I., Economou A., Sotiropoulus S.: Anal. Chim. Acta 580, 24 (2006). 13. Korolczuk M., Rutyna I., Tyszczuk K.: Electroanalysis 22, 1494 (2010). 14. Guzsvány V., Kádár M., Gaál F., Bjelica L., Tóth K.: Electroanalysis 18, 1363 (2006). 15. Baldrianová L., Agrafiotou P., Švancara I., Vytřas K., Sotiropoulos S.: Electrochem. Commun. 10, 918 (2008). 16. Hočevar S.B., Švancara I., Vytřas K., gorevc B.: Electrochim. Acta 51, 706 (2005). 17. Pauliukaitė R., Metelka R., Švancara I., Królicka A., Bobrowski A., Vytřas K., Norkus E., Kalcher K.: Anal. Bioanal. Chem. 374, 1155 (2002). 18. Sopha H., Baldrianová L., Tesařová E., Grincienė G., eidlich T., Švancara I., Hočevar S.B.: Electroanalysis 22, 1489 (2010). 19. Pauliukaitė R., Hočevar S.B., Ogorevc B., Wang J.: Electroanalysis 16, 719 (2004). 20. Bučková M., Gründler P., Flechsig G.-U.: Electroanalysis 17, 440 (2005). 21. Sopha H., Hočevar S.B., Pihlar B., gorevc B.: Electrochim. Acta 60, 274 (2012). 22. Jiminez-Perez R., Baron M., Elie L., Rodriguez J.-G.: Int, J. Electrochem. 8, 3279 (2013). 23. Bratin K., Kissinger P.T., Briner R.C., Bruntlett C.S.: Anal. Chim. Acta 130, 295 (1981). 24. Galík M., 'Mahony A.M., ang J.: Electroanalysis 23, 1193 (2011). 25. Zimmermann Y., Broekaert J.A.C.: Anal. Bioanal. Chem. 383, 998 (2005). 26. ang J., Hočevar S.B., gorevc B.: Electrochem. Commun. 6, 176 (2004). 27. Agüi L., Vega-Montenegro D., Yañez-Sedeño P., Pingarrón J.M.: Anal. Bioanal. Chem. 382, 381 (2005). 28. Hrapovic S., Majid E., Liu Y., Male K., Luong J.H.T.: Anal. Chem. 78, 5505 (2006). 29. Guo S., Wen D., Zhai Y., Dong S., Wang E.: Biosens. Bioelectron. 26, 3475 (2011). 30. Sopha H., Švancara I.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 20 (2013), in press.

170

Insight into the Determination of Ascorbic Acid at Polyaniline Modified Carbon Paste Electrode (Možnosti stanovení kyseliny askorbové na polyanilinem modifikované uhlíkové pastové elektrodě. Úvodní studie) Mat j Stočes and Ivan Švancara Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, CZ-532 10, Pardubice, Czech Republic. Email: [email protected] Abstract Polyaniline (PANI) was synthesized by electropolymerization with the aid of potential cycling technique at a carbon paste electrode (CPE) from the 0.2 M aniline (monomer) solution in the presence of 1 M HCl. The PANI-CPE configuration was tested in the amperometric mode with respect to sensitivity towards ascorbic acid (AA). Firstly, the electropolymerization process was optimized finding that 5 potential cycles (n=5) formed the optimal PANI layer for further determination of AA. The operational potential for amperometric detection was investigated in a range of –0.1V to +0.6V vs. ref., concluding that the value of choice would be in the interval of Eop= 0–0.2V. Then, a linear response of ascorbic acid could be obtained in the concentration range from 100 to 1700 μM, which can be expressed by the respective linear regression data y = 8.863x + 0.078 and r2 = 0.9988. Key Words Carbon paste electrode, Aniline, Electropolymerization / modification, ascorbic acid, amperometric detection. Úvod Kyselina askorbová (vitamin C) je ve vod rozpustný vitamin známý jako účinný antioxidant. Rostliny a v tšina živočich je schopna kyselinu askorbovou syntetizovat příslušnými biochemickými cestami. Lidské t lo ale tuto schopno nemá a vitamin C je pro n j esenciální kyselinou, kterou je nutno přijímat v potrav . Z toho d vodu hraje sledování množství vitaminu C v potravinách a potravinových doplňcích d ležitou roli. Konvekční metody stanovení kyseliny askorbové zahrnují: (i) titrační stanovení; (ii) chromatografické metody, jako HPLC1 nebo HLPC s elektrochemickou detekcí 2,3; (iii) fluometrické metody využívající reakce s o-phenyldiaminem4,5; (iv) spektrofotometrické metody založené např. na reakci s hexykyanoželezitanem 6,7. Z pohledu elektrochemického chování je kyselina askorbová obyčejná, lehce oxidovatelná biologická látka, která je ireversibiln oxidována na kyselinu dehydroaskorbovou a poskytujepři elektroanalytickém stanovení pouze odezvu v podob příslušného píku odpovídající její anodické oxidaci. Mechanismus této ireversibilní oxidace zahrnuje ztrátu dvou elektron a proton . Studie zabývající se mechanismem oxidace kyseliny askorbové uvádí, že při pH 8 a nižším jsou dv následné jednoelektronové oxidace doprovázeny rychlou dehydratací, která činí celý proces nevratným 8. Elektrochemické metody pro stanovení kyseliny askorbové využívají jak nemodifikovaných elektrod, tak elektrod modifikovaných. V případ nemodifikovaných elektrod lze pro stanovení využít rtuť 9, zlatou elektrodu 10, platinu 11, elektrodu ze skelného uhlíku12,13 a v neposlední řad i uhlíkovou pastou elektrodu 11,12 (CPE). Vhodných modifikovaných elektrod je pak celá řada a úplný výčet elektrodových konfigurací včetn jejich detekčních limit , lineárního rozsahu nebo typu analyzovaného vzorku lze najít v příslušném aktuálním

171

přehledovém článku14. Pokud se zam říme na modifikované elektrody na bázi uhlíkové pasty, lze najít hned n kolik typ elektrodových konfigurací, které jsou vhodné pro stanovení kyseliny askorbové. Senzor připravený modifikací uhlíkové pasty sloučeninami vanadu 15 (10% hm.) byl ve spojení s pr tokovou injekční analýzou použit pro rychlé stanovení kyseliny askorbovou s možností analýzy až 48 vzork za hodinu. Metioninem modifikovaná CPE 16 byla použita pro elektrochemické stanovení kyseliny askorbové ve vybraných vzorcích ovocných džus . Uhlíková pasta modifikovaná 2,2'-(1,8-oktanediylbisnitriloethylidin)-bishydrochinonem 17 umožňovala díky elektrokatalytickým vlastnostem modifikátoru dosáhnout detekčního limitu 0,6 μmol·L-1, s využitelným lineárním rozsahem 5 až 30 μmol·L-1. Další modifikátor ze skupiny hydrochinon , tetrabromo-p-benzochinon 18, umožnil snížení oxidačního potenciálu kyselina askorbové a tedy i potenciálu detekce při amperometrickém stanovení, o cca 430 mV (ve srovnání s nemodifikovanou CPE). Tato elektrodová konfigurace dovoluje stanovit kyselinu askorbovou na koncentrační úrovni 10 až 60 μmol·L-1 a to i v přítomnosti dopaminu a kyseliny močové. Další elektrodová konfigurace, uhlíkové pastové mikroelektrody modifikované sedmi r znými typy porfyrin 19 představují velmi citlivé elektrodo s detekčním limitem 1,1·10-14 a 5.1·10-7 mol·L-1. Uhlíková pasta obohacená o v současnosti velmi populární grafen, grafenem dopovaná CPE 20, poskytovala velmi rychlou amperometrickou odezvu (okolo 5 s) při nižším potenciálu detekce než v případ nedopované CPE. Tento přísp vek se zabývá přípravou CPE modifikované polyanilinovým filmem (PANI-CPE) a její použití při stanovení kyseliny askorbové; jedná se o úvodní studii. Elektrodovou konfiguraci PANI-CPE byla v minulosti autory úsp šn použita při příprav enzymatického biosenzoru pro stanovení glukózy 21. Experimentální část emikálie Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. od firmy Aldrich nebo Merck. Zásobní roztok fosfátové pufru byl připraven o koncentraci 0,1M a pH ≈ 7,5; kyselina chlorovodíková o koncentraci 1 M a roztok kyseliny askorbové 0,2 M Příprava pracovní elektrody Uhlíková pastová elektroda (CPE) byla připravena d kladným smícháním 0,3 g uhlíkového prášku (CR-5, Lučební závody Kolín) s vysoce viskózním parafinovým olejem, aby výsledná pasta obsahoval 20% hm. parafinového oleje. Elektropolymerizace polyanilinu (PANI) Elektropolymerizace probíhala z roztoku 0,2 M anilinu v 1 M HCl cyklováním potenciálu od hodnoty -400 mV do +1200 mV. Po vyloučení PANI byla elektroda opatrn opláchnuta destilovanou vodou a umíst na do roztoku fosfátového pufru (0,1 M pH 7,5), kde byla za míchání ponechána po dobu 15 minut z d vod odstran ní všech meziprodukt elektropolymerace a d kladného vymytí anilinu z PANI filmu. Instrumentace Pro všechna m ření bylo použito elektrochemické pracovní stanice Autolab PGSTAT12 (Metrohm) ovládané pomocí softwaru N VA 1.10 (tentýž výrobce). Pracovní elektrodou byla uhlíková pastová elektroda; referenční elektrodou pak Ag/AgCl/3M KCl a pomocná platinová elektroda.

172

Postup a měření Amperometrická byla provád na v objemu 20 ml (0,1M fosfátový pufr, pH 7.5) při konstantní laboratorní teplot (22 ± 2 ºC) a rychlosti míchání 400 otáček/min. Výsledky a diskuse Elektropolymerizace anilinu Voltamogram získaný b hem elektropolymerace PANI ( br. 1) poskytuje v daném potenciálovém okn tři zřetelné oxidačn -redukční páry. S opakovaným cyklováním potenciálu docházelo k oxidaci při nepatrn vyšších hodnotách potenciálu, což je zapříčin no již vyloučeným povlakem PANI na povrchu CPE. První pík okolo hodnoty +220 mV přísluší oxidaci leucoemeraldinu na emeraldin. Což odpovídá oxidaci z kompletn redukované formy PANI na formu částečn oxidovanou. Anodický pík okolo hodnoty +800 mV přísluší oxidaci emeraldinu na perningranilin; tedy oxidaci na pln oxidovanou formu PANI. Mezi t mito hlavními píky jsou patrny vedlejší píky, které mohou být přiřazeny degradačním produkt m nebo p-benzochinonu14.

Obr. 1: Voltamogram získaný b hem elektropolymerace PANI. Experimentální podmínky viz experimentální část. Optimalizace PANI filmu pro amperometrická měření D ležitým faktorem při příprav PANI-CPE je tloušťka, resp. množství, vyloučeného PANI na povrchu CPE. becn lze tloušťku PANI vrstvy regulovat koncentrací anilinu ve vylučovací lázni nebo v případ potenciostatického či galvanostatického režimu délkou doby vylučování. V této konkrétní studii bylo množství vyloučeného PANI, kontrolováno počtem cykl potenciálového cyklování (n=0 až 15) a sledováno jak množství vyloučeného PANI ovlivňuje amperometrickou odezvu kyseliny askorbové ( br. 2A). Maximální odezvy bylo sice dosaženo při dvou cyklech, n=2, nicmén dalším sledovaným parametrem byla i reprodukovatelnost nam řených signál . Zatímco pro PANI vyloučených dv ma cykly (n=2) je proudová odezva 10,1 μA a pro PANI vyloučený p ti cykly (n=5) pouze nepatrn nižší (9,4 μA), tak zásadní rozdíl je práv v reprodukovatelnosti jednotlivých elektrod. Pro PANI (n=2) je sm rodatná odchylka deseti m ření ± 1,44 μA (chyba ±14,3%), pro PANI (n=5) pouze ± 0,44 μA (chyba ± 4,6%) a v případ PANI (n=10) je hodnota sm rodatné odchylek ješt nižší, tedy je dosaženo lepší reprodukovatelnost, na druhou stranu ale již dochází dramatičt jšímu poklesu proudové odezvy: pro PANI (n=10) 5,5 μA a pro PANI (n=15) již elektroda nereaguje na přítomnost kyseliny askorbovou proudovou odezvou.

173

Optimalizace klíčovýc parametrů ampérometrické o měření Zásadní roli v amperometrickém m ření hraje potenciál detekce (Edet). Snahou je docílit nízké hodnoty detekčního potenciálu, při kterém je kyselina askorbová oxidována, protože při vyšších hodnotách aplikovaného potenciálu dochází k oxidaci i dalších elektrochemicky aktivních látek obsažených v reálných matricích a tedy k interferenci stanovované kyseliny askorbové. Závislost proudové odezvy na detekčním potenciálu dokumentuje obr. 2B. Nemodifikovaná CPE má při nízkých Edet i velmi nízkou (praktickou nulovou) proudovou odezvu. xidace kyseliny askorbové je patrná od hodnoty potenciálu 0,2 V; s rostoucí hodnotou Edet roste i hodnota proudové odezvy, ale i zároveň i šum ampérometrického m ření a pro Edet > 0.5 V je hodnota šumu natolik vysoká, že vyhodnocení proudové odezvy je obtížné i po softwarovém vyhlazení záznamu. Elektroda PANI-CPE poskytuje proudovou odezvu již při Edet = 0 V a praktickou totožnou odezvu lze zaznamenat až pro Edet = 0,2 V. Funkce PANI vrstvy zde hraje roli mediátoru; PANI přechází mezi redukovanou formou, leucoemeraldinem, a částečn oxidovanou formou, emeraldinem. Vyšší hodnoty potenciálut (Edet > 0,25V) vedou postupn k poklesu signálu až jeho úplnému vymizení (pro Edet > 0,6V). To m že být vysv tleno tím, že polyanilin postupn přechází na svou nevodivou formu, až je na ni kompletn konvertován (Edet > 0,6 V). Záv rem byla provedena kalibrační studie v koncentrační rozmezí 100 μM až 1,7 mM kyseliny askorbové, při Edet = 0V a za použití PANI-CPE (n=5); reálný záznam m ření viz obr. 3; s příslušnou rovnicí lineární regrese; (y = 8,863x + 0.078 a r2 = 0.9988).

Obr. 2: (A) Vliv množství vyloučeného PANI na amperometrickou odezvu kyselina askorbové. (B) Vliv potenciálu detekce na amperometrickou odezvu kyseliny askorbové na povrchu PANICPE (-■-) na povrchu nemodifikované CPE (…□…). Experimentální podmínky viz experimentální část. Přídavek kyseliny askorbové, cask= 1 mM. Závěr Na povrchu CPE byla technikou potenciálového cyklování (400 až + 1200 mV) elektropolymerizována vrstva polyanilinu. Takto připravená modifikovaná CPE byla použita pro amperometrické stanovení kyseliny askorbové. D ležitá pozorování a zjišt ní b hem experiment lze shrnout takto: (i) Elektroda vykazuje v porovnání s nemodifikovanou CPE vylepšené elektrochemické vlastnosti.(ii) ptimální počet cykl při příprav PANI vrstvy je n = 5. (iii) Vyšší počet cykl při příprav PANI vrstvy vede k poklesu signálu, nižší počet cykl pak k horší reprodukovatelnosti m ření. (iv) Potenciální detekce při amperometrická detekce lze použít v rozmezí 0 až 0,25 V. (v) Lineární rozsah pro stanovení kyseliny askorbové je v koncentračním rozmezí 100 μM až 1,7 mM.

174

Obr. 3: Amperometrický záznam ekvivalentních přídavk kyseliny askorbové na povrchu PANI-CPE. Experimentální podmínky viz experimentální část. Koncentrační rozmezí 100 μM až 1,7 mM; přídavek odpovídá 100 μM kyseliny askorbové. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu ministerstva školství, mládeže a t lovýchovy č. CZ.1.07/2.3.00/30.0021. Literatura 1. Kall M.A., Andersen C.: J. Chromatogr. B 730, 101 (1999). 2. Iwase H.: J. Chromatogr. A 881, 327 (2000). 3. Rizzolo A., Brambilla A., Valsecchi S., Eccher-Zerbini P.: Food Chem. 77, 257, (2002). 4. Borowski J., Szajdek A., Borowska E.J., Ciska E., Zieliński H.: Eur. Food Res. Technol. 226, 459 (2008). 5. Arya S.P., Mahajan M., Jain P.: Anal. Chim. Acta 417, 1 (2000). 6. Nóbrega J.A., Lopes G.S.: Talanta 43, 971 (1996). 7. Lenarczuk T., Glb S., Koncki R.: J. Pharm. Biomed. Anal. 26, 163 (2001). 8. Rueda M., Aldaz A., Sanchez-Burgos F.: Electrochim. Acta 23, 419 (1978). 9. Ruiz J.J., Aldaz A., Dominguez M.: Can. J. Chem. 55, 2799 (1977). 10. Dursun Z., Pelit L., Taniguchi I., Turk J.: J. Chem. 33, 223 (2009). 11. Pisoschi A.M., Pop A., Negulescu G.P., Pisoschi A.: Molecules, 16, 1349 (2011). 12. Erdurak-Kiliç C.S., Uslu B., Dogan B., Ozgen U., Ozkan S.A., Coskun M.: J Anal. Chem., 61, 1113 (2006). 13. Yilmaz S., Sadikoglu M., Saglikoglu G., Yagmur S., Askin G.: Int. J. Electrochem. Sci., 3, 1534 (2008). 14. Pisoschi A.M., Pop A., Serban A.I., Fafaneata C.: Electrochim. Acta 121, 443 (2014). 15. Goreti M., Sales F., Castanheira M.S.A., Ferreira R.M.S., Carmo M., Vaz V.G., DelerueMatos C.: Port. Electrochim. Acta 26, 147 (2008). 16. Chethana B.K., Naik Y. A.: Anal. Methods, 4, 3754 (2012). 17. Mazloum-Ardakani M., Habibollahi F., Zare H.R., Naeimi H., Nejati M.: J. Appl. Electrochem., 39, 1117 (2009). 18. Zare H.R., Nasirizadeh N., Ardakani M.M.: J. Electroanal. Chem., 577, 25 (2005). 19. van Staden R.I.S., Balasoiu S.C., van Staden J.F., Radu G.-L.: J. Porphyr. Phthalocya. 16, 809 (2012). 20. Li F., Li J., Feng Y., Yang L., Du Z.: Sensors Actuators, B 157, 110 (2011). 21. Stočes M., Kalcher K., Švancara I., Vytřas K.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 1917 (2011).

175

Determination of Total Phenolic Content in Selected Wines Using Amperometric Tyrosinase Biosensor Based on Carbon Nanotubes (Stanovení celkového obsahu polyfenolických látek ve vybraných vzorcích vín pomocí tyrosinázového biosensoru na bázi uhlíkových nanotrubic) Milan Sýs a, Radovan Metelka a, Michael Skoupý a, Milan Vlček b, and Karel Vytřas a a Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Joint Laboratory of Solid State Chemistry of Institute of Macromolecular Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic and the University of Pardubice, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Polyphenols exhibit significant antioxidant properties of wines. Their antioxidant capacity is commonly expressed as the equivalent weight of Trolox which is synthetic water-soluble analog of α-tocopherol (vitamin E), and is called “Trolox equivalent antioxidant capacity” (TEAC). This contribution offers a direct determination of TEAC in real samples without the use of free radicals as it is in conventional spectrometric methods. An amperometric tyrosinase biosensor based on carbon paste electrode modified with carbon nanotubes (CPE/CNTs) is presented. The biosensor, CPE/CNTs/Tyrosinase/Nafion, was prepared by immobilization of tyrosinase enzyme together with Nafion on the surface of CPE/CNTs. All key experimental and instrumentals parameters have been investigated and optimal conditions were founded as follows: (i) amount of tyrosinase in Nafion membrane, 3.0 µg; (ii) operating potential for amperometric detection, -0.25 V; (iii) speed of stirring, aprox. 400 rpm; (iv) supporting electrolyte, 0.1 mol L-1 phosphate buffer solution, pH 7.0; (v) temperature 25 ±1 °C. Finally TEACs of wines were determined by hydrodynamic amperometry using the method of multiple standard additions. Keywords: amperometry, biosensor, carbon nanotubes, carbon paste electrode, Nafion, tyrosinase; vitamin E. Introduction Polyphenolic compounds are secondary plant metabolites which are released into the wine during processing of grapes 1. Gallic acid, protocatechuic acid, p-coumaric acid, catechin, epicatechin and resveratrol were observed in sampels of Moravian wines using the high performance liquid chromatography method. Polyphenols are known for their significant antioxidant effect 2. They prevent cardiovascular diseases, cancers, and osteoporosis 3. The role of polyphenols in prevention of neurodegenerative diseases and diabetes mellitus has been described as well 4. Seven different kinds of wines from Moravia (Pálava, Veltlínské zelené, Rulandské šedé, Zweigeltrebe rosé, Rulandské modré, Zweigeltrebe and Dornfelder) were selected for analysis. White and red wines were chosen for comparison of total polyphenolic content (TPC). Ascorbic acid, commonly known as vitamin C, interferes the determiantion of polyphenols by biosensor based on tyrosinase 5. Antioxidants in wine are mostly polyphenols because other antioxidants (such as ascorbic acid and reductive minerals containing Fe, Mn, Zn, and Cu) are present in low concentration levels 6. TPC of selected wines can be expressed as Trolox equivalent antixidant capacity (TEAC) 7. Trolox is synthetic water soluble analog of α-tocopherol (vitamin E) which is commonly used for determination of antioxidant capacities of different foodstuffs 8. Chemical structures of both Trolox and vitamin E is shown in Fig. 1.

176

Fig. 1. Chemical structures of Trolox (a) and vitamin E (b). Tyrosinase is a copper-containing oxidase which exhibits an activity for both catechols and cresols 9. It catalyzes the conversion of phenolic compounds into their quinone derivatives which can be detected amperometrically because polyphenols and their corresponding quinones are usually electroactive 10. This enzyme immobilized on surface of electric transducer as biosensor offers a significant progress in analysis of polyphenols in pH 6-7 phosphate buffer solutions 11. Carbon paste electrode (CPE) with surface modification using carbon nantubes (CNTs) was selected as transducter (CPE/CNTs) for construction of this biological device (CPE/CNTs/Tyrosinase/Nafion). Carbon paste is heterogenous carbon material with specific electrochemical properties. It is a mixture of conductive carbon powder with lipophilic binder which is pressed in Teflon holder 12. Biosensors with CNTs have lower detection limit than bare CPE as transducer due to their specific surface area 13. Experimental Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), mushroom tyrosinase (ex. Agaricus bisporus; E.C. 1.14.18.1; 3130 U mg-1 solid), N,N-dimethylformamide (DMF) radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) were from Sigma-Aldrich (Vienna, Austria). Both KH2PO4 and Na2HPO4 12 H2O for preparation of the 0.1 mol L-1 phosphate pH 7.0 buffer solution were from Lachema, Brno, Czech Republic. All other chemicals were of the analytical grade purity. Ultrapure water ( = 18.3 M cm; Milli-Q system, Millipore) was used for preparing all the solutions. A three electrode system consisting of CPE/CNTs/Tyrosinase/Nafion biosensor (working), Ag|AgCl|3.0 mol L-1 KCl (reference) and platinum wire (counter electrode) was immersed into the cell solution and connected to the potentiostat (PalmSens Ivium Technologies, The Netherlands) employed for electrochemical measurements. All measurements were realized at 25  1 °C. Batch hydrodynamic amperometry as electrochemical technique was used for each of the laboratory experiments. These measurements were carried out in a glass cell containing a buffer solution (10 mL) with constant stirring (400 rpm). If not stated otherwise, the working potential was -0.25 V. Carbon paste was prepared by mixing 0.50 g CR-2 carbon powder with average particle size of 2 µm (Maziva Týn nad Vltavou, s.r.o., Czech Republic) with 130 μL paraffin oil for spectrometry (Merck, Germany) in ceramic mortar for 30 minutes. Freshly prepared carbon

177

paste was packed firmly into the Teflon tube 14 (3 mm in diameter). The electric contact was established through a stainless steel screw. The resistance of prepared carbon paste electrodes should be less than 10 Ω. The bare CPEs were maintained at laboratory conditions. Two different types MWCNTs (diameter 10-30 nm, length 5-15 µm and special surface area 40-300 m2 g-1) and SWCNTs (diameter < 2 nm, length 5-15 µm and special surface area > 400 m2 g-1) of CNTs were used from Shenzhen Nanotech Port Co., Ltd. (Shenzhen, China). Suspension (usually 2.0 mg mL-1) of CNTs without pretreatment step was homogenized in a ultrasonic wave at room temperature for one hour. After that, the fresh 20 µL CNTs suspension in DMF was immobilized on surface of bare CPE which was left in air for one night. A solution for casting the enzyme-entrapping membrane was prepared by mixing neutralized Nafion (5%) in 55 % ethanolic solution (40 μL), pure water (60 µL) and enzyme solution in phosphate buffer solution (150 μL; 500 µg mL-1). An aliquot (10 μL) was applied to the CPE or CPE/CNT surfaces and left to dry for one hour. If not used, the biosensors were stored in a refrigerator at 5 °C. As a reference method, the DPPH spectrometric assay 15 was used for determination of TEAC in selected wines. Helios Delta UV-VIS spectrometer (Thermo Fisher Scientific, USA) were used for spectrophotometric measurements. This method is based on measurements of the decreased absorbance values at 517 nm, when the originally violet solution of the DPPH radical changes to yellow after addition of a sample containing antioxidants. Results and discussion The amperometric response depends on the enzyme activity (amount of enzyme), availability of analyte to enzyme active site (membrane porosity), polymer adhesion to the CPE/CNTs surface (electrical conductivity) and mechanical stability of membrane which depends also on amount of enzyme contained in membrane. The current response increases with increasing amount of tyrosinase in the polymer layer (up to value 3.0 µg). The sensitivity of the biosensor is governed by the redox potential of the electroactive species. In all amperometric biosensors, generally, the selection of the working potential is very important to monitor products of the biocatalytic reaction. Trolox is enzymatically oxidized to α-tocoquinone, which is electrochemically reduced to corresponding hydroquinone. As shown in Fig. 2, the highest current response was observed at working potential of -0.25 V. A pH value of the supporting electrolyte should be searched to support the tyrosinase activity. It was found that phosphate buffers are the most convenient for experiments in neutral media; current response of Trolox at CPE/CNTs/Tyrosinase/Nafion biosensor was the highest at pH 7.0. This value corresponded to the results presented previously 16,17. In batch hydrodynamic amperometry, the speed of stirring has a significant influence on the rate of analyte transport to the biosensor membrane. From stirring speeds 100, 200, 300, 400 and 500 rpm, a value of 400 rpm was selected because no significant increase of the response was observed at higher speeds.

178

0.0

a

I / µA

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

b -1.0 -0.05

-0.15

-0.25

-0.35

E / V vs Ag|AgCl

Fig. 2. Dependence of the amperometric response on the applied electrode potential of the CPE/MWCNTs (curve a) compared with a CPE/MWCNTs/Tyrosinase/Nafion (curve b); analyte, 0.5 × 10-3 mol L-1 Trolox; supporting electrolyte, 0.1 mol L-1 phosphate buffer solution (pH 7.0); speed of stirring, 400 rpm; temperature, 25 °C. In spectrophotometric mesurements, volumes of 20 µL (for white and rosy wines) or 10 µL (for red wines) were usually pippeted to 4 ml DPPH (0.0125 g in 500 ml) methanolic solution and put in the darkness for 10 minutes at laboratoty conditions. After that, the loss of colour was measured at 517 nm. In amperometric measurements with a CPE/CNTs/Tyrosinase/Nafion biosensor at optimal conditions, a multiple standard addition method was used, where a volume of 0.5 mL of wine was added to 10 mL of supporting electrolyte and consequently, 3 or 4 standard additions of 0.01 mol L-1 Trolox (each of 0.5 mL) were applied. It was found that TEACs values were lower than 100 mg L-1 for white wines. On the contrary, TEACs for red wines grew to nearly 300 mg L-1. All results are summarized in Table 1 in which results of both analytical method used are presented. As can be seen, the final results were not always the same for some samples, however a correlation of results was found. A theoretical slope of the correlation line between the results of both method should be equal to 1, while a value of 0.7895 was calculated from the data obtained. Mostly, the values obtained in amperometric measurements are higher. Table I. TEACs in mg L-1 of Moravian wines detemined by tyrosinase biosensor and DPPH assay. Moravia wines Producer Biosensor DPPH assay Dornfelder Vinařství Veritas, Bošovice 153.95 125.4 Pálava Rosenberg Winery, Velké N mčice 83.49 100.79 Ruladské modré Vinařství Veritas, Bošovice 186.21 184.12 Ruladnské šedé Vinařství Mut nice 57.85 53.17 Zweigeltrebe červené Vinařství Žídek, Popice 280.74 230.8 Zweigeltrebe rosé Rosenberg inery, Velké N mčice 108.25 95.23 Veltlínské zelené Rosenberg inery, Velké N mčice 92.93 85.23

179

Conclusion As shown, a tyrosinase-based biosensor can advantageously be used for determination of the total polyphenolic contents expressed as TEACs in samples with low concentration level of ascorbic acid. Thus direct determination of TPC by this biological device can contribute significantly to the progress in analysis of polyphenols. Acknowledgment Support of the University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology (project No. SGFChT 06 2012/13) is gratefully acknowledged. References 1. Aguirre M. J., Isaacs M., Matsuhiro B., Mendoza L., Santos L. S., Torres S.: Food Chem. 129, 514 (2011). 2. Heinonen M.: Mol. Nutr. Food Res. 51, 684 (2007). 3. Manach C., Scalbert A., Morand Ch., Rémésy Ch., Jiménez L.: Am. J. Clin. Nutr. 79, 727 (2004). 4. Adalbert A., Johnson I. T., Saltmarsh M.: Am. J. Clin. Nutr.81, 215 (2005). 5. Isaacs N. S., Eldik R.: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1465 (1997). 6. Lopes P., Drinkine J., Saucier C., Glories Y.: Anal. Chim. Acta 555, 242 (2006). 7. ojdyło A., szmiański J., Czemerys R.: Food Chem. 105, 940 (2007). 8. Triantis T., Stelakis A., Dimotikali D., Papadopoulos K.: Anal. Chim. Acta 536, 101 (2005). 9. Rolff M., Schottenheim J., Peters G., Tuczek F.: Angew. Chem. Int. Ed. 49, 6438 (2010). 10. Kilmartin P. A., Zou H., Waterhouse A. L.: J. Agric. Food Chem.49, 1957 (2001). 11. Sýs M., Pekec B., Kalcher K., Vytřas K.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 9030 (2013). 12. Švancara I., Vytřas K., Barek J., Zima J.: Crit. Rew. Anal. Chem. 31, 311 (2001). 13. Sýs M., Pekec B., Kalcher K., Vytřas K., in: Monitorování cizorodých látek v životním prostředí V, p. 143. University of Pardubice. Pardubice 2013. 14. Švancara I., Metelka R.: Sensing in Electroanalysis, p. 7. University of Pardubice. Pardubice 2005. 15. Von Gadow A., Joubert E., Hansmann C. F.: J. Agric. Food Chem. 45, 632 (1997). 16. Solná R., Skládal P.: Electroanalysis 17, 2137 (2005). 17. Akyilmaz E., Kozgus ., Türkmen H., Cetinkaya B.: Bioelectrochemistry 78, 135 (2010).

180

Effect of Working Electrodes Design on Current Response in Continuous Monitoring of Presence of Redox Species (Vliv návrhu pracovních elektrod na proudovou odezvu při kontinuálním sledování přítomnosti redoxních látek) Katarzyna Szuszkiewicz a, Radovan Metelka b, Martin Bartoš b, and Pavel Klein a a Contipro Pharma a.s., 561 02 Dolní Dobrouč, Czech Republic, E-mail: [email protected] b University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The effect of various configurations of working electrodes on biamperometric current response of redox species in continuous monitoring at elevated temperature was examined. Three different designs of platinum electrodes ranging from simple band electrodes screenprinted on corundum ceramic base to interdigitated platinum arrays formed on the glass substrate by lithographic techniques were tested. The iodide/iodine redox couple in triiodide solutions was selected as a model system with reversible electrochemical behaviour. From various tested geometries of working electrodes, the interdigitated arrays exhibited the current responses towards the presence of redox species higher by one order of magnitude comparing to other designs. Key words: Platinum electrodes, Screen-printed electrodes, Interdigitated arrays, Biamperometry, Iodide, Iodine. Úvod Při kontinuálním monitorování analyt s využitím elektrochemické detekce jsou kladeny pom rn vysoké nároky na provedení detektoru, stabilitu elektrodového materiálu a jeho odolnost proti případné pasivaci povrchu elektrod produkty elektrochemických reakcí. Pro sledování přítomnosti redoxních látek m že být výhodné použití biamperometrie. Tato elektrochemická technika využívá m ření proudu na dvou polarizovatelných elektrodách, na které je přivedeno malé nap tí v řádu desítek milivolt . Proud teče mezi elektrodami v případech, kdy jsou v roztoku přítomny buď ob formy redoxního páru, které se mohou při daném rozdílu potenciál oxidovat a redukovat 1, anebo dva r zné redoxní systémy s blízkými potenciály poločlánkových reakcí 2. Biamperometrie se vyznačuje n kolika charakteristickými vlastnostmi. Instrumentální uspořádání je velmi jednoduché a snadno se nastavují podmínky vlastního experimentu. Metoda je dostatečn citlivá a její selektivitu je možné ovlivňovat velikostí nap tí, vkládaného na elektrody 2. S rostoucím nap tím na elektrodách se zv tšuje i m řený proud, jehož velikost rovn ž závisí na ploše elektrod. Na elektrody se přivádí pouze malé nap tí, tudíž je omezena koroze elektrodových materiál při dlouhodobých experimentech 3, a neprojevuje se vliv nabíjecího proudu, neboť elektrody jsou neustále polarizovány stejným nap tím 4. V případ planárního uspořádání biamperometrického detektoru jsou možnosti uspořádání pracovních elektrod ke zlepšení citlivosti m ření omezené.

181

Velkého zvýšení citlivosti m ření lze dosáhnout použitím dvou tzv. propletených (interdigitated) elektrod, které mají tvar hřebene a jsou do sebe zaklesnuty 3. Elektrodové dráhy a mezery mezi nimi lze vytvářet litografickými technikami v šířce desítek nanometr až stovek mikrometr . Při malých rozm rech elektrod, které jsou dostatečn blízko u sebe, se projevuje efekt redoxní cyklické reakce: produkt reverzibilní elektrochemické reakce se mezi sousedními, jinak polarizovanými elektrodami zp tn přem ňuje na výchozí látku a naopak 5. Limitní proud redoxní cyklické reakce vzr stá až o n kolik řád se zmenšující se šířkou elektrod a mezer mezi nimi 6, nicmén podle simulačních studií se nepředpokládá jeho další zesílení při mezerách menších než 100 nm 7. Předkládaný přísp vek shrnuje výsledky experiment s n kolika r znými návrhy biamperometrických detektor pro kontinuální monitorování přítomnosti jodu. Experimentální část Byly použity senzory s tišt nými platinovými elektrodami na keramickém podkladu v kruhovém uspořádání AC1. 2.RS a s propletenými (interdigitated) elektrodami u typu CC1. 2 (BVT Technologies, a.s., Česká republika). U tříelektrodových senzor AC1 byla připojeny pouze platinové pracovní (pr m r 1 mm) a pomocné elektrody. Pracovní plocha senzoru CC1. 2 byla 2 × 2 mm a geometrická plocha jedné hřebenové elektrody 1,09 mm2. Dále byla testována čidla s dv ma propletenými platinovými elektrodami DRP-G-IDEPT5 a DRP-G-IDEPT10 (DropSens, Špan lsko), připravenými pomocí litografických technik na substrátu ze skla ( br. 1). Jednotlivé typy se liší šířkou elektrodových drah a mezer mezi nimi (5 µm u DRP-G-IDEPT5 a 10 µm u DRP-G-IDEPT10). Rozm r pracovní plochy senzor byl 7 × 5 mm, geometrická plocha jedné hřebenové elektrody pak 8,75 mm2.

Obr. 1. Testované platinové senzory – AC1.W2.RS (BVT Technologies, a.s., vlevo), CC1.W2 (BVT Technologies, a.s., uprostřed) a DRP-G-IDEPT10 (DropSens, vpravo). Kontinuální m ření byla provád na s využitím elektrochemického analyzátoru PalmSens2, osmikanálového multiplexeru CH8 a ovládacího software PSTrace 4.2 (PalmSens BV, Nizozemsko), ve kterém byl vytvořen skript pro sekvenční a opakované načítání hodnot proudu z jednotlivých senzor připojených k multiplexeru po dobu n kolika dní s využitím osobního počítače. Pro biamperometrická m ření byly senzory zapojeny v dvouelektrodovém uspořádání a polarizovány nap tím 40 mV po celou dobu trvání experimentu.

182

Pro m ření s modelovým redoxním systémem jod/jodid byla na povrch testovaných senzor přiložena vrstva agarového gelu s přídavkem 0,67 g KI, na kterou bylo napipetováno 0,3 ml Lugolova roztoku. Difuze jodu přes tuto vrstvu gelu k povrchu testovaných senzor byla poté sledována biamperometricky v inkubátoru ICT 52 (Falc, Italy) při teplot 37 °C. Agarový gel byl připraven rozpušt ním 1,2 g agar-agaru a 6 g želatiny (vše Merck, N mecko) ve 100 ml destilované vody. Po n kolikaminutovém povaření bylo 1,5 ml tekuté sm si nalito do jamek mikrotitrační kultivační destičky o pr m ru 35 mm ke ztuhnutí. Výsledky a diskuse Pro kontinuální sledování přítomnosti jodu byly testovány čtyři r zné konfigurace biamperometrického senzoru - disková elektroda a výseč mezikruží (pracovní a pomocná elektroda senzoru AC1), propletené elektrody u senzoru CC1 s třemi širokými pruhy v každé části a propletené elektrody u senzor DRP-G-IDEPT s n kolika stovkami mikrometrových proužk (250 u DRP-G-IDEPT5 a 125 u DRP-G-IDEPT10) se šířkou drah a mezer 5 a 10 µm. Prvotní testy byly provád ny v klasickém vsádkovém uspořádání a sm řovaly k určení experimentálních podmínek dlouhodobého monitorování přítomnosti jodu za přídavku KI. Za použití senzor AC1 byl nejprve po dobu dvou dní testován vliv velikosti polarizačního nap tí a míchání na biamperometrickou proudovou odezvu. Při míchání roztoku magnetickým míchadlem byly pozorovány n kolikanásobné hodnoty protékajícího proudu v porovnání s nemíchaným roztokem, ale záznam vykazoval velké proudové oscilace v d sledku okamžitých zm n proud ní roztoku v blízkosti elektrody, které nebyly patrné při m řeních bez míchání. Po n kolika dnech trvání experiment docházelo k rozpoušt ní nezapojené stříbrné referentní elektrody p sobením agresivního jodu, a proto nebyly senzory AC1 dále testovány. Ke kontinuálnímu monitorování přítomnosti jodu, pronikajícího přes cca 2 mm tlustou vrstvu agarového gelu s přídavkem KI, byly použity senzory CC1 a DRP-G-IDEPT s propletenými hřebenovými elektrodami. M řený proud v závislosti na čase dosáhl svého maxima asi jednu hodinu po zahájení experimentu, kdy přes vrstvu gelu difunduje k elektrodám nejv tší množství jodu a poté proud klesal v d sledku postupného rozkladu jodu vzdušným kyslíkem, urychleného vyšší teplotou. Tabulka I shrnuje zjišt né výsledky z nam řených dat pro tři experimenty. Je patrné, že se vzr stající geometrickou plochou použitých elektrod se rapidn zvyšují také celkové m řené proudy. Pom r maximálního proudu senzor DRP-G-IDEPT10 a CC1 zhruba odpovídá pom ru geometrických ploch jejich elektrod. U senzor DRP-GIDEPT5 vychází pom r proud vyšší, což lze přisoudit projevujícímu se efektu redoxního cyklování, jak je patrné při porovnání senzor DRP-G-IDEPT se stejnou geometrickou plochou, ale s jiným strukturním uspořádáním elektrod. Relativní sm rodatná odchylka m ření na senzorech s propletenými elektrodami je až 15 %, což je více, než bylo očekáváno od elektrod s vysoce reprodukovatelným povrchem, připraveným litografickými technikami. Možné vysv tlení je v nedostatečné izolaci přívodních drah, které se mohly zapojit do elektrodové reakce a zv tšovaly tak aktivní povrch elektrody. Tabulka I. Biamperometrické odezvy r zných senzor pro 0,5% Lugol v roztok (n = 3). Senzor Plocha jedné Plocha signálu Maximální proud 2 elektrody, mm Pr m r, mA min RSD, % Pr m r, µA RSD, % CC1.W2 1,09 6,2 21,7 DRP-G-IDEPT5 8,75 148,6 5,3 206,2 13,8 DRP-G-IDEPT10 8,75 122,3 15,1 168,8 10,7

183

Závěr Pro kontinuální monitorování přítomnosti jodu lze s výhodou využít jednoduché biamperometrické techniky s použitím planárních dvouelektrodových platinových senzor . Jediným omezením je nutná přítomnost KI. Konfigurace a geometrická plocha pracovních elektrod má pak zásadní vliv na citlivost m ření. U propletených hřebenových elektrod s dostatečn malou šířkou elektrodových drah a mezer mezi nimi se projevuje zesilující efekt redoxního cyklování elektrochemicky reverzibilního analytu. Pro dlouhodobá m ření je nejvhodn jší použít platinové elektrody, připravené litografickými technikami na sklen ném substrátu, které odolávají agresivnímu p sobení jodu. Poděkování Tato práce vznikla za podpory Technologické agentury České republiky (projekt č. TA03011029 „Nové kryty ran s programovaným uvolňováním účinných látek určené pro inhibici biofilmu“). Literatura 1. Reilley C. N., Cooke W. D., Furman N. H.: Anal. Chem. 23, 1223 (1951). 2. Song J. F., Zhao C., Guo W., Kang X. F., Zhang J. C.: Anal. Chim. Acta 470, 229 (2002). 3. Rahimi M., Mikkelsen S. R.: Anal. Chem. 83, 7555 (2011). 4. Lichtig J., Zaia D. A. M., Valente J. P. S., Rezende M. O. O.: J. Braz. Chem. Soc. 4, 172 (1993). 5. Anderson L. B., Reilley C. N.: J. Electroanal. Chem. 10, 295 (1965). 6. Bard A. J., Crayston J. A., Kittlesen G. P., Varco S. T., Wrighton M. S.: Anal. Chem. 58, 2321 (1986). 7. Yang X., Zhang G.: Sensor. Actuat. B-Chem. 126, 624 (2007).

184

Voltammetric Behavior of Insecticides Pymetrozine and Imidacloprid using Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické chování insekticidů pymetrozinu a imidaclopridu s využitím stříbrné pevné amalgámové elektrody) Renáta Šelešovská, Lenka Bandžuchová, Michaela Kadubcová, and Michaela Št pánková Institute of Environmental and Chemical Engineering, University of Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Possibility of application of the mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) has been investigated for voltammetric analysis of insecticides pymetrozine and imidacloprid. Cyclic voltammetry (CV) and direct current voltammetry (DCV) has been used for study of the voltammetric behavior of analyzed substances depending on pH of supporting electrolyte and scan rate. Differential pulse voltammetry (DPV) has been applied for insecticides determination. Finally, the proposed methods have been successfully used in the analysis of insecticides preparations and spiked river water. All obtained results were compared with those achieved using hanging mercury drop electrode (HMDE). Key words: Pymetrozine, Imidacloprid, Silver solid amalgam electrode, Voltammetric determination. Introduction Pymetrozine (PYM, 6-Methyl-4-[(E)-(pyridin-3-ylmethylen)amino]-4,5-dihydro-2H-[1,2,4]triazin-3-on (IUPAC), Fig. 1A, CAS: 123312-89-0) is selective insecticide used to protect vegetables, fruits, oilseeds, tobacco, ornamentals and other plants from aphids and whitefly. PYM has neuroactive effects, e.g., it can influence the sensory responses, cause the paralysis or affect the food intake of stricken insect. PYM does not have significant negative effects. It is slightly toxic to aquatic invertebrates 1,2. Imidacloprid (IMI, N-{1-[(6-Chloro-3pyridyl)methyl]-4,5-dihydroimidazol-2-yl}nitramide, Fig. 1B, CAS: 138261-41-3) belongs into the group of neonicotinoide insecticides, which are neurotoxic. It is the most commonly substance used for controlling of sucking insects and fleas in domestic animals. IMI is systematic insecticide; it can permeate from the soil into the whole plant which becomes toxic for insects and invertebrates. IMI is considered as moderately toxic. The symptoms observed after the exposure to the preparations containing IMI including e.g., reduction of activities, impairment of coordination, tremor, weight loss or liver damage 3,4.

A

B

Fig. 1. Structural formulas of pymetrozine (A) and imidacloprid (B). This work is focused on the determination of PYM and IMI using silver solid amalgam electrode modified by mercury meniscus. This electrode represents the step between mercury electrode and solid electrodes, and it combines the advantages of the both above-mentioned 185

types, especially the high hydrogen evolution and good possibility of surface regeneration comparable with HMDE with the good mechanical stability and nontoxic electrode material of solid electrodes. The m-AgSAE was used up to now for many various analytical applications in determination of inorganic 5,6 and organic compounds 7-10, as well as in the analysis of peptides 11 and DNA 12-14. Experimental All chemicals used for the preparing of the standard solutions, electrolytes and other stock solutions were of p.a. purity. Britton–Robinson (B–R) buffer of a pH value from 2 to 12 was prepared from an alkaline component of 0.2 M NaOH (Lachema, Brno, Czech Republic) and an acidic component consisting of 0.04 M H3PO4, 0.04 M H3BO3 and 0.04 M CH3COOH (Lachema, Brno, Czech Republic). The electrolytes based on acids were diluted from the concentrated acids (96 % H2SO4, 65 % HNO3 and 35 % HCl, all from Penta, Praha, Czech Republic) by the distilled water. For the amalgam electrode activation 2 M solution of KCl (Penta, Praha, Czech Republic) was used. 1×10-3 M stock solution of pymetrozine (Sigma Aldrich, Praha, Czech Republic) was prepared by dissolution in 50 % solution of ethanol and 2×10-4 M solution of imidacloprid (Sigma Aldrich, Praha, Czech Republic) was prepared by dissolution in distilled water. Both stock solutions were stored in the dark in a refrigerator. Voltammetric measurements were performed with the computer controlled Eco-Tribo Polarograph (Polaro-Sensors, Praha, Czech Republic), equipped by POLAR.PRO software for Windows XP version 5.1. The m-AgSAE with the working surface 0.39 mm2 and HMDE with the surface 0.73 mm2 (both from Eco-Trend Plus, Praha, Czech Republic) served as working electrodes. Ag/AgCl/saturated KCl was used as a reference and a platinum wire as an auxiliary electrode (both from Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) in all described experiments. The measurements were performed at laboratory temperature (23±2°C). xygen was removed from the measured solutions by bubbling with nitrogen (purity class 4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for 5 minutes. The values of pH were measured using pH-meter Hanna 221 (Hanna Instruments, Inc., USA) and solutions of PYM were prepared by applying an ultrasonic bath Bandelin Sonorex (Schalltec GmbH, Germany). CV and DCV were used for the study of the voltammetric behavior of both analyzed insecticides in dependence of pH and scan rate. DPV with optimized parameters was used for PYM and IMI determination. The limits of decision (LOC), detection (LOD) and quantification (LOQ) were calculated as described in [15] and the parameters of calibration curves (e.g., slope, intercept) were calculated using software Excel 2003 (Microsoft, USA). Silver solid amalgam electrode was abraded on a soft emery-paper at first and then polished using the polishing kit (Electrochemical Detectors, Turnov, Czech Republic) consisting of polishing polyurethane stock, Al2O3 suspension (particle size 1.1 mm), and soft polishing Al2O3 powder (particle size 0.3 mm). The m-AgSAE was prepared by immersion of the polished electrode into the liquid mercury for 15 s and by shaking the pot with mercury. It is suitable to renew the meniscus once a week in the case of long term measurements. Before beginning of the work, as well as after every pause longer than 1 hour, the electrode surface was activated in the solution of 0.2 M KCl by applying -2200 mV vs. Ag/AgCl/ KCl (satur.) electrode for 300 s while the solution was stirring. The regeneration step of the electrode surface was inserted into the “design” utility of particular measuring methods used in the computer software Polar 5.1. It consisted of the setting of the fixed regeneration potential Ereg -1100 mV for 30 s. The regeneration was realized directly in the supporting electrolyte or analyte.

186

Results and discussion The voltammetric behavior of PYM and IMI on m-AgSAE has been studied over a wide pH range. It was ensured by diluted acids as well as using B-R buffer (pH 2-12). PYM yielded one chemically irreversible reduction signal in whole tested pH range in the area of negative potentials. The highest current signal was observed in B-R buffer of pH value of 3 about the potential -800 mV. Therefore, this medium has been used in the all next measurements. In case of IMI, two irreversible reduction signals have been recorded in supporting electrolytes of pH from 2 to 10. The highest peaks were observed in B-R buffer of pH 10. First signal was placed at the potential about -780 mV and the second at the potential -1350 mV. First peak was chosen for the development of the method of IMI determination. When the scan rate was changed from 25 to500 mV s-1 using DCV, a linear dependence was achieved between the peak current and the square root of the applied scan rate for both analyzed insecticides. It suggests that the reduction of PYM and the first reduction step of IMI correspond to the diffusion-controlled process. All these results correspond to the results obtained using HMDE. The parameters for DPV determination of PYM and IMI were found on m-AgSAE. It was observed that the initial potential (Ein) does not affect the peak height substantially. In all following experiments, the value of Ein was chosen as 0 mV (PYM) and -100 mV (IMI), respectively. The pulse height and pulse width were tested next. The proposed values of the pulse height were -60 mV (PYM) and -70 mV (IMI). The pulse width was set to the value of 20 ms for both analytes. To ensure the ideal reproducibility of the registered current signals on m-AgSAE, it was necessary to optimize the parameters of the regeneration process. In case of PYM determination, the optimized regeneration process included the application of the fixed regeneration potential value Ereg. Suitable regeneration time (treg) was 30 s and the optimal value of Ereg was found as -1100 mV. Optimal surface regeneration for IMI was found as 30 regeneration cycles between -100 and -1500 mV in jumps (one jump took 0.3 s). These regeneration procedures were realized directly in the analyzed solutions. The achieved relative standard deviations (RSD) of the repeated measurements of PYM and IMI obtained on m-AgSAE under the proposed regeneration parameters did not exceed 3 % and were fully comparable with those achieved on HMDE. The reproducibility of insecticides determination using DPV on m-AgSAE was tested by five times repeated analysis of PYM and IMI at several different concentration levels in model solutions. The method of standard addition was applied. The achieved results for both analytes proved very good accuracy of proposed methods. It is possible to conclude, that the calculated values of RSDs obtained from these repeated analyses do not exceed 4% and are almost equal for both compared electrodes. Figure 2 shows an example of the dependence of the peak height on the PYM concentration in the range from 5×10-7 to 1×10-4 mol L-1. The linear dynamic range determined for PYM was from 1×10-7 to 2×10-4 mol L-1 and for IMI from 2.5×10-7 to 4×10-5 mol L-1. As it was proved above from the measurements of the dependences of peaks height on scan rate, the reductions of PYM and IMI, respectively, are diffusion-controlled reactions. This conclusion corresponds to our experimental observations, i.e., none of the analytes cannot be accumulated (and thus increased its amount before the analysis) at the surface of the working electrodes. The statistical parameters, especially the limits of detection, for PYM and IMI using DPV in combination with m-AgSAE and HMDE, respectively, are summarized in Table I. The applicability of the m-AgSAE for DPV determination of PYM and IMI was verified by analysis of real samples of the pesticides preparations and spiked river waters. The analyzed solutions of pesticide preparation containing PYM were prepared by dilution of granules in

187

the mixture of ethanol and distilled water (1:1) applying the ultrasound bath. In case of IMI the preparation was diluted in distilled water only. To eliminate the interferences of surface active substances and other compounds likely to be present in the analyzed material, the standard addition method was used for the determination of content of both insecticides. The results achieved using m-AgSAE corresponded with the declared contents of analytes in the preparations. The analyzed river water samples from Labe and Chrudimka were spiked by PYM and IMI to the concentration of 2×10-6 mol L-1. During the analyses 5 mL of each sample was placed into the polarographic vessel and 5 mL of B-R buffer was added. The standard addition method has been used for insecticides concentrations evaluation. The determined concentrations corresponded with the spiked amount of both analytes.

Fig. 2. Concentration dependence of pymetrozine recorded on the m-AgSAE. Method – DPV, electrolyte – B-R buffer (pH 3), Ein = 0 mV, Efin = -1100 mV, Ereg = -1100 mV, treg = 30 s, v = 20 mV s-1, cPYM = 5×10-7-1×10-4 mol L-1. Table I. Statistical parameters recorded on m-AgSAE and on HMDE under optimized conditions pymetrozine imidacloprid m-AgSAE HMDE m-AgSAE HMDE LOC [mol L-1] 3.5×10-8 1.1×10-7 2.4×10-8 8.3×10-8 LOD [mol L-1] 6.6×10-8 2.2×10-7 4.7×10-8 1.6×10-7 LOQ [mol L-1] 1.3×10-7 4.3×10-7 1.3×10-7 3.6×10-7 Conclusion The voltammetric behavior of insecticides pymetrozine and imidacloprid on m-AgSAE was investigated and a novel analytical method was developed for their determination in environmental samples on the basis of the voltammetric studies. All obtained results were compared with those achieved using HMDE. The applicability of m-AgSAE in connection

188

with DPV was verified by analysis of insecticides preparations and spiked river water samples. It can be concluded, that proposed voltammetric methods can be considered as a sensitive and environmentally acceptable tools for analysis of PYM as well as of IMI and mAgSAE can be a good alternative to mercury electrodes. Acknowledgements This work was supported by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project No. CZ.1.07/2.3.00/30.0021) and by the University of Pardubice (project No. SGFChT06/2014). Literatura 1. Kramer W., Schirmer U., Jeschke P.: Modern crop protection compounds. Wiley-VCH, Weinheim 2012. 2. Ausborn J., Wolf H., Mader W., Kayser H.: J. Exp. Biol. 208, 4451 (2011). 3. Buffin D.: Pest. News 62, 22 (2003). 4. Cox C.: J. Pest. Reform 21, 15 (2001). 5. Novoný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000). 6. Yosypchuk B., Novotný L.: Chem. Listy 96, 756 (2002). 7. Yosypchuk B., Novotný L.: Talanta 56, 971 (2002). 8. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B.: Sensors 6, 445 (2006). 9. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 60, 375 (2012). 10. Bandžuchová L., Šelešovská R.: Acta Chim. Slov. 58, 776 (2011). 11. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007). 12. Fadrná R., Yosypchuk B., Fojta M., Navrátil T., Novotný L.: Anal. Lett. 37, 65 (2004). 13. Fadrná R. Cahová-Kuchaříková K., Havran L., Yosypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis 17, 452 (2005). 14. Yosypchuk B., Fojta M., Havran L., Heyrovský M., Paleček E.: Electroanalysis 18, 186 (2006). 15. Miller J.C., Miller J.N.: Statistics for Analytical Chemistry, Ellis Horwood, Chichester 1986, p. 124.

189

Transport of Phytochelatin PC2 across Model Phospholipid Membrane (Trasport fytochelatinu PC2 přes modelovou fosfolipidovou membránu) Ivana Šestáková, Kateřina Nováková, Bohdan Josypčuk, and Tomáš Navrátil J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Using electrochemical cell with two compartments separated by phospholipid membrane on polycarbonate support, transport of phytochelatin PC2 by means of cell penetrating peptide TP10 and in lesser extent with Mastoparan X was confirmed with voltammetry. Formation of the membrane and transport was followed by electrochemical impedance spectroscopy. Key words: Phospholipid membrane, Phytochelatin, Transport, TP10, Mastoparan X, Voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy. Úvod Fytochelatiny jsou polypeptidy o struktuře nejčast ji (Glu-Cys)n-Gly, které vznikají v rostlinách, řasách a houbách jako odezva na přítomnost n kterých kov , zejména Cd, Cu, Hg a As. Účinek kadmia je nejsiln jší a fytochelatiny jej váží ve form komplex , které jsou ukládány nejprve ve vakuolách kořenových bun k. V kořenech rostlin jsou proto nacházeny nejvyšší obsahy tohoto toxického kovu. Teprve při vyšší exposici dochází u n kterých rostlin k transportu kadmia i do vn jších částí (stonky, listy), přičemž takovéto rostliny jsou vyhledávány z hlediska využití k remediaci p dy 1, 2. Předm tem studií je v této souvislosti otázka zda se fytochelatiny mohou podílet také na transportu do dalších částí rostliny 3. Existují r zné zp soby transportu látek přes fosfolipidovou membránu. Na našem modelu, kde je fosfolipidová dvojvrstva vytvářena v pórech polykarbonátového nosiče, jsme studovali transport iont kadmia 4 či m di 5 přes modelovou membránu s inkorporovaným ionoforem A23187. Pro transport v tších molekul se ukázaly vhodné speciální peptidy, které mohou vnikat do buňky, nazývané CPP peptidy (z anglického cell penetrating peptides) 6. Tyto peptidy se nejprve váží na membránu ve form šroubovice. Vazba peptid vytváří nerovnom rnou vrstvu přes lipidovou dvojvrstvu, zp sobuje její porušení a umožňuje peptidu pr chod hydrofobním jádrem dvojvrstvy za současné tvorby póru, kterým mohou procházet další látky. Jakmile je translokace peptidu dokončena, je obnovena rovnováha i struktura membrány 7. Bylo zjišt no, že pro tvorbu póru je nutné překročení určité kritické hodnoty pom ru peptid: lipid (v tšinou 1:50). Dva z obdobn se chovajících CPP (mastoparan a TP10), pro které byl pomocí fluorescenčního značení 8 prokázán pr nik do protoplast z kultivaru N. tabacum jsme použili pro studii transportu fytochelatinu PC2.

Obr. 1. Strukturní vzorec PC2

190

Experimentální část Fytochelatin PC2 byl syntetizován (www.genosphere-biotech.com).

ve

firm

Genosphere

Biotechnologies,

Paříž

Peptidy mastoparan X - 14 aminokyselin (INWKGIAAMAKKLL-NH2 ) a TP10 – 21aminokyselin (AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2.) byly syntetizovány v Ústavu organické chemie a biochemie AVČR, v.v.i. Pro přípravu fosfolipidové membrány byl používán 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- fosfocholin (Avanti Polar lipids, Alabaster, USA), rozpušt ný v 10µl ethanolu a 100µl n- heptanu (p.a. ethanol 99,88%, p.a. n-heptan 99%, Penta- Švec Praha, Česká republika ). Jako elektrolyt byl používán 0,1M KCl, připravený z KCl Suprapur, (Merck, Česká republika) a deionizované vody (Milli –Q-gradient, Millipore Corp., USA). Fosfolipidová membrána byla vytvářena v pórech hydrofilního polykarbonátového nosiče s velikostí póru 0,2 µm (Nucleopore Track-Etch Membrane, hatman, USA). Pro m ření elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS) byla používána již dříve popsaná dvoudílná sklen ná cela 5, v jejímž středu je umíst n polykarbonátový nosič s fosfolipidovou membránou. b části cely byly napln ny elektrolytem (0,1 M KCl). Po vytvoření membrány byly do části 1 přidány vodný roztok fytochelatinu a CPP peptidu, po 60 minutách od přidání byl odebrán elektrolyt z části 2, ve kterém byly zjišťovány látky prošlé membránou. EIS m ření byla provád na s použitím potenciostatu PGSTAT302N+ FRA2 modul (Metrohm, Česká republika), se softwarem Nova 1.9. Jako pracovní a referentní elektrody byly použity Ag drátek pokrytý AgCl, pomocnou elektrodou byl platinový drátek. M ření byla provád na v rozsahu 0,1 Hz až 1 MHz s amplitudou 0,005 V. Voltametrická stanovení byla provád na s použitím počítačov řízeného analyzátoru PC-ETP (Polaro- Sensors, Praha, Česká republika) se softwarem P LAR PRO 5.1. a Multielchem 2.1. Pracovní elektrody byly HMDE (rtuťová tužková elektroda fy Polaro Sensors) a stříbrná amalgámová elektroda ve form m-AgSAE, připravená a aktivovaná dle práce 9. Další testovanou elektrodou byla CuSAE 10. Referentní elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda Pt drátek (Elektrochemické Detektory, Turnov, Česká republika). M ření byla provád na při laboratorní teplot s použitím základních elektrolyt 0,1 M KCl a borátového pufru pH 8,5. Pro m ření pH byl používán pH metr Jenway 3505 (Bibby Scientific Ltd. UK). Výsledky a diskuse Stanovení fytochelatinu s použitím CuSAE nebylo úsp šné, protože při transportu dochází především k transportu CPP, jehož aminokyseliny jsou na této elektrod aktivní. Nicmén podmínky nalezené pro CuSAE byly úsp šn aplikovány pro stanovení PC 2 na m-AgSAE. Pro voltametrické stanovení na HMDE byla využita tvorba Hg komplexu v prostředí borátového pufru11. Po aplikaci TP10 a PC2 na fosfolipidovou membránu ve stechiometrickém pom ru 6 CPP:lipid = 2:50 byl v elektrolytu 2 nalezen PC2 a to 25,8 µg – což odpovídá 0,2 % z p vodn přidaného množství do elektrolytu 1. Při obdobn provedeném pokuse s mastoparanem X bylo v elektrolytu 2 nalezeno 0,09 µg PC2 což odpovídá 0,0007%. množství přidaného do elektrolytu 1. To odpovídá údaj m v literatuře 6, kde TP10 je při transportu n kolikanásobn účinn jší nežli mastoparan . Také m ření EIS odpovídají předpokládanému mechanismu – je patrná zm na pouze po přidání

191

CPP peptidu a rychlý návrat do ustáleného stavu, na rozdíl od experiment s použitím ionoforu A23187, kde k pr chodu iont docházelo v podstatn delším intervalu. Provedené experimenty potvrdily transport fytochelatinu přes fosfolipidovou membránu a jsou v souladu s představou, že k nim dochází až při vyšších koncentracích 12. Závěr Pomocí voltametrie na stříbrné amalgámové elektrod a na HMDE byl potvrzen transport fytochelatinu PC2 přes fosfolipidovou membránu pomocí speciálních peptid TP10 a mastoparanu . Sledování tvorby a stability fosfolipidové membrány pomocí EIS potvrdilo dříve navržený mechanismus tvorby póru. Poděkování Josypčuk B. a Šestáková I. d kují za podporu grantu GAČR P206/11/1638, Navrátil T. a Nováková K. grantu GAČR P208/12/1645. Literatura 1. Zenk M .H.: Gene 179, 21 (1996). 2. Clemens.C.: Biochimie 88, 1707 (2006). 3. Gong J.M., Lee D.A., Schroeder J. I.: PNAS 100, 10118 (2003). 4. Navrátil T., Šestáková I., Štulík K., Mareček V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 5. Parisová M., Navrátil T., Šestáková I., Jaklová Dytrtová J., Mareček V.: Int. J. Electroch. Sci. 8, 27 (2013). 6. Almeida P..F. Pokorny A.: Biochemistry 48, 8083 (2009). 7. Yandek L.E.,Pokorny A., Almeida P. F.: Biochemistry 48, 7342 (2009). 8. Mae M., Myrberg H., Jiang Y, Paves H., Valkna A., Langel U.: Biochim.Biophys. Acta 1669, 101, (2005). 9. Yosypchuk B., Novotný L.: Talanta 56, 971 (2002). 10. Yosypchuk B., Šestáková I., Novotný L.: Talanta 59, 1253 (2003). 11. Cruz B.H., Díaz-Cruz J.M., Šestáková I., Velek J., Arino C., Esteban M.: J. Electroanal. Chem. 520, 111 (2002). 12. Park J., Song W., Ko D,.,EomY., Hansen T.H., Schiller M., Lee T.G., Martinola E., Lee Y.: The Plant Journal 69, 278 (2012).

192

Enzymatic Incorporation of Biotin into DNA for DNA Hybridization Analysis and for Sensitive Detection of PCR-Amplified DNA (Enzymatické inkorporace biotinu do DNA pro analýzu hybridizace a citlivou detekci DNA amplifikované pomocí PCR) Jan Špaček, Martin Ženka, Lucia Haroníková, Lud k Havran, and Miroslav Fojta Institute of Biophysics, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135, 612 65, Brno, Czech Republic. E-mails: [email protected] Abstract We present two enzymatical electrochemical assays for DNA analysis. For hybridization analysis we used probes with biotin-14-dC introduced to 3’ H end by terminal transferase. For detection of PCR products we used Deep Vent polymerase to incorporate biotin-14dCduring PCR. In both cases streptavidin-alkaline phosphatase conjugate was subsequently attached to the incorporated biotins and was used to catalyze dephosphorylation of 1-naphthyl phosphate to 1-naphthol, the electrochemical signal of which was utilized for detection. Compared to the former method, biotin incorporation during PCR offers lower molar detection limits, whereas application of the biotin-tailed probe can provide us with more selective detection. Key words: DNA hybridization, Electrochemical DNA sensors, Biotin label, Streptavidin alkaline phosphatase, TdT, Terminal Transferase, PCR, p53. Úvod b prezentované metody jsou založené na mnohonásobné inkorporaci biotinu do řet zc DNA pomocí enzym . Alternativou k enzymatické inkorporaci biotinu je chemická inkorporace biotinu na 5‘ konec primer pro PCR, nebo použití sondy značené biotinem na 3‘- nebo 5‘-konci. Takto biotinylované oligonukleotidy se získávají na komerční bázi a mají zpravidla pouze jeden biotin v každém řet zci DNA. Enzymatická inkorporace umožňuje řízeným zp sobem zařadit v tší počet nukleotid značených biotinem do řet zc DNA a tím mnohonásobn snížit limity detekce. etekce pomocí ybridizační sondy: Enzymatická inkorporace biotinem značených nukleotid pomocí terminální transferázy (TdT) byla již využita pro amplifikaci elektrochemického signálu po hybridizaci na povrchu zlatých elektrod 1. Zde prezentujeme amplifikaci hybridizačního signálu na povrchu uhlíkových elektrod. Metoda je založená na adsorpci denaturovaných PCR produkt z alkalického prostředí na povrch uhlíkových elektrod a následné hybridizaci značených sond. Na biotin značených sond je poté navázán konjugát alkalické fosfatázy a streptavidinu (SALP), který zajišťuje přem nu 1-naftylfosfátu na naftol, který je elektrochemicky aktivní 2. Proti předchozím experiment m využívajícím sondu synteticky značenou jedním biotinem, používáme sondu mnohonásobn značenou. Mnohonásobná inkorporace biotinu na 3‘ konec sondy byla provedena enzymatickou reakcí s TdT v kombinaci se značenými a neznačenými nukleosid trifosfáty. Dalším rozdílem proti dříve publikovaným pracím je využití pentilkových tuh 0,5 HB K H-I-N R jako levných jednorázových pracovních elektrod (PeGE). etekce biotinylovanýc P R produktů: Mnohonásobn značené PCR produkty byly vytvořeny přidáním r zných pom r biotin-14-dCTP (dCbioTP) v či dCTP v klasické PCR 3. Detekce takto modifikovaných PCR produkt byla provád na pomocí stejného enzymatického systému jako u výše zmín né detekce hybridizace.

193

Experimentální část Pro optimalizaci metody jsme využívali PCR produkty získané amplifikací 987-bp oblasti plazmidu Bluescript (BSK) a sondu komplementární ke střední části amplikonu. Použité oligonukleotidy jsou uvedené v tabulce I. Jako nespecifickou DNA jsme použili DNA izolovanou z telecího brzlíku. TdT, Deep Vent, polynukleotid kináza (PNK) a jejich příslušné pufry byly zakoupeny od New England Biolabs, SALP od Promegy. Účinnost enzymatické inkorporace dCbioTP jsme zjišťovali pomocí gelové elektroforézy. Enzymatickou inkorporaci s TdT jsme ov řili pomocí 15% denaturačního PAGE s primery značenými na 5’konci radionuklidem 32P pomocí PNK . Produkty PCR jsme detekovali na 1% agarovém gelu. Elektrochemické m ření jsme provád li voltametrií s lineárním skenem pomocí potenciostatu Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) a tříelektrodového zapojení (pracovní elektroda z tužkového grafitu, referenční elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát). Jako elektrolyt byl použitý uhličitanový pufr (0,5 M Na2CO3 a 0,5 M NaHCO3, pH 9,5) s 5mM 1- naftylfosfátem. Tabulka I. Použité oligonukleotidy (5‘3‘). BSK primer L BSK primer R sonda

AAGCCCTCCCGTATCGTAGT AGCTCACTCAAAGGCGGTAA CGAACGACCTACACCGAACT

etekce pomocí ybridizační sondy: Sondy byly termináln značeny kombinací dCbioTP a dATP. Pom r iniciátoru k monomeru 4 byl 100, koncentrace sondy byla 0,18μM. V celkovém objemu 20 μl reakční sm si jsme použili 20U TdT. Detekce hybridizace na povrchu PeGE probíhala následovn : 1) Adsorpce PCR produkt na povrch PeGE (ponoření elektrody do 2 μl roztoku s 0,3M NaCl a 50mM NaOH, 60 s) 2) Blokování zbylého volného povrchu mlékem (ponoření elektrody do 7 μl 5% w/w sušené nízkotučné mléko, 1xPBS, 120 s) 3) Hybridizace s termináln značenou sondou (ponoření elektrody do 2 μl roztoku s 0,3M NaCl, 60 s) 4) Navázání SALP na biotin sond (ponoření elektrody do 1 μl 20x zřed ného SALP v mléku na 60 s) 5) Enzymatická přem na 1-naftylfosfátu na naftol (v elektrolytu obsahujícím uhličitanový pufr a 1-naftylfosfát) 6) Elektrochemické m ření (LSV, počáteční potenciál 0V, koncový potenciál 0,9V, rychlost scanu 1V/S) Po každém kroku následoval 10s opláchnutí v PBS. Detekce biotinylovanýc P R produktů: PCR produkty s inkorporovanými dCbio byly přečišt ny pomocí centrifugačních kolonek „PCR Purification Kit“ ( iagen), adsorbovány na povrch PeGE a detekovány za obdobných podmínek, jako v předchozím experimentu (rozdíl byl v absenci hybridizačního kroku, neboť v tomto případ obsahuje biotinové značky již sám produkt PCR). Postupy pokus jsou schematicky znázorn ny na br. 1.

194

Obr. 1. Schéma experiment . Z genomové DNA se amplifikuje (a) oblast zájmu, a u té detekujeme přítomnost konkrétní sekvence, nebo (b) primery navrhneme tak, aby produkt vznikal pouze, pokud oblast (ne)obsahuje hledanou mutaci. Velikost signálu N je přímo úm rná množství biotinu a tedy množství hybridizované (a) sondy (b) množství amplikonu. Signál M je signál vzniklý oxidací protein z mléka a pro analýzu DNA nemá žádný význam. Výsledky a diskuze Detekce pomocí hybridizační sondy: Pomocí TdT lze k DNA enzymaticky připojit i nukleotidy nesoucí velmi objemné skupiny sloužící jako značky. Pokud ale už došlo k zařazení n kolika t sn následujících modifikovaných molekul do vznikajícího řet zce, pak TdT tento řet zec už dále nerozeznává jako iniciátor a proto je reakce předčasn ukončena5. Při použití 100% roztoku dCbioTP dochází k zařazení maximáln 5 nukleotid (obr. 2). Proto je výhodn jší řet zce značit kombinací dCbioTP a dATP. Hybridizační experimenty provád né s 0,18μM sondou značenou 80% dCbioTP 20% dATP, kterou byly detekovány PCR produkty adsorbované z 50 ng/μl poskytovaly 48x vyšší signály oxidace naftolu, než jaké jsme obdrželi při použití chemicky syntetizované sondy pouze s 1 biotinem, při zachování specificity hybridizace a nulového signálu pozadí. Efekt je pravd podobn umocn n i tím, že volné konce sody zasahují do roztoku nad mléčné proteiny blokující povrch elektrody a jsou tím pádem lépe přístupné pro navázání SALP. Limity detekce budou prezentovány v přednášce. Detekce biotinylovanýc P R produktů: Kontrolní experimenty využívající gelovou elektroforézu ukázaly, že amplifikace příslušného fragmentu DNA probíhá prakticky stejn účinn od 0% do 40% zastoupení dCbioTP v či dCTP. U 60% dCbioTP vzniká menší množství produktu se správnou délkou. U 80% dochází ke vzniku malého množství výrazn zkráceného produktu a u 100% dCbioTP k PCR amplifikaci nedochází. Při přímé analýze nepřečišt né reakční sm si po PCR reakci dochází ke kompetici mezi neprodlouženými primery a amplikony o povrch elektrody. V b žném nastavení PCR reakce množství primer mnohonásobn převyšuje množství amplikon , což rapidn snižuje citlivost této metody. Po přečišt ní PCR produkt přes centrifugační kolonky jsme získali dobře vyvinuté signály 1naftolu v řádu desítek μA z 50 ng/ul roztoku amplikon a nulový signál u kontroly bez templátové DNA, která simulovala neprob hnutí reakce. Našim dalším cílem je optimalizovat

195

množství použitých primer tak, aby nebylo nutné používat purifikační kit (což je krok, který zvyšuje nákladnost a prodlužuje jinak velice rychlý proces). Závěr Srovnání s předchozími experimenty, které využívaly hybridizační sondy, nebo PCR produkty značené pouze jedním biotinem na řet zec DNA jsme potvrdili, že enzymatická mnohonásobná inkorporace biotinu do řet zc DNA zvyšuje citlivost detekce hybridizace a stanovení DNA. U detekce hybridizace je nutné najít optimum mezi absolutním počtem přidaných biotin na jednu sondu, které jsou úm rné velikosti signálu a zhoršením hybridizace zp sobené zm nou kinetiky hybridizace sond s dlouhými značenými řet zci na 3‘ konci. Podobn je nutné zvolit optimum u PCR. Zvetšení procenta dCbioTP v reakci zvyšuje limity detekce značené DNA, ale příliš velké zastoupení dCbioTP znemožňuje amplifikaci DNA. Modifikaci elektrod a elektrochemické m ření jsme optimalizovali na velice krátký čas analýzy – celkem 7 minut od získání PCR produkt . Kombinace levných jednorázových elektrod, specificity a rychlého času detekce je ideálem pro biosenzory používané v klinické praxi. Ve zde diskutovaných předb žných experimentech, provád ných s využitím PCR amplikonu získaného z plazmidu BSK, ukazujeme, že oba navrhované přístupy jsou technicky možné a poskytují vysokou citlivost a selektivitu analýzy. V přednášce budou prezentovány výsledky aplikace této metody na reálný biologický model, konkrétn detekci delecí obou alel genu p53 v bun čné linii HTC 116.

Obr. 2. Značení hybridizační sondy r zným zastoupením dCbioTP v či dATP v reakci s TdT a použití takto značených sond pro detekci hybridizace. Vzorek kontrola odpovídá vzorku 10% připravenému bez TdT. Koncentrace sondy při hybridizaci byla 0,18μM. (a) Detekce hybridizace na povrchu PeGE. V tší počet dCbio v řet zci odpovídá v tším naftolovým signál m. (b) Na obrázku z PAGE vidíme, že TdT nepřipojí více než 5 následných dC bio (dráha „100%“). Při vyšším zastoupení modifikovaných nukleotid dochází k předčasné terminaci řet zce a tím pádem k zařazení nižšího počtu biotin na jednu sondu). Poděkování Tato práce vznikla s podporou projekt GAČR (P206/12/2378 a P206/11/1638). Literatura 1. Wan Y., Xu H., Su Y., Zhu X., Song S., Fan C.: Biosens. Bioelectron. 41, 526 (2013). 2. Horakova-Brazdilova P., Fojtova M., Vytras K., Fojta M.: Sensors 8, 193 (2008). 3. Diamandis E.P., Christopoulos T.K.: Clin, Chem. 37, 625 (1991). 4. Chang L.M., Bollum F.J.: CRC Crit. Rev. Biochem. 21, 27 (1986). 5. Flickinger J. L., Gebeyehu G., Buchman G., Haces A., Rashtchian A.: Nucleic Acids Res. 20, 2382 (1992). 196

Simultaneous Determination of Purine DNA Bases Using a Novel Electrochemical Approach (Simultánne stanovenie purínových DNA báz využitím nového elektrochemického prístupu) a

Ľubomír Švorc a and Kurt Kalcher b Slovak University of Technology in Bratislava, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic, E-mail: [email protected] b Karl-Franzens University, Institute of Chemistry, Department of Analytical Chemistry, Universitätsplatz 1, A-8010 Graz, Austria

Abstract Novel electrochemical sensor for individual and sensitive determination of purine DNA bases based on the use of boron-doped diamond electrode was proposed as a modification-free alternative to widely used modified electrodes. Guanine and adenine provided well-defined irreversible oxidation peaks at +1.15 and +1.35 V vs. Ag/AgCl electrode in Britton-Robinson buffer solution at pH 6. Limits of detection for guanine and adenine in simultaneous (individual) mode using differential pulse voltammetry were found to be 158 nM and 67 nM (37 nM and 19 nM), respectively. Analysis of various types of DNA samples yielded (G+C)/(A+T) values close to those reported in literature. Key words: Guanine, Adenine, Oxidation, Boron-doped diamond electrode, Simultaneous determination, DNA. Introduction Guanine (G) and adenine (A) represent an important purine bases constituting the essential building block in DNA structure. Their abnormal changes may indicate the deficiency of immunity system leading to the presence of various diseases including epilepsy, cancer, mental retardation and HIV infection 1. The assessment of concentration levels of G and A is considered to be as important parameter in physiology and clinical field. Therefore, an enhancing attention of scientists is still given to the development of modern analytical methods for detection and determination of DNA bases in biological samples. A literature survey reveals many reports dealing with detection and determination of DNA bases using various analytical techniques. They particularly include chromatographic methods such as high-performance liquid chromatography 2, gas chromatography 3, electrophoresis 4 and spectrophotometry 5. These techniques are known for their high sensitivity and selectivity, however, also demand the complicated and tedious sample preparation and expensive instruments. Since the electrochemical activity of DNA was first discovered 6, there have been intensive attempts to apply simple, rapid and modern electrochemical methods for direct DNA analysis and nucleic acid research. Many articles concerning the direct determination of G and A have been published in last decade including the utilization of miscellaneous modifiers such as ionic liquids 7, graphene 8 and carbon nanotubes 9. These electron transfer mediators exhibited the good improvement of sensitivity because of their high electrocatalytic activity to oxidation of DNA bases, however, some of them showed the complicated electrode preparation process and high background. Therefore, it is still a challenge to investigate novel and stable electrode material with high sensitivity and selectivity for direct determination of G and A. Boron-doped diamond (BDD) represents a new class of carbonaceous material which is very attractive in modern electroanalytical

197

chemistry and well acceptable in current literature. It is due to the widest working potential range, low background current, strong electrochemical stability, high resistance to deactivation via fouling and biocompatibility 10. These properties allow the reliable electrochemical determination of analytes oxidizing (reducing) at very positive (negative) potentials, where other electrode materials are not appropriate. In this contribution, the individual and simultaneous voltammetric determination of purine DNA bases using differential pulse voltammetry on bare BDD electrode is described. The significance of our work consists in the possibility of highly sensitive determination of G and A without using any chemical modification of working electrode. The practical feasibility of proposed method is demonstrated in analysis of G and A in various types of DNA (native, thermally and acid denatured fish sperm as well as acid denatured human placenta). Experimental G, A and various types of DNA standards were purchased from Sigma-Aldrich (Austria) and used as received without any further purification. Britton-Robinson (BR) buffer solution was prepared in a usual way by mixing of phosphoric acid, acetic acid and boric acid, with all components at 40 mM concentration and adjusting with sodium hydroxide (0.2 M) to the desired pH value. Individual and mixture stock solutions of G and A (1 mM) were prepared by dissolving suitable amounts of solid standards in 2 ml of sodium hydroxide (0.2 M) followed by dilution with deionized water and stored in fridge at 4-6 ºC when not in use. The electrochemical measurements were carried out with an AUTOLAB PGSTAT 302N (Metrohm Autolab B.V., The Netherlands) potentiostat connected to conventional onecompartment glass cell equipped with three-electrode system consisting of Ag/AgCl/3 M KCl and platinum wire as reference and counter electrode, respectively. BDD electrode inserted in polyether ether ketone body with inner diameter of 3 mm (Windsor Scientific Ltd, Slough, Berkshire, UK) served as working electrode. Glassy carbon (GC) with disk diameter of 3 mm was used as comparative working electrode (BASi, USA). The electrochemical software NOVA 1.9 was employed for processing and data storage. Cyclic (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) were used for recording of voltammograms in the potential range from 0.0 to +2.0 V. The optimized conditions for DPV measurements were found to be as follows: modulation amplitude of 75 mV, modulation time of 50 ms and scan rate of 20 mV/s. The limits of detection (LODs) were calculated as three times the standard deviation for the blank solution (BR buffer solution) divided by the slope of the respective calibration curve. The simultaneous determination of G and A in DNA samples was performed by standard addition method. Results and discussion Fig. 1 shows CV voltammogram of 15 µM mixture solution of G and A in BR buffer solution at pH 6. As can be seen, G and A yielded single and well defined oxidation peaks at higher positive potentials at about +1.15 V and +1.35 V vs. Ag/AgCl electrode, respectively, without presence of any cathodic peaks on the reverse scans indicating that the electrode reactions of purine DNA bases on BDD electrode are highly irreversible. In the absence of G and A, no redox peaks were observed in whole working potential range and the background current was appeared to be sufficiently low on bare BDD electrode. To evaluate the benefits of the use of BDD electrode with respect to other carbonaceous electrode material, CV measurements on bare GC electrode were also carried out to compare the current response of 15 µM mixture solution of studied analytes. It is evident from Fig. 1 that bases oxidized at potentials close to

198

oxygen evolution reaction and the poorly defined oxidation peaks at +1.15 V and +1.40 V were detected on GC electrode.

Fig. 1. CV voltammograms of blank (∙∙∙∙∙), 15 µM G (─ • ─) and 15 µM A (──) in BR buffer solution at pH 6 on bare BDD electrode. CV conditions: start potential 0 V, upper vertex potential +2 V, lower vertex potential 0 V, step potential 1 mV and scan rate 50 mV/s. G and A were simultaneously determined by changing their equal concentrations and calibration curves were constructed. Two sharp and well defined peaks were observed at about +1.05 and +1.35 V without interfering each other, respectively. The results presented in Fig. 2 show that both oxidation peaks increased linearly with their concentrations in the range from 0.3 to 19 µM. The analytical performance for individual and simultaneous mode is listed in Table I. The low LOD values were achieved as a consequence of high S/N ratio and RSD values revealed the good repeatability of the proposed method. It can be stated that bare BDD electrode may be a sensitive electrochemical sensor for individual and simultaneous determination of G and A.

Fig. 2. DP voltammograms of mixture solution containing G and A at equal concentrations in BR buffer solution at pH 6 on bare BDD electrode. Corresponding concentrations: (a) 0, (b) 0.3, (c) 0.4, (d) 0.5, (e) 0.7, (f) 1, (g) 2, (h) 3, (i) 5, (j) 7, (k) 9, (l) 11, (m) 13, (n) 15, (o) 17

199

and (p) 19 µM. The optimized DPV operating parameters: modulation amplitude 75 mV, modulation time 50 ms and scan rate 20 mV/s. The dependences between peak currents of bases (μA) and their concentrations (μM) appear in inset. Table I. Analytical parameters for individual and simultaneous determination of G and A in BR buffer solution at pH 6 on bare BDD electrode using proposed method (n = 6). Individual mode Simultaneous mode Analytical parameter G A G A Intercept, nA 12 9 8 7 SD of intercept, nA 1 1 1 1 Slope, nA/µM 82 160 19 45 SD of slope, nA/µM 5 12 2 3 Linear range, µM 0.21-23 0.12-25 0.3-19 0.3-19 R2 0.998 0.999 0.999 0.999 LOD, nM 37 19 158 67 RSD*, % 1.5 2.5 3.3 4.2 * Calculated for 10 µM (individual or mixture) solution of G and A To evaluate the selectivity of proposed method, the effect of the possible interfering agents was tested by their addition to 10 μM mixture solution of G and A in BR buffer solution at pH 6. The results suggested that 100-fold concentration excess of some inorganic ions such as K+, Na+, Mg2+, Fe3+, Zn2+, Pb2+, Cu2+, Cl-, SO42-, CO32- and NO3- had no influence on the oxidation peaks of G and A with signal change less than 5%. No significant interferences were recorded in 50-fold excess of organic compounds such as glucose, urea, cysteine, lactic acid and uric acid (signal change below 5%). Ascorbic acid oxidized at +0.75 V vs. Ag/AgCl electrode under experimental conditions, thus some difficulties about overlapping its oxidation peak with G could occur. As depicted in Fig. 3, the 30-fold excess of ascorbic acid had higher influence on the signal of G (signal change of about 30%) due to clear overlapping of their oxidation peaks. However, in spite of this fact it can be concluded that the proposed method provides the sufficient selectivity and offers the promising possibilities for simultaneous determination of G and A in biological samples.

Fig. 3. DP voltammograms of 10 µM mixture solution of G and A in the presence of ascorbic acid (AA) in its various concentrations: (a) blank, (b) 0, (c) 2, (d) 4, (e) 8, (f) 12, (g) 15, (h) 18, (i) 22 (j) 26 and (k) 30 in BR buffer solution at pH 6 on bare BDD electrode. The optimized DPV operating parameters: modulation amplitude 75 mV, modulation time 50 ms and scan rate 20 mV/s.

200

To examine the validity of the developed procedure, the proposed method was applied for the simultaneous determination of G and A in various types of DNA. It is important to emphasize that the bases are embedded in the interior of double helix and therefore their detection is sterically hindered due to the crowded phosphate group on the exterior of the helix. In addition, on the basis of this knowledge, the most detection strategies of G and A in native DNA samples face the problem with poor sensitivity. Despite of this fact, our effort was focused on the construction of calibration curves and the evaluation of G and A contents in native, thermally and acid denatured DNA samples. The LODs for native, thermally and acid denatured DNA from fish sperm were calculated to be 0.250 and 0.181, 0.148 and 0.079, 0.109 and 0.055 µg/ml for G and A, respectively. From these values it is evident, that the most sensitive simultaneous determination of purine bases in DNA samples was achieved in acid denatured DNA. This fact confirms the significant unwinding of duplex DNA by acid denaturation enabling G and A residues to be more accessible to the BDD electrode surface. Furthermore, G and A contents (determined as molar ratio, mol %) in all types of DNA samples were calculated and their values varied from 21.6 to 22.2% for G and from 27.3 to 28.1% for A, respectively. Subsequently, (G+C)/(A+T) values in the range from 0.78 to 0.80 were obtained. These values coincided to the standard value of 0.77 11 indicating the practical usefulness of proposed method. Conclusions The chemically modified electrodes can provide the significant benefits in determination of required analyte, especially when sensitivity and selectivity is low on the bare electrodes. However, this contribution manifests the successful application of bare BDD electrode for the sensitive determination of purine DNA bases in biological samples. The low LODs were obtained in both individual and simultaneous modes; these values belong to the lowest ones when compared with previously reported electrochemical methods. In comparison with other electrodes, BDD electrode avoids the problems with tedious complex preparation of modified electrodes. The method can be used to simultaneously determine G and A free or contained in various types of DNA (un-pretreated and denatured). In this way, boron-doped diamond represents one of a few modification-free electroanalytical tools to widely used modified electrodes for sensitive monitoring of purine DNA bases. This may make the proposed method promising for future uses in clinical diagnosis and the research of genetic information. Acknowledgments This work was supported by the Grant Agency of the Slovak Republic (grant No. 1/0051/13) and the Slovak Research and Development Agency under the contract No. APVV-0797-11. References 1. Badralmaa Y., Natarajan V.: J. Virol. Methods 193, 184 (2013). 2. Fan H., Yang F.Q., Li S.P.: J. Pharm. Biomed. Anal. 45, 141 (2007). 3. Min K., Ebeler S.E.: Food Chem. Toxicol. 46, 96 (2008). 4. Haunschmidt M., Buchberger W., Klampfl C.W.: J. Chromatogr. A 1213, 88 (2008). 5. Mei Y., Ran L., Dongyan H., Yuying G.: Luminiscence 20, 307 (2005). 6. Paleček E.: Nature 188, 656 (1960). 7. Liu T., Zhu X., Cui L., Ju P., Qu X., Ai S.: J. Electroanal. Chem. 651, 216 (2011). 8. Yin H., Zhou Y., Ma Q., Ai A., Ju P., Zhu L., Lu L.: Process Biochem. 45, 1707 (2010). 9. Abbaspour A., Ghaffarinejad A.: Electrochim. Acta 55, 1090 (2010). 10. Švorc Ľ., Rievaj M., Bustin D.: Sens. Actuators B 181, 294 (2013). 11. Davidson N., The Biochemistry of the Nucleic Acids, Cox & Nyman, Norfolk, UK 1972.

201

Oxidation Mechanisms of Diflunisal on Glassy Carbon Electrode Chiara Tiribilli a,b, Stefania Giannarelli b, Romana Sokolová a, and Michal Valášek c a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b University of Pisa, Department of Chemistry and Industrial Chemistry, Via Risorgimento, 35, 56126 Pisa, Italy, E-mail: [email protected] c Karlsruhe Institute of Technology (KIT), The Institute of Nanotechnology Hermann-vonHelmholtz-Platz 1, 76344 Eggenstein-Leopoldshafen, Germany Abstract The electrochemical oxidation of diflunisal in acetonitrile was studied on a glassy carbon electrode. Diflunisal yields one irreversible oxidation wave at 1.6 V (vs. Ag/AgCl/1M LiCl electrode). The oxidation mechanism depends on the basicity of the solvent. The study is based on cyclic voltammetry, electroanalytical methods and UV-Vis spectroelectrochemistry. The degradation products were determined by separation techniques (HPLC-DAD, GC-MS). Key words: Diflunisal, Cyclic Voltammetry, Oxidation Mechanism, Electron Transfer, Glassy Carbon. Introduction Voltammetry belongs among methods, which are frequently used for physico-chemical studies as well as analysis of various drugs and bioactive compounds 1-8. Diflunisal (DIF) is a synthetic difluorophenyl derivative of salicylic acid and presents similar analgesic and antiinflammatory activity. It belongs to the non-steroidal anti-inflammatory drug class (NSAID).

Fig 1. Chemical structure of diflunisal. It is used to treat moderate pain and relieve the inflammation, swelling and joint pain associated with rheumatoid arthritis and ostearthis. A comparison of the pharmacological profile of diflunisal with those of some well-known anti-inflammatory drugs (aspirin, ibuprofen, indomethacin) showed that diflunisal is more potent and less toxic than this drugs. It also enhances gastrointestinal tolerance and has a longer duration of action than that of aspirin9-12. Diflunisal is rapidly and completely absorbed after oral administration and the maximum plasma concentration appears between 2 and 3 hours. More than 99% of the drug in plasma is bound to proteins; then it is almost eliminated by Phase II of metabolism 9,12. Several methods have been reported for the assay of diflunisal in its formulations and biological fluids. These methods employed spectrophotometry 13, spectrofluorimetry 14, capillary electrophoresis 15 and chromatographic techniques (HPLC-DAD 16, LC–TOF-MS 17, GC–HRMS 17, GC–MS 17). The redox properties of drugs can give information about their role in metabolic processes or their pharmacological activity 18. Only a few electrochemical studies (DPP 9, DPAdSV 9, AdSV 10) were found in the literature of diflunisal, concerning optimization of methods for the determination of the drug in several biological matrix. To our

202

knowledge, no previously studies have been done about its mechanisms of oxidation. The electrochemical oxidation of hydroxy compounds was extensively studied in the literature. It is often connected with the proton transfer and depends on the presence of proton donors and/or acceptors in the solution 19-21. Experimental Solvent and Reagents Diflunisal (DIF, 2',4'-difluoro-4-hydroxybiphenyl-3-carboxylic acid) was purchased from Sigma-Aldrich, Germany. The procedure for the synthesis of 2',4'-dichloro-4hydroxybiphenyl-3-carboxylic acid (DIC) 22 was modified. Acetonitrile (anhydrous, 99.8%) and pyridine (anhydrous, 99.8%) were purchased from Sigma-Aldrich, Germany. Tetrabutylammonium Hexafluorophosphate (TBAPF6), which was used as the supporting electrolyte, was obtained from Sigma Aldrich and dried before use. All reagents and chemicals were used without any further purification. Methods Electrochemical measurements were done in 0.1 M TBAPF6 in acetonitrile using an electrochemical system for cyclic voltammetry. It consisted of a fast rise-time potentiostat interfaced to a personal computer via an IEEE–interface card (AdvanTech, model PCL–848) and a data acquisition card (PCL–818) using 12 bit precision. Several aliquots of a stock solution of DIF in acetonitrile (3∙10-2 M) were used for the measurements of cyclic voltammetry. A three-electrode electrochemical cell was used with an Ag|AgCl|1M LiCl reference electrode separated from the test solution by a salt bridge. The working electrode was the glassy carbon microelectrode (diameter 0.7 mm). The auxiliary electrode was the platinum wire. Oxygen was removed from the solution by passing a stream of argon. The exhaustive electrolysis and cyclic voltammetry before and after electrolysis were performed using a PGSTAT 12 AUTOLAB potentiostat (Ecochemie, Netherlands). Spectroelectrochemistry was performed using an optically transparent thin-layer electrode (OTTLE) cell 23 with a three electrode system (platinum working and auxiliary electrode, silver quasi reference electrode) mounted in a thin layer (thickness 1.7 mm) between optical windows. The experimental setup is described in reference13. The 1.0 cm quartz cuvettes were used for recording the absorption spectra. The HPLC-DAD system consisted of the Agilent 1260 series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) (binary pump, vacuum degasser and diode array, and fluorescence detector G1315 C/D and G1321B FLD) connected to a computer loaded with Agilent ChemStation Software. A Rheodyne manual injector with a 20 μL loop was used. Effective chromatographic separation was achieved using a Z Zorbax SB-C8 (4.6×250 mm, 5 μm particle size) column with a mobile phase composed of 0.05 M phosphoric acid, acetonitrile, and methanol in the ratio of 40:48:12 (by volume). The mobile phase, filtered by passing through a 0.45 μm pore size membrane filter prior to use, was pumped isocratically at a flow rate of 1 mL/min, and quantification of the analytes was based on measuring their peak areas at 228 nm; the acquisition of DAD spectra was achieved in the range 190–400 nm, 4 nm steps. Five minutes were waited between injections which allowed re-equilibration of the column to the initial conditions. A fluorescence detector was set at λexc 230 nm and λem at 445 nm. The injection volume was 20 μL. All determinations were performed at 25°C. A 6890 gas chromatograph (Agilent Technologies) equipped with a quadrupole mass spectrometric detector (at 150 °C), model 5973N (electron impact 70 eV, ion source 230 °C,

203

interface temperature 280 °C), was used for GC/MS analysis of the reduction products. Electrolyzed samples were dried in a vacuum and the products were separated from the supporting electrolyte by extraction with diethylether. The extract (1 ml) was passed through a ‘Florisil’ cartridge, which was pre-treated with a mixture of dichloro-methane and hexane (ratio 1:2). The column was dried and subsequently eluted with 15 ml of a mixture of dichloromethane and hexane. The resulting solution was reduced in volume to 3 ml and an amount of 2 μl was injected into the GC/MS spectrometer. The chromatographic separation was performed on a 5% phenyl-95% methylpolysiloxane HP-5MS chemical-bonded fused silica capillary column (Hewlett-Packard) of 30 m length, 0.25 mm internal diameter, and 0.25 μm film thickness. Helium of 99.995% purity was used as a carrier gas. The initial temperature was 80 °C, and then a temperature increase of 4 ◦C.min−1 up to 290 °C was applied, followed by an isothermal period of 10 min. The injector (splitless mode) was kept at 250 °C. Results and discussion The stability of diflunisal under ambient conditions The stability of DIF in acetonitrile in the presence of air was tested. The absorption spectrum of the solution of DIF in acetonitrile prepared under inert atmosphere of argon was compared with the absorption spectrum of solution exposed to the air. No change in absorbance was found. Cyclic voltammetry A typical cyclic voltammogram of DIF in acetonitrile is shown in Fig. 2. The anodic scan shows only one oxidation peak at potential 1.6 V. On the reverse scan no complementary peak is observed; this behavior is typical for irreversible chemical reaction couple to the charged transfer 24,25.

Fig. 2. Cyclic voltammogram of 2.4 mM DIF in 0.1 M TBAPF 6 on glassy carbon microelectrode. The scan rate was 0.125 V/s. The influence of the scan rate (ν) and DIF concentration on the oxidative peak current (Ip) or peak potential (Ep) were studied. The peak current changed linearly with DIF concentration. The dependence of the peak potential on concentration gives the slope δEp/δlog cDIF 30 mV/decade. Figure 2 shows cyclic voltammograms of DIF at different scan rates. The peak current changed linearly with scan rate; this shows that the electrode process is controlled by diffusion and that it is not related to adsorption of reactants (Inset of Fig. 3). A counterpeak at 1.4 V corresponding to the reduction of DIF·+ appeared at higher scan rates (see curves d and e in Fig. 3). The electrochemical indications δEp/δlog cDIF = 30 mV/decade and the

204

independency of Ipν-½ on the scan rate suggest the presence of a chemical reaction step following the electron transfer.

Fig. 3. Cyclic voltammograms of 0.6 mM DIF in 0.1 M TBAPF6 on glassy carbon microelectrode at different scan rates: a) 0.065, b) 0.125, c) 0.25, d) 0.50, e) 1.0 V/s. The inset shows the dependence of the peak current on the square root of the scan rate. The influence of the basicity of the solvent was studied by measurements of cyclic voltammograms at different concentration of pyridine (Fig. 4).

Fig. 4. Cyclic voltammograms 0.2 mM DIF in 0.1 M TBAPF6 on glassy carbon microelectrode at different concentrations of pyridine: a) 0, b) 0.02, c) 0.13, d) 0.23, e) 0.45, f) 56.62 mM. The scan rate was 0.125 V/s. Conclusion The oxidation mechanism depends on the presence of dissociation forms in solution. The oxidation peak at 1.6 V decreases and a new peak at 1.11 V increases with the increasing concentration of pyridine. There is no significant shift of their potentials, which indicates that carboxylic group is not involved in the oxidation. The overall oxidation mechanism of dianion of DIF involves the participation of hydrogen.

205

Acknowledgements This work was supported by the Academy of Sciences of the Czech Republic (M200401201) and University of Pisa Funds for Research. References 1. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 2. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal.-Warsaw 52, 911 (2007). 3. Navratil T., Senholdova Z., Shanmugam K., Barek J.: Electroanalysis 18, 201 (2006). 4. Dlaskova Z., Navratil T., Heyrovsky M., Pelclova D., Novotny L.: Anal. Bioanal. Chem. 375, 164 (2003). 5. Hromadova M., Sokolova R., Pospisil L., Lachmanova S., Fanelli N., Giannarelli S.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1647 (2009). 6. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011). 7. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 8. Selesovska R., Bandzuchova L., Navratil T.: Electroanalysis 23, 177 (2011). 9. Beltagi A.M.: J. Appl. Electrochem. 39, 2375 (2009). 10. Sayin F., Kır S.: J. Pharm. Biomed. Anal. 25, 153 (2001). 11. Davies R.O.: Pharmacotherapy 3, 9S (1983). 12. Hanna J., Ruyle W.V., Matzuk A.R., Kelly K.W., Witzel B.E., Holtz W.J., Houser R.A., Shen T.Y., Sarett L.H. ; J. Med. Chem. 21, 11 (1978). 13. Trskova R., Rychlovsky P., Nemcova I., Turek P.: Pharmazie 51, 550 (1996). 14. Pérez-Ruiz T. Martinez Lozano C., Tomas V.: Fres. J. Anal. Chem. 361, 492 (1998). 15. Ding Y., Garcia C.D.: Electroanalysis 18, 2202 (2006). 16. Shaalan R.A., Belal T.S.: Sci. Pharm. 81, 713 (2013). 17. Kioussi M.K., Lyris E.M., Angelis Y.S., Tsivou M., Koupparis M.A., Georgakopoulus C.G.: J. Chromatography B 94, 69 (2013). 18. Gupta V.K., Jain R., Radhpyari K., Jadon N., Agarwal S.: Anal. Biochem. 408, 179 (2011). 19. Hapiot P., Neudeck A., Pinson J., Fulcrand H., Neta P., Rolando, C.: J. Electroanal. Chem. 405, 169 (1996). 20. Eggins B. R., Chambers J. Q: J. Electrochem. Soc. 117, 186 (1970). 21. Sokolová R., Degano I., Bulíčková J., Ramešová Š., Hromadová M., Gál M., Fiedler J., Valášek M.: Electrochim. Acta 56, 7421 (2011). 22. Adamski-Werner, Sara L.; Palaninathan, Satheesh K.; Sacchettini, James C.; Kelly, Jeffery W. J. Med. Chem. 47,355 (2004). 23. Krejčik, M., Danek, M., Hartl, F.: J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. 317, 179 (1991). 24. Torriero A.A.J., Luco J.M., Sereno L., Raba J.: Talanta 62, 247 (2004). 25. Brown, E. R., Sandifer, J.: In Physical Methods of Chemistry: Electrochemical Methods, Rossiter, B. W., Hamilton, J. F., Eds., Wiley: New York, Vol. 2, Chapter 4 (1986).

206

Simultaneous Determination of TBHQ and BHT in Petroleum Products using Linear Scan Voltammetry with a Gold Disc Electrode (Simultánní stanovení antioxidantů TBHQ a BHT v ropných produktech pomocí LSV a zlaté diskové elektrody) Markéta Tomášková and Jaromíra Chýlková University of Pardubice, Faculty Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, 530 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Direct voltammetric determination of antioxidants tert-butylhydroxyquinone (TBHQ) and butylated hydroxytoluene (BHT) in isopropanol containing 0.1 mol L-1 H2SO4 using linear scan voltammetry with gold working electrode was tested. The developed method was purposed for determination of these antioxidants in mineral oil and biodiesel. The samples of mineral oil were extracted using ethanol and the samples of biodiesel were analyzed without any special sample treatment or separation. The electroanalytical method developed has enabled the determination of antioxidants in model and real samples with satisfactory results and good prospects for practical analysis. Key words: Antioxidant, tert-butylhydroquinone, Butylated hydroxytoluene, Voltammetry, Gold disc electrode. Úvod Oleje se využívají v celé řad pr myslových odv tví. Zamezují tření a tím opotřebení namáhaných materiál . Používají se také k chlazení stroj a zařízení. Vzhledem ke zvyšující se kvalit olej se prodlužuje i doba jejich životnosti, což je nanejvýš žádoucí 1,2. Základním procesem stárnutí oleje v motoru je termooxidace. Ta je ješt doprovázena polymerací, kondenzací, termickým št pením, odpařováním složek oleje atd. Jedním ze znak oxidace je také tmavnutí oleje. xidační zplodiny motorových olej vedou k tvorb usazenin na místech, kde je olej v klidu nebo jen v pomalém pohybu, k tvorb lepkavých kal a lak na st nách válce a pístu. Pro zpomalení oxidačních reakcí se do motorových olej přidávají aditiva, tzv. antioxidanty3. Antioxidační účinek vyplývá ze specifické struktury t chto látek. Nejčast ji používanými jsou butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisol (BHA), tertbutylhydroquinone (TBHQ), propyl gallate (PG) and pyrogallol (PA) 4. V praxi bylo zjišt no, že mnohem účinn jší než jedna sloučenina je použití sm si dvou a více antioxidant . V této práci je popsáno voltametrické stanovení sm si TBH a BHT na zlaté diskové elektrod . Tato metoda byla již úsp šn použita pro stanovení BHT5. Byly optimalizovány parametry stanovení TBH a hlavní pozornost pak byla zam řena na experimentální testování této metody při analýze minerálních olej nebo bionafty a na simultánní stanovení TBH a BHT. Experimentální část Všechny použité chemikálie byly analytické čistoty. Standardní roztoky TBH a BHT (4 g.l-1) byly připraveny rozpušt ním vhodného množství TBH (Sigma Aldrich) a BHT (AppliChem) v 96%-ním roztoku etanolu. Pro stanovení obou antioxidant byl použit základní elektrolyt složený z rozpušt né kyseliny sírové (Penta) o koncentraci 0,1 mol.l -1 ve sm si s isopropanolem (Penta). Antioxidanty byly stanovovány v matrici minerálního oleje a bionafty. Reálné vzorky minerálních olej byly extrahovány 96% ethanolem (Penta). Pro odstran ní zbytk oleje z extraktu byl použit bezvodý síran sodný (Sigma Aldrich).

207

Voltametrické analýzy byly realizovány za použití elektrochemického analyzátoru EP 100VA (HSC Servis: Bratislava, Slovensko) v tříelektrodovém uspořádání, které se skládá ze zlaté diskové elektrody (AuDE, Ø 2 mm, HSC Servis, Bratislava, Slovensko) jako pracovní elektrody, Ag/AgCl/3 mol.l-1 KCl elektrody jako referentní a platinového drátku (3x5 mm) jako pomocné elektrody. Všechny analýzy probíhaly v isopropanolu obsahujícím 0,1 mol.l-1 kyselinu sírovou. Vzorky bionafty byly analyzované přímo bez nutných úprav. Antioxidanty stanovované v minerálním oleji musely být izolovány extrakcí ze 4-5 g pomocí 96%-ního etanolu za použití ultrazvukového pole po dobu 10 minut. Po usazení suspenze byla horní vrstva odd lena, zbavena zbytk oleje a analyzována. Výsledky a diskuse Protože v praxi je používána k prevenci proti oxidaci sm s antioxidant , bylo zkoumáno simultánní stanovení TBH a BHT. brázek 1 ukazuje křivky anodické oxidace získané pomocí LSV na zlaté elektrod v isopropanolu obsahujícím 0,1 mol.l-1 H2SO4 jako základním elektrolytu. Byla použita metoda standardního přídavku (byly přidány 2 přídavky) a získány dobře definované píky pro oba antioxidanty. Analyzovaná sm s byla v koncentračním pom ru přibližn 1:1.

Obr. 1. Záznam křivek anodické oxidace TBH a BHT v základním elektrolytu (0,2 ml 48% H2SO4 + 14,8 ml isopropanolu). Exp. podm.: EIN = +0,5 V, EFIN = +1,3 V, rychlost polarizace 40 mV.s-1, Křivka 0 – základní elektrolyt, Křivka 1 – sm s TBH a BHT v základním elektrolytu (koncentrace TBH : 15.3 μg.ml-1, koncentrace BHT: 16,5 μg.ml-1), Křivka 2, 3 – (plná čára) první a druhý přídavek standardního roztoku BHT (16,7 μg.ml-1), Křivka 4,5 – (přerušovaná čára) první a druhý přídavek standardního roztoku TBH (15,5 μg.ml-1). Potenciál maxima píku TBH byl zaznamenán při 0,755 V a BHT při 1,07 V. Dostatečná vzdálenost potenciál píku 0,315 V zcela jasn umožňuje simultánní stanovení antioxidant . Vzorky TBH a BHT o známých koncentracích 15,3 μg.ml-1 pro TBH a 16,5 μg.ml-1 byly opakovan stanoveny. Získané výsledky pro 5 opakovaných stanovení ukázaly, že pr m rné hodnoty (15,4 μg.ml-1 a 16,5 μg.ml-1, resp.) leží v 95%-ním intervalu spolehlivosti a liší se o 0,8% a 0,3% od reálných hodnot. Standardní odchylky byly 0,99 μg.ml-1 pro TBHQ and 1,07 μg.ml-1 pro BHT.

208

Navržená metoda byla nejprve aplikována na simultánní stanovení TBH a BHT ve vzorcích minerálního oleje o známé koncentraci. Tyto modelové vzorky byly připraveny homogenizací známého množství antioxidantu a čisté matrice oleje. V případ tohoto stanovení antioxidant v minerálním oleji bylo pozorováno, že matrice extrahovaného roztoku zp sobuje posun voltametrických křivek studovaných antioxidant k vyšším pozitivním potenciál m (o 245 mV pro TBHQ a 270 mV pro BHT: viz. Obr. 1 a 2), dojde tak k jejich překrytí s pozadím a to znemožňuje jejich správné vyhodnocení. Chyba stanovení byla v tomto případ okolo 15% pro TBH a 20% pro BHT.

Obr. 2. Záznam křivek anodické oxidace TBH a BHT (izolovány z minerálního oleje) v základním elektrolytu (0,2 ml 48% H2SO4 + 14,8 ml isopropanolu). Exp. podm.: EIN = +0,7 V, EFIN = +1,5 V, rychlost polarizace 40 mV.s-1, Křivka 0 – základní elektrolyt, Křivka 1 – sm s TBH a BHT v extraktu minerálního oleje (koncentrace TBH : 2,52 g.kg-1, koncentrace BHT: 2,47 g.kg-1), Křivka 2, 3 – (plná čára) první a druhý přídavek standardního roztoku BHT (16,7 μg.ml-1), Křivka 4,5 – (přerušovaná čára) první a druhý přídavek standardního roztoku TBH (15,5 μg.ml-1). Vzhledem k tomu, že software analyzátoru umožňuje provád t r zné matematické operace, je možné vyřešit tento problém pomocí matematického kroku, který je zobrazen na obrázku 3A pro TBHQ a 3B pro BHT.

Obr. 3. Záznam křivek anodické oxidace sm si antioxidant TBH (A) a BHT (B) v extraktu vzorku minerálního oleje po matematické úprav . Křivka 1,1´ – sm s TBH a BHT v etanolickém extraktu minerálního oleje (koncentrace TBH : 2,52 g.kg-1 a BHT: 2,47 g.kg-1), Křivka 2, 3 – první a druhý přídavek standardního roztoku TBH (15,5 μg.ml-1), Křivka 2´,3´– první a druhý přídavek standardního roztoku BHT (16,7 μg.ml-1).

209

Voltametrické křivky byly rozlišeny po odečtení křivky základního elektrolytu a poté byly derivovány. Tento přístup byl použit na všechny analýzy vzork minerálního oleje. Podobn se postupovalo i u vzork sm sné motorové nafty o známé koncentraci, které byly připraveny rozpušt ním vhodného množství antioxidant a čisté bionafty. Výsledky analýz modelových vzork bionafty i minerálního oleje jsou uvedeny v tabulce I. Tabulka I Výsledky analýz modelových vzork minerálního oleje a bionafty. Deklarované hodnoty koncentrace antioxidant (A) v minerálním oleji: TBH 2,52 g.kg-1; BHT 2,47 g.kg-1 (B) v bionaft : TBH 2,25 g.kg-1; BHT 2,51 g.kg-1. TBHQ BHT Modelový Stanoveno Stanoveno vzorek Chyba [%] Chyba [%] -1 [g kg ] [g kg-1] 2.29 -8.9 2.70 +9.7 2.64 +4.9 2.37 -4.0 MO 2.45 -2.5 2.60 +5.3 2.44 -3.1 2.71 +9.8 2.73 +8.6 2.62 +5.9 2.25 0.0 2.32 -7.6 2.18 -3.1 2.57 +2.5 SMN 2.11 -6.3 2.40 -3.2 2.18 -3.1 2.20 +3.2 2.34 +4.0 2.61 +3.9 * MO – modelový vzorek minerálního oleje; SMN – modelový vzorek sm sné motorové nafty (bionafty) Z hodnot uvedených v tabulce 1 je možné říci, že metoda voltametrického stanovení TBH a BHT poskytuje spolehlivé výsledky i v tak komplikované matrici jako jsou minerální oleje nebo bionafta. Protože množství antioxidant ve vzorcích bylo známé, bylo možné porovnat správnost získaných výsledk . To m žete vid t i v tabulce 1, kde zde nejsou významné rozdíly mezi nalezenými a deklarovanými hodnotami pro množství TBH a BHT v modelových vzorcích. Vypracovaný postup voltametrického stanovení TBH a BHT byl aplikován na čtyři praktické vzorky, které byly poskytnuty výrobcem, a u nichž byl obsah antioxidant deklarován technologickým postupem. Nalezené hodnoty jsou prezentovány v tabulce II. Z ní vyplývá, že u všech vzork byl deklarovaný obsah antioxidantu potvrzen. K dispozici jsme m ly pouze vzorky bionafty, které obsahovaly pouze antioxidant TBH . Tabulka II Výsledky stanovení antioxidanty TBH v praktických vzorcích. Vzorek č. Deklarováno [ppm] Stanoveno * [ppm] 1 100 94.4±2.5% 2 120 122.3±6.3 3 100 94.10±0.89 4 120 122.6±6.2 * Pr m r ze tří stanovení

210

Chyba [%] -5.57 +1.85 -5.86 +2.21

Na základ uvedených hodnot, lze konstatovat, že vypracovaná voltametrická metoda stanovení antioxidant , včetn navrženého postupu vyhodnocení, poskytuje spolehlivé výsledky i v tak složité matrici, jako jsou sm sná motorová nafta či minerální olej a m že být použita v laboratořích zabývajících se efektivním využitím maziv a pohonných hmot. Závěr V rámci provedených experimentálních prací bylo možné navrhnout a ov řit metodu voltametrického stanovení fenolických antioxidant TBH a BHT ve sm sné motorové naft a minerálních olejích. Z předložené práce vyplynulo, že voltmetrické stanovení syntetických fenolických antioxidant provád t v prostředí organického rozpoušt dla - isopropanolu za přítomnosti 0,1 mol.l-1 H2SO4 s využitím zlaté indikační elektrody a metody LSV, která je pro analyzované koncentrace dostatečn citlivá. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu SGFChT05/2014. Literatura 1. Veselý V., Mostecký J. et al.: Petrochemia. Nakl. Alfa, Bratislava 1989. 2. Mat jovský V.: Automobilová paliva. Grada Publishing, Praha 2005. 3. Straka B.: Motorové oleje a tribotechnická diagnostika naftových motor . Nakladatelství dopravy a spoj , Praha 1986. 4. Karavalakis G., Hilari D., Givalou L., Karonis D., Stournas S.: Energy 36, 369 (2001). 5. Chýlková J, Tomášková M, Mikysek T, Šelešovská R, Jehlička J.: Electroanalysis 24, 1374 (2012).

211

Rapid and Sensitive Determination of Metformin in Human Urine and Serum by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection (Rychlé a citlivé stanovení metforminu v lidské moči a séru pomocí kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí) a

Petr T ma a, Jana Fauknerová Mat jčková a, Vlastimil Jurka b, and Eva Samcová a Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, CZ-100 00 Prague 10, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Physics, Academy of Sciences of Czech Republic, Cukrovarnická 10/112, CZ162 53 Praha Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected]

Abstract Capillary electrophoresis with contactless conductivity detection has been used for direct determination of the antidiabetic drug metformin in human urine and serum. Metformin is separated in 2 M acetic acid as background electrolyte. The monitoring of metformin levels in urine is performed on the short separation path under high electric intensity. Under these conditions, the migration time of metformin is 35 s and the limit of detection is 0.3 µM. Urine samples are 50-fold diluted by 0.01 M HCl and hydrodynamically injected into the capillary in low amount. A method of large volume sample stacking has been developed for the monitoring of plasma levels of metformin. Serum samples treated by acetonitrile are injected into the capillary in large amount and after switching on the separation voltage the undesirable acetonitrile is forced out of the capillary. This technique reduces the limit of detection to 0.03 µmol/L. Key words: Capillary electrophoresis, Contactless conductivity detection, Large volume sample stacking, Metformin. Úvod Metformin (Obr. 1) je orální antidiabetikum ze skupiny biguanid . Metformin je v současnosti první volbou léčby diabetu 2. typu a předepisuje se primárn lidem s nadváhou (www.idf.org). Klinická studie prokázala, že desetileté podávání metforminu u obézních diabetik redukuje závažné zdravotní komplikace a mortalitu o 30% více ve srovnání s léčbou inzulínem a sulfonylureou 1. Podávání metforminu u obézních diabetik a diabetik s nadváhou navíc nepřispívá k dalšímu r stu jejich t lesné hmotnosti 2. Metformin je v současnosti nejrozšířen jším antidiabetikem a pouze v USA bylo v roce 2010 předepsáno 48 milion balení 3. Přirozeným zdrojem drog ze skupiny biguanid je rostlina Galega officinalis 4. Pro účely současné medicíny se ovšem metformin vyrábí synteticky 5. Pro kontrolu čistoty léčiv, stanovení metforminu v rostlinných přípravcích a v klinických vzorcích byla vyvinuta celá řada analytických metod založených na HPLC s UV detekcí; HPLC-MS; GC-MS a dalších. Tento přísp vek je zam řen na vývoj velmi rychlého kapilárn elektroforetického (CE) stanovení metforminu v lidské moči a séru. Úprava moče i séra před CE analýzou je velmi jednoduchá a spočívá pouze v řed ní t lní tekutiny popřípad deproteinizaci vzorku. Vysoká citlivost stanovení při použití univerzální bezkontaktní vodivostní detekce (C4D) 6 je založena na separaci v krátké kapiláře, kde je eliminováno nadbytečné rozmytí vzorku a dále na on-line prekoncentraci vzorku pomocí vysokého dávkování vzorku do kapiláry (large volume sample stacking).

212

Obr. 1. Struktura metforminu. Experimentální část Elektroforetická m ření byla provedena na elektroforetickém přístroji HP3DCE systém (Agilent Technologies, aldbronn Germany) vybaveným C4D, který je zabudován do elektroforetické kazety a termostatován na 25C. Všechny analýzy vzork moči a séra byly provedeny v křemenné kapiláře s vnitřním pr m rem 50 µm a celkovou délkou 31,7 cm. Pro zastavení elektroosmotického toku byla kapilára pokryta pomocí INST roztoku (Biotaq, U.S.A.). Separace metforminu byly provedeny v optimalizovaném základním elektrolytu o složení 2,0 M kyselina octová (pH 2,15). C4D je umíst n v elektroforetické kazet asymetricky ke konc m kapiláry, 17,0 cm od jednoho konce (označen jako dlouhý konec) a 14,7 cm od druhého konce (označen jako krátký konec). Pro stanovení metforminu v moči (i) a séru (ii) byly vyvinuty dv rozdílné metody: i. Vzorky moči řed né vodou byly dávkovány do krátkého konce kapiláry v malém množství (tlak 50 mbar po dobu 2 s, odpovídá délce zóny vzorku v kapiláře 2.3 mm). Po nadávkování bylo zapnuto separační nap tí +30 kV a současn s tím byla zóna vzorku vytlačena ven z kapiláry aplikací negativního tlaku. Hydrodynamický impuls použitý k vytlačení zóny vzorku z kapiláry je stejný jako impuls dávkovací, 100 mbar.s. Po zapnutí separačního nap tí kationty metforminu i ostatní ionty rychle vycestují ze zóny vzorku a následn je zbylé rozpoušt dlo ze zóny vzorku vytlačeno ven z kapiláry. V případ , kdy nebyla zóna vzorku vytlačena z kapiláry, docházelo k přerušení elektroforetického proudu b hem separace. – Zóna vzorku po vycestování iont představuje velký odpor pro pr chod elektrického proudu a zapříčiní přerušení separace. ii. Vzorky séra deproteinizované acetonitrilem byly dávkovány do dlouhého konce kapiláry ve velkém množství (tlak 50 mbar po dobu 20 s, odpovídá délce zóny vzorku 22,9 mm). Poté bylo zapnuto separační nap tí +20 kV a současn s tím je zóna acetonitrilu vytlačována ven z kapiláry aplikací negativního tlaku -50 mbar po dobu 20 s. Metformin op t vycestuje ze zóny acetonitrilu do okolního BGE, která by bez odstran ní představovala překážku pro pr chod elektrického proudu. Vzorky diabetické moči a séra byly získány na II. interní klinice fakultní nemocnice Královské Vinohrady. Diabetickému pacientovi byl podáván hydrochlorid metforminu v množství 1000 mg/den. Vzorky moči byly před analýzou 50krát řed ny 0,01 M HCl. Vzorky séra byly deproteinizovány acetonitrilem; k 100 µl séra bylo přidáno 300 µl acetonitrilu okyseleného HCl v množství 0,01 mol/l. Po protřepání byla sm s zfiltrována (Durapore centrifugal filter devices, velikost pór 0,45 µm, Millipore, USA) a použita k CE analýze. Výsledky a diskuse Metformin je báze s hodnotami disociačních konstant 2,8 and 11,5 a v kyselém BGE migruje jako kation. Z tohoto d vodu byly pro CE separace metforminu testovány roztoky kyseliny 213

octové (HAc). V roztocích HAc byly dříve provedeny úsp šné separace aminokyselin 7, neurotransmiter 8 a biogenních amin 9, které svou bazickou povahou připomínají metformin. Navíc C4Ds vykazují v BGEs založených na HAc nízký šum a vysokou stabilitu základní linie. Složení BGE bylo optimalizováno přímo při separacích vzork diabetické moče. Z testovaného koncentračního rozmezí 0,1 až 4,0 M HAc bylo nejlepších výsledk dosaženo v 2,0 M HAc. V tomto BGE dochází k úplnému odd lení metforminu od anorganických kationt přítomných v moči. Pík metforminu nekoliduje ani s žádnou mikrosložkou přítomnou v moči, což bylo ov řeno při separacích r zných vzork fyziologické moče, kdy se v pozici metforminu nenachází žádný jiný pík (Obr. 2). Metformin v dávkách, v kterých se používá u diabetických pacient , představuje dominantní složku moče. Z tohoto d vodu byl vývoj CE stanovení metforminu v moči sm rován k provád ní rychlých rutinních analýz. Separace je provád na na krátké efektivní separační dráze 14 cm, při vysoké hodnot separačního nap tí 30 kV a nízkém dávkování vzorku (100 mbar.s). Za t chto podmínek je migrační čas metforminu 35 s a hodnota separační účinnosti 116000 m-1 pro vzorek diabetické moče s obsahem metforminu 3,2 mmol/l. Další předností této metody je současné stanovení kreatininu s dobou migrace 45 s, na jehož koncentraci se ostatní analyty v moči přepočítávají pro korekci rozdílné diurézy.

Obr. 2. Elektroferogram fyziologické moče (A) a moče diabetického pacienta se stanovenou koncentrací metforminu 3,2 mmol/l (B). Detail (C): kontrolní fyziologická moč před (c1) a po přídavku metforminu 10 µmol/l. Identifikace pík : metformin (1) a kreatinin (2). Stanovení metforminu v séru představuje složit jší úkol, protože koncentrace metforminu v séru diabetik je cca 1000krát nižší v porovnání s močí. Z tohoto d vodu byl vývoj metody sm rován k dosažení nízkých hodnot L D za použití vysokého dávkování vzorku. 10krát vyšší dávkování vzorku séra v porovnání se vzorkem moči vede k hodnot L D 0,03 µmol/l. I za t chto dávkovacích podmínek je pík metforminu dobře odd len od ostatních složek séra, především anorganických iont a bazických aminokyselin. Z detailního elektroferogramu fyziologického vzorku séra spikovaného 1,0 µM přídavkem metforminu je patrné (Obr. 3), že metformin op t nekoliduje s žádným jiným píkem přítomným v séru. Použití vysokého dávkování vzorku je spjato s potlačením vodivosti séra přídavkem acetonitrilu, v jehož prostředí kationt metforminu rychle migruje a zaostřuje se při vstupu do okolního BGE o vysoké vodivosti 10. Zónu acetonitrilu je poté nutno z kapiláry odstranit, aby nedocházelo přerušení separace nebo k nežádoucímu prodloužení migračního času. Za zde uvedených podmínek bylo úsp šné odd lení metforminu od ostatních složek séra provedeno na krátké efektivní separační dráze 17 cm při nap tí 20 kV s dobou separace 86 s. Hodnota separační účinnosti v séru je velmi vysoká, 490000 m-1. To souvisí s dobrým zaostřením velkého

214

dávkovaného objemu vzorku do úzké zóny a také s nízkou koncentrací metforminu v séru (cca 4,0 µmol/l). Stanovení je navíc vysoce citlivé, jak dokládá 1,0 µM přídavek metforminu k séru, který je velmi dobře odlišen od hladiny šumu C4D.

Obr. 3. Elektroferogram fyziologického séra (A) a séra diabetického pacienta se stanovenou koncentrací metforminu 4,4 µmol/l (B). (A1): fyziologické sérum s přídavkem 1,0 µM metforminu. Závěr Elektroforetické separace provád né na krátké separační dráze umožňují dosáhnout migračních čas do 1 min i při použití nespecializovaných komerčních přístroj CE. Tyto rychlé separace jsou vhodné pro rutinní stanovení farmak v rozsáhlých souborech klinických vzork . Pro detekci celé řady biogenních analyt lze použít univerzální bezkontaktní vodivostní detekci namísto finančn náročné hmotnostní detekce. Citlivost CE-C4D stanovení lze n kolika násobn zvýšit provád ním prekoncentrace vzorku přímo v kapiláře. Zavedení následného vytlačení nežádoucího rozpoušt dla ze zóny vzorku přispívá k dosažení vysoké rychlosti separace a současn zlepšuje opakovatelnost stanovení. CE-C4D je tak velmi vhodnou alternativou k široce rozšířené HPLC-MS a pro mnohé biomedicínské aplikace nabízí celou řadu výhod. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Univerzity Karlovy projekt PRVOUK P31 a UNCE 204015. Literatura 1. Group U.P.D.S.: Lancet 352, 854 (1998). 2. Selvin E., Bolen S., Yeh H., et al.: Arch. Intern. Med. 168, 2070 (2008). 3. Informatics I.I.f.H., The Use of Medicines in the United States: Review of 2010, New York, 2011. 4. Bailey C.J., Day C.: Pract. Diab. Int. 21, 115 (2004). 5. Werner E.A., Bell J.: J. Chem. Soc., Trans. 121, 1790 (1922). 6. Kuban P., Hauser P.C.: Electrophoresis 34, 55 (2013). 7. Tuma P., Malkova K., Samcova E., Stulik K.: J. Sep. Sci. 33, 2394 (2010). 8. Tuma P., Soukupova M., Samcova E., Stulik K.: Electrophoresis 30, 3436 (2009). 9. Gong X.Y., Hauser P.C.: Electrophoresis 27, 4375 (2006). 10. Tuma P., Sustkova-Fiserova M., Opekar F., Pavlicek V., Malkova K.: J. Chromatogr. A 16, 94 (2013).

215

Application of Cyclopentenediones for Preparation of Permselective Layers (Využití cyklopentendionů pro přípravu permselektivních vrstev) Jan Vacek a, Jan Hrbac b, Pavel Matejka c, and Jan Storch d Department of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University, Hnevotinska 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic, b Department of Physical Chemistry, Palacky University, tr. Svobody 26, 771 46 Olomouc, Czech Republic c Department of Physical Chemistry, Institute of Chemical Technology, Prague, Technická 5, 166 28 Prague 6, Czech Republic d Institute of Chemical Process Fundamentals of the AS CR, v.v.i., Praha 6,165 02, Czech Republic, E-mail: [email protected] a

Abstract In this contribution, we report that electrooxidation of PCD, phenolic cyclopentenedione, 2,2′-bis[4,5-bis(4-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-cyclopent-4-ene-1,3-dione] results in the formation of stable films with permselective properties on metal and carbon surfaces. The electropolymerization process proceeds in neutral and alkaline aqueous medium at potentials higher than +0.6 V (vs. Ag/AgCl/3M KCl). The PCD polymer prepared was characterized by electrochemical methods, quartz crystal microbalance and optical spectroscopy techniques. The PCD film can be used for electrode coating and preparation of an anti-interference barrier. Thus, we performed SAR study which could open the door to developing novel functional films and electrochemical tools for bioactive compounds sensing. Key words: Cyclopent-4-ene-1,3-dione, Structure-activity Relationship, Bioactives sensing. Introduction Functional barriers and development of permselective layers (films) are important goals for many applications in chemistry today, e.g. analytical chemistry, energy conversion, biochemistry and industrial chemistry in general. Compact permselective layers, directly fabricated onto the electrode surface are used to suppress the access of the interfering species. The selectivity is mainly provided on the basis of molecular weight, charge and hydrophobicity or hydrophilicity differences among the analyte and several interfering molecules which pass or do not pass through the layer. To prepare anti-interference barriers two experimental approaches can be used, the first one being “solvent casting” and the second approach is electrosynthesis. In the view of analytical chemistry, electrodes equipped with permselective films are used for the electrochemical analysis of biologically active compounds. The elimination of interferences during the determination of basal metabolites and selected bioactives is one of the most noteworthy applications of permselective layers. Owing to the broad spectrum of applications of these compact layers, new compounds for their preparation are being designed. Here, we focus on preparation of novel phenolic cyclopentenedione (PCD) based polymeric permselective layer using carbon, gold and platinum as solid supports. This study was aimed at (a) developing a procedure for the preparation of PCD layer by electropolymerization, (b) characterization of PCD layer prepared, (c) evaluating of the stability and applying of PCD permselective layer for bioactives (e.g. dopamine) amperometric sensing, and (d) performing the SAR study for finding of CPD compounds useful for electropolymerization process and novel functional films preparation.

216

Experimental The PCD used in this study (2,2′-bis[4,5-bis(4-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyphenyl)cyclopent-4-ene-1,3-dione]), also known as nostotrebin 6 (Fig. 1A), was isolated and purified according to previously published protocol 1. Ascorbic acid (AA) and paracetamol (PA) were purchased from Sigma Aldrich (USA). Sodium nitrite was obtained from Lachema (Czech Republic). Dopamine (DA) and uric acid (UA) were purchased from Fluka (Germany). PBS solution (0.05 M NaCl and 0.05 M Na2HPO4 and NaH2PO4) at pH 7.4 was used as supporting electrolyte. Voltammetric analysis was performed using the CH-Instruments Model 660C electrochemical workstation in three-electrode configuration. Ag/AgCl/3M KCl was used as a reference electrode, and Pt-wire served as an auxiliary electrode. The range of working electrodes used in this study included CHI101 gold, CHI102 platinum and CHI104 glassy carbon electrode. A custom-made carbon fiber microelectrode (CFE) was prepared as described in ref. 2. EQCM measurements were performed on CH-Instruments 440C apparatus using gold coated quartz crystals. The signal is expressed as Δf = f − f(ref), i.e. frequency change relative to reference crystal. Fourier transform Raman spectra were acquired using Equinox 55/S (Bruker, Germany) spectrometer equipped with FRA 106/S Raman module (Bruker). Samples were irradiated by the Nd-YAG laser beam (1064 nm, 50 mW, Coherent, USA). The spectra were collected and processed using the OPUS 4.0 (Bruker) software. The electrodeposition was performed on electrochemically gold coated platinum electrodes (7 mm side, 0.3 mm thickness of Pt, thickness of Au layer ca. 2 μm). Fourier transform infrared (FTIR) spectra were collected using Nicolet 6700 (Thermo Scientific) spectrometer equipped with single-bounce attenuated total reflection (ATR) accessory MIRacle based on ZnSe crystal. The spectra were processed using the Omnic 8.2 (Thermo Scientific) software. The electrodeposition was performed on gold foils (thickness 0.1 mm). Relative standard deviation (RSD) for the preparation of PCD permselective layer was evaluated with six PCD-modifications of one gold electrode prepared independently and tested to 50 μM DA in the presence of 10 mM AA. For intra-day reproducibility measurement, DA was analyzed after 1 h periods in a mixture of various concentrations of AA (1–10 mM). In case of inter-day reproducibility, DA was measured in the presence of AA for 14 consecutive days.

Results and Discussion Cyclic voltammograms of PCD (for chemical structure see Fig. 1A), obtained on glassy carbon electrode (GCE) in PBS at v = 100 mV s− 1, are characterized by a broad peak around + 0.6 V (Fig. 1B, line 1). The complex irreversible anodic reaction probably proceeds via hydroxyl groups and this is in agreement with previously published results on structurally similar substances 3. In the second and subsequent scans, the current of the oxidation peak sharply decreased, indicating the polymerization process and the film formation (Fig. 1B).

217

Fig. 1. Structure of the PCD unit used in the study, formerly called nostotrebin 6 (A). Cyclic voltammograms of 0.1 mM PCD in PBS at glassy carbon electrode (B). In addition to GCE, similar behavior was observed for gold and also platinum electrodes. For all experiments in the study, PCD film was prepared onto electrode surfaces after bareelectrode immersion into PBS containing 0.1 mM PCD and potential cycling from 0 to + 0.9 V at v = 1000 mV s−1 for 60 s. Then the electrode was washed by distilled water and used for other experiments. The 0.1 mM PCD was used corresponding to fully saturated solution under the conditions used. At higher concentrations, limited solubility of the PCD monomer was observed. The formation of PCD layer can be found only in aqueous environment. The formation of PCD layer was studied by electrochemical quartz crystal microbalance (E CM), Fourier transform Raman spectroscopy and reflection infrared (FTIR) spectroscopy. The E CM experiment was based on the frequency decrease occurring when the mass of the oscillating gold coated quartz crystal is increased. The observed decrease in frequency of the quartz crystal in PBS electrolyte containing PCD, at potentials higher than +0.6 V, confirmed the formation of the film. Similar polymerization phenomena occurring for (poly)hydroxylated compounds has been confirmed by several authors, ref. 3. Raman spectra of solid monomeric form of PCD and also PCD layer after electropolymerization on gold surface were compared to corresponding FTIR data. The spectral data indicate that for the polymeric form of PCD: (i) the enhancement of characteristic bands of CH2 groups is evident, (ii) aromatic ring vibrations exhibit only negligible shifts and (iii) cyclopentenedione ring modes are changed markedly. The spectral changes in cyclopentenedione skeleton observed after electropolymerization indicate initial adsorption onto gold electrode surface via the electron-rich carbonyl groups. Subsequently, anodic reaction of the most sterically accessible phenolic moieties gives rise to oxidative coupling (C–C) and hence polymer formation. The formation of p-substituted oxo groups instead of a certain fraction of hydroxyl groups, additional hydroxylation processes and C-O oxidative coupling cannot be fully neglected. The structure will be further elucidated also with respect to the participation of cyclopentenedione rings in the polymerization process probably occurring at higher potentials of oxidation, which is manifested as CH2 bands enhancement in Raman and FTIR spectra after PCD polymerization 4. During the investigation of PCD electrochemical behavior and characterization of PCD polymeric film by the above approaches, we also focused on the functionality evaluation of the PCD film. It was found that the PCD polymeric layer formed onto carbon surface gives

218

Inter-day reproducibility of DOPA response (%)

Intra-day reproducibility of DOPA response (%)

unique permselectivity for dopamine (DA). Given that DA is a target molecule in neuroscience, the PCD layer was prepared onto cylindrical carbon fiber microelectrodes (CFEs) which were prepared and pretreated according published protocol 2. In contrast to cationic DA, the PCD layer deposited on the CFE prevents oxidation of anionic and neutral interfering species and such as ascorbate (AA), uric acid (UA), paracetamol (PA) and nitrite. DA can therefore be determined amperometrically in significant excess of easily oxidizable species. 120

A

107

109

108

107

107

105

104

103

101

7 mM AA; 50 µM DA

8 mM AA; 50 µM DA

9 mM AA; 50 µM DA

10 mM AA; 50 µM DA

100

100

80

60

40

20 Control 0 1mM AA

1 mM AA; 50 µM DA

2 mM AA; 50 µM DA

3 mM AA; 50 µM DA

4 mM AA; 50 µM DA

5 mM AA; 50 µM DA

6 mM AA; 50 µM DA

120

B

100

100

100

95

97 88

85

83 80 60 40 20 0 1

2

7

8

9

10

Day

14

Fig. 2. (A) Intra- and (B) inter-day reproducibility measurement for 50 µM dopamine (DOPA) in presence AA (10 mM if not stated otherwise) by using DPV at PCD-modified gold electrode (n=3 for each measurement; average values are presented). For amperometry at CFE, PBS (pH 7.4) was used as supporting electrolyte and a constant potential of + 0.4 V was applied. The detection limit was estimated to be 50 nM for S/N = 3 and the current response of DA was linear (R2 = 0.999, Y = 0.63X − 0.13 (nA dm3/μmol)) from 50 nM to 30 μM. The permselective properties of PCD layer were also studied on gold electrode by differential pulse voltammetry (DPV). The dependence of peak height vs. concentration of DA was linear in the concentration range from 50 nM to 5 μM (R2 = 0.993, Y = 6.4 × 10− 3X + 1.5 × 10− 2 (A dm3/mol)). The permselectivity is most probably driven by a charge exclusion mechanism for DA because the addition of high concentration of NaCl leads to lack of selectivity for DA in the presence of AA excess. This effect is highly probably connected to elimination (unmasking) of charge exclusion properties of formed PCD film (deposit). The key contribution of the

219

other exclusion mechanism is improbable because of quite similar molecular weight and the hydrophilic nature of tested analytes. Finally, the stability of PCD film was tested as a function of permselectivity for DA in the presence of interfering AA using gold electrode and DPV. RSD for the preparation of PCD permselective layer was ± 1.3% (n = 6). Intra-day reproducibility was 105% with RSD ± 2.9%. For inter-day measurements, a reproducibility of 93% with RSD ± 6.5% was found (Fig. 2). A very similar stability and reproducibility can also be found for carbon electrodes. c b

c a

b n

ELECTRODE Fig. 3. Schematic representation of CPD based polymeric layer formed onto electrode surface. a – strongly adsorbed CPD skeleton, b – components for polymerization process, c – modifications for functionality, e.g. hydrophobicity/hydrophilicity. Conclusion Electrochemically prepared functional films onto solid surfaces represent an interesting topic in current chemico-physical research. One possibility for preparing films with specific permselective properties is application of PCD. Electrooxidation of PCD around + 0.6 V (vs. Ag/AgCl, 3 M KCl) leads to the formation of stable film onto metal and carbon surfaces that has been fully characterized under aqueous conditions 4. This finding could open a new area in preparation of PCD-based films with different functionality (Fig. 3). Thus, we performed SAR study to developing novel tailored functional films and electrochemical tools for bioactive compounds sensing. Acknowledgements This work was supported by the Ministry of Industry and Trade of the Czech Republic (FRTI4/457). References 1. Vacek J., Hrbac J., Kopecky J. Vostalova J.: Molecules 16, 4254 (2011). 2. Halouzka V., Hrbac J., Jirovsky D., Riman D., Jakubec P., Bartosova Z., Masek V., Mojzes P., Vacek J.: Curr. Anal. Chem. 9, 305 (2013). 3. Zatloukalova M., Kren V., Gazak R., Kubala M., Trouillas P., Ulrichova J., Vacek J.: Bioelectrochemistry 82, 117 (2011). 4. Hrbac J., Jakubec P., Halouzka V., Matejka P., Pour M., Kopecky J., Vacek J.: Electrochem. Commun. 38, 53 (2014).

220

Ionic Liquids and Protein Electroanalysis (Iontové kapaliny a elektroanalýza proteinů) Jan Vacek a, Jiří Vrba a, Martin Kubala b, and Martina Zatloukalová a Department of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University, Hnevotinska 3, 775 15 Olomouc, Czech Republic b Department of Biophysics, Faculty of Science, Palacky University, 17. listopadu 12, 771 46 Olomouc, Czech Republic, E-mail: [email protected] a

Abstract This study focuses on application of room temperature ionic liquids (ILs) as solubilizers, adsorption solvents and supporting electrolytes for electrochemical analysis of proteins. The proteins, BSA and HSA, were analyzed by adsorptive transfer square-wave voltammetry at carbon electrode where oxidation currents of Tyr and Trp residues of the proteins were observed. The electrochemical data were supported by denaturing and native electrophoresis. The data acquired using BSA and HSA model proteins, could be used in further applications of ILs for protein solubilization, protein electrochemistry and developing new protein sensing strategies. Key words: Ionic liquids, Electroanalysis, Protein, Imidazolium, Ammonium salts. Introduction Room temperature ionic liquids (ILs) are organic salts with low melting points, low vapor pressure, good stability and high conductivity. ILs exist in the liquid state under ambient laboratory conditions which enable their use in many chemistry and biochemistry fields, including protein research. They also have a broad spectrum of electrochemical applications 1. In this study, we focus on the application of ILs for protein solubilization, adsorption and application as electrolytes in electrochemical measurements. For this purpose, human serum and bovine serum albumins, HSA and BSA, were used as model proteins. Both proteins were characterized using several spectral and/or electrochemical methods, based on intrinsic electroactivity measurement in aqueous buffered solutions 2. One way of analyzing proteins is through the anodic reactions of aromatic amino acid residues in polypeptide chain, namely Tyr (Y) and Trp (W) residues, at carbon electrodes 2. The study aimed at (a) investigating the electrochemical oxidation of HSA and BSA after solubilization and adsorption using ILs, (b) analyzing and discussing the stability of the proteins after solubilization in ILs, and (c) testing ILs as supporting electrolytes in the anodic voltammetry of proteins. Experimental Proteins and buffer components were obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, USA). All solutions were prepared using reverse-osmosis deionized water (Ultrapur, Watrex, CZ). The proteins were solubilized using the following ILs [purity in %]. Ammonium-based ILs: ethylammonium nitrate [>97%] and 2-hydroxyethylammonium formate [>97%]. Imidazolium-based ILs: 1-ethyl-3-methylimidazolium ethylsulfate [99%]; 1-butyl-3methylimidazolium dicyanamide [98%]; 1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate [98%]; 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate [>95%]. ILs were donated by Ionic Liquids Technologies GmbH (Heilbronn, DE).

221

The proteins were analyzed using ex situ (adsorptive transfer) voltammetric analysis with a basal-plane pyrolytic graphite working electrode, PGE (9 mm2, source of PG: Momentive Performance Materials, USA). PGE was first dipped into 5-μL aliquot of the studied sample. After an accumulation period, the electrode was washed by deionized water and placed in an electrochemical cell containing supporting electrolyte. Square-wave voltammetry (SWV) was performed at room temperature with a μAutolab III analyzer (Metrohm Autolab, NL) in a three-electrode setup with Ag/AgCl/3 M KCl electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode. Other parameters: time of accumulation, tA = 30 s, supporting electrolyte: acetate buffer (pH 5.0), frequency: 200 Hz. The stability of the proteins were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and by nondenaturing (native) PAGE. SDS-PAGE was performed according to Laemmli and nondenaturing PAGE employed a system developed by Ornstein and Davis. Proteins in the gels were visualized by Coomassie blue staining. For other details see ref. 3. Results and Discussion BSA and HSA, used as model proteins, were electrochemically examined after their accumulation onto PGE surface using the ex situ SWV method. The ILs were used either as a medium for protein solubilization and adsorption or as a supporting electrolyte. First, we focused on the usability of ILs for HSA and BSA solubilization and adsorption for ex situ SWV measurement. The dissolved proteins (final conc. 10 μM) were adsorbed onto the PGE surface. After formation of the adsorbed layer, the electrode was washed with distilled water, dried and placed in an electrochemical cell, where SWV was performed in 0.2 M acetate buffer (pH 5.0). The scan was performed from 0 V to +1.5 V as described previously 3. Using these conditions for sample adsorption, the PGE surface was always fully covered by the analyzed proteins. Table I Tyrosine and tryptophan residues in HSA and BSA. Protein Total Tyr (Y) Trp (W) HSA 18 1 BSA 20 2

Surface exposed Tyr (Y) Trp (W) 9 0 12 0

The proteins dissolved and adsorbed from the Britton–Robinson buffer (pH 7.4), in the absence ILs, exhibited SWV oxidation peaks Y&W at potential around +0.8 V. In proteins, this anodic peak is assigned to the oxidation of Tyr (Y) and Trp (W) residues. HSA and BSA contain in total 18 Y and 1 W and 20 Y and 2 W, respectively (Table I). Generally, it is considered that intrinsic protein electroactivity is caused by the electroactive amino acid residues that are, after protein adsorption, in direct contact with an electrode surface. Hence, it may be assumed that only the residues localized on a protein surface can be oxidized. It is very likely that only Tyr residues contribute to the current response because the Trp residues are localized in the protein interior or in the cavities that are accessible from the solvent only by a narrow tunnel. Based on the high-resolution structures, we can identify 9 Tyr in HSA and 12 Tyr in BSA on the protein surface (Table I). The contribution of Trp residues to anodic response cannot be strictly excluded, especially in cases where experimental conditions involve significant structural changes of the proteins.

222

Further, both proteins were solubilized and adsorbed from the ILs/water mixture under the same conditions as described above. All six examined ILs were used for this purpose; however, ILs competed for the electrode surface with the analyzed proteins. Hence, we observed the peak Y&W decrease due to co-adsorption processes. SW voltammograms of HSA and BSA solubilized and adsorbed in 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate/water or ethylammonium nitrate/water (80:20, v/v) mixtures are shown in Fig. 1. 60

60

45 30

B

H3C

N

N

+

H3 C

O

Current (µA)

Current (µA)

A

O -

CH 3

Ele

Peak Y&W

15 0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

Potential (V)

H3C

45

NH 3

+

NO 3

30

-

Peak Y&W

Ele

15 0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

Potential (V)

Fig. 1. Ex situ SW voltammograms of HSA (full line) and BSA (dashed line) after solubilization in 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate-water (A) and ethylammonium nitratewater (B) solutions (80:20, v/v); concentration of proteins: 10 μM; supporting electrolyte: 0.2 M acetate buffer, pH 5.0. The co-adsorption effect of IL vs. studied protein was examined with various IL/water ratios. In addition to the quantitative effects connected with the co-adsorption processes, we also examined changes in the potential of oxidation peaks of HSA and BSA. With increasing amounts of ILs in the sample, we observed a small but proportional shift of the Y&W peak toward less positive values. This observation indicates that the presence of ILs facilitates the protein electrooxidation, which may be due to the good conductive properties of ILs. An alternative explanation could be some partial IL-modification of the PGE surface or modification of the protein structure, i.e. stabilization of adsorbed film that may facilitate the anodic reaction. For interpretation of these results and also to check for protein integrity, we analyzed the HSA and BSA after their incubation with the ILs using gel electrophoresis. Electrophoretic separation was performed under both denaturing (sodium dodecyl sulfate, SDS) and nondenaturing (native) conditions. The results of PAGE confirmed that ILs application does not cause aggregation, fragmentation or structural changes of the studied proteins, which could affect their electrophoretic mobility. Finally, we studied the possible use of ILs as a supporting electrolyte for the SWV of proteins. HSA and BSA were first accumulated onto the PGE surface from Britton–Robinson buffer (pH 7.4), subsequently washed, dried and placed in an electrochemical cell containing IL electrolyte. All tested IL electrolytes were useful for electrochemical oxidation of both proteins. Due to substantially different pH and other physico-chemical parameters of examined ILs, the Y&W peak of both HSA and BSA was observed at different potentials (Table II). Our results suggested that the pH of tested ILs is the driving factor affecting the peak Y&W potential for both proteins. Increasing pH of the supporting electrolyte, shifts the potential peak Y& toward less positive values, by −55 mV per pH unit. The pH effects presented here were obtained in a series of experiments with Britton-Robinson buffer in the 223

pH range 3–12. Shifts of peak Y&W potentials recorded for the aqueous buffered electrolyte correspond very well to the results obtained using ILs electrolytes 4. Table II The potentials of SWV peaks Y&W of HSA and BSA in 0.2 M acetate buffer (pH 5.0) and selected ILs. Average values of potentials (n=6) are expressed vs. Ag/AgCl/3M KCl. The standard deviations (S.D.) were less than ±3 mV for all potentials. Electrolytes pH Peak Y&W potential (V) HSA BSA Acetate buffer, 0.2 M 5.0 0.908 0.925 1-Ethyl-3-methylimidazolium ethylsulfate 7.6 0.772 0.786 1-Ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate 3.9 0.943 0.896 1-Ethyl-3-methylimidazolium acetate 12.1 0.518 0.552 1-Buthyl-3-methylimidazolium dicyanamide 8.5 0.645 0.694 Ethylammonium nitrate 4.5 0.864 0.874 2-Hydroxyethylammonium formate 7.0 0.843 0.850 Conclusion This study focused on the applicability of selected ILs with the imidazolium or ammonium cation for solubilization of model proteins HSA and BSA. We examined the adsorption of these proteins from ILs onto PGE surface and also electroooxidation of the adsorbed protein layer in the IL environment. Our results show that 1-ethyl-3-methylimidazolium ethylsulfate, 1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate, 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate, 1buthyl-3-methylimidazolium dicyanamide, ethylammonium nitrate and 2hydroxyethylammonium formate could be used as solubilizers and adsorption solvents for SWV analysis of both proteins 4. The results could be applied in electrochemical examination of other proteins and ILs properly modified by hydrophobic functional groups could also be useful for solubilization of poorly water-soluble proteins and their subsequent electroanalysis 5. Acknowledgements This work was supported by the Czech Science Foundation, project No. 14-08032S, and by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, project No. LD14033 (COST Action EU-ROS, BM1203). References 1. Chen X.W., Liu J.W., Wang J.H.: Anal. Methods 2, 1222 (2010). 2. Palecek E, Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007). 3. Vacek J., Zatloukalova M., Vrba J., Kubala M., Electrochim. Acta (2014) in press. 4. Zatloukalova M., Orolinova E., Kubala M., Hrbac J., Vacek J.: Electroanalysis 24, 1758 (2012). 5. Vacek J., Zatloukalova M., Havlikova M., Ulrichova J., Kubala M.: Electrochem. Commun. 27, 104 (2013).

224

Voltammetric Analysis of Anthraquinone-labeled Nucleotide Triphosphates and Oligonucleotides at Gold Electrodes (Voltametrická analýza nukleosidtrifosfátů a oligonukleotidů značených antrochinonem na zlatých elektrodách) Pavlína Vidláková a, Jana Balintová b, Lud k Havran a, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics ASCR,v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry v. v. i., Flemingovo nam. 2, 166 10 Praha 6, Czech Republic Abstract DNA labelling is used for increase of sensitivity of electrochemical detection. When the DNA or oligonucleotides (ONs) are chemically modified, their electrochemical responses can be changed depending on electrochemical activity of the introduced moiety. One option of DNA labeling is incorporation of chemically modified nucleotides using corresponding deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) into DNA molecules with using primer extension (PEX). In our study we used anthraquinone labeled dNTPs and ONs with enzymatically incorporated anthraquinone labeled nucleotides. Thus synthesized ON stretch bearing the anthraquinone tags was electrochemically analyzed using voltammetry at gold electrodes. Key words: DNA, Anthraquinone, Electrochemical analysis, DNA modification, Primer extension. Úvod Elektrochemická aktivita nukleových kyselin byla objevena v 50. letech 20. století a od té doby je používána ke studiu struktury a interakcí přirozených i modifikovaných molekul nukleových kyselin i syntetických oligonukleotid . Přestože je přirozená DNA sama o sob elektrochemicky aktivní a je možné ji studovat na r zných typech elektrod 1, je pro řadu analytických aplikací praktické použít DNA značenou elektroaktivními molekulami (například komplexy přechodných kov 2,3, amino- nebo nitroskupinami 4,5, antrachinonem 6 apod.). Tyto látky podléhají redoxním reakcím a dávají takto modifikované DNA nové elektrochemické vlastnosti, které je možné využít pro studium struktury a interakcí nukleových kyselin a v oblasti DNA diagnostiky. Pro značení DNA je často využívána metoda prodlužování primeru (PE ). Při této metod je pomocí r zných DNA polymeráz prodlužován řet zec DNA od 5´ konce ke 3´konci. Syntéza probíhá podle templátu. DNA polymerázy dokáží inkorporovat jak přirozené, tak i chemicky modifikované nukleotidy. Experimentální část Antrachinonem modifikované nukleosidtrifosfáty byly připraveny Sonogashira cross-coupling reakcí 2-ethynylantrachinonu a N-(-2-propynyl)-antrachinoncarboamidu s halogenovanými nukleosidtrifosfáty. Inkorporace značených nukleosidtrifosfát byla provád na metodou prodlužování primeru (PEX) s využitím enzymu vent-(exo)-DNA polymerázy. Jako templáty pro PE reakci byly používány oligonukleotidy 5´-CTAGCATGAGCTCAGTCCCATGCCGCCCATG3´modifikované SH skupinou na 5´- nebo 3´- konci. Připravené PE produkty byly imobilizovány na povrchu zlaté diskové elektrody prostřednictvím vazby S-Au. Imobilizace byla provád na přes noc při laboratorní teplot .

225

Voltametrická m ření byla provád na na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The Netherlands) spojeném s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém zapojení (Ag/AgCl/3M KCl jako referenční elektroda, platinový drátek jako pomocná elektroda). M ření bylo provád no v inertní atmosféře argonu. Jako pracovní elektroda byla používána zlatá disková elektroda. Cyklická voltametrie (CV) - základní elektrolyt 0,2 M acetátový pufr pH 5, počáteční potenciál 0,05 V, potenciál bodu obratu -0,7 V. Square wave voltametrie (SWV) - základní elektrolyt 0,2 M acetátový pufr, pH 5, počáteční potenciál -1 V, konečný potenciál 0 V nebo počáteční potenciál 0 V a konečný potenciál -1 V. Výsledky a diskuse Elektrochemické chování deoxynukleosidtrifosfát ( br. 1) značených antrachinonem bylo studováno pomocí CV a S V na zlaté diskové elektrod . Pro elektrochemické chování antrachinonu je charakteristická dvouelektronová redoxní chinon/hydrochinon přem na. V katodické v tvi cyklického voltamogramu poskytuje antrachinon pík A red při potenciálu okolo -0,4 V, příslušející redukci antrachinonu na antrahydrochinon. V anodické v tvi cyklického voltamogramu je patrný pík A H2ox příslušející zp tné oxidaci antrahydrochinonu ( br. 2A). Ve S V značených dNTP je dobře patrný pík antrachinonu při potenciálu -0,3 V (Obr. 2B).

Obr.1. 7-deazaadenosintrifosfát a cytidintrifosfát značené propargylkarbamoylantrachinonem.

Obr. 2. CV (A) a S V (B) poskytované dATP (přerušovaná čára) a dCTP (plná čára) značených antrachinonem na zlaté diskové elektrod , základní elektrolyt 0,2 M acetátový pufr, počáteční potenciál -1 V, konečný potenciál 0 V, koncentrace dNTP 20 M. Metodou PE byly připraveny neznačené oligonukleotidy a oligonukleotidy značené antrachinonem. Byly připraveny ds DN, které m ly jeden řet zec na 5´ konci nebo na 3´ konci modifikovaný SH skupinou, která umožňuje kovalentní vazbu takto modifikovaného DN na povrch zlaté elektrody, a ve druhém řet zci bylo inkorporováno 4 nebo 8 nukleotid s navázaným antrachinonem. Elektrochemické chování takto připravených oligonukleotid bylo studováno pomocí CV a S V na zlaté diskové elektrod . V CV DN značených

226

antrachinonem je stejn jako CV značených dNTP patrný pár pík A red/AQH2ox (Obr. 3A), ale píky nejsou tak dobře vyvinuté, jako u voltamogram dNTP. Neznačené DN na zlaté elektrod v použitém potenciálovém rozsahu (0 - -0,7 V) neposkytují žádný signál. Jako vhodn jší metoda než CV se pro studium antrachinonem modifikovaných DN ukázala S V. Ve S V modifikovaných DN m řených jak v katodickém (0 až -1V) tak v anodickém sm ru (-1 až 0V) je dobře patrný pík antrachinonu ( br. 3B). Velikost píku koresponduje s počtem molekul antrachinonu vázaných na DN.

Obr. 3. CV(A) a S V (B) neznačeného PE produktu a PE produktu značeného antrachinonem na zlaté diskové elektrod , základní elektrolyt 0,2 M acetátový pufr, CV – počáteční potenciál 0V, potenciál bodu obratu -0,7 V, SWV- počáteční potenciál -1 V, konečný potenciál 0 V. Závěr V této práci se zabýváme možností studia nukleosidtrifosfát , oligonukleotid a DNA značených antrachinonem pomocí voltametrických stanovení na zlaté diskové elektrod . Z našich výsledk vyplývá, že takto značené dNTP i DNA lze na zlatých elektrodách velmi dobře detekovat, díky dobře vyvinutému reverzibilnímu píku v oblasti kolem -0,3 V, který b hem CV a S V poskytuje zbytek antrachinonu. Naše výsledky ukazují, že tento zp sob značení a stanovení DNA lze použít pro analýzu sekvencí DNA a DNA protein interakcí. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grant GA ČR (P206/12/2378, P206/12/G151). Literatura 1. Palecek, E., Jelen, F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang, J., ed.), pp 74-174, Elsevier, Amsterdam 2005. 2. Fojta, M., Havran, L., Kizek, R., Billova, S., Palecek, E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004). 3. Vrabel, M., Horakova, P., Pivonkova, H., Kalachova, L., Cernocka, H., Cahova, H., Pohl, R., Sebest, P., Havran, L., Hocek, M., Fojta, M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009). 4. Cahova H., Havran L., Brazdilová P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2059 (2008). 5. Horakova P., Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011). 6. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: ChemEur. J. 17, 14063 (2011).

227

A Preliminary Study of Modification of 7-Deazaadenine with a Complex of Osmium Tetroxide with 2,2’-Bipyridine (Předběžná studie modifikace 7-deazaadeninu komplexem oxidu osmičelého s 2,2‘-bipyridinem) Lada Vítová a, Lud k Havran a, Miroslav Fojta a, ndrej Šedo b, Zbyn k Zdráhal b, and Radim Vespalec a a Institute of Biophysics, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135, 612 35 Brno, Czech Republic; E-mail: [email protected] b Central European Institute of Technology, Masaryk University, Kamenice 753/5, 625 00 Brno, Czech Republic Abstract Reactivity of a purine nucleic base analogue 7-deazaadenine (A*) in short oligodeoxynucleotide (ODN) towards an osmium tetroxide complex with 2,2´-bipyridine (Os,bipy) was investigated by means of electrochemistry, capillary electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry. Electrochemical measurement, electrophoretic analyses and mass spectrometric analyses of reaction mixture proved that ODN with an A* residue yields an osmium adduct with properties similar to those exhibited by the well-known adduct of thymine. Key words: Electrochemical analysis; Capillary electrophoresis; Mass spectrometry; Oligonucleotide; Electroactive label; Osmium tetroxide, 7-deazaadenine. Úvod Pro studium struktury, strukturních zm n a interakcí biopolymer (nukleových kyselin, protein a polysacharid ) se často používají r zné značky, včetn elektrochemicky aktivních 1. Mezi nimi se osv dčily mimo jiné komplexy osmia. Takové značky se získávají reakcí přirozených složek biopolymer (pyrimidinových nukleobází v DNA, tryptofanu v proteinech) s oxidem osmičelým ( s 4) a stabilizací vzniklých osmát pro vodné prostředí terciárními aminy. Komplex s 4 s 2,2´-bipyridinem ( s,bipy) se pro modifikaci nukleových kyselin používá už více než 30 let 2. V nukleových kyselinách je reakce s tímto komplexem selektivní pro pyrimidinové báze v jednořet zcové DNA 1,3. Purinové báze jsou v či s 4 i jeho komplex m relativn rezistentní. Za účinn jších reakčních podmínek ale byla detekována částečná modifikace guaninu v DNA a syntetických polynukleotidech 4. Bylo však také publikováno, že s 4 reaguje se 7-deazapurinovými nukleotidy 5. Smyslem této práce je tuto reaktivitu ov řit v případ 7-deazaadeninu a postupn dovést k analytickému využití v oblasti studia nukleotidových sekvencí. Krom standardního elektrochemického m ření byly reakční sm si analyzovány také kapilární elektroforézou (CE) a hmotnostní spektrometrií s analyzátorem doby letu a laserovou desorpcí/ionizací za účasti matrice (MALDI-TOF MS). Experimentální část Studovanými DN byly pentamery složené ze čtyř nukleotid s adeninem, lišící se druhem nukleové báze v koncovém nukleotidu, která má být místem modifikace komplexem s,bipy. Použité DN m ly sekvenci: 4A-T, 4A-A* a 5A. Modifikační reakce ODN (0,01 mM) pomocí s,bipy (1 mM) byla provád na 60 minut při 37°C (předpoklad úplné konverze) v 10 mM Tris-HCl pH 6,8.

228

Elektroc emické analýzy Reakční sm s byla analyzována na elektrod z pyrolytického grafitu (PGE). Nezreagovaný Os,bipy byl extrahován z povrchu pracovní elektrody izopropylalkoholem. Elektrochemické m ření bylo provád no pomocí adsorptivní přenosové rozpoušt cí voltametrie s vnuceným pravoúhlým nap tím (AdTS S V) za použití potenciostatu/galvanostatu Autolab (Ecochemie, Holandsko) v kombinaci s elektrodovým systémem VA-stand 663 (Metrohm, Herisau, Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako referenční elektroda byla použita Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. Elektrolytem byl 0,2 M acetátový pufr (pH 5,0). E analýzy Hlavní součástí laboratorní sestavy byl spektrofotometrický detektor pro kapalinovou chromatografii Jasco 875 UV–VIS (Jasco, Tokio, Japonsko) upravený pro práci s radiáln prosv covanou kapilárou termostatovanou kapalinou. Vysokonap ťový zdroj Spellman CZE 1000R (Plainview, New York, USA) poskytoval nap tí vkládané na kapiláru (+20 kV). CE separace byly provedeny v nepokryté křemenné kapiláře (MicroSolv Technology, USA) o vnitřním pr m ru 75 m a separační délky 48 cm, termostatované na 25°C. Pufrující složkou základního elektrolytu (BGE) byla 3-(cyklohexylamino)-2-hydroxy-1propansulfonová kyselina (CAPS ) nastavená Na H na pH 9,6. Separované zóny byly detekovány při vlnové délce 260 nm. dezvu detektoru monitoroval software Clarity v CE modifikaci (Data Apex, Praha, Česká Republika). Reakční sm si oligodeoxynukleotid byly analyzovány bez předb žných úprav. MS analýzy 0,6 l reakční sm si bylo smícháno s 2,4 l MALDI matrice (3-hydroxypikolinové kyseliny, 75mg·ml-1 ve sm si voda:acetonitril 1:1, v/v) a 0,6 l této sm si bylo naneseno na MALDI destičku. MALDI-T F MS m ření byla provedena na přístroji Ultraflex III (Bruker Daltonic, Brémy, SRN) v reflektronovém negativním módu detekce. Vzorky použitých syntetických DN byly dodané firmou VBC-Biotech Services GmbH (Vídeň, Rakousko), s 4 firmou JMC (Velká Británie). Všechny ostatní chemikálie byly od firmy Sigma-Aldrich (Praha, Česká Republika). Výsledky a diskuze Elektroc emické analýzy Po inkubaci s s,bipy poskytují DN 4A-T a 4A-A* na PGE voltametrické píky aodpovídající reverzibilním redox přechod m osmia, zatímco 5A žádný takový signál neposkytuje (Obr. 1). V případ aduktu s,bipy s T bylo prokázáno, že pík je specifický pro adukt T-Os,bipy. Z t chto výsledk lze tedy usuzovat, že A*, podobn jako T (a na rozdíl od A), tvoří s s,bipy elektrochemicky aktivní adukt. Z obrázku 1 je rovn ž patrno, že osmium v aduktu s A* má posunutý redox potenciál o 45 mV do mén negativních hodnot, což v principu umožňuje od sebe oba typy adukt odlišit na základ jejich rozdílného elektrochemického chování. E analýzy pH 9,6 základního elektrolytu bylo zvoleno za účelem eliminace protonizace nukleových bází v DN. Nedochází tak k jejich coulombické interakci s negativním nábojem ionizovaných silanolových skupin na vnitřním povrchu kapiláry. Při zvolených experimentálních podmínkách bylo dosaženo odd lení zóny DN od zóny jeho pomaleji migrujícího reakčního produktu - osmátu stabilizovaného 2,2´-bipyridinem.

229

35



A4-T A4-A* A5

30

I [A]

 25

20

15 -0.9

-0.6

-0.3

0.0

E [V] Obr. 1. Voltamogramy poskytované na PGE DN 4A-T (čárkovaná čára), 4A-A* (plná čára) a 5A (čerchovaná čára) po inkubaci s Os,bipy. Mobility studovaných DN (0) a jejich detekovaných reakčních produkt (mod) a rozdíly t chto mobilit (mobilitní diference, ) jsou uvedeny v Tabulce I. V souladu s očekáváním a publikovanými studiemi 6,7 je záv r, že dochází k modifikaci thyminu v oligodeoxynukleotidu 4A-T. CE analýzy reakční sm si 4A-A* a zjišt ná  ukazují, že se A* modifikuje podobným zp sobem jako T. Mobilitní diference závisela na typu DN. Její rozdílné hodnoty u pentamer 4A-T a 4A-A* mohou být zp sobeny rozdíly ve velikosti a tvaru solvatačního obalu molekul. Tabulka I. Mobility výchozích DN (0), jejich reakčních produkt (mod) a rozdíly mobilit (). ODN 4A-T 4A-A* a -30,0 -29,4 0 a -27,8 -28,0 mod a 2,2 1,4  a

Mobilita uvedena v jednotkách 10-9 m2·V-1·s-1

MS analýzy Vznik aduktu ODN s s,bipy lze potvrdit pomocí MALDI-TOF MS s využitím modelování izotopového vzoru. Přítomnost atomu osmia v komplexu byla ov řena na základ specifického izotopového vzoru odpovídajícího signálu. brázek 2 znázorňuje MALDI-TOF MS spektrum produktu vzniklého reakcí s,bipy s oligodeoxynukleotidem 4A-A*. V případ 4A-A* tedy byl nalezen očekávaný produkt modifikace.

230

Intens. [a.u.]

2019.413

50

2017.413

40

30

20

10

0 2010

2015

2020

2025

2030

Obr. 2. Detailní pohled na MALDI-T F MS spektrum produktu vzniklého reakcí s oligodeoxynukleotidem 4A-A*.

2035 m/z

s,bipy

Závěr Výsledky elektrochemických, CE a MALDI-TOF MS analýz ukazují, že se syntetická nukleová báze 7-deazaadenin v DN modifikuje komplexem s,bipy podobným zp sobem, jako přirozená pyrimidinová báze thymin. V další fázi bude tato práce dopln na o analogickou studii chování 7-deazaguaninu a následn budou navrženy možné bioanalytické aplikace. Vedle statických elektrochemických m ření se jeví využití CE a MS nabízející vysokou separační účinnost a vysokou selektivitu a citlivost jako výhodné při analýzách popsaných reakčních sm sí. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu GAČR (P206/12/G151). Literatura 1. Paleček E.: Method. Enzymol. 212, 139 (1992). 2. Paleček E., Lukášová E., Jelen F., Vojtíšková M.: Bioelectrochem. Bioenerg. 8, 497 (1981). 3. Fojta M., Havran L., Kizek R., Billová S.: Talanta 56, 867 (2002). 4. Jelen F., Karlovský P., Makaturová E., Pečínka P., Paleček E.: Gen. Phys. Biophys. 10, 461 (1991). 5. Sayers E. W., Waring M. J.: Biochemistry 32, 9094 (1993). 6. Nomura A., Tainaka K., Okamoto A.: Bioconjug. Chem. 20, 603 (2009). 7. Reske T., Surkus A. E., Duwensee H., Flechsig G. U.: Microchim. Acta 166, 197 (2009).

231

Simultaneous Determination of Caffeine and Taurine in Energy Drinks by Micellar Electrokinetic Chromatography in Short Separation Capillary (Současné stanovení kofeinu a taurinu v energetických nápojích micelární elektrokinetickou chromatografií v krátké separační kapiláře) Blanka Vochyánová a, František pekar a, and Petr T ma b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, CZ-100 00 Prague 10, Czech Republic, E-mail:[email protected] a

Abstract A method has been developed for the rapid and simultaneous determination of taurine and caffeine using a laboratory-made instrument enabling separation analysis in a short 10.5 cm capillary. The substances are detected using a contactless conductometry / UV photometry detector that enables recording both signals at one place in the capillary. The separation of caffeine and taurine was performed using the MEKC technique in a background electrolyte with the composition 40 mM CHES, 15 mM NaOH and 50 mM SDS, pH 9.36. Under these conditions, the migration time of caffeine is 43 s and of taurine 60 s; LOD for caffeine is 4 mg L-1 using photometric detection and LOD for taurine is 24 mg L-1 using contactless conductometric detection. The standard addition method was used for determination in Red Bull energy drink of caffeine 317 mg L-1 and taurine 3860 mg L-1; the contents in Kamikaze drink were 468 mg L-1 caffeine and 4110 mg L-1 taurine. The determined values are in good agreement with the declared contents of these substances. RSD does not exceed 3%. Key words: Capillary micellar electrokinetic chromatography, Dual detection, Contactless conductometric detection, Photometric UV detection, Caffeine, Taurine, Energy drinks. Úvod Energetické nápoje jsou využívány ke zvýšení výkonnosti a bd losti a jejich spotřeba roste s r stem nárok kladených na lidskou činnost, s r stem intenzity životního stylu. Základními složkami v tšiny energetických nápoj jsou, vedle sacharid , kofein a taurin. Taurin přízniv ovlivňuje řadu fyziologických d j v organizmu, mj. optimalizuje činnost centrální nervové soustavy, zlepšuje psychickou pohodu, stimuluje myšlenkové pochody a jeho účinky výrazn umocňuje alkaloid kofein. Stanovení obsahu obou t chto látek v energetických nápojích je d ležité, protože při předávkování mohou mít tyto látky, především kofein, nežádoucí účinky 1,2. Pro stanovení kofeinu a taurinu v nejr zn jších matricích byla vypracována řada analytických metod, jejich přehled lze nalézt v mnoha souborných článcích, např. 3-5. Jednotlivé složky jsou v energetických nápojích stanovovány v tšinou odd len . Současné stanovení obou analyt bylo popsáno, pokud je nám známo, pouze v pracích 6-8 s využitím finančn a technicky náročné instrumentace a metodiky. Vzhledem k tomu, že v energetických nápojích jsou koncentrace obou stimulant vysoké, je pro praxi d ležit jší nenáročná předúprava vzorku, rychlost analýzy a nízká cena analýzy než nízké detekční limity dosahované použitím náročných metodik. V předkládané práci je popsána metodika rychlého simultánního stanovení kofeinu a taurinu v energetických nápojích využívající micelární elektrokinetickou chromatografii (MEKC) v krátké 10,5 cm dlouhé kapiláře s duální detekcí; optická detekce, UV/VIS, je použita pro detekci kofeinu a bezkontaktní vodivostní detekce, C4D, pro stanovení taurinu. Metodika byla

232

testována na stanovení obou analyt v energetických nápojích Red Bull a Kamikaze z b žné obchodní sít . Experimetální část Ke stanovení kofeinu a taurinu byla použita v laboratoři zhotovená aparatura. Separační a detekční část aparatury je umíst na na čelním panelu UV/VIS detektoru Saphire (ECOM s.r.o., Czech Republic) pod opticky a elektrostaticky stínícím krytem, obr. 1, pod nímž jsou separační kapilára (1), dávkovací (2) a koncová (3) nádobka, duální detekční cela (4) a elektronika bezkontaktního vodivostního detektoru (5) a (6).

Obr. 1. Schema aparatury pro MEKC v krátké kapiláře s duální detekcí. Komponenty aparatury zakreslené v rámečku jsou umíst né pod stínícím krytem na čelním panelu spektrálního detektoru. Separační kapilára (1), dávkovací nádobka (2), koncová nádobka (3), duální detekční cela (4) – elektrody C4D (4a), přívod záření z UV/VIS detektoru sv tlovodným vláknem (4b), generátor sinusového nap tí (5), m řidlo střídavého proudu a usm rňovač (6), výstup k dalšímu zpracování signálu (7), vysokonap ťové elektrody (8), dávkovací ventil (9), přívod separačního elektrolytu při dávkování vzorku (10), dávkovací smyčka (11), dávkovací trubička (12), odpad přebytku elektrolytu při dávkování (13), vstup pro připojení ke zdroji podtlaku při promývání či aktivaci kapiláry (14). Konstrukční uspořádání bezkontaktní vodivostní části detekční cely je převzato z práce 9. Postup dávkování vzorku do krátké kapiláry a její promývání je detailn popsán v pracích 10,11, proto jen stručn . Vzorek je do kapiláry nadávkován tak, že současn s přepnutím šesticestného dávkovacího ventilu (9) do polohy „inject“ je konstantní rychlostí a po definovanou dobu přivád n separační elektrolyt trubičkou (10) k dávkovacímu ventilu. Proudem elektrolytu je definovaný objem vzorku z dávkovací smyčky (11) nesený kolem dávkovacího konce kapiláry, který je v dávkovací nádobce (2) zasunut do hloubky asi 0,5 mm do přívodní PTFE trubičky (12). Doba dávkování je tak řízena dobou, po kterou protéká

233

kolem ústí kapiláry zóna roztoku vzorku; přebytek separačního elektrolytu odtéká po dobu dávkování do odpadu (13). Dávkováno je bez přerušení vysokého nap tí na elektroforetických elektrodách (8). Po skončení separace je vytvořením podtlaku (14) v koncové nádobce kapilára promyta separačním elektrolytem. Podtlakem v koncové nádobce byl do kapiláry nasáván i aktivační roztok Na H či promývací voda. Dávkovací smyčka je pln na injekční stříkačkou. Použit byl optimalizovaný separační elektrolyt (BGE) o složení 40 mM CHES, 15 mM Na H a 50 mM SDS, pH 9,36. Standardní roztoky kofeinu (Sigma-Aldrich) a taurinu (Roth, Germany) o koncentraci 992 a 1250 mg L-1, byly připraveny v roztoku separačního elektrolytu a uchovávány v chladničce. Analyzovány byly vzorky energetických nápoj Red Bull (Red Bull GmbH, Austria) – kofein, 80 mg ve 250 mL (tj. po přepočtu 320 mg L-1), taurin, 0,4 % (4000 mg L-1) a Kamikaze (Tecfood, CR) – kofein, 120 mg ve 250 mL (480 mg L-1), taurin, 4000 mg L-1 (v závorce je uveden výrobce nebo distributor, obsah kofeinu a taurinu podle údaje na etiket ). Jedinou úpravou vzork nápoj před analýzou byla desetiminutová sonikace k odstran ní rozpušt ných plyn . Vzorky byly poté uchovávány v lednici a pro všechna m ření byly řed ny 10 BGE. Výsledky a diskuse V použitém BGE lze separovat záporn nabitý taurin od neutrálního kofeinu. Na elektroferogramu na obr. 2 je nejprve patrný pík tzv. water gapu (E F), poté pík kofeinu (1) a poslední je pík taurinu (2). Rozlišení kofein/water gap je 2,4 a rozlišení kofein/taurin je 6,4. Pro současnou detekci taurinu a kofeinu je nutno použít duální C4D/UV detektor. Taurin neabsorbující v UV/VIS oblasti spektra je detegován pomocí C4D jako pozitivní pík a kofein s purinovou strukturou je detegován fotometricky při optimalizované vlnové délce 216 nm. Poznámka: Kofein poskytuje signál i v univerzálním C4D. Experimentáln bylo ov řeno, že odezva C4D na kofein se m ní s koncentrací málo; lze předpokládat, že zóna kofein/micely ovlivňuje především permitivitu roztoku, na níž C4D reaguje a nikoli elektrickou vodivost.

Obr. 2. Elektrochromatogram energetického nápoje Kamikaze s C4D záznamem (A) a UV záznamem při 216 nm (B). Experimentální podmínky, BGE 40 mM CHES +15 mM Na H + 50 mM SDS (pH 9.36); +5 kV/+33 µA. Identifikace pík , kofein (1), taurin (2).

234

Závislost ploch pík kofeinu i taurinu na koncentraci byla lineární v celém testovaném intervalu koncentrací (kofein, 20 až 500 mg L-1, taurin, 25 až 625 mg L-1), proto bylo možno oba analyty stanovovat jak metodou vn jšího standardu (kalibrační graf), tak i metodou standardního přídavku. Výsledky stanovení jsou shrnuty v tabulce I. Tabulka I. Výsledky stanovení kofeinu a taurinu v energetických nápojích metodou kalibračního grafu a standardního přídavku. Uvedené výsledky jsou pr m rem ze tří paralelních stanovení. Deklarované hodnoty obsahu kofeinu jsou 320 a 480 mg L-1 v nápoji Red Bull a Kamikaze a taurinu 4000 mg L-1 v obou nápojích. Procento deklarovaného obsahu vyjadřuje vztah mezi experimentáln stanovenými hodnotami koncentrace a hodnotami deklarovanými na etiket plechovky s nápojem. Red Bull Kamikaze Metoda kalibračního grafu Koncentrace kofeinu, mg L-1 324,7  1,2 459,2  13,5 Procento deklarovaného obsahu, % 101,5 95,7 RSD, % 0,2 1,3 Koncentrace taurinu, mg L-1 Procento deklarovaného obsahu, % RSD, %

4123,9  139,9 103,1 1,5

4178,6  339,3 104,5 3,7

Metoda standardního přídavku Koncentrace kofeinu, mg L-1 Procento deklarovaného obsahu, % RSD, %

317,0  19,2 99,1 2,7

467,7  11,2 97,5 2,0

Koncentrace taurinu, mg L-1 Procento deklarovaného obsahu, % RSD, %

3857,0  235,3 96,4 2,8

4110,4  224,0 102,8 2,5

Z tabulky I je zřejmé, že ve v tšin případ je deklarovaná hodnota koncentrace obou analyt uvnitř intervalu spolehlivosti experimentáln zjišt ných koncentrací a stanovený obsah stimulant se liší od deklarovaného o mén než 4 %. Výsledky byly rovn ž hodnoceny statistickými testy 12. Pro porovnání shodnosti experimentáln zjišt ných a deklarovaných hodnot byl použit TI test a pro porovnání výsledk získaných ob ma kalibračními metodami Lord v test. Z výsledk TI testu vyplynulo, že při použití metody standardního přídavku nejsou žádné stanovené koncentrace statisticky odlišné od hodnoty deklarované, při použití metody kalibračního grafu byl stanovený obsah kofeinu statisticky odlišný od hodnoty deklarované. Z výsledk Lordova testu vyplývá, že ob kalibrační metody poskytují srovnatelné výsledky, statisticky odlišné byly pouze při stanovení taurinu. Na základ výsledk testu lze pro stanovení kofeinu a taurinu v energetických nápojích metodou MEKC doporučit metodu standardního přídavku jako spolehliv jší. Závěr Stanovení kofeinu a taurinu v energetických nápojích separací v krátké kapiláře s duální detekcí vhodn doplňuje dříve popsané stanovení sacharid v t chto nápojích 11. Předúprava vzorku je nenáročná a stanovení je rychlé, separace trvá za používaných experimentálních podmínek asi jednu minutu. Metoda je vhodnou alternativou k doposud popsaným metodám umožňujících současné stanovení obou aktivních komponent energetických nápoj . 235

Popsaná metodika je založena na specializované aparatuře. Lze předpokládat, že ji lze adaptovat i pro komerční elektroforetické aparatury, pokud umožňují dávkování vzorku do krátkého konce kapiláry a jsou vybaveny C4D a UV detekcí. V t chto aparaturách jsou oba detekční systémy zpravidla v r zných místech kapiláry, takže látky jsou detegovány v rozdílném stupni separace - to však pro jejich stanovení nemusí být na závadu. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Univerzity Karlovy v Praze, projekt SVV. Literatura 1. Huxtable R.J.: Physiol. Rev. 72, 101 (1992). 2. Nehlig A., Daval J.L., Debry G.: Brain Res. Rev. 17, 139 (1992). 3. Švorc L., Tomčík P., Svítková J., Rievaj M., Bustin D.: Chem. Listy 107 (2013) 530. 4. P. Talik, J. Krzek, R.J. Ekiert, Sep. Purif. Rev. 41 (2012) 1. 5. S. Mou, X. Ding, Y. Liu, J. Chromatogr. B 781 (2002) 251. 6. Marchei E., Pellegrini M., Pacifici R., Palmi I., Pichini S.: J. Pharm. Biomed. Anal. 37, 499 (2005). 7. Aranda M., Morlock G.: J. Chromatogr. A 1131, 253 (2006). 8. Chirita R., Dascalu C., Gavrila L., Elfakir C.: Rev. Chim.- Bucharest 61, 1173 (2010). 9. T ma P., pekar F., Jelínek I.: Electroanalysis 13, 989 (2001). 10. Opekar F.: Chem. Listy 106, 289 (2012). 11. Vochyánová B., pekar F., T ma P., Štulík K.: Anal. Bioanal. Chem. 404, 1549 (2012). 12. Miller J.C., Miller J.N.: Statistics for Analytical Chemistry, Ellis Horwood, Chichester 1986, p. 124.

236

Electroanalysis of Uncoupling Protein UcP1 (Elektroanalýza odpřahujícího proteinu UcP1) Martina Zatloukalova, Martin Modriansky, and Jan Vacek Department of Medical Chemistry and Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University, Hnevotinska 3, Olomouc 775 15, Czech Republic E-mail: [email protected] Abstract The present study focuses on electrochemical analysis of transmembrane mitochondrial uncoupling protein 1 (UcP1) using intrinsic electroactivity measurement with carbon and mercury electrodes. For UcP1 solubilization the nonionic surfactant poly(ethylene glycol) octyl ether (octyl-PoE) was used. Prior to electroanalysis samples containing the reconstituted protein were verified for UcP1 transport activity by quenching of SPQ fluorescence in the presence of TES anion. With respect to the fact that octyl-PoE did not interfere with electrochemical analysis, the protocol proposed here allowed us trace analysis of UcP1. These preliminary results provide a solid guideline for further investigations of UcP1 by electrochemical methods. Key words: Uncoupling protein 1, Poly(ethylene glycol) octyl ether, Protein activity, Voltammetry, Chronopotentiometry, Membrane proteins. Introduction Intrinsic electroactivity monitoring seems to be a useful tool for examination of protein structural changes and functional properties. Besides water-soluble proteins, it is possible to study poorly water-soluble proteins and membrane proteins in the presence of suitable detergents or other stabilizing agents, e.g. lipid components. The investigation of intrinsic electroactivity of proteins is based on recording of oxidation peaks ‘Y& ’ of Tyr and Trp residues at carbon electrodes or chronopotentiometric cathodic peaks ‘H’ and ‘S’ at mercury electrodes 1-3. The routine analytical tools for protein structure study are based on optical principles and on measurement of global protein signal for selected amino acid residues, for example Trpfluorescence analysis. We assume that electrochemical methods, unlike optical methods, reflect primarily physicochemical changes occurring at the surface of proteins, which can be induced not only by global but also local structural transitions of the proteins. For instance, local transition may occur after protein surface interaction with a ligand, e.g. drug, often leading to modulation of accessibility of electroactive amino acid residues to the electrode surface and hence to a signal change.

Fig. 1. The schematic representation of uncoupling protein 1 (UcP1).

237

In this study, we focused on uncoupling protein 1 (UcP1). Uncoupling proteins are mitochondrial transporters present in the inner membrane of mitochondria. They belong to the family of anion mitochondrial carriers that include e.g. adenine nucleotide transporter. The term ‘uncoupling protein’ was originally used for UcP1, which is uniquely present in the mitochondria of brown adipocytes, the cells destined to maintain body temperature of small mammals by process called non-shivering thermogenesis. In these cells, UcP1 allows protons to re-enter mitochondrial matrix in the presence of free fatty acids, effectively bypassing ATP synthase. Activation of UcP1 enhances respiration, and the uncoupling process results in a futile cycle and dissipation of oxidation energy as heat 4,5. The aim of this work was (a) to isolate UcP1 from brown fat mitochondria obtained from Golden Syrian hamsters, (b) to verify the activity of UcP1 prior to electrochemical analysis and (c) to analyze the redox, electrocatalytic and adsorption/desorption behaviour of UcP1. Experimental Buffer components were obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, USA). All solutions were prepared using reverse-osmosis deionized water (Ultrapur, Watrex, CZ). UcP1 was purified from brown fat mitochondria obtained from Golden Syrian hamsters. Briefly, mitochondria at 5 mg total protein were mixed with poly(ethylene glycol) octyl ether (octyl-PoE) detergent with or without lipids (L-α-phosphatidylcholine and cardiolipin) and then incubated on hydroxyapatite (HTP) column as described previously 6. The HTP eluate containing no lipids was used for control experiments without further manipulation. The HTP eluate containing protein/detergent mixture (sample A) was adjusted to internal medium composition (84.4 mM TEA2SO4, 29 mM TEA-TES, 0.6 mM TEA-EGTA, pH 7.2). Equivalent HTP eluate containing protein/detergent/lipid mixture was adjusted to internal medium composition plus 2 mM SPQ and further incubated for 2.5 hours on BioBeads column to slowly remove the detergent and allow proteoliposomes formation (sample B). Excess fluorescent probe was removed using Sephadex G-50 column. Activity of the reconstituted UcP1 was verified by SPQ quenching in the presence of TES anion 7. UcP1 activity was induced using 10 µM laurate with K+driven-valinomycin clamped gradient across the liposomal membrane. The activity was inhibited by 1 mM GDP added to the external medium (84.4 mM K2SO4, 29 mM TEA-TES, 0.6 mM TEA-EGTA, pH 7.2). Control preparations contained detergent only dissolved in the internal medium, detergent/lipid mixture dissolved in the internal medium, and liposomes prepared without UcP1 protein. The protein UcP1 (conc. 1 µg/ml) was analyzed using ex situ (adsorptive transfer) voltammetry and chronopotentiometry with a basal-plane pyrolytic graphite working electrode, PGE (9 mm2, source of PG: Momentive Performance Materials, USA) and hanging mercury drop electrode (HMDE). The electrodes were first dipped into 5-μL aliquot of the studied sample (sample A). After an accumulation period, the electrodes were washed by deionized water and placed in an electrochemical cell containing pure supporting electrolyte. Square wave voltammetry (SWV) or constant-current chronopotentiometric stripping analysis (CPSA) were performed at room temperature with a μAutolab III analyzer (Metrohm Autolab, NL) in a three-electrode setup with Ag/AgCl/3 M KCl electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode.

238

Results and discussion Molecular weight of UcP1 is a 33 kD and the protein has a tripartite structure containing approximately 100 amino acid residues in three tandem repeats. Each part encodes for two transmembrane segments and one long hydrophilic loop. The schematic representation of structure and summary of electroactive amino acid residues of UcP1 are shown in Fig. 1 and Table I. The sample A and sample B were used for electrochemical analysis and analysis of protein activity, respectively, see Experimental. Prior to electrochemical analysis protein samples were verified for transport activity by monitoring quenching of SPQ fluorescence in the presence of TES anion. All protein samples displayed transport activity in the presence of free fatty acid, while this transport was inhibited in the presence of 1 mM GDP. Hence the reconstituted UcP1 was in stable conformation in the samples investigated. Table I. Summary of UcP1 electroactive amino acid residues (UniProt: P04575). Amino acids Lysine Arginine Cysteine Histidine Tryptophan Tyrosine

Abbrev. Lys Arg Cys His Trp Tyr

Number 16 12 7 4 2 9

First, we focused on electrooxidation of UcP1 using PGE and ex situ SWV. After isolation and solubilization of UcP1 by nonionic detergent poly(ethylene glycol) octyl ether (octylPoE, for structure see Fig. 2A), the surface of PGE was modified by 10 µl of analyzed sample, washed with deionized water and placed into electrochemical cell containing pure 0.2 M acetate buffer (pH 5.5). The scan was performed from 0 V to +1.5 V. Under these conditions, the oxidation peak (wave) Y&W at potential around +0.8 V was found. Anodic peak occurring in proteins around this potential is associated with oxidation of Tyr (Y) and Trp (W) residues. UcP1 contains 9 Tyr and 2 Trp totally (Table I) but probably only the amino acid residues on protein surface may be associated with the anodic reaction (Fig. 2B). Further, we focused on reduction of UcP1 by using constant-current chronopotentiometric stripping analysis (CPSA) at HMDE. The electrode was modified by the UcP1 in the same way as described above for SWV. Peak H appeared at the negative potential around –1.92 V depending on experimental conditions, especially stripping current height and pH of supporting electrolyte (Fig. 3A). Peak S was found at potential around –0.68 V (Fig. 3B). As described previously, the protein layer adsorbed on mercury electrodes at negative potentials serves as a catalyst for catalytic hydrogen evolution reaction (CHER), forming socalled chronopotentiometric peak H. Multiple amino acid residues can participate in electrocatalytic peak H formation. These include Cys and basic amino acid residues, Arg, His and Lys, acting as proton donors which are then regenerated by accepting protons from acid constituent of the supporting electrolyte, thereby completing the electrocatalytic cycle 8-10. It is also possible to follow reduction of Hg-S bond (peak S) of Cys-containing proteins at Hg surfaces. The number of Cys and basic amino acid residues in UcP1 is shown in Tab. I. The number of selected amino acid residues participating on cathodic signals of UcP1 will be subject to further investigation.

239

A B

1.4 1.2

Electrolyte UcP1

I, A

1.0 Peak Y&W

0.8 0.6 0.4 0.2 0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

E, V

Fig. 2. (A) The structure of detergent poly(ethylene glycol) octyl ether (octyl-PoE) and (B) square wave voltammogram of UcP1 at PGE. SWV experiment: concentration of protein: 1 µg/ml, tA: 60 s, supporting electrolyte: acetate buffer pH 5.5, vs. Ag/AgCl/3 M KCl.

A

UcP1 Electrolyte

Peak H

0.6 0.4 0.2

(

dE/dt)-1, s/V

0.8

0.0 -2.0

-1.0

-0.5

0.0

E, V

B

UcP1 Electrolyte

0.015

-1

(dE/dt) , s/V

0.020

-1.5

0.010 Peak S

0.005 0.000 -1.0

-0.8

-0.6 E, V

-0.4

Fig. 3. Chronopotentiograms of UcP1 at HMDE. CPSA experiment: tA: 30 s, concentration of protein: 1 µg/ml, supporting electrolyte: Britton-Robinson buffer pH 6.5, initial (0 V) and end (-2.0 V) potentials, stripping current: -30 μA, vs. Ag/AgCl/3 M KCl. 240

Conclusion In this short contribution, measurement of the intrinsic electroactivity of transmembrane protein UcP1 using mercury and carbon electrodes is described. Our method is applicable to study of redox processes of other poorly water-soluble proteins and membrane proteins 1-3. Especially, SWV analyses seem to be sensitive tools to study proteins rich in Tyr and Trp residues. Investigation of catalytic signals of proteins using Hg-electrodes has already proven to be an effective tool in the study of their structural changes, which is in agreement with results published not only for water soluble proteins 11 but also for Na+/K+ ATPase transmembrane protein 1-3. This work provides a solid guideline for further investigations of structural changes and interactions of UcP1 by electrochemical methods. Our future investigations will use UcP1 as a model membrane protein for analysis of protein interaction with reactive oxygen species (oxidative modifications) and protein/lipid interactions. Acknowledgements This work was supported by the Czech Science Foundation, project No. 14-08032S, and by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, project No. LD14033 (COST Action EU-ROS, BM1203). The authors thank to Dr. M. Jaburek from the Czech Academy of Science for supplying isolated brown fat mitochondria. References 1. Zatloukalova M., Orolinova E., Kubala M., Hrbac J., Vacek J.: Electroanalysis 24, 1758 (2012). 2. Vacek J., Zatloukalova M., Vrba J., Kubala M., Electrochim. Acta (2014) in press. 3. Vacek J., Zatloukalova M., Havlikova M., Ulrichova J., Kubala M.: Electrochem. Commun. 27, 104 (2013). 4. Bolehovska R., Cervinkova Z., Pospisilova M., Lotkova H., Pliskova L., Palicka V.: Klin. Biochem. Metab. 17, 227 (2009). 5. Rousset S., Alves-Guerra M.C., Mozo J., Miroux B., Cassard-Doulcier A.M., Bouillaud F., Ricquier D.: Diabetes 53, S130 (2004). 6. Garlid K.D., Orosz D.E., Modriansky M., Vassanelli S. Jezek P.: J. Biol. Chem. 271, 2615 (1996). 7. Orosz D.E., Garlid K.D.: Anal. Biochem. 210, 7 (1993). 8. Doneux T., Dorcak V., Palecek E.: Langmuir 26, 1347 (2010). 9. Doneux T., Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 56, 9337 (2011). 10. Dorcak V., Ostatna V., Palecek E, Electrochem. Commun. 31, 80 (2013). 11. Palecek E, Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007).

241

Voltammetric Determination of Benzophenone-3 at Boron-Doped Diamond Electrode (Voltametrické stanovení benzofenonu-3 na bórem dopované diamantové elektrodě) Jaroslava Zavázalová, Kateřina Procházková, Michaela Nezbedová, and Karolina Pecková Charles University in Prague, Faculty of Science, University Centre of Excellence "Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43, Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Voltammetric behaviour of benzophenone-3 was investigated in anodic region using cyclic and differential pulse voltammetry at boron-doped diamond (BDD) electrodes. Optimum conditions for the determinations of studied analyte were estimated based on the influence of pH on the voltammograms in Britton-Robinson buffer, and composition of basic electrolyte. Linear calibration dependence was obtained in the range of 1 – 100 μmol dm–3. Further, the enhancement of voltammetric signal of benzophenone-3 in the presence of cationic surfactant cetyltrimethylammonium bromide was investigated. Key words: Boron-doped diamond electrode, Benzophenone-3, Cyclic voltammetry, Differential pulse voltammetry, Surfactant, Cetyltrimethylammonium bromide. Úvod rganická látka benzofenon-3 (2-hydroxy-4-methoxybenzofenon; BP-3) se hojn využívá v kosmetických přípravcích, např. jako složka krému na opalování, která pohlcuje ultrafialové záření 1. BP-3 se také používá jako UV stabilizátor plastových potravinových obal , aby se zabránilo fotodegradaci obalu nebo potravin 2. BP-3 je elektrochemicky aktivní látka (viz br. 1), a tudíž je možné ji stanovit pomocí moderních voltametrických metod 3, 4. Bórem dopovaný diamantový (BDD) film je oblíbený elektrodový materiál, mezi jehož vlastnosti patří široké potenciálové okno, mechanická i chemická stabilita, nízký zbytkový proud a biokompatibilita 5, 6. Cílem této práce bylo nalézt vhodné podmínky pro voltametrické stanovení benzofenonu-3 s použitím bórem dopované diamantové elektrody a ov ření možnosti využití BDD elektrod ke stanovení této organické látky v přítomnosti surfaktantu.

Obr. 1. Chemická struktura benzofenonu-3.

242

Experimentální část Materiál Zásobní roztok BP-3 (98%, Aldrich) o koncentraci 1·10–3 mol dm–3 byl připraven rozpušt ním přesn naváženého množství látky ve 100 ml 0,01 mol dm–3 hydroxidu sodného. Britton v-Robinson v (BR) pufr o příslušném pH byl připraven smísením vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,2 mol dm–3 s roztokem obsahujícím kyselinu boritou, fosforečnou a octovou (vše p. a., Lach-Ner, Neratovice, ČR), každou o koncentraci 0,04 mol dm–3. Přesná hodnota pH byla m řena pH metrem 3510 (Jenway, UK) s kombinovanou sklen nou elektrodou. Zásobní roztok surfaktantu CTAB (99 %, Fluka) o koncentraci 1·10–2 mol dm–3 byl připraven rozpušt ním přesn naváženého množství látky ve 25 ml deionizované vody (Millipore -plus System, Millipore, USA). Aparatura Voltametrická m ření provedená pomocí Eco-Tribo polarografu (Polaro-Sensors, Praha, ČR) se software PolarPro (verze 5.1) byla m řena v tříelektrodovém zapojení s pracovní elektrodou ponořenou v polarografické nádobce společn s Ag/AgCl (3 mol dm–3 KCl) referentní elektrodou (ETP CZ-R00408), a platinovou drátkovou pomocnou elektrodou (ob Elektrochemické detektory, Turnov, ČR). Jako pracovní elektrody byly použity dva typy borem dopované diamantové elektrody. Pro voltametrické stanovení BP-3 bez použití surfaktantu byl použit BDD film deponovaný na křemíkové destičce umíst né v teflonovém t le (zkonstruováno v naší laboratoři 7; dále značeno BDDA). Geometrická plocha elektrody byla 10,2 mm2. BDD film byl připraven metodou chemické depozice par s mikrovlnným ohřevem (pom r B/C v reakční sm si 2000 ppm) na Fyzikálním ústavu Akademie v d České republiky, v. v. i. v dd lení funkčních materiál . Pro voltametrické stanovení BP-3 ve sm si se surfaktantem byla použita komerčn dostupná BDD elektroda s pr m rem 3,0 mm (plocha 7,1 mm2, indsor Scientific, UK; dále značeno BDDB). Pracovní postupy Před prvním m řením a mezi jednotlivými skeny v nepřítomnosti CTAB byla elektroda BDDA opláchnuta deionizovanou vodou a elektrochemicky aktivována v 0,5M vodném roztoku kyseliny sírové střídáním potenciálu +3,0 V, –3,0 V, +3,0 V, –3,0 V, +3,0 V, každý po dobu 15 s. V přítomnosti CTAB byl elektrodový povrch elektrody BDDB vždy před prvním m řením elektrochemicky aktivován v 0,5M roztoku kyseliny sírové vložením potenciálu +2,4 V a mezi jednotlivými skeny mechanicky čišt n lešt ním na alumin . Cyklická voltametrie (CV) byla m řena rychlostí skenu 100 mV s–1. Diferenční pulsní voltametrie (DPV) byla použita s následujícími parametry: polarizační rychlost 20 mV s–1, pulsy o šířce 100 ms a výšce +50 mV. bjem m řeného vzorku byl vždy 10 ml: Do 10ml odm rné baňky bylo odpipetováno potřebné množství zásobního roztoku studované látky a poté dopln no základním elektrolytem po značku. Veškerá m ření byla provád na za laboratorní teploty. Všechny křivky byly m řeny nejmén třikrát a poté statisticky vyhodnoceny. Výška píku sledované látky byla vyhodnocována prodloužením základní linie před náb hem píku v případ CV a od spojnice minim před a za píkem v případ DPV. Limit stanovitelnosti byl vypočítán jako koncentrace analytu, jehož výška píku odpovídá desetinásobku sm rodatné odchylky nejmenší vyhodnotitelné koncentrace. Výsledky a diskuse Nejprve byl studován vliv pH na DP voltamogramy BP-3 v prostředí BR pufru v rozsahu pH 2,0 – 12,0 na BDDA filmové elektrod . Bylo zjišt no, že BP-3 poskytuje jeden pík, jehož potenciál se posouvá sm rem k pozitivn jším potenciál m se zvyšujícím se pH. V BR pufru o pH 2,0 poskytuje BP-3 pík při potenciálu +1056 mV, v pH 12,0 při potenciálu +620 mV.

243

Zároveň bylo zjišt no, že dochází k pasivaci elektrodového povrchu již po prvním skenu. Pasivace elektrodového povrchu je při elektrochemickém stanovení organických látek na pevných elektrodách b žným jevem, jelikož dochází velmi často k ireverzibilní adsorpci reakčních produkt či interferent na povrchu elektrody. Proto byl navržen program, který využívá kombinaci míchání roztoku a střídání aktivačního potenciálu +3,0 V, –3,0 V, +3,0 V, –3,0 V, +3,0 V, každý po dobu 15 s, v 0,5M vodném roztoku kyseliny sírové. Jako optimální pH pro stanovení studované látky bylo vybráno pH 12,0, při kterém byl nam řen nejvyšší pík BP-3 a při m ření deseti opakovaných sken s navrženou aktivační úpravou mezi jednotlivými skeny bylo dosaženo reprodukovatelných výsledk s relativní sm rodatnou odchylkou 7,9 %. Kalibrační závislosti m řené v rozmezí koncentrací 1 – 100 μmol dm–3 jsou lineární v celém m řeném rozsahu. Limit stanovitelnosti BP-3 bez přítomnosti surfaktantu činí 5,0·10–6 mol dm–3. Dále byl studován vliv přítomnosti surfaktantu CTAB na výšku píku BP-3 pomocí BDDB elektrody v prostředí BR pufru pH 9,0. Z cyklických voltamogram znázorn ných na br. 2 je zřejmé, že po přídavku CTAB lze pozorovat dobře vyvinutý oxidační pík BP-3 a posun potenciálu píku k mén pozitivním hodnotám, což sv dčí o interakci kationtového surfaktantu CTAB s BP-3, který je v tomto pH ve form aniontu. Také na této elektrod v přítomnosti CTAB byla pozorována pasivace elektrodového povrchu. V tomto případ byla elektroda mechanicky čišt na lešt ním na alumin (opakovatelnost m ření s relativní sm rodatnou odchylkou do 5,0 %). ptimalizace DP voltametrického stanovení BP-3 v přítomnosti CTAB bude předm tem dalšího studia. I (nA)

1500 1000 500 0 -500 0

300

600

900 1200 1500 E (mV)

Obr. 2. Cyklické voltamogramy BP-3 (c = 5·10–5 mol dm–3) bez přídavku (slab ) a s přídavkem (tučn ) CTAB (c = 1·10–3 mol dm–3) na BDDB elektrod v prostředí BR pufru pH 9,0 (čárkovan ). Rychlost skenu 100 mV s–1. Závěr Cyklická a diferenční pulsní voltametrie byla použita k prostudování voltametrického chování BP-3 bez přítomnosti a v přítomnosti surfaktantu CTAB na dvou typech borem dopované diamantové elektrody. Pro stanovení BP-3 bez přítomnosti CTAB byly nalezeny optimální podmínky, dále zm řena koncentrační závislost a určen limit stanovitelnosti, který činí 5,0·10–6 mol dm–3. Dále tato studie potvrzuje možnosti využití BDD elektrod ke stanovení

244

organických látek v přítomnosti surfaktantu 3, 8, které byly dříve opomíjeny kv li představám o malé náchylnosti BDD povrchu k adsorpci organických látek 9. Poděkování Tato práce byla finančn podporována Grantovou agenturou Univerzity Karlovy v Praze (projekt GAUK684213) a Univerzitou Karlovou v Praze (projekt SVV260084). Literatura 1. Gonzales H., Abrot A., Larko O., Wennberg A. M.: Brit. J. Dermatol. 154, 337 (2006). 2. Suzuki T., Kitamura S., Khota R., Sugihara K., Fujimoto N., Ohta S.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 203, 9 (2005). 3. Laranjeira M. T., de Lima F., Cesar de Oliveira S., Ferreira V. S., Soares de Oliveira R. T.: American Journal of Analytical Chemistry 2, 381 (2011). 4. Vidal L., Chisvert A., Canals A., Psillakis E., Lapkin A., Acosta F., Edler K. J., Holdaway J. A., Marken F.: Anal. Chim. Acta 616, 28 (2008). 5. Fujishima A., Einaga Y., Rao T. N., Tryk D. A.: Diamond Electrochemistry. Elsevier, Amsterdam 2005. 6. Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009). 7. Cizek K., Barek J., Fischer J., Peckova K., Zima J.: Electroanalysis 19, 1295 (2007). 8. Yardim Y., Levent A., Keskin E., Senturk Z.: Talanta 85, 441 (2011). 9. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007).

245

Electropolymerization of Methylene Blue on Highly Oriented Pyrolytic Graphite and Characterization of Deposited Film Magda Zlámalová a,b, Pavel Janda a, and Karel Nesm rák b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic a

Abstract This work presents the investigation of methylene blue (MB) polymerization as well as characterization of deposited conductive film on basal plane highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) substrate. Poly(methylene blue) modified HOPG electrodes (HOPG/pMB) have been prepared by potential cycling in aqueous electrolyte solution containing monomer methylene blue. Atomic force microscopy (AFM) has been used for the nanomorphological study of immobilized poly(methylene blue) film. Key words: Poly(methylene blue), Electropolymerization, Cyclic voltammetry, Atomic force microscopy. Introduction Chemically modified electrodes were found to be advantageous for a wide range of applications including electroanalytical studies and analyzes. In general, the electrode surface modification can improve the electrochemical response to analyst by mediating or catalyzing its charge transfer reaction, protecting the surface against passivation and by changing the electrochemical reaction mechanism respectively. Utilizing electrodes with immobilized suitable chemical mediators can solve some problems with bare solid electrodes such as insufficient sensitivity and selectivity, slow electron transfer, current and potential oscillations, or high overpotential. Electropolymerization is an effective way of surface modification. Electrosynthesized polymers exhibit some unique behavior that the corresponding monomers do not always display. In the past few years, surface-modified electrodes based on the electropolymerization of various phenoxazine and phenothiazine derivatives have been reported in the literature1,2 . The electrocatalytic activity of poly(methylene) blue in presence of some biologically active compounds has been already reported in several studies3-7. Cyclic voltammetry performed in aqueous solution of monomeric methylene blue leads to immobilization of a conductive polymer film on the electrode surface. It was observed, that the rate of the polymerization increased with increasing pH, indicating that basic solutions are the optimal media for the polymerization of MB3. It has been already published that electrochemical properties of resulting film are dependent on the electrode substrate8. The aim of our work is to propose a new system which combines auspicious electrochemical properties of pMB and simplicity of use of HOPG substrate for preparation of HOPG/pMB electrode. Experimental Reagents and supporting electrolyte solutions Methylene blue was purchased from Lachema. The supporting electrolyte solution used for the electropolymerization of MB consisted of 0.1 M phosphate buffer and 0.1 M sodium

246

nitrate or potassium sulfate (pH 8.0). The concentration of monomeric MB dissolved in the solution was 0.1 mM. Solution of 0.1 M phosphate buffer with 0.1 M KCl was used for pMB electrochemical characterization and for other experiments. Solutions of sodium sulphide were prepared immediately before experiments. Millipore Milli-Q pure water (resistivity ≥ 18 MΩcm) and analytical grade reagents were used for preparation of all solutions. Stock solutions were kept in glass vessels in dark at ~6°C. All experiments were performed at room temperature. Instrumentation Graphite substrate was prepared by peeling off basal plane of highly oriented pyrolytic graphite (HOPG, ZYB Grade, 12 mm x12 mm x 2 mm; Momentive Performance Materials Quartz). All electrochemical experiments were carried out on computer-controlled potentiostat-galvanostat Wenking POS2 (Bank Electronik) with software CPC-DA (Bank Elektronik) in a three-electrode electrochemical cell of volume 2 ml with HOPG/pMB as a working electrode, saturated calomel reference electrode (SCE), and platinum wire counter electrode. The pH measurements were carried out with a pH-meter (Jenway 3510) at room temperature. Nanomorphology of pMB layer was examined by the atomic force microscope NanoScope IIIa Multimode, Bruker) in the semicontact mode to minimize tip/surface interactions. The Si cantilevers (OTESPA) were oscillated at ~300 kHz. Preparation of pMB-modified HOPG The electrochemical polymerization of methylene blue was carried out under argon atmosphere in an one-compartment electrochemical cell containing methylene blue monomer solutions in 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) with 0.1 M NaNO3 or 0.1 M K2SO4 saturated by argon. The preparation of pMB films was carried out by voltammetric cycles between -0.6 V and +1.1 V at the sweep rate 100 mVs-1. The polymer growth was controlled by the deposition time or the number of deposition cycles. After electropolymerization both the electrode and the cell were thoroughly rinsed with phosphate buffer containing 0.1 M KCl to remove any remaining monomeric MB. Results and discussion Fig. 1 shows typical cyclic voltammograms obtained during film growth. The voltammetric curve is similar to that obtained on glassy carbon electrode3. Beyond cca 0.8 V the rapidly rising current (wave III) originates from the oxidation of the MB to a cation-radical MB+· formed by the polymerization of monomer. The growth of the polymer film is accompanied by a decrease of the monomer oxidation peak at -0.26 V (I, I') and by an increase of redox waves corresponding to the polymeric MB (II, II'). We observed that the oxidation peak I is decreases in subsequent cycles. It was suggested that initial increase of peak current is in consequence of MB adsorption on the graphite surface. Adsorbed MB monomer shows an oxidation peak at the same potential as that of the monomer from solution.

247

30,0

II 20,0

III

I

6

I.10 , [A]

10,0 0,0 -10,0

I'

-20,0

II'

-30,0 -0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

E, [V]

Fig. 1 The pMB film growth during electropolymerization from a solution containing 0.1 mM MB monomer in 0.1 M phosphate buffer and 0.1 M NaNO3 (pH 8.0). 30 minutes cycling between −0.6 and +1.1 V vs. SCE at scan rate 100 mVs−1. Based on findings published so far2, polymer film thickness was higher when the supporting electrolyte contained SO42- or NO3-, suggesting that these anions catalyze the deposition proces. In our case, this phenomenon was observed just in presence of NO3- in solution. On the contrary, SO42- in supporting electrolyte induced lower response in current peaks of pMB (Fig. 2). For this reason MB was electropolymerized in 0.1 M phosphate buffer containing 0.1 M NaNO3 (pH 8.0). 30,0 20,0

6

I.10 , A

10,0 0,0 -10,0 -20,0 -0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

E, V

Fig. 2 The first and the last sweep of the pMB film growth during electropolymerization of MB from a solution containing 0.1 mM MB monomer in: (___) 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0); (___) 0.1 M phosphate buffer containing 0.1 M NaNO3 (pH 8.0); (---) 0.1 M phosphate buffer containing 0.1 M Na2SO4 (pH 8.0). 30 minutes cycling between −0.6 and +1.1 V vs. SCE at scan rate 100 mVs−1.

248

Anodic and cathodic peak currents depend linearly on the square root of the scan rate. This result implies diffusion controlled processes; in this case the redox process is probably controlled by diffusion of the counter ions from the solution. Cyclic voltammetry was performed to investigate catalytic activity of HOPG/pMB towards sodium sulphide as a model SH-/S2- analyte. For this measurement sodium sulfide was dissolved in 0.1 M phosphate buffer with 0.1 M KCl (pH 8.0). With the first dissociation constant of hydrogen sulfide in aqueous solutions pKa1~7.02 practically all hydrogen sulfide in the solution is in the form of HS-. Based on cyclic voltammetry measuremens, we can conclude that pMB film deposited on HOPG basal plane substrate displays sufficient electrocatalytic activity towards sulfhydryl group and pMB-modified electrode can thus be utilized for construction of potentiometric and amperometric sensor respectively. Atomic force microscopy (AFM) images of the HOPG/pMB provided detailed information about changes in the surface nanomorphology and homogeneity of the deposited film. After modification, spherical nanostructures were found on HOPG basal planes forming relatively homogeneous layer. No significant changes in the nanomorphology of pMB film were found after voltammetric measurement in presence of sulfides. Conclusion In this work poly(methylene blue) film was deposited on the HOPG basal plane substrate. We have investigated electrochemical behavior during electropolymerization and electrochemical properties of resulting HOPG/pMB electrode. Modified electrode exhibits electrocatalytical activity towards sulfhydryl group. Our findings will be utilized for the development of new potentiometric and amperometric sensor respectively. Acknowledgements This work was supported by grant project SVV260084 of Charles University in Prague. References 1. Schelreth D. D., Karyakin A. A.: J. Electroanal. Chem 395, 221 (1995) 2. Barsan M. M., Pinto E. M., Brett C. M. A.: Electrochim. Acta 53, 3973 (2008). 3. Karyakin A. A., Strakhova A. K., Karyakina E. E., Varfolomeyev S. D.: Bioelectrochem. Bioenerg. 32, 35 (1993). 4. Marinho M. J. C, Cabral M. F., Mazo L. H.: J. Electroanal. Chem 685, 8 (2012) 5. Komura T., Niu G. Y., Yamaguchi T., Asano M., Matsuda A.: Electroanalysis 16, 1791 (2004). 6. Silber A., Hampp N., Schuhmann W.: Biosens. Bioelectron. 11, 215 (1996). 7. Rincón R. A., Artyushkova K., Mojica M., Germain M. N., Minteer S. D., Atanassov P.: Electroanalysis 22, 799 (2010) 8. Liu J., Mu S.: Synthetic Metals 107, 159 (1999)

249

250

251

E-mail: [email protected]

tel.: 266 053 877

tel./fax: 286 890 502

DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK AS-DETECTOIL Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod. na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika, čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. – jako kontrolní a bezpečnostní systém.

POPIS ZAŘÍZENÍ Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V – akumulátor, trafo) a z výstupu pro instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a jiného systému. Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí.

TECHNICKÉ ÚDAJE připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 mA; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg

252

ISE sponsored Meeting

253

E-mail: [email protected] tel.: 266 053 877 tel./fax: 286 890 502 Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj

PC ECO - TRIBO voltametrický/POLAROGRAFický analyzátor ● vysoká citlivost ● snadná automatizace ● ideální pro speciaci ● stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook) ● verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP Metody

  

Elektrody

  

DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie, DP a Tast polarografie Chronopotenciometrie s konstantním proudem Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele Miniaturní tužková rtuťová Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná Pevné amalgamové stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová)

Použití Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii) ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace 10-10 až 10-11 mol/l 

stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp. většiny prvků Mendělejevovy tabulky  stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl-, CN-, Br-, J-, SO42-, PO43-, S2-)  sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů, pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů atd.). Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv v běžných podmínkách, bez demontáže Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie, geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd. Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven, průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu; zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi 80 % atd.

Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj analytických metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu, vhodný pro výukové účely.

254

255

© Best servis Ústí nad Labem

256