Funkční vzorek
ELISA test pro stanovení specifických prasečích IgA protilátek proti O-antigenům Salmonella enterica ssp. Enterica sérovar Typhimurium
Autoři MVDr. Ján Matiašovic, Ph.D. Hana Kudláčková Mgr. Jan Gebauer MVDr. Alena Osvaldová
Funkční vzorek byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu (QJ1210115), Ministerstva zemědělství České republiky (MZe 0002716202) a projektu AdmireVet (CZ.1.05/2.1.00/01.0006, ED0006/01/01). 2013
ISBN 978-80-86895-37-6
Funkční vzorek
ELISA test pro stanovení specifických prasečích IgA protilátek proti O-antigenům Salmonella enterica ssp. Enterica sérovar Typhimurium
Autoři MVDr. Ján Matiašovic, Ph.D. Hana Kudláčková Mgr. Jan Gebauer MVDr. Alena Osvaldová
Funkční vzorek byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu (QJ1210115), Ministerstva zemědělství České republiky (MZe 0002716202) a projektu AdmireVet (CZ.1.05/2.1.00/01.0006, ED0006/01/01).
2013
2
OBSAH
Úvod
4
I. Cíl metodiky
5
II. Vlastní popis metodiky
5
II.1. Metodika ELISA reakce
5
II.2. Validace ELISA reakce
6
III. Srovnání „novosti postupů“
10
IV. Popis uplatnění certifikované metodiky
10
V. Ekonomické aspekty
10
VI. Seznam použité související literatury
10
VII. Seznam publikací s využitím funkčního vzoru
11
Dedikace
11
3
Úvod Nejčastějšími původci salmonelových infekcí prasat v České republice i většiny zemí Evropské unie jsou netyfoidní sérovary Salmonella enterica, zejména pak sérovary Typhimurium a Derby, které se vyskytují v přibližně 65% případů kultivačního záchytu salmonel. Dalších 25% případů představují sérovary Enteritidis a Agona (EFSA 2008). Sérovary Typhimurium a Derby mají shodné O-antigeny lipopolysacharidového obalu (O1, O4, O5, O12), sérovary Enteritidis (O1, O9, O12) a Agona (O4, O12) se s nimi shodují ve dvou O-antigenech (Murray a kol., 1995). O-antigeny jsou imunogenní a u prasat se proti nim vytváří protilátková odpověď (Nielsen a kol., 1995). Použití lipopolysacharidu S. Typhimurium jako antigenu v ELISA soupravě tak umožňuje detekci protilátek proti všem čtyřem sérovarům salmonel. Kromě náhodných infekcí původem z kontaminovaného krmiva nebo prostředí (Boughton a kol., 2007) jsou zdrojem infekce prasat jedinci vylučující salmonely trusem. Častým zdrojem infekce pro selata jsou jejich latentně infikované matky. Po odstavu selata z infikovaných vrhů dál šíří infekci mezi dosud neinfikovaná selata (Proux a kol., 2001). K infekci prasat dochází nejčastěji orální cestou. Po průchodu žaludkem se salmonely množí ve střevu a pronikají zejména přes stěnu ilea do submukózy a lymfatických orgánů (Scherer et al., 2008). Slizniční imunita tak má významnou úlohu při obraně organismu před infekcí a její důležitou složkou jsou IgA protilátky přítomné v lumenu střeva (Matiasovic a kol. 2013). IgA protilátky se dostávají do kolostra ze séra, později do mléka také sekrecí B-lymfocytů usídlených v mléčné žláze (Porter a kol. 1970). Nízké hladiny IgA protilátek proti lipopolysacharidu S. Typhimurium v séru odpovídají nízkým hladinám IgA protilátek v kolostru, naproti tomu při absorbanci IgA v séru vyšší než 0,3 je následně v kolostru vysoká hladina IgA protilátek proti lipopolysacharidu S. Typhimurium (Graf 1). Měření hladiny IgA protilátek proti lipopolysacharidu S. Typhimurium v séru nebo kolostru prasnice tak umožňuje odhadnout chráněnost selat před infekcí S. Typhimurium.
4
Graf 1: Vztah hladiny IgA proti lipopolysacharidu S. Typhimurium v séru a kolostru
I.
Cíl metodiky
Cílem metodiky bylo zavést a validovat ELISA test, který bude umožňovat detekci specifických IgA protilátek proti S. Typhimurium v prasečím séru, plazmě, kolostru, mléku a obsahu střev. Taková ELISA metoda není v současné době komerčně dostupná.
II.
Vlastní popis metodiky II.1. Metodika ELISA reakce Specifický antigen použitý v testu je komerčně dostupný lipopolysacharid S.
Typhimurium (Sigma-Aldrich, kat. č. L6511).
5
Jamky mikrotitrační desky (Maxisorp, Nunc, Dánsko) jsou potaženy antigenem ředěným v příslušném pracovním ředění v karbonát-bikarbonátovém pufru (0.05 M, pH 9.6) v objemu 100 μl na jamku (inkubace 16 hodin, 4ºC). Následně jsou desky třikrát promyty PBS s obsahem 0,05% tweenu (PBS-T, pH 7,2). Vyšetřované vzorky prasečího séra nebo plazmy jsou ředěny 100x, vzorky kolostra a mléka 1000x a vzorky střevního obsahu 2x v PBS-T s přídavkem 0,5 % kaseinového hydrolyzátu a v objemu 100 μl jsou aplikovány do jamek mikrotitrační desky. Po inkubaci (1h, 37°C, vlhká komůrka) je deska třikrát promyta roztokem PBS-T a do jamek je přidáno 100 μl konjugátu značeného křenovou peroxidázou (Goat anti-pig IgA conjugate, Bethyl Laboratories, Montgomery, USA) v příslušném pracovním ředění. Po inkubaci (60 min, 37°C, vlhká komůrka) je deska opět třikrát promyta a do jamek je přidáno 100 μl roztoku substrátu s chromogenem TMB Complete (Test-line, Brno, Česká republika). Enzymatická reakce je zastavena po 10 minutách 50 μl 2M kyseliny sírové. Výsledná absorbance je odečítána při 450 nm pomocí multikanálového spektrofotometru Synergy H1 (Biotek, USA). Vyšetřované vzorky a standardní pozitivní a negativní kontrolní séra jsou testovány vždy v duplikátech. Pracovní ředění antigenu a konjugátu je ověřováno boxovou titrací se standardními vzorky sér vždy pro každou novou šarži antigenu a nebo konjugátu. Hranice pozitivity vyšetřovaných vzorků byla určena průměrem hodnot naměřených absorbancí kontrolních sér neinfikovaných zvířat a trojnásobkem směrodatné odchylky tohoto průměru.
II.2. Validace ELISA reakce a) Homogenita potažení mikrotitrační desky: Test byl proveden na jedné 96 jamkové desce dané výrobní šarže s jedním vzorkem séra. Byl proveden standardní ELISA test dle pracovního postupu uvedeného výše. Výsledek testu je vyjádřen pomocí průměrné hodnoty absorbancí vyšetřovaného vzorku séra a variačního koeficientu (CV). Vzhledem k okrajovému efektu nejsou do výpočtu hodnoty absorbancí krajních jamek desky (šedá barva). Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 1.
6
Tabulka 1: Výsledky testu homogenity potažení mikrotitrační desky
průměrná hodnota absorbance:
1,018
směrodatná odchylka výběrová:
0,089
variační koeficient (%):
8,755
b) Opakovatelnost (intra-assay variability): Tento test byl proveden v jedné výrobní šarži mikrotitračních desek se dvěma negativními (N1 a N2) a dvěma pozitivními (P1 a P2) vzorky séra v šestnácti replikacích od každého vzorku dle standardního pracovního postupu uvedeného výše. Pro každý vzorek byla vypočítána průměrná hodnota absorbance, směrodatná odchylka výběrová a variační koeficient (Tabulka 2). Výsledkem testu je variační koeficient pro celý rozsah měření. Tabulka 2: Výsledky testu opakovatelnosti (intra-assay variability):
číslo měření 1
N1 0,121
N2 0,188
P1 1,063
P2 1,924
2
0,100
0,198
1,123
1,723
3
0,144
0,232
1,091
1,899
4
0,095
0,232
1,078
1,806
7
5
0,136
0,257
1,080
1,758
6
0,088
0,289
1,053
1,900
7
0,085
0,298
0,979
1,737
8
0,117
0,265
1,018
1,860
9
0,129
0,205
1,143
1,953
10
0,092
0,248
1,110
1,835
11
0,122
0,216
1,166
1,841
12
0,117
0,255
1,027
1,904
13
0,112
0,293
1,180
2,063
14
0,081
0,240
1,042
1,801
15
0,110
0,222
0,993
1,763
16
0,124
0,217
1,087
1,821
průměrná hodnota absorbance:
0,109
0,241
1,077
1,849
směrodatná odchylka výběrová:
0,016
0,033
0,056
0,086
variační koeficient (%):
14,867
13,554
5,244
4,679
směrodatná odchylka výběrová pro celý rozsah:
0,055
variační koeficient pro celý rozsah (%):
10,649
c) Opakovatelnost (inter-assay variability): Zkouška byla provedena na deskách pocházejících z jedné výrobní šarže. Testování bylo provedeno jako deset samostatných analýz. Byly testovány dva negativní (N1 a N2) a dva pozitivní (P1 a P2) vzorky sér, každý vzorek v kvadruplikátu dle standardního pracovního postupu uvedeného výše. Pro každý vzorek byla vypočítána průměrná hodnota absorbance ze všech testů, dále směrodatná odchylka výběrová a variační koeficient pro celý rozsah měření (Tabulka 3). Tabulka 3: Výsledky testu opakovatelnosti (inter-assay variability)
číslo měření
N1
N2
P1
P2
1
0,139
0,245
1,154
1,980
2
0,097
0,244
1,105
2,127
3
0,120
0,321
1,067
2,011
4
0,113
0,337
1,075
1,923
5
0,143
0,313
0,951
1,638
8
6
0,133
0,275
0,990
1,606
7
0,089
0,277
0,938
1,651
8
0,122
0,325
0,971
1,835
9
0,135
0,295
0,961
1,654
10
0,120
0,235
0,888
1,687
11
0,129
0,221
0,950
1,632
12
0,114
0,221
0,923
1,664
13
0,126
0,308
0,902
1,635
14
0,088
0,261
0,886
1,684
15
0,088
0,234
0,961
1,714
16
0,092
0,221
0,976
1,798
17
0,098
0,286
0,929
1,613
18
0,092
0,245
0,882
1,676
19
0,081
0,245
0,948
1,876
20
0,085
0,226
0,960
1,814
21
0,099
0,333
0,875
1,886
22
0,083
0,230
0,998
1,803
23
0,089
0,236
0,880
1,700
24
0,107
0,258
0,907
1,776
25
0,130
0,265
0,987
1,892
26
0,114
0,228
0,912
1,821
27
0,137
0,236
0,934
1,823
28
0,121
0,220
0,978
1,785
29
0,118
0,320
0,990
1,746
30
0,109
0,280
0,995
1,917
31
0,144
0,312
0,886
1,712
32
0,122
0,326
1,145
1,879
33
0,082
0,232
1,048
1,891
34
0,080
0,226
1,045
1,902
35
0,083
0,235
0,989
1,880
36
0,112
0,311
1,059
1,944
37
0,116
0,257
1,080
1,924
38
0,083
0,289
1,053
1,723
39
0,124
0,298
0,979
1,899
40
0,094
0,265
1,018
1,806
N1
N2
P1
P2
průměrná hodnota absorbance:
0,109
0,267
0,979
1,798
směrodatná odchylka výběrová:
0,020
0,037
0,072
0,123
9
variační koeficient (%):
18,045
směrodatná odchylka výběrová pro celý rozsah:
0,074
variační koeficient pro celý rozsah (%):
12,472
III.
13,973
7,380
6,848
Srovnání „novosti postupů“
ELISA metoda pro stanovení specifických IgA protilátek prasat proti O-antigenům netyphoidních sérovarů salmonel prasat není komerčně dostupná.
IV.
Uplatnění funkčního vzoru
ELISA metoda pro stanovení specifických IgA protilátek proti O-antigenům S. Typhimurium je používána v laboratoři autorů k výzkumným účelům. Potenciál dalšího využití metody je v komerčním stanovení odhadu protektivity kolostrální imunity proti S. Typhimurium předávané prasnicemi selatům.
V.
Ekonomické aspekty Metoda je na pracovišti autorů zavedena a používána. Komerční využití závisí na
zavedení vakcinace prasnic proti netyphoidním sérovarům Salmonella enterica. VI.
Seznam použité a související literatury
1. 2.
The EFSA Journal, 2008, 135: 1-111. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H. Manual of Clinical Microbiology. Washington, DC: ASM Press. 1995. 3. Nielsen, B., Baggesen, D., Bager, F., Haugegaard, J., Lind, P. The serological response to Salmonella serovars typhimurium and infantis in experimentally infected pigs. The time course followed with an indirect anti-LPS ELISA and bacteriological examinations. Veterinary Microbiology, 1995, 47: 205-18.
10
4. 5. 6.
7.
8.
VII. 1.
Boughton, C., Egan, J., Kelly, G., Markey, B., Leonard, N. Rapid infection of pigs following exposure to environments contaminated with different levels of Salmonella typhimurium. Foodborne Pathogen and Disease, 2007, 4: 33-40. Proux, K., Cariolet, R., Fravalo, P., Houdayer, C., Keranflech, A., Madec, F. Contamination of pigs by nose-to-nose contact or airborne transmission of Salmonella Typhimurium. Veterinary Research, 2001, 32: 591-600. Scherer, K., Szabó, I., Rösler, U., Appel, B., Hensel, A., Nöckler, K. Time course of infection with Salmonella typhimurium and its influence on fecal shedding, distribution in inner organs, and antibody response in fattening pigs. Journal of Food Protection 2008, 71: 699–705. Matiasovic, J., Kudlackova, H., Babickova, K., Stepanova, H., Volf, J., Rychlik, I., Babak, V., Faldyna, M. Impact of maternally-derived antibodies against Salmonella enterica serovar Typhimurium on the bacterial load in suckling piglets. Veterinary Journal, 2013, 196: 114-115. Porter, P., Noakes, D.E., Allen, W.D. Secretory IgA and antibodies to Escherichia coli in porcine colostrum and milk and their significance in the alimentary tract of the young pig. Immunology. 1970, 18:245-257.
Seznam publikací s využitím funkčního vzoru Matiasovic, J., Kudlackova, H., Babickova, K., Stepanova, H., Volf, J., Rychlik, I., Babak, V., Faldyna, M. Impact of maternally-derived antibodies against Salmonella enterica serovar Typhimurium on the bacterial load in suckling piglets. Veterinary Journal, 2013, 196: 114-115.
Dedikace Funkční vzorek ELISA test pro stanovení specifických prasečích IgA protilátek proti O-antigenům Salmonella enterica ssp. Enterica sérovar Typhimurium byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu (QJ1210115), Ministerstva zemědělství České republiky (MZe 0002716202) a projektu AdmireVet (CZ.1.05/2.1.00/01.0006, ED0006/01/01).
11
Vydal:
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Hudcova 70, 621 00 Brno
Název:
ELISA test pro stanovení specifických prasečích IgA protilátek proti Oantigenům Salmonella enterica ssp. Enterica sérovar Typhimurium
Autoři:
MVDr. Ján Matiašovic, Ph.D. Hana Kudláčková Mgr. Jan Gebauer MVDr. Alena Osvaldová
Funkční vzorek ELISA test pro stanovení specifických prasečích IgA protilátek proti Oantigenům Salmonella enterica ssp. Enterica sérovar Typhimurium byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu (QJ1210115), Ministerstva zemědělství České republiky (MZe 0002716202) a projektu AdmireVet (CZ.1.05/2.1.00/01.0006, ED0006/01/01).
12
