Rode pulp macrofagen in de milt; APK voor rode bloedcellen.
Robin van Bruggen Dept. Blood Cell Research Sanquin Research
Introductie •Waarom bestuderen we de interactie tussen rode bloedcellen (RBC) en milt macrofagen (Mø)? •Tot 25% van de donor RBC wordt binnen 24 uur na transfusie geklaard, waarschijnlijk door milt Mø. •Kennis over het mechanisme leidt mogelijk tot nieuwe strategieën om de klaring te voorkomen.
Mebius and Kraal, Nature Reviews in Immunology
Blue et al. Am. J. Ana. (1981)
Levenscyclus van de rode bloedcel
Levenscyclus van de rode bloedcel
Humane rode pulp Mø
Factoren die een rol spelen in RBC klaring “Eat me” signals • Auto-IgG binding aan senescent cell antigeen (Band3) • Phosphatidylserine (PS) exposure. • “Don’t eat me” signals: CD47 expressie
from H.U. Lutz
CD47
CD47
SIRPα
SIRPα
Inhibits Phagocytosis
Allows Phagocytosis
Fagocytose assay CFSE labelling
manipulation
incubation
RBC lysis
Fagocytose van rode bloedcellen door Mø
% positive red pulp mø
60
40
20
)2 -F (a b' D 47 C
un tr ea te d
0
CD47 signalering in rode bloedcellen • Anti-CD47 antibodies induceren: - PS exposure - Vesicle vorming door rode bloedcellen
aC D
47
44
23 5a
aC D
aC D
co nt ro lI gG
PS exposure (% positive cells)
CD47 binding induceert PS exposure 100 80
60
40
20
0
CD47 binding induceert vesicles
Induceert SIRP CD47 signalering op RBC? • Rode pulp Mø zijn geen ideaal model om CD47/SIRP interacties te bestuderen. • Ons model: Chinese Hamster Ovary (CHO) cellen getransfecteerd met SIRP • CHO cellen werden geïncubeerd met RBC, RBC werden geoogst en PS exposure en vesicle shedding werden bekeken.
Resultaat: geen effect van SIRP expressie op PS exposure en vesicle shedding.
CHO-SIRPα cellen binden RBC
Scheiding van rode bloedcellen op leeftijd • Slechts een kleine fractie van de RBC werden gebonden door CHO-SIRP cellen; ouderdom?
Elutriatie en Percoll fractionering om RBC te scheiden op leeftijd.
Binding van oude RBC aan SIRP
“Kunstmatig verouderde” erythrocyten • Erythrocyten ondergaan veel oxidatieve schade tijdens het vervoeren van zuurstof. • Hoewel er meerdere enzymen actief zijn in erythrocyten om oxidatieve schade tegen te gaan of te repareren, vertonen oude erythrocyten tekenen van oxidatieve schade, zoals methemoglobine (metHb). • Een manier om erythrocyten kunstmatig te verouderen is het incuberen van deze cellen in 5 M Cu2+. • Vervolgens is de binding van Cu2+ behandelde erythrocyten aan SIRP getransfecteerde CHO cellen bepaald.
Rol van serum voor RBC binding aan SIRP
Thrombospondin-1 • Een serum eiwit dat kan binden aan CD47, afhankelijk van de conformatie van CD47. • TSP-1 is een eiwit dat gesecreteerd wordt door plaatjes; disulfide-linked homotrimeric glycoprotein. • TSP-1 speelt een rol bij cel-cel en cel-matrix interacties. • TSP-1 speelt een rol in fagocytose van apoptotische cellen. • Bindt aan CD47 op sikkelcellen (vanwege een conformationele verandering in CD47). • Kan binden aan phosphatidylserine (PS).
Kunstmatige veroudering geeft “switch” in CD47
TSP-1 bindt na kunstmatige veroudering
Rol van TSP-1 voor RBC binding aan SIRP
C D
**
ag ed
tr ea te d
te d
60
ag ed +4 N G G ag ed +4 N 1K
47 -F (a b' )2
un tr ea
phagocytosis (% of positive spleen m )
Rol van TSP-1 voor fagocytose door rode pulp Mø **
40
20
0
Conclusies • Identificatie van een nieuw mechanisme voor RBC klaring gebaseerd op CD47/SIRP signalering. • CD47 ondergaat een conformationele switch in oude RBC waarschijnlijk door oxidatieve schade. • TSP-1 bindt vervolgens aan CD47; SIRP op de Mø ziet CD47 nu als “eat me” signaal, resulteert in fagocytose.
CD47 SIRPα
Changed CD47 SIRPα Inhibits Phagocytosis
Belangrijk voor bewaarde/gekweekte RBC?
In vitro transfusie assay.
10
1
Belangrijk voor bewaarde/gekweekte RBC? *
150
red cell concentrate whole blood
*
MFI
100
50
0
nt ro l
Control
co
A 6. 1
Anti-TSP-1
Met dank aan • Bloed Cel Research Patrick Burger Elena Kostova Petra Hilarius-Stokman Boukje Beuger Dirk de Korte Timo van den Berg
• HLA-Diagnostiek Paulien Kuin-Valkenhof Claudia Ranzijn Junior Lardy
