SALMONELLA SSP. GYORS, MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL TÖRTÉNŐ DETEKTÁLÁSA Nyirő-Fekete B., Tabajdi-Bajza N., Kovácsné Kis É., Pocklán E., Zoller L., Micsinai A., Gasparikné Reichardt J. Hungalimentaria 2015.04.22-23.
BEVEZETÉS • • • •
élelmiszerekben és takarmányokban előforduló patogén mikroorganizmusok idő- és munkaigényes klasszikus eljárások igény a biztonságos, de gyorsabb, pontosabb kórokozók kimutatásárára számos új, gyors eljárás (BAX, Microseq ABI valamint legújabban a 3M Molecular Detection System készülék)
Cél: - a 3M új elven működő, izotermális rendszer PCR rendszerek - készülékek kimutatási határ értékei - mesterségesen beoltott kísérő mikroflóra hatása - a kémiai fertőtlenítőszerek maradványainak hatása - teljesen vagy részlegesen inhibíciót adó minták vizsgálata
BEVEZETÉS A 3M Molecular Detection System (MDS) és a PCR összehasonlítása: 3M izotermális DNS amplifikáció
PCR (polimeráz lánc reakció)
Bst DNS polimeráz
Taq DNS polimeráz
Primerek száma
6 (+)
2
DNS denaturáció
állandó hőmérséklet
hő ciklikusan ismétlődő fűtés és hűtés: DNS denaturáció (94°C) és enzimatikus DNS replikáció (55°C majd 72°C)
Enzim
Reakció hőmérséklete Amplifikáció Detekció
izotermikus (60°C)
folyamatos
ciklikus
biolmineszencia
fluoreszencia
3M MDS elve LAMP PCR – loop mediated isothermal amplification Folyamatos amplifikáció izotermális körülmények között – gyorsabb futás
1c 2c
3c
4c
2
3
4
5
6
1c 2c
3c
4c
5c
6c
1
3
2
2
3c 2c
3c
6c
5c 4
4c 3c
2c
5c
4
1
2
3
4
5
6
1c
2c
3c
4c
5c
6c
3c
3
5c 4 6c 5 6
4
1c
Robosztus: PCR inhibitorokra kevésbé érzékeny
6
3
1
Bst DNS polimeráz – letolja az előzőleg képződött szálat a komplementer szálról
5
4
2
1
Bonyolult rendszer: 6 primer – 8 célszakasz – specifikusság növelése
3
2
1
2
4
3
4c
5
3 4 3c 4c 5 2c 5c 4
3 3 2c 3c
4c 5c 4 4 4c 4
5c
5 4c
3M MDS elve
BEVEZETÉS A hagyományos Salmonella vizsgálat időigénye ISO
Hagyományos vizsgálati módszer
Elődúsítás 16-20 h
1. nap
Szelektív dúsítás 20-48 h
Szelektív agar 48-72 h
Biokémiai reakciók, Megerősítő vizsgálatok 72 h-
2. nap
3. nap
4 - 7. nap
Minta előkészítési eljárások PCR eljárás –BAX előkészítés/dúsítás (25g/225ml BPW) inkubáció 37 °C – 18-24±2 óra
utódúsítás: BHI levesben (37°C, 3 óra) lízis reagens előkészítése
PCR eljárás–ABI előkészítés/dúsítás (25g/225ml BPW) inkubáció 37 °C – 18-24±2 óra centrifugálás majd felülúszó eltávolítása homogenizálás lízis reakció: 100 °C , 10 perc
lízis reakció: 37 °C – 20perc 95 °C – 10perc/hűtési idő – 5perc
homogenizálás centrifugálás
50 µL lizált minta
Értékelés: program (automatizált) kapacitás: 96 minta detekciós idő: 3,5 óra
DNS higítás 30 µL lizált minta Értékelés: program (automatizált) kapacitás: 96 minta detekciós idő: kb. 80 perc
3M Molecular Detection System eljárás-MDS előkészítés/dúsítás (25g/225ml BPW) inkubáció 37 °C – 18-24±2 óra
minta
közvetlenül a lízis csőbe forgatás: 3-5X hőkezelés: 100°C-15perc hűtés – 10 perc forgatás: 3-5X vízszintes mozgatás: 3X állni hagyni (5 perc) 20 µL lizált minta
(liofilizált pelletet tartalmazó reagens cső)
amplifikáció és detekció 15-75 percben Színkódolt valós idejű (real-time) eredmény. kapacitás: 96 minta
VIZSGÁLT MINTÁK Korábbi vizsgálatokban teljesen vagy részlegesen inhibíciót adó minták előkészített húsok fűszerek kakaópor sötét, színes gyümölcsök (valamilyen erős festékanyag) tejpor kávé aroma kémiai fertőtlenítőszerek maradványai stb. Fals pozitív előkészített húsok, nyers húsok „fals pozitivitás”----holt sejtek kimutatása ---- higiéniai indikátor! kiszűrés: elődúsítás nélküli vizsgálat Enterobaktériumok (pl. Citrobacter spp.)
EREDMÉNYEK A módszerek érzékenysége/kimutatási határa EREDMÉNYEK (pozitív/negatív)
Salmonella tranoroa
Hígitási tagok
BAX
ABI
MDS
EREDMÉNYEK Hagyományos tenyésztéssel
*10-8
-
-
-
0
*10-7
-
-
-
7
*10-6
-
-
-
50
*10-5
-
-
-
456
*10-4
+
-
+
SZÁMLÁLHATATLAN
*10-3
+
+
+
SZÁMLÁLHATATLAN
*10-2
+
+
+
SZÁMLÁLHATATLAN
*10-1
+
+
+
SZÁMLÁLHATATLAN
hígítási sor elődúsítás nélkül vizsgálat: protokollok alapján
MDS kimutatási határ: ~103 kópia/reakció
EREDMÉNYEK Salmonella tranoroa kimutatása Citrobacter freundii baktérium jelenlétében EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) BAX ABI MDS kontroll
-
-
-
Salmonella (~102) Citrobacter (~103)
+
+
+
Salmonella (~102) Citrobacter (~104)
+
+
+
Salmonella (~102) Citrobacter (~105)
+
+
+
Salmonella (~102)
+
+
+
Citrobacter (~105)
-
-
-
Nincs zavaró hatás
ferde agar tenyészetekszuszpenzió 1:1 arány mátrix: darált sertéshús 25 g minta+225 ml előmelegített pufferelt peptonvíz - dúsítás (ISO), 37±1°C, 24 h vizsgálat: protokollok alapján 3 párhuzamos vizsgálat
EREDMÉNYEK EREDMÉNYEK (pozitív/negatív)
MDS
BAX
ABI
Fertőtlenítőszer1
-
-
-
Fertőtlenítöszer2
-
-
-
Fertőtlenítöszer3
-
-
-
Fertőtlenítöszer4
? INH
-
-
Fertőtlenítöszer5
-
-
-
Fertőtlenítöszer6
-
-
-
Fertőtlenítöszer7
-
-
-
Fertőtlenítöszer8
-
-
-
Fertőtlenítöszer9
-
-
-
Steril alkohol
-
-
-
Fertőtlenítőszer1 + Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer2 + Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer3 + Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer4 + Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer5+ Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer6+ Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer7+ Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer8 + Salmonella (~107)
+
+
+
Fertőtlenítőszer9+ Salmonella (~107)
+
+
+
+
+
+
FERTŐTLENÍTŐSZER
Steril alkohol + Salmonella
(~107)
Befolyásolják-e kémiai fertőtlenítőszerek a S. tranoroa detektálhatóságát környezeti higiéniai minták esetében? 9 ml BPW (ISO) 1 ml ~107 Salmonella tranoroa szuszpenzió 1 ml 3%-os fertőtlenítőszer oldat dúsítás előmelegített pufferelt peptonvízben (ISO), 37±1°C, 24 h vizsgálat: protokollok alapján
Nincs zavaró hatás
EREDMÉNYEK EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE
egész szegfűszeg
gyümölcsös teafű
őrölt fűszerkömény
kakaópor
tejpor
őrölt pörkölt kávé
spenótpor
fűszer paprika
MDS
BAX
ABI
-
-
? INH
-
-
? INH ? INH ? INH
-
-
? INH
-
-
? INH ? INH ? INH ? INH
-
-
-
-
-
-
-
-
? INH ? INH ? INH -
EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE
paprika aroma
MDS
BAX
ABI
-
-
-
-
-
-
dió
-
-
-
? INH
-
-
? INH
-
? INH
-
szójaliszt
? INH
-
-
-
-
-
-
-
-
-
karotin
egész fahéj
-
-
-
? INH
-
-
? INH
-
-
-
? INH
-
-
-
-
-
-
-
60 vizsgált minta (abszolút negatív)
40 minta: negatív
20 minta: inhibíció
-
-
-
-
-
-
? INH
-
-
-
balzsam ecet
25 g minta+225 ml előmelegített pufferelt peptonvíz- dúsítás (ISO), 37±1°C, 24 h
-
-
flavonoidok
-
Inhibitorokat tartalmazó minták vizsgálata
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
MDS, BAX kíválóan teljesített
EREDMÉNYEK
S. tranoroa-val kontaminált inhibitoros minták vizsgálata
EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE
egész szegfűszeg
őrölt fűszerkömény
kakaópor
tejpor
őrölt pörkölt kávé
spenótpor
MDS
BAX
ABI
+
-?
+
? INH
+
+
? INH
+
+
? INH
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-?
+
? INH
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
? INH
+
? INH
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
MINTA MEGNEVEZÉSE fűszerpaprika
paprika aroma
dió
szója liszt
karotin
egész fahéj
flavonoidok
balzsam ecet
EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MDS BAX ABI + -? + -? + + + + + + + -? + ? INH + + ? INH + + ? INH + ? INH + ? INH + + + + + + + + + + + + + + + + + ? INH + ? INH + + -? + + -? + + + + + + + + + + + -? + -? + + + + + + + -? + -?
minta + ~103 nagyságrendű Salmonella tranoroa
54 vizsgált minta (abszolút pozitív)
11 minta: ”fals” negatív 30 minta: pozitív
13 minta: inhibíció
EREDMÉNYEK Salmonella spp. jelenlétének vizsgálata BAX és MDS készülékekkel valós takarmány és környezet higiéniai mintákban Összesen vizsgált minták száma: 184
BAX valamennyi minta negatív
MDS 2 inhibíció/kérdéses: száraz takarmányminta 2 inhibíció/kérdéses: környezet higiéniai minta 3 pozitív: környezet higiéniai minta (nem tipikus pozitív MDS görbe)
Konklúzió 1.
2.
3.
4.
5.
A 3M Molecular Detection System és a BAX rendszerrel történt vizsgálatok hasonló eredményt adtak a kimutatási határ meghatározása során. Ez az ABI eljárásnál egy nagyságrenddel nagyobb volt, mint az előbb említett két másik módszernél. Mindhárom eljárás hasonlóan viselkedett a kísérő mikroflóra jelenlétében. A protokoll szerint elvégezett vizsgálatok alapján a Salmonella tranoroa detektálását a kísérő baktérium (Citrobacter freundii) nem akadályozta. BAX, MDS, ABI készülékek a kémiai fertőtlenítőszerek jelenlétében is megbízható eredményt adtak. MDS és BAX készülékkel az erős mátrix hatású minták esetében kiváló eredményeket kaptunk szemben az ABI módszerrel, mely több esetben is inhibíciót adott. A valódi takarmány és környezet higiéniai minták vizsgálata BAX és ezzel párhuzamosan vizsgált MDS eljárással kérdéseket vetett fel. 184 mintából az MDS készülékkel elvégzett vizsgálatokból 7 kérdéses, míg ugyanezen mintákra kapott eredmény BAX eljárással valamennyi negatív volt.
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!
