Jindra Vrzalová
„x“ druhů mikrokuliček rozlišených různou kombinací barev (spektrální kód)
na každém druhu je navázána molekula vázající specificky jeden analyt (protilátka, antigen, DNAsonda, …,)
Sandwichová metoda Navázání analytu na mikrokuličky
Poté navázání reporterové molekuly (např. druhá protilátka s phycoerytrinem)
Vyhodnocení pomocí kalibrační křivky pro každý analyt Vzorky mohou být měřeny na přístroji několika typů
Modifikace průtokové cytometrie Mikrokuličky protékají přístrojem jedna po druhé U každé kuličky jsou změřeny fluorescence vzniklé po excitaci 2 různými lasery: Jeden laser určuje barvu kuličky = druh analytu
kvalita Druhý laser stanovuje množství reporterové molekuly = množství analytu
kvantita
Pro celou analýzu se používají mikrofiltrační 96 jamkové destičky
Pro odstranění nenavázaných substancí je používána filtrace přímo na deskách (mikrokuličky s navázanými substancemi zůstávají v desce, vše ostatní je odsáto dnem desky)
Nová možnost separace pro multiplex Výhoda – jednodušší automatizace, lepší reprodukovatelnost
http://www.luminexcorp.com/kitfinder/ Alzheimer Nádorové markery Kardio markery Buněčná signalizace Cytokiny, Chemokiny, růstové faktory Genová exprese a genotypizace Endokrinologie Epigenetika Isotypizace Metabolické markery Nervový a CNS systém Sepse Kožní markery Transkripční faktory Toxikologie Testování očkovacích látek
Analytický přínos Stejná a standardní preanalytika a analytika pro všechny analyty Urychlí a ušetří práci Malé množství materiálu
Klinický a výzkumný přínos Získání obrovského množství dat
Finanční přínos To se vyplatí!!!
Extracelulární proteiny v oběhu Membrána stav receptorů Intracelulární 2. poslové – signální kaskády Transkripční faktory DNA – SNP, mutace, amplifikace mRNA Regulátory translace – např. microRNA proteiny
Sérum Plazma Výpotky Seminální
plazma Supernatanty buněčné kultury Mikrodialyzáty Nitrooční tekutina
• Lidské • Myší • Krysí • (Prasečí)
Ideální
biomarker
1. specifický pro daný typ choroby 2. nepřítomný u osob bez dané choroby 3. koncentrace by měla korelovat s tíží onemocnění / agresivitou
Žádný
současný marker to nesplňuje
Hledání
nových biomarkerů?? Kombinace biomarkerů !!! nový analytický přístup – multiplexové technologie
Existující panely musí být optimalizovány v souladu s klinickými otázkami
Problém: Ověření panelů pro klinické účely vyžaduje studie s velkým počtem pacientů
Dosud nelze statimové vyšetření Nedostatečná validace
Plné využití je možné pouze ve spojení s multiparametrickým hodnocením výsledků Klinické
Technické
Proteiny ve velmi nízkých koncentracích v krvi
Proteiny vyžadující ředění Adhezivní molekuly MMP9 Adiponektin PAI-1
Interleukiny Růstové faktory Chemokiny
Proteiny vyžadující speciální preanalytiku PTH, ACTH
100 (50) analytů v imunoanalýze – dnes pouze teorie
Rozdílné výsledky pro některé analyty:
Serum/EDTA plasma comparison for VCAM
EDTA plasma
4000 3000 y = 0,8447x + 184,18 R2 = 0,7883
2000 1000
VCAM linear trend
0 0
1000
2000
3000
4000
serum
• v séru a v plazmě • v EDTA a citrát. plazmě
Typ materiálu má vliv i na úspěšnost detekce proteinu
Miliony
Kompromis je nezbytný musí být použit materiál vhodný pro většinu proteinů nebo pro nejdůležitější proteiny ve studii
EDTA plasma
Serum/EDTA plasma comparison for MMP9 2,50 2,00 1,50 MMP9 1,00 0,50 0,00 0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50 Miliony
Serum
ACTH
– plasma !!! Insulin Leptin OPN – Osteopontin Osteokalcin Osteoprotegerin PTH – plasma !!!
Vypočtená funkce: Logit = -2,4315 + 1,3156 * MIF - 0,7761 * PRL + 4,1199 * CA125_LU 1,4290 * OPN + 1,3022 * Leptin + 3,7243 * IGF „přiřazuje každému markeru koeficient přírůstku - důležitosti“
Odds ratio
Vypočtené zařazení
skupina
Odds ratio
Vypočtené zařazení
skupina
0,09
0, benigni ?
0
0,09
0, benigni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
0,09
0, benigni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
53,72
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
3,21
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
3073,28
1, maligni ?
1
0,33
0, benigni ?
0
200,2
1, maligni ?
1
0,32
0, benigni ?
0
5,41
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
53,72
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
736,2
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
24,72
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
5,41
1, maligni ?
1
0,04
0, benigni ?
0
197,53
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
200,2
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
3,64
1, maligni ?
1
0,09
0, benigni ?
0
3,25
1, maligni ?
1
Proliferativní typ (PDR) Hlavní důvod slepoty u dospělých v USA ovlivňuje centrální i periferní vidění Následek angiogeneze – zvýšená novotvorba „nekvalitních“ cév, které vedou často k hemoragickým projevům Roli hrají: Angiogenní faktory Antiangiogenní faktory Chemokiny, zánětlivé cytokiny
Stanovení faktorů v nitrooční tekutině
PDR 24.2.2010 VEGF conc.: 7246 pg/ml
Novotvořené cévy
Po léčbě (pars plana vitrectomie): Residuální fibrotická tkáň 13.4.2010 VEGF conc.: 16 pg/ml
Patient was not treated by anti-VEGF drugs
AUC VEGF IL6 IL8 IP10 MCP1 TGFB1 100
Sensitivity
80
60
40
20
0 0
20
40 60 100-Specificity
80
100
95% CI
b
VEGF
0.809
0.634 to 0.924
IL6
0.809
0.634 to 0.924
IL8
0.909
0.756 to 0.981
IP10
0.824
0.652 to 0.934
MCP1
0.670
0.485 to 0.823
TGFB1
0.650
0.465 to 0.807
Panel
gastrointestinálních patogenů Cystická fibróza - genetika Panel respiratorních virových onemocnění Novorozenecký screening Pharmakogenetika - Cytochrome P450 2D6 genotypizace Detekce a diferenciace HSV 1&2 viru u žen Testování
alergií Autoimunitní choroby HLA testování
Děkuji za pozornost
