RNDr. Miroslav POHANKA, Ph.D

Učební texty Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany v Hradci Králové

RNDr. Miroslav POHANKA, Ph.D.

B IOSE NZORY PRO ST ANOVE NÍ CHE MICKÝCH A B IOL OGICKÝCH AGENS

Studijní pomůcka

Centrum pokročilých studií

Svazek 360 2009

Autor: RNDr. Miroslav Pohanka, Ph.D. – Centrum pokročilých studií, Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Hradec Králové

Recenze: Ing. Vítězslav Vlček, Ph.D.

 Miroslav Pohanka,, 2009

ISBN 978-80-7231-336-5

OBSAH

Seznam ustálených zkratek a spojení ....................................................................... 4 1. Úvod ..................................................................................................................... 5 2. Základní pojmy ..................................................................................................... 7 2.1. Úvod do statistiky měření .................................................................... 7 2.2. Důležité termíny v problematice biosenzorů ....................................... 12 3. Přehled chemických a biologických agens ........................................................... 16 3.1. Chemická agens ................................................................................... 16 3.2. Biologická agens ................................................................................. 18 4. Biorekogniční elementy vhodné pro konstrukci biosenzorů ................................ 21 4.1. Protilátky ............................................................................................. 21 4.2. Enzymy ................................................................................................ 27 4.3. Genetická informace ............................................................................ 32 5. Metody imobilizací biorekogničních elementů .................................................... 36 5.1. Fyzikální imobilizace .......................................................................... 36 5.2. Chemická imobilizace ......................................................................... 38 6. Členění biosenzorů podle fyzikálně-chemických převodníků ............................. 44 6.1. Elektrochemické převodníky ............................................................... 44 6.2. Hmotnostní převodníky ....................................................................... 46 6.3. Optické převodníky ............................................................................. 48 7. Příklady některých aplikací .................................................................................. 51 8. Použitá a doporučená literatura ............................................................................ 55

3

SEZNAM USTÁLENÝCH ZKRATEK A USTÁLENÝCH SPOJENÍ BW

biologická zbraň (biological weapon)

BWA

biologické agens (biological warfare agents)

CDC

Centers for Diseases Control and Prevention

CV

cyklická voltametrie

CW

chemická zbraň (chemical weapon)

CWA

chemická zbraň (chemical warfare agents)

DPV

differential pulse voltammetry

ECL

elektrochemiluminiscence

EDTA

etylendiamintetraoctová kyselina

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

ENFET

enzyme field effect transistor

FITC

fluorescein isothiokyanate

ISFET

ion-sensitive field effect transistor

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

LAPS

light-addressable potentiometric sensor

LD50

střední smrtná dávka

LOD

limit detekce (limit of detection)

LOQ

mez stanovitelnosti (limit of quantification)

MOSFET

metal-oxide-semiconductor field-effect transistor

SAM

self-assembled monolayer

SPR

rezonance povrchových plasmonů (surface plasmon resonance)

SÚJB

Státní úřad pro jadernou bezpečnost

SWV

square wave voltammetry

TRF

time-resolved fluorescence

4

1. ÚVOD Problematika biosenzorů (biočipů) prošla mnohými změnami, reagovala na současný vývoj ostatních vědních oborů a široce zasáhla i do komerční sféry. Přitom vlastní prvopočátky problematiky biosenzorů byly nenápadné a sledovali úplně jiné cíle. U zrodu prvních biosenzorů stál profesor Leland Clark (1918 – 2005). Výzkum profesora Clarka byl zaměřen na problematiku krve a přípravu umělé krve. K jeho objevům patří mimo jiné i kapalina na bázi fluorokarbonů dýchatelná namísto vzduchu. Při výzkumu profesor Clark opakovaně narážel na obtíže s kontinuálním sledováním koncentrace vybraných látek v krvi nezbytné pro kontrolu vlastních experimentů. V roce 1956 prezentoval koncept kyslíkové elektrody s katodou a anodou uzavřenou pod polopropustnou membránou jako vhodný nástroj pro kontinuální sledování hladiny rozpuštěného kyslíku. Touto elektrodou byl schopen sledovat množství kyslíku nejen v roztocích, ale i krvi. Do dnešních dnů je tato tzv. Clarkova elektroda rozsáhle využívána. Převratným se stal rok 1962, kdy Clark na setkání Americké akademie věd v New Yorku předvedl první biosenzor. Byla jím modifikovaná chronoamperometrická elektroda s navázaným enzymem glukosaoxidasou. Tímto prvním biosenzorem byl Clark schopen měřit hladinu glukózy v krvi bez jakýchkoliv úprav a použití činidel. Biosenzory pro stanovení glukózy se následně staly komerčně nejúspěšnějšími a osobní glukometry pro diabetiky i složitější laboratorní aplikace jsou založeny právě na Clarkově prvním biosenzoru, i když technické zpracování je již samozřejmě zcela odlišné a nahrubo purifikovaná glukosaoxidasa je dnes nahrazena rekombinantní variantou. Za zmínku stojí, že první komerční biosenzor byl glukometr YSI 23A (Springs Instruments) uvedený na trh v roce 1975 jako vývojové zakončení Clarkova biosenzoru. Rok 1975 pak dále významně ovlivnil řadu vědních odvětví včetně konstrukcí biosenzorů díku objevu Kohlera a Milsteina. Ti v rámci své tzv. hybridomové technologie dokázali připravit první monoklonální protilátky. Produkce levných protilátek s dostatečnou afinitou vůči antigenu umožnila rozvinout široké pole novému typu biosenzorů, tzv. imunosenzorům. Konstrukce imunosenzorů byla značně ovlivněna i prvními adaptacemi piezoelektrických biosenzorů. I když piezoelektrický jev byl znám od konce devatenáctého století, komplexní fyzikální platformu získal až studiem profesora Sauerbreye v padesátých letech minulého století. V roce 1972 (tedy ještě před objevem Kohlera a Milsteina) navrhl použít křemenné mikrovážky fungující na piezoelektrickém jevu tým vedený Shonsem. Jejich imunosenzor s vázaným albuminem byl použit pro sledování hladiny polyklonální protilátky s aviditou vůči albuminu. Prudký rozvoj konstrukce nových typů biosenzorů byl odstartován v osmdesátých létech minulého století. Byl podmíněn zejména dostupností polovodičových elektrod a optických vláken. Od devadesátých let minulého století je zájem o biosenzory vystupňován i díky postupné miniaturizaci měřicích zařízení. Jako příklad můžeme zmínit elektrochemické analyzátory velikosti náramkových hodinek s minimální pořizovací cenou ve srovnání s (v té době) tradičními laboratorními přístroji. V uplynulých letech se do popředí vědeckého zájmu dostávají i metody založené na nelineární optice. Proniknutí biosenzorů do vojenství a ochrany civilního obyvatelstva bylo relativně pomalé a v popředí zájmu stály zejména tradiční analytické techniky. V uplynulých létech však došlo k zaměření pozornosti na konstrukci biosenzorů pro rychlou detekci chemických a biologických agens. Příčinou širšího zájmu o biosenzory je snaha detekovat přitomnost vybraných agens v prostředí nejen specializovanými týmy, ale i jednotlivci pro které není detekce hlavním úkolem. Na současném trhu jsou komerčně dostupná různá zařízení s integrovaným biosenzorem. Lze říci, že biosenzory jsou konstruovány nejen pro detekci otravných látek, ale i patogenních mikroorganizmů a některých přírodních toxinů.

5

Tento text je podle svého názvu zaměřen na přehled biosenzorů pro stanovení chemických a biologických agens. Problematika biosenzorů je zde nicméně podávána komplexně s ohledem na předpokládanou obtížnou orientaci čtenáře v problematice, pokud není tato problematika prezentována uceleně. Je třeba zdůraznit fakt, že problematika biosenzorů je interdisciplinární a stejně jako slovo biosenzor se skládá ze dvou částí „bio“ a „senzor“, tak i k pochopení biosenzorů jsou důležité nejen znalosti z oblasti biochemie, molekulární biologie, respektive imunologie, ale i fyzikální chemie, organické chemie a především analytické chemie.

6

2. ZÁKLADNÍ POJMY V této kapitole jsou nastíněny základy statistiky nezbytné pro pochopení vlastní problematiky a dále výklad důležitých pojmů týkajících se biosenzorů. Detailnější informace pak čtenář může najít v odborné literatuře doporučené v literární části.

2.1. Úvod do statistiky měření Analyt: Analyt je látka, kterou analyzujeme ve vzorku. Z definice není analyt vymezen pouze na chemické látky. Analytem může být antigen při použití imunometody, mikroorganizmu aj. Při diagnostikách je pak analytem stanovovaný marker. Například při stanovování přítomnosti aflatoxinu v cereáliích je analytem právě aflatoxin. Přesnost a správnost měření: Tyto termíny jsou velmi často nesprávně interpretovány. I když na první pohled mohou působit jako synonyma, jejich význam je zcela odlišný. Přehledně je příklad měření třemi metodami s různou přesností a správností uveden v obrázku 1. Jako přesnou označíme tu metodu (detektor, analytické zařízení…), která je zatížena jen malou směrodatnou odchylkou měření. Nepřesná metoda pak poskytne značný rozptyl měření. Neznamená to však, že přesná metoda je i správná. Pokud již mluvíme o správnosti, pak máme na mysli, že při dostatečném opakování měření bude průměr korespondovat se skutečností i když některá z jednotlivých měření mohou být odlehlá.

b a

c - mg/l

9

c 6

3

0

Obrázek 1: Příklad stanovení koncentrace analytu třemi různými metodami a – c. Na ose y je pro ilustraci znázorněna hodnota hmotnostní koncentrace. Přerušovanou čarou je indikována skutečná koncentrace analytu a tečkovanou čarou pak přípustnou nejistotu měření. Uvedené rozsahy jsou pouze ilustrativní. Zatímco metoda a je správná (průměr odpovídá skutečné hodnotě), je však zároveň nepřesná – velký rozptyl měření nastíněný chybovými úsečkami. Metoda b je přesná (malá chyba měření), ale není správná. Výsledek je značně odlehlý od skutečné koncentrace analytu. Metoda c je přesná i správná.

7

Limit detekce a mez stanovitelnosti: V literatuře jsou pro tyto pojmy používány ustálené zkratky. Pro limit (též mez) detekce je to LOD (limit of detection) a pro mez stanovitelnosti pak LOQ (limit of quantification). Výpočet LOD a LOQ je často upravován pro konkrétní metody. LOD a LOQ jsou závislé především na chybě měření. Tato chyba může být reprezentována směrodatnou odchylkou, nebo tzv. šumem, což je časová fluktuace měřeného signálu v nepřítomnosti analytu. LOD a LOQ závisí rovněž na citlivosti metody tj. na strmosti kalibrační závislosti. Jako LOD se považuje takové množství (koncentrace) analytu, které způsobí změnu měřeného signálu v rozsahu trojnásobku velikosti šumu. U LOQ je to pak desetinásobek. Obecně uznávaný výpočet pro kalibrační závislost lineární povahy je následující:

LOD =

3× h sm

LOQ =

10 × h sm

Kde h představuje ustálenou hodnotu signálu šumu, nebo chybě signálu získanému měřením blanku a sm směrnici kalibrační závislosti. Pokud určíme přítomnost látky na hranici LOD, prokázali jsme její přítomnost 95% (hladina pravděpodobnosti P = 0,05) u LOQ pak na 99% (P = 0,01). Pro zpracování výsledků můžeme samozřejmě použít i jiných statistických metod např. porovnat experimentální hodnoty ze série měření blanku a neznámého vzorku. Vyobrazení odhadu limitu detekce a meze stanovitelnosti na příkladu potenciometrické analýzy je přiloženo ve formě obrázku 2.

50

U - mV

40

30

20

10x

3x

10

LOQ

LOD blank

0 0

1

2

3

4

5

c - mmol/l

Obrázek 2: Příklad určení limitu detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ). Pro ilustraci byla zvolena potenciometrie jako modelová metoda. Měření blanku odpovídá prvnímu bodu v grafu. Trojnásobek a desetinásobek směrodatné odchylky na ose y a následný odhad LOD a LOQ svislicí na osu x z průsečíku s kalibrační přímkou je znázorněn přerušovanou linií.

8

Citlivost metody: Je to změna měřeného signálu vůči koncentraci měřeného analytu: dS/dc. U kalibrací s lineárním průběhem pak citlivost odpovídá směrnici této kalibrace. Je tedy zřejmé, že citlivá metoda je ta, která poskytne maximální změnu měřeného signálu v přítomnosti analytu. Často opakujícím se omylem je záměna limitu detekce a citlivosti. Jak je zřejmé z kapitoly věnované limitům detekce, citlivost metody značně ovlivňuje její limit detekce. Ovšem i citlivá metoda může mít velmi vysoký limit detekce, pokud je měření zatíženo velkou chybou. Selektivita: Selektivita metody nám určuje zda se měřeném signálu mohou podílet i jiné faktory než jen stanovovaný analyt. Jestliže má metoda malou selektivity, je velká pravděpodobnost získání falešně pozitivního výsledku. To může být velmi nepříjemné při detekci přítomnosti biologických a chemických agens. Falešně pozitivní stanovení může vzniknout i díky jevu, který se nazývá hystereze. Pojem hystereze značí paměť systému tj. vliv minulých měření na to současné. Kalibrace: Obecné zásady platné pro kalibraci a použití standardů vycházejí z ISO/IEC 17025. Kalibrace je proces, při kterém hledáme závislost mezi měřeným signálem (např. absorbance, vznik potenciálu, velikost měřeného proudu aj.) a měřenou jednotkou (např. koncentrace látky v roztoku). Pro účely kalibrace je použit tzv. standard se známým množstvím analytu. Z hlediska mechanizmu použití rozlišujeme standardy vnější a vnitřní. Vnější standardy jsou používány nezávisle na vlastním analyzovaném vzorku. Kalibrace pomocí vnějších standardů se odehrává před začátkem vlastních měření neznámého vzorku. Kalibrace vnitřní využívá definovaného přídavku standardu do analyzovaného vzorku a následné porovnání změněného signálu se signálem původním. I když použití vnitřních standardů je zpravidla rychlejší a jistou výhodu představuje i fakt, že vlastní analýza i kalibrace probíhá téměř ve stejném čase, bývají výsledky měření s vnitřními standardy hůře reprodukovatelné. Ideální kalibrace je lineární. Nicméně při velkém rozsahu standardů se kalibrace stává sigmoidní. Z důvodů dosažení linearity se některé kalibrace, zvláště v potenciometrii, realizují po matematické transformaci na semilogaritmické vynesení signálu vůči koncentraci. Lineární rozsah kalibrace udávaný v počtu desetinných míst (řádů) koncentrace analytu se velmi často považuje za ukazatel kvality metody. Odchylka a nejistota měření: V rámci opakovaných měření můžeme stanovit takzvanou očekávanou hodnotu měření, která odpovídá poloze rozdělení na ose reálných čísel. Rozložení hodnot na ose reálných čísel odpovídá tzv. rozptylu σ2. Směrodatná odchylka měření σ je pak druhou odmocninou rozptylu měření a relativní směrodatná odchylka jejím procentuálním vyjádřením vzhledem k průměru měření. Matematicky můžeme směrodatnou odchylku měření vyjádřit jako odmocninu sumy čtverců rozdílu hodnot jednotlivých měření x od průměrné hodnoty µ vydělenou množstvím opakování měření N:

σ=

1 N

N

2 ( x − µ ) ∑ i i =1

9

Pro Gaussovo (normální) rozdělení hodnot platí, že v rozsahu µ±σ leží 68% dat. Pro interval µ±2σ je to 95% a pro µ±3σ pak 99% experimentálních dat. Se směrodatnou odchylkou měření souvisí další parametr a to je nejistota měření u. Při použití metodiky, která poskytuje nejen přesné, ale i správné výsledky můžeme nejistotu měření ztotožnit se směrodatnou odchylkou. V reálných podmínkách je však nejistota měření větší. Nejistota měření má aditivní charakter výsledná kombinovaná nejistota pak může být vyjádřena jako vliv dílčích nejistot měření hodnoty x, výsledná nejistota se pak nazývá kombinovaná standardní nejistota uc:

uc ( x ) = u A2 ( x ) + u B2 ( x ) Jako příklad kombinované nejistoty můžeme zjednodušené uvést stanovení obsahu glutathionu v krevní plazmě. Zatímco nejistota uA je způsobena chybou při zpracování krve (např. pipetování či jiná manipulace se vzorkem), uB je již vlastní chyba měření (např. HPLC nebo fotometrické stanovení). Obdobně jako pro směrodatnou odchylku a Gaussovo rozdělení můžeme stanovit i intervaly spolehlivosti ve formě rozšířené nejistoty U. Je to k násobek kombinované standardní nejistoty. Pro k = 1 leží v daném intervalu 68% experimentálních dat, pro k = 2 je to 95% (P = 0.05) a pro k = 3 pak 99% (P = 0.01).

U = k × uc (x ) Reprodukovatelnost a opakovatelnost: Když mluvíme o chybě měření, máme na mysli směrodatnou odchylku nebo relativní směrodatnou odchylku získanou sérií měření toho samého vzorku. Tato měření jsou však prováděna v daném čase. Opakovatelnost nepřímo odpovídá chybě měření vykonanému tou samou osobou na stejném pracovišti a se stejným vzorkem s časovým odstupem. Pokud je metoda opakovatelná, je výsledek opakované analýzy statisticky nerozlišitelný od původního měření. Na rozdíl od opakovatelnosti, reprodukovatelnost vypovídá o chybě pří reprodukci výsledků s daným vzorkem a stejnou metodou v jiné laboratoři. Korelace: Korelace je proces, při kterém hledáme souvislosti mezi dvěma nezávislými veličinami. Pearsonův korelační koeficient je číselným vyjádřením těsnosti korelace. Pro soubor vzájemně přiřazených proměnných hodnot X a Y v celkovém počtu bodů N lze korelační koeficient r vypočítat podle následujícího vzorce:

10

N

i =1

i =1

N

∑ X ∑Y

i =1

N

∑ XY −

r=

N

N

N

(∑ X − 2

(∑ X ) i =1

N

i =1

N

2 N

)(∑ Y 2 − i =1

(∑ Y ) 2 i =1

N

)

Statistické software jsou vybaveny nástroji pro výpočet korelačního koeficientu. Vzhledem k časové náročnosti výpočtu Pearsonova korelačního koeficientu je proto dávána přednost právě příslušnému software. Při použití software je však třeba dát pozor na správnou terminologii. Korelační koeficient (r) je velmi často zaměňován za koeficient determinace r2 (viz níže) díky nesprávným překladům software do českého jazyka. Korelační koeficient může nabývat hodnot v rozmezí -1 až 1. Při 2D grafickém vynesení pak záporný korelační koeficient odpovídá záporné směrnici a kladný koeficient kladné směrnici. Mezním případem je korelační koeficient 0, kdy žádná korelace nebyla nalezena a experimentální hodnoty jsou nejčastěji zcela náhodně rozptýleny. Korelační koeficient může nabýt nulové hodnoty také v některých specifických situacích, ty však nejsou typické pro běžná stanovení. Pokud se hodnota korelačního koeficientu blíží 1 nebo -1, hodnoty se stávají uspořádanými a mezní korelací pří hodnotách 1 a -1 je pak přímka. Příklady čtyř grafů s různou mírou korelačního koeficientu jsou vyobrazeny v obrázku 3. r=1 2 r=1 X

X

r = -1 2 r=1

Y

Y

r = -0,1 2 r = 0,01

X

X

r = 0,9 2 r = 0,8

Y

Y

Obrázek 3: Příklady rozdílných korelací. V každém grafu je vyobrazen korelační koeficient (r) a koeficient determinace (r2). Grafy nahoře představují extrémně těsný vztah, kdy proměnné jsou si nepřímo (vlevo) a přímo (vpravo) úměrné. Graf vlevo dole představuje velmi těsnou závislost. Graf vpravo dole zanedbatelnou závislost.

11

Pro posouzení těsnosti vztahu dvou proměnných můžeme rozlišit míru korelace jako zanedbatelnou do 0,2 (-0,2), v rozmezí 0,2 až 0,4 (-0,2 až -0,4) tento vztah není příliš těsný, pro hodnoty 0,4 až 0,7 (-0,4 až -0,7) se vztah stává těsným. Při dalším zvýšení korelačního koeficientu na hodnotu 0,7 až 0,9 (-0,7 až -0,9) je pak vztah velmi těsný. Nad hodnotu 0,9 (-0,9) mluvíme o extrémně těsném vztahu. S korelačním keficientem úzce souvisí pojem koeficient determinace (r2). Jedná se o druhou mocninu korelačního koeficientu. Nabývá hodnot od 0 do 1. Lze říci, že koeficient determinace vypovídá o interpretovatelnosti modelu na daná data. Například koeficient determinace r2 = 0,95 vypovídá o faktu, že 95% hodnot proměnné y může být vysvětleno korelací na proměnnou x.

2.2. Důležité termíny v problematice biosenzorů Co je to biosenzor? V první řadě je důležité ujasnit vlastní termín biosenzor. Různí autoři zařazují pod pojem biosenzor různá zařízení, průkazníkové pásky atd. Pro objasnění termínu biosenzor můžeme přijmout obecnou definici, kterou přidělil IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) ve svém periodiku Pure and Applied Chemistry 64, 143 v roce 1992: "Biosensor: a device that uses specific biochemical reactions mediated by isolated enzymes, immunosystems, tissues, organelles or whole cells to detect chemical coumpounds usually by electrical, thermal or optical signals." V překladu tedy můžeme pojmem biosenzor označit jakékoliv zařízení užívající specifické biochemické reakce zprostředkované izolovanými enzymy, immunosystémem, tkáněmi, nebo celými buňkami pro detekci chemických sloučenin měřením elektrického, termálního, nebo optického signálu. Z praktického hlediska je však definice biosenzoru prezentovaná společností IUPAC jen velmi těžko použitelná. Na jednu stranu jsou jako biosenzory považovány pouze zařízení detekující chemické sloučeniny, což neodpovídá současné realitě. Na druhou stranu není vymezeno použití prvků biologické povahy. Ve svém důsledku by pak mohl být za biosenzor považován například i ELISA kit. Dnes obecně přijímaná a v odborné literatuře v různých modifikacích uváděná definice biosenzoru je následovná: jedná se o analytické zařízení skláda-jící se ze tří komponent: první je prvek přírodního původu, tzv. biorekogniční element. Tím může být, stejně jako v definici od IUPAC, enzym, protilátka, organela aj. Druhou komponentou je fyzikálně-chemický převodník. Poslední komponentou je pak detektor. Příkladem může být tradiční biosenzor pro stanovení glukózy. Biorekogniční element je zde glukosaoxidasa, fyzikálně-chemický převodník pak pracovní elektroda, resp. kombinovaná elektroda. Detektorem je elektrochemický analyzátor. Důležitou podmínkou toho, aby analytické zařízení bylo považováno za biosenzor je spojení biorekogničního elementu a fyzikálně-chemického převodníku. Schéma biosenzoru si můžeme vysvětlit na příkladu biosenzoru pro stanovení glukosy. Na stejném principu pracují i osobní glukometry. Tento biosenzor je přehledně znázorněn v obrázku 4. Jeho rekogniční schopnost je dána specifitou enzymu glukosaoxidasy (GOx). Je to monooxigenasa oxidující glukosu na glukonovou kyselinu ping-pongovým mechanizmem vyjádřeným následujícími rovnicemi:

12

glukosa + GOx ( FAD )  → glukonová.kyselina + GOD ( FADH 2 ) GOx ( FADH 2 ) + O2  → GOx ( FAD ) + H 2 O2 H 2 O2  → O 2 + 2 H + + 2e −

V první rovnici přechází kofaktor glukosaoxidasy flavin adenin dinukleotid (FAD) na redukovanou formu. Ve druhé rovnici se FADH2 zpětně oxiduje za předání dvou elektronů a dvou protonů na molekulu kyslíku za vzniku peroxidu vodíků. Poslední rovnice pak indikuje elektrodový proces.

glukonová kyselina

glukosa

GOx 2x emembrána detektor elektroda

Obrázek 4: Schematické znázornění biosenzoru pro stanovení glukosy. Zkratka GOx vyjadřuje glukosaoxidasu.

Biochip: Obdobně jako pojem biosenzor i pojem biochip není zcela jednoznačně vymezen. Původní definice podle IUPAC, že se jedná o zařízení s integrovaným elektrickým obvodem a použitím proteinů (Pure and Applied Chemistry 64, 148, z roku 1992) je pro dnešní potřeby nepoužitelný. Ve velké části případů můžeme pojem biochip ztotožnit s pojmem biosenzor a mnoho autorů tyto dva termíny považuje za synonymum. Dříve se očekávalo, že biochip obsahuje polovodičové elektrody nebo integrovaný obvod. Dnes se pod pojmem biochip skrývají i tzv. microarray techniky. U těchto technik je současně měřeno více parametrů (multikanálové stanovení). Biorekogniční element může být ssDNA, protein (lektin), protilátka aj. Jako nosná matrice zde slouží řada materiálů. V literatuře jsou nečastěji zmiňovány sklo a křemík. Měření interakce s analytem je nejčastěji založeno na fluorescenci.

13

Biorekogniční element: Od pojmu biorekogniční element je odvozena předpona bio ve slově biosenzor. Biorekogniční element je nezastupitelný prvek který poskytuje selektivitu vůči analytu. Z praktického hlediska můžeme biorekogniční elementy rozdělit do dvou skupin podle principu interakce s analytem: biokatalytické a bioafinitní. •

Biokatalytické rekogniční elementy přeměňují analyt do jiné formy. Tato přeměna, nebo vzniknuvší produkt jsou pak stanovovány. Jako biokatalytické rekogniční elementy nejčastěji vystupují enzymy, ale mohou to být i celé buňky nebo i tkáně. Mezi biokatalytické rekogniční elementy můžeme zařadit i glukosaoxidasu použitou v glukometru. Glukosaoxidasa katalyticky přeměňuje glukosu na glukoronovou kyselinu.

•

Bioafinitní rekogniční elementy selektivně reagují s analytem. Jako typické příklady můžeme zmínit protilátku (stanovení antigenu), antigen (stanovení protilátek), úsek DNA nebo chromozom (stanovení látek schopných interkalovat DNA, stanovení specifických sekvencí atd.). Menšího rozšíření dosáhlo použití lektinů a specifických receptorů.

Fyzikálně-chemický převodník: Umožňují převod interakce rekogničního elementu do měřitelné fyzikální veličiny. Tyto převodníky mohou být zcela rozdílné povahy od velmi složitých po jednoduché pracovní elektrody reprezentované například prostým drátkem z platiny. Fyzikálně-chemickým převodníkům je věnována samostatná kapitola.

Multikanálové stanovení: Termínem multikanálové stanovení označujeme schopnost současně měřit více vzorků (je integrováno více detektorů stejného typu), nebo více analytů (integrováno více dektorů různého typu). Například pro multikanálovou spektrofotometrii jsou běžné multijamkové titrační destičky obsahující nejčastěji čtyřnásobky celkového počtu jamek: 24, 96, 384 a 1536. Počet kanálů se neřídí pravidly, ale konkrétními potřebami. Nicméně lze říci, že i pro ostatní typy zařízení je počet kanálů většinou číslo dělitelné čtyřmi. Příklad elektrod s různým počtem kanálů používaných pro konstrukci amperometrických biosenzorů je uveden na obrázku 5.

14

Obrázek 5: Sítotiskové elektrochemické senzory používané pro konstrukci biosenzorů. Vpravo je jednokanálový senzor kombinovaný. Pracovní (Pt), referenční (Ag/AgCl) a Pt pomocná elektroda (dolní část) jsou ve formě soustředných kruhů. Výstupní kontakty jsou pak na horní části obrázku. Vlevo dole je čtyřkanálový senzor obsahující pouze pracovní elektrody, v horní části obrázku se zlatými elektrodami, v dolní s platinovými. V levém horním obrázku je osmikanálový senzor.

15

3. PŘEHLED CHEMICKÝCH A BIOLOGICKÝCH AGENS V této kapitole jsou popsány některé nezbytné informace nutné k pochopení problematiky biologických a chemických bojových prostředků. Tento text je nicméně zaměřen směrem na problematiku biosenzorů a pro hlubší pochopení problematiky je třeba nahlédnout do příslušné literatury. Některé vhodné zdroje informací jsou referovány v kapitole Použitá a doporučená literatura.

3.1. Chemická agens Chemická agens (chemické bojové prostředky) jsou skupina chemických látek schopných způsobit smrt, zranění, nebo zneschopnění nepřítele. Použití a skladování chemických agens je zakázáno Konvencí o chemických zbraních (Convention on the prohibition of the development, production, stockpiling and use of chemical weapons and on their destruction) z roku 1993. Do roku 2009 tuto konvenci podepsalo 188 zemí. Dohledem na dodržování konvence a další administrativní záležitosti byla zřízena výkonná složka OPCW (Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons) se jmenovanými delegáty z členských zemí včetně České republiky. V dnešní době se pozornost věnovaná problematice chemických agens přesouvá z pohledu čistě vojenského na problematiku terorizmu. Podle ustálených zvyklostí dělíme chemické agens na pět základních skupin: všeobecně jedovaté, dusivé, zpuchýřující, psychoaktivní a nervově paralytické látky. Další chemické látky mohou být využity pro vojenské účely, nejsou však považovány za chemická agens. Jedná se především o dráždivé látky (např. slzotvorné látky), zápalné látky (např. napalm, termit aj.), herbicidy (růstové herbicidy a defolianty) a dýmotvorné látky. Postavení slzotvorných látek je specifické vzhledem k tomu, že je konvencí zakázáno jejich použití pro vojenské účely, ale tyto agens smí být nasazena pořádkovými silami. Na pomezí chemických a biologických agens jsou přírodní toxiny. Některé nízkomolekulární toxiny přírodního původu mohou ve své toxicitě předčít i známá chemická agens. Z těchto přírodních látek byl pro vojenské účely použit T2 toxin (mykotoxin). Nakládání s některými dalšími toxiny (např. aflatoxiny) je přísně regulováno.

chemická agens

nervově paralytické

zpuchýřující

všeobecně jedovaté

psychoaktivní

dusivé

sarin

Lewisit

HCN

BZ

fosgen

tabun

dusíkatý yperit

CNCl

LSD

chlor

VX

Sirný yperit

chlorpikrin

Obrázek 6: Přehledné rozdělení chemických agens s příklady vybraných zástupců.

16

Nervově paralytické látky: První objevenou nervově paralytickou látkou byl tabun. Jeho objev je datován do roku 1936 a podílel se na něm tým německých vědců kolem Gergarda Schradera. Druhou látkou byl sarin objevený o tři roky později. Nervově paralytické látky se dělí na dvě základní skupiny tzv. G serii a V serii. Mezi G látky je řazen sarin, soman, cyklosarin a tabun. Do skupiny V látek pak především VX (vyskytuje se ve více verzích), VE, VG, VM, VR. Jak látky G, tak i V jsou chemickou strukturou organofosfonáty. Látky skupiny G obsahují vazbu fosfor – fluor, respektive fosfor – kyanid (tabun). Látky skupiny V jsou thioestery obsahující vázaný diethylaminoethanthiol (Tammelinovy estery). Nervově paralytické látky jsou silné neurotoxiny s mechanizmem působení na cholinergní systém. Cílovou strukturou je enzym acetylcholinesterasa ukončující cholinegní transmisi. Mimo acetylcholinesterasu dochází i k inhibici dalších serinových hydrolas podílejících se zejména na bazálním metabolizmu. K úmrtím při otravách nervově paralytickými látkami dochází z důvodů cholinergní krize a nadměrné stimulace cholinových receptorů. Projevy intoxikace lze zmírnit podáním antagonisty acetylcholinu: atropinu. Je možné i navrácení aktivity acetylcholinesterasy použitím tzv. reaktivátorů, které odštěpí organofosfonátové reziduum z aktivnícho centra enzymu. Vzhledem k dobrému hodnocení aktivity cholinesteras in vitro a komerční dostupnosti čistých enzymů je konstrukce biosenzorů pro stanovení neurotoxických látek předmětem širšího zájmu.

Zpuchýřující látky: Jsou různorodou skupinou látek se společnou symptomatickou manifestací založenou podrážení a poškození kůže a sliznic. Jednotlivé zpuchýřující látky byly popsány již v devatenáctém století a byly masově nasazeny v období první světové války. Vizuálně se intoxikace projevuje vznikem puchýřů v místě kontaktu. Zvláště nebezpečný je kontakt se sliznicí plic mající za následek plicní edém a v konečném stadiu i udušení. Zajímavostí je, že typické puchýře se tvoří u člověka a prasat. Savci mající srst netvoří puchýře, ale místa kontaktu s těmito látkami připomínají spáleninu. Kromě vlastních zpuchýřujících účinků jsou tyto látky i mutageny a karcinogeny. Dusíkatý yperit byl dříve v malých dávkách používán jako cytostatikum. Hojení po zasažení zpuchýřujícími látkami je velmi pomalé. Zasažení očí často přináší i trvalou slepotu. Je nutno poznamenat, že mechanizmus vzniku puchýřů není ještě komplexně vysvětlen. Častou komplikací při expozici způchýřujícím látkám je sepse z poškozených tkáních. Typickými zástupci jsou lewisit, sirný a dusíkatý yperit. Toxicita lewisitu je založena také na přítomnosti arsenu. Expozice se projeví i poškozením jater. Proti lewisitu existuje specifické antidotum: BAL (British anti-Lewisite; 2,3-disulfanylpropanol). V současné době je za větší hrozbu než lewisit považován yperit z důvodu větší perzistence a neexistence účinného antidota. Všeobecně jedovaté látky: Mezi všeobecně jedovaté látky řadíme kyanidy a kyanovodík. Kyanovodík je bezbarvý plyn respektive těkavá kapalina typického hořkomandlového zápachu. Kyanovodík je používán při dezinfekci budov, dezinfekci a deratizaci obilních skladišť a železničních vagónů. Má širší uplatnění i v průmyslu jako je extrakce zlata a stříbra z rud, výrobě nitritů, olejů, pryží a plastických hmot (např. metakrylátové pryskyřice). Do prostředí se může dostat i při požárech, zejména při hoření polyakrylonitrilu, polyuretanů aj. Základním mechanizmem akutního toxického účinku kyanovodíků a kyanidů je inhibice enzymů obsahujících železo v trojmocné formě (katalasy, cytochromy, hem aj.). Otrava nastupuje rychle a projevuje se nauzeou, tonickými křečemi a dušností. U otrávených

17

je typické růžové zabarvení kůže a viditelných sliznic. Z dechu je cítit hořkomandlový zápach. Léčba je založena na reakci volných kyanidových aniontů s antidotem a následná samovolné eliminaci za těla. Jako účinné látky se osvědčili amylnitrit, EDTA a thiosulfát sodný.

Psychoaktivní látky: Použití psychoaktivních látek je šetrnější vůči obětem ve srovnání s ostatními typy chemických agens. Postižení nejsou usmrceni, jen dočasně vyřazeni z bojové nebo jiné činnosti. Tím ovšem nelze říci, že psychoaktivní látky nemohou být nebezpečné. Například při bleskovém zásahu bezpečnostních sil v Moskevském divadle Dubrovka v říjnu 2002 byl použit derivát fentanilu pro zneškodnění únosců. Vlivem různých okolností však došlo i k úmrtí některých rukojmí. Typickými zástupci psychoaktivních látek jsou BZ (3-quinuclidinyl benzilát) a LSD (diethylamin kyseliny lysergové). Mechanizmus obou látek je rozdílný. Látka BZ je kompetitivní inhibitor acetylcholinu na muskarinových receptorech. Oproti tomu látka LSD působí na receptory spojené s G proteiny, především na dopaminový receptor. Dusivé látky: Mezi dusivé látky řadíme širokou skupinu chemických sloučenin působící na dýchací cesty. Při rozsáhlé expozici dochází ke vzniku edému plic. Malé koncentrace dusivých látek dráždí nervová zakončení ve sliznici dýchacích cest. Symptomaticky se expozice projevuje kašlem, dušností, pálení na prsou, nevolností, pálením očí a slzením. Poškozená plicní sliznice se snadno může stát branou vstupu patogenů, proto se u intoxikovaných jedinců nasazují antibiotika. Kromě vojenského použití jsou dusivé látky i časté intermediáty v organických syntézách a k intoxikaci dochází i při průmyslových haváriích. Typickými zástupci jsou fosgen, chlorpikrin a chlor. V plynném stavu jsou těžší než vzduch. Fosgen na vzduchu vytváří bělavou až nažloutlou mlhu, chlor je žlutozelený. Fosgen se projevuje zápachem po zatuchlém senu, u chlorpikrinu se udává zápach po myšině. Chlorpikrin se pro vojenské účely používal i ve směsi s yperitem pro snížení jeho bodu tuhnutí.

3.2. Biologická agens Biologická agens (biologické bojové prostředky) představují skupinu především patogenních mikroorganizmů, mikroorganizmů produkujících toxiny a mikroorganizmů způsobujících onemocnění zvířat a rostlin. Ve srovnání s chemickými agens byla snaha regulovat a zakázat použití mikroorganizmů pro válečné účely mnohem staršího data. Již v roce 1925 byl připraven protokol o použití biologických agens: "Protocol for the prohibition of the use in war of asphyxiating, poisonous or other gases, and of bacteriological methods of warfare”. Tímto protokolem se však signatáři zavázali nepoužít biologická agens pro válečné účely. Vývoj biologických zbraní, jejich testování a skladování nebylo žádným způsobem regulováno až do roku 1972, kdy byla podepsána mezinárodní konvence “The United Nations Convention on the prohibition of the development, production, and stockpiling of bacteriological and toxin weapons and their destruction” kterou ratifikovalo 163 států. Obdobně jako u chemických agens, i u biologických se v současné době považuje za větší riziko kriminálního zneužití než vojenská aplikace. Pro konstrukci biologické zbraně lze teoreticky použít jakýkoli patogenní mikroorganizmus nebo toxinckou látku přírodního původu (u syntetických látek mluvíme o chemických zbraních). Odhaduje se, že na zemi existuje okolo 1400 lidských patogenů. Z toho počtu je

18

200 virového a 500 bakteriálního původu. Pro členění biologických agens se můžeme přidržet členění podle CDC (Centers for Diseases Control and Prevention, Atlanta, USA) na kategorie A, B a C. Příklady vybraných biologických agens s uvedeným onemocněním, které způsobují, jsou uvedena v přehledné tabulce 7.

biologická agens

bakteriální

virová

toxiny

Bacillus antracis (antrax)

Orthopoxvirus variola (neštovice)

ricin (Ricinus communis)

Brucella melitensis (brucelóza)

Marburg virus (marburg)

botulotoxin (Clostridium botulinum)

Francisella tularensis (tularemie)

Dengue virus (dengue)

T2 (Fusarium sp.)

Yersinia pestis (mor)

Obrázek 7: Ukázka vybraných zástupců biologických agens. V závorce je pak uvedeno onemocnění, které způsobují (viry a bakterie), nebo zdrojový organizmus (toxiny).

Kategorie A podle CDC: Do kategorie A jsou řazena vysoce virulentní biologická agens snadno přenosná ze zvířete na člověka, nebo z člověka na člověka. Jejich zneužití způsobí vysokou smrtnost mezi zasaženými, rychlé šíření v blízké populaci. K zamezení epidemie je třeba vynaložit velmi náročná opatření, která mají však jen limitovanou účinnost. Do úvahy se bere i panika, která doprovází vzniklou epidemii. Organizmy řazené do kategorie A se dají jednoduše kultivovat. Mezi biologická agens kategorie A se řadí: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, resp. botulotoxin, Yersinia pestis, Variola major, Francisella tularensis a původci hemoragických horeček (Ebola, Marburg, Lassa Machupo etc.).

Kategorie B podle CDC: Biologická agens kategorie B způsobují nemoci méně šiřitelné ve srovnání s kategorií A. Mezi již nakaženými se dá očekávat rovněž nižší smrtnost. Přesto je však případné zneužití

19

biologických agens kategorie B doprovázeno rozsáhlými protiepidemickými opatřeními. Jako významné zástupce lze uvést např: Brucella sp., Clostridium perfringens, Salmonella sp., Escherichia coli O157:H7, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, ricin, Stafylokokální enterotoxin B (SEB), Rickettsia prowazekii, virové encefalitidy, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum.

Kategorie C podle CDC: V této kategorii jsou zařazena biologická agens, která nejsou v současné době považována za aktuální riziko z hlediska vojenského, nebo kriminálního. Často se jedná o patogeny s dlouhou dobou latence (např. HIV). Tím ovšem nelze říci, že zde nejsou řazeny původci velmi vážných infekčních nemocí. CDC do této kategorie mimo jiné řadí např. virus Nipah nebo hantavirus. Reakcí na Iránsko – Iráckou válku bylo ustavení tzv. Australské skupiny v roce 1984. Tato skupina je zacílena na potlačení zneužití chemických látek a mikroorganizmů pro vojenské účely. V současné době je v Australské skupině začleněno čtyřicet zemí včetně zemí Evropské unie, Japonska, USA, Kanady, Austrálie. Byla sestavena rozsáhlá databáze biologických agens, která podléhají zvýšenému mezinárodnímu dohledu. Tomuto dohledu podléhají rovněž technická zařízení, která by mohla být použita pro šíření biologických agens, nebo jejich kultivaci ve velkém měřítku. Například se jedná o fermentory, separátory buněk, aerosolové komory, rozstřikovače rozstřikující více než 2 litry roztoku za minutu při velikosti částic aerosolu menší než 50 µm, vybavení pro laboratoře BSL3 a BSL4 aj. V České republice je zodpovědnou institucí za dohled nad dodržováním úmluv Oddělení pro kontrolu zákazu biologických zbraní náležící pod Státní úřad pro jadernou bezpečnost (SÚJB). Tato instituce se zabývá výkonem státního dozoru. Dohoda Australské skupiny spolu s Konvencí z roku 1972 byly převzaty i do Českého právního systému. Zejména se jedná o zákon 281/2002 Sb. a ministerskou vyhlášku 474/2002 Sb. Agens jsou členěna do tří základních skupin: Biologická agens (Biological agents), Zvířecí patogeny (Animal pathogens) a Rostlinné patogeny (Plant pathogens). Mezi dohlížené organizmy patří i jinak neškodné organizmy, do nichž by byla vložena genetická informace z mikroorganizmů vedených v ministerské vyhlášce 474/2002.

20

4. BIOREKOGNIČNÍ ELEMENTY VHODNÉ PRO KONSTRUKCI BIOSENZORŮ Biorekogniční element určuje specifitu celého biosenzoru. Správný výběr biorekogničního elementu je nezbytným krokem v zamýšlené konstrukci nového biosenzoru. Teoreticky můžeme použít infinitní množství různých biorekogničních elementů, v praxi se však setkáváme zejména s enzymy, protilátkami (respektive antigeny pro stanovení hladiny protilátek, v obou případech mluvíme o imunosenzorech) a v současné době i s uměle syntetizovanými úseky ssDNA. V následných kapitolách je v kostce nastíněna biochemie těchto biorekogničních elementů.

4.1. Protilátky Využití protilátek pro analytické účely má dlouhou tradici. Dlouhou dobu však bylo doménou imunologů a protilátky se používaly především při aglutinačních testech, případně metodě ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Fyziologickým úkolem protilátek je interakce s cizorodou, nebo jinak nechtěnou strukturou. Ve své podstatě je tedy využití protilátek pro konstrukci biosenzorů snadné a vhodným způsobem doplňují enzymy jako biorekogniční elementy. Zatímco enzymy použitelné pro konstrukci biosenzorů jsou obvykle specifické proti nízkomolekulárním látkám, imunosenzory mohou snadno detekovat makromolekulární struktury, které jsou jednoduchými metodami jen obtížně analyzovatelné. Nelze ovšem toto tvrzení paušalizovat. Existují i enzymové biosenzory pro stanovení makromolekulárních struktur, jako je např. v odborné literatuře popsaný biosenzor pro stanovení albuminu na základy hydrolýzy proteasou a na druhou stranu pak imunosenzor pro rychlou detekci nízkomolekulárního mykotoxinu aflatoxinu.

Struktura protilátek: Za fyziologických podmínek můžeme v krvi rozlišit pět typů protilátek: IgG (ty tvoří až 75% z celkového počtu imunoglobulinů s hmotnostní koncentrací 8 – 18 g/l), dále IgM (5-10%), IgA (10-20%) a menší frakce IgE a IgD. Imunoglobulin G se vyskytuje ve čtyřech formách označovaných jako IgG1 – IgG4. V lidském těle je produkován B-lymfocyty přibližně jeden týden po probíhající infekci. Nejčastěji bývá specifický vůči proteinovým antigenům. Tím se liší od IgM, který se objevuje po kratší době a je afinitní vůči lipopolysacharidům. IgG má přibližnou molekulovou hmotnost 155 kDa a skládá se ze dvou těžkých řetězců typu γ (50 kDa) a čtyřech lehkých řetězců typu κ nebo λ (22 – 25 kDa). Tyto lehké řetězce jsou u člověka společné i s ostatními imunoglobuliny. Struktura IgG připomíná písmeno Y, její schéma je vyobrazeno jako obrázek 8.

21

paratop

N

N

N

VL

N

VH

CL

lehký řetězec

CH -S-S-

CH2

-S-S-S – S -S – S -

O

O

glykosylovaná oblast

těžký řetězec

CH3 C

C

Obrázek 8: Struktura imunoglobulinu G.

IgG obsahuje dvě antigen vázající místa, paratopy, lokalizované na dvou Fab regionech. Vlastní Fab je složena ze dvou lehkých řetězců (každá obsahuje konstantní a variabilní oblast CL a VL) a ze dvou těžkých řetězců (opět konstantní a variabilní oblast CH1 a VH). Fc region je tvořen dvěma konstantními oblastmi CH2 a CH3. Ačkoli Fc region není schopen přímo reagovat s antigenem, je důležitou částí celé molekuly. Kromě strukturní úlohy je přes něj realizována vazba na T a B lymfocyty. Některé imobilizační postupy jsou založeny na specifické interakci Fc regionu s molekulou proteinů bakteriálního původu: G, L, nebo A. V imobilizačních postupech se rovněž často využívá glykosylovaná oblast CH2. Za zmínku stojí specifické štěpení IgG pomocí dvou enzymů. Prvním je papain specificky štěpící spojení CH1 a CH2 oblasti za vzniku dvou volných fragmentů Fab. Enzym pepsin pak odštěpuje Fc region za vzniku struktury F (ab)2. Další molekulou používanou pro konstrukci biosenzorů je imunoglobulin M. Jeho nevýhodou ve srovnání s IgG je nižší afinita k antigenu. Na druhou stranu obsahuje díky pentamerní struktuře pětkrát více paratopů a tím do jisté míry vyrovnává nižší afinitu. Druhou nevýhodou IgM je častější cross-reaktivita oproti IgG. Cross-reaktivitou je schopnost imunoglobulinu vázat se kromě původního antigenu i na antigen, se kterým se imunitní systém dosud nesetkal. Biosenzory založené na IgM mají pak větší pravděpodobnost falešně pozitivních výsledků analýzy. Jestliže IgG jsme označili za strukturu tvaru písmene Y, pak IgM má tvar do kruhu uspořádaných pěti písmen Y. Tyto jednotlivé domény jsou vázány svými Fc regiony prostřednictvím polypeltidové řetězce J. Celková molekulová hmotnost IgM je 900 kDa. Jednotlivé domény imunoglobulinu M se od IgG liší typem těžkého řetězce µ. Další tři typy imunoglobulinů A, D a E jsou fyziologicky důležité, nicméně nejsou typickými biorekogničními elementy pro konstrukci biosenzorů. To ovšem neznamená, že

22

v budoucnu nedojde k jejich širšímu užití. Zejména IgA podílející se na ochraně sliznic by mohl najít využití díky své dimerní struktuře a typicky vysoké afinitě vůči antigenům.

Příprava protilátek: Podle způsobu přípravy rozlišujeme tři typy protilátek: polyklonální, monoklonální a rekombinantní. Za fyziologických podmínek vznikají protilátky jako odpověď na přítomnost makromolekulárních molekul. Nízkomolekulární látky nejsou imunitním systémem rozpoznány. Mluvíme o tzv. haptenech. Tyto hapteny imunitní systém rozpoznává až po interakci s vhodnou makromolekulou (in vitro příprava). Některé látky však spontánně reagují s plazmatickými proteiny a v této formě následně evokují reakci imunitního systému. Příprava polyklonálních protilátek proti infekčním organizmům je snadné. Laboratorní zvíře infikované tímto patogenem vytvoří protilátku bez dalších stimulů. Pro zvýšení titru protilátek je však možné aplikovat adjuvans. Tradičním přípravkem je Freundovo adjuvans. Rozlišujeme Freundovo adjuvans kompletní a nekompletní. Kompletní Freundovo adjuvans je extrakt z Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium butyricum spolu se příměsí lipofilní frakce. Kompletní adjuvans je toxická substance a při imunizacích se používá jen jedenkrát. Nekompletní adjuvans má redukované množství toxických přísad, na druhou stranu je jeho efektivita nižší. Alternativním přípravkem je na Titermax. Jeho účinnost je sice nižší ve srovnání s Freundovým adjuvans, jedná se ale o méně toxickou směs látek tvořenou především polyoxypropylenem, polyoxyethylenem a skvalenem. Sérum z imunizovaných zvířat se dá použít přímo ve stavu v jakém je. Je zde však riziko cross-reactivity s jinými antigeny, zejména lipopolysacharidy. Proto je vhodné sérum frakcionovat. Například precipitací síranem amonným lze oddělit balastní proteiny krevní plazmy a dokonce i skupinu IgG od IgM. Purifikace hyperimunních sér může být realizována i některou z chromatografických technik. Historie monoklonálních protilátek začíná rokem 1975, kdy Kohler a Milstein popsali hybridomovou technologii. Jedná se o produkci protilátek z imortalizovaných B-lymfocytů. Protilátky jsou identické, protože jsou produkovány klony vycházejícími z jediné buňky. Příprava spočívá v několika navazujících krocích. Schematicky je zobrazena v obrázku 9.

23

Imunizované zvíře

izolace B-lymfocytů

fúze B-lymfocytů a myelomových buněk

nefúzované Blymfocyty nejsou schopny prolyferovat

nefúzované myelomové buňky zahynou v HAT mediu

výběr nejlepší linie

produkce protilátek ve zvířatech ve formě ascitické tekutiny

produkce protilátek v buněčné suspenzi

Obrázek 9: Schéma přípravy monoklonálních protilátek.

Na počátku přípravy monoklonální protilátky je opět imunizace laboratorního zvířete. B-lymfocyty se izolují ze sleziny a následně fúzují s myelomovými buňkami pomocí polyetylen glykolu. Selekce fúzovaných a nefúzovaných buněk se děje prostřednictvím selektivního HAT media (hypoxanthin-aminopterin-thymidin). B-lymfocyty nejsou schopny proliferovat a v mediu postupně odumřou. Nefúzované myeloidní buňky mají poškozený gen pro hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferasu (HGPRT) a nemohou proto využívat hypoxanthin. V selektivním mediu mohou proliferovat pouze fúzované buňky vytvořené z B-lymfocytů a myelomů. B-lymfocyty dodají funkční HGPRT a myelomové buňky schopnost proliferace. V následných krocích se medium s fúzovanými buňkami ředí a v kultuře je pak již pouze jeden klon. Vhodnými metodami se vybere klon s produkcí nejlepší protilátky. Následná produkce může být realizována ve formě ascitické tekutiny po vpravení do těla laboratorního zvířete. Od tohoto postupu se však dnes upouští z důvodů bolestivosti pro zvíře. Protilátky mohou být rovněž produkovány kultivačními metodami v buněčné kultuře, nebo bioreaktoru. Posledním typem podle přípravy jsou rekombinantní protilátky. Jejich produkce byla iniciována především snahou připravit humánní protilátky, které dostupnými technikami přípravy monoklonálních a polyklonálních protilátek nejsou dostupné z etických důvodů. Při přípravě rekombinantních protilátek se izoluje mRNA produkovaná B-lymfocytem. Z této mRNA se reverzibilní transkriptázovou PCR připraví komplementární DNA. Ta se vnáší do vhodného hostitelského organizmu (Escherichia coli nebo jiný prokaryot, kvasinka

24

Saccharomyces cerevisiae, rostlinné a živočišné buňky aj.). Rekombinantní protilátky lze humanizovat tzn. připravit chimérickou protilátku nesoucí Fab oblast z původního zdrojového organizmu a Fc lidskou. Výhodou humanizovaných protilátek je fakt, že na ně imunitní systém člověka nereaguje jako na antigen. Toho se široce využívá v medicíně pro přípravu léčebných přípravků. DNA pro rekombinantní protilátku lze vylepšit přidáním úseku kódující polyhistidin (6xHis tag): v DNA se opakující sekvence cat, nebo cac. Protilátky pak lze velmi snadno chromatograficky izolovat díky silné vazbě na některé chromatografické matrice. Ačkoliv genetická informace může být snadno přenesena a být sní manipulováno, pravdou je, že v hostitelském organizmu se vždy nedaří plně reprodukovat procesy z původní buňky. Tzv. posttranslační modifikace mohou přitom být nezbytným krokem k tomu, aby cílový protein byl plně funkční.

Použití protilátek: Afinitní interakce protilátka – antigen může být v některých případech sledována přímo některými specifickými technikami, jako je například nelineární optika nebo piezoelektrické mikrovážky. Ve většině případů je třeba však provést značení protilátek. Dříve se pro tyto účely používaly radionuklidy, dnes jsou to především fluorescenční značky a enzymy. Od sedmdesátých let se v návaznosti na přípravu monoklonálních protilátek rovněž rozvíjí ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Alternativou klasické metody ELISA je dot-blot při kterém se titrace realizuje na mebráně a reagencie jsou dodávány ve formě mikrolitrových kapek. Jako detekční próby se převážně používají konjugát protilátky s peroxidázou z křene selského (horse radish peroxidase – HRP) nebo alkalickou fosfatázou (ALP). Dot blot lze s výhodou použít tam, kde je třeba analyzovat zóny na elektroforetickém gelu. Analyty jsou western blotem přeneseny na nitrocelulózovou, PVDF, příp. jinou membránu, kde se detekují enzymem značenými protilátkami (dot blot). Na obdobném principu jako ELISA funguje i elektrochemiluminiscence (ECL). Primární protilátka je obdobně jako u metody ELISA adsorbována na pevný povrch (komerčně využívané jsou magnetické kuličky, které se po nanesení analytu koncentrují magnetem). Sekundární – detekční – protilátka obsahuje jako chemiluminiscenční značku trisbipyridal ruthenatý komplex Ru(bpy)3II+, který redukuje tripropylamin (TPA). Reakce je provázena emisí záření o vlnové délce 620 nm. Time-Resolved Fluorescence (TRF) je metoda sendvičového typu obdobně jako ELISA a ECL. Detekční protilátky jsou značené lanthanoidovými cheláty, nejčastěji se používá europium EuIII+. Výhodou použití lanthanoidu jako fluorescenční značky je značný posun frekvence záření, například při použití chelátu EuIII+-allophycocyanin se k excitaci používá záření o vlnové délce 337 nm, emitované záření pak má vlnovou délku 665 nm. Jako detekční limit pro tuto metodu se uvádí zachycení 10-17 mol značené protilátky. Značení protilátek: Z enzymových značek lze zmínit peroxidázu z křene selského Armoracia rusticana (HRP; EC 1.11.1.7). HRP je malý hemoprotein s molekulovou hmotností 40 kDa. Má vysoké číslo přeměny pro používané substráty, na druhou stranu lze zmínit i nevýhodnou vysokou labilitu při větší změně pH. Dá se využít pro konstrukci optických i elektrochemických analytických metod. Pro elektrochemické stanovení se jako reakční směs používá roztok peroxidu vodíku a jodidu draselného nebo sodného. Ve vodném roztoku vzniká molekula vody, hydroxylový anion a molekulární jod. Odlišná reakce však probíhá v přítomnosti EDTA, kdy vzniká kyslík, jodid a voda. Vlastní elektrochemická reakce probíhá jako zpětná redukce jodu na jodid při -50 mV proti argentchloridové elektrodě. Schematicky je reakční kaskáda znázorněna v obrázku 10.

25

2I-

HRP +

I2

H 2O2

+

2OH-

-50 mV vs. Ag/AgCl 2I-

I2 2e

Obrázek 10: Reakční kaskáda katalyzovaná HRP a následné elektrochemické vyhodnocení.

Při optickém vyhodnocování aktivity HRP se používají dva chromogeny: o-fenylendiamin a o-aminofenol. Reakce o-aminofenolu v přítomnosti peroxidu vodíku a HRP je vyjádřena na obrázku 11.

NH2

NH HRP H 2O2

OH

O

Obrázek 11: Reakce o-aminofenolu v přítomnosti HRP a peroxidu vodíku.

Dalším enzymem používaným pro značení protilátek je alkalická fosfatasa (ALP; EC 3.1.3.1). ALP se podílí na defosforylaci mnoha substrátů a je to zároveň důležitý marker četných onemocnění především aplastické anemie a leukemie, ale i jiných. Jak sám název napovídá, ALP je nejaktivnější při alkalickém pH. Nejvyššího čísla přeměny dosahuje při pH 10. Typickým chromogenem pro stanovení aktivity ALP je p-nitrofenol fosfát. Vznikající p-nitrofenol poskytuje žluté zabarvení media. Schéma reakce je přehledně znázorněno v obrázku 12.

O HO

P

OH

O

OH O ALP

+

H 2O -

O

P

OH

OH

N+ O

HO

-O

N

+

O

Obrázek 12: Rozklad p-nitrofenol fosfátu na p-nitrofenol a anorganický fosfát působením ALP. Disociace kyselých vodíků ortofosforečnanu není pro přehlednost uvažována.

26

Kromě enzymových značek se pro vizualizaci protilátek používají fluorescenční barviva. Je to skupina látek s různou strukturou. Nejběžnější a zároveň nejstarší jsou fluorescein a rhodamin. U některých fluorescenčních barviv jsou v rámci jejich homologních řad vybírány vlnové délky emitovaného záření. Typickým příkladem jsou například cyaniny. Cy3 s tříuhlíkatým spojovacím řetězcem je excitován při vlnové délce 550 nm a emituje při 570 nm zelenou barvu. Cy5 obsahuje pětiuhlíkatý spojovací řetězec a je excitovaný vlnovou délkou 650 mn, emituje červené záření 670 nm. Typickým fluoroforem je fluorescein. Ve vodném prostředí absorbuje fluorescein záření o vlnové délce 494 nm a emituje záření o vlnové délce 521 nm viditelné jako žluté až žlutozelené záření. Pro značení biomolekul je dodáván fluorescein ve formě isothiokyanátu umožňující vazbu na volné aminoskupiny makromolekul. Schematicky je struktura fluorescein isothiokyanátu a jeho vazba na aminoskupinu znázorněna v obrázku 12.

O

O

O

OH

O

O

O

RNH 2

HO

OH

HO

N

NH R

S

S

N H

Obrázek 12: Vazba fluorescein isothiokyanátu na aminoskupinu makromolekly (R).

4.2. Enzymy Enzymy jsou schopny, obdobně jako protilátky, cíleně reagovat s cílovou molekulou. Na rozdíl od protilátek enzymy se substrátem nejen interagují, ale zároveň jej modifikují. Biosenzory založené na enzymech mohou fungovat v celé řadě měřících formátů a pomocí fyzikálně-chemického převodníku může být sledována změna koncentrace substrátu, nebo produktu. Substrát může být analytem anebo pouze markrem a analytem je například inhibitor enzymu. Již v polovině 19. století si Louis Pasteur povšiml, že alkohol může být tvořen „živou silou“ ukrytou v buňce a použil termín „ferment“. Termín enzym byl poprvé použit v roce 1878 Wilhelmem Kuhnem. Pochází z řeckých slov en – v a zýmé – kvasnice. V roce 1897 experimenty na usmrcených kvasnicích německý vědec Eduard Buchner prokázal, že ke kvašení cukru může docházet i v neživém extraktu z buněk kvasinek. Ve velké části enzymů můžeme vysledovat následné složení. Ačkoli velmi často může být samotná proteinová struktura dostatečná pro vykonání biochemické reakce, v mnohých enzymech vystupuje jen jako tzv. apoenzym. Tj. jakýsi prekurzor enzymu bez katalytické aktivity. Plně aktivní se apoenzym stává až navázání tzv. kofaktoru. Tento kofaktor může být vázán velmi pevně (kovalentní vazba), pak mluvíme o prostetické skupině. Pokud se

27

kofaktor váže volně a snadno opět disociuje, je nazýván koenzym (kosubstrát). Koenzymy mohou být složité organické struktury jako je například flavin adenin dinukleotid (FAD) a nikotinamid adenin dinukleotid (NAD). Někdy jsou však koenzymy jednoduché anorganické ionty (např. hořečnaté, selenové aj.).

Mechanizmus působení enzymů: Enzymy katalyzují konverzi substrátu do reakčního produktu. Je však třeba si uvědomit že enzymy nemohou posunout rovnovážnou konstantu reakce, pouze snižují energetickou barieru tj. energetickou hodnotu nutnou pro excitaci reaktantů do tranzitního stavu ∆G≠ - aktivační energii. Posunem hodnoty ∆G≠ zvyšují rychlost, jakou se produkty tvoří. Enzymy mohou vykazovat několik úrovní selektivity vůči substrátu. Chemoselektivita označuje schopnost enzymů zajistit reakci vybraných funkčních skupin. V kontrastu s chemoselektivitou je regioselektivita. Regioselektivita se projevuje např. při hydrolýze proteinů. Proteasy jsou selektivní vůči určitým pořadím aminokyselin a nemohou štěpit každou peptidovou vazbu, ale jen určitou vazbu mezi některými aminokyselinami. Posledním termínem je stereospecificita. Enzymy mohou zcela selektivně rozpoznat izomery substrátu. Například laktátdehydrogenasa existuje ve dvou variantách: L-laktátdehydrogenasa přeměňuje L-laktát na pyruvát, nereaguje však s D-laktátem. Člověk exponovaný D-laktátu je proto intoxikován, protože jeho enzymový aparát není schopen D-laktát zpracovávat. Na druhou stranu některé mikroorganizmy produkují D-laktátdehydrogenasu, která štěpí pouze D-laktát a nevykazují aktivitu v přítomnosti L-laktátu. Pro popis funkce enzymu jsou popsány dva základní modely. První navrhl Emil Fisher v roce 1894. Nazývá se model zámku a klíče nebo templátový. Enzym je popsán jako zámek, do kterého se hodí pouze určitý klíč (substrát). V tomto modelu se předpokládá rigidní struktura jak enzymu, tak i substrátu. Druhým modelem je tzv. indukované přizpůsobení navržené Danielem Koshlandem v roce 1958. Koshland předpokládal flexibilitu aktivního centra enzymu a ke správnému rozpoložení funkčních částí aktivního centra dojde až vlivem interakce se substrátem. Jako analogie k modelu zámku a klíče se uvádí připodobnění k ruce (substrát) a rukavici (enzym).

Vyjádření aktivity enzymů: Pro základní vyjádření enzymové aktivity v daném preparátu se užívají dvě jednotky: kataly a enzymové (mezinárodní) jednotky U. Podle SI je správnější použití jednotky katal, který je vyjádřen jako mol substrátu přeměněný za jednu vteřinu. Enzymová jednotka je pak vyjádřena jako jeden mikromol substrátu přeměněný za jednu minutu. Jednoduchým přepočtem můžeme zjistit, že 1U odpovídá 16,67 nkat.

1kat = 1mol / s 1U = 1µmol / min = 16,67nkat = 16,67nmol / s Kataly ani enzymové jednotky neuvažují koncentraci substrátu. Proto se zavádí další dvě jednotky: specifická aktivita – aktivita přepočítaná na jeden mg čistého enzymu a molární aktivita – aktivita přepočítaná na jeden mol enzymu. Z molární aktivity lze snadno přepočítat číslo přeměny (turnover number) – počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednu minutu.

28

Enzymová kinetika: Pro jednoduché případy můžeme kinetiku enzymových reakcí popsat Kinetikou podle Michaelise a Mentenové. Pro jednoduchý případ přeměny substráty S na produkt P za pomocí enzymu E přes tranzitní stav ES můžeme uvést reakční rovnici:

E + S ↔ ES → E + P Se vzrůstající koncentrací substrátu vzrůstá rychlost enzymem katalyzované rekce. Tato rychlost však nejvíce narůstá jen v prvotní oblasti, další zvyšování koncentrace substrátu se projeví méně. Při určité koncentraci substrátu je enzym již substrátem zcela saturován a rychlost dále nenarůstá. Maximální dosažitelná rychlost je označována jako Vmax. Další důležitá konstanta je KM – Michaelisova konstanta. Tato konstanta odpovídá koncentraci substrátu, při níž je aktuální rychlost rovna jedné polovině Vmax. Typická saturační křivka je uvedena v obrázku 13.

v - kat

Vmax

1/2 Vmax

KM

c - mol Obrázek 13: Typická saturační křivka pro enzym řídící se Michaelisovskou kinetikou. Osa x označuje koncentraci substrátu, osa y rychlost enzymové reakce.

Výše uvedená enzymová reakce může být popsána kinetickou rovnicí podle Michaelise a Mentenové. Tato rovnice dobře popisuje enzymovou kinetiku pro případ jednoduché přeměny substrátu na produkt za předpokladu, že enzym není alostericky modulován substrátem, nebo produktem, substrát v nadbytku neinhibuje enzym a u enzymů s více aktivními centry neexistuje kooperativita. Rovnice Michaelise a Mentenové je uvedena níže. Rychlost je kalkulována v katalech. Význam ostatních symbolů je totožný s předchozím textem.

Vmax [S ] v= K M + [S ]

29

Kinetika podle Michaelise a Mentenové počítá s tím, že enzym reaguje pouze s jedním substrátem. Při složitějších reakcích však enzym může reagovat s více substráty anebo substrátem a kosubstrátem. U tzv. dvousubstrátových reakcí můžeme vysledovat několik základních způsobů reakce substrátů s enzymem. Interakce mezi substráty a enzymem mohou interagovat náhodným mechanizmem (1). U tohoto mechanizmu nezáleží, který substrát se váže jako první a který jako druhý. Při uspřádaném mechanizmu (2) se váže nejdříve jeden substrát, teprve potom druhý. Takto fungují například dehydrogenasy. Nejdříve dochází k vazbě NAD+, teprve potom k vazbě R-OH. Poslední variantou je ping-pongový mechanizmus (3). Při něm enzym reaguje s prvním substrátem, přeměňuje ho na první produkt P a sám přechází do aktivované formy Ea, teprve tato forma reaguje s druhým substrátem T na druhý produkt R. Tímto způsobem působí například některé oxidoreduktasy, transferasy aj. S ,T E →  EST → E + P + R

(1)

T E+S → ES → EST → E + P + R

(2)

T E + S → E a + P → E+R

(3)

Inhibice enzymů: Inhibice enzymů je důležitým aspektem enzymové kinetiky a může k ní docházet i při enzymových stanoveních. Inhibice enzymu může být nežádoucím efektem vyskytujícím se jak in vivo, tak i při in vitro stanoveních. Na druhou stranu je však cílené inhibice enzymů využíváno při některých léčebných postupech (například inhibice cyklooxigenasy acetylsalicylovou kyselinou – aspirinem). I při analytických stanoveních je často využíváno inhibicí enzymů. Inhibitor je analytem a jeho přítomnost je prokázána díky poklesu aktivity enzymu. Tento mechanizmus se používán například pro stanovení nervově paralytických látek a některých organofosfátových pesticidů pomocí enzymu acetylcholinesterasy. Z hlediska vratnosti inhibicí můžeme rozlišit inhibice enzymů na dvě skupiny: reverzibilní a ireverzibilní. Zatímco reverzibilní inhibice jsou dočasné a aktivita enzymů může být snadno navrácena, tak ireverzibilní inhibice vede k trvalému odstranění enzymové aktivity. Jako příklad ireverzibilního inhibitoru můžeme uvést arsenitan, který reaguje s thioly. Pokud je však arsen přítomen ve formě arseničnanu, je schopen kompetovat s anorganickým fosfátem. Jako jiný příklad můžeme být zmíněn enzym podílející se na neurotransmisi, acetylcholinesterasa. Ta je ireverzibilně inhibována některými pesticidy a nervově paralytickými látkami. Mnohé toxiny jsou však schopny se reverzibilně vázat blízko aktivního centra acetylcholinesterasy a dočasně ji inhibovat. Typickým příkladem jsou aromatické struktury, například aflatoxin. Zatímco u ireverzibilní inhibice není možné tuto inhibici zvrátit navýšením koncentrace substrátu, reverzibilní inhibice mohou být takto minimalizovány. Při reverzibilní inhibici mohou nastat tři různé základní mechanizmy. Jestliže se inhibitor váže mimo vazebné místo substrátu a neovlivňuje vazbu substrátu do aktivního centra, ale průběh vlastní enzymové reakce, jedná se o tzv. nekompetitivní inhibici. Inhibitor vázající se do aktivního centra enzymu může soutěžit o vazebné místo se substrátem. Mluvíme tedy o kompetitivní inhibici. Posledním případem je akompetitivní inhibice. V tomto případě se enzym neváže na samotný enzym, ale pouze na komplex enzym substrát. 30

Rozdělení enzymů: Enzymy jsou v živých organizmech rozšířeny velkou měrou a dá se říci, že provázejí život od jeho prvopočátků. Díky ohromné rozmanitosti reakcí, které katalyzují, vznikla snaha provést roztřízení enzymů do logických skupin. Vzniklo takzvané EC číslování (Enzyme Commission number). Každý enzym má svůj kód. Jako příklad můžeme uvést dva enzymy: EC 1.1.1.27 a EC 1.1.1.28. Pod tímto kódem jsou uvedeny L-laktátdehydrogenasa a D-laktátdehydrogenasa. První číslo odpovídá základní skupině enzymů, zde oxidoreduktasy (EC 1.). Druhé číslo (EC 1.1.) zde označuje, že donorem je R-OH. Třetí (EC 1.1.1.) v tomto případě odpovídá koenzymu NAD+ nebo NADP+ jako akceptoru. Poslední číslo je již pořadové umístění enzymu ve skupině. Základních skupin EC je šest. Pro přehlednost jsou uvedeny v obrázku 14.

číslo

název

katalyzovaná reakce

EC 1.

oxidoreduktasy

Redoxní reakce, přenos H nebo O atomu, respektive přenos elektronů z jiné substrátu

EC 2.

transferasy

Přenos funkční skupiny (např. metyl, acyl, fosfát aj.) z jedné molekuly na druhou

EC 3.

hydrolasy

Hydrolytický rozklad molekuly substrátu na dvě molekuly produktů

EC 4.

lyasy

Nehydrolytické štěpení substrátu

EC 5.

isomerasy

Změna struktury molekuly substrátu – přechod jednoho izomeru na druhý

EC 6.

ligasy

Spojení dvou molekul substrátu za spotřeby energie ve formě ATP

Obrázek 14: Základní rozdělení enzymů do skupin podle EC.

Enzymy používané pro konstrukci biosenzorů: Enzymy patří k tradičním biorekogničním elementům biosenzorů. Z dostupných studií můžeme usoudit, že k dispozici je velké množství enzymů a velká řada z nich již byla testována jako potenciální biorekogniční element. Přes obrovské množství prací v dostupných vědeckých databázích lze však za komerčně zajímavé, nebo dokonce komerčně využívané biosenzory založené na enzymech označit jen malou část z nich. Na tomto místě si představíme vybrané zástupce s vyšším praktickým dopadem. Vlastní sledování aktivity enzymů je založeno na rozdílných principech. U NAD(P) dependentních enzymů lze využít fotometrický fyzikálně-chemický převodník a Warburgův optický test. Tam kde z nedisociované

31

látky vzniká kyselina či zásada jako je běžné pro glukosaoxidasu a tvorbu glukonové kyseliny, lze využít sledování acidifikace (bazifikace) media pH senzitivní potenciometrickou elektrodou. Pokud vzniká látka schopná podstoupit redoxní reakci (například hydrolýza thioesterů na volný thiol) lze snadno použít chronoamperometrické nebo voltametrické vyhodnocení. Nejběžnějším enzymem pro konstrukci biosenzoru je glukosaoxidasa (GOx; EC 1.1.3.4.). Mechanizmus jejího použití je detailně popsán v kapitole věnované definici biosenzoru. Jako další oxidasy lze uvést askorbátoxidasu (EC 1.10.3.3.) používanou pro stanovení množství askorbátu (vitamín C) v potravinách. V přítomnosti kyslíku oxiduje L-askorbát na dehydroaskorbát. Dále například již výše zmíněnou L- a D-laktátdehydrogenasu a alkoholoxidasu (EC 1.1.3.13.). Pro stanovení fenolu lze použít tyrosinasu (fenoloxidasu; EC 1.14.18.1.). Pomocí vodivostních biosenzorů lze stanovit močovinu při využití ureasy (EC 3.5.1.5.) jako biorekogničního prvku. Pro stanovení reziduálního penicilinu lze použít biosenzor s navázanou penicilinasou (β-laktamasa; EC 3.5.2.6.). Pro stanovení neurotoxických látek lze použít acetylcholinesterasu (EC 3.1.1.7) a butyrylcholinesterasu (EC 3.1.1.8).

4.3. Genetická informace Využití genetické informace tj. informace obsažené v řetězcích DNA nebo RNA přináší zcela specifické výsledky v analýze biologického materiálu. Přes aktuálnost problematiky byl tento směr výzkumu z hlediska biosenzorů dlouho přehlížen. V současné však existují funkční aplikace využití genetické informace pro rozdílné účely. V tomto přehledu si zmíníme některé relevantní informace důležité k pochopení významu genetické informace a metod aplikací.

Zdroj genetické informace: Watson a Crick popsaly v roce 1958 centrální dogma molekulové genetiky jednoduchým schématem, a sice že bílkovina vzniká translací (překladem) polyribonukleové kyseliny (RNA) a RNA vzniká transkripcí (přepisem) polydeoxyribonukleové kyseliny (DNA). Teprve později byla popsána schopnost některých mikroorganizmů přepisovat RNA do DNA za pomocí reverzní transkriptasy. Genetická informace v molekule DNA je dána pořadím čtyř bází: adeninu (A), guaninu (G), cytosinu (C) a thyminu (T). Z toho adenin a guanin jsou purinové báze. Thymin a cytosin jsou pak pyrimidinové báze. Molekula DNA dále obsahuje společný strukturní skelet sestávající se z deoxyribosy (sacharid) a molekuly fosfátu. Molekula RNA je velmi podobná jednořetězcové DNA. Z chemického hlediska se liší náhradou thyminu za uracil (U) a náhradou deoxyribosy za ribosu. Báze navázaná na sacharid (ribosu nebo deoxyribosu) se nazývá nukleosid. Jestliže je navázán i fosfát, jedná se o tzv. nukleotid, který může být ve formě nukleotid mono- di- nebo trifosfátu. Genetická informace je kódována pořadím tří nukleosidů tzv. tripletem. Při přepisu jeden triplet kóduje jednu aminokyselinu, nebo start či stop kodon. Podle Watsona a Cricka se báze specificky párují. Adenin se páruje s thyminem v molekule DNA, nebo uracilem v molekule RNA. Guanin se páruje s cytosinem. Tyto vazby jsou slabé nevazebné interakce založené na vodíkových můstcích. Vazba dvou komplementárních jednořeťezcových vláken vede k tzv. hybridizaci. Tato interakce mezi dvěma vlákny však může být zrušena při denaturaci. Vlastní denaturace může být navozena chemicky chaotropními činidly, nebo působením zvýšené teploty. Tohoto principu se široce

32

využívá v mnohých instrumentálních technikách včetně polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction – PCR). A

T NH2

N

N

N

R

O

HN

N

N O

R

G

C O

N

N R

H2N

NH

N

N

N NH 2

O

R

Obrázek 15: Strukturní vzorce bází přítomných v molekule DNA. Čárkovaně jsou vyznačeny vodíkové vazby mezi dvěma komplementárními bázemi.

Sledování interakcí dvou komplementárních vláken: Interakce dvou komplementárních vláken je vysoce specifický proces. Právě na této specifitě je založeno mnoho instrumentálních metod včetně četných aplikací využívající biosenzory. Situace je obdobná jako v případě protilátek. Přestože je hybridizace vysoce specifická, není ve svém principu provázena výrazným fyzikálním jevem. S postupem času však vznikly četné fyzikálněchemické metody vhodné pro sledování hybridizace. Zde v krátkosti představíme ty, které jsou vhodné nebo dokonce již byly použity pro konstrukci biosenzorů. Hybridizaci lze stanovit i bez použití speciálního značení. Platí zde stejně jako pro protilátky, že typickými metodami jsou nelineární optika a hmotnostní piezoelektrické převodníky. V problematice hybridizací je však pozornost upřena i na další metodiku a tou je voltametrie. Při redoxních reakcích navozených vloženým napětím se mohou vybraná místa ve struktuře DNA (RNA) oxidovat, nebo redukovat. Intenzita těchto redoxních reakcí silně závisí právě i na tom, zda je řetězec nukleových kyselin hybridizován či nikoliv. Redoxní reakce DNA se bohužel uplatňují až při velmi vysokých nebo nízkých potenciálech. Způsob jak dosáhnout lepších pracovních potenciálů při použití DNA biosenzorů je založen na značení imobilizované próby například metylenovou modří. Próba je zvolena tak, aby obsahovala palindrom, nebo dvě vzdálené samo komplementární struktury. Konec řetězce je označen metylenovou modří, která při voltametrickém vyhodnocení poskytuje silný proudový pík díky blízkosti s povrchem elektrody. Pokud je v roztoku přítomna komplementární oligonukleotid, dojde k hybridizaci a vzdálení metylenové modři od povrchu elektrody.

33

Pro sledování hybridizace dvou oligonukleotidů byla vyvinuta i četná fluorescenční barviva založená na interkalaci dsDNA. Nejstarší a nejznámější je pravděpodobně ethidium bromid. Ethidium bromid jen velmi málo fluoreskuje ve vodném roztoku. Pokud je, ale vmezeřen do hydrofobního prostředí uvnitř dvoušroubovice DNA, je tato interakce provázena vznikem silné fluorescence. Ethidium bromid je excitován při 530 nm a emituje záření o vlnové délce 600 nm. Manipulace s ethidium bromidem je riziková. Ethidium bromid je karcinogen a teratogen. V současné době se použití ethidium bromidu nahrazuje jinými barvivy především na bázi cyaninů. Je možné zmínit široce užívaný SYBR Green I excitovatelný při 488 nm a emitující zelené světlo o vlnové délce 522 nm. Podobnou strukturu má SYBR Green II excitovatelný při 497 nm a emitující při 520 nm. Pro značení prób oligonukleotidů se využívají i výše uvedená barviva Cy3 a Cy5.

N

ethidium bromid

N N N+

BrN+

NH2

S

SYBR Green I H2N

Obrázek 16: Strukturní vzorce dvou fluorescenčních barviv používaných pro sledování hybridizace: SYBR Green I a ethidium bromid.

V mnohých experimentech se volí kromě vazby vlastního fluorescenčního barviva na molekulu oligonukleotidu ještě navázání tzv. zhášedla (quencher). Zhášedla silně snižují účinnost fluorescence, jestliže je jejich molekula v těsné blízkosti s molekulou fluorescenčního barviva. Kombinace zhášedla a fluorescenčního barviva umožňuje více variant uspořádání měření. Pro snadnější pochopení se zaměříme na nejjednodušší případ. Próba krátké jednořetězcové DNA obsahuje na jednom konci navázané zhášedlo a na druhém fluorescenční barvivo. Dokud nedojde k hybridizaci, je díky flexibilnímu řetězci DNA umožněno přiblížení zhášedla a fluorescenčního barviva. Fluorescence roztoku je neměřitelná. Po přidání analyzovaného vzorku obsahujícího DNA komplementárního k próbě dojde k hybridizaci. Úsek dvouřetězcové DNA má již zmenšenou flexibilitu a dojde k oddělení zhášedla a fluorescenčního barviva. Tento efekt se projeví silným nárůstem fluorescence.

34

DNA microarray: Výzkum genomů živých organizmů a jejich sekvenace je experimentálně náročný proces. Microarray techniky se ukázaly jako vhodný nástroj použitelný v tomto výzkumu. Od poloviny devadesátých let minulého století do současnosti bylo připraveno velké množství adaptací založených na microarray. Co vlastně máme na mysli, když mluvíme o microarray? Jedná se o analytické zařízení obsahující velké množství měřících kanálů. V principu se jedná multikanálový biosenzor. U DNA microarray je na 1 měřící destičce navázáno až 2 100 000 jednotlivých prób (např. NimbleGen, Roche). Tato matrice je pak inkubována s měřeným vzorkem a nastalé hybridizace jsou rozpoznávány. Pro vyhodnocení se nejčastěji využívá měření fluorescence ve spojení s multikanálovým uspořádáním optických vláken. Jako nosný materiál pro konstrukci microarray se používají křemíkové čipy, kvalitní skleněné destičky, případně výbrusy některých plastů. Vazba prób je založena na obdobných principech, jako je typické pro vlastní biosenzory. DNA microarray mohou být použity pro různé účely, tomu je pak následně podřízeno uspořádání měření. Stanovení expresního profilu genů jsou exponovaní jedinci (buněčné linie) vystaveni různým podmínkám. Do media jsou přidávány fluorescenčně značené nukleosidy emitující při rozdílných vlnových délkách. Komparací exprimovaných mRNA lze pak podle barvy jednotlivých zón s hybridizovanými oligonukleotidy určit, které geny se exprimují stále a které až při experimentální expozici. Jinou metodou typickou pro DNA microarray je určování bodového polymorfismu (single nucleotide polymorphism – SNP). Při něm jsou sledovány změny ve struktuře genetické informace na úrovni jednotlivých nukleotidů. Metodou SNP byl například dokazován původ kmene Bacillus anthracis použitého v tzv. antraxových dopisech v roce 2001. Pomocí DNA microarray lze sledovat i další parametry genetické a určit vazbu proteinů a léků na strukturu chromatinu.

35

5. METODY IMOBILIZACÍ BIOREKOGNIČNÍCH ELEMENTŮ Jak již bylo řečeno v úvodní části, biosenzor je takové zařízení, ve kterém je biorekogniční element těsně navázán na fyzikálně-chemický převodník. Imobilizace biomolekul je specifický proces, ve kterém je třeba zohlednit charakter imobilizované látky, povrch fyzikálně-chemického převodníku a povahu analytu. Metod použitelných k imobilizaci biomolekul je velké množství. Přesto lze vysledovat některé základní postupy. V tomto textu jsou imobilizace rozlišeny na dvě základní skupiny. Tou první je mechanické zachycení, druhou pak zachycení pomocí specifické vazby.

5.1. Fyzikální imobilizace Fyzikální (mechanická) imobilizace biomolekul je založena na zachycení biorekogničního elementu k povrchu fyzikálně-chemického převodníku bez toho aby došlo k chemické reakci mezi matricí a biorekogničním elementem. Nejčastěji se jedná o zachycení do membrán. Při volbě imobilizačního postupu je třeba zvážit velikost biorekogničního elementu a analytu. Fyzikální imobilizace je vhodná především pro zachycení enzymů katalyzujících reakci nízkomolekulárních substrátů. Jestliže je funkce biosenzoru založena na afinitní vazbě dvou biomolekul obdobné velikosti, není možné použít fyzikální imobilizaci a je třeba biorekogniční element kotvit chemicky. Ve vyjímečných případech je možné použit jednoduchou adsorpci na pevný povrch. U takto zachyceného biorekogničního elementu lze však očekávat postupné vymývání biorekogničního elementu a tím postupnou ztrátu citlivosti biosenzoru. Nejjednodušší imobilizace biorekočního elementu je jeho zachycení mezi dvě membrány s menší velikostí pórů (cut off) než podle molekulární hmotnosti odpovídá biorekogničnímu elementu a vetření do uhlíkové pasty v případě voltametrických biosenzorů. Vyspělejší technologie jsou založeny na tvorbě membrány in situ a zachycení biorekogničního elementu do tvořící se membrány. Levnou látkou použitelnou pro tvorbu membrán je želatina. Pro výrobu želatiny se využívá kůží a kostí zvířat. Po odstranění přebytečného tuku z biologických materiálů se acidickou, alkalyckou, nebo enzymovou hydrolysou kolagenu připraví želatina. Hydrolysa je zdlouhavý proces a trvá od několika hodin po několik dnů. Nejčistší želatina je získána enzymovou hydrolysou. Tvorba membrán je velmi snadná. Vodná suspenze nabobtnalé želatiny s přídavkem biorekogničního elementu se injektuje na povrch fyzikálně-chemického převodníku a nechá se zaschnout. Možná je rovněž separátní příprava membrány a její výřez je teprve následně přenášen na povrch převodníku. Větší uplatnění nalézají membrány založené na polyakrylamidu. Jedná se o kopolymer připravený ze dvou složek: akrylamidu a bisakrylamidu. Výhodou polyakrylamidu je možnost upravovat velikost pórů změnou poměrů akrylamidu a bisakrylamidu. Zvýšení množství bisakrylamidu vede ke zvýšení zesítění a zmenšení velikosti pórů. Nevýhodou přípravy polyakrylamidu je toxicita akrylamidu. Po polymeraci je vzniknuvší polyakrylamid již netoxický. Na druhou stranu nelze vždy zaručit úplnou polymeraci vstupních reagencií a redukci toxicity beze zbytku. Zesíťování akrylamidu a bisakrylamidu je vyobrazeno v obrázku 17. Pro tvorbu membrán se využívají i další látky schopné polymerace. V krátkosti lze zmínit polyvinylalkohol, latexy a algináty. Vhodnou látkou pro konstrukci biosenzorů je i polypyrrol a jeho N deriváty. Tento polymer vytváří dlouhá vlákna polymerací pyrrolu. Polypyrrolové membrány a polymery vzniklé z derivátů pyrrolu mají dvě výhody, které předurčují jejich oblibu při imobilizaci biomolekul. Pyrrol může být polymerován elektrochemicky vloženým napětím 800 mV způsobem, jak je prezentováno na obrázku 18. Elektrochemická polymerace umožňuje dobře definovat podmínky polymerace a řídit její 36

průběh. Druhou výhodou je vodivost vzniklého polymeru. Zatímco většina organických polymerů je nevodivá a tím i nepoužitelné pro tvorbu elektrochemických biosenzorů, polypyrrolové membrány jsou vysoce vodivé i bez použití různých modifikantů. Elektropolymerací lze připravit i nevodivé membrány použitím fenolu nebo dokonce pyrrolu, pokud je elektrochemicky plně zoxidován vyšším napětím.

O

O NH2

O

+

NH HN

bisakrylamid

akrylamid

O

O NH2

O NH2

NH2

R

R NH2 O

NH

NH2

O

O

O

O NH

NH2

R

R NH2

NH2

O

O

Obrázek 17: Polymerace směsi akrylamidu a bisakrylamidu.

37

-e2

-2H+ 2

N H

N H

N H

N H

n N H

N H n

Obrázek 18: Polymerace pyrrolu.

Dalším druhem membrán membrány obsahující kovy nebo polokovy ve formě tzv. sol-gel. Tyto uspořádané vrstvy vznikají hydrolysou a polykondenzací alkoxidů nebo chloridů kovů (polokovů). Při sol-gel imobilizaci vzniká vysoce uspořádané 3D síto s definovanou velikostí vnitřních kavit. Imobilizace sol-gel technikou je vhodná především pro zachycení biomolekul na křemen pokrytý oxidem křemičitým, sklem, některými plastickými hmotami aj. matricemi fyzikálně-chemických převodníků pokrytých hydroxylovými skupinami. Dobře dostupné jsou například prekurzory sol-gel γ-aminopropyltriethoxysilan (APTES) a glycidoxypropyltriethoxysilan (GOPS). Jako jiný příklad pevné membrány vytvořené sol-gel technikou je reakce mezi hexahydrátem chloridu hlinitého a polyetylen oxidu ve vodném etanolu.

5.2. Chemická imobilizace Při chemické imobilizaci je vytvářena vazba mezi povrchem fyzikálně-chemického převodníku a některou z volných funkčních skupin biorekogničního elementu. Povrchy mnohých fyzikálně-chemických převodníků mohou však být značně inertní. Zejména elektrody tvořené drahými kovy by bylo možno jen obtížně použít pro imobilizaci biomolekul, pokud by nedošlo k jejich úpravě. Využívá se tzv. modifikace povrchu elektrod z drahých kovů spontánním vytvořením monovrstev – SAM (self-assembled monolayer). Jako běžný příklad můžeme uvést modifikaci povrchu zlaté elektrody pomocí cysteaminu s následnou aktivací glutaraldehydem. Přehledným způsobem je tato imobilizace vyjádřena v obrázku 19. Zatímco amino skupina cysteaminu není schopna reagovat se zlatem, thiol vytváří kovalentní vazbu s atomem zlata. Volná aminoskupina cysteaminu ční do prostoru směrem od povrchu elektrody. Biomolekula obsahující volný aldehyd nebo keton na svém povrchu může přímo reagovat s aminoskupinou zachyceného cysteaminu. Častěji se však provádí aktivaci homobifunkčním činidlem glutaraldehydem. Potom se na organizovanou a aktivovanou mono-

38

vrstvu může vázat jakákoliv látka obsahující volnou aminoskupinu. Na rozdíl od oxo skupin jsou aminoskupiny na povrchu biomolekul velmi běžné a velká většina biomolekul může být proto tímto způsobem zachycena.

NH2

Au +

NH2

HS

OHC

Au

CHO

S

N Au

CHO

S

RNH2

N Au

NR

S

Obrázek 19: Zachycení biomolekuly s volnou aminoskupinou na zlatý povrch modifikovaný cysteaminem a aktivovaný glutaraldehydem. Molekula vody odstupující při kondenzační reakci není znázorněna.

Jako vhodná matrice pro zachycení biomolekul jsou používány i polysacharidy. Jsou relativně levné a stabilní reagencie. Některé komerčně dodávané převodníky mají povrch pokrytý karboxycelulosou. Mnohé biomolekuly jsou glykosylovány, například protilátky, a dají se využít pro jejich kovalentní imobilizaci. Protože molekuly sacharidů nejsou samy o sobě příliš reaktivní, je třeba je před vlastním imobilizačním postupem aktivovat. Jednoduchým, ale efektivním postupem je parciální oxidace jodistanem sodným nebo draselným. Při této oxidaci se otevírá pyranosový kruh za vzniku dvou aldehydických skupin. Další zachycení biomolekuly přes volnou aminoskupinu je totožné s imobilizací na reziduum glutaraldehydu. Schematické vyjádření oxidace a imobilizace biomolekuly je zobrazeno na obrázku 20.

39

CH2OH O

CH 2OH

NaIO4

OH

O OH

O

O

n

n

CH2OH

RNH2 O

NR

NR n

Obrázek 20: Oxidace polysacharidu (zobrazena celulosa) jodistanem sodným a následné navázání biomolekuly na glukopyranosové residuum. Molekula vody odstupující při kondenzační reakci není znázorněna.

Pokud je povrch, na který chceme zachytit biomolekulu hydroxylován, lze zachytit biomolekulu esterovou vazbou. Pro molekuly obsahující minimum kyselých funkčních skupin, můžeme výhodně použít aktivaci hydroxylovaného povrchu epichlorhydrinem. Tato látka reaguje elektrofilně s hydroxylem za odstoupení chloridu. Na druhém konci obsahuje vysoce reaktivní oxiranový kruh, na se snadno aduje biomolekula svou aminoskupinou. Při imobilizačním postupu je však třeba dbát opatrnosti z důvodu toxicity a karcinogenity epichlorhydrinu. Zachycení biomolekuly je znázorněno na obrázku 21.

Cl

O

S-OH

S

RNH2

O

O

OH S

O

NR

Obrázek 21: Imobilizace biomolekuly s volnou aminoskupinou pomocí epichlorhydrinu na hydroxylovaný povrch (S-OH).

Pro aktivaci hydroxylovaných povrchů lze použít i další široce používané činidlo: bromkyan. Pomocí tohoto činidla lze vázat biomolekuly i na povrch polysacharidů a toto činidlo je používáno i pro tvorbu matricí pro afinitní chromatografii. Zejména pro zachycení biomolekul na agarosu. Stejně jako v případě epichlorhydrinu je i bromkyan toxický a při jeho manipulaci je třeba dbát opatrnosti. Mechanizmus reakce je vyobrazen v obrázku 22. Pro

40

zahájení imobilizace a reakce bromkyanu s hydroxylem je třeba zvýšit pH. Matrice, které jsou nestabilní ve vyšším pH jsou proto nevhodné pro imobilizaci biomolekul pomocí bromkyanu.

S-OH

NaOH

S-O -

CNBr

SO NH

S-OH

S-OH

S-OH

S-O-CN

SO

RNH 2

RNH 2

+ NH2 SO

S-O-C NHR

NR

S-OH

SO

Obrázek 22:Využití bromkyanu (CNBr) pro imobilizaci biomolekuly s volnou aminoskupinou na hydroxylovaný povrch, nebo molekulu polysacharidů (SOH). Při kondenzačních reakcích nejsou znázorněny malé odstupující molekuly.

Četného využití nacházejí i metody zachycení biomolekuly na karboxylovaný povrch. Opět i zde platí, že některé biomolekuly mohou reagovat s vlastní matricí přímo. V tomto případě ty molekuly, které mají volné hydroxylové skupiny a jsou schopny vytvářet stabilní estery. Za stabilnější vazbu se uvažuje zachycení biomolekuly volnou aminoskupinou za tvorby amidové vazby. Jako typické nástroje vhodné pro zachycení biomolekuly na karoboxylováný povrch můžeme uvést reakce využívající karbodiimidy a N-hydroxysukcinimidy. Pro syntetické účely jsou zavedeny zejména dicyklohexylkarbodiimid (DCC), diisopropylkarbodiimid a 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid. Mechanizmus rekace využívající DCC je znázorněn na obrázku 23, imobilizace pomocí N-hydroxysukcniimidu (NHS) je pak na obrázku 24.

41

O S

O

N C N

+ OH

S O

O

RNH 2

+

S NHR

N C NH

NH C O NH

Obrázek 23: Zachycení biomolekuly RNH2 na karboxylovaný povrch SCOOH pomocí dicyklohexylkarbodiimidu.

O O S

HO +

OH

O

N

S

O

O

O

N O

RNH2

O S

-NHS

NH

R

Obrázek 24: Zachycení biomolekuly RNH2 na karboxylovaný povrch SCOOH pomocí N-hydroxysukcinimidu (NHS). V imobilizačních procedurách se často využívají i různé struktury přírodního původu schopné specifické vazby. Lze zmínit vazbu biotinu na avidin, nebo streptavidin. Avidin a streptavidin jsou proteiny skládající se ze čtyř podjednotek. Každá podjednotka má vysokou specifitu vůči biotinu. Komplex avidin biotin je vysoce stabilní, disociační konstanta KD je přibližně 10-15 mol/l. Při imobilizačních postupech se využívá zejména faktu, že jedna

42

molekula avidinu (streptavidinu) váže čtyři biotiny. Proto se na povrch váže avidin a biomolekula je značena biotinem. Při přidání roztoku biomolekuly se pak na jednu imobilizovanou molekulu avidinu váží právě čtyřy značené biomolekuly. Specifickou interakcí je i vazba Fc části protilátek na některé proteiny bakteriálního původu: protein A, G a L. Na povrch převodníku lze proto předem navázat pouze některý z těchto proteinů a vlastní biorekogniční element může být vysoce specificky a dostatečně rychle zachycen až při samotném měření. Především v procedurách, kde je třeba rychle vyizolovat analyzovanou látku, váže se biorekogniční molekula na povrch tzv. magnetických mikročástic. Při afinitní reakci je měřená látka navázána na magnetickou mikročástici a celý konjugát následně přitažen na povrch měřícího senzoru, nebo dno separační kyvety. Při konstrukcích biosenzorů se zároveň v rozvinuté míře začínají používat nanočástice. Pro konstrukci biosenzorů pak zejména bývají aplikovány grafitová nanovlákna nebo fullereny. Tyto nanočástice jsou komerčně dodávány již s upraveným povrchem a vlastní zachycení biorekogničního elementu je prováděno některým z výše uvedených imobilizačních postupů, případně jeho modifikací.

43

6. ČLENĚNÍ BIOSENZORŮ PODLE FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PŘEVODNÍKŮ 6.1. Elektrochemické převodníky Společným prvkem elektrochemických biosenzorů je přítomnost enzymu jako biorekogničního elementu a změna elektrochemických vlastností na fyzikálně-chemickém převodníku jako primárního signálu. Biorekogniční element může být složen jen z enzymu, v tomto případě se většinou stanovuje enzymový substrát. V opačném případě enzym slouží jako značka navázaná na protilátku, nebo próbu oligonukleotidu. Pro přímé stanovení krevních metabolitů nebo některých průmyslově využívaných organických látek je zavedeno používání enzymů, většinou ze třídy oxidoreduktas, jako glukosa oxidasy nebo glukosa dehydrogenasy pro stanovení glukosy, alkohol oxidasy pro ethanol, laktát dehydrogenasy nebo laktát cytochrom c oxidoreduktasy pro stanovení L-laktátu (některé aplikace i pro D-laktát), ureasy pro stanovení močoviny a cholesterol oxidasy koimobilizované s cholesterol esterhydrolasou pro stanovení cholesterolu. Podle použitého fyzikálně-chemického převodníku a primárního výstupního signálu, tj. signálu vycházejícího přímo ze senzoru, zpravidla dělíme elektrochemické biosenzory na potenciometrické, voltametrické a impedimetrické (konduktometrické).

Potenciometrické biosenzory Potenciometrické biosenzory využívají iontově selektivní eletrody (ISE) jako fyzikálně-chemického převodníku. Při měření s ISE soustavou neprochází proud, pouze se akumuluje potenciál na rozhraní iontově selektivní membrány. Biorekogniční element je zpravidla imobilizována na povrchu membrány ISE. Jako ISE se historicky používala skleněná pH elektroda. V současné době se dává přednost polovodičovým senzorům obsahujícím až desítky ISE. Zejména ISFET (ion-selective field effect transistor) a LAPS (ligth addressable potentiometric sensor) patří k trendovým zařízením. Elektroda se volí taková, aby byla schopná selektivně vnímat přítomnost iontu produkovaného (spotřebovávaného) enzymovou reakcí. Např. glukosa oxidasa se může imobilizovat na povrch pH elektrody (skleněné, ISFET...). Glukosa vstupující do reakce má minimální vliv na pH roztoku, glukonová kyselina vystupující z reakce acidifikuje médium a tato změna je zaznamenána pH elektrodou. Nernstův potenciál na skleněné pH elektrodě je popsán Nicolsky-Eisenmanovou rovnicí, její obecná forma pro ISE je následující: n RT   E=E + ln aa + ∑ K a ,i (ai ) za / zi  za F  i =1  0

Symboly v rovnici mají univerzální význam. E je potenciál, R univerzální plynová konstanta, za valence měřeného iontu (pro pH elektrodu za = 1), F Faradayova konstanta, T teplota, aa aktivita měřeného iontu, ai aktivita interferujícího iontu a Ka,i představuje selektivitu iontově specifické membrány.

Voltametrické biosenzory Voltametrické biosenzory pracují na principu sledování vzniku Faradayova proudu díky redoxní reakci. Z běžně dostupných metod voltametrických stanovení lze zmínit chronoamperometrii, cyklickou voltametrii, linear sweep voltametrii, square wave voltametrii a diferenční pulzní voltametrii. Při cyklické voltametrii a linear sweep voltametrii je napětí

44

lineárně zvyšováno do předem zvolené hodnoty. U cyklické voltametrie je poté opět lineárně snižováno. Po celou dobu měření zaznamenávány hodnoty proudové odezvy. Nevýhodou cyklické voltametrie a linear sweep voltametrie je silné ovlivnění měření Faradayova proudu proudem polarizačním. U square wave voltametrie a diferenční pulzní voltametrie ve vliv polarizačního proudu zmírněn nebo téměř odstraněn díky pulznímu zvyšování napětí. Pro praktické účely konstrukce biosenzorů se však nejčastěji používá chronoamperometrie (dále jen amperometrie) při které je fixně nastaveno vložené napětí a měřený Faradayův proud se měří buď kontinuálně, nebo v určitém časovém úseku po počátku měření. Amperometrické biosenzory představují jisté zjednodušení oproti potenciometrickým. Kalibrace amperometrických biosenzorů je typická rozsáhlou lineární oblastí. Jako pracovní elektroda amperometrického biosenzoru může sloužit drátek drahého kovu nebo sítotisk obsahující tenkou vrstvu tohoto kovu pokrytou biorekogniční složkou (enzymem). Jinou variantou amperometrického biosenzoru jsou pasty, především uhlíkové, ve kterých je suspendován enzym. Amperometrický biosenzor můžeme zjednodušeně považovat za miniaturizovanou baterii produkující enzymovou reakcí elektrický proud. Proud procházející pracovní elektrodou se pohybuje v řádu nA – µA. Aby byla enzymová rekce viditelná, je v některých případech nutné do soustavy dát takzvané vložené napětí mezi referenční a pracovní elektrodu. Toto napětí způsobí oxidaci (redukci) produktu enzymové rekce, poté co prodifunduje biorekogniční složkou k vlastnímu povrchu elektrody. Amperometrické biosenzory mohou pracovat ve dvou nebo tříelektrodovém uspořádání. Dvou elektrodové uspořádání obsahuje pouze referenční a pracovní (tj. elektrodou s biorekogniční složkou) elektrodu. Referenční elektrody mají zvýšený přechodový odpor, proto je nevýhodou tohoto uspořádání úbytek napětí na povrchu referenční elektrody při vyšším elektrickém proudu a díky tomu zkrácený lineární rozsah kalibrační závislosti. Složitější tříelektrodové uspořádání obsahuje kromě dvou zmíněných elektrod navíc tzv. pomocnou elektrodu. Zpravidla to je čistý zlatý nebo platinový film (drátek). Napětí v tříelektrodovém uspořádání se nastavuje mezi referenční a pracovní elektrodu. Proud pak systémem prochází mezi pracovní a pomocnou elektrodou.

Obrázek 25: Komerčně dodávaný tříelektrodový senzor připravený metodou sítotisku; a – zlatá pracovní elektroda; b – Ag/AgCl referenční elektroda; c – zlatá pomocná elektroda; d – výstupní kontakty.

45

Impedimetrické biosenzory Impedimetrické biosenzory sledují změnu impedance nebo jejích složek. Impedanci (Z) lze považovat za součet veličin: rezistance (R), kapacitance (C) a induktance. Pro potřeby konstrukce biosenzorů je však využití induktance minimální, její hodnota je u většiny impedimetrických biosenzorů nulová, a v matematickém vyjádření impedance se proto zanedbává:

Z 2 = R2 +

1 ( 2 fC ) 2

Rezistance je převrácená hodnota konduktance, proto se někdy biosenzory využívající změnu rezistance nazývají konduktometrické. Impedimetrické biosenzory obsahují dvě elektrody, z nichž jedna má imobilizovanou biorekogniční složku. Na elektrody je přiváděno střídavé napětí (s amplitudou kolem 100 mV), přičemž biosenzor je součástí Wheatstoneova můstku. Značnou nevýhodou impedimetrických biosenzorů je vyšší citlivost k interferujícím látkám, kterou může být de facto jakýkoliv elektrolyt. Většího rozvoje dosáhly impedimetrické biosenzory pro stanovení močoviny za použití ureázy jako biorekogniční složky. V mediu probíhá katalyzovaná reakce:

( NH 2 ) 2 CO + 3H 2 O  → 2 NH 4+ + HCO3− + OH − Princip je zřejmý. Nedisociované molekuly vody a močoviny na straně reaktantů v reakci čtyři mají minimální význam na impedanci měřeného roztoku. Produkované ionty však mohou impedanci roztoku mnohonásobně zvýšit. Impedimetrické biosenzory mohou být úspěšně využity i pro monitorování růstu mikroorganizmů na principu sledování impedance metabolitů vylučovaných do média.

6.2. Hmotnostní převodníky Hmotnostní převodníky jsou takové, které přímo reagují na změnu hmotnosti látky navázané na jejich povrch. Z praktického hlediska došla většího rozšíření skupina tzv. piezoelektrických biosenzorů. Princip funkce těchto biosenzorů je založen na piezoelektrickém jevu. Tento piezolektrický jev byl objeven bratry Curiovými již roku 1880. Ve svém výzkumu nalezli zajímavý fyzikální jev. Anizotropní krystaly, tj. krystaly bez centra symetrie jsou schopny při mechanickém namáhání generovat orientované dipóly. Jev funguje i opačně. Tedy tak, že přivedení elektrického napětí se projeví mechanickou deformací. Při konstrukci biosenzorů se využívá právě této varianty. Používaným materiálem pro konstrukci biosenzoru mohou být přírodní křemeny, nebo umělé materiály jako například polyvinylidenfluorid. Dále využitelné jsou například fosforečnan hlinitý, Rochellova sůl (vinan sodnodraselný), topas (Al2SiO4(FOH)2), turmalín, soli niobičitanů a titaničitanů. Komerčně dostupné a pro konstrukci biosenzorů jsou vhodné zejména řezy křemenného monokrystalu – tzv. křemenné mikrovážky QCM (Quartz Crystal Microbalance). Závislost změny rezonanční frekvence ∆f (Hz) na změnu hmotnosti povrchu křemenného krystalu ∆m (g) umístěného v plynné fázi je popsána Sauerbreyovou rovnicí z roku 1959:

46

− 2 f 02 ∆m ∆f = A ρq µq Kde f0 je počáteční frekvence krystalu, A kontaktní plocha (cm2), ρq je hustota krystalu (2,684 g.cm-1) a µq modul pružnosti křemene (2,947⋅1011 g.cm-2). Sauerbrayova rovnice však nepočítá s roztoky a jejich viskozitou. Proto přibližně třicet let po Sauerbrayovi byla postulována tzv Kanasawa Gordonova rovnice. Závislost změny rezonanční frekvence pro různé kapalné fáze podle rovnice Kanasawa a Gordona je následující:

∆f = f 03 / 2

∆( ρη )

πηq ρq

Význam symbolů je stejný jako v předchozí rovnici. ρ a η bez indexu jsou míněny pro kapalnou fázi. Veličina η značí viskozitu. Skutečná změna frekvence při reálném měření je aditivní a projeví se v ní jak ∆m tak ∆(ρη). Ovšem z hlediska analytického má pozitivní význam pouze ∆m, vliv ∆(ρη) působí naopak rušivě, pokud v průběhu měření dochází ke změně viskozity anebo hustoty media. Odrušení vlivu ∆(ρη) lze provést za použití impedančního analyzátoru, který je však značně nákladný. V praxi se však spíše dbá realizace experimentů a úprava vzorků v roztocích o konstantní viskozitě a hustotě.

Obrázek 26: Schéma piezoelektrického QCM. 1. zlatá elektroda o průměru 5 mm, 2. křemenný krystal – AT řez, 3. nosné a vodivé drátky, 4. průchod drátků nosnou destičkou přes izolační krček, nosná destička a výstupní kontakty.

47

Ve shodě s předchozími rovnicemi můžeme tedy zjednodušeně říci, že piezoelektrický senzor kmitá určitou frekvencí a pokud se na jeho povrch naváže stanovovaná látka, tak je změna rezonanční frekvence přímo úměrná hmotnosti navázané látky. U nejběžnějších komerčních QCM senzorů s f0 10 MHz odpovídá detekovaná změna 1 Hz přibližně navázaným 3 ng látky. Obecně platí, že vyšší frekvence f0 umožňuje citlivější stanovení s nižším limitem detekce. Na druhou stranu výbrusy křemenných monokrystalů musí být velmi tenké a jsou proto i křehké. Velkou výhodou piezoelektrických biosenzorů je možnost získání výstupního signálu (změny rezonanční frekvence) přímo – bez jakéhokoliv značení. Na druhou stranu u piezoelektrických biosenzorů nedochází k amplifikaci signálu, jako je to běžné u elektrochemických biosenzorů. Mluvíme zde o piezoelektrických biosenzorech a rezonanční frekvenci jako výstupním signálu. K tomu abychom byli schopni výstupní signál získat, potřebujeme dvě zařízení: oscilátor, který je spolu s biosenzorem součástí elektrického širokopásmového oscilačního obvodu a kde přesná frekvence je dána aktuálními vlastnostmi biosenzoru – především jeho interakcí s analytem a frekvenčního čítače který měří frekvenci kmitů v oscilačním obvodě. Pro zmínku můžeme uvést, že první piezoelektrický biosenzor byl zkonstruován v roce 1972. Tento QCM měl na svém povrchu vázaný bovinní albumin. Byla sledována interakce mezi albuminem a sérovými protilátkami specifickými proti albuminu. Citlivost i správnost měření odpovídala tehdy běžným aglutinačním metodám.

6.3. Optické převodníky Jako optické převodníky označujeme skupinu zařízení umožňující charakterizovat analyt, respektive interakci analytu s biorekogničním elementem. Při konstrukci optických biosenzorů máme de facto na výběr ze tří základních technologických možností. Prvním jsou zařízaení na principu absorpční spektrofotometrie, druhé na principu fluorometrie a třetí založené na nelineární optice. Oživení zájmu o optické převodníky a konstrukci optických biosenzorů přinesla především dostupnost levných optických vláken s dobře definovanými vlastnostmi a dále pak konstrukce funkčních zařízení pracujících na principu nelineární optiky, především těch pracujících na principu rezonance povrchových plasmonů (surface plasmon resonance). Při absorpčním spektrofotometrickém stanovení se vychází z Lambert-Beerova zákona o absorpci záření. Využívá se známý fakt, že záření procházející roztokem s rozpuštěnou světlo absorbující látkou o koncentraci c, celkové optické dráze l dopadá s intenzitou (energií) I0 a vystupuje s intenzitou I je absorbováno hodnotou A podle rovnice:

A = − log

I = εcl I0

Symbol ε je molární absorpční koeficient specifický pro danou látku. Při spektrofotometrii je celková optická dráha, tj. zdroj záření, měřená kyveta a detektor v přímé optické dráze. Na proti tomu při fluorometrii může být optická dráha přímá, nebo detektor – kyveta a detektor – zdroj záření mohou být v úhlu (nejčastěji 90°). Zatímco při absorpční spektrofotometrii je měřen specifický pokles intenzity záření v dané vlnové délce, u fluorometrie je měřena emise záření o delší vlnové délce jako produkt vnitromolekulárních singletových přechodů elektronů po absorpci budícího záření. Podle druhého zákona termodynamiky je pak budící záření o kratší vlnové délce. Část záření se ztratí v ji48

ných vnitromolekulárních přechodech a zbytek je zpět vyzářen po deexcitaci výše zmíněných singletových elektronů. Zatímco při absorpční spektrofotometrii je kvalitativním měřítkem látky absorpční koeficinet, při fluorometrii se je kvantový výtěžek φ.

φ=

Ne Na

Ne je množství emitovaných fotonů a Na je pak množství absorbovaných fotonů. Intenzita emitovaného fluorescenčního záření I pro fluoreskující látku o koncentraci c je pak definována podle rovnice:

I = φc

Zájem o spektrofotometrické a fluorometrické biosenzory byl umocněn díky rozvoji optických vláken. Komerčně se používají plastická a skleněná optická vlákna. Pro zefektivnění celého systému a následnou miniaturizaci se při použití fluorometrických biosenzorů používá tzv. dělič záření (beam splitter). Je to vlastně polopropustné zrcadlo jedním směrem propouštějící záření od laseru a druhým směrem odrážející záření do detektoru. Jedním vláknem je pak přiváděno záření do měřícího prostoru a zároveň odváděno emitované záření k detektoru. Možné je rovněž vedení dvěma vlákny kdy jedno vlákno je vede záření do měřícího prostoru a druhé odvádí emitované záření. Výhodou optických vláken je možné multikanálové stanovení, kdy do jedné měřící cely je přivedeno více vláken a každé vlákno je ukončeno jedním biorekogničním elementem. Jednoduché schéma fluorimetrického biosenzoru s jedním optickým vláknem a děličem záření je vyobrazeno na obrázku 27.

3 4

Y Y

1

5

Y 7

antigen

2

Y

protilátka

Y

fluorescenčně značená protilátka

6

Obrázek 27: Schematické znázornění fluorescenčního biosenzoru pro stanovení antigenu (např. patogenní mikroorganizmus) za pomocí flurescenčně značené protilátky a sendvičového uspořádání imunokomplexu. Číselný popis: 1 – laser; 2 – detektor; 3 – dělič záření; 4 – optická vlákno; 5 – reakční cela; 6 – vtok vzorku do reakční cely; 7 – výstup vzorku z reakční cely.

49

Biosenzory využívající nelineární optiku využívají sice optického záření pro vyvolání signálu, výstupní signál je však založen na elektromagnetickém principu. Zde si uvedeme princip fungování měření rezonance povrchových plasmonů (SPR). Odraz záření optickým hranolem a rozklad záření na jednotlivé složky záření je notoricky známé. SPR obsahuje optický hranol s jednou stranou pokrytou vrstvou kovu případně polokovu. Experimentálně se nejlépe osvědčily zlato, stříbro, měď, titan a chrom. Při průchodu světla hranolem dochází k interakci fotonů s elektrony kovových atomů. Tento jev je provázen elektromagnetickým zářením šířícím se na rozhraní kov/dielektrikum (optický hranol). K této interakci dochází při určitém úhlu dopadu záření na kovem pokrytou hranu. Tento úhel je specifický pro danou vrstvu kovu. Pokud na vnějším povrchu tohoto kovu dochází k dalším fyzikálním procesům jako je vazba analytu na imobilizovaný biorekogniční element, dojde k posunu tohoto úhlu. Tato změna úhlu, při které dochází k maximálnímu přenosu energie je počítána jako specifický signál. Automatizovaná měření ovšem mají jako výstup relativní posun změny úhlu ukazovaný již jako výstupní signál. Princip fungování SPR je nastíněn v obrázku 28. Velkou výhodou SPR je možnost stanovit analyzovaný vzorek bez jakéhokoli značení. Tento fakt je zejména výhodný pro sledování specifických interakcí protilátek na zachycený antigen, vazby patogenního mikroorganizmu na zachycenou protilátku a sledování hybridizací oligonukleotidů. Použitelnost SPR je limitována molekulovou hmotností vázané látky. V nedávné době byla SPR použitelná jen na sledování interakcí makromolekul. Současná zařízení jsou však schopna rozlišit i vazbu látek s molekulovou hmotností nad 200 Da a jsou tedy použitelná i pro stanovení nízkomolekulárních toxinů a některých bojových chemických prostředků. Zároveň jsou popsány i studie zaměřené na sledování interakcí biologických agens s imobilizovanými protilátkami.

1

1

2

Y

protilátka

2

α elektromagnetické záření

antigen

optické záření

Obrázek 28: Vyobrazení principu fungování SPR biosenzoru. Pro názornost je demonstrována interakce imobilizované protilátky s antigenem prezentujícím biologické agens. V pravé části je grafický záznam transmitance hranolem (propustnosti záření) T v závislosti na úhlu dopadu α. Křivka číslo 1 je pro situaci, kdy na imobilizovanou protilátku není navázán antigen (č. 1 ve schématu). Druhá křivka (čárkovaná) pak pro situaci, kdy dochází k vazbě antigenu.

50

7. PŘÍKLADY NĚKTERÝCH APLIKACÍ Ačkoliv ze studia odborné literatury se může zdát, že biosenzory pro stanovení biologických a chemických agens jsou mimo hlavní zájem odborníků, není to úplně pravda. Mnoho pracovišť svým výzkumem přispívá ke znalostem v oblasti konstrukce biosenzorů, vzhledem k legislativním překážkám a obtížím při nakládání s vysoce nebezpečnými biologickými a chemickými agens se používají (z vojenského hlediska) mimetika. Jsou to látky blízké biologickým a chemickým agens, ale se zmenšenou nebezpečností. Mnoho vědeckých týmů například připravuje biosenzory pro stanovení nepatogenního organizmu Bacillus subtilis představujícímu mimetikum B. anthracis. Chemická agens mají rovněž svá mimetika: bischlorethylether lze použít namísto yperitu. Vysoce toxické nervově paralytické látky lze nahradit organofosfátovými pesticidy. V následném textu kapitoly jsou zmíněny příklady aplikací biosenzorů pro stanovení vybraných chemických a biologických agens. Pro stanovení nervově paralytických látek a některých pesticidů jsou dlouhodobě využívány enzymy acetylcholinesterasa (EC 3.1.1.7.) a butyrylcholinesterasa (EC 3.1.1.8). Enzym acetylcholinesterasa se podílí na cholinergní neurotransmisi. Jeho konkrétní úloha je hydrolysa neurotransmiteru acetylcholinu na cholin a octovou kyselinu v neurosynaptické štěrbině a tím ukončování signálu. Ve větší míře se acetylcholinesterasa rovněž nachází na povrchu krevních buněk, kde se podílí na neuroendokrinní regulaci některých procesů. Význam butyrylcholinesterasy není tak snadno definovatelný, jako je tomu v případě acetylcholinesterasy. V minulosti se nazývala plasmatická cholinesterasa díky faktu, že acetylcholinesterasa je na povrchu krevních buněk a po centrifugaci krve zůstává v plasmě pouze butyrylcholinesterasa. Zatímco acetylcholinesterasa je pojmenována po nativním substrátu, přirozený substrát butyrylcholinesterasy se nepodařilo nikdy nalézt a butyrylcholin je jen alternativní substrát. Butyrylcholinesterasy se využívaly dříve z důvodu snadnější přípravy. Mají však nižší číslo přeměny substrátu a pro analytické účely se dnes využívají acetylcholinesterasy. Jak acetylcholinesterasa, tak i butyrylcholinesterasa jsou tzv. serinové hydrolasy. V aktivním centru obsahují hydrolyticky aktivní serin, který je zároveň selektivně a ireverzibilně esterifikován nervově paralytickými látkami a organofosfátovými pesticidy v tzv. oxo-formě. Pro sledování aktivity acetylcholinesterasy bylo v minulosti vytipováno několik metod. Dvě z nich se zdají být nejperspektivnější a nalezly širšího uplatnění. V Armádě České republiky jsou především dva typy detekčních instrumentů založených na acetylcholinesterase. První je Chemický průkazník (ChP) 71, respektive jeho modifikace vzor 05. Obě verze ChP jsou schopny semikvantitativního hodnocení přítomnosti nervově paralytických látek (a jiných látek podle typu trubičky) v okolním prostředí za pomocí detekčních trubiček s vázanou acetylcholinesterasou. Druhým dostupným instrumentem je průkazníkový papírek Detehit. V minulosti byly zařazeny i poloautomatické systémy GSP a GSA. ChP 71 s příslušnými detekčními trubičkami je prezentováno jako obrázek 29.

51

Obrázek 29: Fotografie Chemického průkazníku 71 a detekční trubičky pro stanovení nervově paralytických látek.

Princip stanovení nervově paralytických látek jak ChP, tak i přípravkem Detehit je totožné. Jedná se o modifikovanou Ellmanovu reakci vyobrazenou v obrázku 30. Alternativní substrát acetylthiocholin je hydrolyzován na octovou kyselinu a thiocholin. Thiocholin reaguje s 5,5´- dithiobis-(2-nitrobenzoovou) kyselinou za vzniku 2-nitro-5-thiobenzoové kyseliny. Reakce se projevuje vznikem žlutého zbarvení spektrofotometricky měřitelného při 412 nm. Tato reakce je blokována v přítomnosti nervově paralytické látky inhibicí acetylcholinesterasy.

O AChE

N+

N+

S

CH3COOH

SH

HOOC O2N

HOOC O2N

COOH S

S

COOH N+

S

HS

S

NO 2

Obrázek 30: Ellmanova reakce katalyzovaná acetylcholinesterasou (AChE).

52

NO2

ChP a Detehit nejsou biosenzory v pravém slova smyslu. Nicméně lze očekávat budoucí zavedení zařízení založeného na biosenzorech pro stanovení nervově paralytických látek. Tímto směrem probíhá intenzivní výzkum na několika pracovištích včetně tuzemských i zahraničních. Kromě spektrofotometrického sledování aktivity acetylcholinesterasy lze využít i chronoamperometrické stanovení. Obdobně jako u Ellmanovy reakce je použit alternativní substrát acetylthiocholin. Vznikající thiocholin je oxidován vloženým napětím přibližně 450 mV (závisí na materiálu elektrod a přítomnosti různých elektrochemických modifikátorů). Princip měření je zobrazen v obrázku 31. Experimentálně testované elektrochemické biosenzory s acetylcholinesterasou jsou schopny detekovat nervově paralytické látky v koncentraci 10-9 mol/l.

O AChE

N+

CH3COOH

N+

S

SH 2x -H2

450 mV

N+ S

S N+

Obrázek 31: Elektrochemické sledování aktivity acetylcholinesterasy (AChE).

Na principu optických biosenzorů využívajících fluorescenčně značené protilátky pracují některé automatizované systémy. Například systémy RAPTOR a BioHawk (na obrázku 32) jsou schopny multikanálově stanovit biologická agens. RAPTOR je čtyřkanálový, BioHawk je pak osmikanálový biosenzor. Reakční cela obsahuje imobilizovanou protilátku schopnou reagovat s daným analytem. Stanovení je v sendvičovém uspořádání se sekundární fluorescenčně značenou protilátkou. Biosenzory RAPTOR a BioHawk lze stanovit velké množství patogenních mikroorganizmů a toxinů přírodního původu. Jedná se o mikroorganizmy Francisella tularensis, Bacillus globigii, B. anthracis, Erwinia herbicola, Brucella abortus, Yersinia pestis (F1 antigen), Escherichia coli (O157:H7 kmen), Salmonella typhimurium, Giardia lamblia, virus vakcinie. Z toxinů lze stanovit například: ricin, botulotoxin, cholera toxin, stafylokokální enterotoxin B a kokain. Limit detekce se pohybuje přibližně kolem 104 CFU/ml pro mikroorganizmy a 0,1 – 1000 ng/ml pro toxiny. Výhodou zařízení BioHawk a RAPTOR je jejich přenositelnost a snadná manipulace v polních podmínkách. Pro zachycení biologického aerosolu ve vzduchu je třeba použít zároveň i sběrač frakcí.

53

Obrázek 32: Detekční zařízení BioHawk. Vlevo je celkový pohled na zařízení. Vpravo nahoře je pohled na otevřené víko s biosenzorem a vpravo dole pak vlastní matrice obsahující imobilizovanou protilátku a kanály průtočného systému.

54

7. POUŽITÁ A DOPORUČENÁ LITERATURA 1. BORISOV, SM. – WOLFBEIS, OS. Optical biosensors. Chemical Reviews, 2008, vol. 108, p. 423. 2. COOPER, J., et al. Biosensors. New York, Oxford University Press, 2004. 3. GUISAN, JM., et al. Immobilization of enzymes and cells. New Jersey, Humana Press, 2006. 4. HOŘEJŠÍ, V. – BARTŮŇKOVÁ, J. Základy imunologie. Praha, Triton, 2001. 5. NOVÁK, J., et al. Fyzikální chemie – bakalářský a magisterský kurz. Praha, VŠCHT, 2008. 6. POHANKA, M. Biosenzory pro detekci biologických agens. Vojenské zdravotnické listy, 2007, roč. 76, s. 148. 7. POHANKA, M. – SKLÁDAL, P. Electrochemical biosensors – principles and applications. Journal of Applied Biomedicine, 2008, vol. 6, p. 57. 8. POHANKA, M., et al. Biosensors for biological warfare agent detection. Defence Science Journal, 2007, vol. 57, p. 185. 9. POHANKA, M., et al. Progress of biosensors based on cholinesterase inhibition. Current Medicinal Chemistry, 2009, vol. 16, p. 1790. 10. PROSSER, V., et al. Experimentální metody biofyziky. Praha, Academia, 1989. 11. SCHULZ-KIRCHRATH, S. Compendium biological warfare agents. OWR AG, Elztal-Rittersbach, Německo, 2008. 12. SCHULZ-KIRCHRATH, S. Compendium chemical warfare agents. OWR AG, Elztal-Rittersbach, Německo, 2008. 13. WISE, DL., et al. Bioinstrumentation and Biosensors. New York, Marcel Dekker, 1991. 14. ZÝKA, J., et al. Analytická příručka. Praha, SNTL, 1979.

55

RNDr. Miroslav POHANKA, Ph.D. BIOSENZORY PRO STANOVENÍ CHEMICKÝCH A BIOLOGICKÝCH AGENS Studijní pomůcka

Učební texty Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany Svazek 360 Vydala Univerzita obrany r. 2009 Vydání 1. Počet stran 56 Neprošlo redakční jazykovou úpravou Vytiskla Fakulta vojenského zdravotnictví UO Formát A4 – AA 4,7 Náklad 90 výtisků

56