Samenvatting DNA is het molecuul dat in levende organismen alle genetische informatie bevat. Het komt doorgaans voor als een dimeer van twee complementaire nucleotide-polymeren, waarbij de individuele nucleotiden in het polymeer gekoppeld zijn via fosfodiëster verbindingen. Elke nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suikergroep en een base (zie Figuur 1). Er zijn vier base-soorten die voorkomen in DNA; adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T).
Figuur 1. Algemene structuur van een nucleotide (links) en de structuren van de verschillende basen (rechts).
De specifieke interactie tussen de verschillende basen (adenine koppelt met thymine en guanine met cytosine) door middel van waterstofbruggen zorgt ervoor dat de twee complementaire nucleotide-strengen zich ordenen in een dubbele-helix structuur (Figuur 2). T
A
G
C
G
C
H H H
N
N
O H
G A
T T
N
N
N N
H
C
N
O
N
N
O N N
N N
A
N
H O N
G G
H
C C
A
T
H A
T T
Adenine
Thymine
Guanine
Cytosine
A C
G
Figuur 2. Waterstofbruggen tussen de DNA-basen en een schematische weergave van de dubbele DNAhelix.
De genetische informatie is gecodeerd in de volgorde van de basen in het DNA. Gebruik makend van de specificiteit van de structurele ordening van deze basen, zijn er buiten de dubbele helix ook andere DNA-assemblages mogelijk. Deze unieke eigenschap, samen met de mogelijkheid om vrijwel elke gewenste DNA-volgorde the synthetiseren, stelt men in staat om voorspelbare DNA-assemblages van variërende complexiteit te bouwen, uiteenlopend van twee-dimensionale tot drie-dimensionale structuren. Vanwege haar speciale eigenschappen is het DNA-molecuul gebruikt in verschillende wetenschappelijke onderzoeksvelden, zoals katalyse, synthese en nanotechnologie. Deze
veelzijdigheid van het DNA geeft het potentieel van het molecuul weer om in een toenemend aantal onderzoeksvelden te worden gebruikt en om innovatieve, functionele systemen te creëren. Zo is de toepassing van DNA in nanotechnologie nog slechts in het beginstadium, waardoor mogelijkheden grenzeloos lijken. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift had als doel om nieuwe, functionele systemen gebaseerd op DNA-structuren te ontwikkelen. Hiervoor werd een modulaireassemblage benadering gevolgd, gebruik makend van zowel gefunctionaliseerde als nietgefunctionaliseerde oligonucleotiden. De resulterende, op DNA-gebaseerde systemen lieten zien toe te passen te zijn in de katalyse en synthese, alsmede in moleculaire sensoren licht-oogst-applicaties. Al deze systemen waren gebaseerd op het gebruik van oligonucleotiden met covalent gebonden functionele moleculen. Deze laatste aanpak liet de precieze plaatsing van functionele groepen in de DNA-structuur toe, wat zorgde voor een beter begrip van de systemen en daardoor, voor een makkelijker optimalisatie. In het eerste hoofdstuk van dit proefschrift wordt een overzicht van de toepassingen van het DNA-molecuul in de wetenschap gegeven. Dit hoofdstuk geeft de diversiteit weer van de onderzoeksvelden waarin DNA succesvol is toegepast. Hoewel er dus al tal van DNAapplicaties zijn, blijven er nog vele mogelijkheden over om te verkennen. Hoofdstuk 2 beschrijft de constructie van twee op DNA gebaseerde katalysatoren met een covalent gebonden metaal complex. De katalysatoren werden bestudeerd in de asymmetrische koper(II)-gekatalyseerde Diels-Alder reactie tussen azachalcon en cyclopentadieen (Figuur 3). Verschillende conversie- en enantioselectiviteitswaarden werden verkregen bij gebruik van twee monodentaat-liganden, zoals bijvoorbeeld pyridine, of een bidentaat ligand, zoals bipyridine. De modulaire aard van het systeem liet een snelle optimalisatie toe door de eenvoudige omwisseling van welke gewenste module dan ook. Deze aanpak maakt dus niet alleen gebruik van de makkelijke assemblage door middel van DNA-hybridisatie, maar gebruikt ook de inherente chiraliteit van het DNA om één van de twee mogelijke enantiomeren in overmaat te verkrijgen. Enantiomere overmaten tot 93% werden verkregen met de op bipyridine gebaseerde katalysator.
Figuur 3. Op DNA gebaseerde katalysatoren met covalent gebonden pyridine- (links) en bipyridinegroepen (rechts).
142
Samenvatting
In hoofdstuk 3 werden twee verschillende benaderingen voor het creëren van een kunstmatig ribosoom onderzocht. In dit hoofdstuk werd de sjabloon-functionaliteit van DNA gebruikt om de koppeling tussen aminozuren te bevorderen. Hierbij waren de aminozuren verbonden aan verschillende oligonucleotiden, welke complementair waren aan het DNA-sjabloon (Figuur 4). Het gevolgde ribosoom-ontwerp impliceert het gebruik van beschermde aminozuren, waardoor een ontschermingsstap nodig is voordat de peptide-koppeling plaats kan vinden. De twee onderzochte benaderingen maken gebruik van verschillende ontschermingsmethoden; palladium gekatalyseerde ontscherming van Alloc-beschermde aminozuren en lichtgeïnduceerde ontscherming van onitrobenzylcarbamaat-derivaten. Pogingen om de ontscherming volgens de eerste methode uit te voeren waren niet succesvol. Echter, ontscherming door middel van bestraling met licht was niet alleen mogelijk in het geïsoleerde beschermde aminozuuroligonucleotide-conjugaat, maar ook wanneer deze was geïntegreerd in het kunstmatige ribosoom. Ondanks het feit dat de koppeling tussen aminozuren na ontscherming nog niet is waargenomen, zijn de resultaten aanmoedigend. Koppelingsreacties tussen overeenkomstige groepen komen voor in de natuur, dus is het goed mogelijk dat een optimalisatie van het systeemontwerp zal resulteren in de vorming van de gewenste peptide verbinding.
Figuur 4. Schematische weergave van een kunstmatig ribosoom.
De sjaboon-functionaliteit van DNA vormt ook een essentieel onderdeel in het onderzoek dat wordt beschreven in hoofdstuk 4. In dit onderzoek werden twee afzonderlijke oligonucleotiden, beiden gebonden aan één helft van een enzym (murine dihydrofolaatreductase (mDHFR)), gecombineerd met een complementair DNA-sjabloon. De hybridisatie van de oligonucleotide-componenten met een sjabloon-streng maakte een herassemblage van het gesplitste enzym mogelijk, waarmee haar katalytische activiteit werd hersteld (Figuur 5). De katalytische activiteit van het enzym bleek gemoduleerd te worden door het inbouwen van een variërend aantal verkeerde baseparingen in het DNA-sjabloon. Bovendien werd laten zien dat deze activiteit afhankelijk is van de concentratie van het gebruikte DNA-sjaboon.
143
Figuur 5. Schematische weergave van de herassemblage van het gesplitste enzym door middel van DNA hybridisatie.
Een directe toepassing van dit enzymatische systeem, het maken van een moleculaire sensor, wordt besproken in hoofdstuk 5. Het ontwerp omvat een combinatie van het in hoofdstuk 4 beschreven systeem en een moleculaire herkenningsgroep, zoals bijvoorbeeld een adenosinetrifosfaat (ATP) aptameer (Figuur 6). De gekozen aanpak is gebaseerd op het vrijkomen van een deel van de sjabloon-DNA streng in een DNAherstructurering ten gevolge van herkenning van het ATP molecuul. Het vrijkomen van dit deel van het sjabloon is essentieel voor de correcte DNA hybridisatie en de daaropvolgende herassemblage van het gesplitste enzym. Verschillen in de enzymatische activiteit werden waargenomen bij de aan- of afwezigheid van het doel-molecuul (ATP), wat betekent dat de DNA-herstructurering die nodig is voor de herassemblage van het enzym daadwerkelijk plaatsvindt wanneer ATP wordt herkend. Een evenwicht tussen de stabiliteit van het gevouwen aptameer en het gehybridiseerde enzymatische systeem is nodig voor een optimale prestatie van het geheel. Het ontwerp van de aptameer-DNAsjabloon streng is dus cruciaal, waardoor de gevoeligheid van de sensor wellicht kan worden verhoogd door de base-volgorde in het DNA.
Figuur 6. Schematische weergave van de door ATP-geïnitieerde herassemblage van een gesplitst enzym.
144
Samenvatting
Het laatste experimentele hoofdstuk van dit proefschrift beschrijft de constructie van een licht-oogst systeem gebaseerd op een DNA G-quadruplex (Figuur 7).
N
NH
N N
N HN
N
N
Figuur 7. Schematische weergave van de op een G-quadruplex gebaseerde, kunstmatige licht-oogstantenne. E.O. = energieoverdracht.
In deze specifieke door DNA aangenomen structuur is het mogelijk om donor (coumarine) en acceptor moleculen (porfyrine) te plaatsen in de onderlinge orientatie die nodig is om energieoverdrachtsprocessen plaats te laten vinden. Bij gebruik van DNA strengen die niet in staat waren om de quadruplex structuur te vormen, werd overeenkomstig ook geen energieoverdracht waargenomen.
145
