4 Ruang Lingkup Penelitian Penelitian meliputi pengambilan dan sterilisasi sampel, isolasi DNA genom pada jaringan tanaman padi, amplifikasi gen 16S rRNA dan gen nifH, analisis keragaman menggunakan teknik DGGE dan konstruksi pohon filogenetik.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Padi Padi merupakan tanaman yang memiliki karakteristik tipe rumput dengan umpun kuat, termasuk tumbuhan annual (berumur 1 tahun), tinggi tanaman bervariasi antara 1,5-2 m, helaian daun berbentuk garis (linearis) dengan tepi yang kasar dan panjangnya 15-80 cm. Tanaman padi memiliki malai dengan panjang 15-40 cm yang tumbuh keatas dengan ujung menggantung. Buah tanaman padi tersusun atas bulir yang memiliki bentuk beragam, panjang bulir 7-10 mm dan memiliki lebar ± 3 mm. Buah tanaman padi ini mengandung pati (van Steenis et al. 2008). Pengelompokan tanaman padi secara taksonomi adalah sebagai berikut Dasuki (1991): Dunia : Plantae Kelas : Monocotyledoneae Sub-Kelas : Commelinidae Ordo : Cyperales Famili : Poaceae Genus : Oryza Spesies : Oryza sativa Fiksasi Nitrogen Fiksasi nitrogen merupakan proses pengubahan dinitrogen (N2 atau N N) menjadi amonia (NH3) yang berguna untuk pertumbuhan tanaman. Reaksi yang terjadi pada semua mikrob pemfiksasi nitrogen dalam proses fiksasi gas nitrogen dikatalisis oleh enzim nitrogenase (Kaminski et al. 1998). Nitrogenase terdiri atas 2 jenis komponen protein yang sensitif terhadap oksigen. Komponen 1 (dinitrogenase) terdiri atas protein besi-molibdenum yang mengandung 2 subunit. Komponen 2 (dinitrogenase reduktase) terdiri atas protein besi-sulfur yang mentransferkan elektron pada dinitrogenase. Protein-protein ini beserta ATP, Mg2+, dan sumber elektron merupakan komponen-komponen yang esensial dalam aktivitas fiksasi N2 (Moat et al. 2002). Nitrogenase memerlukan donor elektron dari adenosin-3-fosfat (ATP) untuk memulai proses fiksasi nitrogen. Elektron dihasilkan secara in vivo, baik secara oksidatif maupun fotosintetik. Siklus oksidasi-reduksi dimulai ketika elektron ini ditransfer ke flavodoxin atau ferredoxin, (4Fe-4S) yang mengandung
5 elektron carrier yang mentransfer elektron ke protein Fe dari nitrogenase. Dua molekul MgATP terikat pada Fe protein yang tereduksi dan dihidrolisis untuk menghasilkan elektron yang akan ditransfer ke protein FeMo. Proses reduksi molekul N2 terjadi pada protein FeMo melalui beberapa tahapan reaksi. Transfer elektron harus terjadi sebanyak enam kali pada setiap molekul N2 yang difiksasi. Oleh karena itu total ATP yang dibutuhkan untuk memfiksasi molekul N2 yaitu 12 ATP, akan tetapi nitrogenase juga mereduksi proton menjadi H2. Reaksi tersebut menggunakan dua elektron, sehingga total energi yang digunakan untuk mereduksi molekul N2 menjadi NH3 yaitu 8 elektron yang ditransfer dan 16 MgATPs yang dihidrolisis (Cheng 2008). Enzim nitrogenase merupakan enzim yang diekspresikan ketika N2 merupakan sumber nitrogen satu-satunya, karena gen yang menyandikan fiksasi nitrogen dihambat oleh sumber nitrogen yang disuplai secara eksogen (contoh: amonia) (White 2000). Kompleks nitrogenase mengandung dua protein yang terpisah. Komponen 1 (dinitrogenase) merupakan komponen yang terdiri atas empat sub unit 240 kDa yang disandikan oleh gen nifD dan nifK. Kofaktor besimolibdenum (FeMo-co) dari dinitrogenase disintesis oleh beberapa gen nif (nif Q, B, V, N, E). Komponen 2 (dinitrogenase reduktase, disandikan oleh gen nifH) merupakan protein yang terdiri atas 2 subunit 60 kDa. Protein ini mengandung kluster besi-belerang (Fe4S4) pada bagian tengahnya (Moat et al. 2002). Gen yang beperan mengekspresikan kemampuan fiksasi nitrogen (nif) telah dikaji dengan baik pada Klebsiella pneumonia (Madigan et al. 2012), sehingga regulasi gen-gen nif pada bakteri ini dijadikan model yang sangat baik untuk bakteri yang memiliki kemampuan memfiksasi nitrogen. Regulasi gen-gen nif pada K. pneumoniae diatur oleh operon nifLA. Protein NtrC mengaktivasi transkripsi operon nifLA dibawah kondisi nitrogen yang terbatas. Protein nifA merupakan regulator positif yang berperan sebagai faktor yang dibutuhkan untuk transkripsi gen nif. Produk gen nifL berpengaruh dengan protein nifA untuk mencegah aktivasi nifA ketika tersedianya produk fiksasi nitrogen (amonia atau asam amino) atau oksigen. Fungsi nifZ, W, U, S, X, dan T masih belum diketahui secara jelas. Akan tetapi, ada bukti yang menyatakan bahwa produk gen nifW dan nifZ terlibat dalam proses salah satu komponen nitrogenase dan produk gen nifX merupakan regulator positif pada regulasi nif ketika merespon adanya asam amino dan oksigen (Moat et al. 2002). Fragmen spesifik gen nifD dan nifH dari K. pneumoniae merupakan gengen yang memiliki sekuens yang konservatif pada semua mikrob pemfiksasi nitrogen (Kaminski et al. 1998). Gen nifH sering digunakan sebagai penanda molekuler suatu mikrob yang dapat memfiksasi nitrogen karena memiliki basis data sekuen non-ribosomal terbesar dari berbagai mikrob. Selain itu gen ini telah digunakan pada berbagai jenis primer dan mampu mengamplifikasi dengan baik sampel dari lingkungan maupun mikrooganisme secara langsung (Zehr et al. 1989). Gen nifH memperlihatkan keunikan filogenetik sehingga dapat dibuat hubungan kekerabatan dari mikrob diazotrof. Penelitian terdahulu mengenai analisis keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah sawah di Sukabumi dengan menggunakan penanda molekuler gen nifH dan nifD menunjukkan bahwa hasil analisis keragaman menggunakan penanda gen nifH lebih beragam dibandingkan dengan gen nifD (Munjiati 2013). Hasil tersebut mengindikasikan bahwa sekuen gen nifH tidak hanya memiliki situs yang conserved, melainkan
6 juga memiliki situs variatif yang lebih bervariasi dibandingkan dengan gen nifD, sehingga penanda gen ini sangat baik digunakan untuk analisis keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen. Analisis keragaman mikrob pemfiksasi nitrogen pada rizosfer dan akar rumput endemik (Lasiurus sandicus) yang tahan terhadap kekeringan asal gurun Thar, India telah dilakukan dengan menggunakan primer spesifik gen nifH. Hasil penelitian tersebut berhasil menemukan dominasi suatu sekuens nifH yang berkerabat dekat dengan Pseudomonas pseudoalcaligens. Selain itu, beberapa sekuen nifH memiliki kesamaan dengan diazotrof yang dapat dikultivasi seperti Azospirillum brasilense, Rhizobium spp. dan berbagai macam bakteri pemfiksasi nitrogen yang tidak dapat dikulturkan (Chowdury et al. 2009). Dua aktinomiset endofit pada akar tanaman Casuarina equisetifolia asal Meksiko telah berhasil diisolasi dan termasuk ke dalam anggota genus Thermomonospora dan Micromonospora. Kedua aktinomiset terebut memiliki kemampuan menambat nitrogen karena dapat tumbuh pada media tanpa nitrogen. Selain itu hasil amplifikasi dengan menggunakan primer spesifik gen nifH menunjukkan adanya kemiripan dengan gen nifH pada genus Frankia (Valdes et al. 2005). Penelitian mengenai bakteri pemfiksasi nitrogen telah banyak dilakukan termasuk dengan teknik DGGE. Analisis keragaman dengan teknik DGGE telah mampu menggambarkan keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada pada lingkungan. Penelitian yang ada saat ini lebih kearah bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada pada tanah. Penelitian mengenai bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada pada tanah rizosfer dan jaringan akar tanaman padi serta pengaruh tipe agroekosistem masih belum ada kajian lebih lanjutnya. Sehingga sangat penting untuk mengetahui keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang ada pada tanah rizosfer dan jaringan akar tanaman padi agar dapat melengkapi informasi yang ada. Beberapa penelitian mengenai keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen yang dianalisis dengan teknik DGGE dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah rizosfer Sampel Diazotrof Referensi Tanah Rizosfer Uncultured nitrogen-fixing Wartiainen et al. 2008 tanaman padi di bacterium Provinsi Fujian, Uncultured bacterium clone nifH Cina gene. Rhizosphere soil Uncultured bacterium clone Diazotrophic rhizosphere community, Bt-transgenic white spruce Endophytic Azoarcus wild rice Azoarcus kallar grass endophyte Diazotrophs associated with rice roots Uncultured endophytic bacterium clone associated with maize Azonexus caeni Methylococcus capsulatus Bath Rhizobium daejeonese Sphingomonas azotifigens
7 Tabel 1 Keragaman bakteri pemfiksasi nitrogen pada tanah rizosfer (Lanjutan) Sampel Diazotrof Referensi Tanah rizosfer Uncultured bacterium clone IS110 Coelho et al. tanaman EU048166.1 2009 gandum Uncultured bacterium clone IPA74 (Sorghum EU048016.1 bicolor) di Klebsiella pneumoniae AY242355.1 Brazil Azohydromonas lata AB188122.1 Uncultured bacterium clone IS98 EU048155.1 Klebsiella pneumoniae AY242355.1 Uncultured bacterium clone IS92 EU048149.1 Uncultured bacterium clone IS41 EU048099.1 Uncultured bacterium clone DQ995905.1 Uncultured bacterium clone IPA69 EU048011.1 Tanah pertanian hortikultura di Shanghai, Cina
Rhizobium sp. (GQ241353.1) Bradyrhizobium japonicum (GQ289565.1) Azospirillum brasilense (GQ161239.1) Azospirillum amazonense (GU256445.1) Azospirillum lipoferum (FQ311868.1) Sphingomonas azotifigens (AB217474.1) Burkholderia xenovorans (EF158805.1) Azohydromonas lata (AB188122.1) Azoarcus sp. BH72 (AM406670.1) Dechloromonas sp. (AJ563286.1) Zoogloea oryzae (AB201045.1) Azonexus hydrophilus (EF626685.1) Rhodocyclales Azospira oryzae (U97115.2) Azoarcus indigens (U97118.2) Sideroxydans lithotrophicus (CP001965.1) Methylocaldum szegediense (DQ002937.1) Acinetobacter sp. (EU693341) Ectothiorhodospira sp. (HM149325.1) γ-Proteobacterium BAL281 nifH isolate (AY972874.1) Anabaena sp. (HQ836199.1) Uncultured bacterium (EU048119.1) Uncultured bacterium (HQ335575.1 Uncultured bacterium (GU097336.1)
Perez et al. 2014
8 Mikrob Endofit Mikrob endofit merupakan mikrob yang hidup di dalam jaringan tanaman, akar, batang, daun, dan buah selama periode tertentu dari siklus hidupnya (Tan dan Zou 2001). Mikrob endofit membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya. Pada satu jaringan tanaman kemungkinan ditemukan beberapa jenis mikrob endofit (Strobel dan Daisy 2003). Hampir setiap tanaman tingkat tinggi memiliki beberapa mikrob endofit yang mampu menghasilkan senyawa bioaktif atau metabolit sekunder. Salah satu mikrob endofit yang mulai dikembangkan terutama dalam bidang kesehatan dan pertanian yaitu aktinomiset. Aktinomiset merupakan kelompok bakteri gram-positif yang memiliki filamen dan tergolong bakteri yang memiliki komposisi basa nitrogen GC yang tinggi yaitu >55% (Miyadoh 1997). Sebagian besar aktinomiset membentuk spora dan hal ini dapat digunakan sebagai dasar identifikasi. Aktinomiset secara taksonomi termasuk dalam Kelas Actinobacteria, Sub-kelas Actinobacteridae, Ordo Actinomycetales, dan berdasarkan klasifikasi molekuler terbagi dalam 10 Subordo (Stackebrandt et al. 1997). Aktinomiset telah diketahui mampu menghasilkan beragam metabolit sekunder dengan beragam fungsi biologi seperti antimikrob dan enzim pendegradasi bahan organik. Oleh karena itu aktinomiset digunakan sebagai agen biokontrol dan mampu menginduksi tanaman menjadi tahan terhadap penyakit (Hasegawa et al. 2006). Beberapa penelitian telah menunjukkan hasil yang mendukung pendapat tersebut. Streptomyces spp. yang diisolasi dari rizosfer mampu menghasilkan senyawa metabolit yang dapat menghambat pertumbuhan mikrob patogen tular tanah (Lestari 2006). Streptomyces sp. juga dilaporkan mampu menekan perkembangan penyakit hawar daun bakteri pada tanaman padi yang disebabkan oleh X. oryzae pv. oryzae. Kemampuan isolat yang diperoleh ini juga menunjukkan spektrum penghambatan yang cukup luas karena mampu menghambat mikrob kompetitor lainnya, seperti bakteri Gram positif dan Gram negatif serta fungi patogen (Hastuti et al. 2012b). Aktinomiset endofit PM5 telah diketahui mampu menghasilkan senyawa antifungi alifatik dengan unit lakton dan keton karbonil yang dapat menghambat pertumbuhan miselia Pyricularia oryzae dan Rhizoctonia solani pada tanaman padi (Prabavathy et al. 2006). Penelitian mengenai keragaman aktinomiset lebih banyak pada aktinomiset yang dapat dikulturkan, sedangkan keragaman aktinomiset yang tidak dapat dikulturkan belum banyak diketahui. Selain itu belum ada informasi mengenai keragaman aktinomiset pada berbagai tipe agroekosistem pada tanaman padi. Oleh karena itu penelitian ini sangat penting untuk melengkapi data mengenai keragaman aktinomiset endofit pada tanaman padi asal Indonesia baik yang dapat dikulturkan, maupun yang tidak dapat dikulturkan. Beberapa penelitian mengenai keragaman aktinomiset dapat dilihat pada Tabel 1.
9
Tanaman inang Akar dan daun tanaman padi asal Provinsi Guangdong, Cina
Tanaman tropis asal Papua New Guinea dan Pulau Solomon
Tabel 2 Keragaman aktinomiset pada berbagai tanaman Aktinomiset endofit Referensi Culturable Unculturable S. cyaneus Tian et al. S. cyaneus 2007 S. exfoliates S. lanatus S. aurantiacus S. galilaeus S. paresii Streptomyces sp. S. glauciniger S. turgidiscabies S. kathirae S. thermocarboxydus. S. caviscabies S. laceyi S. scabies Janibacter sp. Actinomycete NK951 N. simplex N. thermolilacinus Mycobacterium sp. Actinomycetales bacterium M. anthracenicum M. chitae M. rhodesiae M. fortuitum Micromonospora sp. Corynebacterium sp. Rhodococcus sp. Actinoplanes sp. Frankia sp. Amycolatopsis sp. Dactylosporangium sp. Lechevalieria Lentzea Actinoplanes Dactylosporangium Amycolatopsis Kibdelosporangium Pseudonocardia Kitasatospora Streptomyces Microbispora Nonomuraea Planotetraspora Sphaerisporangium Streptosporangium Thermomonosporaceae
-
Janso dan Carter 2010
10 Tabel 2 Keragaman aktinomiset pada berbagai tanaman (Lanjutan) Aktinomiset endofit Tanaman inang Referensi Culturable Unculturable Akar tanaman Microbacterium sp. Patrick et tomat (Physalis M. foliorum al. 2010 ixocarpa) asal Cellulomonas sp. Meksiko C. xylanilitica 20 Tanaman padi asal India
Streptomyces albosporus S. cinereus S. flavus S. globisporus S. roseosporus S. hygroscopicus S. lavendulae S. viridis S. griseorubroviolaceus Actinopolyspora sp. Micromonospora sp. Nocardia sp. Saccharopolyspora sp.
-
Gangwar et al. 2012
Akar tanaman dataran pasang surut asal Korea
Micrococcus Mycobacterium Microbacterium
-
Bibi et al. 2012
Daun tanaman Spermacoce verticillata (Rubiaceae)
Microbispora sp. Streptomyces sp. Nocardia sp.
-
Conti et al. 2012
Metagenom Metagenom didefinisikan sebagai aplikasi teknik genom modern untuk mempelajari komunitas organisme mikrob secara langsung pada lingkungan alaminya, tanpa melewati tahapan isolasi dan pengayaan di laboratorium (Chen dan Pachter 2005; Patrick dan Handelsman 2005). Metode analisis metgenom telah berkembang menjadi pendekatan yang sangat efektif untuk penemuan produk alami baru dan fungsi mikrob (He et al. 2007). Pada awalnya, target utama studi metagenom yaitu mikrob yang tidak dapat dikulturkan dan DNA purba. Namun pada saat ini teknologi metagenom di aplikasikan pada penelitian yang mengkaji susunan keragaman mikrob (Shanks et al. 2006). Hanya 0.001-0.1% dari seluruh total mikrob di air laut, 0.25% di air tawar, 0.25% di sediment, dan hanya 0.3% mikrob tanah yang dapat dikulturkan secara in vitro (Amann et al. 1995; Singh et al. 2008). Pada zaman sekarang penelitian metagenom telah sangat
11 berkembang karena adanya perancangan (construction) vektor kloning gen seperti kromosom artifisial bakteri (Bacterial Artificials chromosomes (BACs) atau kosmid (Xu 2006; Babcock et al. 2007) yang memungkinkan untuk mengkloning dan mengekspresikan segmen DNA yang besar dan kompleks (Singh et al. 2008). Prinsip analisis keragaman secara metagenomik berdasarkan analisis DNA yang diambil secara langsung dari lingkungan. Saat ini beberapa gen telah digunakan sebagai penanda molekuler bagi kelompok prokariot, dan yang paling banyak digunakan adalah gen penyandi 16S rRNA. Gen ini bersifat ubikuitus hanya pada kelompok prokariot sehingga dapat menjadi penanda universal yang spesifik untuk kelompok prokariot. Gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik (Stackebrandt dan Goebel 1994). Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Selain gen 16S rRNA, gen nif juga memiliki sekuens yang konservatif pada semua mikrob pemfiksasi nitrogen, sehingga dapat digunakan untuk mengetahui keragaman mikrob pada suatu sampel lingkungan (Kaminski et al. 1998). Beberapa teknik berbasis molekuler yang digunakan untuk menganalisis keanekaragaman mikrob adalah Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), Fluorescent in-situ Hybridization (FISH), Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) dan Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) (Marsh et al. 2000). Analisis keragaman genetika yang sederhana untuk menelaah keanekaragaman dapat dilakukan dengan teknik ARDRA. ARDRA dan TRFLP merupakan metode yang paling sering digunakan, akan tetapi metode ini memiliki kelemahan yaitu teknik ARDRA memiliki keterbatasan dalam hal kepraktisan, dibutuhkan pustaka gen 16S rRNA dalam ukuran yang besar untuk menggambarkan keragaman mendekati kergaman yang sebenarnya di alam. TRFLP memiliki keterbatasan yaitu data yang kurang representatif karena fragmen yang dianalisis hanya pada bagian ujung 5’ dari produk amplifikasi saja, sehingga ada kemungkinan berbagai kelompok besar bakteri yang berbeda hanya memunculkan satu macam TRF (Pangastuti 2008). Oleh karena itu, dalam penelitian ini menggunakan teknik DGGE dikarenakan oleh kesederhanaan dan kepraktisan untuk menganalisis komunitas mikrob secara langsung. Selain itu penggunaan teknik ini dapat memisahkan fragmen yang memiliki panjang sama tetapi urutan basa berbeda. Dengan demikian, sekuen DNA yang berbeda, bahkan perbedaan hanya satu pasang basa nukleotida, akan muncul sebagai pita pada posisi yang berbeda di dalam gel poliakrilamida (Muyzer dan Smalla 1998). Penggunaan DGGE telah berhasil digunakan untuk mendeteksi komunitas aktinomiset pada tanah di pulau Barrientos (Learn-Han et al. 2012). Teknik DGGE juga dapat dimanfaatkan untuk memonitor komunitas bakteri selama proses eksperimen bioremidiasi pada tumpahan minyak di pesisir pulau Pari
