Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová … … aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o.

Agenda 1

2

2

Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů •

Bradfordové metoda

•

BCA metoda

•

UV 280

•

AAA

IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů •

Výhody IČ spektroskopie – 5 vysoce reálných scénářů

•

Představení systému DirectDetect™

Presentation title in footer | 00 Month 0000

Současný stav kvantifikace proteinů Bradfordové metoda •

Založena na použití Coomassie Brilliant Blue G250

•

Barvička se váže především na bazické aminokyseliny (arginin)

•

Posun absorpčního maxima z 465 nm na 595 nm

•

Měřeno v kyvetách nebo mikrotitračních destičkách (na jedno použití)

•

Nutnost standardní série pro každé stanovení

•

BSA není vhodným standardem pro každé stanovení

•

Známou interferencí jsou detergenty

3


Současný stav kvantifikace proteinů BCA metoda •

Dvoustupňová reakce (biuret + chelatace CuI činidlem BCA)

•

Vzniklá komplexní sloučenina má absorpční maximum 562 nm

•

Redukce CuII → CuI ovlivněna sekvencí (cystein, tyrosin, tryptofan)

•

Opět se měří v kyvetách/mikrotitr. destičkách, nutnost standardní série

•

Známé interference: Redukční činidla (DTT) Chelatační činidla (EDTA) Fosfolipidy, adrenalin, dopamin, chlorpromazin, penicillin a jiné

4


Současný stav kvantifikace proteinů UV – 280 nm absorbance •

Spoléhá na absorpci záření aromatických aminokyselin v primární struktuře

•

Metoda je závislá na znalosti ε280

•

Rychlá metoda bez nutnosti kalibrace

•

Interference – látky, které absorbují v UV (nukleové kyseliny a jiné)

•

Nelineární pro vyšší koncentrace

5


Současný stav kvantifikace proteinů Analýza aminokyselin •

Obecně uznávaná jako „zlatý standard“ v kvantifikaci proteinů

•

Vzorek je rozložen na jednotlivé AK (6M HCl,0.1% fenol;110 ºC;24hod)

•

Následuje separace (iontoměnič), derivatizace (ninhydrin) a detekce

•

Nejde o rutinní, operativní metodu (core facility)

•

Finančně a časově náročná

6


Současný stav kvantifikace proteinů Historické intermezzo

7


NOVINKA 2012: DirectDetect™

8


DirectDetect™ IČ spektroskopie & kvantifikace proteinů Přístroj měří FT-IR spektrum vzorku naneseného na měřící kartu

9


DirectDetect™ Proč právě IČ? • Kvantifikace proteinů je založena na analýze vibračních pásů amidových vazeb – vlastní všem peptidům, proteinům • Měření není závislé na primární struktuře proteinu • Kvantifikace začíná na tripeptidech • Lze použít BSA jako univerzální standard

10


DirectDetect™ – scénář č. 1 Srovnání IČ vs. UV

11


DirectDetect™ – scénář č. 2 SDS ve vzorku

12


DirectDetect™ – scénář č. 3 Tween® 20 ve vzorku

13


DirectDetect™ – scénář č. 4 Redukční činidla ve vzorku

14


DirectDetect™ – scénář č. 5 Proteiny v buněčných lyzátech

15


DirectDetect™ Srovnání IČ a AAA AAA DirectDetect

16


DirectDetect™ Software Součástí přístroje je notebook se SW pro analýzu a uchovávání dat

17


DirectDetect™ Software SW umožňuje: • Analýzu a uchovávání dat z měření • Vytváření vlastních kalibračních křivek • Uživatelská prostředí (operátor vs. administrátor) • Práci se spektry • Export dat

18


2

2

3

3

DirectDetect™ Spotřební materiál – „karta“ Vzorek dávkován na membránu z hydrofilního PTFE, ve které je kroužek z hydrofóbního PTFE – umožňuje co nejpřesnější fokusaci paprsku spektrofotometru na vzorek

• Dynamický rozsah měření: 0,2 – 5 mg/ml • Objem vzorku: pouze 2 µl 48


DirectDetect™ Kvantifikace peptidů Weighted material 4,5

Direct Detect water

4,0 50%MeOH 1%AcOH

Concentration [mg/mL]

3,5 3,0 35%AcCN 0.5%TFA

2,5

50%DMSO

2,0 1,5 1,0

50%DMSO DMSO

0,5 0,0 P1

P2

P3

P4 Peptide

49


P5

P6

DirectDetect™ Karta Tento typ kvantifikace proteinů umožňuje i měření dat zpětně

• DirectDetect (po 60 hod)

• Coomassie (po 30 min)

• BCA (po 30 min)

50


DirectDetect™ Výhody systému • Špičková FT-IR technologie • Neruší detergenty a redukční činidla • Není potřeba znát extinkční koeficient proteinu • Vzorky je možné uchovat pro další reanalýzu • Potřebuje minimum vzorku k měření • Jde o platformu – kvantifikace dalších biomakromolekul (lipipy, NK, cukry) • Kompaktní přístroj (30 x 22 cm)

51


DirectDetect™ Nabídka Systém zahrnuje: -

DirectDetect spektrofotometr

-

Dell Latitude 2120 notebook

-

DirectDetect Software

-

Stojan na notebook

-

Stojánek na karty

-

50 ks karet

52


Děkuji za pozornost. Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. [email protected] +420 737 273 961

53 Presentation title in footer | 00 Month 0000

Sbohem, paní Bradfordová

Recommend Documents